Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях"

на правах рукописи

СУРОВЦЕВА Елена Владимировна

Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека

на животных моделях

Специальности 03 00.04 - «Биохимия» 03.00 03 - «Молекулярная биология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в ВНК "Биохимия мышц" Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и лаборатории химии белка ГосНИИГенетика им. С.И. Ллиханяна

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Б. Шевелев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б.С, Народицкий

кандидат биологических наук А.В. Жердев

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский

Университет Росздрава

Защита состоится «_»_2005г. в_часов на заседании

диссертационного совета К002.247.01 при Институте биохимии им А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

яоо^. {оо1Ъ

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Секреторные белковые медиаторы большинства важнейших процессов в организме человека и млекопитающих функционируют в очень низких физиологических концентрациях. При этом высокая биологическая активность ростовых факторов и цитокинов в отношении клеток организма, как правило, компенсируется их стремительной деградацией. Высокая скорость распада и синтеза ростовых факторов приводит к формированию квазистационарных концентрационных градиентов вблизи клеток-продуцентов, которые, по-видимому, возникают за счет распределения ростовых и сигнальных факторов в организме. Создание именно таких устойчивых во времени градиентов является желательным условием тестирования действия лимфокинов и ростовых факторов на животных моделях, однако эта задача не реализуема при введении испытуемых белков в систему в форме готовой субстанции.

Наиболее физиологичным методом доставки ростовых факторов представляется индуцированная экспрессия клеточных медиаторов собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении в отдельные клетки животного генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. В настоящее время многие проекты, направленные на создание средств борьбы с вирусными и онкологическими заболеваниями, включают введение в организм человека ДНК, несущей ген соответствующего цитокина [Bartlett et al., 2003]. В этом случае уровень экспрессии определяется, прежде всего, силой промотора, а также возможностью доставки ДНК к тканям-мишеням.

Доля клеток, непосредственно подвергающихся трансфекции в результате внутримышечной инъекции неупакованной ДНК, очень невелико (не более 10"5 в непосредственно вблизи точки инъекции), поэтому напрямую оценивать эффективность доставки конструкций по появлению белкового продукта или специфического транскршгга представляется затруднительным. В этой связи наиболее доступными являются косвенные методы оценки на основе измерения уровня продукции специфических антител в ответ на синтезированный in situ рекомбинантный белок. Выявление таких антител, легко доступное в техническом отношении, может служить доказательством факта доставки ДНК в заданный участок ткани-мишени.

Цель и задачи исследования

В качестве цели настоящей работы рассматривалась разработка генно-инженерных конструкций для доставки растворимого TNF-a1 человека в секреторной и внутриклеточной форме в клетки млекопитающих. Эффективность разработанных конструкций оценивалась по критерию появления в крови животного в результате парентерального введения плазмидной ДНК специфических поликлональных антител против TNF-a человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1) создание иммунохимической системы детекции TNF-a на основе антител, выработанных при иммунизации кролика ггггг^ттгтШН

»ОС национала

2) получение биологически активного стандарта стандарта для разработки тест-системы;

3) характеристика специфичности аффинноочищенных антител против TNF-a человека;

4) создание конструкций для доставки TNF-a человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме;

5) изучение свойств полученных конструкций в тестах на животных моделях.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность доставки TNF-a человека на животной модели с помощью свободной ДНК. В нашем случае доставка TNF-a человека проведена параллельно на двух видах животных, причем сопоставлена эффективность действия секретируемого и несекретируемого вариантов белков.

Подтверждено ранее высказанное предположение [Chowdhury et al., 2001; Gardsvoll et al., 2000] о значительных различиях характера ответа на антиген, доставляемый методом ДНК-иммунизации, в случае крысы и кролика. Это проявилось, в частности, в форме двухфазной динамики сероконверсии титра специфических антиткел у кролика.

Практическая ценность работы

В представляемой работе первая часть посвящена получению рекомбинантного TNF-a человека, необходимого в дальнейшей работе для иммунобиохимических тестов. Предложен оригинальный дизайн генной конструкции, приводящий к более высокому, по сравнению с ранее использовавшимися [Шингарова и др., 1997] уровню продукции целевого продукта (до 100 мг/л). Разработана оригинальная методика ренатурации TNF-a т телец включения. Факт приобретения TNF-a нативной конформации в результате ренатурации рекомбинантного белка подтвержден наличием связывания продукта ренатурации с экстраклеточным доменом рецептора TNF 1 типа в тесте in vitro. Нативный рецептор TNF получен экспрессией в клетках Drosophila melanogaster.

Вторая часть работы посвящена характеристике полученных аффинно очищенных поликлональных антител против TNF-a человека. Получены предварительные данные, подтверждающие перспективность использования этих антител при дифференциальной и уточняющей диагностике больных рассеянным склерозом.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 3 печагные работы.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (135 наименований). Диссертация содержи! 17 рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы

Материалы работы представлялись на ежегодном конкурсе работ института биохимии им.А.Н. Баха РАН (декабрь 2004) и на конференции "Перспективные

направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, институт биороганической химии им.М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, февраль 2005г).

Материалы и методы Методы работы с культурами клеток эукариот

Культивирование клеток линии питотоксических лимфоцитов

Линию нормальных цитотоксических лимфоцитов человека CER43 поддерживали в жидкой среде RPMI 1640 (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% инакгивированной лошадиной сыворотки при 37°С и 8% С02. Для стимуляции роста CER43 раз в 10 дней в клеточную культуру вносили 10-кратный избыток периферических моноцитов крови человека (РВМС), выделенных центрифугированием в градиенте фиколла.

РВМС выделяли из свежей крови здорового донора В 50-мл. стерильную пробирку отбирали 35 мл крови. Далее на дно пробирки осторожно наслаивали 10 мл фиколла. После центрифугирования 10 мин 1500g отбирали среднюю фазу. Процедуру повторяли три раза. Из 35 мл крови выделяли в среднем 50х106клеток.

Культивирование клеток эмбриональной линии Drosophila melanosaster

Клетки стандартной лабораторной линии дрозофилы S2 (Invitrogen, Германия) выращивались на очищенной от белка среде Шнейдера Insect-Xpress (Biowhitaker, США) с добавлением 10% инакгивированной лошадиной сыворотки при 26°С, при качании со скоростью 115 об/мин. Клетки пересевали 2 раза в неделю, стараясь держать в логарифмической фазе роста 5х105-1х106клеток/мл.

Генно-нженерное конструирование

Получение кДНК из клеток линии CER43

Суммарную РНК выделяли с использованием Oligotex Direct mRNA Mini Kit (Qiagen, Германия), после чего с использованием ревертазы Mo MuLV (Eppendorf, Германия) и случайных праймеров (N6) получали первую цепь кДНК. Реакцию проводили при 37°С в течение 1 ч и останавливали прогревом до 70°С в течение 5 мин.

Сборка экспрессионной конструкции для получения TNFR1 в клетках дрозофилы

На основании опубликованной нуклеотидной последовательности мРНК TNFR1 (номер доступа в NCBI Gene Bank - NCBI NM_001065) была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров:

TNFRl-for (Kpnl) (5')-catagggtaccaecatgggcctctccaccgtec-3' TNFR2-rev (AgeI) (5')-cattcaccggtggtgcacacggtgttctg-3'

В праймер TNFRl-for был введен элемент Козака (agca) и стартовый кодон ATG. С использованием ПЦР на амплификаторе марки (Applied Biosystem, США) был получен фрагмент ДНК ожидаемого размера 500 п.н., кодирующий TNFR1.

ПЦР-амплификат был расщеплен по сайтам KpnUAgel и клонирован в вектор pMT/V5-His (Invitrogen, Германия), предварительно линеаризованный теми же рестриктазами. В результате была получена плазмидная конструкция pMT-TNFRl, кодирующая рекомбинантный ed-TNFRl.

Сборка экспрессионных конструкций TNF-a человека

Праймеры TNF1, TNF2, TNF3 и TNF5 были сконструированы на основе нуклеотидной последовательности [NCBIМ26331]. TNF-1 (Ndel) (5' )-ggcatatgatgcgcagcagcaggccgcaaccccgagcgataaa TNF-2 5' )-cgccaccacatgggccaccggtttatcactcggggtgc

TNF-3 (ВатШ) (5')-ggggatccgttaacccgcaggctgaggggcagctccagtg TNF-5 {Xbal) (5')-ggtctagagggcaataatcccaaagtag

Для генноинженерного конструирования на базе вектора рЕТ23а (Novagen, CIIIA) в работе использовали штамм Е. coli ВМН 71-18 (thi, supE, F'proAB, ¡acP ZAM15) (Promega, США). Для проведения экспрессии под контролем промотора фага Т7 служил штамм BL21(DE3) (F-, отрТ, hsd^(rb', mb~), dem, gal, (DE3), pLysS, Cmr).

ПЦР с геномной ДНК человека и праймерами TNF3 и TNF5 осуществлялась на термоциклере Tercyc MC-16 (ДНК-технология, Россия). При проведении ПЦР использовали ДНК-полимеразу Taq (Бионем, Россия). Геномную ДНК-матрицу вносили в реакционную смесь до конечной концентрации 0.01 мю/мкл. ПЦР проводили в следующих условиях: 94°С -1 мин, 54°С - 45 с, 72°С -15 с, 30 циклов.

Получение генноинженерных конструкций для ДНК-иммунизации против TNF-q человека

Фрагмент ДНК для клонирования был получен ПЦР с использованием Т7 стандартного праймера (MBI Fermentas, Литва) и праймера TNF5 на матрице pTNF5.

На базе системы прямого клонирования ПЦР-продуктов pGem-T-Easy (Promega, США) была получена промежуточная конструкция pGem-TNF2.

Фрагмент ДНК, кодирующий зрелый TNF-oc человека, был получен рестрикцией плазмиды pGem-TNF2 по сайтам Noll и Spei и клонирован в предварительно линеаризованный по сайтам Not] и Xbal вектор pC-DNA3. Полученная плазмидная конструкция pCD-TNF3 использовалась далее для иммунизации животных.

