Цитоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных системными аутоиммунными заболеваниями в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц

Сабирзянова, Алсу Зуфаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных системными аутоиммунными заболеваниями в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных системными аутоиммунными заболеваниями в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц"

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

На правах рукописи

005009316

Сабирзянова Алсу Зуфаровна

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ АНТИТЕЛ К ДНК СЫВОРОТОК КРОВИ БОЛЬНЫХ СИСТЕМНЫМИ АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В КУЛЬТУРЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

03.01.04 - биохимия

2 ФЕВ гш

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2012

005009316

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцс

Невзорова Татьяна Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мустафин Илынат Ганиевич

кандидат биологических наук Уразов Наиль Гумерович

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Казанская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Казань)

Защита состоится « 16 » февраля 2012 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

Автореферат разослан « /3 » января 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор ^г? ^^ Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные заболевания (АИЗ) - это заболевания, возникающие вследствие гиперактивности иммунной системы, дисбаланса во взаимодействии ее звеньев и нарушения толерангаосга к молекулам собственного организма (Ройт, 2007).

Общим признаком АИЗ является гиперглобулинемия и избыточное образование широкого спектра ААТ (Насонов и Сура, 1988). Аутоантитела (ААТ) -это антитела (AT), способные взаимодействовать хотя бы с одним аутоантигеном (антигеном собственных тканей).

При некоторых аутоиммунных патологиях, а также других заболеваниях и физиологических состояниях, таких как стресс, беременность наблюдается повышение содержания в крови больных аутоантител класса IgG к нативной ДНК (IgG-AAT к нДНК), происхождение и биологическая роль которых на сегодняшний день остаются невыясненными.

Системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА) - это хронические тяжелые системные аутоиммунные заболевания с неясной этиологией и обширной картиной иммунопатогенеза.

Характерное повышение уровня IgG-AAT к нДНК в крови больных СКВ является одним из диагностических критериев данного заболевания. Российскими учеными было обнаружено, что AT к ДНК при СКВ обладают ДНК-гидролизующей активностью (Gabibov et al., 1994).

PA - распространенное АИЗ, поражающее 0,5-2% взрослого населения в работоспособном возрасте 35-55 лет (Каратеев, 2007). Было показано, что приблизительно у 25% пациентов с РА наблюдаются повышенный уровень AT с ДНК-гидролизующей активностью (Suchkov, 2001; Gabibov et al., 2006).

СКВ и РА снижают качество и продолжительность жизни населения, поэтому входят в число важных биомедицинских и социальных проблем современности. К сожалению, с каждым годом число больных СКВ и РА возрастает (Арлеевская и др., 2010; Невзорова и Винтер, 2006).

Вероятно, развитее АИЗ является следствием сочетания многих факторов, среди которых необходимо выделил, наследственную предрасположенность, гормональный статус человека и негативное воздействие физико-химических и биологических факторов окружающей среды. Согласно литературным данным, риск развития аутоиммунной патологии у родственников больных АИЗ в 2 раза выше, чем в остальной популяции (Silman and Pearson, 2002). Вместе с тем ранняя диагностика СКВ и РА является сложной

задачей, так как симптомы часто неспецифичны и могут наблюдаться при широком спектре как ревматических, так и неревмаггическкх заболеваний.

В связи с этим важной задачей биохимии является разработка подходов и методов диагностики, прогнозирования течения патологического процесса, контроля эффективности комплексной терапии и мероприятий профилактики АИЗ.

Для решения поставленной проблемы необходим поиск и анализ маркера, обладающего свойствами, специфичными для разных АИЗ, и отражающего изменение иммунного статуса человека задолго до развитая полномасштабной картины патологического аутоиммунного процесса

В ряде работ показано, что активность АИЗ (в частности, СКВ) ке всегда коррелирует с уровнем ААТ к ДНК (Villalta et al., 2009; Becker-Merok et al-, 2006). У многих пациентов с СКВ в период устойчивой ремиссии заболевания и отсутствии клинического синдрома сохраняется высокий уровень ААТ к ДНК по сравнению с нормой. Кроме того, , повышенный уровень ААТ к ДНК наблюдается и при других АИЗ, например, РА с клиническими проявлениями, отличными от СКВ. Это наводит на мысль, что не только и не столько уровень, а в большей мере свойства ААТ к ДНК определяют течение патологического процесса при развитии АИЗ и могут различаться при разнообразных аутоиммунных патологиях.

ААТ к ДНК, вероятно, являются участниками патологического процесса, но их роль в развитии и течении СКВ, РА и других АИЗ представляется исследователям неоднозначной.

Большинство авторов поддерживают мнение о патогенетической роли гетерогенной популяции ДНК-связывающих и ДНК-гидролюующих ААТ класса IgG в аутоиммунитете (Reefinan et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al, 2007; Kowal et al., 2004; Невзорова, 2005). Но не исключено, что ААТ к нДНК, как часть пула естественных ААТ, в норме выполняют защитную функцию, способствуя удалению трансформированных и пораженных вирусами клеток, аутоантигенов, образующихся при разрушении тканей, и поддерживая гомеостаз организма (Полетаев и Чурилов, 2009).

В исследованиях последних лет показано, что некоторые ААТ к ДНК способны не только связывать растворимые антигены и рецепторы на поверхности клеток, но и проникать через мембрану внутрь клеток, взаимодействовать с органоидами и локализоваться в ядре, влияя на метаболические процессы (Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Argüelles, 2006; Jang et al., 2009).

кровотоке, что часто наблюдается при СКВ и является, по крайней мере, одной их причин утраты аутотолерантности иммунной системы (Lorenz et al, 2000).

