Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химическая, иммунохимическая и биологическая характеристика пролактина амниотической жидкости человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая, иммунохимическая и биологическая характеристика пролактина амниотической жидкости человека"

АКАДШИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ШСГИТУТ ЭКСПЕРШЕ1 !Т АЛЬНОЙ ЭНДОКРИНОЛОГИИ В Э Н Ц

На правах рукописи УДК 577.175.328.08

СЕГАНОВА Мария Илиева

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ, ЖШ10ХИМИЧЕСКАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЛАКТИНА АМНИОТИЧЬСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена во Всесоюзном эндокринологическом научном центре АМН СССР

Директор - профессор И.И. Дедов

Научный руководитель: доктор биологических наук A.A. Булатов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ведущее учреждение - Институт акушерства и гинекологии АМН СССР, Ленинград

в '/7 час. на заседании специализированного совета /Д 001.13.01/ при ВЭНЦ АМН СССР /Москва, ул. Дмитрия Ульянова, II/.

профессор А.Я. Николаев

доктор биологических наук. Н.Д. Фанченко

- -защита диссертации' состоится

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВЭНЦ АМН CCCI

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В.Я. Игнатков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.Актуальность темы. Одашм.лз основных направлений современной эндокринологии является биохимия белковых гормонов -важнейших биорегуляторов всех видов обмена в организме. Уже выделено большинство белково-пептидных гормонов человека, изучена их химическая структура, исследуется взаимосвязь их структуры и специфической физиологической функции. .

Многие белковые гормоны характеризуются полафункциональ-ностью. Предполагают, что она связана .с отдельными пептидными участками их молекул. Другой причиной, полифункциональности белковых гормонов может быть молекулярный полиморфизм, который привлекает все более пристальное внимание исследователей.

Одним из наиболее интенсивно изучаемых в настоящее время белковых гормонов, вырабатываемых в организме человека и животных специализированными клетками передней дола гипофиза /лактотрофами/, является пролакгин. Необходимо ошетить, что он был одним из последних выделенных и охарактеризованных ги-пофизарных гормонов человека. Причиной этого является низкая концентрация пролактана в гипофизе человека и трудность его выделения в чистом виде. Однако интерес к нему велик из за широкого спектра его биологических эффектов /поряэда 85 функций/. Наиболее важной стороной его физиологического действия у млекопитающих считают непосредственное вовлечение в регуляцию процессов репродукции.

Как установлено, для пролактана, выделяемого из гипофиза, свойственна не только полифункциональность, но. а природный молекулярный полиморфизм. При этом изофоркы гормона могут различаться не только по физико-химическим, но я по иммунологическим и биологическим свойствам. Они могут изменяться под влиянием различных физиологических воздействий.

Работами ряда исследователей показано, что у женщин при беременности происходит значительное накопление вммунореактивного пролактана в амниотической жидкости, причем в количестве, значительно перевншающеы его уровень в крови. Предполагается, что основным источником амниотического пролактана является децидуальная ткань. Физиологическая роль амниотического пролактина пока остается неясной. Мало исследованы

его физико-химические, иммунохимические и биологические свойства, молекулярные формы и шс соотношение. Вместе с тем вопрос о свойствах амниотического пролактина, его роли при беременности и взаимоотношениях с гипофизарным пролактином представляет значительный интерес как для эндокринологии, так и для акушерства.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение пролактина амниотической жидкости женщин, его содержания и качественного состава в различные сроки беременности, физико-химических, иммунохимических и биологических свойств этого гормона в сравнении со свойствами гипофизарного пролактина. Для осуществления намеченной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Выделение и очистка амниотического пролактина человека.

2. Сравнительная физико-химическая характеристика амниотического и гипофизарного пролактина.

3. Исследование биологических свойств высокоочищенного амниотического пролактина.

4. Изучение иммунохимических свойств амниотического пролактина человека в сравнении с гипофизарным.

5. Изучение динамики содержания пролактина и отдельных его молекулярных форм .в амниотической жидкости в процессе развития беременности.

Научная новизна работы. Проведено исследование физико-химических, иммунохимических и биологических свойств пролактина, выделенного в высокоочищенном виде из амниотической жидкости беременных женщин. Установлено их совпадение с аналогичными свойствами доминирующей формы гипофизарного гормона с молекулярной массой 23 кДа.

С помощью иммунохимических методов установлено, что амнио-тический пролактин, а также пролактин децидуальной ткани проявляет молекулярный полиморфизм, характерный и для гипофизарного гормона. Впервые изучена динамика изоформ амниотического пролактина в ходе беременности. Во все сроки в амниотической жидкости обнаружены три формы гормона - с молекулярной массой 23 и 25 кДа /примерно в постоянном соотношении/ и особая высокомолекулярная форма, количество которой резко возрастает в 22 .- 29 недель беременности. Причем пик высокомолекулярной формы про-

- 3 - Sl

лактина совпадает с максимумом общего содержания иммунореак-тивного гормона, что ставит вопрос о специфической физиологической роли высокомолекулярной формы.

