Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина

Кушнарева, Наталья Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина"

На правах рукописи

Кушнарева Наталья Сергеевна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ: РОЛЬ ПРОЛАКТИНА

специальность 03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003485999

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой -доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Ольга Вячеславовна Смирнова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией физиологии мышечной деятельности Института возрастной физиологии РАО Валентин Дмитриевич Сонькин

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова Владимир Борисович Кошелев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 21 декабря 2009 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Образование желчи - жизненно важная функция организма, ее нарушение ведет к синдрому холестаза. По современным представлениям под холестазом понимают нарушение синтеза, секреции и оттока желчи (Подымова, 2004). Синдром холестаза встречается при различных состояниях, которые могут быть объединены в 2 большие группы: 1) нарушение образования желчи (вирусные, алкогольные, лекарственные и токсические поражения печени, холестаз беременных, цирроз, бактериальные инфекции); 2) нарушение тока желчи (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, туберкулез, реакция отторжения трансплантата). Заболевания печени, сопровождающиеся холестазом, зависят от пола и многие из них являются преимущественно женскими (Радченко, 2005). Пик желчекамнеобразования у женщин совпадает с репродуктивным периодом. Физиологическая беременность как пусковой момент патологических процессов в желчевыводящей системе послужила поводом к причислению заболеваний желчного пузыря ко «вторым женским заболеваниям после гинекологических» (Торчинов и др., 2006).

За последнее десятилетие расширилось понимание патогенеза холестаза. Появляется много данных о работе гепатобилиарной транспортной системы в печени, почках и кишечнике, регуляции транспортеров, участвующих в образовании желчи и нарушениях при холестазе. Показано, что не все изменения в экспрессии транспортеров гепатобилиарной системы носят «про-холестатический», «негативный» характер, - некоторые перестройки в клетках печени и почках представляют собой компенсаторный (анти-холестатический) механизм, защищающий организм от повреждений (Zollner et al., 2006). Половая дифференцировка показана в уровне экспрессии и регуляции транспортеров, участвующих в процессе желчеобразования. Показано участие половых гормонов в регуляции работы гепатобилиарной транспортной системы при холестазе (Shimizu et al., 2007).

Билирубин - один из физиологически значимых анионов, являющихся важными компонентами желчи, селективно захватывается транспортерами базолатеральной мембраны гепатоцита из крови, с последующей конъюгацией с глюкуроновой кислотой. Скорость транспорта конъюгированного билирубина из печени в желчь лимитируется его экскрецией через транспортеры каналикулярной (апикальной) мембраны гепатоцита (Решетняк, 2003).

Чувствительность печени к пролактину, одному из женских половых гормонов, оценивая по уровню его рецепторов, очень высока и сопоставима с чувствительностью молочной железы (Varas et al., 2005, Bogorad, 2006, SimonHoltorf et al., 2006,). Известны отдельные молекулярные мишени действия пролактина на печень (Cao et al., 2004, Taffetani et al., 2007), однако его конечные физиологические эффекты на желчевыделительную и другие функции печени остаются неясными. Экспрессия рецепторов пролактина в печени зависит от пола: у особей женского пола уровень рецепторов данного гормона выше, чем у мужского (Розен и др., 1991, Smirnova et al., 1994).

1 I ,

Известны несколько функционально различных изоформ рецептора пролактина. Длинная изоформа рецептора опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), главным образом STAT5 (Bole-Feysot et al., 1998). Короткие изоформы рецептора пролактина не способны активировать STAT5 белки и являются негативными регуляторами JAK2/STAT5 сигнализации, из-за образования гетеродимеров с длинной формой рецептора, препятствующих активации STAT-каскада. Однако недавно было показано, что короткие изоформы рецептора пролактина обладают достаточно широким спектром собственных эффектов, связанных с тканеспецифическими сигналами пролактина, с активацией/ингибированием многих транскрипционных факторов независимо от действия гормона через длинную изоформу рецептора пролактина. (Devi et al., 2009). Спектр эффектов пролактина определяется типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ рецептора гормона (Huang et al., 2008).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах у крысы: в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы независимо от пола животных. В холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, повышая уровень длинной изоформы и увеличивая экспрессию короткой (Богорад, 2004; Остроухова, 2008). Однако роль пролактина и его рецепторов в процессе патогенеза синдрома холестаза и зависимости от пола его развития остается не ясной.

Цель и задачи исследования.. Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе для оценки вклада пролактина в развитие патогенеза данного синдрома.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения концентрации билирубина в желчи и крови, скорости желчетока, относительной массы печени (в дальнейшем -показатели экскреторной функции печени) при холестазе и в начальный постхолестазный период у самок крыс.

2. Изучить изменения показателей экскреторной функции печени самок крыс в зависимости от длительности гиперпролактинемии при холестазе и в начальный постхолестазный период.

3. Проанализировать половые особенности показателей экскреторной функции печени при индукции и снятии холестаза и их изменение на фоне гиперпролактинемии.

4. Проанализировать влияние длительной гиперпролактинемии на экспрессию мРНК изоформ рецептора пролактина и их соотношение в гепатоцитах и холангиоцитах самок крыс при холестазе.

5. Осуществить поиск возможных молекулярных мишеней действия пролактина на гепатоциты и холангиоциты самок крыс на фоне холестаза при длительной гиперпролактинемии.

Научная новизна полученных результатов. В результате проведенного исследования установлено, что на фоне холестаза крыс действие пролактина на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается по сравнению с нормой и зависит от длительности гиперпролактинемии. В начальный постхолестазный период впервые выявлена половая зависимость в показателях экскреторной функции печени: у самок скорость восстановленного желчетока ниже, а концентрация билирубина в желчи выше, чем у самцов. Показано, что в условиях гиперпролактинемии на фоне обструктивного холестаза исчезают половые различия в концентрации билирубина в постхолестазной желчи и скорости желчетока и выявляются половые особенности альтернативных путей выведения билирубина у крыс. Впервые показано, что при холестазе в сочетании с длительной гиперпролактинемией в гепатоцитах самок крыс чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, а в холангиоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной. Установлено, что длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза у самок крыс не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера МКРЗ базолатеральной мембраны гепатоцитов и холангиоцитов, снижает экспрессию мРНК транспортера МЮР2 апикальной мембраны гепатоцитов, не действует на экспрессию мРНК этого транспортера в холангиоцитах и существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для апикальной мембраны холангиоцитов транспортера СМ К.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные важны для фундаментальной и клинической гепатологии в плане понимания компенсаторных и патологических изменений функций различных типов клеток печени в условиях обструктивного холестаза и роли пролактина в этих изменениях. Результаты исследования позволяют направленно осуществлять поиск транскрипционных факторов, участвующих в патогенезе холестаза при тканеспецифическом действии пролактина. Результаты работы свидетельствуют о необходимости учета возможного двоякого (про- и антихолестатического) действия пролактина в патогенезе данного синдрома.

Обнаруженные нами половые особенности в исследуемых показателях экскреторной функции печени позволяют обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии холестаза в будущем, а рецепторы пролактина могут служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия. Эксперименты с длительной гиперпролактинемией в сочетании с холестазом у самок крыс могут служить в качестве модели для изучения встречающегося у людей синдрома «известковой желчи». Используемую нами модель сочетания гиперпролактинемии и холестаза у самок крыс можно применять при изучении синдрома холестаза беременных.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Россия, Москва, 2008), V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Россия, Москва, 2008), XXI Европейском конгрессе эндокринологов «ЕСЕ 2009» (Турция, Стамбул, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Physiology 2009» (Ирландия, Дублин, 2009), XXXVI Международном конгрессе физиологов «IUPS 2009» (Япония, Киото, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Россия, Санкт-Петербург, 2009) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в их числе 3 статьи (1 из них в печати) в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на/^/страницах, содержит<?-5"рисунков и таблиц. Список литературы включает 22./ источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Работа проводилась на половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс массой 190-250 г. Количество животных, вид операции, биоматериал и описание экспериментальных групп приведено в Таблице 1. Крысы обоего пола были распределены на 3 экспериментальные группы: с нормальным уровнем пролактина, с 2-х недельной и 4-х недельной пшерпролактинемией. В каждой группе были контрольные животные без холестаза, крысы на фоне холестаза и после его снятия в начальный постхолестазный период. У крыс каждой группы собирали желчь и кровь, взвешивали печень, дренировали общий желчный проток.

Дифференциальное выделение гепатоцитов и холангиоцитов. Часть экспериментов проводили на двух типах клеток печени самок крыс: гепатоцитах и холангиоцитах. Способ выделения фрагментов желчных протоков основан на методе, предложенном группами проф. Алышни и Альваро (Alpini, Phillips et al, 1994, Alpini, Ulrich et al, 1994, Mennone et al, 1995, Alvaro et al, 1997). В ходе выделения гепатоцитов и фрагментов внутрипеченочных желчных протоков проводили контроль качества разделения клеток: 1) по морфологии фрагментов протоковых структур и гепатоцитов; 2) по экспрессии специфических генов-маркеров методом ПЦР в «реальном» времени (см. ниже): для гепатоцитов - это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов - цитокератин 19 (Alpini et al, 1994).

Таблица 1. Число животных, тип биоматериала и вид операции в каждой экспериментальной группе.

ОПЕРАЦИИ биоматериал БЕЗ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА УРОВЕНЬ ПРОЛАКТИНА В КРОВИ ГИПЕР-ПРОЛАКТИНЕМИЯ (2-х недельная) ДЛИТЕЛЬНАЯ ГИПЕР-ПРОЛАКТИНЕМИЯ (4-х недельная)

интактные гонадэктомированные интактные интактные

САМЦЫ САМКИ САМЦЫ САМКИ САМЦЫ САМКИ САМКИ

БЕЗ ХОЛЕСТАЗА желчь 36 44 11 9 12 10 5

кровь 3 3 - - 3 3 3

печень 5 7 - - 3 4 3

дренирование желчного протока 36 43 11 9 12 10 5

выделение гепатоцитов - 3 - - - - 4

С ХОЛЕСТАЗОМ желчь 26 16 10 9 10 12 10

кровь 16 13 4 3 5 6 8

печень 19 13 5 4 6 8 8

выделение гепатоцитов 4 5

выделение холангиоцитов - 4 - - - - 4

В НАЧАЛЬНЫЙ ПЕРИОД СНЯТИЯ ХОЛЕСТАЗА желчь 8 12 5 4 4 4 Ток желчи не восстановился

кровь 8 10 5 4 4 4

печень 8 10 5 4 4 4

дренирование желчного протока 8 12 5 4 4 4 Ток желчи не восстановился

Хирургические методы. Все хирургические вмешательства проводили под легким эфирным наркозом. За день до операций крысам не давали есть при свободном доступе к воде. После операций животным восстанавливали доступ к пище и воде.

Гонадэктомию крыс проводили согласно классическому методу (Киршенблат, 1969), удаляя у самцов - семенники и эпидидимисы, у самок -яичники. Животных брали в основные эксперименты через 4 недели после гонадэктомии.

Перевязка и дренирование общего желчного протока крысы.

Обструктивный холестаз индуцировали перевязкой общего желчного протока в течение 14 дней. На проток накладывали две лигатуры, затем осуществляли перевязку и разрез протока между лигатурами. Через две недели производили забор скопившейся желчи, декапитацию животного, собирали кровь и мочу, взвешивали печень, вычисляя коэффициент масса печени/масса крысы, для оценки степени тяжести патологии. У части крыс через 14 дней из печени в дальнейшем дифференциально выделяли гепатоциты и холангиоциты. В исследование включали только крыс с признаками желтухи (как типичное проявление холестаза). Дренирование общего желчного протока проводили при введении в него полиэтиленового катетера крысам с нормальной работой печени до перевязки протока и крысам с признаками обструктивного холестаза (декомпрессию протока проводили через 14 дней после его перевязки). Начальным постхолестазным периодом считали момент через 3 часа после декомпрессии. После дренирования животных декапитировали, собрав желчь, кровь и мочу, взвешивали печень. У части крыс из печени в дальнейшем дифференциально выделяли гепатоциты и холангиоциты.

Трансплантация гипофиза под капсулу почки - модель создания гиперпролактинемии. Персистирукицую гаперпролактинемию (постоянно повышенный уровень пролактина в крови) вызывали классическим методом пересадки гипофиза донора под почечную капсулу реципиента того же пола. В работе были использованы две модели гиперпролактинемии: двухнедельная (в дальнейшем, гиперпролактинемия) и четырехнедельная (в дальнейшем, длительная гиперпролактинемия). В первом случае пересадку гипофиза производили одновременно с перевязкой общего желчного протока. Во втором - сначала пересаживали гипофиз, а через 14 дней после этого перевязывали общий желчный проток на фоне уже стабильно повышенного уровня пролактина. В качестве доноров гипофизов для трансплантации использовали половозрелых крыс, у которых сразу после декапитации извлекали гипофиз. Одновременно с этим у экспериментального животного делали небольшой надрез капсулы левой почки, под почечную капсулу немедленно пересаживали выделенный гипофиз. Общее время данной операции не превышало 2 минут. Трансплантацию считали успешной, если через 14 дней после операции чётко была видна васкуляризация гипофиза под оболочкой почки и отходящий сосуд. Определение пролактина крысы в сыворотке иммуноферменшым методом в соответствии с протоколом производителя с использованием набора для определения пролактина в сыворотке крысы EIA 4493 (DRG, USA)

показало, что пересадка гипофиза вызывает 2-3 кратное повышение концентрации гормона в сыворотке крови по сравнению с соответствующей группой без трансплантации гипофиза.