Для получения конструкции pCD-TNF4 был синтезирован праймер-

TNF7(//i«<fflI) (5 ')-aaaagcttgatgcggatcctggagctggccgagga

ПЦР-амплификат размером 1.8 т.п.н. был получен на матрице геномной ДНК человека с использованием праймеров TNF7 и TNF5. Далее этот амплификат был расщеплен рестриктазами Hindlll/Xbal pC-DNA3, предварительно лианеризованный этими же рестриктазами Полученная конструкция pCD-TNF4 была использована для иммунизации животных.

Иммунизация животных

Иммунизация крыс рекомбинантным белком в виде телец включения и получение сыворотки против ТМ^-а человека

Иммунизацию 2-х крыс породы \Vistar проводили подкожно 3 раза с интервалом 10 дней в присутствии при первой иммунизации полного, а в 2-х последующих неполного адъюванта Фрейнда Для однократного введения одному животному использовали 500 мкг рекомбинантного ЮТ-а в виде телец включения в суспензии в физиологическом растворе объемом 300 мкл. Кровь отбирали из хвостовой вены. Для дальнейшего анализа использовали цельную сыворотку, образовавшуюся после отделения естественного фибринового сгустка

ДНК-имунизация

В настоящее время не существует общепринятого протокола иммунизации животных ДНК. В нашей работе для решения этой задачи использовалась следующая экспериментальная методика: ,

ДНК-иммунизация крыс

Крысы были проиммунизированы внутримышечно 3 раза с интервалом 10 дней. При однократной инъекции одному животному вводили 300 мкг ДНК, растворенной в 300 мкл физиологического раствора. Кровь отбирали из хвостовой вены. Для анализов использовали цельную сыворотку. ДНК-иммунизация кролика

Кролик был проиммунизирован внутримышечно 3 раза конструкцией pCD-TNF3 и 4 раза конструкцией pCD-TNF4 с интервалом 14 дней. При однократной инъекции животному вводили 1 мг ДНК, растворенной в 1 мл физиологического раствора. Кровь отбирали из ушной вены.

Результаты и их обсуждение Получение TNF-a и тестирование его активности in vitro

TNF-a человека был получен в результате экспрессии в Е coli. Метод получения рекомбинантных белков в Е coli технически прост и экономически доступен. Для получения биологически активного продукта рекомбинантный белок, предварительно полученный в виде телец включения, подвергают процедуре ренатурации.

В качестве теста, позволяющего оценивать корректность фолдинга при ренатурации TNF-a in vitro была использована его способность к связыванию с экстраклеточным доменом рецептора TNFR1.

Получение экспрессионных конструкций TNF-a

Экзон-интронная структура человеческого гена TNF-a была исследована на основании последовательности, депонированной в банке генов NCBI. Первичный транскрипт TNF-a, кодируемый локусом в составе 6-ой хромосомы человека, содержит 4 экзона. Лидерная последовательность кодируется экзоном 1 и частью экзона 2, зрелый TNF-a кодируется 3 экзонами, из которых первые 2 имеют незначительную длину, кодируя в сумме лишь 19 аминокислот. Сходную экзон-интронную структуру имеют многие другие гены секреторных белков эукариот, в том числе ростовые факторы GM-CSF [NCBI Х03020], фоллистатин [NCBI АН001463], инсулиноподобный фактор роста IGFlEa [NCBI Е01351].

Сборку гена, кодирующего зрелую форму TNF-a, проводили, комбинируя клонирование ПЦР-амплификата и сборку ДНК из синтетических олигонуклеотидов. Для клонирования ПЦР-фрагмента кодирующей области, соответствующего экзону 3 геномного гена TNF-a, была подобрана пара праймеров TNF3 и TNF5. Продукт ПЦР, полученный с использованием этой пары праймеров на матрице геномной ДНК человека, имел размер 436 п. н. Амплифицированный фрагмент был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ23а, в результате чего была получена промежуточная конструкция pTNF-al.

Недостающие в конструкции pTNF-al два экзона были получены ферментативной достройкой пары частично комплементарных синтетических олигонуклеотидов (Рис. 1).

Синтетическая часть

Ȉ-

nüOnVKT П11Р

Nde I Яра1

jraei

Рис. 1. Схема сборки экспрессионной конструкции pTNF5 на базе вектора рЕТ23а под контролем индуцибельного промотора Т7

Существуют наблюдения, свидетельствующие о значительном влиянии на эффективность трансляции 5'-концевых кодонов, располагающихся в составе мРЛК непосредственно вблизи старта трансляции [Патрушев, 2000]. С учетом этого обстоятельства, восстанавливая участок кодирующей области, недостающий в составе конструкции pTNF-al, за счет клонирования синтетического ДНК-дуплекса, мы заменили первые 5 кодонов гена человека на синонимичные им кодоны, предпочтительно использующиеся в Е coli.

Val, следующий за N-концевым остатком Met, в природном человеческом гене в составе полусинтетического гена был заменен на Met Следующий Arg кодировался бы чрезвычайно редким для Е coli кодоном AGA (Рис. 2) В результате сборки полусинтетического гена TNF-a в составе конструкции pTNF5 кодон AGA был заменен на CGC, что не сказалось на аминокислотном составе продукта, но, потенциально могло привести к повышению уровня синтеза рекомбинантного белка в клетках Е coli. Следующие 3 кодона (Ser, Ser, Ser) также были заменены на синонимичные Синтетический фрагмент был внесен в состав конструкции pTNF-al, в результате чего получена конструкция pTNF5, кодирующая зрелый вариант TNF-a человека. Таким образом, был получен полусинтетический ген TNF-a ожидаемого размера 490 п. н.

V

Ndel

1. ag^fe|^Sttctcgäaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagca

2.catatggtccgcagcagcagccgcaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcga

3. MMRSSSRTPSDKPVAHVVA

Рис. 2. Фрагмент последовательности полусинтетического гена TNF-a человека вблизи начала транслируемой области; I) природный ген человеческого TNF-a; 2) полусинтетический ген; 3) аминокислотная последовательность, получаемая при трансляции как природного, так и полусинтетического генов Цветом отмечены нуклеотиды в природном гене, подвергшиеся замене в составе полусинтетического гена

Продукция и очистка рекомбинакгного TNF-a

По результатам анализа телец включения из биомассы соответствующих рекомбинантных штаммов, обе конструкции pTNF-al и pTNF5 в условиях индукции ИПТГ (изопропил-Р-тиогалактозид) вызывали накопление целевых белковых продуктов в клетках Е coli. Тем не менее, при экспрессии конструкции pTNF-al в Е. coli удалось получить соответствующий белковый продукт. При этом участок, отсутствующий в продукте pTNF-al по сравнению с полноразмерным зрелым TNF-a, не составляет отдельного глобулярного домена. Уровень продукции усеченного белка в нашей системе составлял 70-90 мг/л Полноразмерный зрелый белок - продукт конструкции pTNF5 - также эффективно синтезировался в использованной системе. При этом уровень его продукции в различных экспериментах можно оценить на уровне 50-100 мг/л (Рис. 3).

Рис. 3. Накопление рекомбинантного TNF-a в лизатах Е coli На дорожки нанесен: 1) суммарный лизат культуры, трансформированной pTNF5; 2) суммарный лизат культуры, трансформированной pTNF-al; 3) стандарты молекулярной массы. Целевые продукты отмечены стрелками

В литературе приводится ряд данных об экспериментах по синтезу TNF-a человека в Е. coli Так, Шингаровой и соавт. [Шингарова и др.,1997] описана экспрессия TNF-a под контролем промотора триптофанового оперона Е. coli,

причем продукт экспрессии накапливался в цитоплазме в растворимом виде, а не формировал тельца включения. Однако уровень экспрессии при этом оказывался невысоким. При этом выделение и очистка такого белка требовала нескольких стадий, что сказывалось на количественном выходе конечного продукта

Синтез белка в нашей системе происходила под контролем индуцибельного промотора фага Т7. Поскольку ген ДНК-полимеразы фага Т7 в использованном нами штамме Е coli BL21(DE3) находился под контролем лактозоиндуцибельного промотора lac-tac, для запуска транскрипции в среду культивирования добавляли И1ПТ. При этом TNF-a накапливался в виде телец включения с высоким выходом. Следует отметить, что мы модифицировали протокол экспрессии по сравнению со стандартным [Palmer et al., 1995]. В настоящее время в литературе наиболее часю упоминается схема, при которой индуктор добавляется по достижении культурой оптической плотности A6g0=0 3-0.4. Мы обнаружили, что в разработанной нами системе ИПТГ может быть внесен одновременно с инокулятом, что это не сказывается на выходе белка, но позволяет сократить время ферментации.

Ренатурация TNF-a

В литературе описана экспрессия TNF-a человека, а также его ренатурация из телец включения в лабораторных и полупромышленных условиях Однако, конструктивные особенности нового продуцента, в том числе уровень продукции целевого продукта и состав среды культивирования, привели к качественному изменению свойств и химического состава исходного материала (телец включения), используемых для ренатурации. Исходя из этого, при разработке схемы ренатурации не были использованы подходы, ранее положительно зарекомендовавшие себя применительно к TNF-a, а была выбрана методология, основанная на скрининге панели буферных растворов для ренатурации, и тех свойствах белка, которые могут бьггь рассчитаны на основании лишь известной аминокислотной последовательности. Из рассмотрения были исключены методы гель-фильтрации, диализа и другие, ограничивающие возможность широкого варьирования состава буферов или требующие значительных количеств обрабатываемого белка, что нежелательно на начальных этапах отработки методики.

На этапе подбора условий ренатурации применялся экспресс-протокол, включающий одноступенчатое разбавление аликвот телец включения, предварительно солюбилизированного в растворе хаотропного агента (6 M гуанидин-гидрохлорид), панелью из 15 различных буферных растворов. При этом часть панели была исключена из эксперимента путем сопоставления их pH с pi белка, подлежащего ренатурации- предполагается, что вблизи pi белок менее склонен к формированию агрегатов за счет ионных взаимодействий. С помощью пакета программ "DNA STAR" была рассчитана pi денатурированного TNF-a человека, составившая 7.28. С учетом этого результата из полной панели были отобраны только буферные растворы со щелочными значениями pH (табл 1).

