Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пролиферация и дифференцировка овальных клеток в процессе индуцированного гепатоканцерогенеза

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Пролиферация и дифференцировка овальных клеток в процессе индуцированного гепатоканцерогенеза"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

Р А Д А Е В А СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

УДК 616.36-006:576.385.3

ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ОВАЛЬНЫХ КЛЕТОК В ПРОЦЕССЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ГЕПАТ0КАНЦЕР0ГЕНЕЗА

Специальность 03.00.11 - эмбриология, гистология

и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

•Москва 1991

Работа выполнена в Институте биологии развития им.Н.К.Кольцова АН ССОР

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.Я.Бродский кандидат биологических наук В.М.Фактор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.С.Ченцов доктор биологических наук Н.П.Дмитриева

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР

Защита диссертации состоится /У-У^ 1991 года в 14 час. на! заседании Специализированного совета Д002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР, Москва, ул. Вавилова, 26, конференц-зал.

С диссертацией можно .ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР.

Автореферат разослан " ^ " 1991 года.

Ученый секретарь

Специализированного совета С кандидат биологических наук ✓

г

I 1

Протопопова

жтуальность проОлеш. Концепция существования в печени стволовых )пителиальных клеток (Grlsham, 1980) в последнее время получает' жспериментальное »подтверждение (Reid, 1990). Основной моделью для изучения стволовых клеток взрослой печени является. индуцированный ^епатоканцерогенез. Это связано с появлением на ранних этапах пре-геопластического роста новой популяции клеток, получивших название эвальных (Farber- et al-, 1956). Возрастает число доказательств , что в эе составе есть клетки, способные к дифференцировке как в гепатоцитарном, так и в холангиолярном направлениях, то есть удовлетворяющие критериям стволовых клеток печени (Pauso et al., 1987; Sell et al., 1987). Одновременно, развиваются представления о значении эвальных клеток как предшественников гепатоклеточных карцином (Sell, (990). Таким образом, актуальность изучения овальных клеток эпределяется проблемой происховдения и дафференцировки эпителиальных клеточных линий печени. Ее решение способствует выяснению механизмов гисто- и канцерогенеза.

Несмотря на длительную историю исследования овальных клеток, происхождение и судьба их не вполне ясны. Часть исследователей полагает, что овальные клетки возникают из гипотетических стволовых клеток, в качестве которых рассматриваются или клетки каналов Геринга, или отдельные клетки неясной морфологии, локализованные в районе портальных триад. Другая точка зрения - они происходят из клеток желчного эпителия. Наконец, в литературе не исключается предположение, что овальные клетки возникают из гепатоцитов. Разногласия касаются также вопроса о потенциале развития овальных клеток. Наиболее обоснованными являются представления о возможности дифференцировки овальных клеток в гепатоциты. Основным аргументом в пользу этого предположения служит обнаружение среди овальных клеток переходных клеточных форм, промежуточных по своим морфологическим и биохимическим свойствам между овальными клетками и гепатоцитами. Однако эти наблюдения носят фрагментарный характер, большинство из них сделано на препаратах изолированных клеточных популяций. Кроме того, до недавнего времени предполагалось, что пролиферация овальных клеток происходит только на ранних стадиях индуцированного гепато-канцерогенеза у крыс, тогда как у мышей эта клеточная реакция или совсем отсутствует или слабо выражена. Недавно разработана новая модель индуцированного гепатоканцерогенеза у мышей (Урываева, Фактор, 1988). Экспериментальная техника состоит в однократной инъекции ди-пина, мощного генотоксического агента, и последующей частичной гепат-эктомшт. Такое воздействие вызывает необратимое поврездение генома

всех исходных гепатоцитов и приводит в конечном итоге к их постепенной элиминации. Восстановление поврежденной паренхимы происходит в виде фокусов роста вновь образованных гепатоцитов, появлению которых предшествует овально-клеточная пролиферация.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании происхождения, свойств и потенциала развития овальных клеток, индуцированных у мышей введением дипина и частичной гепатэктомией.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.

1.Исследовать динамику развития популяции овальных клеток мышей в процессе дипинового гепатоканцерогенеза.

2.Изучить ультраструктуру овальных клеток и закономерности их роста на разных этапах развития для установления направления их дифференцировки.

3.Охарактеризовать пролиферативную активность овальных .клеток в зависимости от интенсивности овально-клеточной реакции и локализации в структуре печеночной дольки. 4.Сравнить ультраструктуру и потенциал развития овальных клеток и

клеток пролифэрирунцего келчного эпителия. Научная новизна. В работе детально охарактеризована динамика развития клеточных популяций в процессе дипинового гепатоканцерогенеза. Показано, что на ранних стадиях пренеопластического роста происходит мощная и длительно поддерживающаяся пролиферация овальных клеток, имеющих строго протоковый тип организации.

Наиболее существенным результатом работы является наблюдение, что ультраструктура и направление дифференцировки овальных клеток зависят от их локализации в печеночной дольке. Овальные клетки, расположенные в портальных областях, дифференцируются в гепатоциты. Другая часть овальных клеток, инфильтрирующих паренхиму, развивается по холангиолярной линии дифференцировки.

Обнаружено, что все перестройки ткани, связанные с обновлением клеточного состава паренхимы, включая некроз исходных гепатоцитов, развитие популяций овальных клеток и вновь образованных гепатоцитов, происходят последовательно в пределах печеночной дольки в направлении от портальных трактов к центральным венам.

Благодаря использованию комплексного подхода, состоящего из комбинации анализа серийных полутонких срезов-автографов с последующим изучением меченых клеток на сериях ультратонких срезов, впервые охарактеризованы закономерности роста протоковой системы овальных клеток. На основе полученных данных сформулирован вывод о том, что первое

коление овальных клеток возникает из клеток каналов Геринга.

Продемонстрировано существование гетерогенности овальных клеток в ношении пролиферативного потенциала. Фракция роста овальных клеток, сположенных в районе портальных триад, постоянна в течение всего риода • развития овально-клеточной реакции, в то время как, олиферативная активность овальных клеток, инфильтрирующих паренхиму, няется в зависимости от интенсивности реакции.

Показано, что овальные клетки, обладая широкими [фференцировочными возможностями и рядом особенностей [ьтраструктурной организации, коренным образом отличаются от клеток галиферирунщего желчного эпителия и представляют собой состоятельную гетерогенную клеточную популяцию. 1учно-практическая ценность работы. Полученные сведения об источни-IX восстановления паренхимы при токсическом повревдении органа неводимы для понимания клеточных основ роста печени. Они расширяют [ания о механизмах репаративного роста повренденной паренхимы,под-юрждают представления о существовании во взрослой печени стволовых штелиальных клеток. Подробные описания изменений печени на клеточ-)М уровне в условиях патологического роста органа значительно рас-фяют возможности адекватной интерпретации данных клинико-морфоло-гаеского анализа при диагностике различных заболеваний печени, фобация работа. Результаты работы докладывались на II рабочем Создании "Морфоген-2" (Пущино, 1988); XIII Всесоюзной конференции по юктронной микроскопии (Звенигород, 1988); конференции молодых уче-IX ИБР АН СССР (Москва, 1988); Всесоюзной конференции по стволовым теткам (Москва, 1990); Европейской конференции по тканевой и пост-эавматической регенерации (Женева, 1990); объединенном семинаре рдела цитологии и гистологии ИБР АН СССР (Москва, 1991). ГОликации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, груктура в объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора етературы, описания материалов и ' методов исследования, изложения злученных результатов и их обсуадэния, заклннения, выводов. Объем юсертащш складывается из 132 страниц машинописного текста, 7 зблиц, 18 рисунков. Результаты иллюстрированы 38 вклейками микро-этографий. В списке литературы приведены 249 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Работа выполнена на мышах-самцах Р1 (СБА х С57ВЬ/6) эСсой 21-23 г в начале опыта.

Индукция гепатоканцерогенеза. Для индукции гепатоканцерогенез использовали дипиновую модель (Урываева, Фактор, 1988). Она состоит" однократной внутрибршинной инъекции дипина (Химико-фармацевтиче ский институт им. Г.Орджоникидзе) в дозе 60 мг/кг в 0,2 мл фязиоло гического раствора и следующей через два часа стандартной частично: гепатэктомии под эфирным наркозом. Материал фиксировали раз-в неделю : течение первых десяти месяцев после воздействия (всего 279 мыши).

В качестве ингактного контроля было использовано II мышей ; возрасте 2 месяца, каждая массой 21-23 г.

Перевязка общего желчного протока. Операцию проводили под нем-буталовым наркозом (0,05 мг/кг). У животных вскрывали брюшную полост: на уровне грудины, отводили печень под свод диафрагмы и накладывал] 1-2 лигатуры на общий выводной желчный проток недалеко от места ег< впадения в двенадцатиперстную кишку. Печень фиксировали в течение -недель после операции (по 6 животных каждую неделю).

Световая микроскопия. Для гистологических исследований кусочга печени фиксировали 10% раствором формалина в 0,1М фосфатном буфер« (рН=7,4), заливали в гистолласт (Serva, ФРГ), готовили срезы толщине»! 5 мкм и окрашивали гематоксилином Майера. Параллельно часть кусочно! заливали в гисторезину (LKB-Pharmacia, Швеция), готовили полутонки« срезы толщиной 2-2,5 мкм и окрашивали их толуидиновым голубым. Дш выявления соединительной ткани гистологические срезы печени окрашивал! пикрофуксином по Ван Гизону.

Электронная микроскопия. Кусочки печени фиксировали смесью 2,55 раствора глутарового альдегида и 2% раствора формалина в 0,1М фосфатном буфере в течение 1,5 час и дофиксировали раствором 0з04 i 0,1М фосфатном буфере. Затем кусочки обезвоживали и заключали в 3noi 812 (Ероп 812) по стандартной методике. Из 3-4 кусочков ткани от I животного на ультратоме готовили серии полутонких срезов (1-1,5 мкм) х окрашивали их толуидиновым голубым. На полутонких срезах в световол микроскопе выбирали места для последующего анализа и прицельнс затачивали на них пирамида. . Ультратонкие срезы последовательне окрашивали 1,5% раствором уранилацетата в 70° этаноле и цитратоы свинца по Рейнольдсу. Весь материал исследовали в электронных микроскопах серии JEM. Измерения диаметра клеток и их ядер производили на электронно-микроскопических негативах с помощью калибровочной линейки с ценой деления I мм. Размеры клеток и ядер расчитывали по формуле эллипсоида вращения.

Анализ серий полутонких срезов. С каждого исследуемого кусочка печени готовили серии полутонких срезов (1-1,5 мкм) общей толщиной

45-68 мкм. Срезы окрапшвали толуидиновым голубым. На центральном срезе выбирали отдельный проток и зарисовывали его конфигурацию на всех выше и ниже расположенных срезах с помощью рисовальной приставки к микроскопу РА-7. Далее, на столике с подсветкой путем наложения полученных рисунков один на другой определяли пространственную организацию протока.

Радиоавтогрефия. Было поставлено две серии опыта. В первой серии опыта было использовано 18 мышей с разными сроками после индукции гепатоканцерогенеза. У животных определяли величину пролиферативного пула и индекс импульсного мечения овальных клеток. Для этого использовали двойную изотопную метку. За I час до забоя внутрибрюшинно вводили 14С-тимидин (специфическая активность 2 ТБк/моль) в количестве 25,9 кБк/г. Насыщение животных изотопом создавали путем 16-кратных внутрибрюшинных инъекций "^Н-тимидина (специфическая активность 1,8 ТЕк/Ммоль) в количестве 33,3 кБк/г каждые 6 час в течение 4 сут (рис.1а). Для дальнейших исследований было отобрано 8 мышей.

Во второй серии опыта 6 животных насыщали ^Н-тимидином в период активной пролиферации овальных клеток. Материал фиксировали в период появления гепатоцитарных фокусов роста (Э-11 неделя после индукции). Для насыщения животных изотопом использовали ми-нипомпы фирмы "Azlet" (США), которые вшивали внутрибрюшинно. Каждая минипомпа содержала 31,5 МБк ^-тимидина (спев I7Q мкл физиологического раствора и обеспечивала поступление в организм 185 кБк/час в течение 7 суток (рис.16).

Для получения автографов 1-1,5 мкм эпоновые срезы и 5 мкм гистопластовые срезы покрывали ядерной эмульсией типа "М" (СССР), экспонировали при 4°С в течение 3 и 6 месяцев и проявляли амидоловш проявителем. Индекс мечения определяли путем подсчета 500-1500 клеток на срезах-автографах от каждого животного. Результаты обрабатывали методами математической статистики на персональной ЭВМ ARC-386. В работе они представлены графически с помощью системы программ 'Harvard graphic".

преня после шадукцщя,вед

s * з г 1

1ДИДИН + ч^ГЦ-

6 4 3 3 3 количество ыышей

16 ивъекцжй Н-Т через сбхдие 0 часов

'Ъ-т

час

а)

4

16 мышей

время после надушив,нед <5 5 4

Т Т V I "" — ■ ■■ ""

1дишш + ч.г [ I минипомпа - 7 сут

ООО ^

г г г

количество мышей

4 вед

<0

в ИЫшей

Рие.1. Схема первой (а) я второй (б) серий опыта.

цифическая активность 1,8 ТБк/Ммоль)

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика овально-клеточной реакции, индуцированной в печени мышей в процессе дипинового канцерогенеза.

Светооптическое исследование.

Динамика развития овально-клеточной популяции была исследована в течение длительного периода времени на гистологических срезах печени, начиная с 7 суток после индукции и кончая 10 месяцами.

Было обнаружено, что первые овальные клетки появлялись в районе портальных триад (ИТ) через 1-3 недели после воздействия. В течение 3-8 недель они мигрировали в глубь паренхимы вдоль терминальных ветвей портальных сосудов. Максимального развития популяция овальных клеток достигала через 8-10 недель, что соответствовало инфильтрации более половины печеночной дольки. В это время резко менялась окружающая паренхима - значительно возрастал размер исходных гепатоцитов, развивались различные формы патологии клеток и ядер, появлялись одноклеточные и фокальные некрозы, чаще на периферии печеночной дольки. Кульминационной стадией развития популяции овальных клеток (8-10 нед) было появление гепатоцитарных узелков, состоящих из мелких гепатоцитов с базофильной цитоплазмой. Они располагались в тесном соседстве 'с овальными клетками вокруг портальных вен и хорошо выделялись на фоне гигантских гепатоцитов с уродливыми ядрами. В результате интенсивной пролиферации новообразованных гепатоцитов происходило вытеснение овальных клеток к центру дольки и их инволюция вместе с исходными повревденными дипином гепатоцитами (10-26 нед). Во вновь образованной паренхиме сохранялся узловой аденоматозный характер роста и заметная овально-клеточная пролиферация.

Овальные клетки регистрировали в течение первых двух месяцев у 685? мышей, затем у 100%. Несинхронное начало их появления может быть обусловлено различиями в индивидуальной чувствительности к повревдающему воздействию генотоксического агента дипина. Схематическое изображение смены клеточных популяций в процессе дипинового гепатоканцерогенеза представлено на рис.2.

Детальное исследование развития овальных клеток проводили на полутонких срезах. В зависимости от числа овальных клеток и глубины проникновения в печеночную дольку овально-клеточная реакция была условно классифицирована как слабая, средняя и сильная (табл.1).

Таким образом, результаты светооптического исследования пре-неопластической печени показывают, что в процессе дипинового канце-

Рис.2. Схема смены клеточных популяций в процессе дипинового ге-патоканцерогвнеза.I-популяция исходных гепатоцитов, 2-популяция овальных клеток,3-популяция вновь образованных гепатоцитов. За единицу условно принято максимальное количество клеток данного типа.По 5 ю 15 20 25 недели оси абсцисс-время после индукции.

Таблица ¡..Характеристика овально—клеточной реакции (световая микроскопия полут.онких срезов)

Интенсивность реакции Доля овальных клеток (%) Локализация овальных клеток в дольке Локализация овальных клеток в балке

слабая 15 район порты 1-2 гепатоцит

средняя 61 район порты, средняя зона дольки 1-5 гепатоцит

сильная 82 район порты, средняя зона дольки 1-7 гепатоцит

неза у мышей происходит индукция массивной овально-клеточной ции (табл.2). Она достигает максимума в период появления первых тоцитарных узелков, сопровождает процесс полной смены поврен-ых дипином исходных гепатоцитов популяцией новообразованных клеи сохраняется в заметном количестве в районе портальных трактов в ние длительного времени (до 10 мес после воздействия).

афференцировка овальных клеток в гепатоциты на ранних этапах пренеопластического роста. Электронно-микроскопическое исследование.

Всего было исследовано 654 овальные клетки. Общим для них был 'оковый тип организации. Все видимые на светооптическом уровне !ления и тяжи овальных клеток в действительности представляли собой 'оки с неявно выраженными просветами.

' Каждому этапу овально-клеточной реакции соответствовал свой

Таблица 2. Характеристика пренеопластических изменений печени при дипиновом канцерогенезе

Срок после воздействия дипином и ч. г. (нед.)

Число

исследованных животных

Этапы развития популяции овальных клеток

Интенсивность овально-клеточной реакции

_Характеристика паренхимы_

популяция популяция вновь

исходных образованных

гепатоцитов гепатоцитов

42

появление в районе ПТ единичных малых протоков овальных клеток

морфологических слабая изменений не

отмечается

3 - 8

52

миграция в глубь паренхимы, увеличение размеров протоков овальных клеток

деструкция в перипортальных средняя зонах, резкое

увеличение размеров ядер и клеток

8-10

64

формирование сложной сети ветвящихся ана-стомозирующих протоков овальных клеток

развитие всевозможных сильная форм патологии клеток и их ядер

8-10

64

появление в районе

ПТ первых мелких

базофильных

гепатоцитов,

ассоциированных

с овальными

клетками

максимальное развитие клеточного и ядерного уродства, сильная вытеснение дегенерирующих гепатоцитов к центру долек

появление вокруг порты и активный рост узелков, состоявдх из мелких базофильных гепатоцитов без видимых признаков повреждения

10 - 26

121

инволюция овальных клеток, инфильтрирующих паренхиму

единичные полное замещение поврежденной паренхимы протоки в популяцией вновь образованных гепатоци-районе ПТ тов, сохранение узлового характера роста

- 11 -

овень развития овальных клеток.

Первые овальные клетки формировали малые протоки, которые ютояли из 3-5 низкодифференцированных клеток. Протоки распола-1лись вокруг портальных вен, были окружены базальной мембраной и юли хорошо оформленный просвет, заполненный микроворсинками.

На стадии миграции овальных клеток по паренхиме наблюдали ¡сличение размеров протоков и выстилающих их клеток, снижение [ерно-плазменного отнокения (табл.3). Форма протоков сильно

Таблица З.Характеристика овальных клеток и организуемых ими протоков (ультраструктурное исследование)

Характеристики малые смешанные крупные

протоки протоки ■ протоки

число протоков 21 22 63

зона локализации район портальных триад паренхима

число овальных 83 81 490

клеток

диаметр овальных 4-5 6-8 8-10

клеток (мкм)

диаметр ядер (мкм) 3-4 4-6 6-8

ядерно-плазменное 1,0 0,7 0,8

соотношение

зрьировала. Обычно они имели вытянутую извилистую конфигурацию и зсполагались вокруг гигантских гепатоцитов. Часто в местах прилегания зальных клеток к гепатоцитам происходило локальное нарушение злостности базальной мембраны, окружающей проток. В этих случаях 5 жду овальными клетками и соседними гепатоцитами обнаруживали тожественные промежуточные контакты. В части овальных клеток, зфильтрирующих паренхиму, не происходило какого-либо усложнения пьтраструктуры. Морфологически эти клетки были близки клеткам элчного эпителия. Они распространялись по паренхиме от портальных рактов к центральным венам и постепенно элиминировались.

На максимуме овально-клеточной реакции происходило качественное зменение состава протоков, расположенных в портальных областях. В них эявлялись переходные по морфологии клетки, имеющие признаки эпатоцитарной дифференцировки: округление формы, увеличение числа и азмеров митохондрий, развитие шероховатого эндоплазматического етикулума, появление зон отложения гликогена. Наконец, в этих же ортальных районах наблюдали смешанные протоки, сформированные

овальными ■ клетками и гепатоцитами, окруженные общей базальа мембраной. Гепатоциты, входящие в состав таких протоков, имели в" ультраструктурные особенности, характерные для этого клеточного типа

На более поздних стадиях процесса происходило разобщение клек протоков. Вновь образованные базофильные гепатоциты интенсив] пролиферировали. Они формировали структуры типа ацинусов, характера для развивающейся печени, или образовывали 2-3-клеточную балк: Интересно, что процесс дифференцировки овальных клеток в гепатоциты .1 носил массового характера. Основное увеличение численности паренхима клеток происходило главным образом в результате их собственнс пролиферации, о чем свидетельствует присутствие митотических фигур I вновь образованных гепатоцитах и высокий индекс их мечения (см.стр.К

Таким образом, электронно-микроскопическое исследование овальнь клеток в процессе дипинового гепатоканцерогенеза, показало, чч ультраструктура и направление их дифференцировки зависят с локализации в печеночной дольке. Овальные клетки, расположенные вокрэ портальных трактов, дайерэнцируются в гепатоциты через серг. промежуточных клеточных форм. На одном конце этого ряда стоят низке дифференцированные овальные клетки, на другом - вновь образовании гепатоциты, не имеющие морфологических признаков повреждения дипинок Дифференцировка овальных клеток в гепатоциты происходит только внутр протоков, окруженных общей базальной мембраной. Другая часть популяци овальных клеток формирует систему разветвленных протоков организованных по типу желчного эпителия.

Происхождение овальных клеток. Радиоавтографическое и электронно-микроскопическое исследование.

Для решения вопроса о происхождении овальных клеток использовал сочетание светооптического анализа автографов на полутонких среза: печени, залитых в эпон, с последующим ультраструктурным исследование] меченых клеток.

Было обнаружено, что первые изменения при субтотально! повреадении печени дипином связаны с каналами Геринга и проявляются 1 активной пролиферации выстилающих их клеток. Так, при введешп 3Н-тимидина на стадии с минимальным проявлением овально-клеточно! реакции клетки каналов Геринга первыми среди непаренхимны; эпителиальных клеток печени включали изотоп.

Ультраструктурное исследование подтвердило эпителиальную природ первых меченых клеток. Это были маленькие клетки диаметром 4-5 мкм <

небольшим количеством гомогенной цитоплазмы и овальными ядрами 3-4 мкм. Они формировали вместе с гепатоцитом просвет, изолированный от межклеточного пространства плотными контактами. Вокруг протоковых клеток обнаруживалась базальная мембрана, которая, прерывалась на границе с гепатоцитом.

Пролиферация клеток каналов Геринга приводила к появлению первых меченых протоков овальных клеток. Часть меченых протоков была связана с каналами Геринга, другие располагались вблизи них. Анализ серийных полутонких срезов, позволяющий восстановить пространственную организацию ткани, показал, что соседствующие каналы Геринга и малые протоки имели на одном или нескольких срезах общий просвет, т.е. представляли собой единую систему протоков. В зависимости от прохождения плоскости среза такие протоки овальных клеток и каналы Геринга выглядели или как отдельные протоки, или как смежные протоки. Помимо малых меченых протоков, объединенных с каналами Геринга, на ранних стадиях овально-клеточной реакции наблюдали незначительное число отдельно расположенных меченых протоков. Однако на сериях ультраструктурных срезов было прослежено, что они также связаны с каналами Геринга. Оказалось, что на 4-10 срезах из всей серии 1-2 клетки, входящие в состав таких протоков, одновременно формировали с гепатоцитом канал Геринга. Гепатоцит и клетка, контактирующая с ним, имели микроворсинки на поверхности, обращенной в общий просвет. Межклеточное пространство было изолировано от содержимого канала плотными контактами.

Клетки каналов Геринга и первые меченые овальные клетки имели одинаковые размеры и морфологию и были структурно связаны друг с другом. Эти экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что овальные клетки возникают из клеток каналов Геринга.

При средней овально-клеточной реакции возрастало число протоков овальных клеток. На сериях полутонких срезов была прослежена связь между просветами большинства протоков. Ветвясь, они распространялись по паренхиме, выдерживая центропетальное направление, и формировали сеть анастомозирущих протоков. Чем дальше проток располагался от портальных триад, тем большее число клеток выходило в его просвет, тем сложнее и причудливее была его конфигурация.

При сильной овально-клеточной реакции обнаружить начало роста концевых отделов протоковой системы овальных клеток, которые в это время располагаются глубоко в паренхиме, на границе средней и центральной частей дольки, было практически невозможно.

Таким образом, анализ серий полутонких и ультратонких срезов

показал, что рост протоковой системы овальных клеток происходит фокусами в направлении от портальных триад к центральным венам. Таких фокусов роста вокруг портальной вены, как правило, несколько. Центрами их образования служат предсуществующие каналы Геринга.

Пролиферативнвя активность овальных клеток.

Пролиферативная активность овальных клеток зависит от стадии овально-клеточной реакции в момент введения изотопа. На рис'.З представлено изменение индекса мечения при импульсном введении изотопа. При слабой овально-клеточной реакции (животные *ж I и 2) 3-4% овальных клеток включало 14С-тимидин. Значительный рост популяции овальных клеток сопровождался подъемом их пролиферативной активности. Когда инфйльтрирущйе клетки занимали более половины печеночной дольки, то есть на максимуме овально-клеточной реакции (животные №» 8 и 9), происходило существенное уменьшение доли импульсно меченных клеток. Аналогичны изменения пролиферативного пула. Из рис.4 видно, что у мышей со слабой овально-клеточной реакцией мечено в среднем 40% клеток. По мере развития овально-клеточной реакции пул овальных клеток возрастал. Максимальная величина составляла 62%. Относительно невысокая величина пролиферативного пула объясняется асинхронным характером' роста и длительным периодом развития овальных клеток в процессе дипинового гепатоканцерогенеза.

Выявлены существенные различия в индексе мечения овальных клеток, выстилающих терминальные и малые протоки портальных районов и крупные протоки, расположенные в средней зоне печеночной дольки (рис.5). Количество овальных клеток терминальных и малых протоков на максимуме развития составляло 3% от общего числа овальных клеток. Для них характерна относительно постоянная величина индекса мечения в течение всего периода развития овально-клеточной реакции. Фракция роста этой категории овальных клеток, расположенных вокруг портальной вены на глубине 1-2 гепатоцита, составляла -38-45%. Подавляющее большинство популяции овальных клеток было представлено клетками, выстилающими крупные протоки. Они появлялись при средней овально-клеточной реакции и достигали на максимуме реакции 6-7-го гепатоцита в печеночной балке. Величина пролиферативного пула для клеток этой категории протоков менялась в зависимости от интенсивности овально-клеточной реакции (рис.5). Наибольшие значения пролиферативного пула были зарегистрированы у животных со средней по интенсивности овально-клеточной реакцией, тогда как на пике развития популяции овальных клеток, когда

Ш

4 5 Ь 7

номера мышей

Шш

ш

ь 6 7 а. номера мышей

Рис.3. Индекс мечения овальных клеток при импульсном введении 14С-ти-мидина в зависимости от интенсивности овально-клеточной.реакции. По оси абсцисс - номера мышей, интенсивность овально-клеточной реакции возрастает от Ш (слабая) к (сильная); по оси ординат - доля меченых клеток, %. Вертикальные отрезки - стандартные ошибки средних.

Рис.4, Индекс мечения овальных кле-

з

ток при многократных введениях Н-тимидина в зависимости от интенсивности овально-клеточной реакции. Обозначения те же.

Рис.5. Динамика мечения терминальных и малых протоков (заштрихованные столбики), локализованных в районе портальных триад, и крупных протоков (черные) средней зоны печеночной дольки. Обозначения те же.

4 номера мышей

шстема ветвящихся анастомозирупцих протоков была сформирована, зеличина пролиферативного пула овальных клеток падала.

Прием непрерывного мечения 3Н-тимидином в течение I нед, использованный во второй серии опыта, позволил выявить высокую зролиферативную активность всех трех клеточных типов

прене ошш стиче ской печени: овальных клеток, исходных и вновь образованных гепатоцитов. Индекс мечения этих клеточных популяций через I месяц после насыщения изотопом составлял соответственно 11%, 86$, 8056. Высокий уровень вовлечения популяции исходных паренхимных клеток в регенераторный ответ органа на повревдение дипином и частичной гепатэктомией исключает возможность использования метода радиоавтографии для доказательства превращения овальных клеток во вновь образованные гепатоцитн, так как в этом случае невозможна однозначная трактовка результатов по миграции метки из одного клеточного типа в другой.

Ультраструктура пролиферируицего желчного эпителия в условиях перевязки общего желчного протока.

Овальные клетки мышей, как и описанные в литературе овальные клетки крыс, по морфологическим и антигенным свойствам близки клеткам желчного эпителия - холангиоцитам (Marceau et al., 1989). На этом основании ряд исследователей отовдествляют развитие овально-клеточной реакции с разрастанием желчного эпителия. Поэтому особый интерес представляет сравнение морфологии овальных клеток с клетками пролиферируицего желчного эпителия. При этом важно учитывать, что-особенностями рассматриваемых клеточных типов является низкий уровень организации и отсутствие маркерных морфологических признаков. Поэтому для получения объективной оценки рассматривали комплекс разнообразных морфологических признаков, включая ультраструктуру, зону локализации, типы межклеточных контактов.

Пролиферацию желчного эпителия стимулировали перевязкой общего желчного протока.

Через I неделю после операции в районе ПТ обнаруживали резкое увеличение числа желчных протоков. Через 2 недели желчные протоки начинали распространяться по печеночной дольке. Этот процесс осуществлялся путем врастания узких соединительнотканных септ с пролиферирую-щим желчным эпителием в паренхиму по направлению к соседним портальным трактам. К 4 неделям часть соединительнотканных септ, растущих из соседних долек, смыкалась и протоковые клетки смешивались.

На электронно-микроскопическом уровне выделяли два основных морфологических типа пролиферирустцих желчных протоков. Первый тип был представлен хорошо оформленными протоками с извитыми, отчетливо выраженными просветами. Часто они были инфильтрированы кроветворными клетками. Второй тип объединял протоки с узкими или вообще

неразличимыми просветами. Число холангиоцитов, выстилающих

пролифериругацие желчные протоки, было различным и в среднем составляло 10 клеток. Эпителий протоков варьировал по форме. Среди клеток одного протока могли одновременно присутствовать низкие кубические, цилиндрические и промежуточные между ними формы. Но все холангиоциты, несмотря на гетерогенность форм и размеров, имели близкие цитоморфологические характеристики, что свидетельствовало о неизменности их дифференцировочного статуса. По ультраструктуре протоковые клетки желчного, эпителия близки овальным клеткам крупных протоков. Однако мекду ниш были обнаружены и существенные различия (табл.4). Это правде всего, разные зоны локализации. Протоки овальных клеток распространялись по паренхиме и активно взаимодействовали с окружающими гепатоцитами через множественные промежуточные контакты. Клетки желчного эпителия лежали строго в зоне развитого фиброза под интактной базальной мембраной и не имели переходов в паренхиму. Кроме того, клетки желчных протоков характеризовались четко выраженными морфологическими признаками, которые указывали на развитие в них патологических процессов. Так, холангиоциты утрачивали способность к продуцированию на апикальной поверхности нормальных микроворсинок, одновременно появлялись аденоматозные выросты цитоплазмы. Большая доля клеток имела деструктивные изменения органелл, причем они появлялись уже на начальных этапах протоковой реакции - через 2 недели после перевязки общего желчного протока. Некротические овальные клетки регистрировали лишь на поздних стадиях развития, начиная с 8-10 недель после индукции. При этом погибали отдельные клетки, некроз не носил

Таблица 4. Сравнительная характеристика пролиферирующих холангиоцитов и овальных клеток

Морфологические признаки Холангиоциты Овальные клетки

1.локализация в ткани зона фиброза паренхима

2.налравление распростра- портопорталь- портоцентраль-

нения по дольке ное ное

З.базальная меибрана интактная местами разру-

шена

4.наличие контаков с нет есть

гепатоцитами

б.характер развития кассовый в отдельных

некроза клетках

6.наличие переходных нет есть

клеток

массового характера. Овальные клетки были меньше протоковых. Большую часть их занимало ядро, о чем свидетельствует высокое ядерно-плазменное отношение (0,8). В противоположность этому, протоковые клетки имели более развитую цитоплазму. Ядерно-плазменное отношение в этом случае было равно 0,4. Наиболее яркими чертами, выделяющими овально-клеточную популяцию, является присутствие в ее составе переходных клеточных форм с признаками гепатоцитарной дифференцировки и активное взаимодействие овальных клеток с окружающими гепатоцитами через серию промежуточных контаков. Среди 250 просмотренных клеток желчного эпителия эти признаки не были обнаружены.

Таким образом, гиперплазия желчного эпителия, в отличие от овально-клеточной реакции, представляет собой разрастание терминально дифференцированного клеточного типа с ограниченным потенциалом развития. Эти данные укрепляют точку зрения о том, что овальные клетки и протоковые клетки желчного эпителия представляют собой разные клеточные типы.

Заключение

В настоящей работе выполнено электронно-микроскопическое исследование овально-клеточной популяции, индуцируемой в печени мышей с помощью дипина и частичной гепатэктомии. Изучены механизмы роста и дифференцировка овальных клеток, их пролиферативный потенциал, проведено сравнение морфологии и дифференцировочных возможностей овальных клеток и клеток желчных протоков, пролиферирующих в условиях наложения лигатуры на общий желчный проток, предприняты попытки решить вопрос о клеточных источниках овальных клеток.

В процессе дишшового гепатоканцерогенеза у мышей выявлена строгая последовательность событий, кульминация которой возникновение в составе протоков овальных клеток переходных по морфологии клеток и первых вновь образованных гепатоцитов. К моменту их образования лредсуществувдая паренхима претерпевает существенные гистопатологические изменения, развивающиеся вследствие необратимого повреждения дипином генома исходных гепатоцитов. Эти результаты делают мало вероятной возможность образования овальных клеток из предсуществунцих гепатоцитов. Топографическая приуроченность к портальным трактам последовательно сменяющих друг друга этапов дифференцировки овальных клеток в гепатоциты и постоянная величина пролиферативного пула овальных клеток, локализованных в этой зоне

дольки; позволяют рассматривать район порты как своеобразный реактивный центр, запускающий и поддерживающий смену клеточных популяций при дипиновом гепатоканцерогенезе.

Наиболее спорным является вопрос о происхождении овальных клеток. Результаты настоящей работы свидетельствуют в пользу того, что их источником являются клетки каналов Геринга. Установлена тесная структурная связь первых ов£льных клеток с предсуществующими каналами Геринга, прослежена протоковая форма их организации и показано, что они имеют сходные с клетками каналов Геринга размеры и ультраструктуру. Таким образом, можно думать, что среди клеток каналов Геринга есть стволовые эпителиальные клетки печени, которые способны дифференцироваться в гепатоцитарном или холангиолярном направлениях (рис.6).

Полученные данные хорошо дополняют результаты иммунологического анализа, выполненного на этой же экспериментальной модели с помощью моноклональных антител (Фактор и др., 1990), при котором также были обнаружены тесные гистогенетические взаимоотношения между клетками каналов Геринга, овальными клетками й некоторыми стадиями гепатоцитарной дифференцировки.

Интересно, что наши результаты о дифференцировке овальных клеток в гепатоциты имеют поразительное сходство с наблюдениями, сделанными

Pao с коллегами (Rao et al.,1989) на модели регенерирующей поджелудочной железы. Феномен гепатизвции поджелудоч-клетки каналов Геринга - стволовые клетки нод железы, аналогичные

данные о развитии аци-нарной ткани в печени ^ овальные клетки ^ крыс (Rao et ax.jggs,

и возможность превращения овальных клеток атипичные желчные протоки ||Щ|Р печени в кишечный эпи-

t еЩЩ^ телий при некоторых

элиминация Ш'Ш канцерогенных режимах

вновь образованные гепатоциты (Tatematsu et al. ,1984)

укрепляют гипотезу о возможности сущэствова-новая паренхима ния в зрелых растущих

Рис.6. Схема клеточных превращений на ранних тканях мультиготеятных этапах дипинового гепатоканцерогенезе. стволовых клеток.

- 20 -Выводы

1. В процессе гепатоканцерогенеза, индуцированного у мышей введением дипина и частичной гепатэктомией, происходит развитие массивной овально-клеточной реакции. Основные стадии процесса включают: а)появление овальных клеток вокруг • портальных вен (1-3 нед. после индукции); (З)миграцию в глубь паренхимы (3-8 нед.); в)максимум развития (8-10 над.), когда овальные клетки занимают половину объема печени; г)появление вокруг портальных вен фокусов роста вновь образованных гепатоцитов; дпостепенное перемещение овальных клеток к центру печеночных долек и их элиминацию вместе с предсуществукщими, поврежденными дипином гепатоцитами (10-26 нед.).

2. Овальные клетки имеют строго протоковый тип организации. Рост протоковой системы овальных клеток осуществляется фокусами в направлении от портальных триад к центральным венам. Центрами их образования являются предсуществугацие каналы Геринга.

3. Направление дифференцировки овальных клеток зависит от их локализации в структуре печеночной дольки:

а)овальные клетки, расположенные в портальных областях, проходят три стадии развития - низкодифференцированные клетки,сходные по размеру и ультраструктуре с клетками каналов Геринга, переходные клетки и вновь образованные гепатоциты. Дифференцировка овальных клеток в гепатоциты происходит внутри протоков, окруженных общей базальной мембраной;

б)основная часть овально-клеточной популяции представлена клетками, морфологически сходными с холангиоцитами. Протоковые овальные клетки в отличие от нормального и цролиферирувдего желчного эпителия активно взаимодействуют с окружающими гепатоцитами, образуя с ними промежуточные контакты.

4. Популяция овальных клеток гетерогенна по пролиферативному потенциалу:

а)овальные клбтки, выстилающие каналы Геринга и малые протоки, локализованные вокруг портальных трактов, имеют постоянную величину пролиферативного пула - 38-45% - в течение всего периода развития популяции;

б)пролиферативный пул овальных клеток, инфильтрирующих паренхиму, меняется в зависимости от интенсивности реакции, достигая максимума (62%) на промежуточной стадии и минимума (22%) на пике овально-клеточной реакции.

5. Исследование ультраструктуры и особенностей роста желчного эпителия, пролиферируицего в условиях перевязки общего желчного

[ротока, показало, что гиперплазия желчного эпителия в отличие от шально-клеточной реакции представляет собой разрастание терминально щфференцированного клеточного типа с ограниченным потенциалом )азвития.

>. Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что шальные клетки возникают из клеток каналов Геринга и являются ;оммитированными предшественниками, способными в условиях герипортального микроокружения дифференцироваться в гепатоцитарном и :олангиолярном направлениях.

Фактор В.М., Урываева И.В., Пронина С.А. Источники новообразования ■кани печени при полном ее замещении после повреждения канцерогеном [игошом.// Онтогенез. 1988. T.I9.J65. С.554.

1.Пронина O.A. Структурные особенности овально-клеточной популяции в [ренеопластичвской печени.//В сб.: XIII Всесоюзная конференция по шектронной микроскопии. Тезисы докладов. Москва. 1988. С.192. ..Радаева (Пронина) С.А., Фактор В.М. Динамика развития популяции овальных клеток, индуцированных в печени мыши с помощью дипина и ¡астичной гепатэктомии.//Билл.экспер.биол.мед. 1990. Т.109. С.514-517. ,.Радаева (Пронина) O.A., Фактор В.М. Дифференцировка овальных клеток i гепатоциты в процессе индуцированного гепатоканцерогенеза у мышей. !лектронно-микроскопическое исследование.// Цитология. 1990.Т.32. i.331-336.

i.Faotor V.M., Radaeva S.A., Engelhardt N.V., Poltoranina V.S.,Baranov r.N. Stem oells in mammalion liver regeneration.// In: European lonferenoe on tisBue and post-traumatio regeneration. 1990. P.91. ..Фактор B.M., Радаева С.А. Стволовой резерв печени.//Онтогенез.1991. '.22. J?6. C.I8I-I89.

'.Paotor V.M., Radaeva S.A. Oval oells oan differentiate into .epatocytes during dipin-induced hepatooaroinogene3is in mioe.//In: 'onographia in Developmental Biology (Karger.Basel). 1991. in press.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Черметинформация.зак. 222 тар. 100 ТЧ.изл. лист.0,75 печ. лист. 1,0 подписано к печати 26 ♦ 03 » 91 г.