Определение концентрации билирубина в собранной желчи, сыворотке, моче крыс производили с помощью готовых наборов реактивов для определения билирубина BIL 100S (PLIVA- Lachema Diagnostika, Чехия), используя метод азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой в соответствии с методикой, рекомендованной производителем. Фотометрирование проводили на спектрофотометре GENESYS 20. В сыворотке крыс также определяли конъюгированную форму билирубина и вычисляли ее % содержание в крови (концентрация конъюгированного билирубина/концентрация общего билирубина в крови) для оценки тяжести патологии. Значения концентрации билирубина в желчи измеряли в получасовой пробе на 150-180 мин после начала дренирования протока.

В работе использовали средние величины показателей экскреторной функции печени при различных состояниях, в ряде случаев для оценки влияния холестаза использовали также средние величины разницы показателей до и после индукции холестаза, измеренные индивидуально у каждого животного.

Определение скорости желчетока. Интенсивность секреции желчи определяли каждые 10 мин в течение 3 часов после введения катетера в общий желчный проток. Через час после начала дренирования значение скорости желчетока выходило на плато, и мы вычисляли среднее значение скорости в последней получасовой пробе на 150-180 мин после начала дренирования протока. Значения концентрации билирубина и скорости желчетока нормировали на массу тела животного.

Молекулярпо-биологическне методы. Выделение РНК проводили с помощью реагента TRIzol в соответствии с протоколом производителя из 5-10 млн клеток печени: гепатоцитов и холангиоцитов. Выделенную тотальную РНК всех использованных в исследовании образцов клеток для избежания контаминации геномной ДНК обрабатывали ДНКазой I. Обработанную ДНКазоШ РНК очищали с помощью набора колонок для очистки малого количества РНК (RNeasy Plus Mini Kit, "Qiagen",CIIiA). Для дальнейшего синтеза кДНК использовали набор для обратной транскрипции (ImProm-II™ Reverse Transcription System, «Promega», США) в соответствии с протоколом производителя.

Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВУ Синтезированную кДНК использовали как матрицу для проведения ПЦР-РВ на амплификаторе Rotor-Gene 3000 («Corbett-Research», Австралия) с набором реактивов, включающим интеркалирующий краситель SYBR Green I (смесь №М-427, «Синтол», Россия) в соответствии с методикой, рекомендованной производителем. В реакционную смесь со всеми необходимыми компонентами добавляли праймеры в конечной концентрации 160 нМ и синтезированную кДНК в трех разведениях с каждой парой праймеров.

В нашей работе мы использовали праймеры к 1) кДНК hprt (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы) - основного house-keeping гена; 2) кДНК pgkl фосфоглицераткиназы 1 (добавочного house-keeping гена); 3) кДНК Э-актина (второго добавочного house-keeping гена); 4) кДНК транспортера MRP2 (rat multidrug resistance protein 2), 5) кДНК транспортера MRP3 (rat multidrug resistance protein 3), 6) кДНК транспортера CFTR (rat cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 7) кДНК короткой изоформы рецептора пролактина, 8) кДНК длинной изоформы рецептора пролактина, 9) кДНК глюкозо-6-фосфатазы (маркер для гепатоцитов), 10) кДНК цитокератин 19 (маркер для холангиоцитов). Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Beacon Designer 6.00.

Условия проведения ПЦР-РВ: денатурация - в течение 5 минут при 95°С, далее проводили 47 циклов ПЦР в следующем режиме: денатурация 95°С, 10 с, отжиг 59°С 17 с; элонгация 72°С 20 с. Интенсивность флуоресценции SYBR Green, связанного с двухцепочечной ДНК, определяли в конце стадии элонгации каждого цикла при 72 °С на канале FAM/Sybr. После последнего цикла снимали кривую плавления полученных продуктов ПЦР.

В каждую экспериментальную постановку включали контрольные реакции: два отрицательных контрольных образца, в первом есть все компоненты реакции кроме матричной ДНК (оценка загрязнения оборудования или реактивов) и во втором - в качестве матрицы 4 мкг выделенной РНК (контроль на присутствие в результате ПЦР продукта, полученного с геномной ДНК) и положительный контрольный образец, в котором реакция должна пройти обязательно (оценка правильного приготовления реакции и качества используемых реактивов) (Ребриков, 2009).

Уровень экспрессии мРНК изоформ рецептора пролактина, их соотношения и транспортеров клеток печени рассчитывался с использованием гена «домашнего хозяйства» hprt в качестве внутреннего контроля. В настоящее время, при нормировании результатов с использованием генов «домашнего хозяйства», для увеличения точности результатов, принято оценивать уровень экспрессии не одного, а нескольких генов «домашнего хозяйства» (Wong and Medrano, 2005). Мы провели сравнение результатов уровней изучаемых в работе мРНК, рассчитанных в процентах от содержания в данном образце мРНК гена «домашнего хозяйства»: hprt и двух других - pgkl и Р-актина, которые по литературным данным наиболее стабильно экспрессируются в печени даже при жестких условиях эксперимента (Pohjanvirta, 2006). Результаты сравнения показали стабильность экспрессии выбранных генов «домашнего хозяйства». В дальнейшем уровень изучаемых в работе мРНК рассчитывался в процентах от содержания в данном образце мРНК гена hprt.

Амплифицированные продукты анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Сравнение со стандартным набором маркеров показало, что длины всех продуктов амплификации соответствуют ожидаемым значениям. В каждом опыте в пробах без матрицы продукты амплификации отсутствовали. Секвенирование всех продуктов амплификации кДНК

подтвердило их полное соответствие ожидаемым нуклеотидным последовательностям. В работе учитывали только те результаты ПЦР, когда температура плавления продуктов амплификации и их электрофоретическая подвижность соответствовали ожидаемым.

Статистическая обработка данных. Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft Inc.», США). Для определения достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия с р<0,05. Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВЛИЯНИЕ ПРОЛАКТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА

1.1. Показатели экскреторной функции печени у самок крыс в норме, при холестазе и в начальный постхолестазный период

Для исследования влияния пролактина на экскреторную функцию печени крыс мы измеряли два важных показателя работы печени - концентрацию билирубина и скорость желчетока, которые кардинально изменяются в условиях холестаза. При механической обструкции общего желчного протока и последующей декомпрессии в нашей экспериментальной модели произошли ожидаемые изменения данных показателей: 1) при обструкции - остановка желчетока, желтуха, увеличение концентрации билирубина в крови (в основном за счет конъюгированной формы) и относительной массы печени, 2) при декомпрессии - достоверное снижение концентрации конъюгированного пигмента в крови, при этом % конъюгированного билирубина в крови не менялся, снижение относительной массы печени и достоверно ускоренное восстановление желчетока по сравнению с нормой (Табл. 2).

Изменения концентрации билирубина в моче во всех экспериментальных группах были недостоверны в связи с большим разбросом, данные в автореферате не приведены.

1.2. Влияние гиперпролактинемии на показатели экскреторной функции печени самок крыс в норме и на фоне холестаза

Мы выявили отсутствие влияния гиперпролактинемии на исследуемые показатели у самок крыс в норме. Однако на фоне холестаза гиперпролактинемия у самок привела к резкому увеличению концентрации конъюгированного билирубина в крови, при этом изменения процента конъюгированного билирубина в крови не отмечалось. Снятие холестаза на фоне гиперпролактинемии вызвало достоверное падение концентрации пигмента в крови в 4 раза, в результате чего отличия с нормой в данном показателе нивелировались. Гиперпролактинемия вызывала при снятии холестаза достоверное снижение скорости желчетока при отсутствии выраженного влияния на желчеток в норме (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на показатели экскреторной функции печени используемых в работе экспериментальных групп

Группы крыс Концентрация билирубина, мкмоль/л/кг Масса печенн/ масса крысы, % Скорость желчетока, мкл/мик/кг

в желчи в крови

Интактные самки 470 ±26 (44) <10 (3) 2,7 ±0,1 (7) 36 ±1 (43)

самцы 479 ±20 (36) <10 (3) 2,8 ±0,1 (5) 35 ±1 (36)

Интактные + гиперПРЛ самки 505 ±32 (10) <10 (3) 3,2 ± 0,1 (4) 31±3 (10)

самцы 474 ±41 (12) <10 (3) 2,9 ±0,1 (3) 35 ±1 (12)

Интактные + длительная гиперПРЛ самки 577 ±68 (5) <10 (3) 2,9 ± 0,3 (3) 35 ±5 (5)

С холестазом самки 467 ±98 (16) 519 ±59 (13)* 6,2 ±0,3 (13)* Остановка желчетока

самцы 217 ± 37 (26) • ,# 455 ±40 (16) 6,6 ±0,2 (19) Остановка желчетока

С холестазом + гиперПРЛ самки 617 ±70 (12) 1029 ±140 (6)# 6,6 ±0,5 (8) Остановка желчетока

самцы 271 ±70 (Ю) о 515 ± 37 (5)П 6,3 ± 0,3 (6) Остановка желчетока

С холестазом + длительная гиперПРЛ самки 68 ±26 (10) и 598 ±51 (8) 6,1 ± 0,5 (8) Остановка желчетока

После декомпрессии самки 2241 ±237 (12) 296 ±33 (10) # 5,4 ±0,4 (Ю) 56 ± 4 (12)*

самцы 1385 ±248 («)♦ 318 ±54 (8) 6,4 ±0,3 (8) ♦ 75 ±8 (8) ♦

После декомпрессии + гиперПРЛ самки 1861 ±477 (4) 240 ±48 (4) 5,1 ± 0,2 (4) 44 ±3 (4) ♦

самцы 2022 ±220 (4) 418 ±43 (4)п 5,6 ±0,4 (4) 50 ±11 (4)

* р < 0,05 по сравнению с показателем у интактных самок

# р < 0,05 по сравнению с показателем у самок с холестазом

♦ р < 0,05 по сравнению с показателем у самок после декомпрессии желчного протока

а р < 0,05 по сравнению с показателем у самок соответствующей группы с гипсрпролактинемией

• р < 0,05 по сравнению с показателем у интактных самцов

Показатель концентрации билирубина в желчи при холестазе оказался вариабельным. При измерении у части животных индивидуальной разницы концентрации билирубина между холестазной и нормальной желчью было установлено, что на фоне холестаза концентрация билирубина в желчи всегда снижалась по сравнению с исходным уровнем и разница концентраций показателя между холестазной и нормальной желчью всегда была отрицательной. На Рис. 1 видно, что на фоне гиперпролактинемии концентрация билирубина в желчи росла при холестазе по отношению к исходному уровню, разница в его уровне была положительной и достоверно отличалась от разницы, наблюдаемой у животных с нормальным уровнем пролактина.

X с

ю о

Я о

3. -|ии

I о

§ I -200

¡8

« 9

Я X -400 -О. в

-300 ■

(12)

Рис. 1. Степень и направленность изменений концентраций билирубина в желчи на фоне обструктивного холестаза у самок крыс с нормальным (А), повышенным (Б) уровнем пролактина (М±8ет). В скобках - число животных, * р < 0,05 по сравнению с показателем у самок без гиперпролактинемии.

Итак, повышение уровня пролактина в крови у крыс в норме не оказывало влияние на показатели экскреторной функции печени, а при холестазе было показано усиление действия данного гормона. Возможность такого развития событий вытекает из некоторых данных литературы. Известно, что первым этапом действия пролактина является связывание с мембранными рецепторами (Во1е-Реузо1 ег а1., 1998). При обструктивном холестазе изменяется уровень и компартментализация рецепторов пролактина в клетках печени, особенно в холангиоцитах (Смирнова и др., 1998; Остроухова, 2008). Центральную роль при развитии как компенсаторных, так и патологических изменений, возникающих в ответ на холестатические повреждения печени, играют клетки желчных протоков (Магаош е1 а1., 2002), которые активно пролиферируют при холестазе и достигают 20% от массы печени по сравнению с 3% в норме (А1р1ш, 1994), при этом в данном типе клеток существенно возрастает уровень рецепторов пролактина (Во§огас1,2006; Тайе1аш ег а1., 2007).

1.3. Влияние длительной гиперпролактинемии на показатели экскреторной функции печени самок крыс с нормальной работой печени и на фоне холестаза. В нашей работе впервые показана зависимость действия пролактина на фоне холестаза от длительности гиперпролактинемии у самок. Считается, что за две недели после трансплантации гипофиза под почечную капсулу крысы происходит увеличение концентрации пролактина в крови с выходом на плато (Tudpor, 2005). При длительной гиперпролактинемии в холестазной желчи билирубин практически отсутствовал, наблюдался синдром так называемой «известковой» (или «молочно-кальциевой») желчи (Маев, 1997). При использовании нашего способа дренирования протока мы не смогли добиться восстановления тока желчи у крыс данной экспериментальной группы (Табл. 2).