Номер буфера Компоненты и их концентрации

Трис- НС1 мМ NaCl мМ КС1 мМ MgCl2 мМ СаС12 мМ Сахароза М ЭДТА мМ Тритон Х-100 % ПЭГ 4000 %

1 50 9,6 0.4 2 2 0.1 0.5 0.05

2 50 9.6 0.4 2 2 1 0.05

3 50 9.6 0.4 2 2 0.1 0.5

4 50 9.6 0.4 2 2 1 0.5 0.05

5 50 240 10 1 0.05

_Ч г • * ■__s-

JWV'.U

sbyfr'ii

0.5

0.05

Табл. 1. Состав буферных растворов с рН~~8 0, использованных для ренатурации рекомбинантного TNF-a Штриховкой отмечен буферный раствор, показывающий лучший результат, серым цветом отмечены буферные растворы с низким содержанием соли

Состав буферных растворов, приведенный в Табл 1, можно разделить на буферные растворы низкой (№1-4) и высокой ионной силы (№5-8) Концентрацию общего белка в суспензии телец включения определяли по модифицированному методу Лоури (нерастворимые в воде агрегаты предварительно растворяли в небольшом объеме 0.7 MNaOH, разбавляя затем стандартным раствором в 10 раз).

В ходе экспериментов было установлено, что ренатурация TNF-a человека эффективно идет лишь в буферных растворах с высокой ионной силой, в остальных буферах основная масса белка агрегировала и удалялась из раствора при центрифугировании (Рис. 4). Буферный раствор №6, обеспечивший наилучший результат, содержал 240 мМ NaCl, 10 мМ КС1 и 0.5% Triton Х-100 (табл. 1). В то же время, высокая ионная сила буфера не является достаточным условием хорошего выхода ренатурации: так, для буфера 7 ионная сила не отличается от

буфера 6 (Рис. 4 дорожка 8), в то же время, белок, ренатурированный в буфере 7, нестабилен при хранении в течение 7 дней при 4°С, подвергаясь протеолизу (Рис. 4 дорожка 9).

i 16 кДа Ьщ

66 кДа

45 кДа

35 кДа т? чг

25 кДа -■Щ

18,4 кДа

14,4 кДа

1234567 8 9 10 Номера буферов 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 4. SDS-PAAG электрофорез в 12 5% геле ренатурированного TNF На дорожки нанесено (верхний ряд) (1)-стандарты молекулярной массы, (2)-белок TNF-o. до процедуры рефолдинга; (З-Ю)-белок, оставшийся в растворе после ренатурации 2 5 мкг (по общему белку) солюбшизированного материала телец включения в присутствии буферов 1-8 (нижний ряд) (табл I)

Объясняя причину различной эффективности ренатурации TNF-a в зависимости от условий среды, необходимо учитывать, что нативный TNF-a находится в растворе в форме тримера, что характерно для всех лигандов и рецепторов семейства TNF/TNF-R. Существуют данные о возможности аномального фолдинга TNF-a, приводящего к формированию димерных молекул, вместо тримерных. Такой белок стабилен в растворе лишь непродолжительное время и не способен к спонтанному переходу в истинно нативную конформацию.

Экспрессия TNF-R1 в клетках Drosophila melanogaster

Для тестирования функциональной активности TNF-a человека, полученного экспрессией в Е. coli в виде нерастворимого денатурированного белка и подвергнутого далее процедуре ренатурации, была разработана система, при которой предполагалось молекулярное взаимодействие как с моноклональными антителами, так и с нативным экстраклеточным доменом рецептора (ed-TNFRl). Экстраклеточный домен рецептора I типа было решено получить в секреторном виде экспрессией в эукариотических клетках.

Клетки линии S2 Drosophila melanogaster практически идеально подходят для продукции растворимых форм рецепторов человека и высших млекопитающих, так как естественным образом адаптированы для секреции рекомбинантного белка с большим числом дисульфидных связей во внеклеточную среду, обеспечивая при этом их корректный фолдинг. В клетках насекомых белок продуцируется не только

функционально активным, но и гликозилированным, что невозможно в случае экспрессии рекомбинантного продукта в прокариотических микроорганизмах.

Получение кДНК TNF-R1 и создание экспрессионной конструкции pMT-TNFRl

Экстраклеточная часть TNF-R1 кодируется в i-еноме человека 4 экзонами общей длиной 501 п.н., поэтому для создания продуцентов была клонирована кДНК, кодирующая этот белок. Хотя многие клетки организма чувствительны к TNF-a, содержание в них рецепторов невелико, что осложняло задачу выделения препарата мРНК, пригодного для извлечения целевого транскрипта. В качестве источника кДНК TNF-R1 была выбрана мРНК из длительно поддерживаемой в культуре линии предшественников нормальных цитотоксических лимфоцитов человека CER43. Для увеличения уровня продукции TNF-R1 клетки CER43 подвергали стимуляции кокультивированием с облученными периферическими моноцитами крови человека в течение 10 суток. По окончании культивирования окрашивание красителем трипановым синим показало присутствие в культуре большого числа мертвых клеток CER43, что свидетельствовало о запуске апоптоза (клетки-мишени были уничтожены ранее за счет цитотоксической активности CER43).

Фрагмент ДНК длиной 501 п.н., полученный в результате ПЦР первой цепи тотальной кДНК из клеток CER43 после стимуляции, кодировал только экстраклеточный, но не трансмембранный и внутриклеточный домены TNF-R1 (Рис. 5).

РМТ лидер кДНК TNF-R1

6-His стоп-кодон

Kpnl Agel

Рис. 5. Схема сборки конструкции pMT-TNFRl под контролем медь-индуцибельного промотора металлотионеина

В литературе имеются кристаллографические данные высокого разрешения, ■ позволяющие судить о структуре экстраклеточного домена TNF-Rl (ed-TNFRl),

состоящем из 167 а.о. Следует отметить, что ed-TNFRl содержит 9 внутримолекулярных дисульфидных связей. По обилию дисульфидных связей этот • рецептор сходен со многими другими поверхностными трансмембранными

рецепторами эукариот (Fas, KDR, ActRII). В связи с этим растворимые формы лиганд-связывающих доменов рецепторов с трудом поддаются ренатурации in vitro, следовательно, они только с низким выходом могут быть приведены в функционально активное состояние за счет использования стандартной технологии экспрессии в Е. coli и рефолдинга продукта, извлеченного из телец включения. Система экспрессии в клетках Drosophila позволяет получать растворимые формы рецепторов в нативной конформации и естественным гликозилированием, что может иметь значение при изучения взаимодействий рецептора с лигандом.

Учитывая эти соображения, фрагмент ДНК, кодирующий ed-TNFRl, был клонирован в вектор pMT/V5-His, предназначенный для экспрессии в клетках зародышевых линий дрозофилы под контролем индуцибельного медь-зависимого промотора металлотионеина. Данный промотор позволяет обеспечивать высокий уровень транскрипции и широко применяется для продукции рекомбинантных белков.

В результате клонирования была получена конструкция pMT-TNFRl, кодирующая рекомбинантный ed-TNFRl. В составе этого белка на С-конце экстраклеточного домена IW-R1 вместо трансмембранного домена находился двухаминокислотный спейсер Thr-Gly и последовательность из шести остатков His Для обеспечения секреции ed-TNFRl из клеток дрозофилы был использован собственный лидерный пептид TNF-R1

Экспрессия конструкции pMT-TNFRl в клетках Drosophila

С целью получения клеточной линии S2, несущей интегрированную в гепом копию плазмиды pMT-TNFRl, первичная культура трансфицированных клеток подвергалась селекции на устойчивость к гентицину (G418) в концентрации 500 мкг/мл в течение 6 недель. Параллельно с селекцией был проведен тест на способность частично обогащенной культуры к синтезу целевого продукта. Для этой цели из общего пула отбирали часть клеток, подвергшихся нескольким этапам селекции, и индуцировали их ионами двухвалентного металла (Си2+) На 3-ий день после индукции отбирали образцы кондиционированной среды и анализировали наличие в них ed-TNFRl с помощью ELISA.

Клетки Drosophila melanogaster после 6 недель селекции продуцировали ed-TNF-R1 в культуральную среду в виде 3-х полос близкой молекулярной массы, которые указывают на различную степень гликозилирования (Рис. 6).

19S 1 кДа

113 6 кДа 96 4 кДа whг Яг ^ * 1* ' I

*Л 0 кДа Щх

3« 0 кДъ * ktr

28 5 хД* <пт iß-?

1$ 5 хД* i z

Рис. 6. ЯОЯ-РААС электрофорез в 12 5% акртамидном геле продукции ТУР-М 1-стандарты молекулярной массы, 2-культуральная жидкость клеток ИгозорНПа melanogaster, трансфицированных конструкцией рМТ-ТЫРЯ1, 3-культуральная жидкость, сконцентрированная в 70 раз, 4-несвязавшанся белковая фракция после М-ТГГА-сефорозы, 4-проскок, 5-промывка, б-элюция (стрелками отмечен конечный продукт в разной степени гликозилирования)

Экстраклеточный домен рецептора ТМ7 типа 1 был очищен до гомогенного состояния с помощью 2-х стадийной процедуры: металло-хелатной хроматографией на №-ЭТА-сефарозе и гель-фильтрацией на вире^ех HR-200.

В результате был получен продукт, двигающийся при денатурирующем электрофорезе в виде 3-х полос близкой молекулярной массы, что свидетельствовало о различной степени гликозилирования полипептидной цепи

Изучение эффективности взаимодействия ed-TNFRl с рекомбинантным TNF-a человека и тестирование ег о функциональной активности in vitro

Эффективность взаимодействия полученного ed-TNFRl с человеческим TNF-a была протестирована с помощью ELISA в сравнении с эффективностью взаимодействия моноклональных антител к TNF-a. Полученные графики представлены на Рис. 7. Можно предположительно оценить аффинность ed-TNFRl, сопоставив ее с аффинностью моноклональных антител, исходя из утверждения об одновалентности иммобилизованного ed-TNFRl и двухвалентное™ антитела. Молекулярная масса ed-TNFRl (20 кДа). что приблизительно в 6 раз меньше массы IgG (140 кДа). Следовательно, Мг одновалентного лш анд-связывающего центра ed-TNFRl меньше Мг одновалентного антиген-связывающего центра IgG примерно в 3 раза. Таким образом, при сорбции на нланшеты mAb' и ed-TNFRl в равных массовых концентрациях (5 мкг/мл), ed-TNFRl находился в 3-х кратном молярном избытке по сравнению с mAb. Несмотря на это величина сигнала (А490) (Рис. 7), показывающая количество TNF-a, связавшегося с рецегиором, существенно больше в случае mAb, чем ed-TNFRl. Из представленных рассуждений можно сделать вывод о более высокой аффинности моноклональных антител к TNF-a 110 сравнению с растворимым рецептором.