Теоретическая и практическая значимость работы» Результаты настоящих исследований расширяют современные представления о свойствах пролактина. Идентичность свойств преобладающей формы амниотического и гипофизарного пролактина указывает на то, что при определенных физиологических состояниях организма экспрессия гена пролактина возможна не только в таком высоко-спепиализированном органе, каким является гипофиз, но и других тканях, обеспечивающих репродуктивные процессы.

Полученные данные представляют теоретическую и практическую ценность, для специалистов-биохимиков, занимающихся изучением свойств, физиологической функции и полиморфизма пролактина. -

Представляется перспективным использование в акушерстве данных о полиморфизме амниотического пролактина и резком нарастании как общего содержания, так и высокомолекулярной формы гормона в ашшотической жидкости в середине беременности. Выявленный характер динамики данного пула гормона может иметь специфическое значение для нормального протекания беременности ' и обеспечения необходимых условий для внутриутробного развития плода.

Полученные в работе сведения MoiyT быть включены в обзоры и курсы лекций по биохимии, эндокринологии и акушерству в разделах, посвященных структуре и физиологической роли белково-пептидных гормонов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуж-цены на III Всесоюзном съезде эндокринологов Аашкент, 1989г./, ia XI научной конференции болгарских аспирантов с международна! участием /Москва, 1989 г./ и на межлабораторной конферен-даи Института экспериментальной эндокринологии ВЭНЦ АМН СССР.

Публикации: По материалам диссертации опубликованы 2 тези-50в докладов и 2 статьи приняты в печать»

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследо->аний и их обсуждения, выводов и списка литературы /¿М ссылок/.

Работа изложена на /Л7 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и Я> таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Амнаотическую жидкость получали от женщин в различные сроки беременности при ее прерывании по медицинским показаниям а также при нормальных родах. Ткань децидуализированного эндометрия и хориона собирали при медицинских абортах в ранние срО' ки беременности. Гипофизы получали от трупов людей при патоло-гоанатомических исследованиях. Весь перечисленный материал быстро замораживали и хранили при -70°С до проведения исследований.

Экстракцию децидуальной ткани и хориона проводила 0,1 М аммоний ацетатным буфером рН 8,5. Экстракцию гипофизов осуществляли последовательно 0,15 М цитрат-фосфатным буфером рН 4,0 и 0,1 М Каон при рН 12,5.

Основные этапы выделения.и очистки пролактина из амниоти-ческой жидкости состояли в следующем: I - концентрирование амниотической жидкости с помощью ультрафильтрационной установки "Мшитан" с фильтром НИШ 10000 /Mllllpore, сША/, 2 - гель фильтрация концентрата амниотической жидкости через сефадекс G -100 / Pharmacia , Швеция/ В 0,1 М NH^COj /рН 8,5/, 3 - лиофилизация фракций, содержащих иммунореактивный пролак-тин, 4 - повторная гель-фильтрация через сефадекс s -100 в 0,01 М Трис-HCI /рН 8,6/, 5 - ионообменная хроматография на ДЕАЕ-сефарозе сь 6В / Pharmacia, Швеция/ с элюцией белка ступенчатым солевым градиентом /0,05 - 1,0 М Nací в 0,01 М Трис-HCI рН 8,6/, € - аффинная хроматография на конканавалин А-се-фарозе / Pharmacia , Швеция/в 0,05 М Трис-HCI буфере, содержащем 0,2 М ifaCl и по I мМ CaCl2 , MgCl2 ,MnCi2. Специфическую элюцию гликозилированных белков проводили 0,2 М метил-ь-D -маннопиранозидом / serva, ФРГ/, 7 - ионообменная хроматографа на КМ-целлюлозе /СМ 23, Yíhatman , Великобритания/ материала, не сорбировавшегося на конканавалин А-сефарозе, с элюцией белка 0,01 М аммоний ацетатным буфером и 0,1 М. ынднсо5/ рН 8,3/, 8 - ультрафильтрация иммунореактивного материала через фильтр

СХ 10,9 - гель-фильтрация через сверхтонкий сефадекс G -100 / Phaxmacia , Швеция/ в 0,1 M ин^ш^ /рН 8,3/, 10 - концентрирование полученного препарата пролактина ультрафильтрацией.

Содержание пролактина в амниотической жидкости, экстрактах тканей и на этапах выделения определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов реагентов, поставляемых ВОЗ.

- Концентрацию белка в амниотической жидкости, экстрактах тканей и препаратах в процессе выделения определяли методом

Xiowry .

Очищенный амниотический пролактин и изофоркы гормона в амниотической жидкости, экстрактах децидуальной ткани и гипофизов анализировали с помощью вертикального электрофореза в пластинах \2% полиакрилашдного геля в присутствии додецил-оульфата натрия по методу laemmii. Образцы обрабатывали 2-меркаптоэганолом. Гель окрашивали азотнокислым серебром.

Электроперенос белков на нитроцеллюлозные фильтры Нуъ-jnd— с / Amershaii} Велшсобритания/ выполняли по методу Tovbin и соавт. Для выявления иммунореактивных форм гор/.она применяли либо специфическую кроличью антисыворотку к гипофизарному пролактину человека и I - белок А, либо меченые моноклональ-ные антитела против того же гормона с последующей радиоавтографией. Белок А метили методом Preychet и соавт., используя Haï125 и хлорамин-Т.

Для электрофоретических исследований использовали количество материала с одинаковым содержанием иммунорзактивного гормона /около 50 нг/.

В качестве маркеров молекулярной массы в электрофоретических исследованиях служили две хорошо охарактеризованные формы свиного пролактина: негликозилированный с молекулярной массой 23 кДа и гликозилированный с молекулярной массой 25 кДа, а также высокоочищенный препарат доминирующей формы гипофизарно-го пролактина человека с молекулярной массой 23 кДа.

Аминокислотный анализ пролактина проводили с использова-гаем автоматического аминокислотного анализатора "Биотроник 7000", ФРГ, после гидролиза проб 5,7 H HCI при П0°С в течение

24 часов.

я -концевые аминокислоты определяли по реакции с дансил-хлоридом с последующей двумерной хроматографией дансилпроизвсд-ных на полиамидных пластинах в следующих системах растворителей:

1 - вода - 90% муравьиная кислота /100:1,5/;

2 - бензол - ледяная уксусная кислота /9:1/;

3 - н-гептан - н-бутанол - ледяная уксусная кислота

/3:1:1/;

4 - этилацетат - метанол - ледяная уксусная кислота

/20:1:1/;

Для сравнительного изучения лактогенной активности препаратов использовали метод Hicoil, основанный на стимуляции гормоном пролиферации стенок зоба голубей при локальном введении препарата. Каждую дозу вводимого препарата /10, 20 и 40 мкг/ испытывали не менее чем на 5 голубях. В качестве стандарта служил гипофизарный овечий пролактин с активностью 22 МЕ/мг. ■

Способность выделенного гормона связываться о пролактиловыми рецепторами исследовали в радиорецепторном тесте методом Co3tiow с использованием мембранной фракции печени беременных Kpjc в качестве источника рецепторов и меченного гипофизар-ного пролактина. Гипофизарный пролактин человека метида методом Thoreil и Johansson, используя лактопероксидазу И НаХ125

Иммуносорбент для шшуноаффинной хроматографии был получен иммубилизацией на BrCN-сефарозе 4В / Pharmacia, Швеция/ ^-глобулиновой фракции, очищенной из антисыворотки ролика против гипофизарного пролактина человека. Элюцию пролактина проводили 3 М циветт в 0,05 М фосфатном буфере /рН 4,1/. Заключительную очистку препарата осуществляли на сефадексе g -100 / Pharmacia, Швеция/ в 0,1 М фосфатном буфере /рН 7,6/, содержащем 0,1 М iTaCl.

Результаты исследований и их обсуждение

В амниотической жидкости, полученной у женщин в разные сроки беременности, определяли содержание имиунореактивного пролактина радиоиммунологическиы методом. Как видно на рисунке I, оно изменяется в процессе развития беременности.

* I

I

» « I _

10 20 30 40

срок ¿врдовммости

Рисунок I. Содержание пролактина в амниотической

жидкости в различные сроки беременности. По оса абсцисс - срок беременности /недели/ По оси ординат - концентрация пролактина /мЕд/мл/.

Содержание иммуноре активного пролактина в амниотической жидкости наиболее низкое в ранние сроки /7 - 9 недель/ беременности и. составляет в это время в среднем 2,5+0,33 мДц/мл, п = 4. 3 дальнейшем содержание пролактина в амниотической жидкости быстро увеличивается, достигая максимальной величины к 22 - 29 неделям /70,6+5,7 мЕд/мл, п = 14/, а затем снижается к моменту родов в среднем до 17,42+1,61 мЗд/мл, и = Э. Таким образом, изменение уровня пролактина в амниотической жидкости в ходе беременности носит колоколобразный характер. В то же время многочисленными исследованиями твердо установлено, что содержание.гормона в крови матери изменяется иным образом: оно постоянно растет, достигая максимального уровня к концу беременности. Такие различия в динамике уровня пролактина в циркулирующей крови и амниотической жидкости у женщин в хода беременности

севдетельствуют о том, что материнский гипофиз вряд ли является основным источником аыниотического гормона.

