Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF"

На правах рукописи

ЕФИМОВ ГРИГОРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

НОВЫЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ПАР 2015

005560003

Москва 2014

005560003

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов иммунитета Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ИМБ РАН)

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Недоспасов Сергей Артурович, зав. лабораторией молекулярных механизмов иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор Филатов Александр Васильевич, зав. лабораторией иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «ГНЦ Институт иммунохимии» Федерального медико-биологического агентства РФ;

доктор биологических наук, профессор Катруха Алексей Генрихович, ведущий научный сотрудник, руководитель группы иммунохимии кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии

наук (ИБГ РАН)

14

Защита состоится «19» марта 2015 года в' ' часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.

Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН.

Автореферат разослан «19» февраля 2015 года Учёный секретарь диссертационного совета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. TNF (фактор некроза опухолей) является одним их ключевых цитокинов, регулирующих гомеостаз иммунной системы, он обладает широким диапазоном функций: от обеспечения правильного формирования лимфоидных органов в процессе онтогенеза до развития иммунного ответа при острой инфекции и долговременного удержания микобактерий внутри инфицированных гранулем.

Оптимальный уровень экспрессии TNF необходим для нормального функционирования иммунной системы. Дефицитные (нокаутные) по гену 7л/ мыши обладают сниженной устойчивостью к целому ряду инфекций, особенно к внутриклеточным патогенам. В то же время, чрезмерная продукция TNF является ключевым элементом в патогенезе хронических аутоиммунных болезней (ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, псориаз). Трансгенные мыши, несущие несколько копий гена TNF человека, развивают спонтанный аутоиммунный артрит, внутрисуставное введение TNF усиливает симптоматику, а блокировка TNF антителами, напротив, снижает клинические проявления.

По данным клинических исследований нейтрализация TNF с помощью рекомбинантных специфических ингибиторов обладает существенным терапевтическим эффектом в ряде аутоиммунных болезней. Тот факт, что блокировка одного цитокина способна разорвать патологический каскад и привести к стойкой ремиссии, дополнительно подтверждает ключевую роль TNF в патогенезе аутоиммунных состояний.

Однако, учитывая важность TNF для нормального функционирования иммунной системы, очевидно, что его системная блокировка не может не сопровождаться побочными эффектами. Ингибирование биологических функций TNF на уровне всего организма способно вызвать целый ряд побочных эффектов, таких как реактивация латентных внутриклеточных инфекций (туберкулез), увеличение риска возникновения злокачественных новообразований (лимфомы). и др. Кроме того, парадоксальным образом, системная анти-TNF терапия способна сама по себе вызвать вторичную аутоиммунную патологию.

Теоретически возможно разделить патологическую и протективиую функцию TNF за счет создания адресных ингибиторов, которые обеспечили бы селективную блокировку патогенного TNF в области его гиперэкспресии, минимально затрагивая базовую продукцию TNF, необходимую для поддержания функций иммунной системы. Для создания подобных препаратов требуется в том числе детальное изучение патологической сверхпродукции TNF, понимание того, как экспрессия TNF соотносится по времени с развитием клинических симптомов, а также как она изменяется в ответ на анти-TNF терапию.

Существующие на данный момент методы детекции TNF в воспаленных тканях в модельных аутоиммунных заболеваниях на лабораторных животных сопряжены с процессом взятия образцов (биопсий), что само по себе может влиять на течение заболеваний. Альтернативный неинвазивный подход (создание трансгенных линий мышей, в которых под контролем Гя/регуляторных последовательностей находятся флуоресцентные белки или другие метки) имеет ряд ограничений: метка в такой системе остается внутри клетки, тогда как TNF переходит из трансмембранной формы в растворимую, которая может передавать сигнал на существенном отдалении от клетки-продуцента. Таким образом, существует потребность в сенсоре, который мог бы вводиться в системный кровоток и накапливаться в местах гиперэкспрессии TNF, связываясь как с мембранной, так и с растворимой формами TNF.

Некоторые аутоиммунные заболевания, несмотря на доказанную в них патогенную роль TNF, оказались устойчивы к анти-TNF терапии (язвенный колнт) или даже демонстрировали усиление симптоматики в клинических испытаниях (рассеянный склероз).

Эти наблюдения в сочетании с данными о том, что анти-TNF терапия сама по себе может вызвать развитие аутоиммунитета (волчаночноподобный синдром, псориаз) позволили высказать предположение, что модель в которой TNF играет только провоспалительную роль является существенным упрощением. Исследования линий мышей, в которых ген Tnf инактивирован в различных клеточных популяциях, подтвердили эту гипотезу. В ряде модельных заболеваний TNF, производимый отдельными видами иммуноцитов, может играть противовоспалительную роль. Это может объясняться как рахтичиями в контексте передачи сигнала или динамики экспрессии, так и еще не обнаруженными постсинтетическими модификациями этого цитокина. Все это говорит о том, что системная блокировка TNF, которая на сегодняшний день нашла широкое применение в клинике, далека от оптимальной терапевтической стратегии. Селективное ингибирование TNF. производимого отдельными типами клеток может оказаться значительно более эффективным и иметь терапевтический эффект в тех заболеваниях, которые ранее считались невосприимчивы к анти-TNF терапии.

В частности, было показано, что при септическом шоке, индуцированном введением липополисахарида (ЛПС), основным источником патогенного TNF являются макрофаги, тогда как для поддержания иммунного гомеостаза и структуры вторичных лимфоидных органов наиболее важен TNF, производимый В-лимфоцитами (Grivennikov, Immunity, 2005). Кроме того Т-клеточный TNF необходим для контроля над хронической туберкулезной инфекцией (ЛШс, Scientific reports 2013). В экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (модели рассеянного склероза у мышей) TNF, продуцируемый во

4

вторичных лимфоидиых органах Т-клетками, снижает активность болезни (Kruglov, JI, 2011). В аутоиммунном артрите TNF, производимый миелоидными клетками, играет патогенную роль, в то время как TNF, продуцируемый Т лимфоцитами, обеспечивает протективный эффект (Круглое и соавт. направленно в печать).

Описанные выше наблюдения позволяют предположить, что селективный ингибитор TNF, который выборочно блокировал бы TNF, производимый макрофагами мог бы иметь большую эффективность, как минимум, при острых аутоиммунных патологиях.

Одним из подходов к направленной блокировке является создание биспецифических антител, которые способны связываться с поверхностью макрофагов и одновременно захватывать и нейтрализовать производимый ими TNF. Сравнение подобного антитела с системным ингибитором TNF может подтвердить или опровергнуть гипотезу о преимуществе селективной блокировки.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было разработка новых способов изучения механизмов действия анти-TNF терапии в модельных аутоиммунных заболеваниях, создание новых блокаторов TNF и оценка перспективности антицитокиновой терапии, направленной против отдельных клеточных популяций. В работе решались следующие задачи:

1. Создание нового метода прижизненной визуализации участков патологической гиперэкспрессии TNF в моделях острых и хронических аутоиммунных заболеваний.

2. Создание на основе мышиного моноклонального антитела прототипа терапевтического агента - вначале рекомбинантного одноцепочечного антитела (scFv) против TNF, а затем химерного антитела на его основе. Изучение биологической активности и констант взаимодействия нового химерного анти-TNF антитела.

3. Проверка гипотезы, что направленное ингибирование TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда является более эффективным в модели острой аутоиммунной патологии.

Научная новизна работы. В рамках работы был предложен принципиально новый подход определения очагов гиперэкспресаш TNF с помощью вводимого в системный кровоток флуоресцентного сенсора. Полученный флуоресцентный сенсор TNF, названный Vhh41 -К, представляет собой слитный белок, состоящий из однодоменного верблюжьего антитела (VHH) к TNF и флуоресцентного белка Katushka. Для создания данного сенсора были получено и исследовано новое однодоменное антитело к TNF - Vhh41. обладающее высокой аффинностью, но не блокирующее биологическую активность TNF. Антитело Vhh41 и сенсор, полученный на его основе, способны связываться как с TNF человека, так и

с TNF мыши. Нахождение пика эмиссии сенсора в дальне-красной области спектра делает его пригодным для in vivo визуализации очагов гиперпродукции. Несмотря на высокую аффинность к TNF, связавшийся сенсор не нарушает передачу сигнала через TNF-рецептор, что делает возможным изучение динамики гиперэкспрессии TNF in vivo без внесения изменений в развитие аутоиммунной патологии. Флуоресцентный сенсор Vhh41-K был использован для визуализации областей гиперпродукции TNF в моделях аутоиммунных заболеваний: коллаген-индуцированный артрит, септический шок, индуцированный ЛПС, и конканавалин А индуцированный гепатит. Распределение флуоресцентного сенсора в организме при различных аутоиммунных патологиях, связанных с гиперэкспрессией TNF, изучалось методами конфокальной микроскопии и прижизненной визуализации флуоресценции на уровне всего организма.

Кроме того в ходе работы было сконструировано рекомбинантное одноцепочечное антитело (scFv) против TNF человека. Полученное антитело ahT-4 стало основой для получение нового химерного анти-TNF антитела 13239, являющегося действующим прототипом терапевтического блокатора TNF. В рамках данной работы химерное антитело было охарактеризовано по способности ингнбировать TNF-зависимую цитотоксичность. Было проведено сравнение с уже существующим химерным антителом — клинически применяемым блокатором TNF (инфликсимаб). Также были измерены константы взаимодействия этого антитела с TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса. Активность химерного антитела, а также его аффинность, превысили таковые для уже применяющегося в клишгческой практике препарата - инфликсимаб. Кроме того, было установлено, что химерное антитело 13239 нейтрализует TNF in vivo: оно способно защитить мышей от летальной дозы ЛПСЛ5-галактозамина.

Также в ходе работы был создан прототип принципиально нового ингибитора TNF -селективный блокатор TNF, производимого клетками миелоцитарного ряда. Для этого было сконструировано биспецифическое антитело включающее в себя: блокирующее TNF однодоменное антитело и одноцепочечное антитело против поверхностного белка F4/80, экспрессирующегося на моноцитах и макрофагах. Это антитело способно связываться с поверхностью макрофагов и одновременно захватывать и удерживать производимый ими TNF, препятствуя его попаданию в системную циркуляцию. В мышиной модели септического шока, индуцированного введением ЛПС/О-галактозамина, было показано, что в модели острой гепатотоксичности макрофагальный TNF-блокатор значительно более эффективен в сравнении с системным, хотя in vitro препараты обладают одинаковой активностью. Это подтверждает гипотезу о патогенной роли именно макрофагального TNF и преимуществе селективной блокировки этого цитокина.

6

Научно-практическая ценность. Работа имеет теоретическое значение для понимания вклада отдельных клеточных популяций в продукцию патогенного TNF при развитии аутоиммунитета. Большая терапевтическая эффективность селективной блокировки TNF, производимого макрофагами, по сравнению с системной блокировкой подтверждает гипотезу о том, что TNF, производимый разными клетками, имеет различную функцию. Это понимание может дать толчок разработке терапевтических блокаторов TNF нового поколения. Селективные блокаторы будут действовать эффективнее при заболеваниях, в которых уже применяется анти-TNF терапия, а, возможно, и смогут показать эффект в тех нозологиях, в которых системные блокаторы не прошли клинических испытаний.

На отобранное и охарактеризованное в ходе работы однодоменное антитело Vhh41 был получен патент, а разработанный на его основе флуоресцентный сенсор TNF может быть использован для визуализации и изучения очагов гиперэкспрессии TNF при аутоиммунных патологиях и их экспериментальной терапии.

Сконструированное и охарактеризованное химерное антитело 13239 обладает in vitro большей активностью, чем существующий аналог (инфликсимаб).

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном коллоквиуме лаборатории молекулярных механизмов иммунитета и лаборатории передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии ИМБ РАН. Результаты работы были представлены на конференциях:

1. International Symposium and Advanced Training Course on "Molecular Immunology of Protozoan lnfections"INGEBI-CONICET, Буэнос-Айрес. Аргентина (2007). IBC"s 18th Annual International Conference Antibody Engineering, Сан Диего. США (2007),

2. II International Symposium TOPICAL PROBLEMS OF BIOPHOTONICS, Нижний Новгород-Самара- Нижний Новгород, Россия (2009),

3. TRiPR III - Adaptive Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Disease, Генуя, Италия (2009),

4. 14th International Congress of Immunology, Кобэ, Япония (2010),

5. International Workshop «Selection and Transgenic Animal Models of Human Pathology» (STAMP), Новосибирск, Россия (2010),

6. Annual European Congress of Rheumatology, Берлин, Германия (2012),

7. Russian-German symposium "Immunology and Cancer" Нижний Новгород, Россия (2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Получен один патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (8 глав), раздела «Материалы и методы исследования» (6 глав), результатов и обсуждения (6 глав) и заключения. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 210 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение и характеристика нового рекомбинантного однодоменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность.

В рамках первого этапа разработки нового прижизненного неинвазивного метода детекции TNF было сконструировано и очищено рекомбииантное однодоменное антитело, специфически связывающее TNF с высокой аффинностью, но, в то же время, не препятствующее активации TNF рецептора и последующей передачи сигнала. В рамках совместной работы с ИБГ РАН (C.B. Тиллиб) нами была проведена иммунизация двугорбого верблюда (Camelus bactrianiis), и создана фагмидная библиотека всего репертуара последовательностей вариабельных доменов неканонических антител из В-лимфоцитов периферической крови. Затем была проведена селекция антител к TNF методом фагового дисплея. В результате был отобран клон антител Vhh41, обладающий высокой специфичностью и относительно высокой аффинностью к TNF, но в то же время не блокирующий его биологическую активность. Ген антитела Vhh41 был проклонирован в экспрессионный вектор, а затем растворимые антитела были экспрессированпы в клетках Е. coli и очищены из периплазматичекого экстракта с помощью металл-аффинной хроматографии. Методами иммуноферментного анализа (ИФА) и поверхностного плазмонного резонанса было показано, что данное антитело специфично и с высокой аффинностью связывает TNF человека. В тоже время данные, полученные с помощью цитотоксичекого теста на клетках, чувствительных к TNF, показали, что связывание антитела Vhh41 с TNF не влияет на биологические функции TNF. Небольшой размер однодоменного антитела позволяет связанной с ним молекуле TNF одновременно активировать рецептор.

Конструирование, получение и характеристика сенсора TNF для прижизненной визуализации.

Генетическая последовательность, кодирующая флуоресцентный сенсор TNF Vhh41 -К была получен на основе гена антитела Vhh41 и гена, кодирующего флуоресцентный белок Katushka (Sliclierbo. Nal Meth, 2007) (см. Рис. 1). Аналогичным образом были получены еще два контрольных флуоресцентных белка.

А В

Vhh41 линкер ' Katustika линкер 6XHIS

TNF

Рис. 1 Генетическая конструкция и схема строения Vhh41-K.

(А) Строение генетической конструкции: последовательность, кодирующая однодоменное анти-TNF антитело, сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий линкер, а затем геном красного флуоресцентного белка Katushka. вторым линкером и последовательностью, кодирующей полигексидиновую метку. (В) Флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K спонтанно димеризуется. Два VHH домена способны одновременно связываться с тримером TNF.

Флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K был экспрессирован в Е.соИ, затем белок был очищен с помощью никель-хелатной хроматографии. По данным аналитической эксклюзионной водной хроматографии флуоресцентный сенсор Vhh41-K существует в растворе в виде димера. Образование нековалентных димеров происходит за счет взаимного сродства молекул красного флуоресцентного белка. Димеризация флуоресцентного сенсора TNF дает ряд преимуществ: бивалентное связывание снижает константу диссоциации, усиливается флуоресцентный сигнал и увеличивается время полувыведения.

Способность флуоресцентного сенсора Vhh41 -К связывать TNF человека и TNF мыши была проанализирована методом иммуноферментного анализа (Рис. 2) и поверхностного плазмонного резонанса (Таб. 1). Было показано, что Vhh41-K связывается с TNF человека и с TNF мыши с высокой аффинность. Разница в константе диссоциации между флуоресцентным сенсором (9.04 х 10"s М) и исходным однодоменным антителом (9.36 < 10"7 М) подтверждает, что при димеризации обе TNF-связывающие субъединицы остаются функционально активными, за счет чего сенсор способен формировать бивалентную связь.

Katushka

Vhh41

Концентрация, цг/мл Концентрация, цг/мл

Рис. 2 Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора Vhh41-K с TNF человека и мыши методом ИФА.

Взаимодействие сенсора Vhh41-K с человеческим и мышиным TNF было измерено методом иммуноферментного анализа. Для этого рекомбинантный TNF сорбировался в лунках планшетов для ИФА. а образцы сенсора Vhh41-K наносились в убывающих коцентрациях. Затем концентрация сенсора детектировалась с помощью никель-конъюгированной пероксидазы (Pierce, 15165). На графике отложены значения оптической плотности при 450 нм и стандартное отклонение (SD).

Несмотря на то, что для иммунизации верблюда использовался рекомбинантный TNF человека, высокая степень гомологии между TNF человека и мыши (79%) обеспечила возможность перекрестного распознавания. Это обстоятельство позволяет использовать флуоресцентный сенсор TNF не только в генетически модифицированных мышах, несущих ген TNF человека вместо гена 7я/мыши («TNF гуманизованные мыши»), но и в мышах

дикого типа.

Взаимодействие Kd, М (SD) On-rate, 1/Мс (SD) Off-rate, 1/с (SD)

Vhh41-K с TNF 9,04x1o-8 9,75хЮ3 7,29x10"*

человека (3.01x10-7) (З,41х103) (1,49х 10~3)

Vhh41-K с TNF 4,66х1<Г7 l,54xlOJ 6,04x10"3

мыши (2.7хЮ"7) (6,01х103) (2,89х Ю"3)

Таб. 1 Константы взаимодействия Vhh41-K и рекомбннантного TNF человека и мыши, измеренные методом поверхностного-плазменного резонанса на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad).

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF in vitro и in vivo.

Пик поглощения Vhh41-K находится на 588 нм. пик эмиссии на 635 нм. Подобные оптические характеристики делают его пригодным для in vivo визуализации.

10

Результаты цитотоксического теста на культуре мышиной фибросаркомы L929, чувствительной к цитотоксическим эффектам TNF человека, показали, что флуоресцентный сенсор Vhh41-K не влияет на активацию TNF-рецепторов на мембране фибробластов. Эти данные были подтверждены in vivo: в эксперименте по TNF-зависимой острой гепатотоксичности было показано, что флуоресцентный сенсор не оказывает влияния на развитие патологии (Рис. 3). В «TNF гуманизованных мышах» Vhh41-K также не показал TNF-нейтрализующей активности.

Отсутствие влияния флуоресцентного сенсора на биологическую функцию TNF делает его удобным инструментом для изучения динамики экспрессии TNF in vivo без внесения изменений в изучаемую систему.

Vhh41-K

- 200пмоль/г 100 пмоль/г 50 пмоль/г 25 пмоль/г 12,5 пмоль/г — буфер

300 400 500 600 700 Время, мин

800

100-

50-

этанерцепт

1

— 200 пмоль/г

— 100 пмоль/г -.- 50 пмоль/г

— 25 пмоль/г .... 12,5 пмоль/г

— буфер

300 400 500 600 700 800 Время, мин

Рис. 3 Влияние флуоресцентного сенсора Vhh41-K на развитие TNF-завнсимой летальности в модели острой гепатотокснчности.

Мыши получали летальную дозу ЛПС/О-галактозамина в сочетании с различными дозировками (А) флуоресцентного сенсора Vhh41-K. (Б) терапевтического блокатора TNF -этанерцепта. Приведена кривая выживаемости (метод Каплан-Мейера). Vhh41-K не оказывает влияния на развитие патологии, тогда как этанерцепт имеет дозозависимую TNF-нейтрализующую активность.

Полученные данные указывают на то. что системное введение флуоресцентного сенсора не должно мешать развитию TNF-зависимых модельных аутоиммунных патологий, и что данный сенсор может быть использован in vivo для изучения динамики экспрессии TNF как в «TNF гуманизованных» мышах, так и в мышах дикого типа.

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo.

В модели аутоиммунного гепатита, индуцированного введением конканавалина А, было показано, что введенный внутривенно Vhh41-K специфически аккумулируется вблизи стенок центральных вен печени, пораженной аутоиммунным гепатитом (Рис. 4 А). В модели аутоиммунного артрита, индуцированного инъекциями куриного коллагена II типа.

флуоресцентный сенсор способен специфически накапливаться в пораженном суставе в областях лейкоцитарной инфильтрации и в зонах эрозии хрящевой ткани (Рис. 4 Б).

\

Рис. 4 Ex vivo визуализация TNF при помощи Vhh41-K в моделях аутоиммунных заболеваний.

Изображения, полученные методом конфокальной микроскопии. (А) При аутоиммунном гепатите, индуцированном введением конканавалина А, флуоресцентный сенсор Vhh41-K накапливается вблизи стенок центральных вен печени и на поверхности расположенных в них клетках. (Б) В модели коллаген-индуцированного артрита Vhh41-K специфически накапливается в зонах эрозии хрящевой ткани и зонах лейкоцитарных инфильтратов в воспаленных суставах.

Таким образом ex vivo методами было подтверждено, что сенсор специфически накапливается в областях повышенной экспрессии TNF.

Прижизненная визуализация областей сверхэкспрессии TNF с помощью Vhh41-K.

Системное введение Vhh41-K в моделях острой и хронической аутоиммунной патологии, показало, что он способен селективно накапливаться в областях сверхэкспрессии TNF и визуализировать его на уровне всего организма. Введение флуоресцентного сенсора мышам, у которых гиперпродукция TNF была стимулирована введением ЛПС, вызывает диффузное усиление сигнала, что объясняется связыванием сенсора с TNF, циркулирующем в системном кровотоке (Рис. 5).

В качестве модели заболевания, сопровождающегося локализованной гиперпродукцией TNF, был использован коллаген-индуцированный артрит. У мышей, получавших внутривенную инъекцию флуоресцентного сенсора, наблюдалось его специфическое накопление в пораженном суставе (Рис. 6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K пригоден для in vivo визуализации TNF. В дальнейшем с использованием Vhh41-K планируется изучить динамику экспрессии TNF при развитии аутоиммунного и инфекционного воспалительного процесса, а также на фоне анти-TNF терапии.

О мин 20 мин 40 мин 60 мин

1 4 S , } т\ ГчА # t.. i fJl ¡f ^ щ Ы 3 ** I O» jf;

* .', V.. v.. / i y. i

Рис. 5 Прижизненная визуализация областей гипсрэкспреспн TNF при помощи Vhh41-К в модели септического шока-

Мыши получали внутрибрюшинную инъекцию 1 мг ЛПС (А) или буфера (Б). Через час после этого внутривенно вводилось 200 мкг Vhh41-K. Непосредственно перед введением сенсора и далее через равные промежутки времени проводилась прижизненная визуализация флуоресценции на уровне всего организма с помощью прибора Kodak Carestream In Vivo FX PRO. Псевдоцвета отражают интенсивность сигнала. У животных, получаших ЛПС, наблюдалась значительно более интенсивная флуоресценция, чем у контрольных животных.

А

Б

Рис. 6 Прижизненная визуализация областей гиперэкспрессни TNF в модельном аутоиммунном артрите с помощью Vhh41-K.

Мыши, развившие аутоиммунный артрит после иммунизаци куриным коллагеном II типа, вводились в наркоз, а затем получали внутривенно 50 пмоль флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. Прижизненная визуализация проводилась до введения флуоресцентного сенсора и через различные интервалы времени после введения (А) Флуоресценция до введения сенсора TNF. (Б) Флуоресценция через 50 минут после введения флуоресцентного сенсора Vhh41-K. Профили флуоресценции были наложены на рентгенограмму. Псевдоцвета отражают интенсивность сигнала. Наблюдается специфическое накопление сигнала в пораженном суставе (отмечен стрелкой).

Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела, блокирующего биологическую активность TNF.

В рамках данной работы было исследовано ранее полученное в нашей лаборатории

мышиное моноклональное антитело против TNF человека - FIO. Было показано, что in vitro

активность этого антитела превосходит активность инфликсимаба и соответствует

активности этанерцепта1. Затем на основе ранее клонированных последовательностей

1 Применяющиеся в клинической практике рекомбинантные блокаторы

TNF.

вариабельных доменов антитела F10 (Радько, Российский иммунологический журнал, 2002) была получена генетическая конструкцию, кодирующую одноцепочечное антитело - ahT-4. Антитело ahT-4 экспрессировалось в клетках Е. coli и очищалось с помощью последовательных ступеней аффинной хроматографии.

В цитотоксическом тесте in vitro было показано, что ahT-4 эффективно блокирует биологические функции TNF. При сравнении одноцепочечного антитела ahT-4 с Fab-фрагментом материнского антитела в одинаковых молярных концентрациях, их активность не различалась.

Далее в сотрудничестве с компанией ModiQuest (Нидерланды) на основе одноцепочечного антитела ahT-4 было создано и исследовано химерное анти-TNF антитело 13239.

Сравнение кинетики взаимодействия антитела 13239 и инфликсимаба с рекомбинантным TNF человека проводилось методом поверхностного плазмонного резонанса. Кинетика диссоциации комплекса антиген-антитело была определена как 12.6 пМ для химерного антитела 13239 и 33,4 пМ для инфликсимаба (Рис. 7 и Таб. 2).

Анти-TNF активность полученного химерного антитела была изучена in vitro на культуре мышиной фибросаркомы L929, чувствительной к TNF человека, нейтрализующая активность была сравнена с таковой для материнского моноклонального антитела F10 и терапевтического антитела инфликсимаб (Рис. 8). Оказалось, что эффективные дозы моноклонального антитела F10 и химерного антитела 13239, защищающие 50% клеток от TNF-зависимой токсичности (ED?o), практически не отличаются и составляют 51 и 60 пМ соответственно, что в молярном пересчете составляет приблизительно одну молекулу антитела на три молекулы TNF. Дчя терапевтического антитела инфликсимаб EDjo составила 161 пМ, что соответствует 1 молекуле антитела на 1 молекулу TNF.

Таким образом, было продемонстрированно, что полученное новое химерное анти-TNF антитело 13239 имеет значительно большую активность in vitro, чем широко использующееся в клинике терапевтическое химерное антитело инфликсимаб. Кроме того, активность антитела 13239 была подтверждена в пилотном эксперименте in viro: в модели острой гепатотоксичности, индуцированной введением jmC/D-галактозамина.

инфликсимаб

химерное антитело 13239

Ш 120

SOO 1200 1600 2000 2400

Время, с

Г

м

1200 1600 2000 2ВД0

Время, с

10

%

А химерное антитело 13239

Ю ■ ^

Л

%

инфликсимаб

33.4 пМ

12.9 пМ

10"

10" 10° 10' Скорость связывания (М с') Рис. 7 Кинетика взаимодействия химерного антитела 13239 и инфликсимаба с рекомбннантным TNF человека.

(А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 100 нМ - 12,5 нМ с антителом 13239 и инфликсимабом. измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad). По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (on-rate). скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям Kd.

Взаимодействие Kd, М (SD) On-rate, 1/Мсек (SD) Off-rate, 1/сек (SD)

Химерное антитело 13239 1,29x10 й (3.83*10"12) 2,17 хЮ6 (8,49х Ю4) 2,79x10"5 (7,21 хЮ"6)

Инфликсимаб 3,34х10"и (8,84х Ю-'3) 7,74x105 (7,07х 102) 2,58 х10"5 (7.07х Ю-7)

Таб. 2 Константы взаимодействия химерного антитела 13239 и инфликсимаба с TNF человека, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Рис. 8 Сравнение анти-TNF активности in vitro химерного антитела 13239, мышиного моноклинального антитела F10 и инфликсимаба.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз блокаторов TNF.

Конструирование, получение и характеристика селективного блокатора TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда.

Для проверки гипотезы о преимущественной роли макрофагального TNF в патогенезе аутоиммунного воспаления нами было сконструировано биспецифическое антитело А9. которое одной своей частью связывается с поверхностью макрофагов за счет взаимодействия с трансмембранной молекулой F4/80. а второй — захватывает и блокирует производимый макрофагами TNF. Для создания его генетической конструкции были использованы гены однодоменного анти-TNF антитела hTNF—VHH (Coppieters, Arthritis and rheumatism, 2006)

и одноцепочечного антитела против макрофагального поверхностного маркера F4/80 (любезно предоставлено С. Гордоном (Оксфордский университет. Великобритания) и М. Стейси (университет Лидса. Великобритания). В качестве контрольного системного TNF блокатора было сконструировано контрольное антитело - тА9. имеющее ту же структуру и аминокислотную последовательность, что и А9, за исключением того, что его aHTn-F4/80 гипервариабельные участки были мутированы для предотвращения распознавания поверхности макрофагов (Рис. 9).

растворимый

Ab. TNF

трансмембранный TNF

scFv против F4/80

В

А9

CDRl CDR2

Г

Макрофаг

CDRl CDR2

шщ bsss;

анти-TNF VH И

VH домен

VLдомен

His

анти-Р4/80 scFv

mA9

(6S)„ повтор

«З.Яп повтор

повтср

анти-TNF VHH

■шшш

линкер1

VH домен

IIIIMIH "линкер

(G.Sn повтор

(GS)„ повтор

(G4S)n повтор

1X1 1X1 1X1

VL домен

His.

мутированное анти-Р4/80 scFv

Рис. 9 Структу ра А9, его механизм действия и строение генетических конструкций, кодирующих А9 и шА9.

(А) Бнспецифнческое антитело А9 состоит из однодоменного антитела против TNF человека и одноцепочечного антитела против поверхностной молекулы F4/80. экспрессирующейся на моноцитах и макрофагах. (Б) Принцип селективной блокировки TNF. производимого макрофагами: А9 связывется с поверхностью макрофагагов и захватывает высвобождаемый с их поверхности TNF. предотвращая его попадание в системную циркуляцию. (В) Схема генетической конструкции биспецифического антитела А9 и контрольного системного блокатора TNF - mA9. Ген однодоменного анти-TNF антитела сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий глицин-сериновый линкер, а затем геном одноцепочечного антитела против F4/80. Затем следует последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер для аффинной очистки. Контрольное антитело тА9 имеет аналогичную последовательность за исключением того, что 6 гипевариабельных участков aHTH-F4/80 антитела заменены на последовательности вида (GlyiSer)„, что препятствует связыванию антитела с поверхностью макрофагов и превращает его в системный ингибитор TNF.

Оба антитела были экспрессированы в бактериальной системе и очищены методом аффинной хроматографии. Кинетика взаимодействия антител А9 и шА9 с рекомбинантным

TNF человека измерялась методом поверхностного плазмонного резонанса. Оба антитела показали высокую аффинность (Рис. 10 и Таб. 3)

А

160

ш120 >

го 80 х

5 40

А9

тА9

400 800 1200 1600 Время, с

400 800 1200 1600 Время, с

10' 10 10 Скорость диссоциации (М 'с') Рис. 10 Кинетика взаимодействия антнтел А9 и тА9 с TNF.

(А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 50 нМ — 3 нМ с сенсорным чипом, на котором были иммобилизованы биспецифическое антитело А9 и контрольное антитело niA9. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (on-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям константы диссоциации.

Взаимодействие Kd, М (SD) On-rate, 1/Мсек (SD) Off-rate, 1/сек (SD)

А9 8,48x10'" (4,21x10"") 7,97x105 (8,95x104) 6,54x10"5 (2,71x10"5)

тА9 9,47x10" (3,02хЮ"п) 7,45х105 (7,13хЮ4) 6,88x10"5 (1,4x10"5)

Таб. 3 Константы взаимодействия антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Для оценки сравнительной активности антитела А9 в ингибировании биологических

эффектов TNF проводился цитотоксический текст на линии мышиной фибросаркомы L929.

19

Согласно полученным данным анти-Т№ активность антител А9 и тА9 не различается (Рис. 11).

10 10 10 Концентрация, пМ

Рис. 11 Анти-TNF активность антнтел А9, и тА9.

Сравнение активности биспецифического антитела А9 и контрольного антитела шА9. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и тА9.

Способность биспецифического антитела А9 специфически связываться с поверхностью

макрофагов была оценена методом проточной цитофлуориметрии. Биспецифическое

антитело А9 селективно связывается с поверхностью макрофагов (Рис. 12 А). В то же время

было показано, что мутации в CDR контрольного антитела шА9 препятствуют его

взаимодействию с макрофагами (Рис. 12 Б).

Кроме того, было показано, что антитело А9. будучи прикрепленным к поверхности

макрофагов, способно одновременно связывать экзогенно добавленный TNF человека (Рис.

12 В) Это подтверждает возможность связывания двух антигенов одновременно.

биспецифическое антитело

TNF человека

Рис. 12 Взаимодействие антнтел А9 и тА9 с поверхностью макрофагов, одновременное связывание TNF.

(А, Б) Костномозговые макрофаги инкубировались с биспецифическим антителом А9 (красный), без него (синий), или с контрольным антителом тА9 (черный) а затем подвергались окрашиванию антителами, специфичными к А9/тА9. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на антитела А9/шА9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. Биспецифическое антитело А9, но не контрольное антитело тА9, специфически связывается с костномозговыми макрофагами. (В) Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом А9 (красный) или без него (синий), затем с рекомбинантным TNF человека, после чего подвергались окрашиванию флуоресцентно-меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к TNF человека. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события Биспецифическое антитело А9. способно удерживать TNF человека на поверхности макрофагов (клеток, отобранных по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD11Ь)..

Период полужизни биспецифического антитела А9 на поверхности макрофагов, определенный методом проточной цитофлуорометрии, составляет 1,5 часа.

В in vitro экспериментах с макрофагами из «TNF гуманизованных мышей» было подтверждено, что биспецифическое антитело А9 может удерживать эндогенно продуцируемый TNF человека. Предынкубация с антителом А9 макрофагов существенно снижала уровень TNF в супернатанте. измеряемый после стимуляции макрофагов ЛПС.

Рис. 13 Способность биспецифического антитела А9 удерживать TNF человека, производимый макрофагами из «TNF гуманизованных мышей».

Перитонеальные макрофаги, выделенные из из «TNF гуманизованных мышей», инкубировались с биспецифическим антителом А9 или без него, затем отмывались, после

8000-, *

чего экспрессия TNF индуцировалась добавлением ЛПС (к контрольным образцам ЛПС не добавлялся). Через 4 часа инкубации при 37°С. 5% СО? уровень TNF в супернатанте измерялся методом ИФА. На графике отложено определенное среднее значение концентрации TNF и стандартное отклонение (SD).

В экспериментах in vivo в модели септического шока на «TNF гуманизованных мышах» было показано, что адресная доставка блокатора TNF на поверхность макрофагов существенно снижает необходимую терапевтическую дозу. Мыши, получавшие летальную дозу ЛПОО-галактозамина и 750 Ед./грамм веса антител, А9 выживали, в то время как в группе мышей, получивших аналогичную дозу контрольного антитела тА9, наблюдалась 100% смертность. В других дозах также наблюдалось различие в эффектах между двумя антителами. Поскольку оба антитела in vitro показали одинаковую кинетику взаимодействия с TNF и нейтрализующую активность, а также имеют очень близкую друг другу молекулярную массу и аминокислотную последовательность, можно заключить, что разница in vivo связана с адресной доставкой блокатора TNF к клеткам-продуцентам.

Рис. 14 Сравнительная эффективность селективной блокировки макрофагального TNF и системной блокировки TNF в модели острой гепатотоксичностн.

«TNF гуманизированным мышам» вводились различные дозы биспецифического антитела А9 или контрольного системного блокатора TNF - шА9 или буфера. Спустя 30 минут животные получали летальную дозу ЛПСЮ-галактозамина. Приведена кривая выживаемости (метод Каплан-Мейера).

Таким образом было подтверждено, что адресная доставка ингибитора TNF к клеткам-продуцентам является предпочтительной системной блокировке TNF. Дальнейшие исследования будут направлены на создание аналогичного антитела с пролонгированным действием, что позволит использовать его в моделях хронических заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данной работы была создана и изучена панель рекомбинантных молекул на базе генно-инженерных антител против TNF человека. Предполагается, что дальнейшие исследования с использованием этих и подобных молекул внесут существенный вклад в

молекулярную иммунологию цнтокинов и в изучении роли цитокинов в развитии аутоиммунных состояний.

Разработаный флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K способен связывать TNF с высокой аффинностью. Было продемонстрировано, что флуоресцентный сенсор специфически накапливается в локусах гиперпродукции TNF в моделях острых и хронических заболеваний на лабораторных животных и может быть детектирован in vivo и ex vivo методами. Таким образом он может быть использован для прижизненной визуализации областей повышенной экспрессии TNF в ходе инфекционных и аутоиммунных заболеваний. С помощью прижизненной визуализации цитокинов возможно глубже изучить механизмы развития аутоиммунного воспаления и воздействия на него блокаторов цитокинов и других терапевтических агентов.

Новое химерное антитело 13239, полученное на основе одноцепочечного антитела ahT-4 и охарактеризованное в настоящей работе, превосходит по аффинности и in vitro активности использующееся в клиники химерное антитело инфликсимаб. Дальнейшие исследования должны показать, вызывают ли эти свойства снижение эффективной терапевтической дозы in vivo.

Методом селективной блокировки TNF. производимого миелоидными клетками, были независимо подкреплены полученные на панели нокаутных мышей данные о том, что TNF, производимый этими клетками, играет преимущественную патологическую роль в модельных аутоиммунных заболеваниях. Это означает, что существующая на сегодняшний день стратегия системной блокировки TNF при лечении аутоиммунных болезней не является оптимальной. Полученный направленный блокатор макрофагального TNF (биспецифическое антитело А9), может стать прототипом для создания нового класса адресных блокаторов TNF.

ВЫВОДЫ

1. Получено и охарактеризовано новое однодоменное антитело против TNF человека -Vhh41.

2. На основе Vhh41 создан флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K, связывающий TNF, но не блокирующий передачу сигнала через TNF рецептор.

3. Установлено, что Vhh41-K специфично связывается с TNF в областях его гиперпродукции в модельных аутоиммунных заболевания и может быть визуализирован ex vivo и in vivo

4. На основе мышиного моноклонального анти-TNF антитела F10 получено и охарактеризовано однодоменное антитело ahT-4, сохраняющее способность нейтрализовать TNF.

5. Изучен полученный на основе ahT-4 прототип терапевтического агента - химерное антитело против TNF 13239. Данное антитело превосходит имеющийся аналог (инфликсимаб) по аффинности к TNF и биологической активности in vitro.

6. Создано и охарактеризовано биспецифическое рекомбинантное антитело А9, специфичное к поверхностной молекуле на мембране макрофагов и к TNF человека.

7. Установлено, что антитело А9 способно связывается с поверхностью макрофагов, захватывает и удерживает производимый ими TNF.

8. Установлено, что направленное ингибирование TNF, производимого макрофагами, в модели острой аутоиммунной патологии значительно более эффективно, чем системная блокировка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в реферируемых журналах:

1. Efiniov G.A., Kruglov A.A.,, Tillib S.V., Kuprash D.V., Nedospasov S.A.Tumor Necrosis Factor and the consequences of its ablation in vivo. Molecular Immunology 47 (2009) 19-27

1. Г.А. Ефимов, O.A. Вахрушева, А.Ю. Сазыкин, И.А. Муфазалов, A.A. Круглое, Д.В. Купраш, С.А. Недоспасов. Рекомбннантные одноцепочечные антитела, блокирующие биологическую активность Фактора некроза опухоли человека. Российский иммунологический журнал, 2009, ТОМ 3(12), No 1, С. 23-29

2. Drutskaya, M.S., Efimov, G.A., Kruglov, A.A., Kuprash, D.V., Nedospasov, S.A. Tumor necrosis factor, lymphotoxin and cancer. IUBMB Life, 2010,62(4): 283-289.

3. Kruglov A.A., Tumanov A.V., Grivennikov S.I., Shebzukhov Y.V., Kuchmiy A.A., Efimov G.A., Drutskaya M.S., Scheller J, Kuprash D.V., Nedospasov S.A. Modalities of experimental TNF blockadc in vivo: mouse models. Adv Exp Med Biol. 2011 ;691:421-31.

4. A.A. Кучмий, Г.А. Ефимов, С.А. Недоспасов Методы молекулярной визуализации in vivo. Биохимия. 2012, том 77, вып. 12, с. 1603 - 1620.

5. Г.А. Ефимов, З.В. Хлопчатникова, А.Ю. Сазыкин, М.С. Друцкая, A.A. Круглов, Е.С. Шилов, A.A. Кучмий, С.А. Недоспасов, C.B. Тиллиб Получение и характеристика нового рекомбииаитного однодоменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека. Российский иммунологический журнал, 2012, том 6(15), No 4, с. 337-345

6. М.С.Друцкая, Г.А.Ефнмов, Р.В.Зварцев, А.А.Чащина, C.B. Тиллиб, А.А.Круглов, С.А.Недоспасов (2014) Модели артрита, патогенез которых связан с фактором некроза опухолей. Биохимия, 2014, том 79, вып. 12, с. 1650- 1658.

7. И.В. Астраханцева, Г.А. Ефимов, М.С. Друцкая, A.A. Круглов, С.А. Недоспасов (2014) Современная анти-цитокиновая терапия аутоиммунных заболевании Биохимия, 2014, том 79, вып. 12, с. 1607-1618.

8. Г. А. Ефимов, А. А. Круглов, Д.С. Шварев, М.С. Друцкая, С А. Недоспасов (2014) Новые тенденции в антицнтокиновой терапии. Российский иммунологический журнал, 2014, том 8(17), No 3, стр. 706-710

Тезисы конференций:

1. Grigory A. Efimov, Boris V. Radko, Alexei 1. Sazykin, Dmitry V. Kuprash, Sergei A. Nedospasov Construction and Expression of Tumor Necrosis Factor Inhibiting Single Chain Variable Fragment Antibody Engineering San Diego, California, USA, December 4-6 2007, p. 14

2. Kruglov A.A., Shebzukhov Yu.V., Kuchmiy A., Galimov A.R., Efimov G., Grivennikov, S.I., Kuprash D.V., Kozlov S.V., Nedospasov S.A. Mice in tvhich human TNF is mediating both beneficial and deleterious functions: A model comparison of different blockade strategies.

Cytokine (2008), Vol. 43(3), p. 271

3. G. Efimov, O. Vakhrusheva, D. Chudakov, J. Scheller, A. Kruglov, S. Nedospasov Fluorescent fusion proteins for molecular imaging of TNF in mouse autoimmune disease models. International Immunology 2010, Vol. 22 SI iii60

4. G. Efimov, Z. Khlopchatnikova, A. Kuchmiy, A. Kruglov, D. Chudakov, S. Tillib, S. Nedospasov Fluorescent fusion protein for molecular imaging of TNF in mouse autoimmune disease models Ann Rheum Dis 2013;71:Suppl 3 p. 322

Подписано в печать 17.02.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39