Рис. 7. Эффективность взаимодействия ренатурированного TNF-a с моноклоналъными антителами и экстраклеточным доменом рецептора типа 1, протестированная методом ELISA3 1 - связывание ренатурированного TNF и монокюналъных антител (квадраты), 2 - связывание ренатурированного TNF-a и его рецептора (треугольники)

Данные, представленные на Рис. 7, позволяют сделать вывод о связывании TNF-a как с моноклоналъными антителами, так и с нативным экстраклеточным доменом рецептора ed-TNF-Rl и, следовательно, о наличии у ренатурированного из телец включения TNF-a естественной третичной структуры.

2 mAb - моноклональные антитела к TNF-a

3 ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

(Рис. 6).

0,9 г--

0 100 200 300 400 500 600 концентрация TNF-a (нг/мл)

Получение поликлональиой антисыворотки иммунизацией рекомбинантным Т!ЧР-о человека. Использование аффинно-очишенных антител для тестирования продукции Т^-а в сыворотках больных рассеянным склерозом

Иммунизация животных рекомбинантным продуктом, полученным при использовании конструкции рТМ^ в виде телец включения

Получение антител к продукту того или иного вновь открытого гена с неизвестной функцией является распространенной задачей. Ее решение, однако, зачастую осложняется невозможностью эффективно ренатурировать продукт из телец включения. Эффективность ренатурации, в свою очередь, сдерживается сложностью ее оценки по функциональной активности. Таким образом, антитела, полученные против агрегированного нерастворимого белка, могут служить ценным инструментом на начальных этапах исследования локализации и функциональной активности вновь открытых генов и их продуктов. ЮТ-а человека детально изучен в качестве антигена для иммунизации, поэтому он может рассматриваться в качестве удобного модельного объекта для изучения роли нативности антигена с точки зрения развития гуморального иммунного ответа.

В настоящей работе мы использовали в качестве антигена для иммунизации водную суспензию интактных телец включения, представляющих собой продукт конструкции рТ№5. Иммунизацию кролика проводили в три этапа по стандартной схеме, широко применяющейся при работе с разнообразными природными и рекомбинантными белками в нативной форме. При этом на каждой стадии иммунизации животным внутримышечно вводили 1 мг телец включения в виде суспензии в 1 мл физиологического раствора в смеси с полным адъювантом Фрейвда. Наличие продукции поликлональных антител в неочищенной кроличьей сыворотке протестировано вестерн-блотгингом с контрольным препаратом рекомбинангаого ЮТ-а человека (ЯеаГап, Россия) (Рис. 8).

Поликлональную антисыворотку, полученную при иммунизации кролика тельцами включения, тестировали на способность связываться со специфическим антигеном в иммуноблотгинге. Было показано, что сыворотка без дополнительной очистки при разведении в 1500 раз избирательно реагирует с гомологичным антигеном ("ГОР-а) в концентрациях не менее 2.5 нг в образце (Рис. 8), что свидетельствует о высокой аффинности полученных антител Для проверки чувствительности в качестве антигена использовался контрольный препарат ТИР-а человека.

66 кДа

45 кДа 35 кДа

25 кДа

18.4 кДа

''^Weu.i^ua

1 2

Рис. 8. Тестирование эффективности распознавания ренатурированного TNF неочищенной кроличьей политональной антисывороткой.

На дорожки нанесены:

1) 25 нг TNF-a;

2) 2.5 нг TNF-a

Для аффинной очистки фракции поликлональных антител против человеческого TNF-a был предварительно синтезирован сорбент. 0.6 мг ренатурированного TNF-a связали с 2 мл сефарозы, активированной BrCN.

Тестирование содержания TNF в сыворотках больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом с помощью аффинноочищенных кроличьих поликлональных антител

Боковой амиотрофический (BAS) и рассеянный склерозы (MS) - это серьезные нейродегенеративные заболевания, преимущественно аутоиммунной природы, распространенные преимущественно у людей старшей возрастной группы. Они харакгеризуются сложной клинической симптоматикой, и для их распознавания зачастую используют методы лабораторной диа1 нос гики, в том числе, иммунологические.

Методом вестерн-блоттинга с помощью аффинноочищенных кроличьих поликлональных антител сравнили сыворотки 3 больных MS и 3 больных BAS (биологический материал был любезно предоставлен М.Н. Захаровой ин-т неврологии, МЗСР РФ) В качестве контрольной группы служили с 6 сывороток клинически здоровых доноров (предоставлены МГЦ «СПИД»). Как показано на Рис. 9, при окрашивании аффинноочищенными антителами против TNF-a наблюдается выраженное различие состава белков сыворотки крови больных с одной стороны MS, и BAS и здоровых доноров - с другой.

альбуми

TNF

здоровые доноры BAS MS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

13

Рис. 9. Анализ состава белков крови больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом, методом вестерн-блоттинга с аффинноочищенными кроличьими поликлональными антителами. На дорожки нанесен материал сывороток 1-6-здоровых доноров, 7-9-сывороток больных BAS, 10-12-сывороток больных MS, 13 - стандарт, рекомбинантный TNF-a человека (1 нг на дорожку)

Следует отметить, что картина, наблюдаемая при иммунохимическом окрашивании перенесенных на мембрану сывороточных белков антителами против TNF-a не отличается у здоровых людей и больных BAS. но в шже время резко отличается в случае больных MS. На основании полученных данных можно сделать вывод о потенциальной пригодности полученных антител для идентификации больных заболеваниями MS в отличие от BAS в тех случаях, когда этого удается сделать по анализу клинической картины.

ДНК-доставка TNF-a на животной модели in vivo с детекцией результата по выработке антител

В ряде случаев введение экспериментальным животным или человеку ДНК, несущей ген какого-либо ростового фактора, как правило, не приводит к выбросу заметных количеств антигена в кровоток, обеспечивая лишь локальное накопление продукта в ограниченной области близи точки инъекции В этой связи непосредственная детекция продукта, доставляемого с помощью синтеза in situ, технически сложна. Облегчить решение этой задачи возможно путем выявления специфических антител, вырабатывающихся в ответ на появившийся антиген. Антитела вне зависимости от распределения антигена накапливаются в кровотоке и циркулируют в течение долгого времени, значительно превышающего время существования самого продукта эктопической экспрессии.

В ряде случаев антитела, полученные в ответ на ДНК-иммунизацию, могут представлять практическую ценность, так как они вырабатываются в ответ на антиген, синтезированный в естественной для него среде Таким образом, могут быть исключены искажения иммунного ответа, связанные с неестественным фолдингом продукта в гетерологичной системе или in vitro, а также с загрязнением антигена примесными белками продуцента.

ДНК-иммунизация - это недавно появившийся и недостаточно апробированный метод. Основанная масса результатов по ДНК-иммунизации касается выработки ответа против вирусных антигенов, как с целью получения

антител, так и для вакцинации. В данной работе было показано, что этот метод может быть применим и в отношении других типов белков-антигенов, в частности, секреторных сигнальных факторов животных ДНК-иммунизация позволяет значительно сократить временные затраты на получение антигена для иммунизации. Это обстоятельство особенно в том случае, если получение рекомбинанпюго белка в традиционных экспрессионных системах затруднено (например, для мембранносвязанных белков).

ДНК-иммунизация крыс

Для доставки ДНК т vivo было получено 2 генно-инженерных конструкции pCD-TNF3 и pCD-TNF4. В первой из них под контролем CMV находится ген, кодирующий зрелый TNF-a человека без секреторного лидера, а во второй -полный геномный ген TNF.

Схема их функциональных элементов конструкции представлена на Рис. 10.

1) CMV ПЦР-амплификат

pCD-TNF3

Not I

Spel/Xbai

Лидерный ПЦР-амплификат 2) CMV пептид

Hind III

Xba I

PCD-TNF4

Рис. 10. Схема генно-инженерных конструкций, использованных для ДНК-иммунизации на базе вектора pC-DNA3, 1) pCD-TNF3, кодирующая зрелый TNF-a, 2) pCD-TNF4, содержащая геномный (интронированный) вариант гена TNF-a, кодирующая секретируемый вариант белка с лидерным пептидом (штриховкой отмечены экзоны)

Предполагалось, что продукция антигена in vivo будет происходить под контролем CMV промотора, который обеспечивает высокий уровень конститутивной транскрипции. CMV промотор достаточно универсален, при этом от исследователей не требовалось изменять дизайн генно-инженерных конструкций при переходе от одной системы экспрессии in vivo к другой. Дизайн pCD-TNF4 предполагал, что продуцируемый in vivo антиген будет секретироваться в межклеточное пространство с помощью лидерного пептида; в случае pCD-TNF3 будет осуществляться внутриклеточная экспрессия, при этом антиген не

секретируется, но может попасть в межклеточное пространство за счет случайной гибели трансфицированных клеток.

0,9 0,8 0,7 0,6

0,3 0,2 0,1

0 -1-1-------

1-200 1 400 1:800 1:1600 1:3200 1.6400 1 12800 1-25600 разведение сыворотки

Рис. 11. Предварительное тестирование конструкций для ДНК-иммунизации на крысах Иммунизация животных конструкцией■ 1 -pCD-TNF4 (треугольники); 2 -pCD-TNF3 (квадраты)

Для предварительной проверки функциональности собранных конструкций 2 крысы породы Wistar (самки) были проиммунизированы соответственно конструкциями pCD-TNF3 и pCD-TNF4 по стандаршому протоколу, применяемому для белков: внутримышечно, с дозировкой ДНК 1 мг в 1 мл физиологического раствора на инъекцию. Уровень продукции человеческого TNF-a тестировался путем титрования антисывороюк в непрямом методе ELISA.