В связи с этим возникает вопрос о возможности различия амнаотического и гилофизарного гормонов по физико-химическим, иммунохимическим и биологическим свойствам. С целью выяснения этого вопроса было проведено выделение пролактина из амниоти-ческой жидкости человека. Метод выделения амниотического пролактина был максимально приближен к методу выделения высоко-очшценного гипофизарного гормона, использованного для сравнительных исследований. Схема выделения пролактина из амниоти-ческой жидкости человека представлена на рисунке 2.

Учитывая характер изменения содержания пролактина в амнио-тической жидкости в процессе беременности, выделение гормона проводили из жидкости, собранной в основном в середине беременности.

В таблице представлены данные о выходе белка и иымуно-реактивного пролактина на каждом из этапов очистки гормона из5,бл амниотической жидкости. При начальном концентрировании материала с помощью ультрафильтрации, отделяющей белки с молекулярной массой до 10 кДа, общее количество белка снизилось примерно на 40/Ó, а убыль иммунореактивного пролактина не превышала 7,552.

При гель-фильтрации концентрата амниотической жидкости через сефадекс g - 100 /рис. 3/ получено два пика .иммунореактивного пролактина. Белок пика I с более высокой молекулярной массой имел в своем составе не более 1/10 ООО иммунореактиЕного пролактина. В белке главного пика 2 доля пролактина была во много раз больше. Для дальнейшей очистки пролактина использовали материал пика 2, содержавшего наибольшее количество гормона. В результате повторной гель-фильтрации этого материала через сефадекс 6-100 была достигнута 30 - кратная очистка пролактина, о чем свидетельствует увеличение удельной активности препарата гормона, полученного на этом этапе /см. таблицу/.

При ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе фракции, содержащие пролактин, элюировались также двумя ликами - в 0,1 М и 0,2 М Пасх. Дальнейшая работа проводилась с фракцией, вышедшей с колонки при элюции 0,1 М HaCl. Эта фракция соде рожала наибольшее количество пролактина и наименьшее примесей

Рисунок 2. Схема выделения пролактина из амниотической жидкости человека.

фугих белков./рис. 4/. Удельная активность этой фракции увели-шлась в 110 раз по сравнению с исходным материалом.

В гипофизе и в циркулирующей крови человека найдена глико-налированная форма пролактина с молекулярной массой. 25 кДа (ье-

'13 et а1., 1985; Иагкс^ et а1. , 1988).

Рисунок 3. Гель-фильтрация концентрата амниотической жидкости через сефадекс С - 100. Сплошная линия - содержание белка во фракциях;

Пунктирная линия - содержание иммунореак-тивного пролактина во фракциях По оси абсцисс - объем злюции /мл/ * По оси ординат - слева оптическая плотность при длине волны 280 нм, справа концентрация иммуноре активного пролактина /мкг/вд/.

Как видно на рисунке .5 "з", в концентрате амниотической жидкости методами электрофореза в ПААГ в присутствии додецил-сульфата натрия в редуцирующих условиях с последующим радиоим-муноблотингом выявляется наряду с доминирующей формой пролактина с молекулярной кассой 23 кЦа.еще одна иммунореактивная форма с молекулярной массой 25 кДа, соответствующая гликозилиро-ванному гипофизарному пролактину. Б связи с этим нами была еде-

Выход балка и иммунореактивного пролактина на этапах выделения из аыниотической жидкости (5,5 л)

Содер- Иммунореактивный

Этап очистки жаниа пролактин

белка '

мг Ед Ед/мг белка

0,007 0,012

0,054

0,204

0,770

4,570

11,400

лана попытка адсорбировать эту форму гормона на лектине, проявляющем высокое сродство к гликопротеинам. Результаты, полученные при аффинной хроматографии на конханавалин А-сефарозе, свидетельствуют о том, что небольшая доля пролактина в амниотичес-кой жидкости может действительно, быть представлена гликозили-рованноЕ формой. Однако достичь заметной очистки гликозилиро-ванного пролактина таким способом не удалось. Удельная активность гормона, снятого о сорбента с помощью метил-ь-в-манно-пиранозида, была очень низка /0,01 Ед/г/.р белка/, как и общее его содержание в собранной фракции. Причиной току может быть высокое содержание в акниотической жидкости других гликозили-рованных белков. Исследование методом радиоиммуноблотвдга материала, сорбировавшегося на конканавалин А-сефарозе и затем элюированного с нее, показало существенное обогащение препарата. 25. К формой гормона /рис. 5 "г"/. Напротив, в материале, не ; сорбировавшемся на лектине, иммунореактивный пролактин с молекулярной массой 25 кДа присутствовал в малом количестве /рис. 5 "д'7.

