Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия рецепторов пролактина в клетках печени крыс в условиях обструктивного холестаза и ее физиологическое значение

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия рецепторов пролактина в клетках печени крыс в условиях обструктивного холестаза и ее физиологическое значение"

р г- ^ псковский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ тай ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

з ноа вав

БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 612.357.65:577.175.328

ОРЛОВА Альбина Николаевна

Экспрессия рецепторов пролактнна в клетках печени крыс в условиях обструктивпого холестаза и ее физиологическое значеине

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных (зав. каф. - академик РАМН, проф. И. П. Ашмарин) биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук А. Н. Смирнов

доктор биологических наук О. В. Смирнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. II. Бабичев; доктор биологических наук Г. Е. Онищенко

Ведущее учреждение - Всероссийский кардиологический центр РАМН

Защита состоится 7 декабря 1998 г. в 15 час. 30 мин. на заседании специализированного Ученого Совета Д.053.05.35 биологического факультета Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Б. А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточные механизмы передачи гормонального сигнала через специфические рецепторы предстапляют собой центральную проблему современной эндокринологии. Один из аспектов этой проблемы касается особенностей клеточной локализации рецепторов гормонов и тканевой дифференцировки их экспрессии, а также механизмов регуляции пой экспрессии.

В частности, в настоящее время интенсивно изучаются пути проведения клеточного сигнала через мембранные рецепторы цитокинов, к которым относятся рецепторы пролактина (РПрл). Этот гормон в организме млекопитающих выползет ряд физиологических функций, связанных с размножением, осморегуляцией, иммуномодуляцией, регуляцией роста, дифференцировки и метаболизма (Со-ше, РогвуШ, 1975, Вок-РеуйМ й а1., 1998). Несмотря на то, что к настоящему моменту имеются многочисленные данные о механизмах действия РПрл, картина их функционирования все еще остается неполной, а некоторые вопросы - неразрешенными.

Одной из важных мишеней действия гормона является печень. Многочисленные гепатотропные эффекты Прл связаны с регуляцией как метаболических функций печени -центральной метаболической системы организма, так и желчеобразовательных процессов в гепатоцитах.

Индукция пролиферативной активности клеток печени в период раннего постнатального онтогенеза и в результате перевязки общего желчного протока (ПОЖП) сопровождается появлением интенсивной экспрессии РПрл в эпителиальных клетках внутрипеченочных желчных протоков (холангиоцитах), являющихся у интактных взрослых животных Прл-независимыми (Смирнова с соавт., 1996, 1998). Основная часть РПрл в этих клетках локализована не в традиционных компартментах - плазматической мембране и цитоплазме, а клеточном ядре, что позволяет предполагать наличие у Прл неизвестной ранее регуляторной функции в отношении холангиоцитов, реализуемой, возможно, через неклассический путь проведения гормонального сигнала. Регуляция экспрессии РПрл в холангиоцитах существенно отличается от таковой в гепатоцитах, поскольку эта экспрессия не зависит от пола животных и половых стероидов.

К моменту начала данной работы, однако, оставались неясными клеточные механизмы индукции и поддержания высокого содержания РПрл в ядрах холангиоцитов в условиях обструктивного холестаза, особенности гормональной регуляции этих процессов

и физиологическое значение ядерной манифестации РПрл в холангиоцитах, индуцированной холестазом. Кроме того, отсутствовали данные о возможных функциях Прл в отношении гепатоцитов в условиях обструктивного холестаза.

В связи с появлением ядерной манифестации РПрл в пролиферативно активных холангиоцитах встает вопрос о том, насколько уникальной является локализация рецептора мембранного типа в клеточном ядре. До сих пор исследований такого рода не проводилось, а работы по изучению тканевых закономерностей экспрессии РПрл имели целью, в основном, сравнительный анализ интенсивности экспрессии РПрл в разных •псанях.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении особенностей экспрессии РПрл в клетках печени крыс после ПОЖП и ее возможного физиологического значения. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи.

1. Изучение участия Прл в регуляции экспрессии собственных рецепторов в холангиоцитах самцов и самок крыс после ПОЖП.

2. Выяснение возможного физиологического значения появления интенсивной ядерной экспрессии РПрл в холангиоцитах крыс после ПОЖП.

3. Исследование влияния ПОЖП на особенности экспрессии РПрл в гепатоцитах самок и самцов крыс и изучение влияния гомологичного гормона на экспрессию РПрл в гепатоцитах после ПОЖП.

4. Анализ внутриклеточного распределения РПрл в некоторых тканях крыс с относительно высоким содержанием этих рецепторов с целью выяснения тканевой распространенности и условий ядерной манифестации РПрл.

5. Иммуногистохимическая идентификация близкородственных РПрл по структурным и функциональным показателям рецепторов СТГ (РСТГ) в печени крыс для выявления возможных общих закономерностей тканевой и субклеточной экспрессии рецепторов гормонов семейства СТГ.

Научная новизна. Установлено, что ПОЖП индуцирует появление независимой от пола, интенсивной экспрессии РПрл в ядрах холангиоцитов и гепатоцитов крыс, которая не чувствительна к Прл в холангиоцитах и позитивно регулируется Прл в гепатоцитах. Показано участие Прл в поддержании пролиферативной активности клеток желчных протоков и в регуляции ионного баланса желчи в условиях обструктивного холестаза. Обнаружена интенсивная экспрессия РПрл в соединительной ткани

поджелудочной железы в период обструктнвного холестаза. Выявлена ядерная манифестация РПрл в клетках мозгового слоя надпочечников крыс. Впервые показаны закономерности тканевой и клеточной лок&чизации рецепторов СТГ в печени интактных крыс и ее зависимость от гормонального статуса.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся в фундаментальной эндокринологии представления о клеточных механизмах действия Прл, путях их половой и тканевой дифференцировки и регуляторных функциях Прл. Полученные данные важны для фундаментальной и клинической гепатологии в плане понимания компенсаторных и патологических изменений функций клеток печени в условиях обструктивного холестаза н роли Прл в этих изменениях. Обнаруженная в данной работе интенсивная экспрессия РПрл в ядрах хромаффинной ткани надпочечников открывает новые перспективы для изучения участия Прл в стрессорной реакции.

Апробаиия работы. Результаты диссертационной работы апробированы на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), V Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-98» (Москва, 1998), 33 ежегодном съезде Европейской Ассоциации по изучению печени (Лиссабон, 1998), 4 Европейском конгрессе по эндокринологии (Севилья, 1998), III Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, 1998). По теме диссертации опубликовано 8 работ, 1 работа принята в печать, 1 работа сдана в печать.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 11 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 234 источника, из которых 13 отечественных и 221 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе были использованы самцы и самки беспородных белых крыс и крыс линии Вистар весом 110-260 г. Всего в работе использовано 157 животных, не считая погибших после операции по ПОЖП.

Перевязка общего желчного протока (ПОЖЩ. Операцию проводили по модифицированной методике, описанной Alpini et al. (1988). Животных забивали через 10-

14 дней после операции.

Пересадку донорских гипофизов проводили под почечную капсулу крыс-реципиентов по стандартной методике (Киршенблат, 1969).

Введение препаратов.

а) Бромокриптии. Таблетки аптечного препарата парлодела суспензировали в 50% этаноле и вводили крысам подкожно в дозе 10 мг/кг (по 0,5 мл суспензии) ежедневно, начиная с 1-4 дня после операции ПОЖП. Контрольным животным вводили по 0,5 мл растворителя по той же схеме.

б) 17р-эстрадиол вводили интактным самкам а) при изучении надпочечников по 1 мкг в 0,2 мл пропиленгликоля внутримышечно в течение 4 дней; б) в эксперименте по иммуногистохимической идентификации РСТГ - по 15 мкг в 0,5 мл пропиленгликоля внутримышечно в течение 10 дней.

Иммуногистохимическая идентификация РПрл. Локализацию РПрл в печени определяли непрямым иммунопероксидазным методом (Зпдтоуа с1 а1., 1994). Срезы ткани, заключенной в парапласт, последовательно инкубировали с мышиными моноклональными антителами клона Ш или 115 (или с буфером для разведения антител для контроля специфической окраски), кроличьей антимышиной сывороткой и козьими антикроличьими антителами, меченными пероксидазой. В качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин.

Иммуногистохимическая идентификация РСТГ. В качестве первых антител использовали антисыворотку морской свинки, содержащую поликлональные антитела к внеклеточному домену РСТГ человека, перекрестно реагирующие с РСТГ кролика и крысы. Срезы последовательно инкубировали с первыми антителами, кроличьими антителами против морской свинки, с козьими антителами против ^ кролика, конъюгированными с биотипом, и с экстравидинпероксидазой. Пероксидазу визуализировали с помощью 3,3'-диаминобензидина. В качестве контроля специфичности первых антител параллельно проводили инкубацию части срезов а) с неиммунной сывороткой морской свинки; б) с буфером для разведения.

Цитофотометрический анализ. Цитофотометрические измерения проводили на люминесцентном фотометрирующем микроскопе ЛЮМАМ И-3 (Об. х 40), при Х.=520 им, используя световые зонды диаметром 12,5 мкм и 2,5 мкм. Измерения

светопропускания проводили в 100-120 точках на одни срез. У каждого животного анализировали по 2 среза.

Анализ степени пролиферации желчных протоков осуществляли по доле площади, занимаемой желчными протоками, от общей площади срезов печеночной ткани, окрашенной гематоксилином, с помощью рисовального аппарата, совмещенного с микроскопом. У каждого животного анализировали по 8-10 участков на 2-3 срезах ткани печени.

Измерение концентрации неорганических ионов в желчи. Желчь отбирали при забое из желчного протока. Концентрацию ионов Na* и К+ измеряли с помощью пламенной фотометрии, ионов НС03 - с помощью титрования 0,1 н. раствором НС1.

Измерение концентрации билирубина в сыворотке. Концентрацию билирубина в сыворотке исследовали с помощью готовых наборов реактивов «БИО-ЛЛ-ТЕС'Г Билирубин» и «БИО-ЛА-ТЕСТ Билирубин Эталон», («Lachema diagnostica», Чешская Республика).

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ результатов проводили с помощью компьютерной программы «Statistica for Windows 4.5». Анализ гомогенности выборок проводили с помощью метода ANOVA, тест нормальности распределения исследуемых величин проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для анализа значимости наблюдаемых различий использовали t-критерий Стьюдента, а при исследовании концентрации билирубина - односторонний точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экспрессия РПрл в клетках желчных протоков крыс после ПОЖП

1. Цитофотометрический анализ зависимости содержания РПрл в холангиоцитах крыс после ПОЖ11 от пола животных. Ранее на качественном уровне было показано, что экспрессия РПрл в холангиоцитах после ПОЖП не зависит от половых стероидов (Смирнова с соавт., 1998). Для проверки этого заключения в данной работе был применен количественный подход к оценке специфического для РПрл окрашивания ядер холангиоцитов после ПОЖП у крыс с помощью цитофотометрии. С учетом того, что в

холангиоцитах в период гиперплазии ядра увеличиваются в размерах, занимая большую часть объема клетки, полученные результаты в значительной мере отражают общее содержание РПрл в клетках желчных протоков.

В данном эксперименте РПрл-позитивное окрашивание ядер холангиоцитов не обнаруживало половых различий (рис. 1), что является еще одним подтверждением гипотезы о независимости манифестации РПрл в холангиоцитах от половых стероидов после ПОЖП. 0.3

Рис. 1. Цитофотометрический

Ь 0.25

анализ интенсивности экспрессии рецепторов пролактина в холангиоцитах самцов и самок крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока. Здесь и на последующих рисунках данные представлены как среднее ± стандартная ошибка, п - количество животных

САМЦЫ (п=3)

САМКИ (п=6)

Группы животных

2. Влияние пролактина на интенсивность экспрессии РПрл в холангиоцитах после ПОЖП. Еще одним известным регулятором РПрл в клетках является сам Прл: широко известно стимулирующее действие этого гормона на собственные рецепторы во многих тканях, в том числе в гепатоцитах (Мапш с! а1., 1978; Лтк й а1., 1984; ВатЬ (¡1 а1., 1986). С целью исследования влияния Прл на РПрл холангиоцитов крыс после ПОЖП использовали две модели: а) специфическое торможение секреции Прл бромокриптином (БК) у самок и самцов крыс, б) индукцию гиперпролактинемии путем пересадки донорских гипофизов под почечную капсулу самцов перед операцией по ПОЖП (Ма1Бш1а ег а1., 1996).

Было обнаружено, что ни обработка животных БК, ни наличие эктопических гипофизов не влияют на уровень специфического для РПрл окрашивания холангиоцитов (рис. 2, А, Б).

На основе полученных данных был сделан вывод о том, что появление и поддержание высокого уровня экспрессии РПрл в холангиоцитах крыс обусловлено факторами иными, нежели гормональные (половые стероиды, Прл), скорее всего -местными процессами, индуцируемыми обструкцией желчных путей.

0 25

Д

Г>

о X 0.2

о

с 01.4

О»

я

ё 0.1

?

п О 0.05

П

(п=3) (п=3) (п=6) (п=8) САМЦЫ САМКИ

Группы животных Г I Без введения бромокриптина С введением бромокриптина

(п=4)

(п=4)

I_] ПОЖП + ложная

операция

□ ПОЖП+пересадка гипофиза

Рис. 2. Цитофотометрический анализ влияния бромокриптипа (Л) и пересадки донорских гипофизов (Б) на интенсивность экспрессии рецепторов пролактина в холангиоцитах крыс после перевязки общего желчного протока (ПОЖП)

2. Экспрессия РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП

1. Цитоплазматическая манифестация РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП. ПОЖП не вызывает качественных изменений в компартментализации и интенсивности специфического для РПрл окрашивания геиатоцитов (Смирнова с

соавт., 1998), однако изменение и нарушение функций гепатоцитов при обструктивном холестазе может включать изменения в регуляции экспрессии РПрл. С целью проверки этой возможности был проведен цитофотометрический анализ интенсивности специфического для РПрл окрашивания гепатоцитов с использованием антител Ш на фоне обработки БК, проведенной после операции по ПОЖП.

У оперированных животных, получавших растворитель, специфическое для РПрл окрашивание гепатоцитов обнаруживало четкие половые отличия, будучи в 1,3 раза интенсивнее по оптической плотности у самок (р<0,01). После 9-дневного введения БК интенсивность манифестации РПрл в гепатоцитах самок крыс снизилась по сравнению с контролем (р<0,05), приближаясь к выявленной у самцов. У самцов аналогичная схема введения препарата не вызвала изменения РПрл-позитивного окрашивания гепатоцитов. В

результате исчезли достоверные половые отличия (р>0,1) РПрл-позитивной реактивности гепатоцитов опытных животных (рис. 3). Снижение интенсивности экспрессии РПрл в гепатоцитах самок под влиянием БК происходило равномерно во всех зонах печеночной дольки (Табл. 1).

0.25,-

Рис. 3. Цитофотометрический анализ влияния бромокриптина на интенсивность экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцитах крысчерез 14днейпослеперевязки общего желчного протока. #£><0,01 по сравнению с контрольной группой самцов, получавших растворитель; *р<0,05 по сравнению с контрольной группой самок, получавшихрастворитель

(п=3) (п=3) САМЦЫ

Группы животных

(п=5) (п=5) САМКИ

1 1С введением растворителя ш С введением бромокриптина

Таблица 1. Влияние бромокриптина на интенсивность экспрессии рецепторов пролактина (РПрл) в гепатоцитах разных зон печеночной дольки самок через 14 дней после перевязки общего желчного протока.

Группы оперированных животных Интенсивность РПрл-специфической окраски гепатоцитов

центральная зона промежуточная зона перипортальная зона

получавшие растворитель (п= 5) 0,209 ±0,010 0,?18± 0,008 0,203 ± 0,005

получавшие броуокриптин (п=5) 0,174 ±0,008* 0,183 ±0,006* 0,181 ±0,009*

Здесь и в последующих таблицах данные представлены как среднее ± стандартная ошибка, п - число животных. *р<0,05 по сравнению с соответствующими зонами печеночной дольки животных, обработанных растворителем.

Полученные нами данные о снижении интенсивности специфической для РПрл окраски гепатоцитов у самок крыс под действием БК свидетельствуют о сохранении позитивного контроля над РПрл со стороны Прл после ПОЖП. Отсутствие эффекта БК на интенсивность специфической для РПрл окраски гепатоцитов самцов объясняется, по

всей видимости, низким уровнем экспрессии РПрл в этих клетках (Ке11у е1 а1., 1974; Згтттюуа е! а1., 1994), на фоне которого выявление дополнительного негативного влияния отсутствия Прл затруднено.

2. Ядерная манифестация РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП и влияние на лее Прл. Использование в качестве первых антител клона Ш, но не Ш, позволило обнаружить индуцированное ПОЖП РПрл-позитивное окрашивание, локализованное в ядрах гепатоцитов. Окрашивание в ядре было существенно выше, чем в цитоплазме гепатоцитов и наблюдалось во всех зонах печеночной дольки, однако не во всех клетках.

Известно, что клоны Ш и Ш обладают сходным сродством к РПрл и направлены к антигенным детерминантам, локализованным в участках внеклеточного домена, отличных от его гормон-связывающего центра (Е1Ьег§ е1 а1., 1990). Возможно, различия антител № и П6 в способности распознавать РПрл в ядрах гепатоцитов связаны с тем, что транслокация РПрл к ядру включает изменения их конформации и/или модификацию в эндосомально-лизосомальном компартменте, в результате которых они перестают узнаваться антителами Ш, но сохраняют способность взаимодействия с антителами 115.

В холангиоцитах, в отличие от гепатоцитов, не было обнаружено различий клонов и5 и иб в способности связываться с ядерными РПрл. Это обстоятельство может объясняться структурными отличиями ядерных РПрл в двух типах клеток и/или различиями экспонирования РПрл в ядрах холангиоцитов и гепатоцитов.

Механизмы регуляции Прл ядерной экспрессии РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП были исследованы с использованием моделей ингибирования секреции Прл гипофизом БК и создания гиперпролактинемии путем пересадки под почечную капсулу самцов гипофизов от самцов-доноров.

Интенсивность ядерной манифестации РПрл в гепатоцитах варьировала от отсутствия отличий с цитоплазматической (гепатоциты типа 1) до значительного преобладания над ней (гепатоциты типа 2). Цитофотометрический анализ экспрессии РПрл в ядрах проводили только для клеток второго типа, используя два параметра: а) долю гепатоцитов типа 2; б) интенсивность специфического для РПрл окрашивания в гепатоцитах типа 2 с учетом зопатьиых особенностей этого показателя. Кроме этого, оценивали интенсивность цитоплазматической экспрессии РПрл в гепатоцитах без учета зональной вариации.

В доле гепатоцитов с интенсивной ядерной манифестацией РПрл не было обнаружено достоверных зональных отличий у всех групп животных, за исключением самцов с ПОЖП и введением БК. Однако наблюдалась общая тенденция повышения доли гепатоцитов типа 2 от перицентральной к перипортальной зоне во всех экспериментальных группах (Табл. 2).

Цитофотометрический анализ интенсивности РПрл-позитивного окрашивания ядер гепатоцитов обнаружил, что у самок с ПОЖП оптическая плотность специфически окрашенных ядер гепатоцитов существенно ниже в перицентральной зоне, чем в остальных, тогда как у самцов не выявлено зональных вариаций интенсивности ядерной манифестации РПрл. Эта закономерность сохранилась и после введения БК. Кроме того, БК индуцировал значительное снижение специфического ядерного окрашивания в перицентральной и промежуточной, но не в перипортальной зоне (Табл. 3).

Доля гепатоцитов типа 1 у самцов с ПОЖП без предшествующей пересадки гипофиза была ниже в перицентральной зоне, чем в перипортальной и промежуточной. Повышение уровня Прл вызвало снижение доли гепатоцитов типа 2, достоверность чего показана для перицентральной и перипортальной зон (Табл. 4).

Таблица 2. Влияние бромокриптина на долю гепатоцитов с интенсивным РПрл-позитивнъш окрашиванием ядер (тип 2) у самцов и самок крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока

Доля гепатоцитов с окрашиванием типа 2 (%)

Зона САМЦЫ САМКИ

печеночной Без БК С БК Без БК С БК

дольки (п=5) (п=5) (п=4) (п=4)

перицентральная 61.2+8.91 58.4+6.31 59.8+6.98 35.5+7.23

промежуточная 66.8+4.92 63.0+1.67 65.5+2.90 63.5+5.36

перипортальная 77.4+5.89 70.0+2.17* 67.0+10.79 67.3+3.04

* /КО,05 по сравнению с промежуточной зоной той же группы самцов

Таблица 3. Влияние бромокриптина на интенсивность экспрессии РПрл в ядрах и цитоплазме гепатоцитов разных зон печеночной дольки самок и самцов крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока

Интенсивность РПрл-позитивной окраски,

Клеточный ед. оптической плотности

компарт- Зона САМЦЫ САМКИ

мент печеночной Без БК С БК Без БК С БК

дольки (П=4) (п=5) (п=4) (п=3)

перицентральная 0.257+0.018 0.251+0.026 0.212+0.007 0.157+0.002""

ЯДРО промежуточная 0.282+0.029 0.295+0.018 0.250+0.006** 0.207+0.015*'"

перипортальная 0.292+0.024 0.287+0.018 0.250+0.007" 0.225+0.014"

цитоплазма - 0.124+0.012 0.127+0.011 0.120+0.011 0.084+0.005 *

* р<0,05, ** /><0,01 по сравнению с перицентральной зоной той же группы; * р<0,05, р<0,01 по сравнению с аналогичной зоной группы самок с введением растворителя

Таблица 4. Влияние пересадки донорских гипофизов на долю гепатоцитов с интенсивным РПрл-позитивньш окрашиванием ядер (тип 2) в зонах печеночной дольки самцов крыс через 10 дней после ПОЖП

Зона печеночной дольки Доля гепатоцитов с окрашиванием типа 2 (%)

ПОЖП + ложная операция (п=4) ПОЖП+ пересадка гипофиза (п=4)

перицентральная 53.5+2.6 23.5+9.9*

промежуточная 66.8+3.1* 45.0±8.5

перипортальная 74.5+4.4** 49.8+8.4"

* р<0.05, **р<0,01 по сравнению с перицентральной зоной той же группы животных; # р<0,05 по сравнению с аналогичной зоной группы животных с ПОЖП и ложной операцией по пересадке гипофиза

Специфическое окрашивание ядер гепатоцитов у животных без пересадки гипофиза было ниже в перицентральной зоне, чем в промежуточной, и наблюдалась тенденция повышения специфического для РПрл окрашивания от перицентральной зоны к перипортальной. Повышение концентрации Прл в крови в результате трансплантации

гипофизов вызвало исчезновение зональности этого признака и индуцировало значительное снижение специфического ядерного окрашивания во всех зонах печеночной дольки, а также в цитоплазме гепатоцитов (Табл. 5).

Таблица 5, Влияние пересадки донорских гипофизов на интенсивность экспрессии РПрл в ядрах и цитоплазме гепатоцитов разных зон печеночной дольки самцов крыс через 10 дней после ПОЖП

Интенсивность РПрл-позитивной

Клеточный Зона окраски, ед. оптической плотности

компарт- печеночной ПОЖП + ложная ПОЖП +

мент дольки операция (п=4) пересадка гипофиза (п=4)

перицентральная 0.213+0.011 0.151+0.013*

ЯДРО промежуточная 0.244+0.008* 0.158+0.016"*

перипортальная 0.233+0.007 0.176+0.020*

цитоплазма - 0.107+0.004 0.067+0.005***

* р<0,05 по сравнению с перицентральной зоной той же группы животных; * р<0,05, р<0,01, т р<0,001 по сравнению с аналогичной зоной группы животных с ПОЖП и ложной операцией по пересадке гипофиза

Таким образом, ПОЖП вызывает появление интенсивной ядерной экспрессии РПрл в гепатоцитах крыс с тенденцией к зональному градиенту. Эта тенденция проявляется как в форме увеличения доли клеток с интенсивной РПрл-позитивной окраской ядер клеток, так и в форме увеличения абсолютных значений этой окраски в направлении портальной зоны.

Регуляция Прл собственных рецепторов в ядерной области гепатоцитов у самок после ПОЖП имеет в целом те же закономерности, что и в цитоплазме. У самцов с ПОЖП снижение уровня Прл не оказывает заметного влияния на РПрл-специфическое окрашивание ядер паренхимных клеток, а избыток содержания гормона действует на него негативно. Таким образом, система регуляции РПрл в ядрах гепатоцитов гомологичным гормоном после ПОЖП дифференцирована по полу.

Функциональное значение индуцированной ПОЖП манифестации РПрл в ядрах

гепатоцитов еще предстоит выяснить. Можно предположить, что появление РПрл в ядрах связано с появлением у Прл новых функций в отношении гепатоцитов, реализуемых через ядерпые РПрл, в частности, в регуляции пролиферативных процессов (Buckley et al., 1988). В этом случае зональность в содержании РПрл в ядрах гепатоцитов может быть следствием повышения пролиферативной активности гепатоцитов преимущественно в перипортальных областях в условиях холестаза (Fallon et al., 1993), но нельзя исключить, что зональность ядерной манифестации РПрл отражает хорошо известные разлитая в функциональной активности гепатоцитов разных зон, имеющей место и у ингактных животных (Basman, Baker, 1992).

3. Возможная физиологическая роль пролактпна и его рецепторов в клетках печени крыс после перевязки общего желчного протока

Исхода из известных функций Прл, мы исследовали его влияние на 1) пролиферативную активность клеток желчных протоков; 2) ионный баланс желчи путем измерения концентрации неорганических ионов - Na+, К* и НС03" в желчи после ПОЖП. В качестве функционального теста на изменение активности клеток печени при ПОЖП исследовали концентрацию билирубина в сыворотке.

1. Изучение степени пролиферации желчных протоков после ПОЖП и влияния на нее Прл. В первой части эксперимента пролиферацию желчных протоков изучали у самок и самцов крыс, обработанных БК после операции по ПОЖП. В качестве контроля использовали две группы животных: а) контроль 1: операция по ПОЖП без введения каких-либо веществ; б) контроль 2: введение растворителя вместо БК после ПОЖП.

Вторая часть эксперимента состояла в изучении степени пролиферации желчных протоков у самцов с пересадкой донорских гипофизов после ПОЖП.

В двух контрольных группах самцов и самок половых различий в степени пролиферации желчных протоков не наблюдалось. Введение БК индуцировало снижение степени пролиферации желчных протоков у самцов (р<0,01), тогда как у самок влияния БК на этот показатель не выявлено (рис. 4).

В эксперименте по ПОЖП у самцов крыс на фоне повышенного содержания Прл в крови, вызванного пересадкой донорских гипофизов под почечную капсулу, пролиферация желчных протоков у опытных животных оказалась выше, чем у контрольных (р<0,05, рис. 5).

Полученные данные свидетельствуют о существенном позитивном влиянии Прл на пролиферативную активность холангиоцитов у самцов. Половые различия в эффекте Прл на пролиферацию холангиоцитов могут быть связаны, в частности, с половыми различиями ритма секреции Прл гипофизом [Розен с соавт., 1991] и/или с выраженностью влияния на пролиферацию других зависимых от пола факторов. В то же время изменение содержания Прл в крови не оказывает влияния на интенсивность экспрессии РПрл в холангиоцитах животных с ПОЖП. Можно поэтому полагать, что уровень РПрл в холангиоцитах - не определяющий фактор эффективности действия Прл и что механизмы влияния Прл на собственные рецепторы и пролиферация клеток расходятся на ранних этапах проведения гормонального сигнала.

(п=3) (п=13) (п=12) (п=7) (П=14) (п=14) САМЦЫ САМКИ

I I Контроль 1 Контроль 2 В Опыт

Рис. 5. Влияние бромокриптина на пролиферацию желчных протоков в печени крыс после перевязки общего желчного протока. По оси ординат отложена доля площади, занимаемой желчными протоками на срезах печени. Комментарии по группам животных в тексте. р<0,01 по сравнению с контролем 2 (самцы)

Э 4

1 ! -4-

1 щ

— —!—РНт—

; ИВ

1 ид!

ПОЖП+ ложная операция (п=8)

ПОЖП + пересадка гипофиза

(п=5>

Рис. 6. Влияние пересадки гипофиза на пролиферацию желчных протоков у самцов крыс после перевязки общего желчного протока. По оси ординат отложена доля площади, занимаемой желчными протоками на срезах печени. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой самцов (ПОЖП + ложная операция)

2. Влияние Прл на ионный баланс желчи после ПОЖП. Содержание в желчи самок контрольной группы с ПОЖП было выше, чем в желчи самцов (р<0,01). Под воздействием БК половые различия исчезали за счет снижения концентрации Ка+ в желчи у самок при отсутствии реакции у самцов (р<0,001, Табл. 6).

Таблица 6. Влияние БК на концентрацию неорганических ионов в желчи крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока

Концентрация, ммоль/л

Самцы Самки

Ионы С растворителем С БК С растворителем С БК

(п=8) (П=7) (п=15) (п=14)

N3* 122,8 + 5,43 134,40 + 4,14 148,75 + 4,11" 127,78 + 2,75*

К' 4,35 + 0,18 4,66 + 0,11 4,80 + 0,23 5,01 +0,23

НСОз" 33,11 + 1,76 32,51 +0,91 33,32 + 1,63 29,49 + 1,30

* достоверное отличие от группы с введением растворителя (р<0.001)

* достоверное отличие от аналогичной группы самцов (р<0.01) Концентрация ионов К+ и НСОз" в желчи самцов и самок с ПОЖП не имела половых различий у контрольных животных и не изменялась при введении БК. У самцов, которым перед ПОЖП проводили пересадку донорских гипофизов, не было обнаружено отличий ионного состава желчи с контрольными самцами.

