Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функции фактора некроза опухолей, производимого отдельными типами клеток, в аутоиммунитете

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функции фактора некроза опухолей, производимого отдельными типами клеток, в аутоиммунитете"

На правей рукописи

КРУГЛОВ АНДРЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ФУНКЦИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, ПРОИЗВОДИМОГО ОТДЕЛЬНЫМИ ТИПАМИ КЛЕТОК, В АУТОИММУНИТЕТЕ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Учреждения Российской Академии Наук и в Отделе молекулярной иммунологии Института Физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского при Московском Государственном Университете имени М. В. Ломоносова (г. Москва, Россия).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор* член-корреспондент РАН С.А.Недоспасов.

Официальные оппоненты;

Доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин. Доктор биологических наук В. В. Еремеев.

Ведущая организация: Центр Биоинженерии РАН.

Защита диссертации состоится НО^Р/Ь^ в ^ О часов на заседании диссертационного совета Д002.2Й.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им, В.А, Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан О/с/и

года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Актуальность проблемы.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют создавать

генетически модифицированные организмы, включая лабораторных мышей, с целью изучения функции того или иного гена in vivo. Знания, полученные на таких моделях, особенно важны для медицины, поскольку позволяют соотнести результаты с эпидемиологическими данными по предрасположенности к заболеваниям. Кроме того, изучение мышей с генетическим дефицитом по продукту какого-то гена, участвующего в патогенезе заболевания, является частью предклинической оценки терапевтических подходов, основанных на фармакологической блокировке кодируемого этим геном продукта.

Улучшение контроля над инфекционными заболеваниями в последние десятилетия привело к существенному увеличению частоты возникновения различных аутоиммунных патологий, таких как ревматоидный артрит (РА), рассеянный склероз, болезнь Крона и многих других. Происхождение и процессы, приводящие к возникновению этих заболеваний, остаются до конца не выясненными, хотя известно, что экспрессия Фактора Некроза Опухолей (ФНО) возрастает при развитии всех этих патологий. Более того, фармакологическая блокировка ФНО агентами, основанными на биоинженерных монокяональных антителах (Инфликсимаб, Адашшумаб) или биоинженерном растворимом рецепторе ФНО (Этанерсепт) имеет яркие клинические эффекты при лечении течение таких болезней, как ревматоидный артрит и болезнь Крона. Следует отметить, что у ФНО есть целый ряд полезных физиологических свойств, поэтому наряду с положительными эффектами, оказываемыми блокаторами ФНО, этот вид терапии может приводить к понижению антибактериальной защиты организма, проявляющейся в развитии необычных инфекций (например, листериоза) и даже в реактивации туберкулеза. Хотя эти побочные эффекты относительно редки,

результаты изучения физиологических функций ФИО на животных моделях, в т.ч. полученные в нашей лаборатории, уже поставили принципиальный вопрос о приемлемости полной блокировки ФНО в связи с потерей защитных функций организма.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования является изучение биологической роли ФНО, в т.ч. ФНО, продуцируемого отдельными видами клеток иммунной системы макрофагам!:, нейтрофилами, Т-клетками, а также специализированными клетками LTIC (участвующими в формировании лимфоидных органов), при различных аутоиммунных патологиях.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Охарактеризовать трансгенных мышей на основе локуса ФНО/JIT человека и мышей с «нок-ином» (knock-in) гена ФНО человека для дальнейшего использования их при изучении процессов, протекающих in vivo при фармакологической блокировке биологически активного ФНО человека (чФНО) в различных аутоиммунных моделях.

2. Получить и охарактеризовать мышей со специфической делецией ФНО в клетках, экспрессирующих транскрипционный фактор RORyt (Т клетки и клетки, индуцирующие образование лимфоидных органов и Пейровых бляшек (LTIC)) для дальнейшего использования этак мышей в модели колита,

2. Используя мышей, дефицитных по ФНО, изучить роль ФНО в различных аутоиммунных моделях, таких как аутоиммунный артрит и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ).