Амниотическая жидкость . 36 200 268

Концентрат амниотической жидкости 20 800 248

Гель-фильтрация через сефадекс в - 100 I 662 89,5

Повторная гель-фильтрацш через сефадекс в - 100 i 378 77,1

Хроматография на ДЕАВ-сефарозе 76 58,4

Хроматография на КЙ-целлюлозе 3,8 17,36

Гель-фильтрация через сверхтонкий сефадекс G - 1,4 100 ■ 16,0

Рисунок 4. Хроматография пролактин-содержащего материала .на ДЕАЕ-сефарозе. Сплошная линия - содержание белка во фракциях;

Пунктирная линия - содержание иммунореактивного пролактина во фракциях; По оси абсцисс - объем элюции /мл/ По оси ординат - слева оптическая плотность при длине волны 280 нм, справа концентрация иммунореактивного пролактина /мкг/мл/.

Следующей стадией очистки пролактина была ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе, в результате которой иммуиореак-тивный гормон элшровался с колонки одним пиком в 0,1 М ш^нсс^ /рН 8,3/. При этом произошла очистка гормона еще в 6,5 раз по сравнению с предыдущим этапом. Был получен препарат, в кото-

абв г дежзи Рисунок 5. Радиоикмуноблотинг препаратов амняотичес- .

кого пролактина на различных стадиях очистки.

а - высокоочищенный гипофизарный пролактин человека

б - амниотическйй пролактин человека после заключительной гель-фильтрации через сверхтонкий сефадекс б - 100 в - препарат после очистки на КМ-целлюлозе г - материал, элюированный с конканавалин

А-сефарозц метал- ь - d -маннопиранозидом д - материал, не сорбировавшийся на конканавалин А-сефарозе е - материал после очистки на ДЕАЕ-сефарозе ж - материал после повторной гель-фильтрации

на сефадекс С - 100 з - концентрат амниотической жидкости и - свиной гликозилированный /25 К/ и негли-козилированннй /23 К/ пролактин

- к -

ром при электрофорезе в ПААГ и окраске ультрачувствителъ-ным методом с помощью серебра обнаруживалась одна полоса /рис. 6/.

Заключительная очистка амниотичеокого пролактина была проведена с помощью гель-фильтрации через сверхтонкий сефадекс G - 100. В результате было полученЬ 1,4 мг белка, очищенного в I 600 раз /судя по удельной иммунореактивности/ по сравнению с исходным материалом.

а б в

Рисунок 6. Электрофорез амниотичеокого пролактина в ПААГ с додецил-сульфатом натрия после восстановления 2-меркаптоэтанолом. : . . а - после хроматографии на КМ-целлюлозе б - после заключительной гель-фильтрации

на сверхтонком сефадексе б - 100 в - высокоочшцешшй гипофизарный пролактин человека.. . • ' \

Результаты исследования препарата пролактина, выделенного из амниотической жидкости, с помощью электрофореза'в ПААГ в , присутствии додецил-сульфата натрия в редуцирующих условиях свидетельствуют о его гомогенности. Электрофэретическая под-.

- 15 -

вижность исследуемого белка совпадала с подвижностью выделенного из гипофизов человека пролактина с молекулярной массой 23 кДа /рис. 6/.

С помощью реакции с дансилхлоридом в качестве N -концевой аминокислоты в амниотическом пролактине был идентифицирован лейцин, как и в гипо^изарном гормоне человека. Аминокислотный состав препаратов пролактина человека из двух разных источников существенно не различался.

Таким образом, из амниотической жидкости человека получен высокоочищенный препарат пролактина с молекулярной массой 23 кЦа, представляющий собой преобладающую форму гормона в этой биологической жидкости.

При исследовании иммунологических свойств акниотического пролактина в радиоиммунологической система, включающей в качестве стандарта и меченого компонента гипофизарный пролактин человека и поликлональные антитела к этому гормону, было показано, что характер взаимодействия с антителами пролактина из амниотической жидкости и гипофиза не различается. Об этом свидетельствует одинаковый наклон кривых вытеснения меченого ги-пофизарного гормона из комплекса с антителами /рис. 7/. На рисунке 7 видно, что иммунологическая активность амниотического . пролактина, не отличаясь качественно от активности препарата гилофизарного гормона, в количественном отношении была несколько ниже. Однако следует отметить, что высокоочищенные препараты пролактина, выделяемые из гипофиза, обычно характеризуются значительными колебаниями удельной иммунологической активности, в зависимости от процедуры выделения и условий хранения. Нельзя исключить, что наибольшая иммунологическая активность принадлежит какой-то нестабильной форме пролактина, легко подверженной под влиянием физических или химических воздействий кон-формационным или более глубоким структурным изменениям, сопровождающимся снижением или потерей иммунореактивности. Интересно, что при исследовании методом иммуноблотинга препаратов амниотического пролактина на отдельных этапах выделения, а также в разные сроки хранения в них незакономерно появляется и исчезает форма с молекулярной массой менее 23 кДа /рис. 5 -"в", "д", "ж"/. Подобная форма присутствует и в высокоочищен-ном гипофизарном пролактина /рис. 5 "а"/.

8 16 32

128 ПРЯ /кгЛи/

§

. Рисунок 7. Кривые вытеснения гипофизарным /сплошная линия/ и амниотическим /пунктирная линия/ пролактина человека гипофизарного пролак-тина-1*2^ из комплекса с антителам к ги-пофизарному горкону.

По оси абсцисс - концентрация гормона /нг/мл/, По оси ординат - В/В0 х 100.

Биологическое тестирование амниотического пролактина показало, что он по своему влияние' на пролиферации клеток зоба голубей практически не отличается от гипофизарного гормона человека и использованного в качестве стандарта овечьего пролактина с биологической активностью 22 мЕ/мг /рис. В/. В радиорецел-торном тесте амниотический пролакгш активно конкурировал с меченным гипофизарным гормоном человека за связывание с рецепторами мембран печени беременных крыо /ЕД^ = 64 нг/.

Представленные данные свидетельствуют о том, что выделенный из аыниотической жидкости пролактин по физико-химическим, иммунологическим и биологическим свойствам не отличается от преобладающей в гипофизе формы пролактина с молекулярной массой

10 20 <0

Дам пр*1аргга / икр 1

Рисунок 8. Дозозависикые линии регрессии 2-го международного стандарта овечьего пролактина /пунктирная линия с точками/, гипстазарного /сплошная линия/ и амниотаческого /пунктирная .линия/ пролактинов человека. По оси абсцисс - дозы препарата По оси ординат - диаметр зоны пролиферации /мм/.

23 кДа и гормоныиз обоих источников являются, вероятно, продуктами экспрессии одного и того же' гена. Заметим» что в случае другого гипофизарного гормона человека - соыатотропина, струх<-турно родственного пролактину, мы сталкиваемся с иной ситуацией. Недавно показано, что. при беременности в плаценте, в отличие от гипофиза, происходит экспрессия иного, вариантного гена этого горюна, приводя к образованию "плацентарного" соматотропи-на с несколько иными физико-химическими характеристиками.

. Данные, полученные нами в процессе выделения амниотическо-го пролактина, указывают на то, что в амниотической жидкости,

- 18 -

как и в гипофизе, наряду с охарактеризованной выше доминирующей 23 К формой гормона, присутствуют и другие более высокомолекулярные. Содержание этих сопутствующих форм пролактина в амниотической жидкости значительно меньше, чем основной, и выделить их примененным для получения 23 К пролактина способом для изучения свойств не представлялось возможным.

Б связи с этим с помощью иммунохимических методов было проведено изучение молекулярных форм пролактина в амниотической. жидкости в различные сроки беременности. Выяснение этого вопроса представляло интерес как с точки зрения выявления набора изоформ пролактина, присутствующих в амниотической жид- . кости,. так и с точки зрения установления взаимосвязи различных форм гормона гипофиза и амниотической жидкости. На рисун-. ке 9 представлены результаты исследования амниотичеекого про-

е» "" с? :-------..........;-- *• -чу-

а 6 в г д е

Рисунок 9. Икмуноблотинг амниотической жидкости че~ ловека в различные сроки беременности. * а - препарат гипофгзарного пролактина человека

б-е-акниотическая жидкость 18, 22, 29, 38 и 40 недель беременности, соответствен-, но.

лактина в различные сроки беременности-методом иммуноблотинга с использованием поликлональной кроличей антисыворотки к ги-пофизарному пролактину человека для детекции отдельных изоформ гормона. Для сравнения форм пролактина в амниотической жидкости и гипофизе человека аналогичное исследование было проведено с кислым и щелочным экстрактом гипофиза /рис. 10/. В качестве маркеров молекулярной массой использовали две формы свиного пролактина - негликозилированнув /23 К/ и гликозилированную /25 Н/. Во все сроки беременности в амниотической жидкости доминирует иммунореактивная форма, соответствующая преобладающей в гипофизе форме пролактина с молекулярной массой 23 кДа. В течение всей беременности в амниотической жидкости присутствует еще одна форма гормона, имеющаяся в гипофизарном эк-

ООО о

• 25 К ПРЛ 23 К ПРЛ

а б в г

Рисунок 10. Иммуноблотинг экстракта гипофиза человека а - препарат пролактина человека б - гликозилированный /25 К/ и негликозили-

рованный /23 К/ свиной пролактин в - кислый экстракт гипофиза г - щелочной экстракт гипофиза

- 20 -

стракте, с молекулярной массой 25 кДа, что соответствует по электрофоретической подвижности гликозилированному пролактину. Судя по картина иммуноблотинга, соотношение этих изоформ в разные сроки беременности практически не изменяется.-

Третьей, выявляемой в амниотической жидкости, ш^лунореактивной формой гормона является высокомолекулярная, устойчивая к воздействию додецил-сульфата натрия и 2-меркаптоэтаяола форма. Последнее свидетельствует о том,, что она не является результатом нековалентной агрегации мономерных форм или ддасульфадной полимеризации гормона. Обращает на себя.внимание, что доля этой высокомолекулярной формы в общем пуле пролактина в течение беременности не остается постоянной. Количество, ее заметно возрастает в середине беременности, совпадая по времени ее максимального содержания с пиком общего имыунореактивного пролактина в амниотической жидкости. Природа и свойства этой формы гормона в настоящее время не ясны. Однако нами получены .' данные, поз- . воляющие предположить наличие в ее составе углеводного компонента, поскольку после обработки конканавалин А-сефарозой высокомолекулярная форма гормона исчезает из амниотической жидкости и уже не обнаруживается при иммуноблотинге. -

Следует отметить, что изменение соотношения изоформ пролактина в амниотической жидкости и крови матери в процессе развития беременности существенно различаются. По имеющимся в литературе данным в.течение всего срока беременности доля гли-козилированного пролактина в крови постоянно снижается, а не-гликозилированного возрастает. Сведений же.о динамике высокомолекулярной формы гормона в циркуляции беременных женщин в литературе не имеется. Таким образом,полученные нами данные о полиморфизме амниотического пролактина являются еще одним подтверждением негипофизарного происхождения этого пула гормона..

В последнее время появились данные, позволяющие считать, что наиболее вероятным источником пролактина в абиотической жидкости является децидуализированный эндометрий. По нашим' данным в экстракте децидуаяьной ткани в ранние сроки беременности /7 - 9 недель/ содержится около 17,5 мйд пролактина в I г ткани, тогда как в экстракте хориона гормон не определялся даже высокочувствительным радиоиммунологическш методом. Исходя из того, что иммунологическая активность высокоочищенного•

пролактина составляет около 35 Ед/мг белка, можно подсчитать, что в I г децвдуальной ткани присутствует около 0,5 мкг гормона. При изучении изоформ пролактина в экстракте децидуалыюй ткани методом иммунойлотинга о использованием для их детекции меченых моноклональшх антител к пшофизарному гормону человека показано, что в этой ткани в наибольшем количестве обнаруживается та же форма пролактина /23 К/, которая преобладает в амниотической жидкости и гипофизе, однако не присутствует имеющийся в них 25 К пролактин /рис. II "а"/. Дополнительные

; — 25 К ПРЛ ~ 23 К ПРЛ

а б в г Рисунок II, Радиоиммуноблотинг экстрактов гипорза, децидуальной ткани и препаратов пролакти-■ на, выделенных иммуноаффинным 'методом т амниотической жидкости и децидуальной ткани человека. Детекция пролактина с использованием моноклоналышх антител* а - экстракт децидуальной ткани б - экстракт гипофиза в - препарат пролактина из -амниотической жидкости

¡г — йрепарат пролактина из децидуальной 'Ткани

»¿ЛВР

- 22 -

исследования показали, что эту форму гормона в экстракте де-цидуальной ткани с помощью данного варианта иммуноблотинга просто не удалось детектировать. Последнее может быть связано либо с низким содержанием этой формы гормона в общем пуле пролактина, либо с более узкой специфичностью моноклональных антител по сравнению с поликлональными, либо с различиями в иммуно-реажтивности разных форм гормона. При сравнении картин иммуноблотинга гипофизарного экстракта, проведенного с разными антителами видно, что политональная антисыворотка обнаруживает 25 К пролактин /рис. 10/, не выявляемый моноклональными антителами /рис. II "б"/. С другой стороны., при проведении радиоим-муноблотинга пролактина человека, сконцентрированного из экстракта децидуальной ткани с помощью иммуноаффинной хромато-графии(совместно с сотрудниками ИБОХ АН БССР), те же монокло-нальные антитела уже детектировали присутствие в этом препарате 25 К формы /рис. II "г"/. Вероятно,при концентрировании им-мунореактивного пролактина из децидуального экстракта с помощью иммуносорбента содержание в полученном препарате 25 К формы пролактина существенно возросло.

С помощью иммуноаффинной хроматографии были получены препараты пролактина не только, из децидуальной ткани, но и их амниотической жидкости, собранной во время родов. При сравнительном исследовании молекулярных форм пролактина, содержащихся в препаратах из этих двух источников, различий между ними не обнаружено /рис. II "в" и. "г"/* Как в децидуальном, так и в амниотическом.препаратах пролакгина присутствовали щлмунореактивные формы гормона с молекулярной массой 23.и 25 кДа. Все эти данные указывают на возможность синтеза пролактина в де-цидуализированном эндометрии с последующей секрецией й накоплением его в амниотической жидкости для осуществления специфической физиологической функции гормона.

Физиологическая роль амниотичеекого пролактина в настоящее время не ясна, однако ее следу е-." рассматривать с учетом описанного полиморфизма и резкого нарастания содержания как общего пула, так и особой высокомолекулярной формы гормона в амниотической жидкости на 22 - 29 неделях беременности. Нельзя исключить,, что подобно главной роли пролактина у низших живот-

- 23 -

них, на первый план у амниотического пролактина выходит его участие в регуляции водно-солевого обмена, и именно в этот период гормон и некоторые его изофэрмы особенно необходимы для регулирования этого вида обмена и создания оптимальной среды для развития плода в критический период его формирова- . ния.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что содержание иммунореактивного пролактина в амниотической жидкости женщин в процессе развития беременности изменяется и это изменение носит колоколобразный характер. Уровень пролактина постепенно нарастает, достигая максимума в 22 - 29 нед., и снижается к концу беременности, что принципиально отличается от характера изменений содержания пролактина, обычно наблюдаемых в крови беременных женщин.

2. Из амниотической жидкости выделен высокоочвденный про-лактин, который по физико-химическим и иммунологическим свойствам не отличается от молекулярной формы пролактина, преобладающей в гипофизе, и может быть продукте»» экспрессии того же^е-на.

3. Высокоочвденный амниотический пролактин, подобно про-лактину гипофиза, стимулирует пролиферацию клеток зоба голубей и конкурирует с последним за связывание с рецепторами мембран печени.

4. Установлено, что для амниотического пролактина характерен молекулярный полиморфизм. Во все сроки беременности в амниотической жидкости преобладает форма пролактина с молекулярной массой 23 кДа /23 К форма/, соответствующая доминирующей форме пролактина в гипофизе. Кроме того содержится иммуно-реактивная форма с молекулярной массой 25 кДа /25 К форма/, соответствующая гликозилированному пролакгину.

5. Наряду с 23 К и 25 К формами пролактина в амниотической жидкости выявлена особая высокомолекулярная иммунореактив-ная форма, содержание которой резко повышено в 22 - 29 недель беременности. Совпадение по времени повышения содержания высокомолекулярной формы с максимумом общего содержания иммунореактивного пролактина в амниотической жидкости ставит вопрос о зе

- 24 -

1 специфической физиологической роли.

6. Обнаружение в экстракте децидуальной ткани имцдюреак-тивных форм пролактина с молекулярной массой 23 кДа и 25 кДа, аналогичных основным молекулярный формам гормона в аыниотичес- I кой жидкости, свидетельствует о возможности децидуального цроис- \ хождения амниотического пролактина. *

7. При беременности пролактин амниотической жидкости представляет собой самостоятельный пул гормона со специфической физиологической функцией, независимый от црааактина, секретируемого в кр< в кровь гипофизом.

СПИСОК РАБОТ, ОИШШКОВАНШХ ПО'ТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выделение и фракционирование пролактина Амниотической жидкости и децидуальной ткани человека // Тезисы докладов III Всесоюзного съезда эндокринологов, Ташкент, 1989, стр. 92-93// Соавт.'Яковлев В.Н. . Свиридов О.В., Сурвило Л.И., Стрельченок O.A., Булатов A.A.

2. Иммунохимическая характеристика пролактина в амниотической жидкости и децидуальной гкани человека // XI научная конференция болгарских аспирантов в СССР с международным участием "Актуальные проблемы современной науки", Москва, 2-3 июня 1989, Рукопись доклада депонирована в ЦИНГИ, ЦНТБ, ЯД II С 12958 //. V

3. Полиморфизм пролактина в амниотической жидкости женщин в различные сроки беременности // Проблемы эндокринологии, 1991, т.37, ЛЗ // Соавт. Б!улатов A.A. , Макаровская Е.Е.

4. Физико-химическая, иммунохимическая и биологическая характеристика пролактина амниотической жидкости человека

// принята в печать в журнал "Вопросы медицинской химии" // Соавг. Булатов A.A., Макаровская Е.Е. , Кузнецов В.П.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР

подп.к печати2&.(.9| л

ЗАК.вО

тираж I£Го