Был проведен также анализ количества желчи в общем желчном протоке животных на момент забоя, который показал, что введение БК самкам с ПОЖП приводит к увеличению объема желчи в общем желчном протоке по сравнению с контрольными самками, а у самцов изменения концентрации Прл в крови не влияют на этот показатель.

По-видимому, БК оказывает холеретический эффект на печень самок в условиях индуцированного холестаза. Можно было бы предположить, что снижение концентрации ионов Ка* в желчи самок под воздействием БК связано с увеличением объема вырабатываемой желчи. Однако на содержание ионов К+ и НС03' это обстоятельство не оказало влияния, поэтому представляется более вероятным, что БК оказывает тормозящий эффект на транспорт в желчь. Вероятной мишенью выявленного действия Прл служат гепатоциты.

3. Влияние БК на содержание бширубина в сыворотке животных с ПОЖП. У животных с ПОЖП наблюдалась высокая концентрация билирубина в сыворотке. Концентрация общего билирубина в сыворотке оперированных животных не обнаруживала достоверных половых различий, однако анализ фракций билирубина показал, что у самцов содержание неконьюгированного билирубина в 2,22 раза ниже, чем у самок, тогда как концентрация конъюгированного билирубина была сходной у самок и самцов.

Введение БК индуцировало дополнительный рост концентрации билирубина, более выраженный у самок по сравнению с самцами - на 83 и 57% соответственно. Если у самок рост концентрации билирубина в сыворотке был вызван параллельным увеличением конъюгированной и неконъюгированной фракций (в 1,8 и 2 раза соответственно по сравнению с контролем), то у самцов увеличение концентрации билирубина происходило почти исключительно за счет неконъюгированной фракции (возросшей в 3 раза), тогда как во фракции конъюгированного билирубина, в отличие от самок, заметных изменений обнаружено не было, что обусловило появление заметных половых различий в содержании конъюгированного билирубина (Табл. 9).

Таблица 9. Влияние бромокриптина (БК) на концентрацию билирубина в сыворотке крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока

Фракции билирубина, мкмоль/л САМЦЫ САМКИ

Без БК (п=13) С БК (п=14) Без БК (п=14) С БК (п=11)

Общий билирубин 55,03+ 14,38 86,29 +12,95*'* 69,54 + 11,54 130,47 + 22,88**

Неконъюгированный билирубин 9,77 + 2,32** 30,38 + 4,59*** 21,71+4,69 43,44 + 6.46**

Конъюгированный билирубин 45,26 + 12,75 55,91 +8,88"** 47,83 + 9,71 87,04 + 17,64*

* р<0.05, ** /?<0.01, *** р<0.001 по сравнению с контрольной группой животных

того же пола (с введением растворителя); * /т<0.05, ш р<0.0\, *** р<0.001 по сравнению с соответствующей группой самок

Увеличение содержания общего и прямого билирубина в сыворотке животных, обработанных БК, свидетельствует об ухудшении функционирования гепатоцитов в отсутствие Прл у животных с ПОЖП, и, следовательно, о значительном вкладе Прл в регуляцию функций клеток печени, связанных с захватом и метаболизмом билирубина.

Экспрессия РПрл в некоторых других тканях крыс

1. Надпочечники. В хромаффинной ткани мозгового вещества надпочечников, помимо мембранной и цитоплазматической компартментализации РПрл, была

обнаружена ядерная п околоядерная локализация этих рецепторов. Анализ зависимости внутриклеточной компартментализацин РПрл от пола показал, что специфическое для РПрл окрашивание у самок ассоциировано преимущественно с цитоплазматическими и внутриядерными структурами, а у самцов более выражено специфическое для РПрл окрашивание клеточных мембран и околоядерного пространства.

Цитофотометрический анализ ядерной экспрессии РПрл в мозговом слое надпочечников показал выраженную зависимость этого показателя от пола и от женских половых стероидов: ядерная манифестация РПрл оказалась выше у самок, чем у самцов, и интенсивнее у самок, обработанных эстрадиолом, нежели у интактных самок (рис. б).

| | интактиые самцы

Г"" 1 интактиые самки

I I эстрогенизированные самки

п=4 п=4 п=4

Рис. 6. Цитофотометрический анализ экспрессии рецепторов пролактина в ядрах клеток мозгового слоя надпочечников. ** р<0,01 по сравнению с группой интактных самцов; # р<0,05 по сравнению с группой интактных самок

Ядерная манифестация РПрл в клетках хромаффшшой ткани надпочечников может быть связана с регуляцией Прл синтеза и секреции катехоламинов (Fernandez-Ruiz etal., 1987,1988; Hernandez et al„ 1991).

2. Почки. Содержание РПрл оказалось очень высоким как в корковом, так и мозговом веществе. В извитых канальцах коркового слоя и канальцах мозгового слоя РПрл-позитивное окрашивание было локализовано в плазматической мембране и цитоплазме.

3. Яичники. В клетках желтого тела и фолликулов было обнаружено интенсивное РПрл-иознтивное окрашивание. Самое сильное специфическое окрашивание было ассоциировано с цитоплазмой яйцеклеток; менее интенсивно окрашивались плазматические мембраны и цитоплазма фолликулярных и лютеальных клеток. Клетки соединительнотканной стромы окрашивались слабо.

4. Поджелудочная железа. Наиболее высоким содержанием РПрл у интакгных животных характеризовались островки Лангерганса, тогда как в ацинарной, соединительной ткани и протоковых структурах РПрл-позитивное окрашивание было слабым.

Была проведена также иммуногистохимическая идентификация РПрл в клетках поджелудочной железы после ПОЖП. Выбор этого объекта был обусловлен фактом онтогенетического родства и физиологического сходства протоковых структур печени и поджелудочной железы (Wheeler et al., 1960; Хэм, Кормак, 1983; Lenzen et al., 1992), и цель данного исследования состояла в сравнении изменений, происходящих в этих структурах в период обструктивиого холестаза.

ПОЖП вызвала патологические изменения в структуре поджелудочной железы, выраженные в разрастании соединительной ткани, пролиферации клеток протоковой системы и гипертрофии ацинарных клеток. Иммуногистохимическая идентификация РПрл показала заметное усиление специфической для РПрл окраски соединительнотканных структур. Четкой ядерной локализации РПрл в протоках поджелудочной железы, в отличие от желчных протоков, не было обнаружено.

Из полученных результатов можно сделать вывод о различиях регуляции экспрессии Прл собственных рецепторов в клетках печени и поджелудочной железы, в частности, в соединительной ткани и в протоковых клетках этих желез, несмотря на высокое сходство функций последних (Wheeler et al., 1960; Lenzen et al., 1992).

Итак, в исследованных тканях наиболее часто наблюдается ассоциация РПрл с плазматической мембраной и цитоплазматическими структурами. В хромаффинной ткани надпочечников обнаружена ядерная экспрессия РПрл, зависимая от пола и женских половых стероидов.

Иммуногистохимическая идентификация рецепторов СТГв печени крыс

Рецепторы Прл и СТГ принадлежат к одному суперсемейству и имеют высокое сходство в строении и механизмах проведения сигналов их лигандов (Boutin et al., 1988; Gouilleux et al., 1995).

С помощью разработанного нами метода иммуногистохимической идентификации РСТГ в ткани печени крыс мы исследовали особенности экспрессии РСТГ в печени крысы в зависимости от пола и гормонального статуса с целыо сравнения

субклеточной и тканевой компартментализации рецепторов Прл и СТГ. Для работы использовали а) интактных самцов и самок, б) беременных самок, в) самок, обработанных эстрадиолом.

В исследуемых экспериментальных группах животных специфическое для РСТГ окрашивание наблюдалось во всех гепатоцитах, но не литоральных клетках, причем это окрашивание было одинаковым во всех зонах печеночной дольки.

В пределах клетки зависимое от РСТГ окрашивание было обнаружено а) в синусоидальных доменах клеточных мембран, б) в цнтоплазматических гранулах, в) у эстрогенизированных самок - в околоядерной области и/или ядерных мембранах некоторых клеток в перицентральной зоне печеночной дольки.

Далее, было обнаружено, что экспрессия РСТГ имеет ползависимый характер: интенсивность специфического для РСТГ окрашивания оказалась выше у самок, чем у самцов. При этом специфическое окрашивание ассоциировано у самок преимущественно с цитоплазматическими гранулами, а у самцов более выражено специфическое для РСТГ окрашивание клеточных мембран.

У беременных и эстрогенизированных самок интенсивность специфического для РСТГ окрашивания существенно возросла по сравнению с нормальными самками.

Итак, тканевая и внутриклеточная локализация РСТГ сходна с таковой РПрл, и следовательно, одни и те же гепатоциты одновременно экспрессируют оба типа рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о том, внутриклеточная локализация РПрл отличается в разных тканях и разных клеточных популяциях, что позволяет предположить тканеспецифичность клеточной экспрессии этих рецепторов, связанную, возможно, с дифференциальной активностью регуляторных участков промотора гена РПрл в разных тканях, различным соотношением короткой и длинной изоформ рецептора и их компартментализацией, которые обеспечивают различие спектра клеточных каскадов, запускаемых Прл в разных типах клеток. Ядерная манифестация РПрл обнаруживается в гепатоцитах и холангиоцитах крыс в условиях обструктивного холестаза и я мозговом слое надпочечников интактных животных обоего пола. Появление ядерной локализации РПрл в клетках печени после ПОЖП связано, в

частности, с повышением пролиферативной активности этих клеток. Полученные нами данные о ядерной манифестации РПрл в различных типах клеток служат поддержкой гипотезе о наличии прямого пути воздействия Прл на ядерные события, помимо активации им ряда посредников на плазматической мембране и в цитоплазме клетки в ходе осуществления его эффектов.

ВЫВОДЫ

1. Обструктивный холестаз индуцирует появление интенсивной экспрессии рецепторов пролактина в ядрах холангиоцитов и гепатоцитов крыс. Эта экспрессия не зависит от пола, не чувствительна к пролактину в холангиоцитах и позитивно регулируется пролактином в гепатоцитах.

2. Обструктивный холестаз не нарушает общей направленности регуляции уровня рецепторов пролактина в цитоплазме гепатоцитов гомологичным гормоном.

3. Роль пролактина в условиях обструктивного холестаза заключается в стимуляции пролиферативной активности холангиоцитов у самцов крыс и позитивном влиянии на содержание ионов натрия в желчи у самок.

4. Пролактин в условиях обструктивного холестаза участвует в поддержании функций печени, связанных с метаболизмом билирубина, снижая концентрацию общего билирубина в крови.

5. Обструктивный холестаз индуцирует' патологические изменения в поджелудочной железе крыс, сопровождаемые усилением экспрессии рецепторов пролактина в соединительной ткани железы.

6. В мозговом слое надпочечников интактных животных обнаружена ядерная манифестация рецепторов пролактина, зависимая от пола и эстрогенов.

7. Рецепторы пролактина и соматотропного гормона в печени интактных крыс имеют сходный характер тканевой и внутриклеточной локализации и особенности регуляции ее половыми стероидами.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Орлова А. Н., Смирнов А. Н., Смирнова О. В.. Иммуногистохимический анализ рецепторов соматотропного гормона в клетках печени крыс от пола и гормонального статуса // Бюлл. эксп.биол. мед. - 1997 - Т. 124. - №10 - С.432-435

2. Смирнова О. В., Петращук О. М., Орлова А. Н., Смирнов А. Н.. Рецепторы пролактина: субклеточная компартментализация под действием гормональных и пролиферативных стимулов // Второй съезд биохимического общества РАН, Москва, 1923 мая 1997 г. Тезисы стендовых сообщений, Ч. 1 - Москва - 1997 - С. 288-289

3. Орлова А. Н. Физиологическая роль усиления экспрессии рецепторов пролактина в холакгиоцитах крыс поете перевязки общего желчного протока И V Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-98». Секция фундаментальной медицины и физиологии. Тезисы докладов -М.: 1998 - С.27-28

4. Орлова А. Н., Смирнова О. В., Туровецкий В. Б., Смирнов А. Н. Влияние ингибитора секреции пролактина - бромокршгшна на интенсивность экспрессии рецепторов пролактана в клетках печени крыс после перевязки общего желчного протока // Бюлл.эксп.биол.мед. - 1998 - Т. 126 - №7 - С.52-55

5. Орлова А. Н., Смирнов А. Н., Смирнова О. В.. Исследование роли пролактина в регуляции некоторых функций клеток печени после перевязки общего желчного протока // Бюлл.эксп.биол.мед. Принята в печать

6. Орлова А. Н., Смирнова О. В., Туровецкий В. Б., Смирнов А. Н. Ядерная манифестация рецепторов пролактина в гепатоцитах крыс и влияние на нее пролактина // Бюлл.эксп.биол.мед. Сдана в печать

7. А. Н. Орлова. Молекулярные механизмы формирования карликовости Ларона II Новости науки и техшпот - Сер. Мед. Вып. Клиническая эндокринология/ВИНИТИ -1997 - №1 - C.vi-viii

8. Smirnova O.V., Petraschuk ОМ. Orlova A.N. Common bile duct ligation: induction of cholangiocyte prolactin receptor manifestation insensitive to hormonal regulation // J.Hepatol. - 1998 -V.28 - JNslS - P.173 (Proceeding of 33rd Annual Meeting of European Association for the Study of the Liver, Lisbon, Portugal, April 15-18, 1998)

9. Smirnova O.V., Petraschuk О M., Orlova A. N. The mode of prolactin receptor ways of localization of rat liver cell proliferation // Proceedings of 4th European Congress of Endocrinology, Sevilla. Spain, May 9-13, 1998 - Oslo, Copenhagen, Stockholm - 1998 -Abstract .\s PI-332

10. Orlova A. N.,. Smirnova O.V, Smimov A. N. Appearance and functions of prolactin receptors in cholangiocytes after common bile duct ligation // Pathophysiology - 1998 - V.5 - Suppl.l -P.230 (111 International Congress of Pathophysiology, Lahti, Finland, 28 June - 3 July, 1998)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Альбина Николаевна, Москва

Д _ //Г У ^

.4/ / (/ ^ у/ С/ ъ/

/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра физиологии человека и животных Лаборатория эндокринологии

На правах рукописи УДК 612.357.65:577.175.328

ОРЛОВА Альбина Николаевна

ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ КРЫС В УСЛОВИЯХ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА И ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.00.13 - физиология человека и животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук А. Н. Смирнов доктор биологических наук О. В. Смирнова

Москва -1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................. 4

Глава 1. РОЛЬ ПРОЛАКТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ПЕЧЕНИ В НОРМЕ И ПОСЛЕ ПОЖП (литературный обзор).................................................7

1. ФИЗИОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ.........................................................................................7

1.1. Особенности морфофункциональной организации печени...................7

1.2. Физиологические функции печени............................................................9

1.2.1. Печень как центральная метаболическая система....................9

1.2.2. Экзокринная функция печени (желчеобразование)...............12

2. ПЕРЕВЯЗКА ОБЩЕГО ЖЕЛЧНОГО ПРОТОКА (ПОЖП) КАК МОДЕЛЬ ОБСТРУКЦИИ ОБЩЕГО ЖЕЛЧНОГО ПРОТОКА................................................22

2.1. Модель ПОЖП в клинических исследованиях процессов, происходящих при закупорке общего желчного протока ............22

2.2. Динамика компенсаторных и патологических изменений, происходящих в печени после ПОЖП............................................23

2.3. Модификация функций гепатоцитов после ПОЖП..............................25

2.3.1. Изменения желчеобразования..................................................27

2.3.2. Изменения метаболизма билирубина......................................29

2.4. Модификация функций клеток желчных протоков после ПОЖП...............................................................................................................30

3. ФУНКЦИИ ПРОЛАКТИНА В ОРГАНИЗМЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ ЕГО ЭФФЕКТОВ.............................................................................34

3.1.Синтез и структура пролактина................................................................34

3.2. Функции пролактина в организме..........................................................34

3.3. Функции пролактина в печени................................................................36

3.4. Рецепторы и реализация эффектов пролактина......................37

3.4.1. Характеристика гормонсвязывающих и молекулярных свойств рецепторов пролактина (РПрл). Гетерогенность РПрл........................................................................................40

3.4.2. Механизм действия пролактина через его рецепторы ..................................................................................................41

3.'4.2.1 .Димеризация рецепторов................................41

3.4.2.2. Клеточные посредники..................................42

3.4.2.3. Транслокация комплексов пролактина с рецепторами в ядро......................................................46

3.4.3. Процессинг рецепторов...........................................................47

4. ПОЯВЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ РПрл В КЛЕТКАХ ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ В ПЕРИОД ИХ ПРОЛИФЕРАЦИИ...............................50

4.1. Экспрессия РПрл в печени интактных взрослых крыс.........................50

4.2. Неонатальный период..............................................................................51

4.2. ПОЖП........................................................................................................51

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................54

1. МАТЕРИАЛЫ..........................................................................................................54

1.1. Животные..................................................................................................54

1.2. Реактивы....................................................................................................54

2. МЕТОДЫ...................................................................................................................58

2.1. Хирургические операции.........................................................................58

2.2. Введение препаратов (бромокриптина и эстрадиола)..........................58

2.3. Иммуногистохимическая идентификация РПрл в тканях крыс...........58

2.4. Иммуногистохимическая идентификация РСТГ в печени крыс..........60

2.5. Цитофотометрический анализ.................................................................61

2.6. Анализ степени пролиферации желчных протоков..............................62

2.7. Измерение концентрации неорганических ионов в желчи..................62

2.8. Измерение концентрации билирубина в сыворотке.............................63

2.9. Измерение количества белка в неиммунной сыворотке морской свинки и антисыворотке морской свинки к РСТГ...................................................63

2.10. Статистическая обработка результатов................................................63

Глава 3. ЭКСПРЕССИЯ РПрл В КЛЕТКАХ ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ ПОСЛЕ ПОЖП..........................................................................................................64

3.1 Цитофотометрический анализ зависимости содержания РПрл в холангиоцитах крыс после ПОЖП от пола животных............................................64

3.2 Влияние пролактина на интенсивность экспрессии РПрл в холангиоцитах после ПОЖП..........................................................................66

Глава 4. ЭКСПРЕССИЯ РПрл В ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС ПОСЛЕ ПОЖП

........................................................................................................................................69

4.1. Цитоплазматическая манифестация РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП...............................................................................................................69

4.2. Ядерная манифестация РПрл в гепатоцитах крыс после ПОЖП и влияние на нее Прл..........................................................................................71

Глава 5. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ УСИЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ РПрл В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ ПОЖП.....................................................78

5.1. Изучение степени пролиферации желчных протоков после ПОЖП и влияния на нее Прл..........................................................................................79

5.2. Влияние Прл на ионный баланс желчи после ПОЖП..........................81

5.3. Влияние бромокриптина на содержание билирубина в сыворотке и желчи животных с ПОЖП..............................................................................84

Глава 6. ЭКСПРЕССИЯ РПрл В НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ ТКАНЯХ КРЫС

........................................................................................................................................85

Глава 7. ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА В

ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС..........................................................................................92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................95

ВЫВОДЫ..................................................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК - бромокриптин

Бл - билирубин

ГДФ - гуаниндифосфат

ГТФ - гуанинтрифосфат

ЖлК - желчные кислоты

ПК С - протеинкиназа С

ПОЖП - перевязка общего желчного протока

Прл - пролактин

Р- рецепторы

СТГ - соматотропный гормон

ВВЕДЕНИЕ

Гормон аденогипофиза пролактин (Прл) принадлежит к семейству соматотропного гормона (СТГ) и имеет в организме млекопитающих более 300 физиологических функций, связанных с размножением, осморегуляцией, иммуномодуляцией и регуляцией роста, дифференцировки и метаболизма [Cowie, Forsyth, 1975; Bole-Feysot et al., 1998]. Прл оказывает свои многочисленные эффекты через специфические рецепторы, расположенные на мембранах клеток-мишеней.

Рецепторы Прл (РПрл) относятся к обширному суперсемейству рецепторов цитокинов. Если структура и основные закономерности гормональной регуляции РПрл изучены на более ранних этапах исследований этих рецепторов, то исследование механизмов регуляции их клеточной экспрессии и путей проведения гормонального сигнала внутрь клеток-мишеней являются актуальной проблемой современной эндокринологии, для решения которой используют разнообразные методические подходы. Несмотря на то, что к настоящему моменту имеются многочисленные данные о механизмах действия РПрл, картина их функционирования все еще остается неполной, а некоторые вопросы -неразрешенными, и поэтому продолжают активно дискутироваться.

В исследованиях эффектов Прл одним из широко используемых объектов является печень как одна из главных мишеней его действия. Многочисленные гепатотропные эффекты Прл связаны с регуляцией как гомеостатических и метаболических функций печени - центральной метаболической системы организма, так и экзокринных процессов, осуществляемых клетками печени.

Использование моделей, индуцирующих пролиферативную активность клеток печени, в частности, модели индуцированного подпеченочного холестаза у крыс (перевязка общего желчного протока, ПОЖП), позволило обнаружить, помимо традиционно наблюдаемой мембранной и цитоплазматической локализации РПрл, появление интенсивной ядерной экспрессии РПрл в пролиферирующих эпителиальных клетках внутрипеченочных желчных протоков (холангиоцитах), независимой от пола животных и половых стероидов [Смирнова

с соавт., 1998]. Это открытие предоставляет новые возможности для дальнейшего изучения функций Прл в печени, в том числе при нарушении ее функций, а также позволяет расширить знания о путях реализации эффектов Прл в клетках печени; кроме того, открываются новые перспективы для изучения функций холангиоцитов - зоны пристального интереса современной гепатологии, в частности, их участия в желчеобразовательном процессе. К моменту начала данной работы, однако, оставались неясными клеточные механизмы индукции и поддержания высокого содержания РПрл в ядрах холангиоцитов в условиях обструктивного холестаза, особенности гормональной регуляции этих процессов и физиологическое значение ядерной манифестации РПрл в клетках эпителия желчных протоков, индуцированной холестазом. Кроме того, отсутствовали данные о возможных функциях Прл в отношении гепатоцитов в условиях обструктивного холестаза, тогда как выяснение этих функций внесло бы большой вклад в изучение гепатотропных эффектов Прл, являющегося, как хорошо известно, важным фактором регуляции целого ряда биохимических процессов в гепатоцитах интактных животных.

В связи с появлением ядерной манифестации РПрл в пролиферативно активных холангиоцитах логично предположить, что наличие специфических ядерных сайтов, связывающих Прл, и осуществление ряда эффектов Прл путем связывания с этими сайтами может наблюдаться и в других типах клеток. Выявление ядерной манифестации РПрл и ее общих закономерностей в тканях-мишенях Прл способствовало бы не только обобщению этих данных, но и выяснению физиологического значения ядерной локализации РПрл. До сих пор, однако, исследований такого рода не проводилось, а работы по изучению экспрессии РПрл в тканях некоторых видов животных имели целью, в основном, сравнительный анализ интенсивности экспрессии РПрл в разных тканях.

В связи с этим цель данной работы заключалась в изучении особенностей экспрессии РПрл в клетках печени крыс после ПОЖП и ее физиологического значения. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследование участия Прл в регуляции экспрессии собственных рецепторов в холангиоцитах самцов и самок крыс после ПОЖП.

2. Изучение влияния ПОЖП на особенности экспрессии РПрл в гепатоцитах самок и самцов крыс и исследование влияния гомологичного гормона на экспрессию РПрл в гепатоцитах после ПОЖП.

3. Выяснение возможного физиологического значения появления интенсивной ядерной экспрессии РПрл в холангиоцитах крыс после ПОЖП.

4. Анализ внутриклеточного распределения РПрл в некоторых тканях крыс с относительно высоким содержанием этих рецепторов с целью выяснения распространенности и условий ядерной манифестации РПрл в данных тканях.

5. Иммуногистохимическая идентификация близкородственных РПрл по структурным и функциональным показателям рецепторов СТГ в печени крыс для выявления возможных общих закономерностей тканевой и субклеточной экспрессии рецепторов гормонов семейства СТГ.

Результаты, полученные в ходе данной работы, могут иметь большое значение для фундаментальной эндокринологии, так как существенно расширяют имеющиеся знания о клеточных механизмах действия Прл, путях их половой и тканевой дифференцировки, а также для фундаментальной и клинической гепатологии, поскольку вносят вклад в изучение компенсаторных и патологических изменений функций гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков в условиях обструктивного холестаза и роли Прл в этих изменениях.

Глава 1.

РОЛЬ ПРОЛАКТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ПЕЧЕНИ В НОРМЕ И ПОСЛЕ ПОЖП

(литературный обзор)

1. ФИЗИОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ

1.1. Особенности морфофункциональной организации печени

Печень является самой крупной железой в организме, выполняющей одновременно и эндокринные, и экзокринные функции [здесь и далее в разделе цит. по: Хэм А., Кормак В., 1983]. Подобно другим железам, печень состоит из паренхимы и стромы. Паренхиматозные клетки печени (гепатоциты) - это эпителиальные клетки энтодермального происхождения, составляющие 80-90% массы печени. Строма имеет мезодермальное происхождение и состоит из соединительной ткани.

Важнейшей особенностью печени является ее уникальное двойное кровоснабжение. Помимо артериальной крови, поступающей через печеночную артерию, печень получает и венозную кровь, приносимую от желудочно-кишечного тракта, бедную кислородом и насыщенную питательными веществами. 75% притекающей к печени крови поступает через портальную вену, а 25% - через печеночную артерию. Воротная вена и печеночная артерия входят в печень в области ее ворот. Кроме того, через ворота из печени выходит печеночный (желчный) проток и лимфатический сосуд. Венозная кровь оттекает из печени по печеночным венам.

Каждый гепатоцит одновременно выполняет и экзокринную, и эндокринную функции. Поэтому паренхима печени построена таким образом, чтобы каждый гепатоцит контактировал как с протоком для выведения экзокринного секрета - желчи, так и с кровеносным сосудом для выделения в него эндокринного секрета.

Классической морфофуикциональной единицей печени считается печеночная долька. У многих млекопитающих дольки отделены друг от друга соединительнотканными перегородками. Каждая долька имеет полиэдрическую форму. В центре дольки расположена центральная вена, по которой кровь оттекает из дольки, а в каждом углу дольки - так называемая портальная, или воротная, зона, состоящая из ответвлений печеночной артерии, воротной вены и желчного протока. Гепатоциты в дольке располагаются неправильными рядами -трабекулами, которые, направляясь от периферии дольки, сходятся к ее центральной вене. Между тяжами гепатоцитов располагаются щелевидные пространства - синусоиды, по которым смешанная кровь из печеночной артерии и воротной вены направляется от портальной зоны к центру дольки, открываясь в центральную вену (рис. 1). Стенки синусоидов образованы двумя типами клеток: а) эндотелиальными, 2) купферовыми клетками, являющимися производными моноцитов, и, следовательно, их следует рассматривать как макрофаги.

Желчь, вырабатываемая гепатоцитами, секретируется в щели между клеточными мембранами соседних гепатоцитов в трабекуле, называемые желчными капиллярами или каналикулами. По ним желчь оттекает в желчные протоки портальных зон.

Таким образом, каждый гепатоцит имеет три типа поверхностей:

а) синусоидальную, или базолатеральную, контактирующую с синусоидом;

б) каналикулярную, через которую из клетки оттекает секретируемая первичная желчь;

в) межклеточную, или боковую, т. е. поверхность между двумя соседними гепатоцитами в трабекуле, не контактирующую с синусоидом или каналикулой.

При рассмотрении метаболических функций гепатоцитов в дольке более правильным является концепция об ацинусе как структурно-функциональной единице печени, предложенная А. Раппапортом [А. ЯаррароЛ, 1963]. Это представление основано на факте неоднородного кровоснабжения различных частей дольки. Гепатоциты перицентральной области снабжаются кровью с самым низким содержанием кислорода, так как по мере прохождения по синусоиду кровь отдает кислород и насыщается углекислотой. В то же время,

кровь с максимальным содержанием кислорода получают не перипортальные клетки, как это могло бы показаться на первый взгляд, а те гепатоциты, которые окружают мелкие боковые ответвления печеночной артерии и воротной вены в области портального тракта, открывающиеся в синусоиды. Таким образом, ацинус в большей или меньшей степени имеет форму ромба, вершины которого сходятся к центральным венам соседних печеночных долек. В середине ацинуса расположены основные сосудистые стволы. Клетки паренхимы в этой области кровоснабжаются наилучшим образом по сравнению со всеми другими частями ацинуса. Этот участок Раппапорт обозначает как зона 1. Паренхима печени, которая окружает зону 1, обозначается как зона 2. И наконец, наружная часть ацинуса, доходящая до центральной вены, называется зоной 3; она получает меньше кислорода, чем любая другая часть ацинуса (рис. 2).

Представление об ацинусе как метаболической единице используют для объяснения гетерогенности функций гепатоцитов разных зон. Хотя механизмы ее до конца неизвестны, считается, что гетерогенность гепатоцитов отражает функциональную адаптацию к паттерну кровотока в синусоиде.

1.2. Физиологические функции печени 1.2.1. Печень как центральная метаболическая система

Благодаря своей полифункциональности, многообразию и с