3. Изучить роль ФНО, продуцируемого клетками врожденного иммунитета (макрофагами и нейтрофилами) и адаптивного иммунитета (Т клетками), в развитии и патогенезе ЭАЭ и аутоиммунного артрита.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые охарактеризованы «гуманизованные» мыши с «нок-ином» гена ФНО человека и с трансгеном ФНО/ЛТ локуса человека, в которых токсический эффект чФНО в модели острого септического шока может быть ингибирован Инфликсимабом или моноклональными антителами к ФНО человека. Впервые исследованы функции ФНО, производимого ЬТТС клетками, и установлена уникальная функция ФНО, продуцируемого этими клетками, в развитии Пейровых бляшек (ПБ). Впервые изучена роль ФНО, экспрессируемого различными типами клеток иммунной системы, в модели рассеянного склероза (ЭАЭ) и при аутоиммунном артрите - с использованием мутантных мышей с тканеспецифической инактивацией гена ФНО в макрофагах и граяулоцитах, а также в ЬТГС и Т клетках. Показано, что ФНО, экспрессируемый макрофагами и нейтрофилами, играет патогенную роль в аутоиммунном артрите, в то время как ФНО, продуцируемый Т лимфоцитами и Ы1С, по всей видимости, играет минорную роль. Показано, что для начальной фазы развития ЭАЭ необходим только макрофагальный ФНО, а ФНО с Т клеток, осуществляет свою патогенную функцию в эффекторной фазе развития болезни в этой модели рассеянного склероза.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данной работе, имеют не только теоретическое значение для биологии ФНО и иммунорегуляции, но и практическую значимость для медицины, в частности, ревматологии. Биологические антагонисты ФНО широко применяются при лечении ревматоидного артрита, аутоиммунного псориаза, болезни Крона и некоторых других болезней. С другой стороны, поскольку ФНО является важным медиатором устойчивости организма к различным инфекциям, его системное

ингибирование может привести к серьезным побочным эффектам, что и было отмечено у некоторых пациентов, находящихся на антицитокиновой терапии с блокировкой ФНО. Детальное понимание функций ФНО, продуцируемого различными видами клеток иммунной системы в условиях развития аутоиммунных болезней, необходимо для разработки более эффективных и специфических методов терапии (в т.ч. новых типов блокаторов), позволяющих понизить риск побочных эффектов при терапевтической блокировке ФНО у больных.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 7-ой Международной

Энгельгардтовской конференции по молекулярной билогии, Суздаль, 2004; на летней Балтийской школе "Inflammation: A key to common complex diseases", Лунд (Швеция), 2007; на конференции «Gene Expression and Signaling in the Immune System», Cold Spring Harbor Laboratory (США), 2008.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы,

материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста и включают 16 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 145 источников.

Основные результаты.

1. Характеристика новых линий мышей для изучения роли ФНО в аутоиммунных заболеваниях.

1а. Трансгенные мыши, экспрессирующих гены ФНО/ЛТ локуса человека, и мыши с нокином человеческого ФНО как модели для изучения блокировки ФНО в аутоиммунитете.

Несмотря на широкое применение ФНО блокаторов для лечения ряда аутоиммунных болезней, механизм действия этих препаратов до конца не изучен. Более того, хотя Инфликсимаб способен предотвращать течение колита у пациентов, Этанерсепт не оказывает положительного эффекта на заболевание. В настоящее время не существует адекватной животной модели, позволяющей сравнивать действие этих двух блокаторов ФНО in vivo и объяснить разницу в механизме действия. Поэтому на первом этапе работы, используя современные методы молекулярной биологии, в нашей лаборатории были созданы и охарактеризованы трансгенные мыши, экспрессирующие гены локуса ФНО/JIT человека (Рис. 1 А). Ранее в нашей лаборатории были созданы две трансгенные линии мышей с малым числом копий трансгена (Рис. 1Б и Галимов и др. 2008). Анализ экспрессии продуктов генов ФНО/ЛТ локуса в тимусе этих мышей иммуноферментным анализом показал повышенную экспрессию ФНО человека (Рис. 1Г). Анализ профиля экспрессии мРНК ФНО яеловека и мыши показал их сходство, причем кинетика экспрессии мышиного гена ФНО не зависела от присутствия трансгена (Рис. 1В).

Для получения «гуманизованных» мышей, трансгенные животные были скрещены с мышами, в которых отсутствует локус ФНО/ЛТ мыши (Купраш и др., 2002).

Лт ФНЛта

I-1 ¡ГШ

(человеческий ФНО/ЛТлокус)1""»0" Мышиный ФНО/ЛТ)4* (мышиный ФНО/ЛТ локус)дт

чФНОШТлокус + иФНОШТлокус +

2,5

1,5

Т

к

*

Т

Тг1

Дикий тип

Ь

4 ё

X 6 О

Я О N

«Гуменизовэнные» мыши

Рисунок 1. Молекулярно-биологическая арактеристика трансгенных мышей, «гуманизованных» ПО ФНО/ЛТ локусу. А. Схема скрещивания трансгенных мышей, содержащих чФНО/ЛТ локус, для получения «гуманизованных» мышей. Б. Измерение количества копий трансгена в двух трансгенных линиях мышей при помощи ПЦР в реальном времени. В. Экспрессия мРНК чФНО и мФНО в костномозговых макрофагах в ответ на стимуляцию ЛПС(100 нг/мл) Г. Концентрация ФНО и ЛТа человека и мыши в тимусе трансгенных мышей. Д. Ингибирование патогенного ФНО человека в «гуманизованных» трансгенных мышах в модели ЛПС/Д-Гал токсического

шока.

Для проверки биологической активности ФНО в «гумаяизованных» мышах была использована ЛПС/Д-Гал модель острого септического шока и было показано, что, во-первых, в этих мышах ФНО человека биологически активен и является медиатором летальной токсичности, во-вторых, его активность может быть блокирована Инфликсимабом - терапевтическим препаратом на основании моноклонального антитела к чФНО (Рис. 1Д).

На следующем этапе нами были получены мыши с «нок-ином» гена чФНО, в которых ген ФНО мыши вместе с промотором и другими регуляторными элементами замещен на соответствующий сегмент генома человека (Рис. 2). Было показано, что мыши, содержащие по одной копии генов мФНО и чФНО, экспрессируют оба типа белка ФНО, более того, клетки периферической крови, стимулированные лшюполисахаридом, производят оба типа ФНО одновременно (Рис. 2В). Кроме того, костномозговые макрофаги, полученные из таких гетерозиготных мышей, в ответ на стимуляцию ЛПС производят сравнимое количество человеческого и мышиного ФНО (Рис. 2Г, Д). Наконец, в «гуманизованных» мышах этого типа токсический шок, индуцируемый введением ЛПС/Д-Гал, может быть заблокирован моноклональным антителом к человеческому ФНО, а также недавно полученными из ламы наноантителами к чФНО (Рис. 2Е).

«Гуманизованные» мыши развивают экспериментальный артрит при иммунизации эмульсией коллагена в полном адъюванте Фрэйнда, причем патогенную роль играет чФНО. Таким образом, полученные «гуманизованные» мыши представляют собой удобную модель для сравнения различного действия ФНО блокаторов in vivo и для тестирования новых ФНО блокаторов.

Мыши с экспрессией мышиного и человеческого ФНО (чФНО/мФНО)

«Гуманизованные» мыши

0.59 ."•'¿Г'Й 0,6'

аг

0° ю1 ю2 10® 10

0,07 0.5: ■Ш' л т.'

с? ' им

Г

0,025

| 0,02

1 0,015

0,01

0,005

о ■

1

о А Я 0.35 | 0,3 § 0.25

I °'2

I 0,15 0,1 0.05 0

§ I г

чФНО

1200' 1000'

е

и 800

1

2500 2000 | 150О 1000 500 — О

мч

II

ь 5

мФ i

Д-,

5 5

I

Рисунок 2. Характеристика мышей с «нок-ином» гена ФНО человека. А. Схема ФНО/ЛТ локуса в мышах с «нок-ином» гена чФНО. Б. Генетическое типирование мышей, содержащих одну или две копии гена чФНО. В. Анализ продукции ФНО клетками периферической крови в ответ на ЛПС методом проточной цитометрии. Продукция мРНК (Г) и белка(Д) мФНО и чФНО в костномозговых макрофагах в ответ на ЛПС (стимуляция 1,5 часа). Е. Ингибирование ЛПС/Д-Гал токсического шока инфликсимабом (ЗООмкг/мышь), а также мономером и димером (оба по 50 мкг/мышь) нанотел к чФНО из ламы.

16. Характеристика мышей с делецией ФНО в Т клетках и LTIC.

В конце 90-х годов в лаборатории И. Вайсмана были открыты клетки, ответственные за формирование лимфоидных органов (LTIC), которые характеризуются следующим профилем экспрессием поверхностных маркеров: CD4+CD31L7Ra+B22Q"Cdl 1с", производят лимфотоксин-а и р, ФНО, и транскрипционный фактор, - RORyt. Более того, недавние работы свидетельствуют о том, что помимо функции формирования лимфатических узлов и Пейровых бляшек (ПБ), LTIC участвует в восстановлении микроструктуры селезенки после вирусной инфекции. Таким образом, можно предположить, что LTIC могут принимать участие в хронических воспалительных процессах посредством образования терминальных центров в участке воспаления.

Для изучения роли ФНО, производимого LTIC в различных аутоиммунных патологиях, были созданы мыши с делецией гена в LTIC и Т клетках с использованием мышей, экспрессирующих Сге-рекомбиназу под контролем промотора RORyt. Этот транскрипционный фактор экспрессируется специфически в LTIC, ТЫ 7 клетках и в Т клетках тимуса на стадии «двойных положительных» тимоцитов. Для анализа уровня делеции нами были выделены Т и В лимфоциты из тимуса и селезенки ФНОЙох/Аох и мышей с генотипом RORyt -Cre, TNFflox/flox: оказалось, что наряду с делецией в LTIC ген ФНО полностью делегирован и в Т клетках (Рис. ЗА).

Известно, что LTIC - специализированный тип клеток, ответственный за развитие лимфатических узлов и Пейровых бляшек. Нами было обнаружено, что у мышей с делецией гена ФНО только в LTIC и Т клетках полностью отсутствуют ПБ. Более того, анализ кишечника в эмбрионах таких мышей показал, что развитие ПБ блокировано уже на стадии формирования зачатка этого органа (Рис. ЗВ).

„ыши Мыше«егф«0»ЙСГ1 МышисдеяецивйФНО та мыши ренонбинвыя LUCkT в|Д|СиТ«лтш клетках

ltc ажшш

L7C COiTmmi

luc cmt me™

Рисунок 3. ФНО, производимый LTIC, необходим для развития Пейровых бляшек. А. Схема получения мышей со специфической делецией ФНО в Т клетках и LTIC. Б.Аналю делении гена ФНО в различных популяциях клеток методом Саузерн гибридизации. В. Относительное количество мРНК ФНО, JITa и JITP в кишечнике новорожденных мышей. Г. Относительное количество мРНК ФНО, ЛТа и JITp в CD4+CD3- клетках. Д. Иммуногистохимическое окрашивание кишечника на формирование зачатка Пейровых бляшек в 16-ти дневных эмбрионах. Стрелками указаны области формирования зачатка ПБ.

Анализ уровней экспрессии генов JIT в кишечнике новорожденных мышей не выявил значимой разницы между мышами дикого типа и мышами с делецией ФНО в LTIC и Т клетках, подтверждая, что ФНО играет специфическую роль в формировании Пейровых бляшек (Рис. ЗБ). Анализ структуры селезенки не выявил разницы между

мышами дикого типа и мьпиами с делецией гена ФНО в ЬТ1С и Т клетках (или только в Т клетках). Мы сделали вывод, что ФНО, производимый ЫГС, играет уникальную роль в развитии именно этого вида лимфоидных органов - Пейровых бляшек.

Поскольку Пейровы бляшки ответственны за контроль патогенов в кишечнике, в будущем большой интерес представляет изучение этих мышей в модели аутоиммунного колита.

2. Аутоиммунный артрит и роль ФНО.

Для изучения патогенной роли ФНО в аутоиммуном артрите на первом этапе работы были отработаны и использованы две модели индуцирования болезни: артрит, индуцируемый коллагеном, и артрит, индуцируемый «произвольным» антигеном (в нашем случае - положительно заряженным овальбумином).

2а. ФНО необходим для развития артрита, индуцируемого коллагеном, но играет незначительную роль в артрите, индуцируемом овальбумином.

Артрит, индуцируемый коллагеном, представляет собой аутоиммунное заболевание, в котором иммунологический ответ развивается на белок хозяина. Эта модель болезни характеризуется присутствием аутоантител и развитием Т клеточного иммунитета против коллагена второго типа. Более того, коллаген-индуцированный артрит может передаваться при пассивном переносе лимфоцитов, СМ Т клеток, выделенных из мышей, иммугазованных коллагеном. Возможность «заражения» артритом с помощью сыворотки из животных, развивших артрит, остается не до конца доказанной.

Было установлено, что и другие неспецифические белки, такие как овальбумин или бычий сывороточный альбумин, также могут вызывать артрит у мышей при индукции иммунной реакции на антиген белковой природы и последующим внутрисуставным введением того же самого антигена.

Дикий тип неиммун Дикий тип + Эгимрмлт Дикий тип «НО КО

я

I*

I««

Е 1 а

Рисунок 4. Развитие овальбумин-индуцируемого артрита в мышах с генетической и фармакологической блокировкой ФНО. А. Толщина коленных суставов в мышах дикого типа, ФНО КО и в мышах дикого типа, инъецированных Этанерсептом (2 мг/мьпць). Мыши были дважды имуншованы подкожно в основание хвоста 100 мкг эмульсией положительно заряженного овальбумина в полном адьюванте Фрэйнда за три и две недели до индукции артрита. За день до индукции артрита в мышей дикого типа внутрибрюшинно был введен Этанерсепт (2 мг/мышь). Индукция артрита осуществлялась введением в левый коленный сустав 60 мкг овальбумина. Б. Гистологическая оценка артрита в мышах дикого типа, ФНО КО и в мышах дикого типа, инъецированных Этанерсептом.

Для развития артрита животные должны быть иммунизованы эмульсией белка в полном адьюванте Фрэйнда, что позволяет индуцировать сильный иммунный ответ -как гуморальный, так и клеточный. Стоит отметить, что химическая модификация белков, такая как метилирование БСА или внесение положительного заряда в

белковую молекулу овальбумина может приводить к более выраженной хронической форме артрита. Исходя из этих данных, в нашей экспериментальной модели мы использовали овальбумин-индуцируемый артрит, причем в качестве антигена был использован положительно заряженный овальбумин.

Обе модели аутоиммунного артрита были инициированы в мышах дикого типа (С57В1/6) и в мышах с полной делецией ФНО (Рис. 4-6). Развитие овальбумин-

с

индуцируемого артрита характеризовалось существенно меньшим опуханием суставов в ФНО КО мышах. Несмотря на пониженную миграцию лимфоцитов на начальном этапе артрита, гистологический анализ коленных суставов не выявил разницы между развитием артрита в мышах дикого типа и мышах с делецией ФНО. Таким образом, эта экспериментальная модель заболевания развивается по ФНО-независимому механизму и непригодна для наших целей.

В противоположность антиген-индуцируемому артриту, в модели артрита, индуцируемого коллагеном, мыши, дефицитные по ФНО, проявляют полную устойчивость к развитию заболевания, в то время как около 50 % мышей дикого типа развивают артрит (Рис. 6).

Анализ гуморального иммунного ответа, развивающегося в мышах при таком способе индукции болезни, не обнаружил антител к коллагену классов 1§01, 1£02а в мышах с делецией ФНО (Рис. 6). Таким образом, в мышах с инактивацией ФНО не происходит развития гуморального иммунного ответа и продукции антител, специфических к коллагену, которые участвовали бы в патогенезе и эрозии хрящевой и костной ткани при артрите. В то же время, Т клеточный ответ, характеризуемый продукцией ПТ4^ и ПЛ7, не выявил различий между нормальными и ФНО-дефицитными мышами. Мы заключили, что ФНО является важным фактором развития коллаген-индуцируемого артрита в этой мышиной модели.

26. Фармакологическая блокировка ФИО в мышах дикого типа приводит к задержке развития артрита, индуцируемого коллагеном.

Известно, что в мышах с полной делецией фактора некроза опухолей нарушена структура некоторых лимфоидных органов. Чтобы исключить какие-то вторичные эффекты, наблюдаемые в мышах с генетической делецией ФНО, мы применили фармакологическую блокировку ФНО irt vivo в мышах дикого типа. Для этого был использован Этанерсепт - биоинженерный белок, представляющий собой слитный полипептид из растворимого рецептора ФНО человечека (ФНОР2 или р75) и константной области IgGl, так как известно, что оба растворимых рецептора ФНО человека эффективно связываются с ФНО мыши. Ингибирование ФНО осуществлялось с момента второй иммунизации и приводило к задержке в развитии артрита. Тем не менее, полной блокировки болезни достичь не удалось, и артрит у мышей в конечном счете развивался, еще раз подчеркивая, что механизмы развития артрита могут быть и независимыми от ФНО (Рис. 5). Интересно, что при лечении РА около 30% пациентов резистентны к анти-ФНО терапии, что также может свидетельствовать о наличии ФНО-независимых механизмов развития артрита.

2в. Патогенная роль ФНО, производимого клетками миелоидного происхождения, в развитии артрита, индуцируемого коллагеном.

Артрит был индуцирован в мышах со специфической делецией гена ФНО в разных типах клеток имунной системы (Гривенников и др. 2005). Мыши, полностью дефицитные по ФНО, не развивают артрит (Рис. 5), в то время как мыши с делецией

ФНО в Т клетках и 1ЛТС или только в Т клетках развивают артрит с той же частотой, что и мыши дикого типа. Более того, во всех трех вышеперечисленных

100

| Я'' Дикий тит-Этаиерсепт 4 Дикий тип -тк-ФНОКО

о

О г 4 б 8 10 12 14 16 18 5S 22 24 Дни после 2-й иммунизации

Рисунок 5. Фармакологическое ингибирование артрита, индуцированного коллагеном, с помощью блокаторов ФНО. Частота возникновения артрита в мышах дикого типа, ФНО КО и мышах дикого типа, в которых ФНО блокирован о ипользованием Этанерсепта. Мыши были дважды иммунизованы подкожно эмульсией коллагена второго типа из иыгшенка в полном адъюванте Фрэйнда, обогащенного М. Tuberculosis H37Ra (8мг/мл) на 0-й и 21-й дни эксперимента. Блокировка ФНО в мышах дикого типа осуществлялась введением 100 мкг Этанерсепта внутрибрюшинно каждый четвертый день, начиная с дня повторной иммунизации.

группах развивается нормальный гуморальный и Т - клеточный ответ на коллаген (Рис. 6Б). Все эти данные в совокупности свидетельствуют о том, что, по всей видимости, ФНО, производимый Т клетками и LTIC, не играет существенной роли в развитии активного коллаген-индуцированного артрита.

Индукция артрита в мышах с кондиционной инактивацией продукции ФНО только в макрофагах и нейтрофилах (М-ФНО КО) приводила к пониженной частоте возникновения артрита (Рис. 6А). Это свидетельствовало в пользу того, что ФНО,

производимый миелоидными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы, играет важную роль в развитии коллаген-ивдуцируемого артрита.

М-ФНОКО ml 0 '..I Дикий тип

-а— оно ко

10 12 14 16 18 20 22 ДНИ

«в io> да

разведение

Рисунок 6. Развитие артрита, индуцированного коллагеном, в мышах с специфической инактивацией ФНО в разных типах клеток. А. Частота возникновения артрита в мышах с делецией гена ФНО в разных типах клеток. Мыши были дважды иммунизованы подкожно эмульсией коллагена второго типа из цыпленка в полном адыованте Фрэйнда, обогащенного М. Tuberculosis H37Ra (8мг/мл) в 0-й и 21-й дни эксперимента. Б, Титр IgG, IgGl и IgG2a антител, специфических к коллагену второго типа в в сыворотке мышей, развивающих коллагамгадуцируемый артрит. Сыворотка из мышей, развивающих артрит, была взята на 20-й день эксперимента.

3. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит - мышиная модель рассеянного склероза.

Для изучения роли фактора некроза опухолей в рассеянном склерозе была использована модель экспериментального аутоиммуного энцефаломиелита (ЭАЭ), индуцированная иммунизацией синтетическим МОГ38-58 пептидом и введением токсина, приводящего к разрушению гематоэнцефалического барьера.

У мышей дикого типа первые симптомы развивались на 20 день с пиком заболевания, приходящимся на 25-й день. После этого происходила частичная ремиссия заболевания. У мышей с делецией гена ФНО первые симптомы возникали существенно позже, лишь на 25-й день (Рис. 7А), и было показано, что ФНО участвует в инициировании заболевания через активацию экспрессии хемокинов, привлекающих клетки иммунной системы в центральную нервную систему ."Более того, заболевание развивалось неконтролируемо, без ремиссии, характерной для мышей дикого типа, и в ряде случаев приводило к смерти животного. Рестимуляция спленоцитов in vitro на 35-й день после иммунизации, показала повышенное число энцефалогенных Т-клеток в мышах, дефицитных по ФНО, но не в мышах дикого типа (Рис. 7В). Этот факт указывает на то, что на поздних стадиях заболевания ФНО каким-то образом участвует в контроле гомеостаза энцефалогенных Т клеток.

Для изучения роли ФНО, производимого разными типами клеток, в ЭАЭ в дальнейшей работе была использована панель мышей с кондиционной инактивацией ФНО (Гривенников и др. 2005). Эти данные суммированы в Таблице 1.

За. Индукция ЭАЭ зависит от ФИО, производимого макрофагами.

Известно, что основные клетки-продуценты фактора некроза опухолей - это макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки и дендритные клетки, то есть клетки, осуществляющие первую линию защиту против различных патогенов.

Для изучения роли ФНО, производимого клетками миеяодного происхождения, были использованы мыши, в которых ген ФНО был делегирован в клетках,

З.б. .„ эл. * и-

о | 2.0.

" 1.0. 0.6. 0.0.

Дни

ю 1б го Дни

Рисунок 7. Экспериментальный аутоиммуный энцефаломиелит у мышей с делецией гена ФНО в Т лимфоцитах или в макрофагах/нейтрофилах. Клиническое течение ЭАЭ в мышах дикого типа, мышах с полной делецией ФНО и мышах с делецией гена ФНО в макрофагах и нейтрофилах(А); в мышах дикого типа и мышах с делецией гена ФНО в Т киетках(Б) Мыши были иммунизированы подкожно эмульсией МОГ-пептида (50 мкг) в полном адьюванге Фрэйнда, обогащенного М. Tuberculosis H37Ra (8мг/мл). Дополнительно, в день иммунизации петидом и на 2-й день начала эксперименте, внутривенно был введен токсин из Bordetella Pertussis (220 нг/ мышь). Процент CD4+!FNg+ в селезенке (В) и лимфатических узлах (Г) после рестимуляции МОГ-пептвдом (80 мкг/мл). На 35-й день эксперимента клетки, выделенные из селезенки и лимфатических узлов, в концентрации 8,000,000/мл были стимулированы МОГ-пептвдом (80 мкг/мл) в течении 16 часов. После этого, в среду был добавлен GolgiStop для блокирования секреции цитокинов и клетки были инкубированы дополнительно б часов. Затем, клетки были окрашены на поверхностные маркеры и на продукцию цитокинов внугриклеточно, и проанализированы на проточном цитометре.

экспрессирукнцих ген лизоцима (М1уз1), макрофагах и нейтрофилах. Было показано, что мьшш с такой делецией развивают ЭАЭ позднее, чем мыши дикого типа. Развитие первых симптомов начинается на 25-й день, как и в мышах с полным нокаутом ФНО (Рис. 7Б). Следует упомянуть, что использование Мув-Сге трансгена вызывает делецию и в некоторых клетках центральной нервной системы, например, в микроглии. Микроглиальные клетки, которые также являются одним из типов клеток, активно продуцирующих ФНО, в результате чего может происходить экспрессия хемокинов и привлечение Т клеток и воспалительных макрофагов в ЦНС. В экспериментах с пересадкой костного мозга в летально облученных мышей было показано, что ФНО, производимый клетками гематопоэтического происхождения,

Таблица 1. Параметры экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в мышах со специфической делецией ФНО в различных типах клеток.

Мыши Начало заболевания Процент мышей, развивающих ЭАЭ Значение клинического параметра в пике заболевания

Дикий тип 21,6±2,2 100% (6/6) 3,5±0,4

Т-ФНО КО 22±3,2 60% (3/5) 1,2 ±1,3

М-ФНО КО 26,2±1,3 100 %(5/5) 3,7 ±0,6

ФНО КО 27,2±1,8 100 %(5/5) -

ответственен за раннюю индукцию экспрессии хемокинов в ЦНС. На основании вышеизложенного можно заключить, что ФНО, производимый макрофагами (а не клетками микроглии), шрает патогенную роль на начальных стадиях развития ЭАЭ. Анализ заболевания на поздних стадиях показал, что мыши с делецией ФНО в миелоидных клетках способны контролировать заболевание, так как наблюдается его ремиссия (Рис. 7А,В,Г).

36. Повреждение центральной нервной системы в ЭАЭ осуществляется ФНО, производимым Т лимфоцитами.

В последнее годы было установлено, что ЭАЭ представляет собой модель заболевания, зависящую от функции Т клеток. Так, перенос CD4 Т клеток (ТЫ и Thl7 типа), выделенных из имунизованных МОГ-пептидом мышей и рестимулированных этим пептидом in vitro в поляризующих условиях, способен вызывать ЭАЭ у наивных мышей. Т клетки способны производить значительное количество ФНО, в основном, в мембранно-связанной форме, что позволяет рассматривать возможную роль ФНО, продуцируемого Т лимфоцитами, в ЭАЭ. Тем не менее, прямые доказательства важности этого источника ФНО в патогенезе ЭАЭ отсутствовали.

Для выяснения роли ФНО, производимого Т клетками, мы иницировали ЭАЭ в мышах со специфической делецией гена ФНО в Т клетках. Начало заболевания в этой группе мышей не отличалось от такового у мышей дикого типа, что свидетельствовало об отсутствии существенного вклада этого источника в инициацию этой аутоиммунной болезни. Тем не менее, хотя в группе мышей с делецией гена ФНО в Т клетках начальная симптоматика и была сходна с клиническими проявлениями у мышей дикого типа, у части мышей ЭАЭ не развивался совсем, а у остальных развивался ЭАЭ с малыми клиническими значениями. Более того, анализ количества инфильтрирующих в ЦНС клеток лимфоидной системы не выявил разницу между мышами дикого типа и Т-ФНО КО в пик заболевания.

Эти данные свидетельствует о важности ФНО, производимого Т клетками, для развития последующих фаз заболевания, в частности, в непосредственном повреждении ЦНС. Кроме этого, анализ клеток, инфильтрирующих в ЦНС, а также

рестимудяция клеток селезенки и лимфатических узлов in vitro на поздней стадии заболевания не обнаружили никаких различий с мышами дикого типа.

По видимому, Т клетки не принимают участие в собственном гомеостазе/ апопотозе, тем самым, за контроль апоптоза энцефалогенных клеток ответственны какие-то другие типы клеток, экспрессирующие ФИО.

Выводы:

1. Проведено сравнение двух моделей мышей, «гуманизованных» по гену фактора некроза опухолей (ФНО): мышей, содержащих трансген ФНО/JIT локуса и мышином с «нок-ином» человеческого гена ФНО. Показано, что в обоих случаях ФНО человека обладает биологической активностью в мышах, и эта активность может быть блокирована реагентами, специфичными к ФНО человека.

2. ФНО, производимый клетками, ответственными за образование лимфоидных органов (LTIC), необходим для развития Пейровых бляшек.

3. ФНО играет существенную роль в развитии экспериментального артрита, индуцируемого коллагеном, но не играет значимой роли в развитии антиген-индуцируемого артрита.

4. ФНО, производимый макрофагами и нейтрофилами (но не Т клетками), играет патогенную роль в развитии артрита, индуцируемого коллагеном.

5. Патогенный ФНО, производимый как макрофагами, так и Т клетками, участвует в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, причем ФНО из этих двух источников проявляется на разных стадиях заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Grivennikov SI, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Kruglov AA, Marakusha BI, Shakhov AN, Murakami T, Drutskaya LN, Forster I, Clausen BE, Tessarollo L, Ryffel B, Kuprash DV, Nedospasov SA. Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity. 2005 22(1):93-104.

2. Kuprash DV, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Koroleva EP, Drutskaya MS, Kruglov AA, Shakhov AN, Southon E, Murphy WJ, Tessarollo L, Grivennikov SI, Nedospasov SA. Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer's patches. Eur. J. Immunol. 2005; 35(5): 1592-600.

3. Kruglov AA, Kuchmiy A, Grivennikov SI, Tumanov AV, Kuprash DV and Nedospasov SA. Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: Mouse models. Cytokine Growth Factor Rev. 2008 19(3-4):231-244.

4. Kruglov A.A., Janke M., Morawietz L., Kuprash D.V., Scheffold A., Nedospasov S.A. Role of TNF produced by distinct types of leukocytes in autoimmune arthritis. «Gene Expression and Signaling in the Immune System», Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA, 2008.

5. Kruglov A., Lampropoulou V., Drutskaya M., Galimov A., Shebzhukhov Yu., Kuprash D., Fillatreau S., Nedospasov S. Role of Tumor Necrosis Factor expressed by different cell types in autoimmune diseases. "Inflammation: A key to common complex diseases", Lund, Sweden, 2007

6. A. P. Галимов, А. А. Круглов, H. JI. Большева, О. Ю. Юркевич, Д.Я. Липиньш, И. А. Муфазалов, Д. В.Купраш, С. А. Недоспасов. Определение места и характера интеграции геномного фрагмента, содержащего локус фактора некроза опухолей человека, у трансгенных мышей. Мол. Биология, 2008, т. 42(4), с. 1-10.

Напечатано о готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 30.09.2008 г. Формат 60x901/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 535. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Круглов, Андрей Алексеевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История открытия, клонирование, регуляция экспрессии фактора некроза опухолей. | •

Сигнальные пути, активируемые фактором некроза опухолей

ФИО в аутоиммунных заболеваниях

Роль ФИО в ревматоидном артрите

Блокировка ФИО как метод лечения ревматоидного артрита

Рассеянный склероз и роль ФНО в этом заболевании

Модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

ФНО в экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите 35 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты с мышами

Молекулярно-биологические методы

Иммунологические и клеточные методы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Трансгенные мыши, экспрессирующих гены ФНО/ЛТ локуса человека, и 51 мыши с нокином человеческого ФНО как модели для изучения блокировки ФНО в аутоиммунитете.

Характеристика мышей, в которых ген ФНО делетирован в клетках, 54 индуцирующих образование лимфоидных органов.

Развитие артрита у мышей с делецией гена ФНО зависит от способа 61 индукции заболевания.

Подавление проявлений артрита блокагорами ФНО

Развитие артрита, индуцируемого коллагеном, в мышах с тканеспецифической делецией ФНО

Ингибирование артрита, индуцируемого коллагеном, у мышей, гуманизованных» по гену ФНО специфическими антителами к ФНО человека

Развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у ФНОдефицитных мышей

Протекание ЭАЭ в мышах с делецией гена ФНО в макрофагах и нейтрофилах: роль ФНО на ранних стадиях заболевания

ЭАЭ в мышах с делецией ФНО в лимфоцитах и в ЬТЮ: роль ФНО, производимого Т-клетками.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Круглов, Андрей Алексеевич

1. Охарактеризованы две модели «гуманизованных» по гену ФНО мышей и было показано, что человеческий ФНО обладает биологической активностью в этих мышах, которая может блокирована моноклональными антителами к чФНО.

2. ФНО, производимый клетками, индуцирующими образование лимфоидных органов и Пейровых бляшек, необходим для развития Пейровых бляшек.3. ФНО необходим для развития экспериментального артрита, индуцируемого коллагеном, но не играет значимой роли в антиген-индуцируемом артрите.4. ФНО, производимый макрофагами и исйтрофилами (но не Т клетками), играет патогенную роль в развитии артрита, индуцируемого коллагеном.5. Патогенный ФНО, производимый макрофагами и Т клетками, участвует в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита на разных стадиях заболевания.