Полученные данные представлены на Рис. 11. При анализе полученных данных был сделан вывод о целесообразности использования в следующих опытах конструкции pCD-TNF3. В литературе встречаются данные о снижении выхода рекомбинантного белка в случае его секреции по сравнению с аналогичным белком, лишенным секреторного лидера и накапливающимся в цитоплазме. Вероятно, этим можно объяснить трудности в продукции антител в случае pCD-

В следующем опыте 7 крыс породы Wistar (самки) были проиммунизированы раствором ДНК конструкции pCD-TNF3 по стандартной методике иммунизации описанной выше. В качестве положительного контроля 1 животное подвергалось параллельной иммунизации рекомбинантным TNF-a человека. Уровень продукции поликлональных антител тестировался путем титрования сывороток в непрямом ELISA На Рис. 12 представлены данные, показывающие уровень продукции поликлональных антител у отдельных животных.

TNF4.

1,8 1,6 1,4

1,2 ■

<

0,6

0,4

0,2 0

1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1-6400 1:12800 1 25600 разведение сывороток

Рис. 12. Продукция поликлонапьных антител у крыс, проиммунизированных pCD-TNF3, протестированная методом ELISA, 1-3 животные, иммунизированные pCD-TNF3 (круги и квадраты) (Треугольники) - контрольное животное, иммунизированное рекомбинантным белком TNF-ol По оси абсцисс отложено разведение сывороток крыс

Из 7-ми иммунизированных животных достоверно на иммунизацию ДНК прореагировали только три (у остальных четырех животных максимальное значение А490, определяющееся уровнем продукции поликлональных антител, в ELISA практически не отличалось от фонового и на Рис 12 не приведены) При этом уровень продукции поликлональных антител у двух из них оказался невысоким, а иммунный ответ третьего оказался высоким, превысив уровень положительного контроля (при иммунизации белком).

Рассматривая итоги ДНК-иммунизации крыс генно-инженерной конструкцией pCD-TNF3, кодирующей ген зрелого TNF-a человека, можно сделать вывод о значительном разбросе результатов эксперимента. Необходимо отметить, что исходя из литературных данных, в ряде случаев иммунный ответ на ДНК-иммунизацию проходит не по гуморальному пути, то есть путем продукции антител, которые тестировались в этом случае, а только по клеточному пути Объясняя недостаточную воспроизводимость эффекта, мы предположили, что ход иммунного ответа организма на иммунизацию зависит от тонкой гистологической структуры сайта введения ДНК в организм (близость региональных лимфоузлов, сосудов, фасций и т.д.). Однако, остается неясным, какой из факторов привел к резкому усилению эффекту в случае 1-ого животного (Рис. 12).

ДНК-иммунизация кролика

Для эксперимента был взят один кролик, которого изначально троекратно проиммунизировали внутримышечно конструкцией pCD-TNF3, при этом при одной инъекции ему вводили 1 мкг ДНК. В отличие от крыс при иммунизации кролика оказалось возможным исследовать динамику продукции антител. После каждой инъекции ДНК сыворотка кролика тестировалась вестерн-блоттингом и ELISA на предмет появления антител против синтезировавшегося in vivo TNF-a

человека. Следует отметить, что в результате иммунизации кролика конструкцией рСБ-ТОТЗ сколько-нибудь значительной продукции антител получить не удалось.

После этого был сделан вывод о необходимости изменения протокола ДНК-доставки. Поэтому далее кролик был вторичной иммунизации конструкцией рСЭ-ТЬТ4. Уже после первой инъекции ДНК наличие антител против ТОТ-а было подтверждено вестерн-блотгингом (Рис. 13).

Рис. 13. Тестирование продукции поликлональных антител в кроличьей ДНК-иммунизационной сыворотке методом вестерн-блоттинга Окрашивание мембран после переноса белков проведено а) преиммунной сывороткой, Ъ) сывороткой, полученной после 2-кратной ДНК-иммунизации На дорожки нанесены: 1,2 -клеточные лизаты Е coli ВМН 71-18; 3) очищенный рекомбинантный TNF-a. Стрелкой отмечено расположение TNF-a

Однако, несмотря на наличие антител по данным вестерн-блоттинга, при использовании этой сыворотки в постановке ELISA сколько-нибудь значительной продукции поликлональных антител зафиксировано не было (данные не приведены). Следует отметить, что этот факт оказался для несколько неожиданным, гак как чувствительность одних и тех же антител в ELISA, как правило, выше, чем в вестерн-блоттинге. Объяснение этого явления, возможно, связано с особенностями эпитопной специфичности образующихся антител против TNF-a. в случае ДНК-иммунизации.

По литературным Данным динамика продукции антител при ДНК-иммунизации принципиально отличается от сероконверсии при стандартной схеме иммунизации белком. Ответ на ДНК-иммунизацию характеризуется небольшим максимумом после первой или второй инъекции ДНК, затем титр антител падает до нуля, и только через определенное время при условии продолжения инъекций ДНК претерпевает подъем. В настоящий момент не предложено модели, которая может адекватно объяснить такое поведение аппарата синтеза антител при ДНК-иммунизации.

Подобный эффект наблюдался и в настоящей работе. После двух следующих инъекций pCD-TNF4 продукция поликлональных антител не наблюдалась ни в вестерн-блоттинге, ни в ELISA

После 4-ой инъекции pCD-TNF4 в сыворотке животного появились антитела, реагирующие с рекомбинантным антигеном не только в вестерн-блоттинге, но и в ELISA. Результаты испытаний этой сыворотки приведены на Рис. 14.

й

0,1 -

0,08

I о 0,06 -

1 0,04

<

0,02

1.200 1.400 1.800 разведение сыворотки

Рис. 14. Тестирование активности сывороток кролика после четырех инъекций pCD-TNF4 методом непрямого ELISA. Серые стол6цы-А490, характеризующее продукцию поликлональных антител с экспериментальной иммунной сывороткой; черные столбцы-А49о, характеризующее отсутствие сигнала преиммунной (контрольной) сыворотки того же животного

Делая вывод о результатах эксперимента по ДНК-доставке TNF-a человека в ткани крыс и кролика, можно, прежде всего, отметить возможность использования предложенного нами дизайна генно-инженерных конструкций для получения внутриклеточной экспрессии белка in vivo, при условии, что детекция продукта осуществляется по уровню продукции поликлональных антител против него. Однако следует отметить высокий разброс получаемых результатов, что, в конечном итоге, снижает перспективность ДНК-иммунизация как метода, альтернативного типовой иммунизации рекомбинатным белком.

Продукция антител, вызванная инъекциями животным конструкции pCD-TNF3, которая рассчитана на внутриклеточную продукцию белка, в ряде случаев была выше, чем продукция антител, вызванная инъекциями рекомоинантного антигена. Продукция поликлональных антихел после инъекций животным конструкции pCD-TNF4, дизайн которой предполагал секрецию кодируемого гена in vivo, отличалась большей стабильностью, но в ряде случаев показывала эффект несколько худший по сравнению с pCD-TNF3 В качестве возможного приема, позволяющего минимизировать риск неудачи при ДНК-иммунизации целесообразно планировать одновременное введение ДНК конструкций обоих типов.

Выводы

1. Созданы генно-инженерных конструкции для доставки растворимого TNF-а человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме, в том числе, для проведения ДНК-иммунизации. Впервые показана возможность доставки TNF-a в организм млекопитающих с помощью плазмидных конструкций.

2. Получен гуморальный ответ против синтезированного in vivo TNF-a человека, доставляемого с помощью ДНК-иммунизации. Подтверждено ранее сделанное наблюдение о двухфазной динамике сероконверсии специфических антител в ответ на ДНК-иммунизацию у кролика.

3. На основе Е. coli получен новый штамм-продуцент TNF-a человека и предложена методика ренатурации TNF из телец включения.

4. В результате экспрессии в клетках Drosophila melanogaster получен экстраклеточный домен высокоаффинного рецептора TNF-a типа 1. Показано связывание рецептора и лиганда in vitro, что подтверждает нативностъ структуры TNF-a, приобретенной в результате ренатурации.

5. Показана перспективность использования поликлональных аффинноочищенных антител против TNF для исследования клинических материалов, в том числе, сывороток больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Шевелев А.Б. Использование рекомбинантной технологии для изучения взаимодействия рецепторов и их лигандов на примере TNF и TNFR1. // Тезисы. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, стр. 72.

2. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В Г., Домогатский С.П., Шевелев А.Б Новый штамм-продуцент фактора некроза опухолей человека на основе Е coli // Биоорганическая химия. 2005, 5, С 1-8

3. Суровцева Е.В., Аникеева Н., Сикулев Ю., Шевелев А.Б. Получение растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека путем экспрессии в клетках Drosophila. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005, 3, С 34-38

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 29.09.05 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

к

РНБ Русский фонд

2006г4 10029

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суровцева, Елена Владимировна

9

2.1. Функции TNF в клетке

2.1.1. Лиганды и рецепторы семейства TNF. Растворимая и IО трансмембранная форма TNF

2.1.2. Схема внутриклеточной передачи сигналов, осуществляемая с 12 помощью TNF-R. Внутриклеточные каскадные реакции, запускаемые TNF

2.1.2.1. Передача сигналов с помощью TNF-R

2.1.2.1.1. Передача цитотоксического сигнала с участием NF-kB

2.1.2.1.2. Передача цитотоксического сигнала с участием АР

2.1.2.1.3. Эффекторный механизм апоптоза

2.1.2.2. Альтернативные пути передачи цитотоксического сигнала, 16 опосредованные RIP

2.1.2.3. Передача сигналов с помощью TNF-R

2.1.2.3.1. TNF-R2 опосредованная активация NF-кВ и JNK

2.1.2.3.2. Активация апоптоза с помощью TNF-R

2.1.3. Пространственная структура TNF-a и TNF-p. Остатки, 19 ответственные за связывание с рецептором

2.1.3.1. Пространственная структура мономерной формы TNF

2.1.3.2. Пространственная структура тримерной формы молекулы 20 TNF. Аминокислотные остатки, принимающие участие в поддержании пространственной структуры молекулы TNF

2.1.3.3. Структура комплекса TNF-TNF-R. Аминокислотные остатки 23 в молекуле TNF, участвующие в образовании связей с рецептором

2.2. Роль TNF-a в быстрых межклеточных взаимодействиях, 24 запускаемых инвазией

2.2.1. Участие периферических макрофагов и NK-клеток в 24 воспалительных реакциях быстрого типа. Thl и Th2 лимфокины

2.2.2. Участие клеток макрофагального ряда (дендритные клетки) в 31 неклональных воспалительных реакциях быстрого типа. Переход иммунного ответа в генерализованную форму. TNF-a и антиген-презентирующие клетки

2.2.3. Деструктивное действие TNF-a при генерализованном ответе. 35 Роль TNF в заболеваниях, вызывающих гранулематоз

2.3. ДНК-иммунизация, как новый исследовательский инструмент

2.3.1. Принцип ДНК-иммунизации и реакция организма на нее

2.3.1.1. В-клеточный иммунный ответ

2.3.1.2. Клеточный ответ

2.3.1.2.1. Образование CTL

2.3.1.2.2. Т-хелперный ответ

2.3.2. Структура ДНК-конструкций, используемых для иммунизации 44 2.3.2.1. Гистоспецифичный промотор MSA и его регуляция

2.3.3. Особенности ДНК-иммунизации при использовании животных 48 различных видов

2.3.3.1. ДНК-иммунизация мышей и крыс

2.3.3.2. ДНК-иммунизация кроликов

2.3.3.3. Использование обезьян в качестве модельных животных

2.3.4. Методы введения ДНК в организм

2.3.4.1. Внутримышечное введение

2.3.4.2. Введение ДНК с помощью безъыгольного инъектора

2.3.4.3. Бомбардировка коллоидными частицами

2.3.4.4. Введение иммунизирующей ДНК с помощью катионных 55 липосом

2.3.5. Выбор ткани для введения ДНК

2.3.6. Перспективные направления развития ДНК-иммунизации и 58 генотерапии

3. Материалы и методы

3.1. Методы работы с культурами клеток эукариот

3.2. Генноинженерное конструирование 62 3.2.3. Сборка генно-инженерных конструкций

3.3. Культивирование штаммов-продуцентов на основе E.coli и 67 очистка рекомбинантных белков

3.4. Иммунизация животных

3.5. Методы иммунологической детекции

4. Результаты и обсуждение

4.1. Получение TNF-a и тестирование его активности in vitro

4.1.2. Экспрессия TNF-R1 в клетках Drosophila melanogaster

4.2 Получение поликлональной антисыворотки против TNF-a 92 человека. Использование аффинноочищенных антител для тестирования продукции TNF-a в сыворотках больных склерозом

4.3. ДНК-доставка TNF-a на животной модели in vivo с детекцией 97 результата по выработке антител

4.3.1. ДНК-иммунизация крыс

4.3.2. ДНК-иммунизация кролика

5.Выводы

Список сокращений а.о. - аминокислотный остаток

ДАБ - 3,3 'диаминобензидин

ИПТГ - изопропил р-тиогалактозид

ЬСЖ — культур альная жидкость мин - минута

ОФД - ортофенилендиамин т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов

ТХУ — трихлоруксусная кислота ч — час

Ag - антиген

А — оптическая плотность

BAS - боковой амиотрофический склероз

BrCN - цианбромид

BSA - бычий сывороточный альбумин

CD - поверхностный клеточный маркер

CMV — цитомегаловирус

CTL - цитотоксические Т-лимфоциты (cytotoxic T-lymphocyte)

DOPE - диолеил L-a-фосфатидилэтаноламин

DOSPA - диолеилспермидинфосфатидиламин

DOT АР - 1,2-диолеил-З-триметил-аммоний-пропан DOTMA -N-[ 1 -(2,3-диолеилокси)пропил]-М,Ы,Ытриметиламмонийхлорид

Ed-TNFRl - экстраклеточный домен рецептора TNF типа I ELISA - тведофазный иммунный анализ (enzyme linked immune sorbent analisys)

GFP - green fluorescence protein

HBs-Ag - малый поверхностный антиген гепатита В

HSA - человеческий сывороточный альбумин

IFN - интерферон

Ig - иммуноглобулин

IL — интерлейкин

LPS - липополисахарид

LT — лимфотоксин mAb — моноклонапьные антитела

МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex) MSA — мышиный сывороточный альбумин MS — рассеянный склероз NF-kB - ядерный фактор кВ NFAT - ядерный фактор AT Ni-NTA - Ni-нитрилтетраацетат лиганд-группа PBL - лимфоциты периферической крови (peripheral blood lymphocyte) РВМС - моноциты периферической крови (peripheral blood mononuclear cell) PBS - забуференный физиологический раствор

RT-PCR - полимеразная цепная реакция в.реальном времени (real time PCR)

SDS-ПААГ- денатурирующий электрофорез в присутствии SDS Term - терминатор транскрипции

TNF-R - рецептор фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor receptor)

TNF-a - фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях"

Экстраклеточные белковые медиаторы большинства важнейших процессов в организме человека и млекопитающих функционируют в низких физиологических концентрациях. При этом высокая биологическая активность ростовых факторов и лимфокинов в отношении клеток организма, как правило, компенсируется их стремительной деградацией. Высокая скорость распада и синтеза ростовых факторов приводит к формированию квазистационарных концентрационных градиентов вблизи клеток-продуцентов, которые, по-видимому, являются наиболее естественным типом распределения ростовых и сигнальных факторов в организме. Создание именно таких устойчивых во времени градиентов является желательным условием тестирования действия лимфокинов и ростовых факторов, однако эта задача технически не реализуема при введении испытуемых белков в систему в форме готовой субстанции.

В этой связи более физиологичным методом доставки ростовых факторов представляется экспрессия клеточных медиаторов собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении в отдельные клетки животного генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. В настоящее время стратегия борьбы со многими вирусными и онкологическими заболеваниями заключается во введении в организм человека ДНК, несущей ген соответствующего лимфокина [1]. В этом случае уровень внутриклеточной экспрессии определяется, прежде всего, силой промотора, а также возможностью доставки ДНК к тканям-мишеням.

Экспрессирующийся in vivo чужеродный белок может восприниматься организмом в качестве антигена. При этом на него могут вырабатываться антитела. Выявление таких антител, легко доступное в техническом отношении, может служить доказательством факта доставки ДНК в заданный участок ткани-мишени.

TNF-a известен как цитокин макрофагапьного происхождения [1]. Он опосредует ряд местных и системных эффектов и может рассматриваться в качестве противоракового терапевтического агента [2].

Повышенный по сравнению с нормой уровень TNF-a встречается при ряде заболеваний как инфекционной (туберкулез), так и аутоиммунной (склероз, саркоидоз, идиопатическая нейтропения) этиологии. Его использование в качестве маркера для тестирования сывороток больных ставит важную задачу получения антител против этого клеточного медиатора.

TNF играет важную роль в реакциях местного иммунитета, причем его действие носит локальный характер. В этой связи физиологичным методом доставки этого ростового фактора представляется его индуцированная экспрессия собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении животным генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. Тестирование эффективности доставки по продукции специфических поликлональных антител в случае ДНК-доставки является наиболее доступным.

В связи с изложенным выше в качестве цели настоящей работы рассматривалась разработка дизайна генноинженерных конструкций для доставки растворимого TNF-a человека в секреторной и внутриклеточной форме в клетки животных.

Тестирование эффективности доставки TNF-a по продукции специфических поликлональных антител против антигена, выработанного в организме животного, требовало разработки антительной тест-системы с высоким уровнем чувстивительности. В связи с этим, в работе были поставлены следующие научные и практические задачи:

1) Создание оптимизированного полусинтетического гена TNF-a человека и конструирование на его основе штамма на основе Е. coli> обеспечивающего высокий уровень продукции целевого белка;

2) Разработка метода очистки и ренатурации TNF-a из телец включения, с целью дальнейшего использования рекомбинантного белка в качестве антигена для иммунизации и стандарта для калибровки иммунохимических тест-систем;

3) Получение аффинно очищенных кроличьих поликлональных антител против TNF-a человека и создание на их основе иммунохимических тест-систем в вариантах «непрямой иммуноферментный анализ» и «иммуноблоттинг»;

4) Создание конструкций для доставки TNF-a человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме;

5) Изучение функциональности полученных конструкций при введении животным;

6) Изучение свойств аффинноочищенных антител против TNF-a человека при иммунохимическом исследовании сывороток больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом.

2. Литературный обзор

2.1. Функции TNF в клетке

Изучая развитие раковых опухолей у животных, Old [4] обнаружил белок, в присутствии которого происходил геморрагический некроз трансформированных клеток. Этот фактор был назван фактором некроза опухолей - TNF. Beutler и соавт. [5] показали идентичность нового фактора и открытого ранее белка-кахетина.

В последующие годы было обнаружено целое семейство структурно различающихся, но функционально схожих белков - так называемых TNFлигандов. В норме белки этого семейства участвуют в дифференцировке различных тканей, в частности клеток лимфоидной, костной и нервной тканей, регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций, а также пролиферации и апоптозе клеток. Запуск клеточной гибели является одной из основных функций многих членов этого семейства, а для некоторых, по-видимому, и единственной. Среди TNF-лигандов именно TNF-a участвует в наибольшем количестве межклеточных реакций, выполняя роль важнейшего медиатора в передаче сигналов между клетками. Передача цитотоксического сигнала от TNF-a внутрь клетки опосредована TNF-рецепторами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суровцева, Елена Владимировна

5.Выводы

1. Созданы генно-инженерные конструкции для доставки растворимого TNF-a человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме, пригодные для проведения ДНК-иммунизации. Впервые показана возможность доставки TNF-a в организм млекопитающих с помощью плазмидных конструкций.

2. Получен гуморальный ответ против синтезированного in vivo TNF-a человека, доставленного с помощью плазмидных ДНК. Подтверждено ранее сделанное наблюдение о двухфазной динамике сероконверсии специфических антител в ответ на ДНК-иммунизацию у кролика.

3. На основе Е. coli получен новый штамм-продуцент TNF-a человека и предложена методика ренатурации TNF-a из телец включения.

4. В результате экспрессии в клетках Drosophila melanogaster получен экстраклеточный домен высокоаффинного рецептора TNF-a типа 1. Показано связывание рецептора и лиганда in vitro, что подтверждает нативность структуры TNF-a, приобретенной в результате ренатурации.

5. Показана перспективность использования поликлональных аффинноочищенных антител против TNF-a для исследования клинических материалов, в том числе, уточнения диагноза у больных рассеянным склерозом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суровцева, Елена Владимировна, Москва

1. Bartlett E.J., Cull V.S., Mowe E.N., Mansfield J.P., James C.M. // Optimization of Naked DNA Delivery for Interferon Subtype Immunotherapy in Cytomegalovirus Infection // Biol Proced Online. 2003. V. 5. P.43-52

2. Pennica D., Nedwin G.,Hayflick J., Seeburg P., Derynck R., Palladino M., Kohr W., Aggarwal B.B., Goeddel D.E. // Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin // Nature. 1984. V. 312. P. 724-729.

3. Darzynkiewicz Z., Williamson В., Carswell E.A., Old L.J.// Cell cycle-specific effects of tumor necrosis factor // Cancer Res. 1984; 44(1): 83-90.

4. Beutler B.A., Milsark I.W., Cerami A.J. // Cachectin/tumor necrosis factor: production, distribution, and metabolic fate in vivo-II J. Immunol. 1985; 135(6): 3972-3977.

5. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M.E. // Apoptosis signaling by death receptors // Eur. J. Biochem. 1998; 254(3): 439-459.

6. Ashkenazi A., Dixit V.M. // Death receptors: signaling and modulation // Science. 1998; 281(5381): 1305-1308.

7. Brojatsch J., Naughton J., Rolls M.M., Zingler K., Young J.A. // CAR1, a TNFR-related protein, is a cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis // Cell. 1996; 87(5):845-855.

8. Smith C.A., Farrah Т., Goodwin R.G. //The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death // Cell. 1994;76(6):959-962.

9. Tartaglia L.A., Ayres T.M., Wong G.H., Goeddel D.V. // A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death // Cell. 1993;74(5):845-853.

10. Setareh M., Schwarz H., Lotz M. // A mRNA variant encoding a soluble form of 4-IBB, a member of the murine NGF/TNF receptor family // Gene. 1995; 164(2):311-315.

11. Gearing A.J., Beckett P., Christodoulou M., Churchill M., Clements J., Davidson A.H., Drummond A.H., Galloway W.A., Gilbert R., Gordon J.L., //

12. Processing of tumour necrosis factor-alpha precursor by metalloproteinases // Nature. 1994;370(6490):555-557.

13. Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V., Karin M. // Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death // Cell. 1996;87(3):565-576.

14. Jiang Y., Woronicz J.D., Liu W., Goeddel D.V. // Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling by silencer of death domains // Science. 1999;283(5401):543-546.

15. Park A., Baichwal V.R. // Systematic mutational analysis of the death domain of the tumor necrosis factor receptor 1-associated protein TRADD // J Biol Chem. 1996;271(16):9858-9862.

16. Malinin N.L., Boldin M.P., Kovalenko A.V., Wallach D. // MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB induction by TNF, CD95 and IL-1 // Nature. 1997;385(6616):540-544.

17. Woronicz J.D., Gao X., Cao Z., Rothe M., Goeddel D.V. //.I-kappaB kinase-beta: NF-kappaB activation and complex formation with I- kappaB kinase-alpha and NIK // Science. 1997;278(5339):866-869.

18. Yeh T.S., Li S.N., Wu C.J., Liu S.T., Meng C.L., Chang Y.S. // Sequence variations between two Epstein-Barr virus LMP 1 variants have no effect on the activation of NF-kappaB activity // DNA Cell Biol. 1997; 16( 11): 13111319.

19. Nishitoh H., Saitoh M., Mochida Y., Takeda K., Nakano H., Rothe M., Miyazono K., Ichijo H. // ASK1 is essential for JNK/SAPK activation by TRAF2.// Mol Cell. 1998;2(3):389-395.

20. Hoeflich K.P., Yeh W.C., Yao Z., Мак T.W., Woodgett J.R. // Mediation of TNF receptor-associated factor effector functions by apoptosis signal-regulating kinase-1 (ASK1)//Oncogene. 1999;18(42):5814-5820.

21. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D. // Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptor-induced cell death // Cell. 1996;85(6):803-815.

22. Liu X., Li P., Widlak P., Zou H., Luo X., Garrard W.T., Wang X. // The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(15):8461-8466.

23. Halenbeck R., MacDonald H., Roulston A., Chen T.T., Conroy L., Williams L.T. // CP AN, a human nuclease regulated by the caspase-sensitive inhibitor DFF45 // Curr Biol. 1998;8(9):537-540.

24. McCarthy J.V., Ni J., Dixit V.M. // RIP2 is a novel NF-kappaB-activating and cell death-inducing kinase // J Biol Chem. 1998;273(27): 16968-16975.

25. Baker S.J., Reddy E.P. // Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily// Oncogene. 1998; 17(25):3261-3270.

26. Sanz L., Sanchez P., Lallena M.J., Diaz-Meco M.T., Moscat J. // The interaction of p62 with RIP links the atypical PKCs to NF-kappaB activation //EMBOJ. 1999;18(11):3044-3053.

27. Lin Y., Devin A., Rodriguez Y., Liu Z.G. //. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis // Genes Dev. 1999; 13( 19):2514-2526.

28. Martinon F., Holler N., Richard C., Tschopp J. // Activation of a pro-apoptotic amplification loop through inhibition of NF-kappaB-dependent survival signals by caspase-mediated inactivation of RIP // FEBS Lett. 2000;468(2-3): 134-136.

29. Grell M., Becke F.M., Wajant H., Mannel D.N., Scheurich P.11 TNF receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1 //Eur J Immunol. 1998;28(l):257-263.

30. Cheng G., Baltimore D. // TANK, а со-inducer with TRAF2 of TNF- and CD 40L-mediated NF-kappaB activation // Genes Dev. 1996;10(8):963-973.

31. Rothe M., Xiong J., Shu H.B., Williamson K., Goddard A., Goeddel D.V. // I-TRAF is a novel TRAF-interacting protein that regulates TRAF-mediated signal transduction // Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(16):8241-8246.

32. Pomerantz J.L., Baltimore D. // NF-kappaB activation by a signaling complex containing TRAF2, TANK and TBK1, a novel IKK-related kinase //EMBOJ. 1999; 18(23 ):6694-6704.

33. Carpentier I., Beyaert R. // TRAF1 is a TNF inducible regulator of NF-kappaB activation//FEBS Lett. 1999;460(2):246-250.

34. Song H.Y., Rothe M., Goeddel D.V. // The tumor necrosis factorinducible zinc finger protein A20 interacts with TRAF1/TRAF2 and inhibits

35. NF-kappaB activation // Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(13):6721-6725.112

36. Lee S.Y., Lee S.Y., Choi Y. // TRAF-interacting protein (TRIP): a novel component of the tumor necrosis factor receptor (TNFR)- and CD30-TRAF signaling complexes that inhibits TRAF2-mediated NF-kappaB activation // J Exp Med. 1997;185(7): 1275-1285.

37. Tartaglia L.A., Pennica D., Goeddel D.V. // Ligand passing: the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDaTNF receptor// J Biol Chem. 1993;268(25):18542-18548.

38. Pinckard J.K., Sheehan K.C., Schreiber R.D. // Ligand-induced formation of p5 5 and p75 tumor necrosis factor receptor heterocomplexes on intact cells // J Biol Chem. 1997;272( 16): 10784-10789.

39. Sidhu R.S., Bollon A.P. // Tumor necrosis factor analogs: identification of functional domains // Anticancer Res. 1989;9(6): 1569-1576.

40. Munder M., Mallo M., Eichmann K., Modolell M. // Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation // J Exp Med. 1998; 187( 12):2103-2182.

41. Brevington R., Chatterji M., Zoubin M., Miranda R.N., Norimatsu M., Shnyra A. //IFN-y independent autocrine cytokine regulatory mechanism in reprogramming of macrofage responses to bacterial lipopolysaccharide // J Immunol. 2001;167:392-398.

42. Byrne A., Reen D.J. // Lipopolysaccharide induces rapid production of IL-10 by monocytes in the presence of apoptotic neutrophils // J Immunol. 2002; 168(4): 1968-1977.

43. Gerosa F., Baldani-Guerra В., Nisii C., Marchesini V., Carra G., Trinchieri G. // Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells // J Exp Med. 2002;195(3):327-333.

44. Bertier R., Rizzitelli A., Martinon-Ego C., Laharie A.M., Collin V., Chesne S., Marche P.N. // Fibroblasts inhibit the production of interleukin — 12p70 by murine dendritic cells // Immunol. 2003;108:391-400.

45. Wesa A.K., Galy A. // Regulation of T cell cytokine production by dendritic cells generated in vitro from hematopoietic progenitor cells // Cell Immunol. 2001;208(2):115-124.

46. Faehalls G., Stevens L., Bezuidenhout J., Amphlett G.E., Duncan K., Bardin P., Lukey Pt. // Distribution of IFN-y, IL-4 and TNF-a protein and

47. CD8 T cells producing IL-12p40 mRNA in human lung tuberculous granulomas // Immunol. 2002;105:325-335.

48. Ormerod L.P. // Tuberculosis and anti-TNF-alpha treatment // Thorax. 2004;59(11):921

49. Lee C.H., Choi Y.H., Yang S-H., Chang W.L., Sang J.H., Sung Y.C. // Hepatitis С Virus Core protein inhibits interleukin 12 and notric oxideproduction from activated macrofages // J. Virol. 2001;279:271-279.

50. Martino G., Consiglio A., Franciotta D.M., Corti A., Fillipi M., Vanderbroeck K., Sciacca F.L., Comi G., Grimaldi L. // Tumor necrosis factor a and its raceptors in replapsing-remitting multiple sclerosis // J Neurol. Sci. 1997;152:51-61.

51. Davis H.L., Michel M.L., Whalen R.G. // DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis В surface antigen and high levels of circulating antibody // Hum Mol Genet. 1993;2( 11): 1847-1851.

52. Davis H.L., Michel M.L., Mancini M., Schleef M., Whalen R.G. // Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis В virus surface antigen // Vaccine. 1994; 12(16): 1503-1509.

53. Cox M., Maitland N., Scully С. II Human herpes simplex-1 and papillomavirus type 16 homologous DNA sequences in normal, potentially malignant and malignant oral mucosa // Eur J Cancer В Oral Oncol. 1993 ;29B(3) :215-219.

54. Corny R.M., Widera G., LoBuglio A.F., Fuller J.T., Moore S.E., Barlow D.L., Turner J., Yang N.S., Curiel D.T. // Selected strategies to augment polynucleotide immunization// Gene Ther. 1996;3(l):67-74.

55. Xiang Z.Q., Ertl H.C. // A simple method to test the ability of individual viral proteins to induce immune responses // J Virol Methods. 1994;47(1-2):103-116.

56. Fynan E.F., Ewert D.L., Block T.M. // Latency and reactivation of Marek's disease virus in В lymphocytes transformed by avian leukosis virus // J Gen Virol. 1993;74 ( Pt 10):2163-2170.

57. Sedegah M., Hedstrom R., Hobart P., Hoffman S.L. // Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein // Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91(21):9866-9870.

58. Geissler E.K., Wang J., Fechner J.H. Jr., Burlingham W.J., Kiiechtle S.J. // Immunity to MHC class I antigen after direct DNA transfer into skeletal muscle//J Immunol. 1994; 152(2):413-421.

59. Lee A.H., Suh Y.S., Sung J.H., Yang S.H., Sung Y.C. // Comparison of various expression plasmids for the induction of immune response by DNA immunization // Mol Cells. 1997;7(4):495-501.

60. Wu К-J., Wilson D.R., Shin C., Darlington G. // The transcription factor HNF1 acts with C/EBPa to synergistically activate the human albumin promoter through a novel domain // JBC 1994;269:1177-1182.

61. Ни C., Perlmutter D.H. // Cell-specific involvement of HNF-lbeta in alpha(l)-antitrypsin gene expression in human respiratory epithelial cells // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;282(4): 757-65.99.

62. Pastore L., Morral N., Zhou H., Garcia R., Parks R.J., Kochanek S., Graham F.L., Lee В., Beaudet A.L. // Use of a liver-specific promoter reduces immune response to the transgene in adenoviral vectors // Hum Gene Ther. 1999; 10(11):1773-1781.

63. Izban M.G., Papaconstantinou J. // Cell-specific expression of mouse albumin promoter. Evidence for cell-specific DNA elements within the proximal promoter region and cis-acting DNA elements upstream of—160 // J Biol Chem. 1989 5;264(16):9171-9179.

64. Acsadi G., Dickson G., Love D.R., Jani A., Walsh F.S., Gurusinghe A., Wolff. // Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA constructs // Nature. 1991;352(6338):815-818.

65. Yim T.J., Tang S., Andino R. // Poliovirus recombinants expressing hepatitis В virus antigens elicited a humoral immune response in susceptible mice // Virology. 1996;218(l):61-70.

66. Eisenbraun M.D., Fuller D.H., Haynes J.R. // Examination of parameters affecting the elicitation of humoral immune responses by particle bombardment-mediated genetic immunization // DNA Cell Biol. 1993 ;12(9):791-797.

67. Chowdhury P.S., Gallo M., Pastan I. // Generation of high titer antisera in rabbits by DNA immunization // J Immunol Meth. 2001;249:147-154.

68. Gardsvoll H., Solberg H., Dano K., Hoyer-Hansen G. // Generation of high-affinity rabbit polyclonal antibodies to the murine urokinase receptor using DNA immunization //J Immunol Meth. 2000;234:107-116.

69. Wolff L., Koller R. // Regions of the Moloney murine leukemia virus genome specifically related to induction of promonocytic tumors // J Virol. 1990;64(1):155-160.

70. Jiao S., Moberly J.B., Schonfeld G. // Editing of apolipoprotein В messenger RNA in differentiated Caco-2 cells // J Lipid Res. 1990;31 (4):695-700.

71. Davis H.L., Jasmin B.J. // Direct gene transfer into mouse diaphragm // FEBS Lett. 1993;333(1-2): 146-150.

72. Danko I., Wolff J.A. // Direct gene transfer into muscle // Vaccine. 1994;12( 16): 1499-1502.

73. Whalen R.G., Harris J.B., Butler-Browne G.S., Sesodia S. // Expression of myosin isoforms during notexin-induced regeneration of rat soleus muscles // Dev Biol. 1990;141(l):24-40.

74. Nabel E.G., Gordon D., Yang Z.Y., Xu L., San H., Plautz G.E., Wu B.Y.,

75. Gao X., Huang L., Nabel G.J. // Gene transfer in vivo with DNA-liposome120complexes: lack of autoimmunity and gonadal localization // Hum Gene Ther. 1992;3(6):649-656.

76. Furth E.E., Sprecher H., Fisher E.A., Fleishman H.D., Laposata M. // An in vitro model for essential fatty acid deficiency: HepG2 cells permanently maintained in lipid-free medium // J Lipid Res. 1992;33(11): 1719-1726.

77. Pecorino L.T., Lo D.C. // Having a blast with gene transfer // Curr Biol. 1992;2(l):30-32.

78. Tranchant I., Thompson В., Nicolazzi C., Mignet N., Scherman D. // Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids // J Gene Med. 2004 ;6:24-35.

79. Ahearn A., Malone R. // Models of cationic liposome mediated transfection // Gen Ther. Mol. Biol. 1999;4:159-170.

80. Gregoriadis G., Saffie R., de Souza J.B. // Liposome-mediated DNAvaccination // FEBS Lett. 1997;402(2-3): 107-110.121

81. Liu Y., Liggitt D., Zhong W., Tu G., Gaensler K., Debs R. // Cationic liposome-mediated intravenous gene delivery // J Biol Chem. 1995;270(42):24864-24870.

82. Davis H.L., Millan C.L., Watkins S.C. // Immune-mediated destruction of transfected muscle fibers after direct gene transfer with antigen-expressing plasmid DNA//Gene Ther. 1997;4(3):181-188.

83. Fynan E.F., Webster R.G., Fuller D.H., Haynes J.R., Santoro J.C., Robinson H.L. // DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations // Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90(24): 11478-11482.

84. Whalen E., Donnelly T.A., Naughton G., Rheins L.A. // The development of three-dimensional in vitro human tissue models // Hum Exp Toxicol. 1994;13(12):853-859.

85. Davis H.L., Michel M.L., Mancini M., Schleef M., Whalen R.G. // Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis В virus surface antigen // Vaccine. 1994; 12(16): 15031509.

86. Tada H., Maron D.J., Choi E.A., Barsoum J., Lei H., Hie Q., Liu W„ Ellis L., Moscioni A.D., Tazelaar J., Fawell S., Qin X., Propert K.J., Davis

87. A., Fraker D.L., Wilson J.M., Spitz F.R. // Sistemic IFN-p gene therapy results in long-term survival in mice established colorectal liver metastases Hi Clin Invest. 2001;108:83-95.

88. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular cloning // Eds. Cold Spring Harbor Laboratory press. New York. 1989.

89. Athenaes // Protein refolding manual: http://www.athenaenvironrnental.com/Refolding%20Kit%20Manual.pdf

90. Merli S, Corti A, Cassani G. // Production of soluble tumor necrosis factor receptor type I in Escherichia coli: optimization of the refolding yields by a microtiter dilution assay. // Analyt. Biochem.;1995;230:85-91.

91. Шингарова JI.H., Сагайдак Л.Н., Турецкая P.JI., Беркова Н.П., Коробко В.Г // Мутанты факторв некроза опухолей: получение и некоторые свойства// Биоорган, химия.; 1997;23:428-433.

92. Патрушев Л.И. // Экспрессия генов. М.: Наука, 2000.

93. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Беркова Н.П., Коробко В.Г // Взаимодействие анти-TNF-a моноклональных антителЕ7Н2с мутантными и гибридными белкамиБиоорган. химия.;1997;23:428-433.

94. Кэролл С.Б., Логон А // Получение и очистка поликлональных антител к гетерологичным фрагментам гибридных белков, содержаих р-галактазидазу. В: Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир, 1989.

95. Гурвич А.Е. // Получение чистых антител и определение абсолютных количеств антител в сыворотках при помощи антигенов, фиксированных на целлюлозе. // В: Современные методы в биохимии. //М.: Медицина, 1964.

96. Milatovich A., Song К., Heller R. А. // Tumor necrosis factor receptor genes, TNFR1 and TNFR2, on human chromosomes 12 and 1 // Somat. Cell Mol. Genet.; 1991:519-523.

97. Engelmann H., Holtmann H., Brakebusch C. // Antibodies to a solubleform of a tumor necrosis factor (TNF) receptor have TNF-like activity // J.

98. Biol. Chem.; 1990;265:14497-14504.124

99. Cheng J., Liu C., Koopman W. J., Mountz J. D. // J. Immunol.; 1995; 154.- 1239-1245.

100. McTigue M. A., Wickersham J. A., Pinko C. // Crystal structure of the kinase domain of human vascular endothelial growth factor receptor 2: a key enzyme in angiogenesis //Structure Fold Des.;1999;7:319-330.

101. Schneider-Kolsky M. E., Manuelpillai U., Waldron K. // The distribution of activin and activin receptors in gestational tissues across human pregnancy and during labour// Placenta.;2002.;23:294-302.

102. Loetscher H. S., Gentz R. S., Zulauf M. // Recombinant 55-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor. Stoichiometry of binding to TNF alpha and TNF beta and inhibition of TNF activity // J. Biol. Chem.; 1991 ;266:18324-18329.

103. Maroushek Boury N., Bosworth В. Т., Stabel T. J. // Cloning and expression of porcine recombinant soluble tumor necrosis factor receptor 1 // Am. J. Vet. Res.; 1998;59:1317-1322.

104. Sato Y., Nio Y., Omori H., Inoue Y., Hirahara N., Sasaki S., Tamura K. // Human proinsulin gene-transfected Chinese hamster ovary cells secrete immunoreactive insulin // In Vivo. 1999;13(6):535-540.