Следовательно, можно отметить двухфазное действие пролактина на перераспределение пула билирубина при холестазе у самок крыс - увеличение концентрации пигмента как желчи, так и в крови, затем снижение в крови и почти полное исчезновение в желчи. В начальный постхолестазный период с увеличением длительности гиперпролактинемии скорость восстановленного желчетока замедляется вплоть до полной остановки.

Обнаруженные кардинальные нарушения экскреторной функции печени при холестазе на фоне длительной гиперпролактинемии возможно связаны с изменением работы апикальной мембраны клеток желчных протоков. Согласно литературным данным, до 50 % кислотонезависимого желчетока обеспечивает секреция ионов НСОз*. Секреция бикарбоната происходит главным образом на уровне холангиоцитов в ответ на стимуляцию гормонами и нейропептидами (Trauner, 2003). Известно, что белок CFTR апикальной поверхности эпителиальных клеток обеспечивает секрецию хлоридов, ускоряет поступление анионов бикарбоната за счет регуляции работы других транспортеров (Li et al., 2005). Недавно было обнаружено, что пролактин стимулирует секрецию СГ в эпителиальных клетках эндометрия свиньи, осуществляя действие через свою короткую изоформу, которая экспрессируется преимущественно на базолатеральной мембране этих клеток (Deachapunya et al., 2008). Следовательно, возможно, что пролактин участвует в регуляции уровня экспрессии и/или экспонирования на мембране транспортеров апикальной мембраны холангиоцитов при холестазе. Это заставило нас проследить влияние пролактина на экспрессию CFTR в холангиоцитах (см далее). Разный эффект действия пролактина в зависимости от длительности воздействия его воздействия можно объяснить возможным различным действием короткой изоформы рецептора пролактина на ряд транскрипционных факторов клеток печени (Devi et al., 2009), что требует дальнейшего исследования (см. далее).

2. ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ

2.1. Половые особенности перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза у крыс. Мы показали зависимое от пола

изменение работы печени на фоне обструктивного холестаза, в то время как в условиях нормальной работы органа половые отличия исследуемых показателей отсутствовали (Рис. 2). При холестазе у самцов произошло более резкое по сравнению с самками снижение концентрации билирубина в желчи. В нашей работе показано, что зависимость от пола показателей экскреторной функции печени наиболее ярко проявляется в начальный период снятия холестаза. У самцов при декомпрессии общего желчного протока ток желчи восстанавливался с большей скоростью при более низком содержании билирубина в желчи, чем у самок. При предварительной гонадэктомии все выявленные половые различия нивелировались.

3000 -

2500 -

1С

а 2000 г ь с

5 5 1С ^

о 5

1500

I *

1С I юоо

о .

■ I

а *

г 120

100

!- 80-

60 -

а.

□ самки Псамцы

холестаз декомпрессия

(19X9) (9X12) (8) (5)

норма г/э холестаз г/э декомпрессия

(9) (11) (9) (10) (4)(5)

Г1

гЬ

норма декомпрессия

(18) (9) (8) (5)

норма г/э декомпрессия

(9) (11) (4)г/э (5)

Рис. 2. Половые различия концентрации общего билирубина в желчи (А) и скорости желчетока (Б) у крыс в норме, на фоне холестаза и при декомпрессии (МАвет). Темные столбцы - самцы, светлые столбцы - самки. В скобках - число животных, г/э - Гонадэктомированные животные, * р < 0,05 по сравнению с показателем у самок соответствующей группы

Зависимость от пола исследуемых показателей экскреторной функции печени в условиях обструктивного холестаза при отсутствии их в норме может быть связана с изменением работы зависимых от пола транспортеров клеток печени, участвующих в переносе билирубина в желчь и регулирующих желчеток. Известно, что экспрессия в печени интактных крыс мРНК и

белкового продукта белка 2 множественной устойчивости к лекарствам (MRP2), участвующего в транспорте билирубина в желчь, дифференцирована по полу с преобладанием у самок. Однако в норме эти половые различия физиологически не проявляются, так как при этом не выявляется зависимости от пола уровня экспонирования MRP2 на апикальной мембране гепатоцитов, что определяет эффективность действия этого транспортера (Simon, 2006). При холестазе крыс снижается экспрессия мРНК и белка MRP2, происходит также изменение клеточной локализации MRP2: удаление из каналикулярной мембраны за счет возврата в периканаликулярные везикулы, что сочетается со снижением желчетока (Veggi, 2005). Возможно, обструктивный холестаз является таким состоянием, когда скрытая половая дифференцировка экспрессии MRP2 начинает проявляться и отражаться на скорости удаления белка из мембранного компартмента и скорости его повторного встраивания при снятии холестаза, что может реализоваться в виде ползависимого влияния на скорость желчетока при декомпрессии.

Также, вероятно, различия в концентрации и паттерне секреции пролактина у животных разного пола (Розен и др., 1991) в сочетании с изменением экспрессии рецептора пролактина в гепатоцитах и особенно в холангиоцитах (Богорад, 2004) тесно связаны с появлением половых особенностей перераспределения пулов билирубина при обструктивном холестазе.

2.2. Изменение половых особенностей перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза на фоне гиперпролактинемии крыс. Исследование изменения половой зависимости показателей экскреторной функции печени крыс проводили, используя модель двухнедельной гиперпролактинемии. Установлено усиление влияния пролактина на исследуемые показатели в сочетании с холестазом при отсутствии влияния у крыс с нормальной работой печени. Впервые показано, что гиперпролактинемия при снятии холестаза приводит к нивелированию половых различий ряда показателей экскреторной функции печени (концентрация билирубина в постхолестазной желчи, относительная масса печени и скорость желчетока) и появлению половых особенностей альтернативных путей выведения билирубина (Табл. 2). При этом в условиях обструктивного холестаза при гиперпролактинемии сохранилась и стала более выражена зависимость от пола концентрации общего билирубина в желчи, с преобладанием у самок.

Известно, что холестаз приводит к появлению альтернативного пути выведения билирубина и желчных кислот через базолатеральную мембрану гепатоцита обратно в системный кровоток и удалению пигмента из организма через почки с мочой (Zollner, 2006). В нашей работе мы показали (Табл. 2), что при сочетании гиперпролактинемии и холестаза у самок крыс в 2 раза повышается концентрация билирубина в крови (в основном за счет конъюгированной формы) по сравнению с самцами соответствующей экспериментальной группы и самками на фоне холестаза без изменения уровня пролактина в крови. Половые отличия в концентрации билирубина в крови не

исчезли через 3 часа после декомпрессии протока, однако, из-за более резкого падения данного показателя у самок (в 4 раза), концентрация пигмента была выше у самцов в связи с небольшим изменением после снятия холестаза (в 1,2 раза - см. Табл. 2).

Обнаруженное в работе зависимое от пола влияние пролактина на перераспределение пулов билирубина и желчевыделительную функцию печени может быть связано с участием этого гормона в регуляции уровня экспрессии и экспонирования на мембране транспортеров билирубина и желчных кислот, таких как белки множественной устойчивости к лекарствам 2 и 3 (MRP2, MRP3), натрий-таурохолат-котранспортер (NTCP) и некоторые другие, экспрессия которых меняется при обструктивном холестазе и в исследованных случаях зависит от пола (Simon et al., 2006; Zollner et al., 2006; Cheng et al., 2007). Выраженное влияние персистирующей гиперпролактинемии на самцов связано, очевидно, с тем, что создаваемый повышенный уровень пролактина имитирует малофлюктуирующий, женский паттерн секреции этого гормона (Розен и др., 1991), что у самцов не только увеличивает его общий уровень, но и меняет паттерн его секреции на женский.

3. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ

Как уже было показано в предыдущих работах нашей лаборатории и других исследованиях короткая и длинная изоформы рецептора пролактина выявлялись и в гепатоцитах, и в холангиоцитах интактных животных (Bogorad, 2006, Taffetani et al., 2007, Остроухова, 2008). Относительное количество рецептора пролактина (как длинной, так и короткой изоформ) в гепатоцитах выше, чем в холангиоцитах (Bogorad, 2006, Остроухова, 2008). При этом в гепатоцитах интактных самок крыс доминирует короткая изоформа рецептора, соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора в холангиоцитах ниже, чем в гепатоцитах (Остроухова, 2008). По данным нашей лаборатории обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии мРНК рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах: 1) в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы, 2) в холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, главным образом, за счет длинной изоформы, и индуцирует увеличение короткой (Богорад, 2004).

В данном исследовании при анализе результатов мы опирались на ранее полученные данные по экспрессии мРНК рецептора пролактина в холангиоцитах и гепатоцитах крысы с нормальной работой печени.

Впервые в нашей работе продемонстрировано, что при холестазе в сочетании с длительной гиперпролактинемией пролактин сохранял свое позитивное влияние на короткую и длинную форму рецепторов пролактина в гепатоцитах и дополнительно увеличивал долю короткой формы в холангиоцитах. В гепатоцитах чувствительность к пролактину на фоне холестаза в сочетании с длительной гиперпролактинемией увеличилась за счет

относительно равномерного усиления экспрессии мРНК обеих изоформ рецептора, в холангиоцитах увеличилась доля короткой изоформы рецептора пролактина без существенного влияния на длинную (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на экспрессию мРНК и соотношение изоформ рецептора пролактина в клетках печени самок крыс____

мРНК короткой мРНК длинной Соотношение

Тип клеток, состояние изоформы изоформы уровней мРНК

животного рецептора рецептора короткой и

пролактина, пролактина, длинной изоформы

% от мРНК hprt % от мРНК hprt рецептора

пролактина

60 ±6 25 ± 1 2,4 ±0,3 (4)

I ЕГ С холестазом (4) (4)

8 С холестазом + 118 ±7 40 ±3 3,0 ±0,3 (5)

Й длительная (5)* (5) *

К гиперПРЛ

^ 16 ±3,0 14 ±1,4 1,1 ±0,1(3)

е § С холестазом (3) (3)

к Ь С холестазом + 30 ±5,5 17 ±3,4 1,7 ±0,1

длительная (3) (3) (3)*

1 гиперПРЛ

Значения уровня мРНК выражены в % от содержания мРНК гена hprt (M±sem). В скобках - число животных, * р<0,05 по сравнению с соответствующей группой без гиперпролактинемии.

Характер ответа клетки на пролактин определяется соотношением изоформ рецептора. Ответ целого органа складывается из соотношения ответов его клеточных элементов. Таким образом, основываясь на наших данных, можно предположить, что при обструктивном холестазе на фоне длительной гиперпролактинемии в гепатоцитах происходит усиление Jak/STAT каскада, а пропорциональное увеличение обеих форм, возможно, говорит о том, что относительный вклад негативного влияния короткой формы на проведение сигнала длинной существенно не изменилось. В холангиоцитах в данных условиях, вероятно, увеличивается доля «тканеспецифических» каскадов за счет относительного повышения экспрессии короткой изоформы рецептора пролактина, что предполагает усиление ее эффектов на известные зависимые от нее транскрипционные факторы — например, возможная активация ERK (Huang et al., 2008), ингибирование Spl и Galt (Devi et al., 2009, Halperin et al., 2008).

4. ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС НА ФОНЕ ХОЛЕСТАЗА

Белки множественной устойчивости к лекарствам MRP2 и MRP3 и белок трансмембранного регулятора муковисцидоза CFTR - ключевые транспортеры в образовании кислотонезависимого желчетока, экспрессия которых сильно

меняется при холестазе. Выбор данных транспортеров основан на полученных нами результатах при выполнении физиологических экспериментов: отсутствие восстановления скорости желчетока и практическое исчезновение билирубина из желчи на фоне длительной гиперпролактинемии при сочетании с холестазом у самок крыс.

Мы предположили, что повышение чувствительности печени крысы на фоне холестаза к пролакгину, может отражать многогранную роль данного гормона в механизмах регуляции изменения экскреторной функции печени. Таким образом, мы решили изучить особенности экспрессии мРНК транспортеров MRP2, MRP3 и CFTR различных типов клеток печени на модели длительной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом самок крыс.

4.1. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортеров MRP2 и MRP3 клеток печени разного типа у самок крыс при холестазе. Показано, что экспрессия мРНК транспортера MRP2 в норме в гепатоцитах высока, а экспрессия мРНК транспортера MRP3 низка. При холестазе происходило достоверное снижение экспрессии мРНК транспортера MRP2 и соответствующий рост экспрессии мРНК транспортера MRP3 (см. Рис. 3) в гепатоцитах, что привело к росту уровня общего и конъюгированного билирубина в крови (как было показано ранее). Такое реципрокное изменение системы транспортеров MRP2/MRP3 согласуется с литературными данными и считается компенсаторным, антихолестатическим процессом (Zollner, 2006), происходящим в условиях холестаза.

Впервые нами установлено, что в гепатоцитах длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза снижает экспрессию мРНК транспортера MRP2. Этим, очевидно, можно хотя бы частично объяснить выявленное нами снижение концентрации билирубина в желчи и затруднение восстановления желчетока в начальный постхолестазный период у соответствующей группы самок крыс. При длительном воздействии пролактин на фоне холестаза не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК MRP3 в гепатоцитах (Рис. 3).

В холангиоцитах экспрессия мРНК системы транспортеров MRP2 и 3 существенно не изменилась в данных условиях.

Однако можно отметить, что в случае действия короткой двухнедельной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом у самок крыс, возможно обратное действие пролактина на транспортеры - увеличение экспрессии (или стимуляция встраивания данного транспортера в мембрану из везикул) мРНК MRP2 апикальной мембраны клеток (т.к. показано увеличение билирубина в желчи) и увеличение (или стимуляция встраивания данного транспортера в мембрану из везикул) экспрессии мРНК MRP3 базолатеральной мембраны клеток (т.к. показано достоверно резкое увеличение билирубина в крови), что требует дальнейшего исследования экспрессии мРНК данных транспортеров и изучения траффика внутриклеточного пула везикул.

■с

-с 900

1 800 о.

2 700

I 600

500

è 400

300 200 100 0

о О

норма (3)

норма с гиперПРЛ (4)

холестаз(4) холестаз с гиперПРЛ (4)

Г 25 sé

! 20

15 i

г 5

s о -

норма (3)

норма с гиперПРЛ (4)

холестаз(4) холестаз с гиперПРЛ (4)

Рис. 3. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на содержание мРНК транспортеров MRP2 (А) и MRP3 (Б) в изолированных гепатоцитах самок крыс в норме и на фоне холестаза (M±sem). В скобках - число животных,

* р < 0,05 по сравнению с показателем в норме

# р < 0,05 по сравнению с показателем при холестазе

Следовательно, в исследуемой нами модели пролактин может оказывать частичное антихолестатическое действие, участвуя в снижении экспрессии мРНК MRP2 в гепатоцитах. Иншбирование экспрессии мРНК данного транспортера может происходить через активацию Jak/STAT каскада, индуцируемое пролактином через длинную изоформу своего рецептора, так как в гене MRP2 показано наличие STAT элементов (Simon et al., 2006). Однако пролактин может также осуществлять ингибирование экспрессии транскрипционного фактора spl через короткую форму рецепторов (Devi et al., 2009), что в свою очередь, приводит к снижению экспрессии мРНК MRP2, так как в гене MRP2 есть чувствительный элемент для spl (Iida et al., 2001, Kauffmann et al., 2001).

4.2. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК специфического для холангиоцитов транспортера СЕТК у самок крыс при холестазе. В нашей работе мы показали, что длительная гиперпролактинемия в сочетании с холестазом приводит к существенному повышению экспрессии СРП?, холангиоцитов у самок крыс (Рис. 4).

Рис. 4. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на содержание мРНК транспортера СПИ в изолированных холангиоцитах самок крыс при I холестазе (Мхвет). В скобках - число животных,

* р < 0,05 по сравнению с показателем при холестазе

В исследуемой нами модели мы показали появление белой «известковой» желчи у крыс на фоне длительной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом. По литературной данным появление белой желчи говорит о снижении экспрессии МИР2 (что мы подтвердили в нашей работе), ' повышении секреции НСОз" и более длительном течении холестаза у больных (¿ветЬегу, 2000). Также в «известковой желчи» определяют диффузный преципитат карбоната кальция. Сильно изменяется рН желчи в сторону ощелачивания, что приводит к кристаллизации с образованием осадка (Маев, 1997).

В нашей работе мы показали, что пролактин стимулировал экспрессию мРНК, но и, вероятно, активацию работы СРТЛ на мембране холангиоцитов, вызывая повышенную секрецию бикарбоната, что создает базу для образования известковой желчи, и стимулируя поступление воды, что приводит к снижению концентрации билирубина в желчи. Действие гормона в холангиоцитах может происходить, возможно, через короткую изоформу рецептора.

Следовательно, в исследуемой нами модели пролактин при длительном воздействии может оказывать и выраженное прохолестатическое действие в патогенезе холестаза.

350 -

а?

к зоо-О -с

а 250 -

х ■= 0. * 2 X

з!

<0 о

о о

200 ■ 150 -

100

50 -

холестаз (4)

холестаз+гилерПРЛ (4)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о существенной роли пролактина в регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе. На фоне гиперпролактинемии у крыс

а) исчезают половые различия ряда показателей экскреторной функции печени,

б) снижается скорость желчетока при декомпрессии желчного протока,

в) изменяется уровень и соотношение изоформ рецептора пролактина, зависимое от типа клеток печени,

г) изменяется экспрессия мРНК ключевых транспортеров, определяющих кислотонезависимый желчеток и транспорт билирубина в желчь.

Результаты нашей работы показали, что обструктивный холестаз может проявлять и усиливать половую зависимость ряда показателей экскреторной функции печени, которая скрыта в норме. Проведенная работа свидетельствует о том, что ползависимость функций печени может усиливаться при патологии.

Автор выражает глубокую и искреннюю признательность сотрудникам лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН и лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова за неоценимую помощь и ценные советы при проведении молекулярно-биологических исследований.

выводы

1. Действие пролактина на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается на фоне холестаза у крыс по сравнению с нормой.

2. Влияние гиперпролактинемии на перераспределение пулов билирубина при холестазе самок зависит от ее длительности: при 2-х-недельном воздействии содержание билирубина растет в желчи и крови, а скорость восстановленного желчетока замедляется, при 4-х-недельном - концентрация билирубина резко снижается в желчи и приходит к контрольному уровню в крови, а желчеток не восстанавливается.

3. В начальный постхолестазный период выявлена половая зависимость в показателях экскреторной функции печени: у самок скорость восстановленного желчетока ниже, а концентрация билирубина в желчи выше, чем у самцов.

4. В условиях гиперпролактинемии на фоне обструктивного холестаза исчезают половые различия в концентрации билирубина в постхолестазной желчи и скорости желчетока и выявляются половые особенности альтернативных путей выведения билирубина у крыс.

5. Влияние длительной гиперпролактинемии на уровень и соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора пролактина при холестазе самок крыс зависит от типа клеток печени: в гепатоцитах чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, в холаншоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной.

6. Длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза самок крыс: а) достоверно снижает экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов МИР2 (белка 2 множественной устойчивости к лекарствам), не действуя на экспрессию мРНК данного транспортера в холаншоцитах; б) не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов и холангиоцитов МИРЗ (белка 3 множественной устойчивости к лекарствам); в) существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для холангиоцитов хлорного канала СИТИ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Половые особенности перераспределения пулов общего билирубина при индукции и снятии холестаза у крыс И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146, №11. С. 495-498.

2. Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Влияние пролактина на показатели экскреторной функции печени при индукции и снятии холестаза у самок крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т. 148, №11. С. 511-514.

3. Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Изменение половых особенностей перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза на фоне гиперпролактинемии крыс II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010 (в печати).

4. Кушнарева Н.С. Влияние гиперпролактинемии на различные показатели экскреторной функции печени в модели индукции и снятии холестаза у крыс // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». 8-11 апреля 2008. Москва. Секция «Биология». С. 25.

5. Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Скорость желчетока и экскреция билирубина с желчью в модели индукции и снятия холестаза в зависимости от пола крысы // Тезисы к докладу V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». 19-22 мая 2008. Москва. №6. С. 237-238.

6. Kushnareva N., Sergeeva М., Smimova О. Influence of hyperprolactinemia on prolactin receptor manifestation and hepatic bilirubin excretory activity under condition of female rat obstructive cholestasis // Endocrine Abstracts for the 11th European Congress of Endocrinology. 25-29 April 2009. Istanbul, Turkey. V. 20. P620.

7. Kushnareva N., Smirnova O. Restoration of bile bilirubin excretion rate after cessation of obstructive cholestasis is suppressed by hyperprolactinemia in rats // Abstracts for the Annual meeting of the Physiological Society "Physiology 2009". University College Dublin. 7-10 July 2009. Dublin, Ireland. Proc Physiol Soc 15. С 88.

8. Kushnareva N., Smirnova O. Gender differences in redistribution of bilirubin pools in the model of induction and cessation of cholestasis in rats // Abstracts for the The Journal of Physiological Sciences, V. 59, Suppl. 1, 2009. Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences "IUPS 2009". July 27-August 1,2009. Kyoto, Japan. P3PM-15-5.

9. Кушнарева H.C., Сергеева MM., Смирнова О.В. Влияние гиперпролактинемии на уровень экспрессии транспортера MRP3 в клетках печени самок крыс в условиях обструктивного холестаза и его снятии // Тезисы к докладу VII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем». 29 Сентября - 2 Октября 2009. Санкт-Петербург, Россия. С. 240.

Заказ № 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кушнарева, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.^.

Глава 1. ЭКСКРЕТОРНАЯ ФУНКЦИЯ ПЕЧЕНИ И ЕЕ ГОРМОНАЛЬНАЯ

РЕГУЛЯЦИЯ (обзор литературы).

1.1. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ.

1.2. ОБРАЗОВАНИЕ И СЕКРЕЦИЯ ЖЕЛЧИ.

1.2.1. Структура желчевыводящих путей.

1.2.2. Функции и состав желчи.

1.2.3. Механизмы формирования желчетока: роль гепатоцитов и холангиоцитов.

1.2.4. Метаболизм билирубина. Транспортеры билирубина и его производных в клетках печени.

1.2.5. Участие гормонов в регуляции кислотонезависимого желчетока.

1.3. ОБСТРУКТИВНЫЙ ХОЛЕСТАЗ: ПАТОГЕНЕЗ И РОЛЬ ГОРМОНОВ.

1.4. ПРОЛАКТИН И ЕГО ДЕЙСТВИЕ НА ПЕЧЕНЬ.

1.4.1. Функции пролактина в организме.

1.4.2. Особенности секреции пролактина. Гиперпролактинемия.

1.4.3. Структура и изоформы рецептора пролактина. Механизм проведения сигнала пролактина через собственные рецепторы.

1.4.4. Особенности экспрессии мРНК рецептора пролактина в клетках печени.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ.

2.1.1. Экспериментальные группы животных.

2.1.2. Обоснование контрольных групп.

2.1.3. Обоснование отбора крыс через 14 дней после перевязки общего желчного протока. Особенности модели обструктивного холестаза.

2.2. МАТЕРИАЛЫ.

2.2.1. Реактивы.

2.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

2.3.1. Хирургические операции.

2.3.1.1. Кастрация самцов.

2.3.1.2. Овариэктомия самок.

2.3.1.3. Дренирование и перевязка общего желчного протока крысы.

2.3.1.3.1. Дренирование и перевязка общего желчного протока крысы в норме

2.3.1.3.2. Дренирование общего желчного протока крысы в начальный период декомпрессии.

2.3.1.4. Трансплантация гипофиза под капсулу почки — модель создания гиперпролактинемии.

2.3.2. Введение препаратов.

2.3.2.1. Введение бромокриптина

2.3.3. Методы разделения клеток.

2.3.3.1. Дифференциальное выделение гепатоцитов и холангиоцитов.

2.3.3.1.1. Общие стадии разделения клеток печени.

2.3.3.1.2. Выделение гепатоцитов.

2.3.3.1.3. Выделение холангиоцитов.

2.3.3.1.4. Проверка качества выделения клеток.

2.3.4. Биохимические и физиологические методы.

2.3.4.1 Определение концентрации билирубина в желчи, сыворотке и моче крыс.

2.3.4.2 Определение скорости желчетока.

2.3.4.2.1. Определение скорости желчетока крысы в норме.

2.3.4.2.2. Определение скорости желчетока крысы в начальный период декомпрессии.

2.3.4.3 Вычисление скорости экскреции общего билирубина с желчью.

2.3.5. Молекулярно-биологические методы.

2.3.5.1 Выделение РНК из изолированных клеток.

2.3.5.2. Обработка РНК ДНКазой I.

2.3.5.3. Очистка РНК на колонках RNeasy Plus Mini Kit.

2.3.5.4. Синтез первой цепи кДНК.

2.3.5.5. Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I.

2.3.5.6. Анализ результата ПЦР-РВ.

2.3.6. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ПРОЛАКТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ

ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС

ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА.

3.1. ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ У САМОК

КРЫС ПРИ НОРМАЛЬНОЙ РАБОТЕ ПЕЧЕНИ.

3.1.1. Концентрация билирубина в желчи, сыворотке, моче.

3.1.2. Скорости желчетока и экскреции билирубина с желчью.

3.2. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ У САМОК КРЫС.

3.2.1. Концентрация билирубина в желчи, сыворотке, моче.

3.3. ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК В НАЧАЛЬНЫЙ IЮСТХОЛЕСТАЗНЫЙ ПЕРИОД.

3.3.1. Концентрация билирубина в желчи, сыворотке, моче.

3.3.2. Скорости желчетока и экскреции билирубина с желчью.

3.4. ВЛИЯНИЕ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС С НОРМАЛЬНОЙ ФУНКЦИЕЙ ПЕЧЕНИ И НА ФОНЕ ХОЛЕСТАЗА.

3.4.1. Влияние гиперпролактинемии на концентрацию билирубина в желчи, сыворотке, моче.

3.4.2. Влияние гиперпролактинемии на скорости желчетока и экскреции билирубина с желчью.

3.5. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС С НОРМАЛЬНОЙ ФУНКЦИЕЙ ПЕЧЕНИ И НА ФОНЕ ХОЛЕСТАЗА.

3.5.1. Влияние длительной гиперпролактинемии на концентрацию общего билирубина в желчи, сыворотке, моче.

3.5.2. Влияние длительной гиперпролактинемии на скорость желчетока.

ГЛАВА 4. ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ.

4.1. ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПУЛОВ ОБЩЕГО БИЛИРУБИНА ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА У КРЫС.

4.1.1. Половые особенности концентрации общего билирубина в желчи, сыворотке, моче.

4.1.2. Половые особенности скорости желчетока и экскреции билирубина с желчью крыс в начальный период декомпрессии.

4.2. ИЗМЕНЕНИЕ ПОЛОВЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПУЛОВ БИЛИРУБИНА ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА

НА ФОНЕ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ КРЫС.

4.2.1. Влияние гиперпролактинемии на половые особенности концентрации общего билирубина в желчи, сыворотке, моче крыс.

4.2.2. Влияние гиперпролактинемии на половые особенности скоростей желчетока и экскреции билирубина с желчью в начальный постхолестазный период у крыс.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ.

5.1. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА В ГЕПАТОЦИТАХ САМОК КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ.

5.2. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА В ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ.

Глава 6. ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТВИЯ

ПРОЛАКТИНА НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС НА ФОНЕ ХОЛЕСТАЗА.

6.1. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера

MRP2 клеток печени разного типа.

6.1.1. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера MRP2 гепатоцитов.

6.1.2. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера MRP2 холангиоцитов.

6.2. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера

MRP3 клеток печени разного типа.

6.2.1. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера MRP3 гепатоцитов.

6.2.2. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортера MRP3 холангиоцитов.

6.3. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК CFTR в холангиоцитах самок крыс на фоне холестаза.

Глава 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина"

Образование желчи — жизненно важная функция организма, ее нарушение ведет к синдрому холестаза. По современным представлениям под холестазом понимают нарушение синтеза, секреции и оттока желчи (Подымова, 2004). Синдром холестаза встречается при различных состояниях, которые могут быть объединены в 2 большие группы: 1) нарушение образования желчи (вирусные, алкогольные, лекарственные и токсические поражения печени, холестаз беременных, цирроз, бактериальные инфекции); 2) нарушение тока желчи (первичный билиарный цирроз, болезнь Кароли, первичный склерозирующий холангит, туберкулез, реакция отторжения трансплантата). Заболевания печени, сопровождающиеся холестазом, зависят от пола и многие из них являются преимущественно женскими (Радченко и др., 2005). Пик желчекамнеобразования у женщин совпадает с репродуктивным периодом. Физиологическая беременность как пусковой момент патологических процессов в желчевыводящей системе послужила поводом к причислению заболеваний желчного пузыря ко «вторым женским заболеваниям после гинекологических» (Торчинов и др., 2006).

За последнее десятилетие расширилось понимание патогенеза холестаза. Появляется много данных о взаимосвязанной работе ряда транспортеров гепатобилиарной системы в печени, почках и кишечнике, регуляции транспортеров, участвующих в образовании желчи и нарушениях при холестазе. Показано, что не все изменения в экспрессии транспортеров гепатобилиарной системы носят «про-холестатический», «негативный» характер, - некоторые перестройки в клетках печени и почках представляют собой компенсаторный (анти-холестатический) механизм, защищающий организм от повреждений (Zollner and Trauner, 2006). Половая дифференцировка показана в уровне экспрессии и регуляции транспортеров, участвующих в процессе желчеобразования. Показано участие половых гормонов в регуляции работы гепатобилиарной транспортной системы при холестазе (Shimizu et.al., 2007).

Билирубин - одни из физиологически значимых анионов, являющийся важным компонентом желчи, селективно захватывается транспортерами базолатеральной мембраны гепатоцита из крови, с последующей конъюгацией с глюкуроновой кислотой. Скорость транспорта конъюгированного билирубина из печени в желчь лимитируется его экскрецией через транспортеры каналикулярной (апикальной) мембраны гепатоцита (Решетняк, 2003).

Чувствительность печени к пролактину, одному из женских половых гормонов, оценивая по уровню его рецепторов, очень высока и сопоставима с чувствительностью молочной железы (Varas and Jahn, 2005; Bogorad et.al., 2006; Simon-Holtorf et.al., 2006). Известны отдельные молекулярные мишени действия пролактина на печень (Cao et.al., 2004; Taffetani et.al., 2007), однако его конечные физиологические эффекты на желчевыделительную и другие функции печени остаются неясными. Экспрессия рецепторов пролактина в печени зависит от пола: у особей женского пола уровень рецепторов данного гормона выше, чем у мужского (Розен и др., 1991 ; Smirnova et al., 1994).

Пролактин осуществляет свои эффекты, связываясь со специфическими рецепторами к данному гормону и активируя внутриклеточные сигнальные молекулы. Известны несколько функционально различных изоформ рецептора пролактина. Длинная изоформа рецептора опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозишшназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), главным образом STAT5 (Bole-Feysot et al., 1998). Короткие изоформы рецептора пролактина не способны активировать STAT5 белки и являются негативными регуляторами JAK2/STAT5 сигнализации, из-за образования гетеродимеров с длинной формой рецептора, препятствующих активации STAT-каскада. Однако недавно было показано, что короткие изоформы рецептора пролактина обладают достаточно широким спектром собственных эффектов, связанных с тканеспецифическими сигналами пролактина, с активацией/ингибированием многих транскрипционных факторов независимо от действия гормона через длинную изоформу рецептора пролактина. (Devi et.al., 2009а,b). Действие пролактина на клетки определяется типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ рецептора гормона (Huang et.al., 2008).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах у крысы: в гепатоцитах он действует преимущественно, на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы независимо от пола животных. В- холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, повышая уровень длинной изоформы и увеличивая экспрессию короткой (Богорад, 2004; Остроухова, 2008) . Однако роль пролактина и его рецепторов в процессе патогенеза синдрома холестаза и зависимости от пола остается не ясной.

Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе для оценки вклада пролактина в развитие патогенеза данного синдрома.

Для реализации поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать изменения концентрации билирубина в желчи, крови, моче, скорости желчетока и скорости экскреции билирубина с желчью, относительной массы печени (в дальнейшем — показатели экскреторной функции печени) при холестазе и в начальный постхолестазный период у самок крыс.

В результате проведенного исследования установлено, что на фоне холестаза крыс действие пролактина на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается по сравнению с нормой и зависит от длительности гиперпролактинемии. В начальный постхолестазный период впервые выявлена половая зависимость в показателях экскреторной функции печени: у самок скорость восстановленного желчетока ниже, а концентрация билирубина в желчи выше, чем у самцов. Показано^ что в условиях гиперпролактинемии на фоне обструктивного холестаза исчезают половые различиям концентрации билирубина в постхолестазной желчи и скорости желчетока и выявляются половые особенности альтернативных путей выведения билирубина у крыс. Впервые показано, что при холестазе в сочетании с длительной гиперпролактинемией в гепатоцитах самок крыс чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, а в холангиоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной. Установлено, что длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза у самок крыс не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера MRP3 базолатеральной мембраны гепатоцитов и холангиоцитов, снижает экспрессию мРНК транспортера MRP2 апикальной мембраны гепатоцитов, не действует на экспрессию мРНК этого транспортера в холангиоцитах и существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для апикальной мембраны холангиоцитов хлорного канала CFTR.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

Полученные данные важны для фундаментальной и клинической гепатологии в плане понимания компенсаторных и патологических изменений функций различных типов клеток печени в условиях обструктивного холестаза и роли пролактина в этих изменениях. Результаты исследования позволяют направленно осуществлять поиск транскрипционных факторов, участвующих в патогенезе холестаза при тканеспецифическом действии пролактина. Результаты работы свидетельствуют о необходимости учета возможного двоякого (про- и антихолестатического) действия пролактина в патогенезе данного синдрома.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кушнарева, Наталья Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Действие пролактииа на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается на фоне холестаза крыс по сравнению с нормой.

2. Влияние гиперпролактинемии на перераспределение пулов билирубина при холестазе самок зависит от ее длительности: при 2-х-недельном воздействии содержание билирубина растет в желчи и крови, а скорость восстановленного желчетока замедляется, при 4-х-недельном — концентрация билирубина резко снижается в желчи и приходит к контрольному уровню в крови, а желчеток не восстанавливается.

5. Влияние длительной гиперпролактинемии на уровень и соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора пролактина при холестазе самок крыс зависит от типа клеток печени: в гепатоцитах чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, в холангиоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной.

6. Длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза самок крыс: а) достоверно снижает экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов МЯР2, не действуя на экспрессию мРНК данного транспортера в холангиоцитах; б) не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов и холангиоцитов МИРЗ; в) существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для холангиоцитов хлорного канала СРТ11.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о существенной роли иролактина в регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе, при этом: а) исчезают половые различия ряда показателей экскреторной функции печени, б) снижается скорость желчетока при декомпрессии желчного протока, в) изменяется уровень и соотношение изоформ рецептора пролактина, зависимое от типа клеток печени, г) изменяется экспрессия мРНК ключевых транспортеров, определяющих кислотонезависимый желчеток и транспорт билирубина в желчь.

Важность пролактина и запускаемых им сигнальных «тканеспецифичных» путей в регуляции изменения и восстановления экскреторной функции печени при холестазе и в начальный постхолестазный период кажется нам несомненной. Обнаруженные нами половые особенности в исследуемых показателях экскреторной функции печени позволяют обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии холестаза в будущем, а рецепторы пролактина могут служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия. При этом мы показали возможное двоякое действие про- и анти- холестатическое в патогенезе данного синдрома. Возможно, модель длительной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом у самок крыс в будущем может рассматриваться в качестве модели для изучения синдрома «известковой желчи», встречающегося у людей, что требует проведения дальнейших исследований.

Анализ литературных данных и полученных нами результатов показал, что при изучении механизмов регуляции образования и секреции желчи важно:

• учитывать видовые (человек, крыса, мышь) отличия в работе транспортеров, ферментов, строении гепатобилиарной системы

• проводить исследования на животных обоих полов

• учитывать взаимосвязанные изменения работы печени, почек и кишечника при нарушениях гепатобилиарной системы

• исследовать как гепатоциты (учитывая важность зонального расположения основных клеток печени), так и холангиодиты (учитывая их дифферендировку на крупные и мелкие)

• исследовать функционально-различные мембраны полярных клеток: гепатоцитов и холангиоцитов, - апикальную и базальную

• при анализе результатов по уровню экспрессии мРНК транспортеров гепатобилиарной системы учитывать внутриклеточный пул транспортеров и работающие транспортеры на мембране клеток

• исследовать и анализировать характер происходящих изменений (компенсаторные и повреждающие) при патологиях гепатобилиарной системы, соотношение которых меняется от длительности патологии при изучении влияния пролактина и его действия через собственные рецепторы важно: о проводить исследования на животных обоих полов, учитывая отличия в паттерне секреции гормона и в уровне экспрессии рецепторов гормона о исследовать соотношение изоформ рецептора пролактина (учитывая зависимость уровня экспрессии и соотношения изоформ рецепторов и концентрации пролактина в крови от стадии цикла и физиологического состояния у самок крыс) для оценки вклада возможных сигнальных путей действия гормона о учитывать зависимость эффектов действия пролактина от длительности воздействия гиперпролактинемии о учитывать различное влияние пролактина на транскрипционные факторы в зависимости от типа ткани/клеток В ближайших перспективах продолжения работы по исследованию роли пролактина в регуляции экскреторной функции печени при патологии гепатобилиарной системы можно отметить: исследование уровня экспрессии и соотношения изоформ рецептора пролактина в различных типах клеток печени крысы при непродолжительной гипер- и гипопролактинемии на фоне холестаза и его снятия изучение работы транспортеров печени и почек исследование участия возможных транскрипционных факторов различных типов клеток печени крысы для понимания путей проведения сигнала при действии пролактина через собственные рецепторы при холестазе

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кушнарева, Наталья Сергеевна, Москва

1. Богорад Р.Л. Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс: Дис. Канд. Биол.наук. Москва. 2004. - 130 с.

2. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Романцова Т.И. Синдром гиперпролактинемии. М.- Тверь: ООО «Издательство «Триада». 2004. — 304с.

3. Зенкова Т.Ю., Куликов A.B., Богорад Р.Л. и др. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печени человека при холестазе разной этиологии и вторичном раке печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2003 -Т.135 №6 — С.664-668

4. Иванченкова P.A., Свиридов A.B., Грачев С.В. Холестероз желчного пузыря: современный взгляд на патогенез, клинику, диагностику и лечение.- М.: ООО «Медицинское информационное агенство» 2005 — 200с.

5. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии // М.: Высшая школа -1969 С.174-175

6. Коток Т., Богорад Р., Смирнов А., Туровецкий В., Смирнова О. Влияние периовуляторного дисбаланса пролактина на экспрессию рецепторов пролактина в клетках яичника крысы // Онтогенез 2000. Том 31, №2, с. 144-151

7. Лейшнер У. Практическое руководство по заболеваниям желчных путей. — М.: ГЭОТАР-МЕД 2001. - 264с.

8. Маев И.В., Верткин А.Л. Синдром «известковой желчи» // Топ-медицина —1997 №2 - С.35-36

9. Ю. Масюк А.И. Молекулярные и клеточные механизмы желчеотделительной функции печени // Успехи физиол. наук 1990 - Т.21 - С. 18-35

10. П.Орлова А.Н., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Роль пролактина в регуляции некоторых функций клеток печени после перевязки общего желчного протока И Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1999а - Т. 127 - С.573-575

11. Орлова А.Н., Смирнова О.В., Туровецкий В.Б., Смирнов А.Н. Влияние ингибитора секреции пролактина — бромокриптина на интенсивность экспрессии рецепторов пролактина в клетках общего желчного протока // Бюлл. эксп. биол. мед. —1998 Т. 126 - №7 - С. 52-55

12. Орлова А.Н., Смирнова О.В., Туровецкий В.Б., Смирнов А.Н. Ядерная манифестация рецепторов пролактина в гепатоцитах крыс и влияние на нее пролактина // Бюлл. эксп. биол. мед. — 19996 Т. 127 — С.579-582

13. Остроухова Т.Ю. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения: Дис. Канд. Биол. наук. Москва. 2008. 159с.

14. Панин Л.Е., Костина Н.Е., Шестопалова Л.В. Нарушение обмена билирубина и развитие гипербилирубинемии у новорожденных крысят под влиянием несимметричного диметилгидразина (гептила)//Бюллетень СО РАМН. 2005 №4(118).

15. Петращук О.М., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Рецепторы пролактина в клетках желчных протоков в онтогенезе крыс // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1996 — Т. 122 - С.669-672

16. Подымова С.Д. Болезни печени // М.: Медицина 1998

17. Подымова С.Д. Внутрипеченочный холестаз: патогенез и лечение с современных позиций // Гастроэнтерология 2004 - Т 06 - N2

18. Радченко В.Г., Шабров А.В, Зиновьева E.H. Основы клинической гепатологии. Заболевания печени и билиарной системы // СПб: Издательство «Диалект»; М.: Издательство «БИНОМ» 2005 - 864с.

19. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. ПЦР «в реальном времени». -М.: БИНОМ. Лаборатория знаний 2009 - 223 с.

20. Решетняк В.И. Механизмы желчеобразования и первичный билиарный цирроз: Монография. М.: Издательский дом «Красная площадь» - 2003 - 144с.

21. Розен В.Б. Основы эндокринологии. М.: Издательство МГУ — 1994

22. Розен В.Б. Матарадзе Г.Д., Смирнова О.В., Смирнов А.Н. Половая дифференцировка функций печени. М.: Медицина — 1991

23. Рубцов П.М. и Лонина Д.А. Гетерогенность 5'-нетранслируемой области мРНК рецептора пролактина печени крыс // Мол. Биол. — 1996 Т.30 - С.330-338

24. Рубцов П.М. Структура и экспрессия генов рецепторов гормона роста и пролактина // Вестник Акад. Мед. Наук 1994 - Т. 12 - С. 19-23

25. Смирнов А.Н. Элементы эндокринной регуляции. М.: ГЭОТАР-Медиа —2006

26. Смирнова О.В., Богорад Р.Л. Короткие формы мембранных рецепторов: образование и роль в проведении гормонального сигнала // Биохимия 2004 — Т.69 — С.437-450

27. Сухих Г .Т., Назареико Т.А., Лопатина Т.В. и др. Эндокринные формы бесплодия у женщин: диагностика и лечение. Учебное пособие для системы послевузовского образования врачей/ М.: Издательский дом «Русский врач», 2008. — 142с.

28. Торчинов A.M., Кантемирова З.Р., Лисин С.В., Петухов В.А. Беременность и патология желчного пузыря. М.: МАКС Пресс, 2006. - 156 с.

29. Хем А., Кормак В. Гистология. Т. 4. Пер. с англ. М.: Москва - 1983

30. АН S., Edery М., Pellegrini I., Lesueur L., Paly J., Djiane J., and Kelly P.A. The NB2 form of prolactin receptor is able to activate a milk protein gene promoter. Mol. Endocrinol. 1992 - V. 6 - P. 1242-1248

31. Ali S., Nouhi Z„ Chughtai N., Ali S. SHP-2 Regulates SOCS-l-mediated Janus Kinase-2 ubiquitination/degradation downstream of the prolactin receptor // J. Biol. Chem. 2003 - V. 278 - P.52021-52031

32. Alpini G., Glaser S.S., Ueno Y., Pham L., Podila P.V., Caligiuri A., LeSage G., LaRusso N.F. Heterogeneity of the proliferative capacity of rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1998 - V.274 - G.767-775

33. Alpini G., Lenzi R., Zhai W.R., Slott P.A., Liu M.H., .Sarkozi L., Tavolini N. Bile secretory function in intrahepatic billiary epithelium in the rat // Am. J. Physiol. — 1989 V.257 -P.G124-133

34. Alpini G., Phillips J.O., Vroman В., LaRusso N.F. Recent advances in the isolation of liver cells // Hepatology 1994a - V.20 - P.494-514

35. Alpini G., Ulrich C.D., Philips J.O. Pham L.D., Miller L.J., LaRusso N.F. Upregulation of secretin receptor gene expression in rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1994b - V.266 - G922-928

36. Alvarez E.O., Banzan A.M. Behavioral actions of prolactin locally applied into the hyppocampus of adult female rats // J. Neural Transm. 1994 - V.95 - P.17-28

37. Alvaro D., Mancino M.G., Onori P., Franchitto A., Alpini G., Francis H., Glaser S., Gaudio E. Estrogens and the pathophysiology of the biliary tree // World J. Gastroenterol. 2006 - V. 12 - P.3537-3545

38. Alvaro D., Mennone A., Boyer J.L. Role of kinases and phosphatases in the regulation of fluid secretion and С1-/НСОЗ- exchange in cholangiocytes // Am. J. Physiol. -1997 —V.273 -G303-313

39. Arden K.C., Boutin J.M., Djiane J., Kelly P.A., Cavenee W.K. The receptors for prolactin and growth hormone are localized in the same region of human chromosome 5 // Cytogenet. Cell. Genet. 1990 - V.53 - P.161-165

40. Aronson DC, Chamuleau RA, Frederics W Reversibility of cholestatic changes following experimental common bile duct obstruction:fact or fantasy?// J.Hepatol. -1993 —V. 18 (1) -P.85-95

41. Bachelot A. and Binart N. Reproductive role of prolactin // Reproduction -2007-V.133 — P.361-369

42. Basman N. and Baker A. Basic function of the liver // Diseases of the liver and biliary tract // Eds. Gitnick G., Labrecque D.R., Mody F.G. St. Louis Mosby Year Book, 1992

43. Beach J.E., Tyrey L. and Everett J.W. Serum prolactin and LH phase a of delayed versus direct pseudopregnancy in the rat // Endocrinology 1975 - V.96 - P. 12411248

44. Belinsky MG, Dawson PA, Shchaveleva I, Bain LJ, Wang R, Ling V, Chen ZS, Grinberg A, Westphal H, Klein-Szanto A, Lerro A, Kruh GD. Analysis of the in vivo functions of Mrp3 // Mol Pharmacol. 2005 - Jul;68(l):160-8.

45. Benhamouche S., Decaens T., Godard C., Chambrey R., Rickman D.S., Moinard C., Vasseur-Cognet M., Kuo C.J., Kahn A., Perret C., Colnot S. Ape tumor suppresser gene is the "zonation-keeper" of mouse liver // Develop. Cell — 2006 — V.10 -P.759-770

46. Ben-Jonathan N. and Hnasko R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor // Endocrine Reviews 2001 - V.22 - P.724-763

47. Berdiev BK, Qadri YJ, Beños DJ. Assessment of the CFTR and ENaC association // Mol Biosyst. 2009. - V.5(2) - P. 123-127

48. Berlanga J.J., Fresno-Vara L.A., Marti-Perez J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin receptor is associated with c-src kinase in rat liver // Mol. Endocrinol. —1995 — V.9 — P. 12611467

49. Binart N., Imbert-Bollore P., Baran N., Viglietta C., Kelly P.A. A short form of the prolactin (PRL) receptor is able to rescue mammopoiesis in heterozygous PRL receptor mice // Mol. Endocrinol. 2003 - V.17 -P. 1066-1074

50. Bode H.P., Wang L.F., Cassio D., Leite M.F., St-Pierre M.V., Hirata K., Okazaki K., Sears M.L., Meda P., Nathanson M.H., Dufour M.H. Expression and regulation of gap junctions in rat cholangiocytes // Hepatology 2002 - V.36 - P.631-640

51. Bogorad R.L., Ostroukhova T.Y., Orlova A.N., Rubtsov P.M., Smirnova O.V. Long isoform of prolactin receptor predominates in rat intrahepatic bile ducts and further increases under obstructive cholestasis // J Endocrinol 2006 — V.l 88 - P.345-354

52. Bole-Feysot C., Goffln V., Edery M., Binart N. and Kelly P. A. Prolactin and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in prolactin receptor knockout mice // Endocrin.Rev. 1998 - V. 19 - P.225-268

53. Brandebourg T.D., Bown J.L., Ben-Jonathan N. Prolactin upregulates its receptors and inhibits lipolysis and leptin release in male rat adipose tissue // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 - V. 357(2):- P.408-13

54. Breitling R., Krazeisen A., Moller G., Adamski J. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 an ancient 3-ketosteroid reductase of cholesterogenesis // Mol. Cell. Endocrinol. - 2001 - V. 171 - P. 199-204

55. Bridges RS, Dunckel PT. Hormonal regulation of maternal behavior in rats: stimulation following treatment with ectopic pituitary grafts plus progesterone // Biol. Reprod. 1987 - V.37 (3) - P.518-526

56. Buckley A.R., Putnam C.W., Evans R., Laird H.E. 2nd, Shah G.N., Montgomery D.W., Russell D.H. Hepatic protein kinase C: translocation stimulated by prolactin and partial hepatectomy // Life Sci. 1987 - V.41 - P.2827-2834

57. Campbell G.S., Argetsinger L.S., Ihle J.N., Kelly P.A., Rillema J.A., Carter-Su C. Activation of JAK2 tyrosine kinase by prolactin receptors in Nb2 cells and mouse mammary gland explants // Proc. Nati. Acad. Sci. 1994 - V. 91 - P.5232-5236

58. Cao J, Wood M, Liu Y, Hoffman T, Hyde J, Park-Sarge OK, Vore M.

59. EstradioT represses'prolaetin-indueed expression of Na+/taurocholate eotransportingpolypeptide in liver cells through estrogen receptor-alpha and signal transducers andactivators of transcription 5a // Endocrinology. 2004 - V.145 (4) - P. 1739-1749

60. Chang W.P., Clevenger C.V. Modulation of growth factor receptor functionby isoform heterodimerization // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 - V.93 - P.5947-5952

61. Chang W.P., Ye Y., Clevenger C.V. Stoichiometric structure-functionanalysis of the prolactin receptor signaling domain by receptor chimeras // Mol. Cell. Biol. 1998 V.18 -P.896-905

62. Cheng Y., Zhizhin I., Perlman R.L., Mangoura D. Prolactin-induced cellproliferation in PC12 cells depends on JNK but not ERK activation // J. Biol. Chem. 2000- V.275 — P.23326-23332

63. Chu XY, Strauss JR, Mariano MA, Li J, Newton DJ, Cai X, Wang RW,

64. Yabut J Hartley DP, Evans DC, Evers R. Characterization of mice lacking the multidrug resistance protein MRP2 (ABCC2) // J Pharmacol Exp Ther. 2006 - V.317(2) - P.579-89.

65. Clevenger C.V., Furth C.A., Hankinson S.E., and Schuler L.A. The role ofprolactin in mammary carcinoma // Endocrine Reviews 2003 - V.24 - P. 1-27

66. Clevenger C.V., Kline J.B. Prolactin receptor signal transduction // Lupus2001 —V.10-P.706-718

67. Cui Y, Konig J, Leier I, Buchholz U, Keppler D. Hepatic uptake of bilirubinand its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6 // J Biol Chem.- 2001 1. V. 276(13) -P.9626-30

68. Dardenne M., de-Moraes M. do C„ Kelly P.A., Gagnerault M.C. Prolactinreceptor expression in human hematopoietic tissues analyzed by flow cytofluorometry //

69. Endocrinology 1994 - V.134 - P.2108-2114

70. Das R., Vonderhaar B.K. Activation of raf-1, MEK, and MAP kinase inprolactin responsive mammary cells // Breast Cancer Res. Treat. 1996a - V.40 - P.141-149

71. Das R., Vonderhaar B.K. Involvment of SHC, GRB2, SOS and RAS in prolactin signal transduction in mammary epithelial cells // Oncogene 19966 - V.131. P.l 139-1145

72. Das R., Vonderhaar B.K. Transduction of prolactin's growth signal through both long and short forms of the PRL receptors // Mol. Endocrinol. 1995 - V.9 - P.17501759

73. Davis J.A., and Linzer D.H. Expression of multiple forms of the prolactin receptor in mouse liver // Mol. Endocrinology 1989 - V. 3 - P.674-680

74. Deachapunya C., Poonyachoti S., Krishnamra N. Regulation of electrolyte transport across cultured endometrial epithelial cells by prolactin // Journal of Endocrinology 2008. - V. 197 - P.575-582

75. Devost D., Boutin J.M. Autoregulation of the rat prolactin gene in lactotrophs // Mol.Cel.Endocrinology 1999 - V.158 - P.99-109

76. Dif F., Saunier E., Demeneix B., Kelly P.A., Edery M. Cytokine-inducible SH2-containing protein suppresses PRL signaling by binding the PRL receptor // Endocrinology 2001 - V. 142 - P.5286-5293

77. Djiane J., Daniel N., Bignon C., Paly J., Waters M., Vacher P., Dufy B. Prolactin receptor and signal transduction to milk protein genes // Proc.Soc.ExpBiol.Med. — 1994 V.206 - P.299-303

78. Duan W.R., Farmer T.G., Albarracin C.T., Zhong L., and Gibori G. PRAP, a prolactin receptor associated protein: its gene expression and regulation in the corpus luteum // Endocrinology -1997 V.138 - P.3216-3221

79. Erlinger S., Dhumeaux D. Mechanisms and control of secretion of bile water and electrolytes // Gastroenterology 1974 - V.66 -№2 - P281-304

80. Fallon M.B., Brecher A.R., Balda MS, Matter K., Anderson J.M. Altered hepatic localization and expression of occludin after common bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1995b - V.269 (4) - P.C1057-C1062

81. Fallon M.B., Nathanson M.H., Mennone A., Saez J.C., Burgstahler A.D., Anderson J.M. Altered expression and function of hepatocyte gap junctions after common bile duct ligation in the rat // Am. J. Physiol. 1995 - V.268 - P.C1186-C1194

82. Fevery J., B. Van Damme, R. Michiels, J. De Groote, K.P. Heirwegh Bilirubin conjugates in bile of man and rat in the normal state and in liver disease// The journal of clinical investigation, 51 — 1972

83. Fleenor D., Arumugam R., Freemark M. Growth hormone and prolactin receptors in adipogenesis: STAT-5 activation, suppressors of cytokine signaling, and regulation of insulin-like growth factor I // Horm. Res. 2006 - V.66 - P. 101-110

84. Frame M.K., de Feijter A.W. Propagation of mechanically induced intercellular calcium waves via gap junctions and ATP receptors in rat liver epithelial cells // Exp. Cell. Res. 1997 - V.230 - P.197-207

85. Freeman M.E., Kanyicska B., Lerant A., Nagy G. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion // Physiological Reviews 2000 - V.80 - P. 1523-1631

86. Galsgaard E.D., Nielsen J.H., Moldrup A. Regulation of prolactin receptor gene expression in insulin-producing cells // J. Biol. Chem. 1999 - V.274 - P. 18686-18692

87. Gaudio E., Onori P., Pannarale L., Alvaro D. Hepatic microcirculation and peribiliary plexus in experimental biliary cirrhosis: a morphological study // Gastroenterol. -1996 -V.lll-P.l 118-1124

88. Gholson C.F., Bacon B.R. Practical hepatobiliary anatomy and physiology// Essentials of clinical hepatology / Eds. Gholson,C.F., Bacon B.R. St.Lowis: Mosby-Year Book, 1993

89. Gitnick G., LaBrecque D.R., Moody F.G. Diseases of the Liver and Biliary Tract // Mosby-Year Book —1992

90. Goffin V., Kelly P.A. Prolactin and growth hormone receptors // Clin.Endocrinol (Oxf) 1996 - V.45 - P. 247-255

91. Gradilone S., Masyuk A., Splinter P., Banales J., Huang B., Tietz P., Masyuk T., LaRusso N. Cholangiocyte cilia express TRPV4 and detect changes in luminal tonicity inducing bicarbonate secretion // PNAS 2007 - Y.104 (48) - P19138-19143

92. Granato A, Gores G, Vilei M, Tolando R, Muraca M Bilirubin inhibits bile acid induced apoptosis in rat hepatocytes // Gut 2003 - V.52 -P. 1774-1778

93. Gutzman J.H., Rugowski D.E., Schroeder M.D., Watters J.J. and Schuler L.A. Multiple Kinase Cascades Mediate Prolactin Signals to Activating Protein-1 in Breast Cancer Cells // Mol. Endocrinol. 2004 - V. 18 - P.3064-3075

94. Harewood WJ, Gillin A, Hennessy A, Armistead J, Horvath JS, Tiller DJ. Biochemistry and haematology values for the baboon (Papio hamadryas): the effects of sex, growth, development and age // J Med Primatol. -1999. V. 28(1) - P. 19-31

95. Herbert D.C., Ishikawa H., Rennels E.G. Evidence for the autoregulation of hormone secretion by prolactin // Endocrinology 1979 - V. 104 - P.97-100

96. Higashijima H., Yamashita H., Makino I., Kuroki S. Significance of serum delta bilirubin during obstructive jaundice in dogs // J.Surg. Res.-1996 V.66 (2) -119-124

97. Hinuma S., Habata Y., Fujii R., Kawamata V. A prolactin-releasing peptide in the brain // Nature 1998 - V.393 - P. 272-276

98. Hu Z.Z., Li Z., Dufau M.L. Multiple and tissue-specific promoter control of gonadial and non-gonadial prolactin receptor gene expression // J. Biol. Chem. — 1996 — V.271 -P. 10242-10246

99. Hu Z.Z., Li Z., Guan X., Meng J., Dufau M.L. Steroidogenic Factor-1 is an essential transcriptional activator for gonad-specific expression of promoter I of the Rat prolactin receptor gene // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P. 14263-14271

100. Hu Z.Z., Meng J., Dufau M.L. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 // J. Biol. Chem. 2001 - V.276 - P.41086-41094

101. Hu Z.Z., Zhuang L., Meng J., Tsai-Morris C.H., Dufau M.L. Complex 5' genomic structure of the human prolactin receptor: multiple alternative exons 1 and promoter utilization // Endocrinology 2002 - V.143 - P.2139-2142

102. Huang K., Ueda E., Chen Y., Walker A.M. Paradigm-shifters: phosphorylated prolactin and short prolactin receptors // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. — 2008

103. Ihle J.N. STATs: Signal transducers and activators of transcription // Cell -1996 V.84 - P.331-334

104. Ito K, Koresawa T, Nakano K, Horie T. Mrp2 is involved in benzylpenicillin-induced choleresis II Ami Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004 -V.287(l) - P. 42-49

105. Jahn G.A., Edery M., Belair L., Kelly P.A., Djiane J. Prolactin receptor gene expression in rat mammary gland and liver during pregnancy and lactation // Endocrinology- 1991 — V.128 — P.2976-2984

106. Jolicoeur C., Boutin J.M., Okamura H., Raguet S., Djiane J., Kelly P.A. Multiple regulation of prolactin receptor gene expression in rat liver // Mol. Endocrinol. -1989 — V.3 — P.895-900

107. Kanno N., Lesage G., Glaser S., Alpini G. Regulation of cholangiocyte bicarbonate secretion // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.- 2001 -V.281 -G.612-625

108. Kauffinann HM, Vorderstemann B, Schrenk D. Basal expression of the rat, but not of the human, multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene is mediated by CBF/NF-Y and Spl promoter-binding sites // Toxicology. 2001. -V. 167(1) - P. 25-35

109. Kelly P.A., Boutin J.-M., Jolicoeur C., Okamura H., Shirota M., Edery M., Dusanter-Fourt I., Djiane J. Purification, Cloning, and Expression of the Prolactin Receptor // Biol. Reprod. -1989 V.40 - P.27-32

110. Kelly P.A., Djiane J., Postel-Vinay M.C., Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family // Endocrine Reviews -1991 -V.12-P.23 5-251

111. Khattabi E.I., Remade C., Reusens B. The regulation of IGFs and IGFBPs by prolactin in primary culture of fetal rat hepatocytes is influenced by maternal malnutrition // Am J Physiol Endocrinol Metab 2006 - V 291 - P.E835-E842, 2006

112. Kline J.B., Roehrs H., Clevenger C.V. Functional characterization of the intermediate isoform of the human prolactin receptor // J. Biol. Chem. 1999 - V.274 -P.35461-35468

113. Kline J.B., Rycyzyn M.A., Clevenger C.V. Characterization of a novel and functional human prolactin receptor isoform (ASlPRLr) containing only one extracellular fibronectin-like domain // Mol. Endocrinol. 2002 - V. 16 - P.2310-2322

114. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease // Adv. Anat. Embriol. Cell. Biol. 2001 - V. 14 - P. 1-107

115. Koga Y., Kitajima Y., Miyoshi A., Sato K., Kitahara K., Soejima H., Miyazaki K. Tumor progression through epigenetic gene silencing of 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase in human biliary tract cancers // Ann. Surg. Oncol. 2005 - V.12 -P.354-363

116. Kojima T., Yamamoto T., Murata M., Chiba H., Kokai Y., Sawada N. Regulation of the blood-biliary barrier: interaction between gap and tight junctions in hepatocytes // Med. Electron. Microsc. 2003 - V.36 - P.157-164

117. Roller T., Kollerova J., Huorka M., Hlavaty T., Payer J. Impact of basal prolactin levels on the prevalence of complications and the prognosis of patients with liver cirrhosis // Vnitr Lek. 2009 - V55 (5) - P. 468-473

118. Kullak-Ublick G.A., Stieger B., Hagenbuch B., Meier P.J. Hepatic Transport of Bile Salts // Seminars in Liver Disease 2000 - V.20 - P.273-292

119. Kullak-Ublick G.A., Stieger B., Meier P.J. Enterohepatic bile salt transporters in nopmal physiology and liver disease // Gastroenterology 2003 - V. 126 - P.322-342

120. Lebrun J.J., Ali S., Goffin V., Ullrich A., Kelly P.A. A single phosphotyrosine residue of the prolactin receptor is responsible for activation of gene transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995a - V.92 - P.4031 -4035

121. Lebrun J.J., Ali S., Ullrich A., Kelly P.A. Proline-rich sequence-mediated JAK2 association to the prolactin receptor is required but not sufficient for signal transduction // J. Biol. Chem. 19956 - V.270 - P. 10664-10670

122. Lenzen R., Alpini G., Tavoloni N. Secretin stimulates bilr ductilar secretory activity through thr cAMP system // Am.J.Physiol.- 1992 -V.263 (4) P.G527-G532

123. Li Y., Suresh Kumar K. G., Tang W., Spiegelman V.S., Fuchs S.Y. Negative regulation of prolactin receptor stability and signaling mediated by SCFp-TrCP E3 ubiquitin ligase // Mol. Cell. Biol. 2004 - P.4038-4048

124. Li C, Naren AP. Macromolecular complexes of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and its interacting partners // Pharmacol Ther.- 2005. V. 108(2) — P. 208-223

125. Liquita M.G., Catania V.A., Sanchez-Pozzi E.J., Mottino A.D. Ovine prolactin increases hepatic UDP-glucoroniltransferase activity in ovariectomized rats // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 - V.278 - P.921-925

126. Lu J.-C., Piazza T.M., Schuler L.A. Proteasomes mediate prolactin-induced receptor downregulation and fragment generation in breast cancer cells // J. Biol. Chem. — 2005 V.280 - P.33909-33916

127. Lu J.-C., Scott P., Strous G.J., Schuler L.A. Multiple internalization motifs differentially used by prolactin receptor isoforms mediate similar endocytic pathways // Mol. Endocrinol. 2002 - V. 16 - P.2515-2527

128. Luquita MG, Catania VA, Sanchez EJ, Vore M, Veggi LM Induction of phase II biotransformation reacrions in rat jejunum during lactation. Possible involvement of prolactin// Biochim Biophys Acta. 1999 - V. 1472 (1 -2) - P. 82-92

129. Ma F.Y., Anderson G.M., Gunn T.D., Goffin V., Grattan D.R., Bunn S.J. Prolactin specifically activates signal transducer and activator of transcription 5b in neuroendocrine dopaminergic neurons // Endocrinol. 2005 — V. 146 — P.5112-5119

130. Marzioni M., Glaser S.S., Francis H., Phinizy L.J., LeSage G., and Alpini G. Functional Heterogeneity of Cholangiocytes // Sem. Liv. Disease 2002 - V.22 - P.227-240

131. Masyuk A., Masyuk T., Splinter P., Huang B., Stroope A., LaRusso N. Cholangiocyte cilia detect changes in luminal fluid flow and transmit them into intracellular Ca2+ and cAMP signaling // Gastroenterology -2006-V131(3)-P911 -920.

132. Masyuk T., Ritman E., Larusso N. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three -dimensional reconstruction // American J of Pathology 158 (6)-2001

133. Meng J., Tsai-Monis C.-H., Dufau M.L. Human prolactin receptor variants in breast cancer: low ratio of short forms to the long-form human prolactin receptor associated with mammary carcinoma // Cancer Res. 2004 - V.64 - V.5677-5682

134. Mennone A., Alvaro D., Cho W., Boyer J.L. Isolation of small polarized bile duct units // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1995 - V.92 - P.6527-6231

135. Mesa VA, De Vos R, Fevery J Elevation of the serum bilirubin diconjugate fraction provides an early marker for cholestasis in the rat//J Hepatol.-1997-V.27(5)-P.912-6

136. Miyoshi H., Rust C., Roberts P.J., Burgart L.J., Gores G.J. Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas // Gastroenterology 1999 — V.117 -P.669-677

137. Murphy L.J., Tachibana K., Friesen H.G., Stimulation of hepatic insulin-like growth factor-I gene expression by ovine prolactin evidence for intrinsic somatogenic activity in the rat // Endocrinology 1988 - V.122 -P.2027-2033

138. Nagano M., Kelly P.A. Tissue distribution and regulation of rat prolactin receptor gene expression. Quantitative analysis by polymerase chain reaction // J. Biol. Chem. 1994 - V.269 - P.13337-13345

139. Nathanson M.H., Boyer J.L. Mechanisms and regulation of bile secretion // Hepatology — 1991 V. 14 -P.551-566

140. Nathanson M.H., Burgstahler A.D., Mennone A., Fallon M.B., Gonzalez C.B., Saez J.C. Ca2+ waves are organized among hepatocytes in the intact organ // Am. J. Physiol. 1995-V.269-P.G167-G171

141. Nishikawa S., Moore R.C., Nonomura N., Oka T. Progesterone and EGF inhibit mouse mammary gland prolactin receptor and beta-casein gene expression // Am. J. Physiol. 1994 —V.267 -P.C1467-1472

142. Orlova A.N., Smirnova O.V., Smirnov A.N. Appearance and functions of prolactin receptors in cholangiocytes after common bile duct ligation // Pathophysiology -1998-V.5-Suppl.l-P.230

143. Ouhtit A., Morel G., Kelly P. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in the rat// Endocrinology — 1993a-V.133 —P.135-144

144. Ouhtit A., Morel G., Kelly P.A. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in rat reproductive tissues // Biol. Reprod. — 19936 V.49 -P.528-536

145. Parola M., Cheeseman K.H., Biocca M.E., Dianzani M.U., Sater T.F. Isolation and characterization of biliary epithelial cells from normal rat liver // J. Hepatol. -1988 —V.6 —P.175-186

146. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Buteau H., Edery M., Kelly P.A. Internalization of prolactin receptor and prolactin in transfected cells does not involve nuclear translocation//J. Cell. Sci.- 1997a-V.110-P.1123-1132

147. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Pezet A., Vincent V., Edery M., Kelly P.A. Dominant negative and cooperative effects of mutant forms of prolactin receptor // Mol. Endocrinol. -19976 V.l 1 - P. 1020-1032

148. Picoletti R., Bendinelli P., Maroni P. Signal transduction pathway of prolactin in rat liver // Mol. Cell. Endocrinol. 1997 - V.135 - P.169-177

149. Qazi A.M., Tsai-Morris C.-H., Dufau M.L. Ligand-Independent Homo- and Heterodimerization of Human Prolactin Receptor Variants: Inhibitory Action of the Short Forms by Heterodimerization // Molecular Endocrinology 2006 - V.20 - 1912-1923

150. Rappaport A.M. The microcirculatory acinar concept of normal and pathological hepatic structure // Beitr. Path. 1976 - V. 157 - P.215-243

151. Rappaport A.M., Borowy Z.J., Lougheed W.M., Lotto W.N. Subdivision of hexagonal liver lobes into a structural and functional unit // Anat. Rec. 1954 - V. 119 — P. 11-33

152. Ricci F., Kern S.E., Hruban R.H., Iacobuzio-Donahue C.A. Stromal responses to carcinomas of the pancreas: juxtatumoral gene expression conforms to the infiltrating pattern and not the biologic subtype // Cancer Biol. Ther. 2005 - V.4 - P.302-307

153. Robb-Gaspers L.D., Thomas A.P. Coordination of Ca2+ signaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver // J. Biol. Chem. 1995 - V.270 -P.8102-8107

154. Rui H., Lebrun J.J., Kirken R.A., Kelly P.A. JAK2 activation and cell proliferation induced by antibody-mediated prolactin receptor dimerization // Endocrinology 1994 - V. 135 - P. 1299-1306

155. Russell D.L., and Richards J.S. Differentiation-dependent prolactin responsiveness and Stat (Signal Transducers and Activators of Transcription) signaling in rat ovarian cells // Mol. Endocrinol. 1999 - V. 13 - P.2049-2064

156. Sakaguchi K., Ohkubo T., Sugiyama T., Tanaka M., Ushiro H., Nakashima K. Differential regulation of prolactin receptor mRNA expression in rat liver and kidney by testosterone and oestradiol // J. Endocrinol. 1994 - V.143 - P.383-392

157. Sato F, Aoki H, Nakamura K, Taguchi M, Aoki T, Yasuda N. Suppressive effects of chronic hyperprolactinemia on penile erection and yawning following administration of apomorphine to pituitary-transplanted rats //J Androl. — 1997- V. 18(1) — P. 21-25

158. Schwertfeger K.L., Hunter S., Heasley L.E., Levresse V., Leon R.P., DeGregori J., Anderson S.M. Prolactin stimulates activation of c-jitn N-terminal kinase (INK) // Mol. Endocrinol. 2000 - V.14 - P.1592-1602

159. Shimizu I., Kohno N. Tamaki K„ Shono M., Huang H.-W., He J.-H., Yao D.-F. Female hepatology: Favorable role of estrogen in chronic liver disease with hepatitis B virus infection // World J. Gastroenterol. 2007 - V.13 - P.4295-4305

160. Simon-Holtorf J., Monig H., Klomp H.J., Reinecke-Luthge A., Folsch U.R., Kloehn S. Expression and distribution of prolactin receptor in normal, fibrotic, and cirrhotic human liver // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2006 - V. 114 - P.584-589

161. Smirnova O., Orlova A. Functional role for prolactin receptors of rat cholangiocytes under conditions of obstructive cholestasis // J. Hepatol. 1999 - V.30 - SI -p.143

162. Smirnova O., Petrashchuk O., Kelly P. Immunohystochemical localization of prolactin receptor in rat liver cells: dependence on sex and sex steroids // Mol. Cell. Endocr. -1994- V.105 -P.77-81

163. Song IY, Van-Marble J, Van-Noorden C. Redistribution of Ca2+, Mg2+-ATPase activity in relation to alterations of the cytoskeleton and tight junction in hepatocytes of cholestatic rat liver // EurJ.Cell.Biol.- 1996- V. 71(3) P.277-285

164. Sorin B., Vacher A.M., Djiane J., Vacher P. Role of protein kinases in the prolactin-induced intracellular calcium rise in Chinese hamster ovary cells expressing the prolactin receptor// J. Neuroendocrinol. 2000 - V.12 - P.910-918

165. Soroka CJ, Lee JM, Azzaroli F, Boyer JL Cellular localization and up-regulation of multidrug resistance-associated protein 3 in hepatocytes and cholangiocytes during obstructive cholestasis in rat liver // Hepatology. 2001 - V. 33(4) - P.783-791

166. Takakuwa Y., Kokai Y., Sasaki K., Chiba H., Tobioka H., Mor M., Sawada N. Bile canalicular barrier function and expression of tight-junctional molecules in rat hepatocytes during common bile duct ligation // Cell. Tissue. Res. 2002 - V.307 - P. 181189

167. Takikawa H., Wako Y., Sano N., Yamanaka M. Changes in biliary excretory mechanisms in bile duct-ligated rat // Dig. Dis. Sci. 1996 - V.41 - P.256-262

168. Tan D., Huang K.T., Ueda E., Walker A.M. S2 deletion variants of human PRL receptors demonstrate that extracellular domain conformation can alter conformation of the intracellular signaling domain (dagger) // Biochem. 2008 - V.47 - P.479-489

169. Trauner M., Boyer J.L. Bile salt transporters: molecular characterization, function, and regulation // Pysiol Rev. -2003 V. 83 - P. 633-671

170. Trauner M., Meier P.J., Boyer J.L. Molecular regulation of hepatocellular transport systems in cholestasis // J. Hepatol. 1999 - V.31 - P. 165-178

171. Trott J.F., Hovey R.C., Koduri S., Vonderhaar B.K. Alternative splicing to exon 11 of human prolactin receptor gene results in multiple isoforms including a secreted prolactin-binding protein // J. Mol. Endocrinol. 2003 - V.30 - P.31-47

172. Varas SM, Jahn GA. The expression of estrogen, prolactin, and progesterone receptors in mammary gland and liver of female rats during pregnancy and early postpartum: regulation by thyroid hormones // Endocr. Res. 2005 - V.31 (4) - P. 357-370

173. Vasquez J., Nazian S., Mahesh V. Pituitaiy sensitivity to LHRH in hyperprolactinemia induced by perphenazine and renal pituitary transplants in female rats // Biology of reproduction 1980 - V 22 - P. 486-492

174. Veggi LM, Crocenzi FA, Roma MG, Mottino AD. Dapsone impairs the bile salt-independent fraction of bile flow in rats: Possible involvement of its N-hydroxylated metabolite // Toxicology. 2005 - V. 211(1-2) - P. 97-106

175. Verhelst J., Abs R. Hyperprolactinemia: pathophysiology and management // Treat Endocrinol. 2003 - V2 (1) - P. 23-32.

176. Villalba M., Zabala M.T., Martinez-Serrano A., de la Colina R., Satrustegui J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin increases cytosolic free calcium concentration in hepatocytes of lactating rats// Endocrinology 1991 - V.129 - P.2857-2861

177. Vincent V., Goffin V., Rozakis-Adcock M., Mornon J.P., Kelly P.A. Identification of cytoplasmic motifs required for short prolactin receptor internalization // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P.7062-7068

178. Wallaschofski H., Kobsar A., Koksch M., Siegemund A., Hentschel B., Tuschy U., Lohmann T., Sokolova O., Eigenthaler M. Prolactin receptor signaling during platelet activation // Horm. Metab. Res. 2003 - V.35 - P.228-235

179. Wang D.S., Dou K.F., Li K.Z., Gao Z.Q., Song Z.S., Liu Z.C. Hepatocellular apoptosis after hepatectomy in obstructive jaundice in rats // World J. Gastroenterol. 2003 — V.9 — P.2737-2741

180. Wang Y., O'Neal K.D., Yu-Lee L. Multiple prolactin receptor cytoplasmic residues and Statl mediate PRL signaling to the interferone regulatory factor-1 promoter // Mol. Endocrinol. 1997-V.ll -P.1353-1364

181. Wood M., Ananthanarayanan M., Jones B., Wooton-Kee R., Hoffman T., Suchy F. J., Vore M. Hormonal regulation of hepatic organic anion transporting polypeptides // Mol. Pharmacol. V.68 - P.218-225,2005

182. Wu W., Chen Y.H., Ueda E., Tan D., Bartolini P., Walker A.M. Different forms of prolactin have opposing effects on the expression of cell cycle regulatory proteins in differentiated mammary epithelial cells // Oncol. Res. — 2006 — V.16 — P.75-84

183. Yang N., Wang X., Jiang J., Frank S.J. Role of the growth hormone (GH) receptor transmembrane domain in receptor predimerization and GH-induced activation // Mol. Endocrinol. 2007-V.21 - P. 1642-1655

184. Yasui T., Murakami T., Maeda T. Oka T. Involvement of gonadal steroid hormone disturbance in altered prolactin receptor gene expression in the liver of diabetic mice// J. Endocrinol. 1999 - V.161 - P.33-40

185. Yokoyama Y., Kitchens W.C., Toth B., Schwacha M.G., Bland K.I., Chaudry I.H. Upregulation of hepatic prolactin receptor gene expression by 17beta-estradiol following trauma-hemorrhage // J. Appl. Physiol. 2003 - V.95 - P.2530-2536

186. Yu-Lee L.Y. Prolactin modulation of immune and inflammatory responses // Recent Prog. Horm. Res. 2002 - V.57 - P.435-455

187. Zabala M.T. and Garcia-Ruiz J.P. Regulation of expression of the messenger ribonucleic acid encoding the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase in liver and small intestine of lactating rats // Endocrinology 1989 - V. 125 - P.2587-2593

188. Zirulnik F. Anzulovich A.C., Larregle E., Jahn G.A., Gimenez M.S. Role of prolactin in the regulation of cytosolic NADP isocitrate dehydrogenase in the liver of the male rat // Endoer. Res. 2003 - V.29 - P.201-210

189. Zollner G, Trauner M. Molecular mechanisms of cholestasis // Wien Med Wochenschr 2006-V 156 (13-14) -P 380-385

190. Zsembery A, Thalhammer T, Graf J. Bile Formation: a Concerted Action of Membrane Transporters in Hepatocytes and Cholangiocytes // News Physiol Sei. 2000 -V.15 —P. 6-11

191. Zwemer CF, O'Connor EM, Whitesall SE, D'Alecy LG. Gender differences in 24-hour outcome following resuscitation after 9 minutes of cardiac arrest in dogs // Crit Care Med. 1997. - V. 25(2) - P. 330-338

192. Я хочу выразить самую искреннюю признательность своиму научному руководителю д.б.н. О.В. Смирновой за интересную тему, советы, помощь в работе.

193. Благодарю JI.M. Самоходскую (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова) за предоставление возможности проведения ПЦР-РВ.

Информация о работе

Кушнарева, Наталья Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно