Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения

Остроухова, Татьяна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения"

На правах рукописи

Остроухова Татьяна Юрьевна

Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03 00 13 - физиология, 03 00 03 - молекулярная биология

1 3мАР200в

Москва - 2008

003165304

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М В Ломоносова, в лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ Ольга Вячеславовна Смирнова

Петр Михайлович Рубцов

доктор биологических наук доктор биологических наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Владимир Борисович Кошелев доктор биологических наук, профессор,

заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии ГУНУ ФФМ МГУ имени М В Ломоносова

Василий Николаевич Бабичев доктор биологических наук, профессор,

заместитель директора по научной работе ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НИИ канцерогенеза РОНЦ имени Н Н Блохина РАМН

Защита состоится 24 марта 2008 г в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного Ученого Совета Д501 001 93 биологического факультета Московского государственного университета имени МВ Ломоносова по адресу 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд М-1

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Автореферат разослан 24 февраля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ма^—

Б А Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Болезни печени включают в себя обширную полиэтиологическую группу заболеваний человека, в которую входят такие поражения печени как холецистит, холелитиаз, печеночноклеточная недостаточность, гепатиты, цирроз и опухоли печени Эти заболевания приводят как к значительному ухудшению качества жизни пациентов, так во многих случаях и к смерти В разных странах злокачественные новообразования печени составляют от 2% до 50% всех опухолей, и при этом доля их постоянно увеличивается (Aguayo and Patt, 2001, Patel, 2002, Slatteiy and Sahani, 2006) За последние десятилетия уровень смертности от рака печени также растет, при этом данный тип заболевания наиболее трудно диагностируется и плохо поддается лечению

Пролактин, гормон передней доли гипофиза, регулирует широкий спектр функций различных типов клеток, и может секретироваться местно как аугокринный регулятор многих типов клеток, включая опухолевые (Bole-Feysot et al, 1998, Clevenger et al, 2003) В организме млекопитающих пролактин участвует в регуляции роста, дифференцировки, размножения, метаболизма, поведения, иммуномодуляции и осморегуляции (Bole-Feysot et al, 1998) Пролактин является также важным регулятором функций печени, где он индуцирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов (Орлова с соавт, 19996, Piccoletti et al, 1997, Orlova et al, 1998, Smirnova and Orlova, 1999), регулирует рост и дифференцировку гепатоцитов (Розен и др, 1991, Zabala and Garcia-Ruiz, 1989, Crowe et al, 1991, Berlanga et al, 1995), осуществляет соматогенные эффекты (Murphy et al, 1988), регулирует обмен и экзокринные функции гепатоцитов (Bole-Feysot et al 1998) Пролактин реализует свои эффекты, взаимодействуя с рецепторами (РПрл), относящимися к семейству рецепторов цитокинов (Смирнов, 2006) У млекопитающих описано несколько функционально различных изоформ РПрл, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (Bole-Feysot et al, 1998) Длинная изоформа РПрл опосредует основные изученные эффекты пролакгина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), главным образом STAT5 (Bole-Feysot et al, 1998) Короткие изоформы РПрл традиционно считаются негативными регуляторами JAK2/STAT5 сигнализации, т к. не способны активировать S ГАТ5 белки С другой стороны, эффекты коротких

изоформ РПрл связывают с тканеспецифическими сигналами пролактина (Duan et al, 1997, Nokelainen et al, 1998, Russell and Richards, 1999) При этом функциональные особенности действия пролактина на клетки определяются типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ РПрл, характерным для данной ткани

Печень является одной из центральных мишеней пролактина^ и экспрессия РПрл в ней находится па высоком уровне, а также зависит от пола у особей женского пола уровень РПрл выше, чем у мужского (Розен В Б, 1991, Smirnova et al, 1994) Хорошо известно, что опухолевые процессы в печени характеризуются увеличенной пролиферацией различных клеток печени, изменением соотношения се клеточных элементов, структуры печеночной дольки и, как следствие, нарушением сложной и многогранной функции печени В литературе встречаются данные, полученные на человеке и животных, которые свидетельствуют о повышении экспрессии РПрл в клетках печени и изменении их компартментализации, в частности появлении интенсивной экспрессии РПрл в ядрах клеток, в условиях активной пролиферации (Орлова и др, 1998, Смирнова и др, 1998, García-Caballero, 2000) А в последнее время, появились прямые и косвенные доказательства того, что появление рецепторов некоторых факторов роста и цитокинов, в частности, рецепторов родственного пролактину гормона роста, коррелирует с пролиферативным статусом клеток, и конститутивной активацией JAK/STA1 пути (Mertani et al, 2003, Conway-Campbell et al, 2007) С другой стороны, роль пролактина в процессе гепатоканцерогенеза остается не изученной

Цель и задачи исследования Исходя ш вышесказанного, целью настоящей работы было исследование особенностей экспрессии рецепторов пролактина в опухолях различных типов клеток печени человека и крыс, как основы для оценки вклада пролактина в развитие этих опухолей

Для реализации поставленной цели нами были сформулированы следующие

задачи

1 Сравнить характер экспрессии РПрл в печени человека при различных заболеваниях печени, таких как холецистит, обструктивный холестаз разной этиологии, первичные и вторичные опухопи печени, для определения объектов дальнейших экспериментальных исследований на моделях животных Демонстрация того, что в первичных опухолях разных типов клеток печени человека, а также в удаленной от опухоли ткани печени, выявляются значимые изменения как уровня

экспрессии РГТрл, так и их компартментализации, позволило нам выбрать для дальнейших исследований два типа опухолей печени крыс разного клеточного происхождения перевиваемые линии гепатоцеллюлярного рака Н27 и холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, и сформулировать дальнейшие задачи

2 Охарактеризовать экспрессию мРНК основных маркеров разных типов клеток печени и возможность секреции пролактина в клетках печеночных трансплантатов перевиваемых опухолей печени Н27 и РС-1 крыс

3 Оценить интенсивность экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1

4 Исследовать характер компартментализации РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1

5 Проанализировать зависимость от пола экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1

6 Изучить взаимное влияние клеток опухолей и клеток окружающей ткани на экспрессию и характер компартментализации РПрл в ткани печени жнвотного-реципиента.

7 Исследовать уровень мРНК РПрл и соотношение ее изоформ в клетках гепагомы Н27 и слизистого рака РС-1

Научная новизна Установлено, что у человека уровень экспрессии РПрл в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения находится на очень высоком уровне Внутрипеченочные трансплантаты гепатоцеллюлярной карциномы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 крыс, представляющие собой животные модели разных типов рака нечени, также характеризуются повышенной экспрессией РПрл, по сравнению с клетками печени интактных животных Обнаружено, что в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1, в отличие от Н27, возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином Показано, что внутрипеченочные трансплантаты холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуются интенсивной аккумуляцией РПрл в ядрах клеток Выявлено также, что характерная для печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобладанием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах Данная тенденция в целом наблюдается и у человека при различных заболеваниях печени , В клетках гепатомы Н27 при

внугрипеченочной трансплантации выявляется «классическая» для нормальных гепатоцитов гормональная регуляция экспрессии РПрл, позитивно зависимая от эстрогенов, и негативно - от андрогенов Кроме того, присутствие внутрипеченочного трансплантата опухолей Н27 или РС-1 в значительной степени влияет на окружающие и удаленные от опухоли ткани, а характер влияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента, при этом аналогичные данные получены и на человеке Показано, что ткань печени значительно влияет на опухоль в случае РС-1 индуцирует увеличение экспрессии РПрл и аккумуляцию их в ядрах опухолевых клеток, а в опухоли Н27 у животных обоих полов индуцирует увеличение доли мРНК длинной изоформы РПрл, при сравнении с культурой клеток гепатомы Н27 Установлено, что доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1 - только у самцов, по сравнению с печенью интактных животных

Теоретическая значимость работы определяется тем, что в ней наглядно продемонстрирована возможность и важность участия пролактина в патогенезе различных типов заболеваний и в том числе опухолей печени человека и крыс, установлена половая дифференцировка экспрессии РПрл в опухолях печени, показаны также взаимовлияния опухоли и ткани печени

Практическая значимость работы Результаты исследования позволяют обосновать новые подходы для зависимой от пола терапии опухолей печени, а также возможности использования признака ядерной аккумуляции РПрл при диагностике холангиокарциномы, и лечения этого заболевания с помощью лекарств на основе прямой ядерной доставки в клетки опухоли

Апробация работы Результаты исследований были представлены на 8ой Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), 110н Европейской неделе по гастроэнтерологии (Мадрид, 2003), Двухгодичных научных встречах международной ассоциации по изучению печени (Сан-Сальвадор, 2004), 3е" Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), 1ом съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 12ом Международном симпозиуме, посвященном вирусному гепатиту и болезням печени (Париж, 2006) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Москва, 2007)

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунок Список литературы включает источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Биопробы печеии человека. В настоящей работе использовали биоптический и резекционный материал ткани печени человека при различных заболеваниях печени, включая геиагоцеллюлярный и холангиоцеллюлярный рак, всего 35 биопроб

Животные. Работа проводилась на половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс весом 180-250 г. интактных животных, с ложными операциями, а также через 14 дней после гонадоэктомии, всего 76 животных Подкожное поддержание штаммов опухолей гепатомы Н27 и РС-1 Штаммы опухолей Н27 и РС-1 поддерживали подкожной трансплантацией один раз в 12-14 дней в случае гепатомы Н27, и в 21-24 дня в случае холангиоцечлюлярного слизистого рака РС-1

Внутрипеченочная перевивка штаммов опухолей гепатомы Н27 и РС-1 Внутрипеченочную трансплантацию проводили наркотизированным крысам пункцией центральной доли печени суспензии опухолевых клеток, взятых из подкожного трансплантата. Через 25-30 дней печень с опухолью изолировали и выделяли для дальнейших исследований ткань опухоли, ткань, окружающую опухоль (в случае опухоли РС-1) и ткань из лопасти печени, не затронуюй опухолью, в дальнейшем называемую нативной

Дифференциальное выделение гепатоцитов и холашиоцитов. Часть экспериментов проводили на двух типах клеток печени гепатоцитах и холангиоцитах Способ выделения фрагментов желчных протоков основан на методе предложенном группами проф Альпини и Альваро (Alpini, Phillips et al, 1994, Alpini, Ulrich et al, 1994, Mennone et al, 1995, Alvaro et al, 1997) Контроль качества разделения проводили по морфологии и экспрессии дифференциальных маркеров (рис 1) для гепатоцитов - это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов — цитокератин 19 (Alpini et al, 1994)

Рис. 1. Дифференциальное выделение клеток печени. Микрофотография неокрашенных препаратов: а - изолированный фрагмент желчного протока; б -изолированные гепатоциты; в - окраска бромистым этидием продуктов ПЦР на кДНК гепатоцитов (дорожки 1,2) и холангиоцитов (дорожки 3,4) интактной самки. Дорожки 1,4 -продукты амплификации со специфическими олигонуклеотидами на глюкозо-6-фосфатазу (621 н.п.); 2,3 - продукты амплификации со специфическими олигонуклеотидами на цитокератин 19 (310 н.п.).

Полуколичественное цитофотометрическое определение интенсивности РПрл-позитивного окрашивания в срезах печени человека и крысы. Локализацию РПрл в срезах печени человека и крысы определяли непрямым иммунопероксидазным методом (Smirnova et al, 1994) с использованием мышиных моноклональных антител (клон U5) против РПрл крысы, перекрестно реагирующих с РПрл человека. Интенсивность экспрессии РПрл определяли путем полуколичественного анализа изображений участков срезов, полученных на микроскопе Axioplan (Zeiss) с помощью камеры KAF 400 («Photometries», США) с охлаждаемой ПЗС-матрицей. Обработку изображений проводили с помощью компьютерной программы «PMIS 2.1», по разнице между уровнями градации серого в опытных и контрольных срезах, пропорциональной относительной концентрации меченого соединения (Smolen, 1990).

В некоторых случаях иммунопозитивное окрашивание на РПрл анализировали не только в целом по клетке, а также отдельно в ядре и цитоплазме.

Установлено, что большая часть данных не подчиняется нормальному распределению, поэтому результаты выражали в относительных единицах как медианы и верхняя и нижняя квартили.

Определение стабильности экспрессии мРНК Р-актина как гена внутреннего контроля. Проводили амплификацию фрагментов кДНК Р-актина и еще двух стабильно экспрессируемых в печени генов «домашнего хозяйства» - кДНК

гипоксаптингуанинфосфорибозилтрансфераш и кДНК фосфоглицераткиназы 1 (Pohjanvirta et al, 2006), методом полимеразной цепной реакции в «реальном» времени (ПЦР-РВ) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I, на приборе для проведения ПЦР-РВ Rotor-Gene 3000 («Corbett-Research», Австралия) Для определения стабильности экспрессии мРНК ß-актина использовали программу BestKeeper (версия 1) (http //www gene-quantification info/), которая определяет стабильность экспрессии генов «домашнего хозяйства» на основе пороговых циклов (Ct), полученных в ходе эксперимента (Pfaffl et ai, 2004) В результате проведенного анализа показали, что экспрессия гена ß-актина в группах 1) гепатоцитов и холангиоцитов нормальных крыс, 2) интактной печени и гепатоцитах нормальных крыс, 3) в опухоли РС-1 и холангиоцитах нормальных крыс стабильна, т е сравнение относительного количества изоформ РПрл внутри перечисленных групп является корректным, а в клетках опухоли Н27 крыс - нестабильна даже внутри группы одного пола, а также при объединении одной из групп с культурой клеток Н27 В связи с этим, в группах крыс с внутрипеченочной опухолью Н27, мы ограничились лишь сравнением соотношения короткой и длинной изоформ РПрл

Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ) с использованием зондов TaqMan. ПЦР-РВ с использованием зондов TaqMan проводили в стандартной инкубационной смеси для ПЦР-РВ, содержащей праймеры к кДНК одной из изоформ РПрл, праймеры к кДНК ß-акгина, а также зонды к кДНК РПрл (общий для двух изоформ) и к кДНК ß-актина Для определения относительного количества мРНК изоформ РПрл и их соотношения с использованием гена «домашнего хозяйства» ß-актина в качестве внутреннего контроля и нормирования при помощи калибратора, как внешнего стандарта, использовали стандартный сравнительный AACt метод (Livak and Schmittgen, 2001, Bustin, 2004, Roche Applied Science, Technical Note NoLC13/2001, 2001) В каждом из опытов кДНК калибратора была включена в анализ, что обеспечивало постоянную точку для калибровки всей серии экспериментов и возможности сравнения их результатов между собой Уровень экспрессии мРНК каждой из изоформ РПрл выражался в относительных единицах (о е) Уровень экспрессии мРНК данной изоформы в калибраторе принят за 1

Статистическая обработка данных. Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6 0 («Statsoft Inc», США) Проверку

соответствия выборок нормальному распределению проводили с использованием критериев Шапиро-Уилкса и Хи-квадрат Для определения достоверности различий использовали непараметрические критерии Манна-Уитни и Крускалл-Уоллиса, а также Медианный тест Статистически значимыми считали различия, для которых уровень значимости по соответствующему критерию был меньше '0,05 (р<0,05) (Гланц, 1999)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ экспрессии РПрл при заболеваниях печени человека

Особенности экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени человека исследовали, разделив их по степени тяжести поражения печеночной ткани По сравнению с хотестазом разной этиологии, сопровождающимся желтухой, первичным или вторичным раком печени желчнокаменную болезнь без желтухи, те при относительно небольшом холестазе, вызывающем умеренные изменения пролиферативной активности клеток печени можно считать наиболее легким поражением печени, поэтому мы приняли его за условный контроль Данное заболевание сочеталось с наименьшим уровнем иммунопозитивного окрашивания на РПрл, по сравнению с другими исследованными заболеваниями (табл 1) Таблица 1 Интенсивность экспрессии РПрл (вое) при желчнокаменной ботезни (ЖКБ), обструктивной желтухе разной этиологии, вторичном раке печени и гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) Медиана (нижняя квартиль, верхняя квартиль)

Женщины Гепатоциты/ /нативная ткань1 Холангиоциты/ /нативная ткань Опухолевые клетки (центр опухоли)

ЖКБ (без желтухи) 92 (54,149) 210** (156, 319) -

Обструктивный холестаз 213* (140, 303) 552** (429, 640) -

Вторичные опухоли 280* (229,360) 361** (294,418) +

ГЦК 315* (223, 379) 446(191, 685) 217* (159, 302)

от типа вторичной опухоли РПрл-позитивное окрашивание отсутствовало или было равно в среднем 229 (159, 297), * - р<0,001 по сравнению с гепатоцитами пациенток с желчнокаменной болезнью без желтухи, ** - р<0,001 по сравнению с гепатоцитами соответствующей группы пациенток

При обструктивном холестазе пролиферативные процессы сочетаются с некротическими и/или апоптотическими для холангиоцитов характерна мощная пролиферация, а для гепатоцитов сочетание пролиферации и некроза/апоптоза (Miyoshi et al, 1999, Wang et al, 2003) Обструктивный холестаз, сопровождающийся

желтухой, характеризуется существенно увеличенной экспрессией РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах, что аналогично данным полученным на животных (Орлова и др, 1999а, Смирнова и др, 1998) Нами выявлена также повышенная экспрессия РПрл в гепатоцитах у женщин, по сравнению с мужчинами, что согласуется с данными, полученными па гепатоцитах животных (Розен и др, 1991) Из всех рассмотренных нами типов заболеваний, максимальная интенсивность экспрессии РПрл наблюдалась в клетках желчных протоков при обструктивной желтухе разной этиологии что сочеталось с увеличением числа желчных протоков, последнее является косвенным показателем наиболее высокой степени их пролиферации Таким образом, высокая экспрессия РПрл при данном заболевании позволяет рассматривать этот рецептор как объект для фармакологического воздействия на данный патологический процесс

В клетках вторичных опухолей иммунопероксидазная идентификация РПрл выявлялась не всегда, но если выявлялась (только у женщин, в 60% случаев), то в одних случаях окрашивание было равномерным по всей клетке, а в других преобладало мембранное окрашивание Уровень РПрл-позитивного окрашивания опухолевых клеток был ниже или такой же, как у нормальных гепатоцитов Гепатониты больных с вторичными опухолями печени характеризовались высокой экспрессией РПрл, которая еще более возрастала по мере удаления от центра вторичного опухолевого узла Интенсивность экспрессии РПрл в гепатоцитах женщин, страдающих вторичным раком печени, быча выше, чем у мужчин

Таким образом, учитывая нестабильную и относительно низкую экспрессию РПрл в клетках вторичных опухолей, можно заключить, что роль пролактина в прогрессии печеночных метастазов невелика В то же время, печеночная ткань активно реагирует на наличие вторичной опухоли в печени человека значительно увеличивает экспрессию РПрл в гепатоцитах, прямо не соприкасающихся с опухолевыми клетками, и в меньшей степени в холангиоцитах Одной из причин этого может быть увеличение у таких больных обоего пола сывороточной концентрации эстрогенов, которые являются позитивными регуляторами РПрл (Кирег е1 а1, 2001) С другой стороны, этот факт может быть также следствием пролифера? ивного, но в данных условиях протекторного действия протактина на клетки печени, окружающие опухолевые узлы, которые растут и вытесняют нормальные клетки печени

Клетки гепатоцеллюлярного рака характеризовались высокой интенсивностью экспрессии РПрл (рис. 2а). По мере удаления от очага опухоли, манифестация РПрл в ткани печени пациентов с диагнозом гепатоцеллюлярный рак печени, усиливается, при этом даже в большей степени, чем при других рассмотренных нами заболеваниях. В ткани печени, удаленной от опухоли, экспрессия РПрл у женщин выше, чем у мужчин, что также характерно для нормальной половой дифференцировки печени у животных.

У пациенток с диагнозом холангиоцеллюлярный рак печени экспрессия РПрл в малигнизированных холангиоцитах в центре опухолевого узла была особенно высокой, но снижалась по мере удаления от центра опухоли. У одной из пациенток с высокодифференцированной холангиокарциномой, ядра малигнизированных холангиоцитов экспрессировали РПрл на более высоком уровне, чем цитоплазма (рис.

Рис. 2. Иммунопероксидазная идентификация РПрл в ткани центра опухоли у пациенток с диагнозом гепатоцеллюлярная карцинома (а), холангиоцеллюлярная карцинома (б). МГеп-малигнизированные гепатоциты, ПсП - псевдопротоки, Я - ядра, Сл - слизь. Цена деления:

а — 30 мкм, 6-50 мкм.

В гепатоцитах пациенток с холангиоцеллюлярной карциномой, при удалении от центра опухоли, экспрессия РПрл была очень индивидуальна и подвергалась значительным колебаниям, но оставалась на высоком уровне.

Таким образом, исходя из полученных результатов, мы предположили, что степень экспрессии РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах пациентов с описанными заболеваниями связана с пролиферативными процессами, происходящими в данных типах клеток. Поскольку очень высокий уровень экспрессии РПрл наблюдается в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения, а роль пролактина в

гепатоканцерогенезе остается плохо изученной, мы предприняли попытку изучить особенности экспрессии РПрл в опухолях печени на моделях перевиваемых опухолей двух типов у крыс

2. Сравнительный анализ особенностей перевиваемых опухолей печени крыс: гепатомы Н27 и холангиокарциномы FC-1

Гистологические особенности опухолей 1127 и РС-1

Гистологическая структура гепатомы Н27 характеризуется тем, что в ней можно выделить центральные и периферические опухолевые клетки центральные клетки меньше по размеру, чем периферические, (которые, в свою очередь, также меньше, чем гепатоциты нормальных животных) Кроме того, центральные опухолевые клетки располагаются диффузно, не образуют оформленных структур Для периферических опухолевых клеток характерно образование розеточных структур В связи с описанными гистологическими особенностями мы рассматривали экспрессию РПрл в центральных и периферических клетках гепатомы 1127 по отдельности

Гистологическая структура холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуется тем, что ткань опухоли представляет собой кластеры из нескольких опухолевых клеток или отдельные клетки, взвешенные в слизистом секрете У самок клетки неоплазмы бочыне по размеру, чем у самцов Границы между клетками плохо просматриваются Основное внутреннее пространство клетки заполнено огромными вакуолями со слизью (Трещалина и др , 2001), а цитоплазма оттеснена к периферии

Особенности экспрессии мРНК глюкозо-6-фосфатазы и цитокератина 19

Мы предприняли попытку охарактеризовать гепатоцеллюлярную карциному Н27 и холангиоцеллюлярный слизистый рак РС-1 при внутрипеченочной трансплантации с точки зрения экспрессии мРНК главных маркеров гепатоцитов -глюкозо-6-фосфатазы и холангиоцитов - цитокератина 19 Известно также, что экспрессия цитокератина 19 характерна для овальных (стволовых) клеток печени, а также для многих опухолевых клеток разного происхождения, в том числе для клеток гепаггоцеллготярных карцином (Alison, Lovell, 2005, Jakubowski et al, 2005, Ah et al, 2006, Alsaad et al, 2007, Park et al, 2007) Выявлено, что у самцов с внутрипеченочной опухолью Н27, происходит изменение дифференцировки клеток опухоли Н27 в большей степени, чем у самок, т к лишь 20% образцов опухоли у самцов (80% у

самок) экспрессируют мРНК глюкозо-6-фосфатазы, характерную для гепатоцитов, но при этом 75% (20% у самок) - мРНК цитокератина 19, характерного для клеток желчных протоков и для овальных клеток Кроме того, в образце первичной культуры гепатомы Н27 обнаруживается мРНК только цитокератина 19, но не глюкозо-6-фосфатазы

В отношении внутрипеченочных трансплантатов опухоли РС-1 выявляется обратная, по сравнению с гепатомой Н27, картина у самок изменение дифференцировки клеток опухоли выражено сильнее, чем у самцов, т к лишь 60% образцов опухолей у самок (86% у самцов) экспрессируют цитокератин 19, а 80% -глюкозо-6-фосфатазу (17% у самцов)

Особенности экспрессии мРНК пролактина

Для установления возможности аутокринной регуляции пролиферации клеток опухолей Н27 и РС-1 под действием пролактина, мы проверили наличие экспрессии мРНК пролактина во внутрипеченочных трансплантатах опухолей Н27 и РС-1 Экспрессия мРНК пролактина не была обнаружена ни в одном из образцов внутрипеченочной гепатомы Н27, а также в культуре клеток Н27, в то же время экспрессия мРНК пролактина была выявлена в нескольких образцах ткани опухоли РС-1 у 1ой самки крысы, ив4н образцах опухолей у самцов Таким образом, можно предположить, что аутокринная регуляция пролиферации клеток гепатомы Н27 под действием пролактина исключена, а клеток опухоли РС-1 - возможна

3. Особенности экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1 (суммарная экспрессия в клетке)

Иммуногистохимический анализ экспрессии РПрл в клетках опухолей Н27 и РС-1 выявил мощное повышение экспрессии РПрл и в Н27, и в РС-1, по сравнению с гепатоцитами и холангиоцитами интактных животных (рис 3) (табл 2) В случае гепатомы Н27 центральные опухолевые клетки характеризовались более высоким уровнем РПрл-позитивного окрашивания, чем периферические

'Л

•л ■■>>

-, - ", л

" а - - -

■J<iye}1" . * «

а-; Л: ' '_

;ЦОК^ . у......

- ММ/

3 - V

Рис. 3. Иммунопероксидазная идентификация РПрл в печени интактной самки крысы (а), в центральных клетках гепатомы Н27 (б) и клетках холангиоцеллюляриого слизистого рака РС-1 (в). ЖП - желчный проток, Геп - гепатоциты, ЦОК - центральные опухолевые клетки, Цит - цитоплазма, Я - ядро. Цена деления - 30 мкм.

Таблица 2. Сравнение интенсивности экспрессии РПрл (в o.e.) в клетках опухолей при внутрипеченочной трансплантации (в/п) гепатомы Н27 и холангиоцеллюляриого слизистого рака РС-1 самцам и самкам крыс. Представлены измерения по целой клетке. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль).

Группа животных Гепатоциты Клетки опухоли Н271 Холангиоциты Клетки опухоли РС-1

Интактные самцы 61,5 (33; 103) - 57 (14;106) -

Самцы с в/п трансплантатом опухоли 103,5* (69; 138) 119* (90; 151)

Интактные самки 8 Г (46; 122) - 106+ (52; 164) -

Самки с в/п трансплантатом опухоли 268,5*х(227; 336) 208*х(159; 288)

— Центральные опухолевые клетки; * - р<0,001 по сравнению с гепатоцитами (для Н27) или холангиоцитами (для РС-1) интактных животных соответствующего пола; + -р<0,001 по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самцов; х - р<0,001 по сравнению с клетками соответствующей опухоли самцов.

4. Особенности компартментализации экспрессии РПрл во виутрипсченочных трансплантатах Н27 и РС-1

Внутрипеченочные трансплантаты опухолей Н27 и РС-1 отличались по компартментализации РПрл. Для гепатомы Н27 свойственна равномерная экспрессия РПрл в ядре и цитоплазме. Опухоль РС-1 характеризуется гетерогенным субклеточным распределением РПрл (рис. 3). Нами показано, что повышение РПрл-позитивного окрашивания в цитоплазме, а также в целом по клетке, оказалось слабее, чем в ядрах, т.е. клетки опухоли РС-1 аккумулируют РПрл в ядрах (табл. 3).

Таблица 3. Интенсивность экспрессии РГТрл (в o.e.) в ядрах гепатоцитов и холангиоцитов интактных животных, клетках внугрипсченочной (в/п) опухоли РС-1 и нативной ткани печени. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль).

Группа „......— —""Ядра Холангиоциты Клетки опухоли РС-1 Гепатоциты Гепатоциты нативной1 ткани

Интактные самцы 47 (0; 104) - 40 (26; 90) -

Интактные самки 113* (47; 194) - 59**(41;101) -

РС-1-в/п самцы - 191* (119; 288) - 202* (145;293) -

РС-1 в/п самки 408#+ (256; 555) - 427ях (260; 578)

нативная ткань - ткань печени, значительно удаленная от опухоли; * - р<0,001, ** -р<0,05 по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самцов; * - по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самок; + - р<0,001 - по сравнению с клетками опухоли РС-1 самцов; х~ по сравнению с гепатоцитами нативной ткани самцов.

5. Особенности половой диффереинировкн экспрессии РПрл во внутрипечсночных трансплантатах Н27 и РС-]

Оба типа опухолей сохранили половую дифференцировку, характерную для нормальных клеток соответствующего типа: повышенную экспрессию РПрл у самок по сравнению с самцами. Периферические и центральные опухолевые клетки гепатомы Н27 также сохранили половую дифференцировку, свойственную нормальным гепатоцитам (см. табл. 2). Гонадоэктомия животных продемонстрировала «классическую» для нормальных гепатоцитов гормональную регуляцию экспрессии РПря и в клетках Н27, обусловленную позитивным действием эстрогенов, и негативным - андрогенов, на экспрессию РГ1рл: кастрация самцов вызывала повышение экспрессии РПрл, а овариэктомия - снижение экспрессии РПрл в обоих типах клеток гепатомы Н27 (рис. 4).

40G

<о •

300

О-

В 200 Рн

150

8 !í0

8 О

Самцы Самки

! 1

* ■ ÄÄ

\т * 1

-■ WIÜÍ5 -...... IX ÍCS ( Ц&Г

I «ру -

Центральные Периферические Центральные Периферические опухолевые опухолевые опухолевые опухолевые клетки клетки клетки клетки

Рис. 4. Интенсивность экспрессии РПрл в клетках гепатомы Н27 у животных с интактными гонадами (затемненный маркер) и у гонадоэктомированных животных (незатемненный маркер) Представлены измерения по целой клетке Медиана (нижняя квартиль, верхняя квартиль) * - р<0,001, ** - р<0,01 по сравнению с соответствующим типом клеток животного с интактными гонадами

Клетки опухоли РС-1 также как и Н27, характеризуются повышенной экспрессией РПрл у самок по сравнению с самцами (см табл 2)

6 Влияние внутрипеченочных трансплантатов Н27 и РС-1 на экспрессию РПрл в печени

Установлено, что интенсивность влияния внутрипеченочного трансплантата на ткань и, следовательно, функции печени, существенно зависит от типа опухоли Развитие гепатомы Н27 не отразилось на экспрессии РПрл в нативной лопасти печени у самок, но в 1,5 раза снизило экспрессию РПрл в аналогичной лопасти у самцов (табл 4) Половая дифференцировка экспрессии РПрл, характерная для печени нормальных животных, сохраняется в нативной ткани печени крыс с внутрипеченочными трансплантатами Н27

Таблица 4 Интенсивность экспрессии РПрл (в о е) в гепатоцитах интактных животных и нативной ткани печени в присутствии внутрипеченочных трансплантатов Н27 и РС-1 Представлены результаты измерений по целой клетке Медиана (нижняя квартиль, верхняя квартиль)

Пол животного Гепатоциты интактных животных Гепатоциты нативной' ткани в присутствии Н27 Гепатоциты нативной ткани в присутствии РС-1

Самцы 61,5 (33, 103) 41** (20,65) 170* (138, 215)

Самки 81+ (46,122) 80* (56,122) 194*" (144, 238)

'нативная ткань - ткань печени, значительно удаленная от опухоли, * - р<0,001, **-р<0,05 по сравнению с гепатоцитами интактных животных соответствующего пола, + -р<0,001 по сравнению с гепатоцитами интактных самцов, " - р<0,001 по сравнению с гепатоцитами нативной ткани самцсв с в/п трансплантатом соответствуюпей опухоли

Окружающая и удаленная от опухоли РС-1 ткани печени у самцов и самок имели гистологические особенности у самок гепатоциты данных типов тканей были значительно более вакуолизированы, чем у самцов Присутствие внутрипеченочного трансплантата РС-1 индуцировало увеличение РПрл-позитивной иммунореактивности в гепатоцитах окружающей и нативной тканей печени, по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обоих полов (табл 4) Присутствие

внутрипеченочного трансплантата РС-1 вызывало аккумуляцию РПрл в соседних с опухолью, а также отдаленных гепатоцитах преимущественно в ядрах клеток Кроме того, половая дифференцировка экспрессии РПрл сохранялась как в окружающей, так и в нативной ткани печени крыс-опухоленосителей, во всех рассмотренных компартментах. Таким образом, печеночная ткань активно реагирует на рост внутрипеченочной опухоли РС-1, при этом, особенно сильному влиянию опухоли подвержена печень самок крыс, экспрессия РПрл в окружающей ткани в целом по клетке усиливалась в большей степени у самок, чем у самцов

7. Влияние печени на экспрессию РПрл во внутрипсченочных трансплантатах РС-1

На примере РС-1 выявлено и обратное влияние ткани печени на опухоль При подкожной трансплантации РС-1, которая близка к культуре клеток РС-1, экспрессия РПрл была низкой, сохраняла половую дифференцировку и в ядрах была повышена только у самцов, по сравнению с холашиоцитами интактных животных (табл 5) Таким образом, печеночная ткань индуцирует мощное повышение экспрессии РПрл в клетках холангиокарциномы РС-1

Таблица 5 Интенсивность экспрессии РПрл (в о е) в холангиоцитах интактных животных и клетках подкожной и внутрипеченочной опухоли РС-1 Медиана (нижняя квартиль, верхняя квартиль)

Пол животного, Холангиоциты Подкожная Внутрипеченочная

клеточный интактных животных трансплантация рака трансплантация рака

компартмент РС-1 РС-1

2 Цечая клетка 57 (14, 106) 30* (6, 60) 119* (90, 151)

£ « и Ядра 47 (0,104) 57*** (28, 104) 191* (119,288)

Цитоплазма 47 (4, 97) 14* (0,42) 88 ** (64, 135)

К Целая клетка 106* (52, 164) 44+х (26, 74) 208** (159,288)

г « о Ядра 113* (47, 194) 63+ (38,97) 408^ А (256,555)

Цитоплазма 92** (44,149) 38+А (18, 58) 234н'х(157,331)

*р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05 по сравнению с соответствующим компартментом холангиоцитов интактных самцов, +р<0,001, ++р<0,01 по сравнению с соответствующим компартментом холангиоцитов интактных самок, хр<0,001 по сравнению с соответствующими компартментом и видом трансплантации самцов

8. Особенности экспрессии мРНК изоформ РПрл и их соотношения во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1

В клетках опухолей Н27 и РС-1 выявляются мРНК обеих изоформ РПрл. Анализ соотношения уровней мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в гепатоме Н27 показал, что в опухоли это соотношение «смешается» в сторону увеличения экспрессии длинной изоформы РПрл, как у самцов, так и у самок (рис. 5). При этом половая дифференцировка соотношения уровней изоформ, характерная для нормальной печени, исчезает, и у самцов начинает доминировать доля мРНК длинной изоформы РПрл. Интересно отметить также, что в культуре клеток гепатомы Н27 соотношение короткой и длинной изоформ РПрл особенно высокое.

; $ I 5,0 •

! ■§"

| ¡20

Г ю

0.0

Печень Печеш. Гепатош Гепатош К}51ьт\ра Ходгитдаш Холатноцщы Огазисшй Слизистый нормальных нормальных Н2/ К27 клеток нормальных нормальных ракРС-1 рак РС-1 самцов сашк самда самки гепагомыШ? самцсш с»юк ссамки

Рис. 5. Соотношение уровней мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в печени и холангиоцитах интактных животных, и в опухолях Н27 и РС-1. * - р<0,05, ** - р<0,01.

При сравнении соотношения изоформ РПрл в холангиоцитах и опухоли РС-1 у животных обоего пола, мы не выявили достоверных различий (р>0,05), хотя и наблюдали его слабый рост (рис. 5). Половая дифференцировка соотношения изоформ РПрл внутри групп сохраняется: у самцов в опухоли РС-1, также как и в холангиоцитах интактных животных, доминирующей остается длинная изоформа РПрл, а у самок - короткая.

В экспрессии мРНК короткой изоформы РПрл в опухоли РС-1 у самцов не было выявлено достоверных отличий по сравнению с холангиоцитами нормальных

животных, в то же время, экспрессия мРНК длинной изоформы РПрл возросла (р<0,05) (рис. 6). У самок в опухоли РС-,1 наблюдается значительный разброс в экспрессии мРНК обеих изоформ РПрл, и как следствие, достоверных отличий в экспрессии мРНК изоформ РПрл выявлено не было (рис. 6). Таким образом, предполагается, что в опухолях РС-1 у самок повышается чувствительность к пролактину за счет небольшого и относительно равномерного усиления экспрессии обеих, изоформ РПрл. В то же время, у самцов, чувствительность к пролактину возрастает главным образом за счет увеличения уровня длинной изоформы РПрл.

I X «Т

£ щ

1 й-

в а 4,05

^ Й 0,04

! 2 V

« I

3 §4<в

| ® ад

3 р о

ХолаиодйШ Холаяггоциш ОщздльРС-! ОпушьРС-1 нормальных нормальных самцы сами самцов самок

Холаяиошш Холаягшцвш ОихольРС-! Опухоль РС-1 нрапвшх нормальных самцы самки самцов самок ^

Рис. 6. Содержание мРНК короткой (а) и длинной (б) изоформ РПрл в холангиоцитах интактных животных и опухоли РС-1. * - р<0,05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного нами исследования особенностей экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени человека, мы установили, что в первичных опухолях разного клеточного происхождения, а также в удаленной от опухоли ткани печени, происходят значимые изменения как уровня экспрессии РПрл, так и их компартментализации. Мы предположили, что степень экспрессии РПрл в клетках разного типа у пациентов с данными заболеваниями может быть связана с пролиферативными процессами, происходящими в. данных типах клеток. Очевидно, что модели перевиваемых опухолей двух типов клеток печени крыс являются адекватными для экспериментального исследования особенностей экспрессии РПрл при гепатоканцерогенезе.

Установлено, что клетки внутрипеченочных опухолей Н27 и РС-1 частично теряют маркеры, соответствующие нормальным типам клеток печени для гепатоцитов - это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов - это цитокератин 19 Причем степень потери зависит от пола и типа опухоли в гепатоме Н27 у самцов наблюдается изменение дифференцировки клеток в большей степени, чем у самок, а в холангиокарциноме РС-1, наоборот-у самцов

Известно, что многие опухоли характеризуются аутокринной стимуляцией роста и прогрессии (Abou-Shady et al, 1999, Park et al, 1999, Sirica et al, 2001) Экспрессия мРНК пролактина была обнаружена в клетках холангиокарциномы РС-1, но не гепатомы Н27 Таким образом, предполагается, что клетки опухоли РС-1, в отличие от гепатомы Н27, могут аутокринно регулировать собственный рост и прогрессию пролактином

Обнаружено повышение экспрессии РПрл в клетках гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1 по сравнению с клетками соответствующего типа нормальных животных При этом внутрипеченочные трансплантаты опухолей H27 и РС-1 отличались по компартментализации РПрл для гепатомы Н27 свойственна равномерная экспрессия РПрл в ядре и цитоплазме, а клетки опухоли аккумулируют РПрл в ядрах Таким образом, мы предполагаем, что для клеток холангиокарциномы РС-1 прямой ядерный путь действия пролактина важен в большей степени, чем для клеток гепатомы Н27 В то же время вопрос о том, какой вариант пути - про- или антионкогенный осуществляется пролактином в случае прямого ядерного воздействия на клетки опухоли остается открытым, т к пролактин способен запускать как пролиферативные (через циклофиллин В), так и антипролиферативные (через ядерный транскрипционный фактор NF1-C2) прямые ядерные каскады (Fntsche et al, 1998, Rycyzyn and Clevenger, 2002, Johansson et al, 2003, Johansson et al, 2005, Nilsson et al, 2006)

Мы выявили взаимовлияния опухолевых клеток обоего типа и клеток печени реципиентов, которые заключаются в изменениях уровня и/или компартментализации РПрл как в опухолевых клетках, так и в клетках печени, и зависящие от типа опухоли и пола животного-реципиента Что касается внутрипеченочного трансплантата РС-1, то его присутствие индуцировало не просто увеличение экспрессии РПрл, но и аккумуляцию их в ядрах гепатоцитов окружающей и нативной тканей печени, по сравнению с гепатоцитами интактных крыс Таким образом, печеночная ткань

активно реагирует на рост внутрипеченочной опухоли РС-1 Мы предполагаем, что особенность хочангиокарциномы РС-1 - характерная ядерная аккумуляции РПрл не только в клетках опухоли, но и в ткани печени, может быть использована для диагностики - как маркер развития холангиокарциномы, а также служить базой для поиска новых лекарств на основе прямой доставки их в ядра опухолевых клеток Кроме того, если пролактин способен в данных условиях осуществлять проведение пролиферативных сигналов в ткани удаленной от опухоли, то, можно предположить, что таким образом он может играть протекторную роль, стимулируя пролиферацию не малигнизированных гепатоцитов печени, способствуя реализации ее нормальных физиологических функций, и, отчасти сдерживая, тем самым, рост опухоли Следует учесть также что, во-первых, повышение экспрессии РПрл в клетках слизистого рака РС-1 индуцируется именно при внутрипеченочной трансплантации опухоли, по сравнению с подкожной Во-вторых, из литературы известно, что при подкожной трансплантации опухоли РС-1 скорость роста опухолевых узлов выше, а продолжительность жизни крыс ниже, чем при внутрипеченочной трансплантации Можно предположить, что ткань печени каким-то образом сдерживает развитие холангиокарциномы РС-1 Несмотря на различную направленность взаимовлияний в системе «опухоль-печень» в данных типах рака печени, наши результаты согласуются с мнением многих исследователей о важности микроокружения при росте и прогрессии опухолей разного типа

В клетках обеих типов опухолей выявтапись мРНК обеих изоформ РПрл Учитывая, что во внутрипеченочных трансплантатах гепатомы Н27 доля мРНК длинной изоформы РПрл увеличивается у животных обоих полов, при этом половая дифференцировка соотношения, характерная для нормальной печени исчезает, мы предполагаем, что в клетках гепатомы Н27 доля ДАК-8ТАТ каскада повышается, причем равномерно по всей клетке В культуре клеток гепатомы Н27 доминирует короткая изоформа РПрл, что явтяется подтверждением влияния ткани печени на опухоль Что касается экспрессии мРНК изоформ РПрл в опухоли РС-1, то достоверных отличий в экспрессии мРНК короткой изоформы РПрл не было выявлено у животных обоих полов, по сравнению с холангиоцитами нормальных крыс В то же время, экспрессия мРНК длинной изоформы РПрл возросла у самцов, но не у самок Таким образом, предполагается, что в опухолях РС-1 у самок повышается чувствительность к пролактину за счет небольшого и относительно

равномерного усиления экспрессии обеих изоформ РПрч В то же время, у самцов, чувствительность к пролактину возрастает главным образом за счет увеличения уровня длинной изоформы РПрл, обеспечивающей МК-5ТАТ сигнализацию

При внутрипеченочнои трансплантации Н27 и РС-1, а также при подкожной трансплантации, в случае РС-1, клетки опухолей, а также ткань печени, удаленная от опухоли сохранили половую дифференцировку, характерную для нормальных клеток соответствующего типа повышенную экспрессию РПрл у самок по сравнению с самцами В клетках Н27 гонадоэктомия животных продемонстрировала «классическую» для нормальных гепатоцитов гормональную регуляцию экспрессии РПрл Таким образом, мы предполагаем несомненное наличие рецепторов эстрогенов в гепагоме Н27 а также в холангиокарциноме РС-1 Известно, что риск опухолей печени, значительно выше у мужчин, чем у женщин Учитывая, что сигнальные пути эстрогенов и пролактина находятся в тесном перекрестном взаимодействии, полученный результат очень важен для понимания роли пролактина в зависимой от пола профессии опухолей печени

Таким образом, очевидно, что пролактин активно участвует в процессе гепатоканцерогенеза. В то же время, роль его как про- или антиоикогена остается не ясной, т к помимо пролиферативных сигналов, он способен одновременно запускать пути, сдерживающие пролиферацию, и в том числе вызванную им самим В любом случае, прояснение его роли в прогрессии опухолей печени позволит обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии опухолей печени в будущем, а РПрл -может служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия

выводы

1 У человека усиление экспрессии РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах при различных заболеваниях печени в целом преобладает у женщин и различается в зависимости от типа поражения печеночной ткани. В первичных опухолях печени разного клеточного происхождения наблюдается очень высокий уровень экспрессии РПрл

2 В случае внутрипеченочного трансплантата РС-1 возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином, в отличие от внутрипеченочного трансплантата Н27

3 Внутрипеченочные трансплантаты гепатомы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 характеризуются увеличенной экспрессией РПрл по сравнению с клетками печени интакгных животных, причем в случае РС-1 клетки опухоли интенсивно аккумулируют РПрл в ядрах

4 Характерная для нормальной печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобпаданием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах

5 Выявлены взаимовлияния опухолевых клеток Н27 и РС-1 и клеток печени реципиентов, которые заключаются в изменениях уровня и/или компартментализации РПрл как в опухолевых клетках, так и в клетках печени. Характер взаимовлияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента

6 Доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в случае РС-1 только у самцов, по сравнению с интактными животными Половая дифференцировка соотношения мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в клетках опухоли РС-1 не изменяется, по сравнению с холангиоцитами интакгных животных доля мРНК короткой изоформы РПрл у самок выше, чем у самцов

7 Высокий зависимый от пола уровень экспрессии РПрл и изменение путей сигнализации пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения может вносить существенный вклад в гепатоканцерогенез и служить базой для поиска новых путей фармакотерапии

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Смыслова В С , Ьогорад Р JI, Зенкова Т Ю , Смирнова О В Особенности экспрессии рецепторов пролаиина в печени человека при холестазе разной этиологии и развитии опухолевого процесса // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» выпуск 8 Тезисы - Москва-2001 —С 39

2 Зенкова Т Ю , Куликов А В , Богорад Р JI, Розенкранц А А , Платонова Л В , Шоно H И, Гальперин Э И, Смирнова О В Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печени человека при холестазе разной этиологии и вторичном раке печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2003 - Т 135 - № 6 - С 664-668

3 Zenkova Т , KulikovA V , SmislovaV S , Galperin E I, Smirnova О V Prolactin receptor (PRLR) of human liver manifestation under conditions of cholestasis of different etiology and metastatic tumor development // 11th United European Gastroenterology Week Gut Abstract book - Madrid - 2003 - V 52 - s VI - A178

4 Zenkova T Yu , Kulikov A , Bogorad R L , Smyslova V , Galperin E , Smirnova О V Prolactin receptor (PrlR) of human liver manifestation under conditions of cholestasis of different aetiology and metastatic tumor development // Biennial Scientific Meeting of the International Association for the Study of the Liver (IASL) Liver International Abstract book - 2004 - V 24 s 4 - P 18-19

5 Зенкова TIO, Курашова О A , Смирнова О В Особенности экспрессии рецептора пролактина в клетках гепагомы 27 после инокуляции в печень крыс разного нола // Тезисы к докладу 3-го Российского конгресса по патофизиологии Дизрегуляционная патология органов и систем - Москва -2004-С 245

6 Ostroukhova Т Yu, Kulikov А V, Kurashova О А, Smirnova О V Ilyperexpression of prolactin receptor in two types of liver carcinoma cell lines after hepatic transplantation // Digestive Diseases Abstract book - 2005 - V 50, No 10 - P 1998

7 Остроухова T Ю , Кушнарева H С , Смирнова О В Особенности экспрессии рецепторов проаактина в клетках слизистого рака РС-1 крыс в зависимости от пола и места трансплантации // Научные труды I съезда физиологов СНГ Тезисы - Сочи, Дагомыс - 2005 - Т 2 - С 159

8 Остроухова Т10, Куликов А В, Розенкранц А А, Смирнова О В Гиперэкспрессия рецепторов пролактина при внутрипеченочной трансплантации клеток хочангиоцеллюлярного слизистого рака крыс РС-1 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2006 - Т 141 - №3 - С 341-344

9 Ostroukhova Т Yu, Kurashova О А, Rozenkrants А А, Smirnova О V Intrahepatic grafts of rat hepatocellular carcinoma H27 with sex dependent hyperexpression of prolactin receptors // Journal of Clinical Virology 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease Abstract book - Paris - 2006 - V 36 - P 179

10 Остроухова ТЮ, Курашева OA, Розенкранц А А, Смирнова OB Повышенная зависимая от пола экспрессия рецепторов пролактина при внутрипеченочной трансплантации клеток гепатомы Н27 крыс И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007 - Т 143 — С 276-279

11 Smirnova О V , Ostroukhova Т Yu, Bogorad R L JAK-STAT pathway in carcinogenesis, is it relevant to cholangiocarcinoma progression'' // World Journal of Gastroenterology - 2007 - V 13 - P 6478-6491

Подписано в печать 19 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 83 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autorefeiat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Остроухова, Татьяна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. РОЛЬ ПРОЛАКТИНА И ЕГО РЕЦЕПТОРОВ В РАЗВИТИИ

ОПУХОЛЕВЫХ ПРОЦЕССОВ (обзор литературы).

1.1. ПРОЛАКТИН И ЕГО ФУНКЦИИ.

1.1.1. Общие положения.

1.1.2. Секреция пролактина.

1.1.3. Функции пролактина.

1.2. РЕЦЕПТ(ОРЫ ПРОЛАКТИНА И РЕАЛИЗАЦИЯ ЕГО ЭФФЕКТОВ.

1.2.1. Особенности строения рецептора пролактина.

1.2.2. Строение гена рецептора пролактина и его транскрипция.

1.2.3. Сравнительный анализ изоформ рецептора пролактина млекопитающих и механизмы их образования.

1.2.4. Механизм проведения сигнала пролактина через собственные рецепторы.

1.2.4.1. Активация рецепторов.

1.2.4.2. Передача биологического сигнала внутрь клетки.

1.2.4.3. Негативная регуляция запускаемой пролактином внутриклеточной сигнализации.'.

1.2.4.4. Терминация рецепторного цикла.

1.2.4.5. Роль короткой и длинной изоформ РПрл в проведении сигнала.

1.2.5. Регуляция экспрессии мРНК рецептора пролактина.

1.2.5.1. Уровень рецепторов пролактина. Регуляция транскрипции.

1.2.5.2. Регуляция альтернативного сплайсинга пре-мРНК РПрл, соотношения короткой и длинной изоформ РПрл.

1.3. РОЛЬ ПРОЛАКТИНА В РАЗВИТИИ ОПУХОЛЕЙ.

1.3.1. Общая характеристика опухолей и опухолевого процесса.

1.3.2. Аутокринная регуляция роста опухолей различных типов тканей.

1.3.3. Особенности экспрессии РПрл в опухолях различных типов тканей.

1.4. ДЕЙСТВИЕ ПРОЛАКТИНА НА ПЕЧЕНЬ.

1.4.1. Структура и функции печени.

1.4.1.1. Строение печени и ее клеточный состав.

1.4.1.2. Физиологические функции печени. Участие различных клеточных элементов в осуществлении этих функций.

1.4.1.3. Функции клеток печени при развитии холестаза. Общая характеристика холестаза.

1.4.1.4. Функции клеток печени при развитии опухолей печени.

1.4.1.4.а Характеристика различных типов опухолей печени и их гистологических особенностей.

1.4.1.4.6 Особенности экспрессии некоторых маркеров, а также основные метаболические нарушения в опухолях печени.

1.4.1.4.В Особенности экспрессии некоторых сигнальных соединений и рецепторов в опухолях печени.

1.4.2. Механизмы действия пролактина на печень.

1.4.2.1. Действие пролактина на гепатоциты.

1.4.2.2. Действие пролактина на холангиоциты.

1.4.3. Экспрессия РПрл в печени в норме и при различных патологических состояниях.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ.

2.1.1. Биопробы печени человека.

2.1.2. Животные.

2.1.2.1. Экспериментальные группы.!.60 <

2.1.2.2. Обоснование контрольной группы.

2.1.3. Штаммы опухолевых клеток.

2.2. МАТЕРИАЛЫ.!.

2.2.1. Реактивы.

2.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

2.3.1. Хирургические операции.

2.3.1.1. Подкожное поддержание штаммов опухолей.

2.3.1.2. Внутрипеченочная перевивка штаммов опухолей.

2.3.1.3. Кастрация самцов.

2.3.1.4. Овариэктомия самок.

2.3.2. Приготовление перпаратов клеток и тканей для анализа.

2.3.2.1. Подготовка тканей для иммуногистохимического анализа.

2.3.2.2. Подготовка ткани печени для ПЦР-анализа.

2.3.2.3. Дифференциальное выделение гепатоцитов и холангиоцитов.

2.3.2.3.1. Общие стадии разделения клеток печени.

2.3.2.3.2. Выделение гепатоцитов.

2.3.2.3.3. Выделение холангиоцитов.

2.3.2.3.4. Проверка качества выделения клеток.

2.3.3. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина в срезах печени человека и крысы.

2.3.3.1. Приготовление срезов.

2.3.3.2. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина.

2.3.4. Полуколичественное цитофотометрическое определение интенсивности РПрл-позитивного окрашивания.

2.3.4.1. Получение микрофотографий срезов.

2.3.4.2. Подбор интенсивности освещения.

2.3.4.3. Компьютерный анализ интенсивности РПрл-позитивного окрашивания изображений срезов.

2.3.4.4. Измерения клеточных структур.

2.3.4.5. Полуколичественный анализ внутриклеточной относительной концентрации РПрл.

2.3.4.6. Проверка на нормальность распределения.

2.3.5. Выделение РНК из тканей и изолированных клеток.

2.3.6. Обработка РНК ДНКазой 1.74'

2.3.7. Синтез первой цепи кДНК.

2.3.8. Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green 1.

2.3.9. Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ) с использованием зондов TaqMan.

2.3.10. Полимеразная цепная реакция.

2.3.11. Определение стабильности экспрессии мРНК ß-актина как гена внутреннего контроля.

2.3.11.1. Определение порогового цикла Ct.79'

2.3.11.2. Определение эффективности амплификации.

2.3.11.3. Определение стабильности экспрессии мРНК гена ß-актина с помощью программы В estKeeper.

2.3.11.4. Обоснование правомерности нормирования уровней экспрессии генов в разных экспериментальных группах по ß-актину.

2.3.12. Определение относительного количества мРНК изоформ рецептора пролактина и их соотношения с использованием внутреннего контроля и нормирования при помощи калибратора.

2.3.13. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА.

3.1. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЖЕЛЧНОКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ И ХОЛЕСТАЗЕ РАЗНОЙ ЭТИОЛОГИИ.

3.2. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В

ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВТОРИЧНОМ РАКЕ ПЕЧЕНИ.

3.2.1. Гистологические особенности опухолевых образований и печени человека при вторичном раке печени.

3.2.2. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печени человека при вторичном раке печени.

3.3. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА ПРИ ПЕРВИЧНЫХ ОПУХОЛЯХ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА.

3.3.1. Гистологические особенности опухолевых образований и печени человека при доброкачественных опухолях печени.

3.3.2. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в доброкачественных опухолях печени.

3.3.3. Гистологические особенности опухолевых образований и печени человека при гепатоцеллюлярной карциноме.

3.3.4. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцеллюлярной карциноме.

3.3.5. Гистологические особенности опухолевых образований и печени человека при холангиоцеллюлярной карциноме.

3.3.6. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в холангиоцеллюлярной карциноме.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В

КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ.

4.1. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ.

4.1.1. Экспрессия рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах интактных крыс.

• 4.2. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ мРНК ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРОВ

ПРОЛАКТИНА И ИХ СООТНОШЕНИЯ.

4.2.1. Экспрессия мРНК изоформ рецепторов пролактина и их соотношения в гепатоцитах и холангиоцитах интактных крыс.

4.2.2. Экспрессия мРНК изоформ рецепторов пролактина и их соотношения в печени интактных крыс.

4.3. ЭКСПРЕССИЯ мРНК ПРОЛАКТИНА В ИЗОЛИРОВАННЫХ

ХОЛАНГИОЦИТАХ ИНТАКТНЫХ КРЫС.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ ГЕПАТОМЫ Н27 КРЫС.

5.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВНУТРИПЕЧЕНОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ГЕПАТОМЫ Н27.

5.1.1. Гистологические особенности внутрипеченочной опухоли Н27.

5.1.2. Особенности экспрессии мРНК основных маркеров печеночных клеток -глюкозо-6-фосфатазы и цитокератина 19 в клетках гепатомы Н27.

5.1.3. Особенности экспрессии мРНК пролактина в клетках гепатомы Н27.

5.2. ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ ОПУХОЛИ И НАТИВНОЙ ТКАНИ ПРИ ВНУТРИПЕЧЕНОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕПАТОМЫ Н27.

5.2.1. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в клетках гепатомы Н27 и нативной ткани печени у животных с интактными гонадами.

5.2.2. Особенности экспрессии рецепторов'пролактина в клетках гепатомы Н27 у гонадоэктомированных животных.

5.3. ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ мРНК ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРОВ

ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ ГЕПАТОМЫ.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ ХОЛАНГИОЦЕЛЛЮЛЯРНОГО СЛИЗИСТОГО РАКА КРЫСЫ РС-1. t

6.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВНУТРИПЕЧЕНОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА PC-1.

6.1.1. Гистологические особенности внутрипеченочной опухоли РС-1.

6.1.2. Особенности экспрессии мРНК основных печеночных маркеров - глюкозо-6-фосфатазы и цитокератина 19 в клетках опухоли РС-1.

6.1.3. Особенности экспрессии мРНК пролактина в клетках опухоли РС-1.

6.2. ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА ВО ВНУТРИПЕЧЕНОЧНЫХ

И ПОДКОЖНЫХ ТРАНСПЛАНТАТАХ РС-1.

6.2.1. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в клетках опухоли РСпри внутрипеченочной трансплантации.

6.2.2. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в клетках холангиокарциномы РС-1 при подкожной трансплантации.

6.3. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ мРНК ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА И ИХ СООТНОШЕНИЯ В КЛЕТКАХ ОПУХОЛИ РС-1.

6.4. ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УДАЛЕННОСТИ ОТ ОЧАГА ОПУХОЛИ РС-1.

6.4.1. Гистологические особенности окружающей и нативной ткани при внутрипеченочной опухоли PC-1.

6.4.2. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печеночной ткани при внутрипеченочной опухоли PC-1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения"

Болезни печени включают в себя обширную полиэтиологическую группу заболеваний человека, в которую входят такие поражения печени как холецистит, холелитиаз, печеночноклеточная недостаточность, гепатиты, цирроз и опухоли печени. Эти заболевания приводят как к значительному ухудшению качества жизни пациентов, так во многих случаях и к смерти. В разных странах злокачественные новообразования печени составляют от 2% до 50% всех опухолей, и при этом доля их постоянно увеличивается (Aguayo and Patt, 2001, Patel, 2002, Slattery and Sahani, 2006). За последние десятилетия уровень смертности от рака печени также растет, при этом данный тип заболевания наиболее трудно диагностируется и плохо поддается лечению.

Пролактин, гормон передней доли гипофиза; регулирует широкий спектр функций различных типов клеток, и может секретироваться местно как аутокринный регулятор многих типов клеток, включая опухолевые (Bole-Feysot et al., 1998, Clevenger et al., 2003). В организме млекопитающих пролактин участвует в регуляции роста, дифференцировки, размножения, метаболизма; поведения, иммуномодуляции и осморегуляции (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин является также важным регулятором функций печени, где он индуцирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов (Орлова с соавт, 19996, Piccoletti et al, 1997, Orlova et al, 1998, Smirnova and Orlova, 1999), регулирует рост и дифференцировку гепатоцитов (Розен и др., 1991, Zabala and Garcia-Ruiz, 1989, Crowe et al, 1991, Berlanga et al, 1995), осуществляет соматогенные эффекты (Murphy et al, 1988), регулирует обмен и экзокринные функции гепатоцитов (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин реализует свои эффекты, взаимодействуя с рецепторами (РПрл), относящимися к семейству рецепторов цитокинов (Смирнов, 2006). У млекопитающих описано несколько функционально различных изоформ РПрл, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (Bole-Feysot et al., 1998). Длинная изоформа РПрл опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), главным образом STAT5 (Bole-Feysot et al., 1998). Короткие изоформы РПрл традиционно считаются негативными регуляторами JAK2/STAT5 сигнализации, т.к. не способны активировать STAT5 белки. С другой стороны, эффекты коротких изоформ РПрл связывают с тканеспецифическими сигналами пролактина (Duan et al, 1997, Nokelainen et al, 1998,

Russell and Richards, 1999). При этом функциональные особенности действия пролактина на клетки определяются типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ РПрл, характерным для данной ткани.

Печень является одной из центральных мишеней пролактина, и экспрессия РПрл в ней находится на высоком уровне, а также зависит от пола: у особей женского пола уровень РПрл выше, чем у мужского (Розен В.Б., 1991, Smirnova et al., 1994). Хорошо известно, что опухолевые процессы в печени характеризуются увеличенной пролиферацией различных клеток печени, изменением соотношения ее клеточных элементов, структуры печеночной дольки и, как следствие, нарушением сложной и многогранной функции печени. В литературе встречаются данные, полученные на человеке и животных, которые свидетельствуют- о повышении экспрессии РПрл в клетках печени и изменении их компартментализации, в частности появлении интенсивной экспрессии" РПрл в ядрах клеток, в условиях активной* пролиферации1 (Орлова и др., 1998, Смирнова и др., 1998, Garcia-Caballero, 2000). А. в последнее время, появились прямые и косвенные доказательства того, что появление рецепторов некоторых факторов роста и цитокинов, в частности, рецепторов родственного пролактину гормона роста, коррелирует с пролиферативным статусом клеток, и конститутивной активацией JAK/STAT пути (Mertani et al., 2003, Conway-Campbell et al., 2007). С другой стороны, роль пролактина в процессе гепатоканцерогенеза остается не изученной.

Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование особенностей экспрессии рецепторов пролактина в опухолях различных типов.клеток печени человека1 и крыс, как основы для оценки вклада пролактина в развитие этих, опухолей.

Для реализации поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:

1. Сравнить характер экспрессии РПрл в печени человека при различных заболеваниях печени, таких как холецистит, обструктивный холестаз разной этиологии, первичные и- вторичные опухоли печени, для определения объектов дальнейших экспериментальных исследований на моделях животных. Демонстрация! того, что в первичных опухолях разных типов клеток печени человека, а также в удаленной от опухоли ткани печени, выявляются значимые изменения как уровня экспрессии РПрл, так и их компартментализации, позволило нам выбрать для дальнейших исследований два типа, опухолей печени крыс разного клеточного происхождения: перевиваемые линии гепатоцеллюлярного рака Н27 и холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, и сформулировать дальнейшие задачи:

2. Охарактеризовать экспрессию мРНК основных маркеров разных типов клеток печени и возможность секреции пролактина в клетках печеночных трансплантатов перевиваемых опухолей печени Н27 и РС-1 крыс.

3. Оценить интенсивность экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1.

4. Исследовать характер компартментализации РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака PC-1.

5. Проанализировать зависимость от пола экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и PC-1.

6. Изучить взаимное влияние клеток опухолей и клеток окружающей ткани'на экспрессию и характер компартментализации РПрл в ткани печени животного-реципиента.

7. Исследовать уровень мРНК РПрл и соотношение ее изоформ в клетках гепатомы Н27 и слизистого рака PC-1.

В результате проведенного исследования установлено, что у человека уровень экспрессии РПрл в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения находится на очень высоком уровне. Внутрипеченочные трансплантаты гепатоцеллюлярной карциномы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 крыс, представляющие собой животные модели разных типов рака печени, также характеризуются повышенной экспрессией РПрл, по сравнению с клетками печени интактных животных. Обнаружено, что в; клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1, в отличие от Н27, возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином. Показано, что внутрипеченочные трансплантаты холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуются интенсивной аккумуляцией РПрл в ядрах клеток. Было выявлено также, что характерная для печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобладанием у самок сохраняется»как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах. Данная тенденция в целом наблюдается и у человека при различных заболеваниях печени. В клетках гепатомы Н27 при внутрипеченочной трансплантации выявляется «классическая» для нормальных гепатоцитов гормональная регуляция экспрессии РПрл, позитивно зависимая от эстрогенов, и негативно - от андрогенов. Кроме того, присутствие внутрипеченочного трансплантата опухолей Н27 или РС-1 в значительной степени влияет на окружающие и удаленные от опухоли ткани, а характер влияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента, при этом аналогичные данные получены и на человеке. Показано, что ткань печени значительно влияет на опухоль в зависимости от ее типа: в случае РС-1 индуцирует увеличение экспрессии РПрл и аккумуляцию их в ядрах опухолевых клеток, а в опухоли Н27 у животных обоих полов индуцирует увеличение доли мРНК длинной изоформы РПрл, при сравнении с культурой клеток гепатомы Н27. Установлено, что доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1 - только у самцов, по сравнению с печенью интактпых животных.

В проведенной работе наглядно продемонстрирована возможность и важность участия пролактина в патогенезе различных типов заболеваний и опухолей печени человека и крыс; установлена половая дифференцировка экспрессии РПрл в опухолях печени; показано также взаимовлияния опухоли и ткани печени. Результаты исследования позволяют обосновать новые подходы для зависимой от пола терапии опухолей печени, а также возможности использования признака ядерной аккумуляции РПрл при диагностике холангиокарциномы, и лечения этого заболевания с помощью лекарств на основе прямой ядерной доставки в клетки опухоли.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Остроухова, Татьяна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. У человека усиление экспрессии РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах при различных заболеваниях печени в целом преобладает у женщин и различается в зависимости от типа поражения печеночной ткани. В первичных опухолях печени разного клеточного происхождения наблюдается очень высокий уровень экспрессии РПрл.

2. В случае внутри печеночного трансплантата РС-1 возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином, в отличие от внутрипеченочного трансплантата Н27.

3. Внутрипеченочные трансплантаты гепатомы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 характеризуются увеличенной экспрессией РПрл по сравнению с клетками печени интактных животных, причем в случае РС-1 клетки опухоли интенсивно аккумулируют РПрл в ядрах.

4. Характерная для нормальной печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобладанием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах.

5. Выявлены взаимовлияния опухолевых клеток Н27 и РС-1 и клеток печени реципиентов, которые заключаются в изменениях уровня и/или компартментализации РПрл как в опухолевых клетках, так и в клетках печени. Характер взаимовлияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента.

6. Доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в случае РС-1 только у самцов, по сравнению с интактными животными. Половая дифференцировка соотношения мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в клетках опухоли РС-1 не изменяется, по сравнению с холангиоцитами интактных животных: доля мРНК короткой изоформы РПрл у самок выше, чем у самцов.

7. Высокий зависимый от пола уровень экспрессии РПрл и изменение путей сигнализации пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения может вносить существенный вклад в гепатоканцерогенез и служить базой для поиска новых путей фармакотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного нами исследования особенностей экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени человека, мы выявили, что особенно высокий уровень экспрессии РПрл в клетках печени наблюдается при обструктивном холестазе разной этиологии и в первичных опухолях печени. При этом в случае первичного рака печени разного происхождения наблюдались заметные нарушения гистологической структуры печеночной ткани. Кроме того, появление более интенсивной окраски ядер на РПрл по сравнению с цитоплазмой, отмечено в малигнизированных холангиоцитах. Мы предположили, что повышение чувствительности опухолей печени человека разного клеточного происхождения к пролакгину, может отражать многогранную роль пролактина в механизмах гепатоканцерогенеза: с одной стороны, как провоцирующего агента опухолевой прогрессии, с другой - как протекторного фактора. Таким образом, мы решили изучить особенности экспрессии РПрл в опухолях различных типов клеток печени на моделях перевиваемых опухолей двух типов у крыс, как основы для оценки вклада пролактина в развитие этих опухолей.

Гепатома Н27 и опухоль РС-1 представляют собой перевиваемые линии гепатоцеллюлярной и холангиоцеллюлярной слизистой карцином крыс, соответственно. Характеризуя данные типы опухолей при внутрипеченочною трансплантации с точки зрения экспрессии мРНК основных маркеров клеток печени, мы показали, что у самцов с внутрипеченочной опухолью Н27, изменение дифференцировки клеток опухоли Н27 происходит в большей степени, чем у самок, так как именно у самцов чаще экспрессируется цитокератин 19 - не характерный для гепатоцитов маркер. При этом, в образце первичной культуры гепатомы Н27 мРНК глюкозо-6-фосфатазы (маркера нормальных гепатоцитов) не обнаруживается, а цитокератина 19 - обнаруживается. Из литературных источников известно, что потеря специфических клеточных маркеров достаточно частое явление во многих типах опухолей, в том числе это относится и к экспрессии глюкозо-6-фосфатазы в гепатоцеллюрярных карциномах, и часто свидетельствует о дедифференцировке клеток опухоли (Gerber, Thung, 1980, Xu et al., 2001). Кроме того, экспрессия цитокератина 19 не только выявляется во многих злокачественных опухолях, в том числе в гепатоцеллюлярных карциномах, но и коррелирует со степенью злокачественности опухоли и худшим прогнозом для пациентов (Ali et al., 2006, Alsaad et al, 2007, Chen et al., 2007). С другой стороны, цитокератин 19, является одним из маркеров овальных клеток, пролиферация которых индуцируется в условиях, когда гепатоциты не могут по тем или иным причинам регенерировать (Alison and Lovell, 2005, Chiu et al., 2007). Как показано нами, дифференцировка клеток гепатомы Н27 в культуре изменена, и, можно предположить, что они «приближены» к стволовым клеткам печени - овальным клеткам. Ткань, печени, окружающая опухоль, вызывает индукцию «правильных» печеночных маркеров в большей степени у самок, т.е., возможно, что клетки печени, а также гормональный фон, могут быть в некотором плане протекторами, - сдерживающими факторами для развития опухоли Н27. Учитывая обнаруженные различия в половой дифференцировке экспрессии мРНК маркеров в гепатоме Н27, можно предположить, что выявленная «склонность» самцов экспрессировать цитокератин 19, как маркер наиболее злокачественного, роста, согласуется с данными статистики о более частом возникновении гепатоцеллюлярных опухолей у мужчин, по сравнению с женщинами (Acalovschi, 2004, Shimizu et al., 2007).

В-то же время, для холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 остается не совсем понятным, является ли повышенная экспрессия-цитокератина 19 у самцов по сравнению с самками, естественным явлением, характеризующим происхождение опухоли РС-1 из овальных клеток или холангиоцитов, или же маркером злокачественности, а увеличенная экспрессия^ глюкозо-6-фосфатазы у самок, -отражением изменения и/или повышения дифференцировки.

Как впервые обнаружено в нашей работе, клетки опухолей Н27 и РС-1 при* внутрипеченочной трансплантации характеризуются повышенной экспрессией РПрл по сравнению с гепатоцитами и холангиоцитами интактных животных и клетками других прол актин-чувствительных органов (Bole-Feysot et al., 1998). Наши исследования показали, что, по-видимому, эти изменения зависят от клеточного' происхождения опухоли и пола животного-реципиента, но роль и механизмы участия-пролактина в гепатоканцерогенезе могут быть объяснены двояко. Во-первых, участие пролактина в гепатоканцерогенезе, может определяться его ролью как проканцерогенного фактора. В литературе встречается множество примеров участия сигнального пути JAK-STAT, который запускается длинной изоформой РПрл, в прогрессии^ опухолей молочной железы, простаты, яичников, лейкозов (Gouilleux-Gruart et al., 1997, Gao et al., 2001, Garcia et al., 2001). Кроме того, показано, что гиперпролактинемия или локальная гиперэкспрессия пролактина в клетках молочной железы и простаты приводит к гиперплазии этих желез, и может рассматриваться как фактор риска возникновения рака молочной железы, и, возможно, и рака предстательной железы (Kindblom et al., 2003, Manhes et al., 2005, Harvey et al., 2006,

Т\уого§ег е1 а1., 2007). Мы выявили увеличение экспрессии мРНК именно длинной изоформы РПрл в опухоли РС-1 у самцов, по сравнению с холангиоцитами нормальных крыс, что говорит об активации сигнального пути .ГАК-БТАТ в данной опухоли. У самок экспрессия мРНК обеих изоформ увеличилась недостоверно, но суммарное количество мРНК РПрл несколько возросло. Мы не смогли выявить достоверных изменений соотношения изоформ в слизистом раке РС-1 у животных обоего пола по сравнению с холангиоцитами интактных животных. В то же время половая дифференцировка соотношения изоформ РПрл сохранялась. Поэтому, также как в холангиоцитах интактных животных, у самцов доминирующей остается длинная изоформа РПрл, а у самок - короткая, ответственная с одной стороны за негативную регуляцию сигналов, проводимых длинной изоформой РПрл, а с другой стороны, за проведение тканеспецифических сигналов пролактина. В то же время, незначительное увеличение содержания обеих изоформ РПрл у самок в опухоли РС-1 по сравнению с нормальными холангиоцитами, но при этом усиление экспрессии РПрл на уровне белка, говорит о том, что в опухоли могут действовать посггрансляционные механизмы, обеспечивающие гиперпродукцию рецептора, которые также вносят вклад в формирование ответа опухолевых клеток на пролактин. В-клетках Н27 в отличие от опухоли РС-1, соотношение уровней короткой и длинной изоформ РПрл достоверно снижается. Вероятно, это связано с тем, что в клетках гепатомы Н27 РПрл способен, в большей степени, чем в нормальных гепатоцитах, запускать основной каскад 1АК-БТАТ, обладающий возможно пролиферативным действием. А за счет усиленной, хотя и равномерно распределенной по клетке, экспрессии РПрл в малигнизированных гепатоцитах, этот эффект может быть гипертрофирован, особенно в слабо1 дифференцированных центральных опухолевых клетках Н27. Таким образом, 1АК-БТАТ каскад - может принимать участие в прогрессии обеих исследованных нами опухолей, хотя вклад этого пути и особенности его реализации видимо различаются. В клетках гепатомы Н27 сигнальный путь -ГАК-ЭТАТ равномерно усиливается у животных обоих полов, а в клетках РС-1 - только у самцов.

В пользу проканцерогенного действия пролактина говорит и выявленная у животных с внутрипеченочным холангиоцеллюлярным слизистым раком РС-1 мощная ядерная аккумуляция РПрл, которая обнаружена также у одной из женщин с высокодифференцированной холангиокарциномой. В настоящее время все большее количество разнообразных сигнальных молекул и их рецепторов обнаруживается именно в ядрах клеток, в том числе тех, которые связаны с каскадом 1АК-8ТАТ или 8ТАТ-опосредованной передачей сигнала. В то время как мембранная сигнализация характерна для нормальных, не пролнфератнвных условий, то ядерная, -ассоциирована с высоким пролиферативным статусом и малигнизацией клеток (Smirnova, 2000, Lin et al., 2001, Grasl-Kraupp et al., 2002, Ur et al., 2002, Lo et al., 2005, Lo and Hung, 2006, Lo et al., 2006a, Lo et al., 20066). Например, ядерная локализация рецептора EGF - ErbBl, характерна для пролиферирующих тканей, таких как регенерирующая печень, клеточные линии рака и образцы первичных опухолей, и негативно коррелирует с выживаемостью больных раком молочной железы (Lo et al., 2006а, Lo et al., 20066). Ядерный пул ErbBl ко-локализуется и взаимодействует с импортинами aip 1, - белками, ответственными за транспорт макромолекул в ядра клеток (Lo et al., 2006а). В случае родственного пролактину гормона роста была показана (как in vivo, так и in vitro), прямая корреляция .между ядерной локализацией рецептора и высокой степенью пролиферации, дизрегуляцией сигналов, останавливающих пролиферацию клеток, и индукцией прогрессии клеточного цикла (Mertani et al., 2003, Conway-Campbell, 2007). Все эти процессы сопровождались конститутивной активацией белков STAT5 и, в конечном счете, приводили к онкогенезу. В* случае опухоли РС-1 также возможно прямое пролиферативное действие пролактина на ядра' клеток опухоли, опосредованное образованием внутриядерного комплекса пролактин/циклофиллин В, индуцирующего Stat5-зависимую экспрессию' генов, как это было показано для клеток №>2-лимфомы, (Смирнова, 1999, Rycyzynand Clevenger, 2002). Таким образом, мы предполагаем, что ядерная аккумуляция РПрл в клетках РС-1 отражает высокий пролиферативный статус данной опухоли. Увеличение уровня длинной изоформы РПрл в холангиокарциноме РС-1 у самцов согласуется с данными статистики о более частом' возникновении холангиоцеллюлярного рака у мужчин по сравнению с женщинами (Acalovschi, 2004). В случае гепатомы Н27, очевидно, что прямой ядерный путь действия'пролактина не является главным-, т.к. экспрессия РПрл в ядре и цитоплазме опухолевых клеток одинакова.

В последнее время в литературе накапливаются данные об аутокринной стимуляции роста и прогрессии различных типов опухолей, в том числе опухолей печени. Аутокринная стимуляция пролиферации клеток была показана для IL-6, TNF, TGFp, HGF/c-met, Erb, эритропоэтина, лептина и пролактина (Abou-Shady et al., 1999, Sirica et al., 2001, Clevenger et al., 2003, Hardee et al., 2006, Sulkowska et al., 2006). Например, было показано аутокринное усиление степени инвазивности клеточной линии асцитной гепатомы под действием HGF (Miura et al., 2003). Обнаружена аутокринная стимуляция пролиферации клеток линии холангиоцеллюлярного рака интерлейкином-6 (IL-6) (Park et al., 1999). В молочной железе in vitro и in vivo выявлена аутокринная регуляция роста и пролиферации как нормальных, так и опухолевых клеток пролактином (Clevenger et al., 1995, Clevenger et al., 2003). Мы обнаружили экспрессию мРНК пролактина в нескольких образцах ткани опухоли РС-I, при этом из них лишь у одной самки крысы, и предположили наличие аутокринного компонента регуляции роста опухоли РС-1. Полученные результаты не представляются нам удивительными, т.к. в нормальных холангиоцитах, но не гепатоцитах самок крыс, ранее была показана очень низкая базальная! экспрессия мРНК и белкового продукта гена пролактина, которая возрастала в условиях роста и пролиферации клеток желчных протоков - при обструктивном холестазе (Taffetani- S. et al., 2007). В нашем исследовании в некоторых случаях также была зарегистрирована экспрессия мРНК пролактина' в изолированных холангиоцитах интактных самцов и самок крыс. Тот факт, что экспрессия мРНК пролактина обнаруживалась не во*всех образцах изолированных холангиоцитов, вероятно, и свидетельствует о низком уровне экспрессии пролактина клетками желчных протоков в данном физиологическом состоянии. Поэтому в малигнизированных холангиоцитах, наличие и повышение экспрессии мРНК пролактина возможно как продолжение функций нормальных холангиоцитов, а также отражение их активного состояния и. пролиферативного статуса. В литературе есть данные о том, что аутокринная секреция пролактина и. последующая активация JAK2, в клетках линий рака молочной железы человека, является одним из важнейших условий конститутивного фосфорилирования ЕгЬВ2. Последний, при фосфорилировании может ассоциироваться с Grb2 и запускать Ras-МАР-киназный каскад, приводящий к- неограниченной клеточной пролиферации (Yamauchi et al., 2000).

В нашей работе продемонстрирована половая дифференцировка экспрессии РПрл в опухолях Н27 и РС-1, с преобладанием ее у самок. В клетках гепатомы Н27 при внутрипеченочной трансплантации выявляется «классическая» для нормальных гепатоцитов гормональная регуляция экспрессии РПрл, позитивно зависимая- от эстрогенов, и негативно - от андрогенов. Таким образом, мы предполагаем несомненное наличие рецепторов эстрогенов в гепатоме Н27, а также в холангиокарциноме РС-1. В литературе отражены данные о тесных перекрестных взаимодействиях эстрогенов и пролактина (de Castillo et al., 2004, Dong et al., 2006). В различных тканях человека, в том числе в печени, эстрадиол, действуя через а-рецептор, активирует промотор Ш гена РПрл у человека. Кроме того, эстрогены увеличивают, а тамоксифен - антагонист эстрогенов, снижает экспрессию мРНК РПрл в опухолях молочной железы и некоторых других тканях (de Castillo et al., 2004, Leung et al., 2004, Dong et al., 2006). Вместе с тем, пролактин также может стимулировать экспрессию а- и ß-рецепторов эстрогенов, и предполагаемые STAT5a- и STAT5b-чувствительные элементы были найдены в промоторах генов этих рецепторов (Frasor and Gibori, 2003). Из литературы известно, что холангиоциты нормальных животных и гепатоциты животных и человека экспрессируют а- и ß- рецепторы эстрогенов (Alvaro et al., 2002, Alvaro et al., 20066, Shimizu et al., 2007). В условиях злокачественной пролиферации в малигнизированных холангиоцитах экспрессия данных типов^ рецепторов может быть значительно увеличена и в ядре, и в цитоплазме у особей обоего пола, а также нарушено их соотношение в сторону увеличения доли а-рецепторов. Аналогичные данные получены и для гепатоцеллюлярных карцином (Waalkes et al., 2004). Именно для a-рецепторов эстрогенов показано, что они потенцируют злокачественный рост в культурах клеток человеческих холангиокарцином (Alvaro et al., 2006). Кроме того, в некоторых случаях у пациентов со злокачественными опухолями печени регистрируется повышение сывороточной концентрации эстрогенов в крови (Kuper et al., 2001). Таким образом, такое перекрестное взаимодействие сигнальных путей эстрогенов и пролактина может приводить к регуляции и усилению эстрогенами пролактин-индуцированного каскада JAK-STAT в опухолях печени.

Итак, приведенные выше факты свидетельствуют о том, что пролактин может быть проканцерогенным фактором в гепатоканцерогенезе, при этом основные пути проведения потенцирующих рост опухолей сигналов в случае Н27 и РС-1 различаются: для РС-1 важен ядерный путь сигнализации, а для Н27 - относительное увеличение экспрессии длинной формы РПрл и возможное перекрестное усиление сигналов пролактина и эстрогенов.

С другой стороны, помимо пролиферативных сигналов, пролактин способен одновременно запускать пути, сдерживающие пролиферацию, в том числе вызванную им самим.

Известен альтернативный сигнальный, антипролиферативный путь, зависящий от пролактина. Обнаружено, что в клетках молочной железы мышей пролактин с помощью JAK2, локализованной в ядре, способен активировать ядерный транскрипционный фактор NF1-C2, который, в свою очередь, активирует ген опухолевой супрессии р53 (Johansson et al., 2003, Johansson et al., 2005, Nilsson et al., 2006). Белок p53, по механизму отрицательной обратной связи, также способен подавлять индуцированную цитокинами 8ТАТ5-опосредованную транскрипцию генов

Fritsche et al., 1998). Учитывая гиперэкспрессию РПрл в ядрах клеток холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, можно допустить реализацию подобного антитуморогенного действия пролактина в данной опухоли. В случае гепатомы Н27 оно также теоретически возможно, но реализуется в меньшей степени.

Другой механизм негативного контроля проведения сигналов пролактина связан с белками семейства SOCS (супрессоров цитокинной сигнализации) (Смирнов,

2006). SOCS1 способен связываться с JAK2 и ингибировать ее фосфорилирование, а также стимулировать ее убиквитинилирование и протеосомную деградацию комплекса РПрл/.1АК2/80С81; SOCS2 может, с одной стороны, блокировать ингибиторный эффект SOCS1 и SOCS3, а с другой, также как SOCS3 - ослаблять проведение сигнала от РПрл (Freeman et al., 2000, Dif et al., 2001, Ali et al., 2003, Sutherland et al., 2007). Некоторыми авторами показано, что а- рецепторы эстрогенов могут ослаблять запускаемый пролактином сигнальный путь JAK-STAT, за счет усиления экспрессии SOCS2 и SOCS3 на уровне транскрипции (Bjornstrom et al., 2001, Faulds et al., 2001, Leong et al., 2004, Leung et al., 2004). Таким образом, описанное выше перекрестное взаимодействие сигнальных путей эстрогенов и пролактина может вызывать, в конечном итоге, обратную ситуацию - снижение пролиферативных сигналов в опухоли у самок в большей степени, чем у самцов, в случае высокого уровня данных гормонов у самок, т.е. пролиферативные сигналы в опухолях у самцов реализуются в большей степени. Более того, в настоящее время показано,1 что эстрогены являются протекторными факторами гепатоцитов при различных заболеваниях печени, в том числе при гепатоцеллюлярных карциномах (Shimizu et al.,

2007). Для воспалительных процессов в печени, которые в конечном^ итоге могут вызвать фиброз и предрасполагают к онкогенезу, характерно образование агентов, повреждающих мембраны печеночных клеток. Эти процессы сопровождаются окислительным стрессом, т.е. вызывают образование реактивных форм кислорода. Все это приводит, в конечном итоге, к формированию «порочного» круга. Реактивные формы кислорода активируют звездчатые клетки в сторону выработки TNFß, который аутокринным путем снова вызывает образование реактивных форм кислорода>и TNFß, а также стимуляцию выработки коллагена. Bs конечном1 итоге, внутренние антиоксидантные механизмы клеток печени истощаются, усиливается* повреждение гепатоцитов и их генетического материала. Эстрогены в данных условиях выступают как мощные антиоксиданты, снижающие окислительный стресс (Shimizu et al., 2007). Таким образом, это также может быть одной из причин более частого возникновения гепатоцеллюлярного и холангиоцеллюлярного рака печени' у мужчин, при этом пролактин может потенциировать антиокеидантное и протекторное действие эстрогенов.

С другой стороны, возможен и другой сценарий событий: пролактин может выступать антиканцерогенным фактором лишь при условии «правильной» работы других генов, участвующих в клеточной сигнализации. Например, антипролиферативный путь через указанное выше усиление экспрессии SOCS, за счет активации а- рецепторов эстрогенов, которые экспрессируются во многих случаях в гепатоцеллюлярных и холангиоцеллюлярных карциномах, может быть неэффективен. На тканях опухолей и на культурах гепатоцеллюлярных карцином человека было показано, что в некоторых случаях выявляются участки аберрантного метилирования гена SOCS3, что приводит к полному или частичному подавлению его экспрессии (Niwa et al., 2005). В результате этого JAK-STAT-каскад не подавляется, а стимулирует дальнейший рост и миграцию опухолевых клеток. Кроме того, описанный выше антипролиферативный каскад, запускаемый пролактином, с участием ядерного транскрипционного фактора NF1-C2 и гена опухолевой супрессии р53, может быть блокирован мутациями гена р53, которые нередко возникают как в гепатоцеллюлярных, так и в холангиоцеллюлярных карциномах (Chen et al., 2002, Cheung et al., 2002, Farazi et al., 2006, Liu et al., 2006).

В нашей работе продемонстрированы взаимовлияния^ опухоли и ткани печени, как у человека, так и у крыс. Ткань печени, окружающая гепатому Н27 при ее внутрипеченочной трансплантации, индуцирует мощное увеличение доли мРНК длинной изоформы РПрл по сравнению с культурой клеток гепатомы Н27. С другой стороны, присутствие внутрипеченочного трансплантата гепатомы Н27 снижает интенсивность экспрессии РПрл в клетках ткани печенш у самцов, но не влияет у самок, по сравнению с интактными животными. В случае опухоли РС-1 показано, что у самок, по сравнению с самцами, клетки опухоли увеличены, изменение дифференцировки по главным печеночным маркерам усилено, а ткань, окружающая опухоль, вакуолизирована. На первый взгляд, именно у самок опухоль и печеночная ткань подвержены повреждению в большей степени, чем у самцов. С другой стороны, у самок ядерно-цитоплазматическое соотношение ниже, чем у самцов, что может отражать меньшую степень пролиферации клеток. Присутствие внутрипеченочного трансплантата РС-1 индуцирует увеличение экспрессии РПрл, а также аккумуляцию их в ядрах гепатоцитов окружающей и удаленной от опухоли ткани у животных обоих полов. Реакция ткани печени в виде увеличения экспрессии РПрл, причем тем больше, чем удаленнее от опухолевого узла, в незатронутой опухолью ткани наблюдается также и у человека, причем независимо от того, первичной или вторичной является опухоль. Ткань печени, в свою очередь, также влияет на интенсивность экспрессии РПрл в клетках РС-1: индуцирует гиперэкспрессию РПрл и аккумуляцию их в ядрах клеток при внутрипеченочной трансплантации, по сравнению с подкожной трансплантацией. Из литературы известно также, что при подкожной трансплантации опухоли РС-1 скорость роста опухолевых узлов выше, а продолжительность жизни* крыс ниже, чем при внутрипеченочной трансплантации (Трещалина и др., 2001). Таким образом, мы допускаем возможность сдерживающего влияния-клеток печени на рост опухоли. При этом пролактин может играть здесь важную протекторную роль. Предполагаемый сценарий событий может быть таким: пролактин стимулирует пролиферацию не малигнизированных гепатоцитов печени, и тем самым способствует реализации нормальных физиологических функций печени и поддержанию гомеостаза, в организме опухоленосителя. Данный механизм может в большей степени реализоваться у самок, в связи с более высоким уровнем РПрл в печени. В* случае гепатомы Н27 могут быть задействованы и другие процессы: например, осуществление протекторных функций пролактина за счет значительного увеличения доли длинной изоформы РПрл. Несмотря на различную направленность взаимовлияний в системе «опухоль-печень» в данных типах рака печени, наши результаты согласуются с мнением многих исследователей о важности микроокруженияпри росте и< прогрессии опухолей разного типа (Кандыба и др., 2002, Ricci, 2005, Budhu, Wang, 2006, Milsom et al., 2007). Исходя из данных о влиянии растущей опухоли на ткани печени, не следует, (как часто встречается во многих исследованиях) использовать ткань печени; не затронутой- опухолью, в качестве контрольной к ткани опухоли того же пациента.

Итак, пролактин проявляет себя как «двуликий» фактор. Мы предполагаем; что онкогенное или антионкогенное действие пролактина, с одной стороны, зависит от тонкого баланса пролиферативных или антипролиферативных внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых этим» гормоном, а с другой - от множества других, в том числе и индивидуальных факторов, характеризующих данный тип опухоли. Для того, чтобы сделать более точные выводы о роли пролактина в гепатоканцерогенезе, и определить «суммарный» эффект действия пролактина на развитие того или иного типа опухоли, нам кажется необходимым, на примере изученных опухолевых линий Н27 и РС-1, определить вклад как, минимум нескольких факторов, зависящих от данного гормона. Для гепатомьь Н27 нам кажется важным дальнейшее исследование уровня и соотношения экспрессии рецепторов эстрогенов, а также характера метилирования гена SOCS. Для холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 необходимо определить статус фосфорилирования ЕгЬВ2, а также наличие/ отсутствие мутаций гена р53.

Учитывая вышесказанное, можно предположить также, что пролактин на начальном этапе развития опухоли, играет регуляторную и отчасти сдерживающую пролиферацию опухолевых клеток роль, но в результате дисбаланса различных факторов и запускаемых ими каскадов, результат действия пролактина затем оказывается обратным, т.е. туморогепным. При этом степень выраженности пролиферативных каскадов пролактина, по-видимому, зависит как от типа опухоли, так и от пола животного-реципиента. Кроме того, мы предполагаем, что у самцов, канцерогенные пути более выражены, чем у самок. В любом случае, важность пролактина и запускаемых им сигнальных путей, в том числе каскада JAK-STAT в развитии гепатоцеллюлярного и холангиоцеллюлярного рака на примере опухолей Н27 и РС-1 кажется нам несомненной.

Нами показано, что для холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характерна ядерная аккумуляции РПрл не только в клетках опухоли, но и в ткани печени. Данная особенность может быть использована для диагностики - как маркер развития холангиокарциномы. Мы предполагаем также, что ядерная аккумуляция РПрл в клетках холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, а также в окружающих и удаленных от опухоли клетках печени, может отражать высокий пролиферативный статус данной опухоли. Выявленные признаки могут служить основой для поиска новых лекарств на основе прямой доставки их в ядра опухолевых клеток. Кроме того, обнаруженные закономерности экспрессии РПрл, зависящие от регуляции половыми гормонами, позволяют обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии опухолей печени в будущем, а РПрл - может служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Остроухова, Татьяна Юрьевна, Москва

1. Абрикосов А.И. и Струков А.И. Патологическая анатомия // М.: Медгиз- 1953, 1954-Т. 1, Т.2

2. Абрикосов А.И. Руководство по патологической анатомии // М.: Медгиз- 1957 Т.2

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф Б., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки // М.: Мир 1994 - Т.З

4. Ашмарин И.П. Элементы патологической физиологии и биохимии // М.: Издательство МГУ— 1997

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. // М: Практика- 1999

6. Иващенко Ю.Д. и Быкорез А.И. Полипептидные факторы роста и канцерогенез // К.: Наукова Думка 1990

7. Кандыба А.Г., Кобляков В.А., Козлов A.M., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Дятловицкая Э.В. Дигидроцерамиддесатуразная активность в опухолях // Биохимия 2002 - Т.67 - С.717-720

8. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии // М.: Высшая школа -1969-С. 174-175

9. Коган Е.А. Автономный рост и прогрессия опухолей // Рос. жур. гастроэнтер., гепат., колопрокт. 2002 - Т. 12 - №4 - С.45-49

10. Малюгина Л.Л. Перевиваемый альвеолярный слизистый рак печени крысы РС-1 // Анналы онкологии - 1958 - Т.4 - С.600-604

11. Масюк А.И. Молекулярные и клеточные механизмы желчеотделительной функции печени // Успехи физиол. наук 1990 - Т.21 - С. 18-35

12. Орлова А.Н., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Роль пролактина в регуляции некоторых функций клеток печени после перевязки общего желчного протока//Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1999а-Т. 127 -С.573-575

13. Орлова А.Н., Смирнова О.В., Туровецкий В.Б., Смирнов А.Н. Влияние ингибитора секреции пролактина бромокриптина на интенсивность экспрессии рецепторов пролактина в клетках общего желчного протока // Бюлл. эксп. биол. мед. -1998 - Т. 126 - №7 - С. 52-55

14. Орлова А.Н., Смирнова О.В., Туровецкий В.Б., Смирнов А.Н. Ядерная манифестация рецепторов пролактина в гепатоцитах крыс и влияние на нее пролактина // Бюлл. эксп. биол. мед. 19996 -Т. 127 - С.579-582

15. Осташкина Н.М., Дубовая Т.К., Кобляков В.А., Коновалова Г.Г., Панкин

16. B.З. Активность ферментов детоксикации в перевиваемой гепатоме 27 крыс в зависимости от органа трансплантации // Бюлл. эксп. биол. мед. 2000 - T.l 1 - С.577-580

17. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия // М.: Медицина- 1995 С.127-190

18. Петерсон Б.Е. Справочник по онкологии // М.: Медицина 1974

19. Подымова С.Д. Болезни печени // М.: Медицина 1998

20. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М.: Издательство МГУ 1994

21. Розен В.Б., Матарадзе Г.Д., Смирнова О.В., Смирнов А.Н. Половая дифференцировка функций печени // М.: Медицина 1991

22. Рубцов П.М. и Лонина Д.А. Гетерогенность 5'-нетранслируемой области мРНК рецептора пролактина печени крыс // Мол. Биол. 1996 - Т.30 - С.330-338

23. Рубцов П.М. Структура и экспрессия генов рецепторов гормона роста и пролактина// Вестник Акад. Мед. Наук 1994 - Т. 12 - С. 19-23

24. Смирнов А.Н. Элементы эндокринной регуляции // М.: ГЭОТАР-Медиа-2006

25. Смирнова О.В. Новый уровень трансдукции гормонального сигнала: прямой ядерный путь действия белково-пептидных гормонов // Биол. Мембр. 1999 -Т.16 - С.199-211

26. Смирнова О.В., Богорад Р.Л. Короткие формы мембранных рецепторов: образование и роль в проведении гормонального сигнала // Биохимия 2004 - Т.69 -С 437-450

27. Смирнова О.В., Петращук О.М., Смирнов А.Н. Индукция экспрессии рецепторов пролактина в холангиоцитах самцов и самок крыс после перевязки общего желчного протока// Бюлл. эксп. биол. мед. 1998 - Т. 125 - №1 - С.66-70

28. Угрюмов М.В. Современные методы иммуногистохимии и гистохимии // Итоги науки и техники, серия «Морфология человека и животных» 1991 - Т. 15 -С.23

29. Хем А., Кормак В. Гистология. Т. 4. Пер. с англ. М.: Москва - 1983

30. Abou-Shady М., Baer H.U., Friess Н., Berberat P., Zimmermann A., Graber Н., Gold L.I., Когс М., Biichler M.W. Transforming growth factor betas and their signaling receptors in human hepatocellular carcinoma // Am J Surg 1999 - V. 177 - P.209-215

31. Acalovschi M. Cholangiocarcinoma: risk factors, diagnosis and management // Rom J Intern Med 2004 - V.42 - P.41-58

32. Aguayo A., Patt Y.Z. Liver cancer // Clin. Liver. Dis. 2001 - V.5 - P.479507

33. Akker S.A., Smith P.J., Chew S.L. Nuclear post-transcriptional control of gene expression // J. Mol. Endocrinol. 2001 - V. 27 - P.123-131

34. Ali A., Serra S., Asa S.L., Chetty R. The predictive value of CK19 and CD99 in pancreatic endocrine tumors // Am. J. Surg. Pathol. 2006 - V.30 - P. 1588-1594

35. Ali S., Edery M., Pellegrini I., Lesueur L., Paly J., Djiane J., and Kelly P.A. The NB2 form of prolactin receptor is able to activate a milk protein gene promoter. Mol. Endocrinol. 1992-V. 6-P. 1242-1248

36. Ali S., Nouhi Z„ Chughtai N., Ali S. SHP-2 Regulates SOCS-1-mediated Janus Kinase-2 ubiquitination/degradation downstream of the prolactin receptor // J. Biol. Chem. 2003 - V. 278 - P.52021-52031

37. Alison M.R., Lovell M.J. Liver cancer: the role of stem cells // Cell Prolif -2005 V.38 - P.407-421

38. Alpini G„ Glaser S.S., Ueno Y., Pham L„ Podila P.V., Caligiuri A., LeSage G., LaRusso N.F. Heterogeneity of the proliferative capacity of rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1998 - V.274 - G.767-775

39. Alpini G., Phillips J.O., Vroman В., LaRusso N.F. Recent advances in the isolation of liver cells // Hepatology 1994a - V.20 - P.494-514

40. Alpini G., Ulrich C.D., Philips J.O. Pham L.D., Miller L.J., LaRusso N.F. Upregulation of secretin receptor gene expression in rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1994b - V.266 - G922-928

41. Alsaad K.O., Serra S., Perren A., Hsieh E., Chetty R. CK19 and CD99 immunoexpression profile in goblet cell (mucin-producing neuroendocrine tumors) and classical carcinoids of the vermiform appendix // Int. J. Surg. Pathol. 2007 - V.15 - P.252-257

42. Alvarez E.O., Banzan A.M. Behavioral actions of prolactin locally applied into the hyppocampus of adult female rats // J. Neural Transm. 1994 - V.95 - P. 17-28

43. Alvaro D., Alpini G., Onori P., Franchitto A., Glaser S.S., Le Sage G., Folli F., Attili A.F., Gaudio E. Alfa and beta estrogen receptors and the biliary tree // Mol. Cell. Endocrinol. 2002 - V. 193 - P. 105-108'

44. Alvaro D., Mancino M.G., Onori P., Franchitto A., Alpini G., Francis H., Glaser S., Gaudio E. Estrogens and the pathophysiology of the biliary tree' // World J. Gastroenterol. 2006 - V. 12 - P.3537-3545

45. Alvaro D., Mennone A., Boyer J.L. Role of kinases and phosphatases in the regulation of fluid secretion and C1-/HC03- exchange in cholangiocytes // Am. J. Physiol. -1997-V.273 -G303-313

46. Arden K.C., Boutin J.M., Djiane J., Kelly P.A., Gavenee W.K. The receptors for prolactin and growth hormone are localized in the same region of human chromosome 5 // Cytogenet. Cell. Genet. 1990 - V.53 - P. 161 -165

47. Bachelot A. and'-Binart1 N. Reproductive role of prolactin // Reproduction -2007-V. 133-P.361-369

48. Beach J.E., Tyrey L. and Everett J.W. Serum prolactin, and LH phase a of delayed versus direct pseudopregnancy in the rat // Endocrinology 1975 - V.96 - P. 12411248

49. Benhamouche S., Decaens T., Godard C., Chambrey R., Rickman D.S., Moinard C., Vasseur-Cognet M., Kuo C.J., Kahn A., Perret C., Colnot S. Ape tumor suppresser gene is the "zonation-keeper" of mouse liver // Develop. Cell 2006 - V.10 — P.759-770

50. Ben-Jonathan N. and Hnasko R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor // Endocrine Reviews 2001 - V.22 - P.724-763

51. Berlanga J.J., Fresno-Vara L.A., Marti-Perez J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin receptor is associated with c-src kinase in rat liver // Mol. Endocrinol. -1995 V.9 - P. 12611467

52. Bhatavdekar J., Patel D., Ghosh N. Vora H., Shah N„ Karelia N., Balar D., Chikhlikar P., Dave R. Interrelatioship of prolactin and its receptor in carcinoma, of colon and rectum: preliminary report // J. Surg. Oncol. 1994 - V. 55 - P.246-249

53. Binart N., Imbert-Bollore P., Baran N., Viglietta C., Kelly P.A. A short form of the prolactin (PRL) receptor is able to rescue mammopoiesis in heterozygous PRL receptor mice // Mol. Endocrinol. 2003 - V. 17 -P. 1066-1074

54. Bjornstrom L, Kilic E, Norman M, Parker MG, Sjoberg M. Cross-talk between Stat5b and estrogen receptor-alpha and -beta in mammary epithelial cells // J Mol Endocrinol 2001 - V.27 - P.93-106

55. Bode H.P., Wang L.F., Cassio D., Leite M.F., St-Pierre M.V., Hirata K., Okazaki K., Sears M.L., Meda P.", Nathanson M.H., Dufour M.H. Expression and regulation of gap junctions in rat cholangiocytes // Hepatology 2002 - V.36 - P.631-640

56. Bogorad R.L., Ostroukhova T.Y., Orlova A.N., Rubtsov P.M., Smirnova O.V. Long isoform of prolactin receptor predominates in rat intrahepatic bile ducts and further increases under obstructive cholestasis // J Endocrinol 2006 - V. 188 - P.345-354

57. Bole-Feysot C., Goffln V., Edery M., Binart N. and Kelly P.A. Prolactin and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in prolactin receptor knockout mice // Endocrin.Rev. 1998 - V. 19 - P.225-268

58. Brandebourg T.D., Bown J.L., Ben-Jonathan N. Prolactin upregulates its receptors and inhibits lipolysis and leptin release in male rat adipose tissue // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 - V. 357(2):- P.408-13

59. Breitling R., Krazeisen A., Moller G., Adamski J. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 an ancient 3-ketosteroid reductase of cholesterogenesis // Mol. Cell. Endocrinol. - 2001 - V. 171 - P. 199-204

60. Brokaw J., Katsaros D., Wiley A., Lu L., Su D., Sochirca O., de la Longrais I.A., Mayne S., Risch H., Yu H. IGF-I in epithelial ovarian cancer and its role in disease progression // Growth Factors 2007 - V.25 - P.346-354

61. Buckley A., Putnam C., Montgomery D., Russell D. Prolactin administration stimulates rat hepatic DNA synthesis // Biochem. Biophys Res. Commun. 1986 - V.138 -P.l 138-1145

62. Buckley A.R., Putnam C.W., Evans R„ Laird H.E. 2nd, Shah G.N:, Montgomery D.W., Russell D.H. Hepatic protein kinase C: translocation stimulated by prolactin and partial hepatectomy // Life Sci. 1987 - V.41 - P.2827-2834

63. Budhu A., Wang X.W. The role of cytokines in hepatocellular carcinoma // J. Leukoc. Biol. 2006 - V.80 - P. 1197-1213

64. Buenemann C.L., Willy C., Buchmann A., Schmiechen A., Schwarz M. Transforming growth factor-beta-1-induced Smad signaling, cell-cycle arrest and apoptosis in hepatoma cells // Carcinogenesis 2001 - V.22 - P.447-452

65. Bustin S.A. Real-Time PGR // Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proteomics 2005 - P. 1117-1125

66. Bustin, S.A; A-Z of Quantitative PCR // IUL Press, San Diego, CA 2004

67. Cai T., Lei Q.Y., Wang L.Y., Zha X.L. TGF-beta 1 modulated the expression of alpha 5 beta 1 integrin and integrin-mediated signaling in human hepatocarcinoma cells // Biochem. Biophis. Res. Commun. 2000 - V.274 - P.519-525

68. Camarillo I.G., Linebaugh B.E., Rillema J.A. Differential tyrosyl-phosphorylation of multiple mitigen-activated protein kinase isoforms in response to prolactin in Nb2 lymphoma cells // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1997 - V. 215 - P.198-202

69. Campbell G.S., Argetsinger L.S., Ihle J.N., Kelly P.A., Rillema J.A., Carter-Su C. Activation of JAK2 tyrosine kinase by prolactin receptors in Nb2 cells and mouse mammary gland explants // Proc. Nati. Acad. Sci. 1994 - V. 91 - P.5232-5236

70. Chakraborty A., Guha S. Granulocyte colony-stimulating factor/granulocyte colony-stimulating factor receptor biological axis promotes survival and growth of bladder cancer cells // Urology. 2007 - V.69 - P.1210-1215

71. Chang W.P., Clevenger C.V. Modulation of growth factor receptor function by isoform heterodimerization // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 - V.93 - P.5947-5952

72. Chang W.P., Ye Y., Clevenger C.V. Stoichiometric structure-function analysis of the prolactin receptor signaling domain by receptor chimeras // Mol. Cell. Biol. -1998-V.18-P.896-905

73. Chen X., Cheung S.T., So S., Fan S.T., Barry C., Higgins J., Lai K.M., Ji J., Dudoit S., Ng I.O., Van De Rijn M., Botstein D., Brown P.O. Gene Expression Patterns in Human Liver Cancers // Mol. Biol. Cell. 2002 - V.13 - P. 1929-1939

74. Cheng Y., Zhizhin I., Perlman R.L., Mangoura D. Prolactin-induced cell proliferation in PCI 2 ceils depends on JNK but not ERK activation // J. Biol. Chem. 2000- V.275 P.23326-23332

75. Cheung S.T., Chen X., Guan X.Y., Wong S.Y., Tai L.S., Ng I.O., So S., Fan S.T. Identify metastasis-associated genes in hepatocellular carcinoma through clonality delineation for multinodular tumor // Cancer Res. 2002 - V.62 - P.4711-21

76. Chiu C.C., Huang G.T., Chou S.H., Chien C.T., Chiou L.L., Chang M.H., Lee H.S., Chen D.S. Characterization of cytokeratin 19-positive hepatocyte foci in the regenerating rat liver after 2-AAF/CCl(4) injury // Histochem Cell Biol 2007 - V.128 -P.217-226

77. Clevenger C.V. Nuclear localization and function of polypeptide ligands and their receptors: a new paradigm for hormone specificity within the mammary gland? // Breast Cancer Res. 2003 - V.5 - P. 181-187

78. Clevenger C.V., Freier D.O., Kline J.B. Prolactin receptor signal transduction in cells of the immune system // J. Endocrinol. 1998 - V. 157 - P. 187-197

79. Clevenger C.V., Furth C.A., Hankinson S.E., and Schuler L.A. The role of prolactin in mammary carcinoma // Endocrine Reviews 2003 - V.24 - P. 1-27

80. Clevenger C.V., Kline J.B. Prolactin receptor signal transduction // Lupus -2001 —V. 10 P.706-718

81. Costa P., Catarino A.L., Silva F., Sobrinho L.G., Bugalho M.J. Expression of prolactin receptor and prolactin in normal and malignant thyroid: a tissue microarray study // Endocr. Pathol. 2006 - V. 17 - P.377-386

82. Dardenne M., de-Moraes M. do C., Kelly P.A., Gagnerault M.C. Prolactin receptor expression in human hematopoietic tissues analyzed by flow cytofluorometry // Endocrinology 1994 - V. 134 - P.2108-2114

83. Darlington G. Molecular mechanisms of liver development and differentiation // Curr. Opinion Cell Biol. 1999 - V.l 1 - P.678-682

84. Darnell J.E. STATs and Gene Regulation // Science 1997- V.277- P. 16301635

85. Das R., Vonderhaar B.K. Activation of raf-1, MEK, and MAP kinase in prolactin responsive mammary cells // Breast Cancer Res. Treat. 1996a - V.40 - P. 141149

86. Das R., Vonderhaar B.K. Involvment of SHC, GRB2, SOS and RAS in prolactin signal transduction in mammary epithelial cells // Oncogene 19966 - V. 13 -P.l139-1145

87. Das R., Vonderhaar B.K. Transduction of prolactin's growth signal through both long and short forms of the PRL receptors // Mol. Endocrinol. 1995 - V.9 - P. 17501759

88. Devost D., Boutin J.M. Autoregulation of the rat prolactin gene in lactotrophs // Mol.Cel.Endocrinology 1999 - V.158 - P.99-109

89. Diehl A.M. Roles of CCAAT/enhancer-binding proteins in regulation of liver regenerative growth// J. Biol. Chem. 1998 - V.273 - P.30843-30846

90. Dif F., Saunier E., Demeneix B., Kelly P.A., Edery M. Cytokine-inducible SH2-containing protein suppresses PRL signaling by binding the PRL receptor // Endocrinology 2001 - V.142 - P.5286-5293

91. Djiane J., Daniel N., Bignon C., Paly J., Waters M., Vacher P., Dufy B. Prolactin receptor and signal transduction to milk protein genes // Proc.Soc.ExpBiol.Med. -1994- V.206 P.299-303

92. Dong J., Tsai-Morris C.H., Dufau M.L. A novel estradiol/estrogen receptor alpha-dependent transcriptional mechanism controls expression of the human prolactin receptor // J Biol Chem 2006 - V.281 - P. 18825-18836

93. Duan W.R., Farmer T.G., Albarracin C.T., Zhong L., and Gibori G. PRAP, a prolactin receptor associated protein: its gene expression and regulation in the corpus luteum // Endocrinology 1997 - V. 138 - P.3216-3221

94. Fallon M.B., Nathanson M.H., Mennone A., Saez J.C., Burgstahler A.D., Anderson J.M. Altered expression and function of hepatocyte gap junctions after common bile duct ligation in the rat // Am. J. Physiol. 1995 - V.268 - P.C1186-C1194

95. Farazi P.A., Zeisberg M., Glickman J.,Zhang Y., Kalluri R., DePinho R.A. Chronic Bile Duct Injury Associated with Fibrotic Matrix Microenvironment Provokes Cholangiocarcinoma in p53-Deficient Mice // Cancer Res. 2006 - V.66 - P.6622-6627

96. Faulds MH, Pettersson K, Gustafsson JA, Haldosen LA. Cross-talk between ERs and signal transducer and activator of transcription 5 is E2 dependent and involves two functionally separate mechanisms // Mol. Endocrinol. 2001 - V.15 - P. 1929-1940

97. Fleenor D., Arumugam R., Freemark M. Growth hormone and prolactin receptors in adipogenesis: STAT-5 activation, suppressors of cytokine signaling, and regulation of insulin-like growth factor I // Horm. Res. 2006 - V.66 - P. 101-110

98. Fragoso R., Elias A.P., Dias S. Autocrine VEGF loops, signaling pathways, and acute leukemia regulation // Leuk. Lymphoma. 2007 - V.48 - P.481-488

99. Frame M.K., de Feijter A.W. Propagation of mechanically induced intercellular calcium waves via gap junctions and ATP receptors in rat liver epithelial cells // Exp. Cell. Res. 1997 - V.230 - P. 197-207

100. Frasor J, Gibori G. Prolactin regulation of estrogen receptor expression // Trends Endocrinol Metab 2003 - V. 14 - P. 118-123

101. Freeman M.E., Kanyicska B., Lerant A., Nagy G. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion // Physiological Reviews 2000 - V.80 - P. 1523-1631

102. Fritsche M., Mundt M., Merkle C., Jahne R., Groner B. p53 supresses cytokine induced, Stat5 mediated activation of transcription // Mol. Cell. Endocrinol. 1998 -V. 143-P. 143-154

103. Galsgaard E.D., Nielsen J.H., Moldrup A. Regulation of prolactin receptor gene expression in insulin-producing cells // J. Biol. Chem. 1999 - V.274 - P. 18686-18692

104. Ganguli S., Hu L., Menke P., Collier R.J., Gertler A. Nuclear accumulation of multiple protein kinases during prolactin induced proliferation of Nb2 lymphoma cells // J. Cell. Physiol. 1996 - V. 167 - P.251-260

105. Gao B., Shen X., Kunos G., Meng Q., Goldberg I.D., Rosen E.M., Fan S. Constitutive activation of JAK-STAT3 signaling by BRCA1 in human prostate cancer cells // FEBS Lett 2001 - V.488 - P. 179-184

106. Garcia-Caballero T., Morel G., Gallego R., Fraga M., Pintos E., Gago D., Vonderhaar B.K., Beiras A. Cellular distribution of prolactin receptors in human digestive tissues//J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996 - V. 81 P. 1861-1866

107. Gaudio E., Onori P., Pannarale L., Alvaro D. Hepatic microcirculation and peribiliary plexus in experimental biliary cirrhosis: a morphological study // Gastroenterol. -1996 V.l 11 - P.l 118-1124

108. Gerber M.A., Thung S.N. Enzyme patterns in human hepatocellular carcinoma // Am. J. Pathol. 1980 - V.98 - P.395-400

109. Gholson C.F. and Bacon B.R. Essentials of clinical hepatology // Mosby Year Book 1993

110. Gitnick G., LaBrecque D.R., Moody F.G. Diseases of the Liver and Biliary Tract // Mosby-Year Book— 1992

111. Glaser S., Francis H., Demorrow S., Lesage G., Fava G., Marzioni M., Venter J., Alpini G. Heterogeneity of the intrahepatic biliary epithelium // World J. Gastroenterol. -2006 — V.12 — P.3523-3536

112. Goffin V., Kelly P.A. Prolactin and growth hormone receptors // Clin.Endocrinol (Oxf) 1996 - V.45 - P. 247-255

113. Gouilleux-Gruart V., Debierre-Grockiego F., Gouilleux F., Capiod J.C., Claisse J.F., Delobel J., Prin L. Activated Stat related transcription factors in acute leukemia // Leuk Lymphoma 1997 - V.28 - P.83-88

114. Gray S.G., Eriksson T., Ekstrom C., Holm S., von Schweinitz D., Kogner P., Sandstedt B., Pietsch T., Ekstrom TJ. Altered expression of members of the IGF-axis in hepatoblastomas//Br. J. Cancer-2000 V.82 - P.1561-1567

115. Gutzman J.H., Rugowski D.E., Schroeder M.D., Watters J.J. and Schuler L.A. Multiple Kinase Cascades Mediate Prolactin Signals to Activating Protein-1 in Breast Cancer Cells // Mol. Endocrinol. 2004 - V. 18 - P.3064-3075

116. Hardee M.E., Arcasoy M.O., Blackwell K.L., Kirkpatrick J.P., Dewhirst M.W. Erythropoietin biology in cancer // Clin. Cancer. Res. 2006 - V. 12 - P.332-339

117. Hinuma S., Habata Y., Fujii R., Kawamata V. A prolactin-releasing peptide in the brain // Nature 1998 - V.393 - P. 272-276

118. Holtkamp W., Nagel G.A., Wander H.E., Rauschecker H.F., von Heyden D. Hyperprolactinemia in an indicator of progressive disease and poor prognosis in advanced breast cancer // Int. J. Cancer 1984 - V. 34 - P.323-328

119. Hu Z., Dufau M. Multiple and differential regulation of ovarian messenger RNAs and their expression //Biochem. Biophys. Res. Commun. -1991 V.121 - P.219-225

120. Hu Z.Z., Li Z., Dufau M.L. Multiple and tissue-specific promoter control of gonadial and non-gonadial prolactin > receptor gene expression // J. Biol. Chem. 1996 -V.271 -P. 10242-10246

121. Hu Z.Z., Li Z., Guan X., Meng J., Dufau M.L. Steroidogenic Factor-1 is an essential transcriptional activator for gonad-specific expression of promoter I of the Rat prolactin receptor gene // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P. 14263-14271

122. Hu'Z.Z., Meng J., Dufau M.L. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 //J. Biol. Chem. 2001 - V.276 - P.41086-41094

123. Hu Z.Z., Zhuang L„ Meng J., Tsai-Morris C.H., Dufau-M.L. Complex 5' genomic structure of the human prolactin receptor: multiple alternative exons 1 and promoter utilization // Endocrinology 2002 - V. 143 - P.2139-2142

124. Huang K., Ueda E., Chen Y., Walker A.M. Paradigm-shifters: phosphorylated prolactin and short prolactin receptors // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2008

125. Hunter S., Koch B.L., Anderson S.M. Phosphorylation of cbl after stimulation of Nb2 cells with prolactin and its association with phosphatidylinositol-3- kinase // Mol. Endocrinol. 1997 - V.l 1 - P. 1213-1222

126. Ihle J.N. Signaling by the cytokine receptor superfamily. Just another kinase story // Trends Endocr. Metabol. 1994 - V.5 - P. 137-143

127. Ihle J.N. STATs: Signal transducers and activators of transcription // Cell -1996-V.84-P.331-334

128. Ishii M., Vroman B.T., LaRusso N.F. Morfologic evidence of receptor-mediated endocitosis of epidermal growth factor by isolated bile duct epithelial cells // Gastroenterology 1988 - V.94 - P.A550

129. Ishimura N., Isomoto H., Bronk S.F., Gores G.J. Trail induces cell migration and invasion in apoptosis-resistant cholangiocarcinoma cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 2006 - V.290 - P.G129- G136

130. J. Leukoc. Biol. 2006 - V.80 - P. 1197-1213

131. Jahn G.A., Edery M., Belair L., Kelly P.A., Djiane J. Prolactin receptor gene expression in rat mammary gland and liver during pregnancy and lactation // Endocrinology 1991 - V. 128 - P.2976-2984

132. Jin L., Qian X., Kulig E., Scheithauer B.W., Calle-Rodrique R., Abboud C., Davis D.H., Kovacs K., Lloyd R.V. Prolactin receptors messenger RNA in normal and neoplastic human pituitary tissues // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997 - V. 82 - P.963-968

133. Jo M„ Stolz D.B., Esplen J.E., Dorko K., Michalopoulos G.K., Strom S. Cross-talk between epidermal growth factor receptor and c-Met signal pathways in transformed cells // J. Biol. Chem. 2000 - V.275 - P.8806-8811

134. Johansson E.M., Kannius-Janson M., Bjursell G., Nilsson J. The p53 tumor suppressor gene is regulated in vivo by nuclear factor 1-C2 in the mouse mammary gland during pregnancy // Oncogene 2003 - V.22 - P.6061-6070

135. Johnson H.M., Subramaniam P.S., Olsnes S., Jans D.A. Trafficking and signaling pathways of nuclear localizing protein ligands and their receptors // BioEssays -2004-V.26-P.993-1004

136. Jolicoeur C., Boutin J.M., Okamura H., Raguet S., Djiane J., Kelly P.A. Multiple regulation of prolactin receptor gene expression in rat liver // Mol. Endocrinol. -1989- V.3 P.895-900

137. Kawai H.F., Kaneko S., Honda M., Shirota Y., Kobayashi K. Alpha-fetoprotein-producing hepatoma cell lines share common expression profiles of genes in various categories demonstrated by cDNA microarray analysis // Hepatology 2001 - V.33 - P.676-691

138. Kelly P.A., Boutin J.-M., Jolicoeur C., Okamura H., Shirota M„ Edery M., Dusanter-Fourt I., Djiane J. Purification, Cloning, and Expression of the Prolactin Receptor // Biol. Reprod. -1989 V.40 - P.27-32

139. Kelly P.A., Djiane J., Postel-Vinay M.C., Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family // Endocrine Reviews 1991 - V.12 - P.235-251

140. Khattabi E.I., Remade C., Reusens B. The regulation of IGFs and IGFBPs by prolactin in primary culture of fetal rat hepatocytes is influenced by maternal malnutrition // Am J Physiol Endocrinol Metab 2006 - V 291 - P.E835-E842, 2006

141. Kindblom J., Dillner K., Sahlin L., Robertson F., Ormandy C., Tornell J., Wennbo H. Prostate hyperplasia in a transgenic mouse with prostate-specific expression of prolactin II Endocrinology 2003 - V. 144 - P.2269-2278

142. Kline J.B., Clevenger C.V. Identification and characterization of the prolactin-binding protein in human serum and milk // J. Biol. Chem. 2001 - V.276 -P.24760-24766

143. Kline J.B., Moore D.J., Clevenger C.V. Activation and association of the Tec tyrosine kinase with the human prolactin receptor: mapping of a Tec/Vavl-receptor binding site // Mol. Endocrinol. 2001 - V.15 - P.832-841

144. Kline J.B., Roehrs H., Clevenger C.V. Functional characterization of the intermediate isoform of the human prolactin receptor // J. Biol. Cherri. 1999 - V.274 -P.35461-35468

145. Kline J.B., Rycyzyn M.A., Clevenger C.V. Characterization of a novel and functional human prolactin receptor isoform (ASlPRLr) containing only one extracellular fibronectin-like domain // Mol. Endocrinol. 2002 - V. 16 - P.2310-2322

146. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease // Adv. Anat. Embriol. Cell. Biol. 2001 - V. 14 - P. 1-107

147. Knizetova P., Darling J.L., Bartek J. Vascular endothelial growth factor in astroglioma stem cell biology and response to therapy // J. Cell. Mol. Med. 2007

148. Kobayashi M., Suzuki M., Saito T.R., Tanaka M. Developmental changes in the expression levels of alternative first exons of prolactin receptor gene in rat brain // Endocr. Res. 2007 - V.32 - P. 143-151

149. Koga Y., Kitajima Y., Miyoshi A., Sato K., Kitahara K., Soejima H., Miyazaki K. Tumor progression through epigenetic gene silencing of 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase in human biliary tract cancers // Ann. Surg. Oncol. 2005 - V.12 -P.354-363

150. Kojima T., Yamamoto T., Murata M., Chiba H., Kokai Y., Sawada N. Regulation of the blood-biliary barrier: interaction between gap and tight* junctions in. hepatocytes // Med. Electron. Microsc. 2003 - V.36 - P. 157-164

151. Kullak-Ublick G.A., Stieger B., Hagenbuch B., Meier P.J. Hepatic transport of bile salts // Seminars in Liver Disease 2000 - V.20 - P.273-292

152. Kuper H, Mantzoros C, Lagiou P, Tzonou A, Tamimi R, Mucci L, Benetou V, Spanos E, Stuver SO, Trichopoulos D. Estrogens, testosterone and sex hormone binding globulin in relation to liver cancer in men // Oncology 2001 - V.60 - P.355-360

153. Lebrun J.J., Ali S., Goffin V., Ullrich A., Kelly P.A. A single phosphotyrosine residue of the prolactin receptor is responsible for activation of gene transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995a - V.92 - P.4031-4035

154. Lebrun J.J., Ali S., Ullrich A., Kelly P.A. Proline-rich sequence-mediated JAK2 association to the prolactin receptor is required but not sufficient for signal transduction // J. Biol. Chem. 19956 - V.270 - P. 10664-10670

155. Leite De Moraes M.C., Touraine P., Gagnerault M.C., Savino W., Kelly P. A., Dardenne M. Prolactin receptors and the immune system // Ann. Endocrinol. (Paris) 1995 -V. 56 - P.567-570

156. Leung K.C., Johannsson G., Leong G.M., Ho K.K. Estrogen regulation of growth hormone action // Endocr. Rev. 2004 - V.25 - P.693-721

157. Li Y., Suresh Kumar K. G., Tang W., Spiegelman V.S., Fuchs S.Y. Negative regulation of prolactin receptor stability and signaling mediated by SCFp-TrCP E3 ubiquitin ligase // Mol. Cell. Biol. 2004 - P.4038-4048

158. Lin S.Y., Makino K., Xia W., Matin A., Wen Y., Kwong K.Y., Bourguignon L., Hung M.C. Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor// Nat Cell Biol 2001 - V.3 - P.802-8

159. Lincoln D.T., Kaiser H.E., Raju G.P., Waters M.J. Growth hormone and colorectal carcinoma: localization of receptors // In Vivo 2000 - V. 14 - P.41-49

160. Lincoln D.T., Singal P.K., Al-Banaw A. Growth hormone in vascular pathology: neovascularization and expression of receptors is associated with cellular proliferation // Anticancer Res. 2007 - V.27 - P.4201-4218

161. Liquita M.G., Catania V.A., Sanchez-Pozzi E.J., Mottino A.D. Ovine prolactin increases hepatic UDP-glucoroniltransferase activity in ovariectomized rats // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 - V.278 - P.921-925

162. Liu X.F., Zhang H., Zhu S.G., Zhou X.T., Su H.L., Xu Z., Li S.J. Correlation of p53 gene mutation and expression of P53 protein in cholangiocarcinoma // World J. Gastroenterol. 2006 - V.12 - P.4706-4709

163. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2A"dekaddtaCt 1 method // Methods 2001 V.25 - 402-408

164. Lo H.W., Ali-Seyed M., Wu Y., Bartholomeusz G., Hsu S.C., Hung M.C. Nuclear-cytoplasmic transport of EGFR involves receptor endocytosis, importin betal and CRM 1 // J Cell Biochem 2006a V.98 - P. 1570-1583

165. Lo H.W., Hsu S.C., Hung M.C. EGFR signaling pathway in breast cancers: from traditional signal transduction to direct nuclear translocalization // Breast Cancer Res Treat 20066 - V.95 - P.211 -218

166. Lo H.W., Hung M.C. Nuclear EGFR signalling network in cancers: linking EGFR pathway to cell cycle progression, nitric oxide pathway and patient survival // Br J Cancer 2006 - V.94 - P. 184-188

167. Lo H.W., Xia W., Wei Y„ Ali-Seyed M., Huang S.F., Hung M.C. Novel prognostic value of nuclear epidermal growth factor receptor in breast cancer // Cancer Res -2005 V.65 - P.338-348

168. Love R.R., Rose D.R., Surawicz T.S., Newcomb P.A. Prolactin and growth hormone levels in premenopausal women with breast cancer and healthy women with strong family history of breast cancer// Cancer 1991 - V. 68 - P. 1401-1405

169. Lu J.-C., Piazza T.M., Schuler L.A. Proteasomes mediate prolactin-induced receptor downregulation and fragment generation in breast cancer cells // J. Biol. Chem. -2005 V.280 - P.33909-33916

170. Lu J.-C., Scott PM Strous G.J., Schuler L.A. Multiple internalization motifs differentially used by prolactin receptor isoforms mediate similar endocytic pathways // Mol. Endocrinol. 2002 - V.16 - P.2515-2527

171. Ma F.Y., Anderson G.M., Gunn T.D., Goffin V., Grattan D.R., Bunn S.J. Prolactin specifically activates signal transducer and activator of transcription 5b in neuroendocrine dopaminergic neurons // Endocrinol. 2005 - V. 146 - P.5112-5119

172. Malhi H., Gores G.J. Cholangiocarcinoma: modern advances in understanding a deadly old disease // J. Hepatol. 2006 - V.45 - P.856-867

173. Manhes C., Goffin V., Kelly P.A., Touraine P. Autocrine prolactin, as a promotor of mammary tumour growth // J Dairy Res 2005 - V.72 - Spec No - P.58-65

174. Meng J., Tsai-Morris C.-H., Dufau M.L. Human prolactin receptor variants in breast cancer: low ratio of short forms to the long-form human prolactin receptor associated with mammary carcinoma // Cancer Res. 2004 - V.64 - V.5677-5682

175. Mennone A., Alvaro D., Cho W., Boyer J.L. Isolation of small polarized bile duct units // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1995 - V.92 - P.6527-6231

176. Mertani H.C., Raccurt M., Abbate A., Kindblom J., Tornell J., Billestrup N., Usson Y., Morel G., Lobie P.E. Nuclear translocation and retention of growth hormone // Endocrinology 2003 - V.144 - P.3182-3195

177. Michalopoulos G.K. and DeFrances M.C. Liver regeneration // Science -1997- V.276-P.60-66

178. Miller S.L., DeMaria J.E., Freier D.O., Riegel A.M., Clevenger C.V. Novel association of Vav2 and Nek3 modulates signaling through the human prolactin receptor // Mol. Endocrinol. 2005 - V.19 - P.939-949

179. Minoo P., Zadeh M.M., Rottapel R., Lebrun J.J., Ali S. A novel SHP-1/Grb2-dependent mechanism of negative regulation of cytokine-receptor signaling: contribution of SHP-1 C-terminal tyrosines in cytokine signaling // Blood 2004 - V. 103 - P. 1398-1407

180. Miura Y., Kozuki Y., Yagasaki K. Potentiation- of invasive activity of hepatoma cells by reactive oxygen species is mediated by autocrine/paracrine loop of hepatocyte growth factor//Biochem Biophys Res Commun -2003 V.305 - P. 160-165

181. Miyoshi H., Rust C., Roberts P.J., Burgart L.J., Gores G.J. Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas // Gastroenterology 1999 -V. 117 - P.669-677

182. Muccioli G., Ghe C., Faccani G., Lannote M., Forni M., Ciccarelli E. Prolactin receptors in human meningiomas: characterization and biological role // J. Endocrinol. 1997 - V. 153 - P.365-371

183. Murphy L.J., Tachibana K., Friesen H.G., Stimulation of hepatic insulin-like growth factor-I gene expression by ovine prolactin evidence for intrinsic somatogenic activity in the rat //Endocrinology 1988 - V.122 -P.2027-2033

184. Nagano M., Chastre E., Choquet A., Bara> J., Gespach C., Kelly P.A. Expression of prolactin and growth hormone receptor genes and their isoforms in the gastrointestinal tract // Am. J. Physiol. 1995 - V. 268 - P.G431- G442

185. Nagano M., Kelly P.A. Tissue distribution and regulation of rat prolactin receptor gene expression. Quantitative analysis by polymerase chain reaction // J. Biol. Chem. 1994 - V.269 - P. 13337-13345

186. Nathanson M.H., Boyer J.L. Mechanisms and regulation of bile secretion // Hepatology 1991 - V. 14 - P.551-566

187. Nathanson M.H., Burgstahler A.D., Mennone A., Fallon M.B., Gonzalez C.B., Saez J.C. Ca2+ waves are organized among hepatocytes in the intact organ // Am. J. Physiol. 1995 - V.269 - P.G167-G171

188. Nicholson H.D., Whittington K. Oxytocin and the human prostate in health and disease // Int. Rev. Cytol. 2007 - V.263 - P.253-286

189. Nilsson J., Bjursell G., Kannius-Janson M. Nuclear Jak2 and Transcription Factor NF1-C2: a Novel Mechanism of Prolactin Signaling in Mammary Epithelial Cells // Mol. Cell. Biology 2006 - V.26 - P. 5663-5674

190. Nishikawa S., Moore R.C., Nonomura N., Oka T. Progesterone and EGF inhibit mouse mammary gland prolactin receptor and beta-casein gene expression // Am. J. Physiol. 1994 - V.267 - P.C1467-1472

191. Nolin J.M. Intracellular prolactin in rat corpus luteum and adrenal cortex // Endocrinology -1978 V.102 - P.402-406

192. Nowak R.A., Mora S„ Diehl T., Rhoades A.R., Stewart E.A. Prolactin is an autocrine or paracrine growth factor for human myometrial and leiomyoma cells // Gynecol. Obstet. Invest. 1999 - V.48 - P. 127-132

193. Orlova A.N., Smirnova O.V., Smirnov A.N. Appearance and functions of prolactin receptors in cholangiocytes after common bile duct ligation // Pathophysiology -1998-V.5-Suppl.l-P.230

194. Ormandy C.J., Graham J., Kelly P.A., Clarke C.L., Sutherland R.L. The effect of progestins on prolactin receptor gene transcription in human breast cancer cells // DNA Cell. Biol. 1992- V.ll-P.721-726

195. Ouhtit A., Morel G., Kelly P. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in the rat//Endocrinology 1993a-V. 133 - P. 135-144

196. Ouhtit A., Morel G., Kelly P. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in the rat digestive tissues // Am. J. Physiol. 1994 - V.266 -G807-815

197. Ouhtit A., Morel G., Kelly P.A. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in rat reproductive tissues // Biol. Reprod. 19936 - V.49 -P.528-536

198. Park J., Tadlock L., Gores G.J., Patel T. Inhibition of interleukin 6-mediated mitogen-activated protein kinase activation attenuates growth of a cholangiocarcinoma cell line // Hepatology 1999 - V.30 - P. 1128-1133

199. Parola M., Cheeseman K.H., Biocca M.E., Dianzani M.U., Sater T.F. Isolation and characterization of biliary epithelial cells from normal rat liver // J. Hepatol. -1988 -V.6 P. 175-186

200. Patel T. Worldwide trends in mortality from biliary tract malignancies // BMC Cancer 2002-V.2-P. 10

201. Paule B., Terry S., Kheuang L„ Soyeux P., Vacherot F., de la Taille A. The NF-kappaB/IL-6 pathway in metastatic androgen-independent prostate cancer: new therapeutic approaches? // World J. Urol. 2007 - V.25 - P.477-489

202. Pavelic J., Matijevic T., Knezevic J. Biological and physiological aspects of action of insulin-like growth factor peptide family // Indian J. Med. Res. 2007 - V.125 -P.511-522

203. Peirce S.K., Chen W.Y. Quantification of prolactin receptor mRNA in multiple human tissues and cancer cell lines by real time RT-PCR // J. Endocrinol. 2001 -V.171 -P.R1-R4

204. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Buteau H., Edery M., Kelly P.A. Internalization of prolactin receptor and prolactin in transfected cells does not involve nuclear translocation//J. Cell. Sci.- 1997a-V.110-P.1123-1132

205. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Pezet A., Vincent V., Edery M., Kelly P.A. Dominant negative and cooperative effects of mutant forms of prolactin receptor // Mol. Endocrinol. 19976 -V.ll - P. 1020-1032

206. Picoletti R., Bendinelli P., Maroni P. Signal transduction pathway of prolactin in rat liver // Mol. Cell. Endocrinol. 1997 - V. 135 - P. 169-177

207. Piwnica D., Fernandez I., Binart N., Touraine P., Kelly P.A., Goffin V. A new mechanism for prolactin processing into 16K PRL by secreted cathepsin D // Mol. Endocrinol. 2006 - V.20 - P.3263-3278

208. Pohjanvirta R., Niittynen M., Linden J., Boutros P.C., Moffat I.D., Okey A.B. Evaluation of various housekeeping genes for their applicability for normalization of mRNA expression in diox in-treated rats // Chem Bio Interact 2006 - V. 160 - P. 134-149

209. Qazi A.M., Tsai-Morris C.-H., Dufau M.L. Ligand-Independent Homo- and Heterodimerization of Human Prolactin Receptor Variants: Inhibitory Action of the Short Forms by Heterodimerization // Molecular Endocrinology 2006 - V.20 - 1912-1923

210. Rappaport A.M. The microcirculatory acinar concept of normal and pathological hepatic structure // Beitr. Path. 1976 - V. 157 - P.215-243

211. Rappaport A.M., Borowy Z.J., Lougheed W.M., Lotto W.N. Subdivision of hexagonal liver lobes into a structural and functional unit // Anat. Rec. 1954 - V. 119 - P. 11-33

212. Rasmussen R.P. Quantification on the LightCycler in Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications Springer Press, Heidelberg -2001- P.21-34

213. Ricci F., Kern S.E., Hruban R.H., Iacobuzio-Donahue C.A. Stromal responses to carcinomas of the pancreas: juxtatumoral gene expression conforms to the infiltrating pattern and not the biologic subtype // Cancer Biol. Ther. 2005 - V.4 - P.302-307

214. Risbridger G.P., Ellem S J., McPherson S.J. Estrogen action on the prostate gland: a critical mix of endocrine and paracrine signaling // J. Mol. Endocrinol. — 2007 -V.39 — P.183-188

215. Robb-Gaspers L.D., Thomas A.P. Coordination of Ca2+ signaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver // J. Biol. Chem. 1995 - V.270 -P.8102-8107

216. Roche Applied Science. Relative quantification // Technical Note No.LC 13/2001 -2001

217. Rui H., Lebrun J.J., Kirken R.A., Kelly P.A. JAK2 activation and cell proliferation induced by antibody-mediated prolactin receptor dimerization // Endocrinology 1994-V.135-P. 1299-1306

218. Russell D.L., and Richards J.S. Differentiation-dependent prolactin responsiveness and Stat (Signal Transducers and Activators of Transcription) signaling in rat ovarian cells // Mol. Endocrinol. 1999 - V. 13 - P.2049-2064

219. Rutledge R.G., Cote C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves // Nucleic Acids Research 2003 - V.31 - P. 1-6

220. Rycyzyn M.A., Clevenger C.V. The intranuclear prolactin/cyclophilin B complex as a transcriptional inducer // Proc. Natl. Acad. Sci U S A 2002 - V.99 - P.6790-6795

221. Sakaguchi K., Ohkubo T., Sugiyama T., Tanaka M., Ushiro H., Nakashima K. Differential regulation of prolactin receptor mRNA expression in rat liver and kidney by testosterone and oestradiol // J. Endocrinol. 1994 - V. 143 - P.383-392

222. Sakal E., Elberg G., Gertler A. Direct evidence that lactogenic hormones induce homodimerization of membrane-anchored prolactin receptor in intact Nb2-llC rat lymphoma cells // FEBS Lett. 1997 - V.410 - P.289-292

223. Schwertfeger K.L., Hunter S., Heasley L.E., Levresse V., Leon R.P., DeGregori J., Anderson S.M. Prolactin stimulates activation of c-jun N-terminal kinase (JNK) // Mol. Endocrinol. 2000 - V. 14 - P. 1592-1602

224. Shelepov V.P., Chekulaev V.A., Pasha-Zade G.R. Factors within the body determining the glycogen reserves in the tissues of rats with transplantable tumours // Biomed. Sci. 1991 - V.2 - P. 111-120

225. Shimizu I., Kohno N., Tamaki K„ Shono M„ Huang H.-W., He J.-H., Yao D.-F. Female hepatology: Favorable role of estrogen in chronic liver disease with hepatitis B virus infection // World J. Gastroenterol. 2007 - V. 13 - P.4295-4305

226. Simon-Holtorf J., Monig H., Klomp H.J., Reinecke-Luthge A., Folsch U.R., Kloehn S. Expression and distribution of prolactin receptor in normal, fibrotic, and cirrhotic human liver // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2006 - V.l 14 - P.584-589

227. Sinha Y.N. Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance // Endocrine Reviews 1995 - V. 16 - P.354-369

228. Sirica A.E. Cholangiocarcinoma: molecular targeting strategies for chemoprevention and therapy // Hepatol. 2005 - V.41 - P.5-15

229. Sirica A.E., Lai G.H., Zhang Z. Biliary cancer growth factor pathways, cyclo-oxygenase-2 and potential therapeutic strategies // J. Gastroenterol. Hepatol. 2001 - V.16 -P.363-372

230. Slattery J.M. and Sahani D.V. What Is the Current State-of-the-Art Imaging for Detection and Staging of Cholangiocarcinoma? // Oncologist 2006 - V. 11 - P.913-922

231. Smirnova O., Orlova A. Functional role for prolactin receptors of rat cholangiocytes under conditions of obstructive cholestasis // J. Hepatol. 1999 - V.30 - SI -p.143

232. Smirnova O., Petrashchuk O., Kelly P. Immunohystochemical localization of prolactin receptor in rat liver cells: dependence on sex and sex steroids // Mol. Cell. Endocr. 1994- V.105 -P.77-81

233. Smirnova O.V. A new level of hormonal signal transduction: primary nuclear action of protein and peptide hormones // Membr Cell Biol 2000 - V. 13 - P.245-261

234. Smolen A. // Methods in neuroscience. Qualitative and quantitative microscopy 1990 - V.3 - P.208-229

235. Sorin B., Vacher A.M., Djiane J., Vacher P. Role of protein kinases in the prolactin-induced intracellular calcium rise in Chinese hamster ovary cells expressing the prolactin receptor // J. Neuroendocrinol. 2000 - V. 12 - P.910-918

236. Spagnoli F.M., Amicone L., Tripodi M., Weiss M.C. Identification of a bipotential precusor cell in hepatic cell lines derived from trangenic mice expressing cyto-met in the liver // J. Cell Biology 1998 - V. 143 - P. 1101-1112

237. Stevens A. and Lowe J.S. Histology // Mosby 1992 - P. 176-186

238. Sulkowska M., Golaszewska J., Wincewicz A., Koda M., Baltaziak M., Sulkowski S. Leptin—from regulation of fat metabolism to stimulation of breast cancer growth // Pathol. Oncol. Res. 2006 - V.12 - P.69-72

239. Sutherland K.D., Lindeman G.J., Visvader J.E. Knocking off SOCS genes in the mammary gland // Cell Cycle 2007 - V.6 - P.799-803

240. Swartling J.F. Identifying candidate genes involved in brain tumor formation // Ups. J. Med. Sci. 2008 - V. 113 - P.32-71

241. Szulc-Musiol B., Drozdz M., Ryszka F., Dolinska B., Scigala P. The influence of prolactin on the chosen biochemical parameters of the rabbit liver in ischemia // Acta. Pol. Pharm. 2004 - V.61 - P.477-482

242. Takakuwa Y., Kokai Y., Sasaki K., Chiba H„ Tobioka H., Mor M., Sawada N. Bile canalicular barrier function and expression of tight-junctional molecules in rat hepatocytes during common bile duct ligation // Cell. Tissue. Res. 2002 - V.307 - P. 181189

243. Tan D., Huang K.T., Ueda E., Walker A.M. S2 deletion variants of human PRL receptors demonstrate that extracellular domain conformation can alter conformation of the intracellular signaling domain (dagger) // Biochem. 2008 - V.47 - P.479-489

244. Thomas C. Histopatology // B.C. Decker Inc. 1989

245. Trott J.F., Hovey R.C., Koduri S., Vonderhaar B.K. Alternative splicing to exon 11 of human prolactin receptor gene results in multiple isoforms including a secreted prolactin-binding protein // J. Mol. Endocrinol. 2003 - V.30 - P.31-47

246. Tworoger S.S., Eliassen A.H., Sluss P., Hankinson S.E. A prospective study of plasma prolactin concentrations and risk of premenopausal and postmenopausal breast cancer // J. Clin. Oncol. 2007 - V.25 - P. 1482-1488

247. Tyagi A., Sharma Y., Agarwal C., Agarwal R. Silibinin impairs constitutively active TGFalpha-EGFR autocrine loop in advanced human prostate carcinoma cells // Pharm. Res. 2008

248. Ur E., Wilkinson D.A., Morash B.A., Wilkinson M. Leptin immunoreactivity is localized to neurons in rat brain // Neuroendocrinology 2002 - V.75 - P.264-272

249. Villalba M., Zabala M.T., Martinez-Serrano A., de la Colina R., Satrustegui J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin increases cytosolic free calcium concentration in hepatocytes of Iactating rats// Endocrinology 1991 - V. 129 - P.2857-2861

250. Vincent V., Goffin V., Rozakis-Adcock M., Mornon J.P., Kelly P.A. Identification of cytoplasmic motifs required for short prolactin receptor internalization // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P.7062-7068

251. Vona-Davis L., Rose D.P. Adipokines as endocrine, paracrine, and autocrine factors in breast cancer risk and progression // Endocr. Relat. Cancer. 2007 - V.14 -P. 189-206

252. Waalkes M.P., Liu J„ Chen H„ Xie Y., Achanzar W.E., Zhou Y.S., Cheng M.L., Diwan B.A. Estrogen signaling in livers of male mice with hepatocellular carcinoma induced by exposure to arsenic in utero // J. Natl. Cancer. Inst. 2004 - V.96 - P.466-474

253. Wallaschofski H., Kobsar A., Koksch M., Siegemund A., Hentschel B., Tuschy U., Lohmann T., Sokolova O., Eigenthaler M. Prolactin receptor signaling during platelet activation // Horm. Metab. Res. 2003 - V.35 - P.228-235

254. Wang D.S., Dou K.F., Li K.Z., Gao Z.Q., Song Z.S., Liu Z.C. Hepatocellular apoptosis after hepatectomy in obstructive jaundice in rats // World J. Gastroenterol. 2003 - V.9 - P.2737-2741

255. Wang Y., O'Neal K.D., Yu-Lee L. Multiple prolactin receptor cytoplasmic residues and Statl mediate PRL signaling to the interferone regulatory factor-1 promoter // Mol. Endocrinol. 1997-V. 11--P. 1353-1364

256. Wehbe H., Henson R., Meng F., Mize-Berge J., Patel T. Interleukin-6 contributes to growth in cholangiocarcinoma cells by aberrant promoter methylation and gene expression // Cancer Res. 2006 - V.66 - P. 10517-10524

257. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation // BioTechniques 2005 - V.39 - P. 1-10

258. Wood M., Ananthanarayanan M., Jones B., Wooton-Kee R., Hoffman T., Suchy F. J., Vore M. Hormonal regulation of hepatic organic anion transporting polypeptides // Mol. Pharmacol. V.68 - P.218-225, 2005

259. Wu W., Chen Y.H., Ueda E., Tan D., Bartolini P., Walker A.M. Different forms of prolactin have opposing effects on the expression of cell cycle regulatory proteins in differentiated mammary epithelial cells // Oncol. Res. 2006 - V. 16 - P.75-84

260. Wylot M., Laszczynska M., Chorzepa K. Prolactin receptors in the prostate // Pol. Merkur. Lekarski. 2006 - V.21 - P.492-494

261. Yamanaka T., Shiraki K., Sugimoto K., Ito T., Fujikawa K., Ito M.% Takase K., Moriyama M., Nakano T., Suzuki A. Chemotherapeutic agents augment TRAIL-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines // Hepatol. 2000 - V.32 - P.482-490

262. Yang N., Wang X., Jiang J*., Frank S.J. Role of the growth hormone (GH) receptor transmembrane domain in receptor predimerization and GH-induced activation // Mol. Endocrinol. 2007 - V.21 - P. 1642-1655

263. Yasui T., Murakami T., Maeda T., Oka T. Involvement of gonadal steroid hormone disturbance in altered prolactin receptor gene expression in the liver of diabetic mice// J. Endocrinol. 1999 - V. 161 - P.33-40

264. Yokoyama Y„ Kitchens W.C., Toth B., Schwacha M.G., Bland K.I., Chaudry I.H. Upregulation of hepatic prolactin receptor gene expression by 17beta-estradiol following trauma-hemorrhage // J. Appl. Physiol. 2003 - V.95 - P.2530-2536

265. Yu-Lee L.Y. Prolactin modulation of immune and inflammatory responses // Recent Prog. Horm. Res. 2002 - V.57 - P.435-455

266. Zabala M.T. and Garcia-Ruiz J.P. Regulation of expression of the messenger ribonucleic acid encoding the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase in liver and small intestine of lactating rats // Endocrinology 1989 - V. 125 - P.2587-2593

267. Zhu T., Starling-Emerald B., Zhang X., Lee K.O., Gluckman P.D., Mertani H.C., Lobie P.E. Oncogenic transformation of human mammary epithelial cells by autocrine human growth hormone // Cancer Res. 2005 - V.65 - P.317-324

268. Zirulnik F., Anzulovich A.C., Larregle E., Jahn G.A., Gimenez M.S. Role of prolactin in the regulation of cytosolic NADP isocitrate dehydrogenase in the liver of the male rat // Endocr. Res. 2003 - V.29 - P.201-210

269. Я хочу выразить самую искреннюю признательность своим научным руководителям д.б.н. О.В. Смирновой и проф. П.М. Рубцову за интересную тему, советы, помощь в работе и терпение.

270. Выражаю глубокую благодарность A.A. Розенкранцу и П.В. Гулаку за предоставление возможности микрофотографирования, а также за огромную помощь и ценные советы в проведении цитофотометрического анализа.

271. Благодарю JI.M. Самоходскую (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова) за предоставление возможности проведения ПЦР-РВ.

272. Благодарю Л.В. Платонову, Н.И. Шоно и Ю.И. Патютко за постоянную помощь в приобретении материала для исследования.

Информация о работе

Остроухова, Татьяна Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.13

Диссертация

Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы