Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпигенетическая регуляция дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в клетки эндотелия

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Эпигенетическая регуляция дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в клетки эндотелия"

На правах рукописи УДК 577 218

Волчков Павел Юрьевич

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКИ

ЭНДОТЕЛИЯ

Специальности 03 00 03 - молекулярная биология, 03 00 26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗОВОТ'Э 1

Москва " ~

2007

003060791

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН

Научные руководители

доктор биологических наук С.Л Киселев

кандидат биологических наук М.А. Лагарькова

Официальные оппоненты

доктор биологических наук И.А. Гривенников

доктор биологических наук Н И. Дризе

Ведущая организация

Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН

Защита диссертации состоится "30" мая 2007 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан апреля 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд фарм наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одним из эпигенетических механизмов, регулирующих экспрессию генов, является метилирование регуляторных областей генов, приводящее к активированию или ингибированию соответствующих генов Как известно, на ранних стадиях эмбрионального развития происходят значительные изменения уровня метилирования генома Пассивное деметилирование идет до стадии предимплантанционной бластоцисты Со стадии бластоцисты в клетках внутренней клеточной массы идет тотальное de novo метилирование генома, которое участует в репрессии транскрипционно активных повторяющихся элементов генома и способствует тканеспецифической дифференцировке Пассивное тотальное деметилирование, а затем метилирование генома на ранних стадиях развития - это часть репрограммирования генома in vivo Оно необходимо для того, чтобы родительские геномы освободились от гамето-специфичного эпигенетического паттерна, посредством которого достигается тотипотентность бластомеров Затем, по мере развития эмбриона, происходит специализация клеток и приобретение тканеспецифического эпигенетического статуса При переносе в ооцит соматического ядра должно происходить репрограммирование генома, однако, оно происходит не полностью Это приводит к разнообразным нарушениям в экспрессии генов, в том числе и ключевых транскрипционных факторов, необходимых для нормального развития эмбриона Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) предоставляют широкие возможности для изучения биологии развития человека, молекулярных механизмов дифференцировки и поддержания плюрипотентности, а также открывают огромные перспективы использования ЭСК для лечения широкого спектра заболеваний Одной из основных проблем на пути к применению производных ЭСК человека является разработка технологий контролируемой дифференцировки ЭСК и получение иммунологически совместимых с реципиентом клеток Возможное решение проблемы иммунологической совместимости - это получение линий ЭСК путем переноса ядер соматических клеток реципиента в ооцит Однако, для этого должна быть решена проблема неполного репрограммирования генома при переносе ядер

Таким образом, исследование эпигенетической регуляции поддержания плюрипотентности и дифференцировки ЭСК человека и разработка методов получения необходимых типов клеток из ЭСК человека являются актуальными задачами

Цели и задачи.

Основная цель данной работы состояла в изучении эпигенетичекой регуляции дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач

1 Определить связь метилирования регуляторных районов транскрипционных факторов ОСТ4, NANOG и ОСТ4-ассоциированных генов DPPA3 и DPPA5 с их экспрессией на стадии m vitro гаструляции - формирования трех зародышевых листков в эмбриоидных тельцах, для различных линий ЭСК человека

2 Создать модель дифференцировки ЭСК человека в функциональные клетки эндотелия

3 Используя разработанную модель дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия, исследовать роль метилирования регуляторных районов транскрипционных факторов GATA-2, GATA-3 и гена eNOS в регуляции их экспрессии

Научная новизна и практическое значение. Впервые показано, что метилирование регуляторных районов генов ОСТ-4 и NANOG коррелирует с существенным понижением уровня их экспрессии в процессе дифференцировки ЭСК человека в эмбриоидные тельца Также, впервые обнаружено, что метилирование регуляторных районов ОСТ-4-ассоциированных генов DPPA-3 и DPPA-5 не влияет на изменение уровня их экспрессии в процессе дифференцировки ЭСК человека в эмбриоидные тельца Полученные данные указывают на важность мониторинга эпигенетического статуса клеток для репрограммирования генома и позволяют выделить маркерные гены

В ходе исследований разработан протокол получения и селекции клеток эндотелия из ЭСК человека Используя предложенную модель, впервые показано, что статус метилирования промоторных областей генов eNOS, GATA-2 и GATA-3 коррелирует с изменением их экспрессии В результате проведенных исследований был разработан протокол дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия, которые на генетическом, эпигенетическом и физиологическом уровне соответствуют зрелым клеткам эндотелия При решении проблемы иммунологической совместимости возможно использование таких клеток в терапевтических целях

Апробация работы Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на Международном симпозиуме "Стволовые клетки, регенирация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004), Wilsede Meeting "Modern trends in human leukemia" (Wilsede, Germany, 2005), всероссийской конференции "Фундаментальные науки -медицине" (Новосибирск, 2005), VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2006) I-st Congress of the German society for SC research (Cologne, Germany, 2006), Британско-Российском совещании "Стволовые клетки законодательство, исследования и инновации" (Москва, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 8 тезисов научных конференций

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на_страницах

включает_таблиц и_рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов

и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего_

источников

Результаты исследования

Различие в эпигенетическом статусе линий ЭСК человека не затрагивает

метилирования регуляторных районов генов ключевых транскрипционных факторов, необходимых для самоподдержания и сохранения плюрипотентности В регуляции самоподдержания и плюрипотентности ЭСК человека принимает участие ряд ключевых транскрипционных факторов, такие как ОСТ4, NANOG, CRIPTO, Sox2 Сложное сочетание разного уровня экспрессии и взаиморегуляции этих факторов необходимо для нормального развития эмбриона m vivo и самоподдержания ЭСК m vitro Моделью дальнейшего развития ЭСК in vitro, эквивалентной стадии гаструляции, является эмбриоидное тельце (ЭТ) На стадии гаструляции начинается специализация клеток, поэтому функционирование генов, вовлеченных в поддержание плюрипотентного состояния, должно быть надежно заблокировано на этой и дальнейших стадиях развития эмбриона Эпигенентические механизмы позволяют инактивировать транскрипцию гена через сложный многоступенчатый процесс, одним из этапов которого является метилирование ДНК Ранее было показано, что метилирование ДНК лежит в основе регуляции экспрессии гена ОСТ4 мыши, и предполагается, что именно метилирование регуляторного района гена ОСТ4 является критическим при репрограммировании генома методом переноса ядер соматических клеток На стадии бластоцисты в том же временном интервале, что и ОСТ4, экспрессируются так называемые ОСТ4-ассоциированные гены Следует отметить, что часть ОСТ4-ассоциированных генов может реактивироваться в клонированных эмбрионах мыши, а некоторые гены остаются в неактивном состоянии Для анализа эпигенетического статуса

были выбраны гены ЙРРАЗ и ВРРА5, которые, а ат;шч№ от ОСТ4. ио.'шостыо реактивируются при переносе соматического ядра в ооиит мыши. Для анализа экспрессии генов ОСТ 4. ЫЛКОС, ОРРЛЗ и ЮРРЛ5 использовали I1! ПС выделенную из недифференцированных колоний ЭСК (рис.1 Л), частично дифференцированных колонии (рис. I Б) и из эмбриоидпых телец на 12 день дифференцировй (рис. I В).

Рис. I (А) Морфология И5;."?|Ь'Г»::!;и|х:ваци>.|И колоний (о Онегине ;H4V ^ — дифференцированной колони н (об1*сктив х10)ч R - эморнондных тел объекта! и 4 4i

Ио всех проанализированных линиях ЭСК человека (Е5М01-04) (рис.2) уровень экспрессии генов 0СТ4 и 'МЛN00 снижался по мере днфференцировки ЭСК, Наиболее низкий уровень экспрессии генов наблюдался в 12 дневных лмбриоцдлмх тельцах. Стоит отметить, чю паттерн экспрессии гевдв ОСТ 4 и N АНОС сходен и ЭСК. полученных щ разных виде® млеко ]итаю! них. - по мере диффереицирокки ЭСК экспрессия этих генов резко падает. Ш'РАЗ и 0РРЛ5 экепресснровались ВО веек линиях ЭСК и уровень экспрессии

Рис.2 OT-ril.ll" анализ гонов NANOG, ОСТ4, ОРРЛЗ, 131=РА 5 в недифференцированных (U),

дифференцированных ГХ"К человека (D) и s э^бриоидных :с. |.л:ич (ЕВ) иг ЭСК человека ЛИНИИ ES МО! и ESM02 GAPDH исполню fxih как внутренний контрили

Основываясь на данных экпрессии. было решено определить изменения и статусе метилирования регудяторной области человеческого гена ОСИ и 5"-концевых областей генов ЫЛХОО. ОРРЛЗ и 0РРА5 (рнс.З) в линиях ЭСК человека во время д и фферен ни роя ки в эмбриоидные тельца. В качестве контроля была использована ДНК на терминально диффереицпровнных клеток: лимфоцитов периферической крови, в которых исследуем Мб гены не экспрессируктгся.

снижался в эмбриондщ.1Х тельцах (рис.2).

U d ев u d ЕВ nanog Г 'fToln? ВС

gapdh ^. . j ддщ

esm01 esm02

|| I II I ИИ

ргсЬе ЫАЫОС

«"Г"

1 кь ргоЬв ОРРА 3

|Ш 111 !И 1 ¡9 1 1! I 1 И !« |

В1 В!

ВЦ^

[а ! 1 т I ¡и ш ш! I I ) I ) | ишт (и I Я' *_ргсш н

Рис 3 Карта 5'-концевых регионов генов ИАЖХ> (А), ОСТ4 (Б), ОРРАЗ (В), ОРРА5 (Г) Экзоны показаны черным цветом, а направление транскрипции гена стрелкой Нра11/Мзр1 сайты рестрикции показаны вертикальными

линиями Гибридизационные пробы закрашены диагональной штриховкой Буквы В, С, В1 и Н обозначают ограничивающие сайты рестрикции ВатН1, СЙ91, ВЕШ И Нт(Ш1, соответственно

Поскольку информация о регуляторных районах изучаемых генов человека ограничена, статус метилирования ДНК анализировался с помощью Саузерн-блот гибридизации геномной ДНК, обработанной чувствительной к метилированию рестриктазой НраП и нечувствительной к метилированию Мэр1 с пробами, соответствующими 5'-концевым участкам исследуемых генов Выбранный подход позволяет проанализировать качественные изменения метилирования на большом участке генома (в нашем случае 8-12 тпн), то есть анализируются все вероятные регуляторные области, которые попадают в исследуемый участок Регуляторная область гена ОСТ4 млекопитающих достаточно хорошо изучена Сравнительный анализ статуса метилирования и уровня ацетилирования в ЭСК и трофобластах мыши выявил строгую взаимосвязь между эпигенетическим статусом гена и его активностью Однако, подобные эксперименты не проводились на клетках человека, поэтому был проанализирован статус метилирования 5'-области гена ОСТ4 человека, соответствующей регуляторной области гена ОСТ4 мыши Гибридизационный анализ показал, что вся область между ограничивающими сайтами рестрикции размером около 10 тпн и включающая промоторную область гена ОСТ4 не метилирована в недифференцированных ЭСК (рис 4А) Во время дифференцировки в эмбриоидные тельца, в которых экспрессия ОСТ4 все еще наблюдается, но уровень значительно снижен, исследуемая область гена частично метилирована во всех исследованных линиях ЭСК человека На рисунке 4А приведены результаты, полученные для линии ЕвМШ, для остальных линий были получены аналогичные результаты Стрелками указаны гибридизующиеся рестрикционные фрагменты, соответствующие полностью неметилированному состоянию Кроме них, имеются гибридизующиеся рестрикционные фрагменты, скорее всего соответствующие частичному метилированию исследуемой области Частичное метилирование в ЭТ можно объяснить тем, что ЭТ представляют собой

гетерогенную популяцию клеток на разных стадиях дифференцирован, с равным уровнем

iKCnpeCCltí? гена ОС Т4. рис. 4 Анализ уровня метилиронация

иромгн-орвой пеласги ген л ÜCT4 И предполагаемом регуляторной oôaacj i: fciiáNANOG ¡А)Саузерн-пл01 i. l:JJ, m. , 41 i:4J3 ,r, гибрн.!:! maai: OCT4 ijki6w с геном най

гл -M*

ДНК in колун ян ЭСК (r.S'i. змбриоиднык

«■ rcjrcu (ЕВ) L1 j!л лимфоцитов

периа-еническа! крови человека (I IJ.), обработанной CWS (С), irHpaíi

(+Н),Cír9! и MspI (-М). (Б) Саузери-блит гибридизация NA NOG пробы с (¿Пампой ДНК из колоний ЭСК (ES ), :эмбрноидны.\ телец (ЕВ) и и" лимфоцитов периферической крови челоаека (] IL), L_ ^ _ ^ «, обработан ой BitmMI (Be ВашНЕ и I i pal [

(+íil, BamHI и Мк^Ц-М) МадекуЛ'Л^нцй вес гибрид и за ни о иных полос обозначен сбоку.

Таким образом, данные, полученные на ЭСК человека имеете с данными, полученными па ЭСК мыши, покатi>iмают, что метилирование регуляторной области гена ОСП контролирует его экспрессию.

Регулятор! 1ая область гена NANQG мало изучена, Ьыла покачана функциональная значимость некоторых регуляторных элементов 5' области гена NANOG, которые содержат сайты связывания трансрипгшонных факторе® 0ct4, Sox2. регулирующих 'жспрсесию гена ОСТ4. Гены ОСТ4 и NANOG считаются ключевыми транскрипционными факторами, отвечающими 33 поддержание нлюрппотснтностн ЭСК, Анализ уровня экспрессии гена NANOG в ЭСК человека и в ЭТ показал, что во время дифференцировки уровень экспрессии NANOG аналогичен экспрессии ОСТ4 (экспрессия существенно снижалась в процессе дифференцировки в шбриоидные тельца (рис. 2)). !>Ь1Л проанализирован уровень метилировании 5"- области гена NANOG размером 12 т.п.п., куда могли попадать основные регуля горные элементы гена. Как видно из рисунка 4. регуляторнли облает!, гена NANOG не метилирована к недифференцированных ЭСК и частично метилирована в эмбриоидных тельцах Урнс.4Б). Налиаие двух дополнительных гибр иди чующихся рсетрикшюнных фрагментов в образцах из эм^риоидных телец и в контроле можно объяснить аллель специфическим метилированием. Изменение статуса метилирования 5'-концевой области гена NANOG в процессе дифференцировки ЭСК в ЭТ происходит сходно с изменением статуса метилирования регуляторной области гена ОСТ4. Регул я торные участки гена NANOG, определяющие экспрессию гена лежат внутри области, взятой нами для анализа статуса метилирования регуляториого района гена. Транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG позитивно регулируют экспрессию друг друга, то есть поддерживают уровень ■экспрессии друг друга И не дакл клеткам дифференцироваться. Суммируй наши результаты,

полученные на ЭСК человека, и данные, полученные на ЭСК мыши, можно предположить, что сайленсинг транскрипции генов ОСТ4 и NANOG в дифференцированных тканях млекопитающих происходит за счет одновременного или очень близкого по времени гиперметилирования их промоторных районов При инактивации одного из факторов ЭСК смещаются в дифференцировку по одному из путей Для того, чтобы при дальнейшем развитии бластоцисты до стадии гаструлы получались производные всех трех зародышевых листков, вероятно, необходима одновременная инактивация транскрипционных факторов, участвующих в поддержании плюрипотентности Такая одновременная инактивация могла бы осуществляться с помощью эпигенетических механизмов С другой стороны, учитывая эпигенетическую инактивацию ОСТ4 и NANOG в соматических клетках, можно предположить, что при репрограммировании генома, а именно, процедуре переноса ядер соматических клеток, будет происходить неполная реактивация не только гена ОСТ4, но и NANOG Несомненно, это еще больше усложнит разработку технологии переноса ядер, поскольку оба гена кодируют транскрипционные факторы, играющие ключевую роль в раннем эмбриогенезе

Эпигенетический статус регуляторных областей ОСТ4-ассоциированных генов DPPA-3 и DPPA-5 варьирует в разных линиях ЭСК человека, но не влияет на их экспрессию. Регуляторные области генов DPPA3 и DPPA5 не изучены Основываясь на данных экспрессии генов DPPA, было предположено, что регуляция их экспрессии осуществляется аналогично генам ОСТ4 и NANOG Был проанализирован статус метилирования генов DPPA3 и DPPA5 в клетках линий ESM01, ESM02, ESM03 и в лимфоцитах периферической крови человека 5'-концевая область гена DPPA3 полностью метилирована в недифференцированных клетках линии ESM02 и частично метилирована в эмбриодных тельцах, а в недифференцированных клетках линии ESM01 и эмбриодных тельцах частично метилирована (рис 5А) Схожие изменения в статусе метилирования наблюдаются и в 5'-концевой области гена DPPA5 во время дифференцировки ЭСК в эмбриоидные тельца 5'-концевая область гена DPPA5 метилирована в недифференцированных клетках линии ESM02 и частично метилирована в эмбриодных тельцах, а в недифференцированных клетках линии ESM01 и эмбриодных тельцах частично метилирована (рис 5Б) Оказывается, что полученные линии ЭСК имеют разный статус метилирования аутосомных генов, дня которых не показано прямое участие в регуляции самоподдержания ЭСК Таким образом, было продемонстрировано, что полученные по одному протоколу линии ЭСК отличаются статусом метилирования в области аутосомных генов, не вовлеченных напрямую в поддержание плюрипотентности

А |>

ки: ш. ш ил к^ кпз т. КЯ! ¡ли

Й ^м1 Т-и -м!1п 'М .и:|а ■ м'' и -и ч -м- г"' *" II) -ч:| -II -м:| -к

1Л М] ..

- к

ИЛ!.

Е 'г.,

Рис.5 Анализ уроиЕ1я метилирования предполагаемых регтляторлых 5'-концевы\ областей генов [ЛЧ'ЛЗ а ОРЛА5. (А) Саузерн-йзот ¡ндрчдилщия ОРР.лЗ пробы с геяоыной ^НИ из колоний ЭСК (ЕЙ), ;м:"рнси;!!|..:^ те,1"Ц (ПВ) и из лимфоци гоь периферическом крови человека 3 "I О, обработанной В^Щ (ВР %Ш и Ыра11 (+Н). ВщЩ п Игр] (Ш); (Е) Саузерн-блт гибридизация КЛ1\ЮО пробы с геномной ДНК >!3 колонии ГЗСК (ЕЭ), эмбрноиднач телец (ЕВ) н н< лимфоцитов периферической крови человек! (ШЛ обработанной НпкШ1 (НЗ), ШгкНП и НраИ Нт<1Н1 и (-М). Мптск^яяриий »ей

гпОрнлизационных полое обозначен сбоку

Разный статус метилирования генов ЭР РАЗ и РРРА5 не влияет на их экспрессию в ЭСК н на процесс дифферепцировкн к шбрйоидные тельвд. Гипсрмстилнрование регудаторнпи йбцасти гена часто везет к у.олчаяию гена. Однако, в данном случае: метилирование не приводит к иНшбировашвд экспрессии генов. Эти данные покатывают, что экспрессия генов ОРРАЗ и ПРРЛ5 и ЭСК человека не зависит от метилирования ¡1 потенциально возможна их реактивации после ре программирования генома. Экспрессия генов ОСТ4 и МАИ ОС. зависит от статуса метилирования их промоторной области и поэтом^ они хуже реактивируются при соматическом переносе ядер.

На стадии мору л ы у мыши геном еще гитом еттешрован, а на стадии бластрцисты во внутренней клеточной массе происходит полногеномное метилирование. V человека временной интервал метилирования генома в раннем эмбриогенезе несколько отличается. Одно из возможных объяснений разного статуса метилирования линии ЭСК человека, ■заключается в том, что внутренняя клеточная масса, из которой получали ЭСК, была взята с не&ошиой временной раяншгей, к го бремя, кот да идет вотта тотального метилирования генома. Это значит, что у ЭСК при получении есть нредсушествующий эпигенетический статус, который теоретически может влиять и н;) ил потенциал диффереицнровки. Интересно то, что человеческие гена ЫДКОС и РН'РАЗ расположены близко друг к другу на 12 хромосоме. Таким образом, разное метилирование близко расположенных районов в культуре ЭСК говорит о том, что эпигенетическая регуляция во время раннего эмбрионального развития хорошо скоординирована. Другое объяснение вариаций в статусе метилирования между линиями ЭСК человека может быть о с но на но на гам. что линии ЭСК, в которых наблюдалась разница в эпигенетическом статусе РРРАЗ и ВРРА5, имеют различные генотипы (XX и XV"), Хотя гены ОРРАЗ и ГЗРРЛэ расположены на аутосомах, мы

не можем исключить вероятность того, что статус метилирования может быть связан с ранними событиями половой детерминации Относительно недавно было показано глобальное гипометилирование генома в XX линиях ЭСК мыши Глобальное гипометилирование может привести к активации различных регуляторных элементов, что, в свою очередь, может привести к разнице в паттерне экспрессии генов клеточных линий с разным генотипом XX и ХУ На основании наших результатов можно предположить, что линии ЭСК человека могут использовать сходные принципы поддержания шпорипотентного состояния, но их эпигенетическое наследие может быть различным, и, соответственно, потенциал дифференцировки тоже может отличаться

Получение эндотелиальных клеток из ЭСК человека в двумерной системе. Как уже было отмечено ранее, при спонтанной дифференцировке ЭСК способны к образованию производных трех зародышевых листков Спонтанная дифференцировка обычно наблюдается при переводе ЭСК в суспензию и их росте в виде ЭТ Однако, условия культивирования, а, возможно, и индивидуальные особенности линий ЭСК, сильно влияют на их способность к дифференцировке в конкретный клеточный тип

Было решено проверить, есть ли эндотелиальные клетки в ЭТ, образованных из линий ЭСК человека, имеющихся в распоряжении Для анализа было решено взять линии ЬЕ8М01 и ЬЕЭМОЗ Эти линии, полученные в лаборатории ранее, проявляли характерную для данного типа клеток морфологию, экспрессировали соответствующие маркеры и имели нормальный кариотип При переводе в суспензионную культуру ЭСК формировали ЭТ с характерной морфологией для данного типа структур При иммуногистохимическом анализе эмбриоидных телец после 10-12 дней культивирования были обнаружены в небольшом количестве (не более 5%) эндотелиоцитоподобные клетки, экспрессирующие СБ31

О возможности подобной дифференцировки и в двумерной системе говорил тот факт, что при спонтанной дифференцировке ЬЕЗМО) и ИЕвМОЗ встречались группы клеток, похожие на клетки эндотелия, экспрессирующие С031 и Поскольку существенной

разницы в количестве эндотелиальных клеток при спонтанных дифференцировках ЭСК линий ЬЕ8М01 и ЬЕЗМОЗ в ЭТ не было обнаружено, а линия ЬЕ8М01 проявила тенденцию к нестабильности кариотипа, в дальнейшем эксперименты проводились на клетках линии ЬЕБМОЗ на 28 - 38 пассажах

Отсутствие в литературе данных по дифференцировке ЭСК человека в двумерной системе без формирования ЭТ в эндотелиальные клетки потребовало подбора условий и сред для дифференцировки Мы использовали различный состав сывороток с различным сочетанием факторов роста, концентраций и типов сывороток и остановились на наиболее эффективных условиях культивирования

Рисунок 6 Днфферешш ройка :}СК челойека в аадатега^ 1,ць:с jcn с 1 к и ¡и двумерной системе Л-недпф|аре а а а р a . t. .. • u е котонин ЭСК ил фидере МЭФ; Б- дифференцированные нршазегоньгс 5 день, культшицюкйшя, В- икчзистаиоаойпьк структуры, 1 день ^льтнвирорашЙ

Колонии иедифферснииргжаши.'х ЭСК (Рис. 6Д) снимали с обработанного коллагеназой фидера Механически, разрезая на фрагменты размером 300-500 кпеток| и пймещщш на чашки 11етрн, покрытые коллагеном IV типа. О среде DMEMi'VlZ. содержащей 15% FBS, bi-'GI- (4 нг/ми). SCI (20 яг/мл ),V1X¡1' (20 нг/мл}, (слетки на 5 день приобретали морфологии) дифференцированных производных (Рис. 6Б). На 7 день кульчи верования колонии содержали кластеры со суд 1i сто подобных структур (Рис, 6В). Разработанный протокол диффе рвййировки позволял получить культуру клеток, в которой доля тадотщиальньй плеток сасгтайляла до 50%. Иммуноцитохпмичсекий анализ покачал, что большая часть клеток была положительна не голько по раннему маркеру эндотелия, но и зкщрессировала маркер позднего, дифференцированного Ондотелия фактор Вон Бишшбрзидта (vWF).

Рис. 7. Анализ эндотелия полученного И1 ЭСК после К дней (А-15) и [2 дней (Г) культивирования и среде для дифференцнровки А-

ссс\ днс1 ¿ подобные структуры -

светлое поле: В- экспрессия раннего эядогевкаШЮГО

маркера СШ1, ядра окрашены ВАМ, V экслресспн позднего -эндотелиального чаркера V ^ЛДр Г- экспрессия позднего эпдотелиального маркера

СЧЗЮ5, ядра окрашены ОА1-1]

Функциональная активность клеток была проверена следующим образом: клетки, дифференцированные в двумерной системе, образовывали сложные сосуда сто подобные сети

на подложке, покрытой коллагеном IV Таким образом, нами была показана возможность высокоэффективного получения в двумерной системе клеток, несущих поверхностные маркеры и имеющих физиологическую активность клеток эндотелия

Селекция и анализ эндотелиальных клеток из дифференцированных ЭСК человека

Контролируемая дифференцировка, во-первых, должна приводить преимущественно к желаемому клеточному фенотипу Во-вторых, должна существовать возможность селекции нужных популяций клеток, причем сам процесс селекции не должен существенным образом влиять на жизнеспособность и дифференцировку Следующей задачей являлась разработка метода селекции предшественников эндотелия и эндотелиальных клеток из дифференцированных на коллагене IV ЭСК человека Был выбран метод иммуномагнитной сепарации MACS (magnetic activated cell sorting), - эффективная технология магнитного сортинга, основанная на разделении клеток по поверхностным антигенам Подобный метод позволяет быстро и эффективно (с чистотой более 98%) провести селекцию нужной популяции клеток по поверхностным маркерам

Для выбора поверхностного антигена для иммуномагнитной сепарации эндотелиальных клеток, был проведен анализ экспрессии известных эндотелий-специфичных поверхностных маркеров в недифференцированных клетках ЭСК человека и в HUVEC с помощью иммуноцитохимического анализа Маркерами эндотелия являются следующие белки CD31/PECAM1, Flkl/VEGFRl, CD105/endoglm, VE-cadhenn и CD133 Параметры выбора поверхностного маркера для селекции были следующие белок не должен экспрессироваться в недифференцированных ЭСК и должен экспрессироваться в эндотелии, поверхностный маркер должен экспрессироваться на разных стадиях дифференцировки ЭСК в эндотелий, что необходимо для того, чтобы процесс сепарации не зависел строго от времени дифференцировки Так как существует разница в экспрессии многих белков в различных линиях ЭСК человека, то экспрессия всех возможных «кандидатных» маркеров была проверена для линий ЭСК ESM01 и ESM03, не полагаясь только на единичные литературные данные В качестве положительного контроля использовали клетки пупочной вены человека (HUVEC) Иммуногистохимический и ОТ-ПЦР анализы подтвердили наличие экспрессии Flkl в недифференцированных клетках линий ESM01 и ESM03 Временной интервал экспрессии CD31 и VE-cadherin оптимально подходит для селекции Для селекции эндотелия, полученного из ЭСК в двумерной системе был использован CD31, так как в распоряжении имелись антитела на разные эпитопы этого белка и качество имеющихся антител также диктовало использование антител к CD31

Для проведения сепарации клетки на разных стадиях дифференцировки обрабатывали трипсином, промывали PBS, затем PBS/BSA/EDTA, и инкубировали с антителами мыши к

СГ)31 чело не к а (на 1 млн клеток 10 mki антител), затем отмывали от несвязавшихеа антител

и инкубировали to вторичными антителами козы против мыши, ¿вязанными с магни тными

частицами. После соответствующих промывок проводили сепарацию на колонках. Фракцию

CD31 -положительных клеток высевали на чашк^ покрытые коллагеном, к среду для

эн до гениальной дифференцировав. Клетки высеваяи в высокой плотности (не менее 50 ООО

клеток на !см:), 13К как посев в более низкой плотное™ негативно влиял па

жизнеспособность клеток. Из CD31 положительной фракции отбирали аликвоты для оценки

жизнеспособности клеток после сепарации, оценки чистоты популяции

(иммуногистохнмичеекии анализ) и для оценки способности выделенных клеток

образовывать сосудистые структуры (Malrigel assay). Как видно из рисунка 8. клетки

формируют характерную для эндотелия ячеистую сосу до по дойну к) сеть.

Puc.S (A) CD3I клетки эндотелия, полученные из Г)СК, через 2-1 часа iiocjse сот с к иш Фотография is светлом HOjfO. {Б> Тест на матршеле (MaErigel Assay). показывающий эпдо.'г т.прврол> выделенных С HOMOUIbEO имиуномяпштноП сепарации клеток. Фотография полученд с гюмощмо световод i н i не рп i ро вг1н ио i 'о м и кроско пя.

Е>и<.,9 ОТ-ГТЦР анализ генов VE-c;Kl!lcnn, GATA-2. Flfcl. GAPDH GATA-3, eNOS,

С1Э31 и недифференцированных ЭСК линии ESMQ3 (U), клетках эндотелия ИЗ ЭСК линии ESM03, полутемных с помощью иммуномяпштиой сепарации (К) и п клетках зкамеяии уй пупочной вены (I I) человек!

GAPDH

И мму ноги сто химический анализ показал* что более 40% клеток гтоспе селекции были положительны на С'[Щ. Анализ экспрессии генов, характерных для эндотелия, метолом пол у количествен но го ОТ-П1ДР показал, что уровень экспрессии этих генов в клетках эндотелия из ЭСК сравним с уровнем их экспрессии в Е1ЪЛ'1 С (рис.9) Таким образом, в данной части работы было показано, чю клетки эндотелия, дифференцированные т ЭСК. человека, могут быть успешно очитцены .методом магнитной сепарации, при этом сохраняя жизнеспособность и способность к образованию сосу ли стоп оде и пых структур,

!'|] п. чс 1 Н.трпиаиин и рс I улн и н н Экспрессии I С1НШ СА 1 А-2, С Л ТЛ-3 мри д и фферск Ц11 р о вке ЭСК человека в эндотелии. Формирование эндотелия в эмбриогенезе и

функционирование во взрослом организме сопровождается экспрессией целого ряда транскрипционных факторов В недавних исследованиях было показано, что транскрипционные факторы семейства GATA принимают непосредственное участие в реорганизации внеклеточного окружения дифференцированных эндотелиальных клеток, регулируя экспрессию своих генов - мишеней

GATA-2 экспрессируется в различных типах тканей и играет важную роль в образовании гематопоэтических предшественников В процессе дифференцировки и в дифференцированных эндотелиальных клетках GATA-2 регулирует экспрессию таких генов, как eNOS, Эндотелии-1, Flk-1, ICAM-2, Р-селектин, РЕСАМ-1, Utrophin-B, vWF

GATA-3 экспрессируется во многих тканях мышиного эмбриона Как GATA-1 и 2, GATA-3 принято относить к гематопоэтическим транскрипционным факторам Роль GATA-3 в эндотелии мало изучена GATA-3 принимает участие в позитивной регуляции экспрессии гена VCAM-1, a GATA-6 негативно регулирует тот же ген Одни GATA факторы регулируют экспрессию других Например, GATA-1 принимает участие в регуляции экспрессии GATA-2, a GATA-2 регулирует экспрессию GATA-3 Тем самым, образуется сложная сеть регуляции экспрессии, которая отражается на фенотипе клеток

Эти и другие транскрипционные факторы оказывают влияние на экспрессию генов, специфических для эндотелия Одним из характерных эндотелиальных генов является eNOS eNOS производит основную часть оксида азота в эндотелиальных клетках, который участвует в противовоспалительных процессах, регуляции адгезии тромбоцитов к стенкам кровеносных сосудов, а так же ингибирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов eNOS экспрессируется на поздних стадиях дифференцировки эндотелия и характеризует зрелый эндотелий

Для eNOS была показана зависимость экспрессии от эпигенетического статуса его регуляторных областей в эндотелиальных и неэндотелиальных клетках Для транскрипционных факторов GATA-2 и GATA-3 такие исследования не проводились, поэтому было решено исследовать метилирование промоторных областей генов eNOS, GATA-2 и GATA-3 во время тканеспецифической дифференцировки ЭСК человека в клетки функционального эндотелия, для чего была использована разработанная модель дифференцировки и селекции клеток эндотелия из ЭСК человека, описанная выше

Анализ экспрессии GATA-2 при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия показал, что GATA-2 экспрессируется в клетках эндотелия из ЭСК на том же уровне, что и в HUVEC, и не экспрессируется в недифференцированных ЭСК человека (рис 9) Считается, что экспрессия транскрипционного фактора GATA-2 характерна для раннего гемангиобласта Паттерн метилирования промоторного района GATA-2 был

проанализирован в ЭСК человека, не экспрессирующих GATA-2, а также в клетках эндотелия, полученных из ЭСК человека, и HUVEC, экспрессирующих GATA-2 Как и другие GATA гены, GATA-2 ген млекопитающих может экспрессироваться с двух промоторов, селективного и основного Селективный промотор активен в гематопоэтических клетках, а основной во всех остальных типах тканей, где экспрессируется GATA-2 Селективный промотор расположен примерно на 5 т п н ближе к 5'-концу гена GATA-2 С помощью бисульфитного секвенирования была проанализирована область, соответствующая селективному промотору гена GATA-2, экспрессия с которого осуществляется в гематопоэтических клетках Эта область особенно насыщена CpG-динуклеотидами, Для этого были выбраны праймеры на значимую цепь, на область с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции В недифференцированных ЭСК человека уровень метилирования исследуемого района оказался высоким, доля метилированных CpG-динуклеотидов в одном сайте варьировала от 50% до 80% (рис 10А) В эндотелиальных клетках, полученных из ЭСК человека, уровень метилирования был значительно ниже, доля метилированных CpG-динуклеотидов в одном сайте метилирования варьировала от 10% до 30% (рис 10Б) В HUVEC уровень метилирования был немного ниже, доля метилированных CpG динуклеотидов в одном сайте метилирования варьировала от 0 до 20% (рис 10В) Таким образом, в недифференцированных ЭСК, которые не экспрессируют GATA-2, селективный промотор транскрипционного фактора гиперметилирован, а в клетках экспрессирующих GATA2 — гипометилирован

А

ЭСК

ЭСК

* 100 (б

I

р 25 о о

5

lIlllJillllllIlJlilllLlij

Эндотелий из ЭСК Б

g so

Б 25

О 'оо о 75

§ 50

Эндотелий из ЭСК

HUVEC

»»■i.iii.i.i

Положение CpG динуклеотидов в промоторе GATA-2

Положение CpG динукчеотидов в промоторе GATA-3

Рис 10 Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена ОАТА-2 с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции (А) ЭСК человека, (Б) эндотелий, полученный из ЭСК человека, ГШ НОТЕС

Рис И Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена GATA-3 с 228 по -115 нуклеотид относительно старта транскрипции (А) из ЭСК человека, (Б) эндотелий, полученный из ЭСК человека. (В) HUVEC

Из этого следует, что метилирование селективного промотора GATA-2 в ЭСК человека может оказывать влияние на экспрессию этого транскрипционного фактора Эпигенетический контроль селективного промотора GATA-2 был недавно показан для гематопоэтических клетках Учитывая продемонстрированное нами гипометилирование промотора транскрипционного фактора GATA-2, можно сделать вывод, что в эмбриогенезе при эндотелиальной дифференцировке селективный промотор играет такую же важную роль, как при гематопоэтической

Анализ транскрипции GATA-3 выявил низкий уровень экспрессии гена в недифференцированных ЭСК человека и высокий в клетках эндотелия из ЭСК и в HUVEC (рис 9) Как и в случае GATA-2, у GATA-3 существует два промотора Альтернативный промотор находится на расстоянии примерно 10 т п н от основного промотора Экспрессия с альтернативного промотора обнаруживалась только в тканях головного мозга, в остальных тканях экспрессии с этого промотора не происходит, поэтому для изучения возможной эпигенетической регуляции гена GATA-3 нами была выбрана область основного промотора гена Для получения фрагмента регуляторного района гена использовались праймеры на значимую цепь с 228 по -115 нуклеотид относительно старта транскрипции В недифференцированных ЭСК человека исследуемая область была гиперметилирована и уровень варьировал от 60% до 90% метилированных CpG-динуклеотидов (рис НА) В эндотелии, полученном из ЭСК человека, уровень метилирования был низкий - от 10% до 30% метилированных CpG (рис 11Б) В HUVEC наблюдался схожий уровень метилирования от 10% до 20% метилированных CpG (рис 11В) Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что даже в случае гиперметилирования основного промотора гена GATA-3 наблюдается экспрессия гена в недифференцированных ЭСК человека Из этого следует, что метилирование основного промотора в недифференцированных ЭСК недостаточно дам полного ингибирования экспрессии GATA-3 Ранее было показано, что для некоторых промоторов ингибирование, опосредованное метилированием ДНК, эффективно лишь в контексте хроматина Для пассивного деметилирования требуется, чтобы клетка прошла некоторое количество делений без участия поддерживающих ДНК метилтрансфераз Модификация хроматина осуществляется активно, и раньше, чем пассивное деметилирование Вероятно, когда еще не произошло полное деметилирование промоторной области, а хроматин уже приобрел "открытое" состояние, возможна посадка транскрипционных факторов, нечувствительных к метилированию ДНК, и активация транскрипции Вторым возможным вариантом является работа альтернативного промотора гена GATA-3 в ЭСК человека В рамках настоящей работы альтернативный промотор не исследовался Тем не менее, опираясь на полученные нами данные по существенному

увеличению экспрессии GATA-3 в дифференцированных клетках эндотелия, мы можем утверждать, что гипометилирование промотора гена по мере дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия, оказывает положительное влияние на транскрипцию гена GATA-3

Метилирование промоторной области гена eNOS при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия В данной работе была изучена роль метилирования в регуляции экспрессии гена eNOS при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия По результатам ОТ-ПЦР ген eNOS экспрессируется в клетках эндотелия, полученных из ЭСК, и в HXJVEC и не экспрессируется в недифференцированных ЭСК человека (рис 9) По данным Chan и соавторов (Chan Y, 2004), наиболее существенным эпигенетическим модификациям в эндотелиаьных клетках подвергается регуляторный район гена eNOS в ближайшем к старту транскрипции районе Поэтому для бисульфитного секвенирования была использованы праймеры на значимую цепь на область с 13 по -297 нуклеотид относительно старта транскрипции

„ к м

0 50

1

р 25 О

ш о §

>>

£ ч

О 100 О 75

х: 3 в

Ш

ю о

к

fe

S «

ч о rt

50

ЭСК

llllHIIII

<о №

Эндотелий из ЭСК

1 II

HUVEC

Рис 12 Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена еЫОЭ с 13 по -297 нуклеотид относительно старта транскрипции (А) из ЭСК человека, (Б) эндотелий, полученный из ЭСК человека, (В) НиУЕС

Положение CpG динукдеотидов в промоторе eNOS

Для каждого типа клеток было проанализировано по 10 субклонов Уровень метилирования выбранной области в недифференцированных ЭСК человека был высоким и

доля метилированных Срв-динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьировала от 70% до 90% (рис 12А) В эндотелиальных клетках, полученных из ЭСК человека, наблюдался низкий уровень метилирования, доля метилированных СрО динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьировала от 10% до 30% Срв динуклеотидов (рис 12Б) В клетках ГШУЕС доля метилированных СрО-динуклеотидов не превышала 10% (рис 12В) Исследуемая регуляторная область гена еКОв содержит сайты связывания конститутивных транскрипционных факторов Бр1, 8рЗ. Е1з-1, которые активны и в клетках эмбриона Гиперметилирование этого участка в ЭСК человека скорее всего блокирует связывание этих факторов с промоторной областью гена, как это и было показано для гладкомышечных клеток стенки сосудов Известно, что транскрипционный фактор ОА'ГА-2 участвует в регуляции экспрессии гена еЖ>8 В соответствии с нашими данными по мере дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия наблюдается одновременное гипометилирование регуляторных районов генов вАТА-2 и еКЮЗ Таким образом, происходит двойной негативный контроль экспрессии е1Ч08 в недифференцированных клетках ЭСК человека, метилирование блокирует не только промоторный район самого гена, но и промоторный район транскрипционного фактора ОАТА-2, контролирующего экспрессию гена еЬГОБ С другой стороны, не исключено, что это может быть всего лишь следствием тотального гиперметилирования генома на ранних этапах эбрионального развития

Относительно недавно был обнаружен ген Ж>83А8/80№, который кодирует антисмысловой транскрипт по отношению к е>ГО8 80Ые и еЫОЗ расположены «хвост к хвосту» и имеют 662 перекрывающихся нуклеотида на 3'-конце вОИе экспрессируется в неэндотелиальных клетках, и не экспрессируется в эндотелиальных Гиперэкспрессия БОЫе в эндотелиальных клетках приводит к уменьшению экспрессии еМШ Вероятно, экспрессия 80Ые приводит к ингибированию экпрессии гена на посттранскрипционном уровне Был проанализирован уровень экспрессии гена 80Ие в ЭСК человека и в клетках эндотелия В качестве положительного контроля на БОИе использовали РНК из плаценты Анализ экспрессии методом ОТ-ПЦР прказал, что 80Ие не экспрессируется в ЭСК человека и в клетках эндотелия (рис 13) Таким образом, данный эпигенетический механизм не может участвовать в регуляции экспрессии еИОв во время дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия

Рис 13 Анализ экспрессии гена ЭОЫе (КОБЗА) и еЖМ

недифференцированных ЭСК гтх^х -»-саром (и), клетках эндотелия из ЭСК (Е),

НиУЕС (Н) и в плаценте (Р) ОАРБН использован как внутренний контроль

Из полученных данных видно, что уровень метилирования промоторных районов сильно отличается в недифференцированных ЭСК и клетках эндотелия Однако, также наблюдается разница в уровне метилирования, гораздо менее существенная, между клетками эндотелия из ЭСК и HUVEC Объяснение данного факта возможно заключается в том, что клетки эндотелия из ЭСК были получены in vitro, и, несмотря на то, что по экспрессии основных эндотелиапьных маркеров и по образованию сосудоподобных структур они аналогичны первичным клеткам эндотелия, таким как HUVEC, они демонстрируют отличие на эпигенетическом уровне Возможно эти отличия возникли из-за гетерогенности самой эндотелиальной культуры, поскольку не ясно окончательно, к какому типу эндотелия относятся полученные клетки или они могут представлять смесь специализированных эндотелиальных клеток Это предположение подтверждается данными Chan с соавторами (Chan У , 2004), которыми показана разница в уровне метилирования регуляторной области гена eNOS в HUVEC и в HuDerMVEC (клетках эндотелия капилляров кожи), в то время как уровень экспрессии гена eNOS в обеих культурах клеток сходен

Полученные с помощью разработанного протокола клетки эндотелия из ЭСК человека на генетическом, эпигенетическом и физиологическом уровне соответствуют клеткам зрелого эндотелия Таким образом, было показано, что механизмы принимающие участие в дифференцировке ЭСК человека m vitro те же или близки к тем, которые участвуют в аналогичных процессах при развитии эмбриона m vivo

Выводы

1 Впервые показано, что снижение уровня экспрессии транскрипционных факторов ОСТ-4 и NANOG при дифференцировке ЭСК человека в клетки трех зародышевых листков, сопровождается гиперметилированием регуляторных районов этих генов Таким образом, эффективность реактивации этих генов при репрограмировании генома ю vitro низка

2 Впервые показано, что экспрессия OCT-4-ассоциированных генов DPPA-3 и DPPA-5 происходит вне зависимости от статуса метилирования их регуляторных районов, который различается между линиями ЭСК человека

3 С целью изучения эпигенетической регуляции активности генов при направленной дифференцировке ЭСК человека создана оригинальная модель прямой дифференцировки ЭСК в клетки функционального эндотелия

4 Впервые показано, что процесс дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия сопровождается снятием метилирования регуляторных районов генов транскрипционных факторов GATA-2, GATA-3 и гена eNOS и экспрессией этих генов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Киселев С JI, Волчков П.Ю , Филоненко Е С, Прохорович M А , Муфазалов И А , Лякишева А В , Лагарькова M А Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека //Молекулярная медицина 2006 №2 Стр 6-11

2 Лагарькова M А, Лякишева А В , Филоненко Е С , Волчков П.Ю , Рубцова К В, Герасимов Ю В , Чайлахян Р К, Киселев С Л Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, выделенных методом иммуномагнитной селекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2006 №141(1) Стр 112-116

3 MA Lagarkova, P.Y Volchkov, A V Lyakisheva, E S Philonenko, S L Kiselev Diverse epigenetic profile of novel human embiyonic stem cell lines // Cell Cycle 2006 Vol 5 Issue 4 Pp 416-420

4 MA Лагарькова, И А Муфазалов, П Ю Волчков, С JI. Киселев Секретируемый транскрипционный фактор НОХВ4 стимулирует дифференцировку эндотелия из ЭСК человека //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007 №1 Стр 56-59

5 П Ю Волчков, M А Лагарькова, M А Прохорович, С Л Киселев Двойной негативный контроль генов, контролирующих направленную дифференцировку ЭСК человека в эндотеолий //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007 №2 .У Тезисы конференций

6 M А Лагарькова, M В Прыжкова, П. Волчков, С Л Киселев Молекулярно-генетическая характеристика линий эмбрионально-стволовых клеток человека на ранних стадиях дифференцировки // Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" Санкт-Петербург 25 - 27 октября 2004

7 M A Lagarkova, Р Y. Volchkov, А V Lyakisheva, E S Philonenko, S L Kiselev Promoter regions divers methylation profile of plunpotency-related genes m newly derived hESC lines // XVI Wilsede Meeting "Modern trends m human leukemia" June 18-22, 2005 Wilsede, Germany Pp 78

8 Лагарькова M A , Волчков П Ю., Филоненко Е С , Медвинский А, Киселев С Л Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в клетки эндотелия // Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине» 4-8 сентября 2005 Новосибирск Стр 37

9 M А Лагарькова, П.Ю Волчков, Е С Филоненко, С Л Киселев Проблемы направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток // Конференция "Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты" 17-18 ноября 2005 Москва Стр 5

10 С Л Киселев, Лагарькова М А, Филоненко Е С , Прохорович М А, Волчков П.Ю. Молекулярная генетика линий эск человека и проблемы направленной дифференцировки // VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток 12-16 декабря 2005 Звенигород

11 М А Лагарькова, Волчков П.Ю., Филоненко Е С, Медвинский А, Киселев С Л Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в клетки эндотелия // Всероссийский симпозиум "Биология клетки в культуре" Санкт-Петербург 17-19 октября 2006

12 Kiselev S , Lagarkova М, Prokhorovich М, Volchkov Р Human embryonic stem cell lines cultivation and differentiation // I-st Congress of the German society for SC research 2006 Cologne, Germany Pp 95

13 Volchkov P.Y., Lagarkova M.A, Prokhorovich M A, Kiselev S L Epigenetic control of human embryonic stem cells differentiation into endothelial cells // Британско-российское совещание "Стволовые клетки законодательство, исследования и инновации " Москва 2007

Заказ № 163/04/07 Подписано в печать 19 04 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ^мм! с/г ги, е-тай т/о@с/г ги