И до сих пор среди исследователей нет единого мнения о роли поликлональных IgG-AAT к нДНК в нарушении баланса клеточной гибели при развитии СКВ и РА.

Целью работы явилось исследование влияния антител класса IgG к нативной ДНК при системной красной волчанке и ревматоидном артрите на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.

Были поставлены задачи:

1. Оценить влияние антител к ДНК сывороток крови доноров, больных системной красной волчанкой на стадии обострения и в период ремиссии заболевания, больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro;

2. Изучить зависимость влияния антител класса IgG к нативной ДНК на жизнеспособность и метаболизм мононуклеарных клеток in vitro от заряда молекулы антител и аффинности к нативной ДНК;

3. Оценить генотоксичность и влияние антител класса IgG к нативной ДНК в норме и при системных аутоиммунных заболеваниях на уровень апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.

Научная новизна

Впервые на первичной культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц показано, что патогенетический потенциал поликлональных антител класса IgG к нативной ДНК может быть обусловлен изменением их физико-химических и иммунохимических свойств (суммарною заряда молекулы и аффинности к нативной ДНК) при развитии аутоиммунной патологии и отличается в разных группах системных аутоиммунных заболеваний.

Показано, что высокоочищенные свободные от иммунных комплексов антитела класса IgG к нативной ДНК здоровых доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходное влияние на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых лиц in vitro. Обнаружено, что положительно заряженные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в активной стадии заболевания обладают более выраженной цитотоксичностью и генотоксичносгью по сравнению с антителами доноров.

Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не оказывают значимого влияния на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.

Показано, что наряду с положительно заряженными низкоаффинными

антителами, характерными для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания, высокоаффинные антитела класса IgG к нативной ДНК больных ревматоидным артритом проявляют цитогоксичность и генотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.

Влияние субфракций антител класса IgG к нативной ДНК клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом сходно с влиянием антител больных ревматоидным артритом.

Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК при системных аутоиммунных заболеваниях приводят к повышению уровня апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.

Практическая значимость

Изучение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц способствует более глубокому пониманию фундаментальных основ работы иммунной системы человека в норме и при патологии. Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и могут быть использованы в учебном процессе высших учебных заведений на биологических и медицинских факультетах.

Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в норме, при различных аутоиммунных заболеваниях, а также на разных стадиях активности патологического процесса, проявляющееся в воздействии антител на мононуклеарные клетки здоровых лиц, является специфическим маркером, отражающим изменение иммунного статуса, что может быть использовано для создания тест-системы выявления нарушений работы иммунной системы человека.

Практическая значимость работы определяется возможностью использования субфракций антител класса IgG к нативной ДНК в качестве инструмента, позволяющего диагностировать, прогнозировать развитие и течение, проводить мониторинг состояния больных аутоиммунными заболеваниями и оценивать эффективность терапии с использованием культуры клеггок.

Апробация работы

интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехналогии» (Казань, 2010), I и П Международных научно-практических конференциях «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развитая опухоли» (Казань, 2010,2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим перечнем ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 121 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов с 24 рисунками, 3 таблицами и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы со 131 наименованием.

Положения, выносимые на защиту

1. Механизм цитотоксичности ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих антител класса IgG в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц связан с нарушением структуры ДНК хроматина клеток;

2. Цитотоксичность и генотоксичностъ антител класса IgG к нативной ДНК зависит от их физико-химических и иммунохимических свойств. Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК отражает нарушения в иммунной системе при аутоиммунных заболеваниях;

3. Антитела класса IgG к нативной ДНК вносят отрицательный вклад в развитие аутоиммунных заболеваний, приводя к повышению уровня апоптоза здоровых иммунокомпетентных клеток крови человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение антител класса IgG к нативной ДНК из сывороток крови человека

Выделение и все этапы очистки субфракдий антител класса IgG к нативной ДНК (IgG-AT к нДНК) проводили по ранее разработанной методике (Невзорова, 2005). В работе были использованы образцы крови лиц женского пола: 20 образцов крови здоровых доноров (21-72 лет), 7 - больных СКВ на стадии обострения заболевания (24-76 лет), 8 - больных СКВ в период ремиссии заболевания после гормональной терапии (35-40 лет), 20 образцов крови больных РА (31-79 лет) и 20 -клинически здоровых родственников больных РА (40-65 лет), полученные из медицинских учреждений г. Казани. Диагноз СКВ и РА был поставлен квалифицированными ревматологами.

Исследование влияния IgG-AT к нДНК на клетки in vitro Выделение МНК. лимфоцитов и моноцитов из крови человека Мононуклеарные клетки (МНК) из свежезабранной крови здоровых лиц выделяли по стандартной методике на фиколл-верографине - плотность 1.077 мг/мл (Metcalf et al., 1985). Культивирование клеток с АТ к ДНК

Клетки (МНК/моноциты/лимфоциты) инкубировали в трех повторах в 96- / 24-луночном планшете («Linbro», Шотландия) (37°С, 5% С02) с АТ к ДНК сывороток / субфракциями IgG-AT к нДНК. К 160 мкл клеток (2-104 клеток/лунку) в полной среде RPMI-1640 («Gibco», Шотландия), рН 7,4, содержащей 2 мМ глутамина («Serva», Германия), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 200 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, добавляли АТ до конечной концентрации 1 мкг/мл, подобранной экспериментально. Контрольные образцы вместо АТ к нДНК содержали ФСБ (отрицательный контроль) и панкреатическую дезоксирибонуклеазу I (3 ед/мл - положительный контроль («Serva», Германия)), так как патологические АТ к ДНК проявляют ДНК-гидролизующую активность.

Исследования влияния АТ к нДНК на клетки проводили через 72 часа инкубации при 37°С, 5% С02 - время инкубации было подобрано экспериментально.

Для исследования количества клеточного белка, уровня апоптоза, повреждения ДНК МНК, выделения Н202 моноцитами клетки собирали и 4 раза отмывали от среды холодным ФСБ с последующим центрифугированием (200g, 4 минуты).

Исследование общего количества и количества жизнеспособных клеток По окончании времени культивирования клетки аккуратно собирали при 0°С и оценивали общее количество и количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего (0,3% раствор красителя на ФСБ) в камере Горяева. Определение концентрации клеточного белка

Концентрацию белка в клетках определяли колориметрически (методом Бредфорда). Результаты выражали в нанограммах белка в расчете на одну клетку (Осгерман, 1981).

Определение количества потребления глюкозы клетками Концентрацию глюкозы в среде до и после инкубации клеток определяли колориметрическим глюкозоксидазным методом, используя стандартный коммерческий набор реагентов («Агат», Россия). Результаты поглощения глюкозы клетками выражали в % от содержания глюкозы в полной среде до инкубации. Определение продукции перекиси водорода моноцитами Концентрацию перекиси водорода, выделяемой моноцитами после инкубации с АТ к нДНК, определяли колориметрически по окислению фенолового красного пероксидазой

хрена (Pizato et a)., 2006). Результаты выражали a наномолях в расчете на одну клетку. Оценка повреждения ДНК клеток методом флуоресцентной спасгрофотометрии Степень повреждения ядерной ДНК определяли по изменению интенсивности флуоресценции комплекса этидий бромид-ДНК хроматина клеток (Анисимов и Болотников, 1999).

Оценка уровня повреждения клеточной ДНК методом «ДНК-комет» В микроцентрифужные пробирки с 240 мкл 1% агарозного геля («Fermentas», Канада, ТГ1Л < +42 °С) вносили 60 мкл клеточной суспензии, содержащей не менее 105 клеток. В качестве положительного кошроля для визуализации деградации ДНК использовали клетки, инкубированные 5 минут при -20°С в присутствии 100 мкМ Н202.

На предметное стекло (+37°С), покрытое полилизином («ApexLab», Россия), наносили 60 мкл полученного агарозного геля с клетками, равномерно распределяли и оставляли на 30 минут для полимеризации геля.

После полимеризации геля предметные стекла помещали в лизирующий раствор (10 мМ трис-HCl, pH 10, 2,5 M NaCl, 100 мМ ЭДТА-№2, +4°С, 1% Triton Х-100, 5% ДМСО). Лизис клеток проводили в течение I часа при 4°С, после чего стекла переносили в электрофорезный буфер (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА-№2, рН>13, +4°С) на 20 минут. Электрофорез проводили 20 минут при 1 В/см. По окончании электрофореза стекла переносили в 70% раствор этилового спирта на 15 минут для фиксации, после чего микропрепараты высушивали при 20°С в течение 1-2 часов.

Препараты окрашивали акридиновым оранжевым (20 мкг/мл) 30 минут и анализировали на флуоресцентном микроскопе (AxioScope AI «Carl Zeiss», Германия) с соответствующими фильтрами (возбуждающий фильтр 490 нм, дихроичное зеркало 510, отсекающий фильтр 530 нм), увеличение 40х (Marlin et al, 2004; Hartmann et al, 2004; McKelvey-Martin et al, 1997; Speit et a3,2006; Morley et al., 2006).

При визуальном анализе подсчитывали 30-50 «ДНК-комет», затем их ранжировали на пять условных типов с соответствующим для каждого числовым значением от 0 до 4. Степень поврежденности ДНК при этом выражали как индекс «ДНК-комет» (Ида), определяемый по формуле:

Иж = (0И„+1И1+2И2+ЗИз+4И4)/2, где И0-И4 - число «ДНК-комет» каждого типа, 2 - сумма подсчитанных «ДНК-комет» (Сорочинская и Михайленко, 2008).

Оценка апоптоза клеток методом проточной цитометрии Для оценки апоптоза клеток после инкубации с IgG-AT к нДНК проводили двойное окрашивание клеток по стандартной методике с использованием коммерческого набора реагентов (AnnexinV-FITC Apoptosis detection Kit

«eBioscience», Австрия).

В качестве положительного контроля для индукции апоптоза МНК использовали клетки, культивированные в присутствии 100 мкМ дексамегазона («KRKA», Словения) в течение 72 часов при 37°С.

Степень связывания красителей с клетками анализировали на проточном цитофлуоримеггре «FACSCalibur» («Becton Dickinson», США) с использованием программного обеспечения «BD CellQuest Pro».

Результаты выражали в % относительно отрицательного контроля (ФСБ), принятого за 0%.

Статистическая обработка результатов

Для объективной оценки результатов были использованы непарамеггрические критерии значимости. Из полученных данных изменения жизнеспособности и биохимических показателей клеток вычисляли медиану, 97,5 и 2,5 перцентили, используя стандартный пакет Microsoft Excel 2003.

При визуальной оценке «ДНК комет» и вычислении Иде различия между группами определяли с помощью критерия Крускала-Уоллиса.

При анализе данных проточной цитометрии использовали параметрические критерии значимости - вычисляли среднее значение и стандартное отклонение для каждой выборки (Акберова, 2004 а, б).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

IgG-AT к нДНК ассоциируются с обострением СКВ. Уровень IgG-AT к нДНК в сыворотке крови, как ДНК-связывающих, так и ДНК-гидролизующих (ДНК-абзимов), может отражать состояние пациента: возрастать до и на стадии обострения и снижаться в период ремиссии заболевания. ДНК-гидролизующие AT обнаруживаются на пике активности РА, при медленно прогрессирующем и длительном течении заболевания и, особенно, при раннем развитии серьезных висцеральных нарушений.

В литературе имеются данные, что родственники больных АИЗ также предрасположены к аутоиммунным патологиям, но определение критической точки начала развития заболевания является сложной задачей.

Поэтому более глубокое понимание молекулярных механизмов развития АИЗ позволит решить актуальную проблему поиска динамичного маркера, имеющего диагностическое и прогностическое значение, который можно использовать в качестве важного критерия мониторинга иммунного статуса здоровых лиц, пациентов с аутоиммунным синдромом и лиц, предрасположенных к АИЗ.

На сегодняшний день в литературе существуют противоречивые данные о происхождении, механизме действия, биологической роли IgG-AT к нДНК, что, вероятно, связано с их гетерогенностью. Не исключено, что IgG-AT к нДНК являются одним из молекулярных факторов, играющих важную роль в развитии АИЗ, вмешиваясь в процессы жизнедеятельности иммунокомпетентных клеток.

Поэтому в работе было исследовано влияние IgG-AT к нДНК на МНК периферической крови здоровых лиц in vitro.

Поскольку МНК периферической крови являются смешанной культурой, состоящей в основном из лимфоцитов и моноцитов, и взаимодействие клеток может влиять на результаты, был проведен анализ воздействия АТ к ДНК на первичную культуру МНК, а также отдельно на моноциты и лимфоциты здоровых лиц.

Влияние АТ к ДНК сывороток на моноциты здоровых лиц in vitro

На первом этапе клетки культивировали в присутствии АТ к ДНК сывороток для моделирования условий, приближенных к in vivo.

Анализ полученных данных показал, что АТ к ДНК сывороток больных СКВ и РА на стадии обострения заболевания проявляют циготоксичность и генотоксичносгь в культуре моноцитов, сравнимую с действием на клетки генотоксичной ДНКазы I (Olivery et al., 2004; Шкляева, 2009; Nevinsky et al., 2001), что отражается в снижении общего количества, количества жизнеспособных клеток и повышении уровня флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина (рис. 1).

Влияние АТ к ДНК сывороток доноров и больных СКВ в период ремиссии заболевания на моноциты не отличается от отрицательного контроля (ФСБ). Это может объясняться как более низким содержанием IgG-AT к нДНК в крови здоровых людей и больных СКВ в период ремиссии заболевания по сравнению со стадией обострения, так и различиями в свойствах естественных и патологических IgG-AT к нДНК.

В присутствии АТ к ДНК сывороток клинически здоровых родственников больных РА наблюдается тенденция к снижению пролиферации, количества жизнеспособных моноцитов и повышению флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина клеток, сходная с влиянием АТ к ДНК сывороток больных РА.

При оценке метаболических показателей моноцитов было выявлено снижение потребления глюкозы и содержания белка в образцах, инкубированных с АТ к ДНК сывороток больных СКВ. РА. а также тенденция к сниженшо показателей в присутствии АТ к ДНК сывороток клинически здоровых родственников больных РА. Отмечено также, что в присутствии АТ данных сывороток происходит повышение продукции перекиси водорода моноцитами (рис. 2).

Интенсивность флуоресценции ЭБ-ДНК (ед/клетку)

20 15 10

5 0

^ 97,5 перцектдль ^^ медиана

I 2,5 перцентиль

Рис. 1. Влияние AT к ДНК сывороток на моноциты здоровых лиц in vitro А - Изменение общего количества и количества жизнеспособных моноцитов

после 72 часов инкубации при 37°С с AT к ДНК сывороток; Б - Изменение интенсивности флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина моноцитов после 72 часов инкубации при 37°С с AT к ДНК сывороток; 1 - отрицательный контроль (ФСБ), 2 - доноры, 3 - СКВ обострение, 4 - СКВ ремиссия, 5 - РА обострение, б - РА родственники, 7 - положительный контроль (ДНКаза I)

Потребление глюкозы, %

80 60 40 20 0

Нп

97,5 перцентиль I 2,5 перцентиль

Содержание белка, нг/клетку

6 11 I

4 2

97,5 перцентиль медиана

В 2,5 лерцентиль

Выделение Н2Ог, нМ/клетку

4 1

3 1

2 1 1 0

97^5 перцентиль I медиана 2,5 перцентиль

Рис. 2. Изменение метаболических показателей моноцитов здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с АТ к ДНК сывороток А - Потребление глюкозы моноцитами; Б - Содержание белка в клетках; В - Выделение перекиси водорода моноцитами; I - отрицательный контроль (ФСБ), 2 - доноры, 3 - СКВ обострение, 4 - СКВ ремиссия, 5 - РА обострение, 6 - РА родственники, 7 - положительный контроль (ДНКаза I)

Действие AT к ДНК сывороток доноров и больных СКВ в период ремиссии на метаболические показатели моноцитов не отличается от отрицательного контроля.

Учитывая негативное воздействие на моноциты AT к ДНК сывороток здоровых родственников больных РА, можно предположить, что даже в отсутствии каких-либо клинических проявлений в организме генетически предрасположенных к АИЗ лиц на фоне повышенного уровня окислительного стресса (Арлеевская и др., 2010) происходит скрытое зарождение патологического процесса, и IgG-AT к нДНК могут являться одним из прогностических маркеров аутоиммунного синдрома задолго до полномасштабного проявления заболевания.

Влияние субфракций IgG-AT к нДНК на моноциты здоровых лиц in vitro

Так как сыворотка является многокомпонентной системой и AT к ДНК, содержащиеся в ней, могут быть «замаскированы» в составе иммунных комплексов для объективной оценки воздействия IgG-AT к нДНК на клетки необходимо было выделить их в свободном виде. Кроме того, поскольку популяция AT к ДНК является гетерогенной, для более глубокого понимания роли IgG-AT к нДНК в индукции и течении АИЗ была оценена зависимость цитотоксичности и генотоксичноста очищенных IgG-AT к нДНК от их физико-химических и иммуно-химических свойств.

Из каждой сыворотки было получено по 4 субфракции свободных от иммунных комплексов IgG-AT к нДНК, различающиеся зарядом (фракции I - основные AT, характеризующиеся общим положительным зарядом, и П - кислые AT с общим отрицательным зарядом) и аффинностью к нДНК - субфракции а, элюированные с нДНК-целлюлозы буфером, содержащим 1М NaCl, и субфракции б, элюированные с сорбента буфером глицин-HCl с низким значением рН 2.3, что позволяет сделать предположение об их большей аффинности к антигену - нативной ДНК.

Полученные субфракции IgG-AT к нДНК были обозначены как: положительно заряженные низкоаффинные (субфракции 1а), положительно заряженные высокоаффинные (субфракции 16), отрицательно заряженные низкоаффинные (субфракции Па) и отрицательно заряженные высокоаффинные (субфракции 116) (рис. 3).

Показано, что IgG-AT к нДНК доноров in vitro проявляют сходное с СКВ-АТ на стадии обострения заболевания влияние на моноциты здоровых лиц: приводят к замедлению пролиферации, снижению количества жизнеспособных клеток и потребления ими глюкозы, но действие СКВ-АТ, обладающих ДНК-гидролизующей активностью, более выражено по сравнению с естественными AT и сравнимо с положительным контролем - ДНКазой I (рис. 4,5).

Отмечено, что заметное цитотоксическое воздействие оказывают положительно заряженные IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения

заболевания, как высокоаффинные, так и низкоаффиняые (субфракции 1а и 16).

Обнаружено, что после инкубации моноцитов с положительно заряженными IgG-АТ к нДНК (субфракции 1а и 16) доноров снижается общее содержание белка в клетках, и моноциты продуцируют повышенное количество перекиси водорода. AT к ДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходный с IgG-AT к нДНК доноров эффект на клетки in vitro, но, отмечено, что их активирующее воздействие на моноцит более выражено (рис. 6,7).

КРОВЬ f

СЫВОРОТКА

I (NH^SO, ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ НА АКРИЛЕКСЕ Р-б t

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ посадка / \ градиентная элюция

ФРАКЦИЯ II

I отрицательно заряженные

ФРАКЦИЯ I

положительно заряженные j

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА МИКРОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ нДНК-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ

IMNaCI / субфракция 1а

IgG-AT к нДНК

IMNaCI f субфракцня Па

Gly-HCI, рН2.3 субфракция 16

Gly-HCI, рН2,3

субфракция Пб

Рис. 3. Схема выделения и очистки антител класса к нативной ДНК из сыворотки крови человека (Невзорова, 2005)

Влияние субфракций IgG-AT к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания на клетки in vitro не отличается от отрицательного контроля.

Выявлено, что наряду с положительно заряженными низкоаффинными IgG-AT к нДНК, характерными для доноров и СКВ-больных на стадии обострения заболевания (субфракции 1а), цитотоксичность в культуре моноцитов проявляют высокоаффинные IgG-AT к нДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА (субфракции 16 и 116) - приводят к снижению общего количества, количества жизнеспособных моноцитов и потребления ими глюкозы из питательной среды (рис. 4,5).

В присутствии субфракций 1а, 16 и Пб IgG-AT к нДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА наблюдается снижение содержания общего белка в

Количество Ш количество

клеток (тысячи) жизнеспособных клеток

ДО-АТкнДНК да-АТкнДНК 180-АТкнДНК 18С-АТкнДНК ^-АТкнДНК доноров больных СКВ больных СКВ больных РА клинически здоровых (обострение) (ремиссия) родственников

больных РА

Рис. 4. Изменение общего количества и количества жизнеспособных моноцитов здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с субфракциями ^О-А'Г к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили)

Потребление глюкозы, %

ДО-АТкнДНК 1^0-АТ к нДНК [80-АТкнДНК 18С-АТкнДНК igG-AT к нДНК доноров больных СКВ больных СКВ больных РА клинически здоровых

(обострение) (ремиссия) родственников

больных РА

Рис. 5. Изменение потребления глюкозы моноцитами здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с субфракциями 1^0-АТ к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили) 1 - контроль (ФСБ); 2,6, 10, 14,18 - субфракции 1а (положительно заряженные низкоаффинные); 3, 7,11,15,19 - субфракции Па (отрицательно заряженные низкоаффинные);

4, 8, 12, 16, 20 - субфракции 16 (положительно заряженные высокоаффинные);

5, 9, 13, 17,21 - субфракции Иб (отрицательно заряженные выеокоаффивные);

22 - ДНКаза I

Содержание белка, нг/клетку

ДО-АТкнДНК ДО-АТкнДНК [вО-АТкнДНК ДО-АТкнДНК да-АТкнДНК доноров больных СКВ больных СКВ больных РА клинически эдоровых (обострение) (ремиссия) родственников

больных РА

Рис. 6. Изменение содержания белка моноцитов здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с субфракциями ^О-АТ к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили)

Выделение Н202, нМ/клетку

ДО-АТкнДКК ^О-АТ к нДНК ДО-АТкнДНК доноров больных СКВ больных СКВ (обострение) (ремиссия)

ДО-АТкнДНК ДО-АТкнДНК больных РА клинически здоровых родственников больных РА

Рис. 7. Изменение выделения перекиси водорода моноцитами здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с субфракциями ^О-АТ к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили) 1 - контроль (ФСБ);

2, 6, 10,14, 18-субфракции Га (положительно заряженные низкоаффинные);

3, 7,11,15,19 - субфракции Па (отрицательно заряженные нкзкоаффинные); 4, 8, 12, 16, 20 - субфракции 16 (положительно заряженные высокоаффинные); 5,9, 13, 17, 21 - субфракции Нб (отрицательно заряженные высокоаффинные);

22 - ДНКаза 1

клетках и усиление генерации перекиси водорода моноцитами (рис. 6,7).

Результаты оценки влияния субфракций ^в-АТ к нДНК на общую фракцию МНК и отдельно на лимфоциты являются аналогичными результатам, полученным на культуре моноцитов, и подтверждают цитотоксичность АТ к ДНК при системных аутоиммунных патологиях в культуре клеток крови здоровых лиц.

Генотоксичность ^в-АТ к нДНК

Анализ данных флуоресцентной спектрофотометрии показал, что цитотоксичные субфракции ДО-АТ к нДНК доноров, больных СКВ. РА на стадии обострения заболевания и родственников больных РА приводят к повышению флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина лизированных клеток, что свидетельствует об изменении конформации клеточной ДНК, возможном снятии суперспирализации, обусловленным гидролизом ДНК (рис. 8). Для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания генотоксичные субфракции представлены положительно заряженными 1{£5-АТ к нДНК (1а и 16).

Обнаружено, что в сыворотке крови больных РА и клинически здоровых родственников больных РА спектр генотоксичных субфракций шире, чем при обострении СКВ - 1а, 16 и Нб.

к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не приводят к изменению флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК клеток.

Для визуальной оценки повреждений ДНК хроматина после инкубации клеток с ДО-АТ к нДНК проводили гель-электрофорез лизированных единичных клеток.

При наличии разрывов в ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация, что приводит к релаксации молекулы. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что придает наблюдаемым объектам вид комет. Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждения ДНК в изучаемых клетках.

Данные метода «ДНК-комет» подтвердили результаты флуоресцентной спектрофотометрии. Положительно заряженные %С-АТ к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания приводят к повышению Ида, что наиболее выражено для ДНК-гидролизующих АТ больных СКВ (рис. 9).

При визуальной оценке «ДНК-комет», повреждения ДНК были выявлены в клетках после инкубации с положительно заряженными 1^-АТ к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания. Действие СКВ-АТ к нДНК в активной стадии, характеризующихся высокой ДНК-гадролизующей активностью и цитотоксичностью, сравнимо с действием перекиси водорода, использованной в

Интенсивность флуоресценции ЭБ-ДНК, ад/клетку 12 т

ДО-АТкнДНК ^й-АТ К НДНК 180-АТкнДНК [£(}-АТКНДНК ДО-АТ к НДНК доноров больных СКВ больных СКВ больных РА клинически здоровых

(обострение) (ремиссия) родственников

больных РА

Рис. 8. Изменение интенсивности флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина моноцитов здоровых лиц после 72 часов инкубации при 37°С с субфракциями 1^-АТ к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили)

Идк

ГгО-АТкнДНК (дО-АТкнДНК ДО-АТкнДНК ДО-АТКНДНК ^-АТКНДНК доноров болышх СКВ больных СКВ больных РА клинически здоровых

(обострение) (ремиссия) родственников

больных РА

Рис. 9. Изменение индекса «ДНК-комет» после 72 часов инкубации при 37°С мононуклеарных клеток здоровых лиц с субфракциями ^О-АТ к нДНК (медиана, 97,5 и 2,5 перцентили) 1 - отрицательный контроль (ФСБ);

2, 6,10, 14, 18 - субфракции 1а (положительно заряженные низкоаффинные);

3, 7, 11, 15,19 - субфракции На (отрицательно заряженные низкоаффинные); 4, 8, 12, 16, 20 - субфракции 16 (положительно заряженные высокоаффинные); 5,9, 13,17,21 - субфракции 116 (отрицательно заряженные высокоаффинные);

22 - Н202 (положительный контроль для метода «ДНК-комет»)

данном эксперименте в качестве положительного контроля (рис. 9, 10).

Поскольку исследуемые AT являются поликлональными, вероятно, некоторые ДНК-связывающие AT доноров, проникая в клетей, достигают ядра, связываются с адерной ДНК и изменяют ее конформацию, открывая сайты рестрикции для действия ДНКаз. Другие AT к нДНК MOiyr взаимодействовать с компонентами мембраны клеток и индуцировать рецепторопосредованный апоптоз.

Предположительно, IgG-AT к нДНК способны выступать в качестве лиганда для Fas-рецептора, экспрессируемого на поверхности большинства клеток в организме, что отражается изменением в цитоплазматическом «домене смерти» Fas-рецептора и запуском каскада реакций, приводящих в конечном итоге к апоптозу клетки (Ярилин, 2003а; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Argüelles, 2006).

На микрофотографиях видно наличие комет с широким диффузным «хвостом» и практически полным отсутствием «головы» в препаратах клеток после инкубации с СКВ-АТ на стадии обострения заболевания (субфракций 1а и 16), что соответствует описанию апоптотической гибели клеток.

Вероятно, ДНК-гидролизующие IgG-AT больных СКВ в активной стадии заболевания способны стимулировать р53-опосредованный апоптоз, проникая в клетки и нарушая структуру ядерной ДНК. При повреждении ДНК клеток под влиянием физических или химических факторов происходит активация гена р53, продукт которого - белок р53, являющийся регуляторным онкосупрессором, задерживает клетку в фазе G1/S (посредством репрессии генов, регулирующих транскрипцию), чтобы дать время для работы репаративных систем. Если повреждения генетического аппарата клетки ликвидировать не удается, то р53 выступает в качестве проапоптотического фактора и запускает программу апоптоза клетки по митохондриаиьному пути, активируя Вах (Рыжов и Новиков, 2002).

В целом на основании результатов сходной цитотоксичносги и генотоксичносги положительно заряженных IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания можно заключить, что для взаимодействия с цитоплазматической мембраной и проникновения внуфь клеток в данном случае большее значение имеет заряд молекул IgG-AT к нДНК, нежели аффинность их к антигену - нативной ДНК

Отсутствие у доноров клинических признаков заболевания при аналогичном воздействии на клетки IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания объясняется тем, что уровень IgG-AT к нДНК в крови здоровых людей значительно ниже, чем у больных СКВ и представлены они в основном нейтральными для клеток субфракциями отрицательно заряженных AT (Сидорик, 1992).

В процессе выделения IgG-AT к нДНК из сывороток происходит разрушение

Отрицательный контроль 1-1 12 мкм » * • т I-<4 50 МК* - *

Положительный контроль для метода «ДНК-комет» (Н202) |-1 12 мкм

1а |-1 12 мкм 16 |-1 12 мкм

На • |-1 12 мкм Кб Ш I-1 20 мкм

^в-АТ к нДНК больных СКВ (обострение)

Га I-1 12 мкм 1Я ' 4, (•-1 12 мкм

Па |-1 12 мкм т 'Щ |-1 12 мкм

^в-АТ к нДНК доноров

* #■ * * * 13 • * • « |—«—1 50 мкм * 1(5 1-) 12 мкм

На 1-1 12 мкм « • ИВ ^ Ф Щ Ш |-1 50 мкм *

Г«С-ЛТ к нДНК больных СКВ (ремиссия)

(а 1й 1а 1Я

-| 12мкм |-1 12мкм |-1 12 мкм |-( 12 мкм

На Ш На II»

^в-АТ к нДНК больных РА 1дС-ЛТ к нДНК клинически здоровых

родственников больных РА

12 мкм

Рис. 10. Типичные микрофотографии «ДНК-комет» после 72 часов инкубации при 37°С МНК здоровых лиц с субфракциями ^й-АТ к нДНК

иммунных комплексов АТ-ДНК с образованием свободных АТ к нДНК, а в опытах на клетках были использованы равные концентрации всех исследуемых АТ, что дало возможность наблюдать потенциальный негативный эффект на иммунокомпегентные клетки ¡n vitro АТ здоровых доноров.

Не исключено, что патологические СКВ-АТ к нДНК могут происходить от естественных IgG-AT к нДНК, выполняющих в организме защитные функции, но вопрос о причинах подобного аномального переключения остается открытым.

Поскольку патологические СКВ-АТ к нДНК обладают широкой перекрестной реактивностью, можно предположить, что свойства АТ к ДНК различаются в норме и при аутоиммунных патологиях, потому что исходно синтез этих АТ к ДНК В-лимфоцитами был стимулирован антигенами различной природы.

Субфракции IgG-AT к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не обладают генотоксичностью.

На основании полученных результатов можно заключить, что под воздействием гормональной терапии в период ремиссии СКВ изменяется структура и свойства IgG-AT к нДНК, в результате чего они, сохраняя невысокую ДНК-гадролизующую активность, утрачивают способность проникал, в клетки. Вероятно, молекулы IgG-AT к нДНК в норме, при обострении и в период ремиссии СКВ различаются конформационной динамичностью, что влияет на их способность взаимодействовать с антигенами на мембране клеток и оказывать циютоксический и генотоксический эффект.

При визуальной оценке образцов «ДНК-комет» после инкубации клеток с субфракциями IgG-AT к нДНК больных РА выявлено образование выраженных «хвостов комет» и повышение Ида под воздействием субфракций 1а, 16 и 116 (рис. 9, 10). Эти субфракции представлены положительно заряженными низкоаффинными и высокоаффинными положительно и отрицательно заряженными IgG-AT к нДНК. Аналогичные субфракции клинически здоровых родственников больных РА проявляют генотоксичность, сравнимую с АТ к ДНК больных РА.

Основываясь на вышеизложенных результатах, можно выдвинуть предположение, что при РА IgG-AT к нДНК, воздействуя на генетический аппарат МНК, могут изменять транскрипционную активность генов либо вызывать летальные повреждения ДНК.

По-видимому, как положительно, так и отрицательно заряженные высокоаффинные IgG-AT к нДНК больных РА in vivo могут способствовать развитию и обострению патологического процесса в суставной полости.

С одной стороны IgG-AT к нДНК цитотоксически воздействуют на здоровые иммунокомпегентные клетки. Это может быть первопричиной иммунного дисбаланса в организме человека и исходным пусковым механизмом развития хронического

воспаления. К тому же поражение здоровых клеток иммунной системы РА-антителами, приводящее к иммунодефициту, частично объясняет гипотезу триггерной роли инфекции в развитии полномасштабной картины нарушения иммунного статуса при РА, согласно которой аутоиммунный РА-процесс является следствием пролонгированного кумулятивного эффекта повторяющихся банальных инфекций (Арлеевская и др., 2010).

Полученные результаты свидетельствуют, что популяция патологических АТ к нДНК при РА даже шире, чем при СКВ, поскольку наблюдается цитотоксичность и генотоксичность высокоаффинных ¡цв-АТ к нДНК, наряду с положительно заряженными АТ, характерными для периода обострения СКВ.

Это позволяет выдвинуть предположение об исходно иной природе происхождения 1^-АТ к нДНК при РА.

Усиление патогенетического потенциала Г^-АТ к нДНК может быть связано не только с изменением аминокислотной последовательности но также с вариациями углеводных компонентов молекул. Данное предположение подкрепляется открытием дефекта гликозилирования у больных РА. Примерно 14% клинически здоровых доноров не содержат галактозы ни в одной из углеводных цепей Рс-фрагмента молекулы АТ. В то же время у больных РА содержание полностью лишенных галактозы ^ всегда оказывается выше, чем в группе доноров и иногда достигает 60% (Ройт, 2007). Это может усиливать аутоиммуногенность Рс-фрагмента Jg, что объясняет генерацию ревматоидного фактора при РА. Кроме того, изменение гликозилирования АТ может отражаться на общей конформационной лабильности молекул и их способности взаимодействовать с клетками. В то же время при СКВ не наблюдается дефекта гликозилирования 12р.

Наличие в организме родственников больных РА потенциально патогенных 1§0-АТ к нДНК с измененными свойствами является следствием нарушения АТ-синтезирукяцей функции В-лимфоцитов. Сложно сказать, сама патология В-лимфоцитов является генетически детерминированной или в организме наследственно восприимчивых людей присутствует дополнительный фактор, акгавируемый банальными инфекциями, воздействующий на В-лимфоциты и вызывающий соматические мутации генов, приводящие к синтезу цитотоксичных 1§С-АТ к нДНК. Но обнаруженное явление сходной циготоксичносги и генотоксичности 1|*(}-АТ к нДНК родственников и больных РА может свидетельствовать о скрытых патологических изменениях в организме клинически здоровых родственников больных РА и возможном зарождении аутоиммунного синдрома на фоне повышения частоты инфекционных процессов и уровня окислительного стресса (Арлеевская и др., 2010).

Количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза после воздействия

IgG-AT к нДНК оценивали методом проточной цитофлуориметрии по уровню связывания белком аннексином V фосфотидилсерина на внешней стороне цитоплазмагической мембраны и способности клеток исключать пропидий йодид (РГ). В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубированные с глюкокоргикостероидом дексаметазоном, обладающим выраженным проапошотическим действием на иммунокомпетентные клетки.

Среднее количество клеток, связывающих аннексии V, но исключающих PI, после воздействия субфракций AT к ДНК доноров, больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом повышено на 6% по сравнению с отрицательным контролем (ФСБ), принятым за 0% (таблица 1). Субфракции AT к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не приводят к апоптозу МНК in vitro. Значительное количество клеток (выше ~ на 10% по сравнению с отрицательным контролем), находящихся на ранней стадии апоптоза, сравнимое с положительным контролем дексаметазоном, наблюдается после воздействия субфракций AT к ДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания.

Таблица 1

Среднее количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза после 72 часов инкубации с субфракциями IgG-AT к нДНК относительно

контроля (ФСБ), принятого за ноль %

Субфракции АТ к нДНК Содержание клеток, связывающих аннексия V и исключающих PI, % (среднее значение ± стандартное отклонение)

^в-АТ к нДНК здоровых доноров 6,09 ±0,21

ДО-АТ к нДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания 10,48 ±2,28

^С-АТ к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания 0,28 ± 0,09

^-АТ к нДНК больных РА 6,61 ±0,44

^Б-АТ к нДНК клинически здоровых родственников больных РА 6,15 ± 0,3

Дексамегазон 10,34 ± 0,85

В совокупности полученные данные флуоресцентной спектрофотометрии комплексов ЭБ-ДНК хроматина и проточной цитофлуориметрии свидетельствуют о том, что часть клеток после инкубации с ^-АТ к нДНК, связывающая Р1ТС-аннексин V и исключающая Р1, находится на ранней стадии апоптоза, но также результаты электрофореза единичных лизированных клеток обнаруживают значительную популяцию клеток на поздней стадии апоптоза с высоким уровнем деградации ДНК

При использовании в качестве модели первичной культуры лимфоцитов здоровых

лиц были получены аналогичные результаты воздействия субфракций IgG-AT к нДНК. Это является подтверждением того, что именно IgG-AT к нДНК, а не перекись водорода, интенсивно секрегируемая моноцитами под воздействием AT, являются причиной повреждения ДНК хроматина иммунокомнетентных клеток in vitro, поскольку лимфощпы не продуцируют перекись водорода

Нарушение функциональной активности мононуклеарных клеток, повышение уровня их апоптоза приводит к иммунонедостагочности и усилению воспалительного процесса в результате повреждения тканей активными формами кислорода макрофагов, снижению фагоцитоза, повышению содержания апоптотических телец и времени их циркуляции в кровотоке, что и наблюдается при СКВ (Walport, 2000; Yung et al, 2001) и PA. Так как в процессе апоптоза клеток на мембране иммобилизуется значительное количество ядерных аутоантигенов (например, нуклеосом), накопление в организме апоптотических клеток может направлять иммунную систему к продукции новой волны AT (Lorenz et al, 2000), генерации субпопуляций AT к ДНК с новыми свойствами, например, с ДНК-гидролизующей активностью и цитотоксичностыо.

Вероятно, аномальное повышение уровня в крови естественных AT к ДНК в определенных условиях способно привести к повреждению клеток иммунной системы, нарушению их функциональной активности, изменению экспрессии генов. Это может отразиться в нарушении иммунного статуса и индукции аутоиммунного синдрома за счет интенсификации апоптоза здоровых клеток и накопления модифицированных В-лимфоцитов, продуцирующих патологические IgG-AT к нДНК.

Различия во влиянии IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ в период ремиссии заболевания является свидетельством изменения свойств AT к ДНК после гормональной терапии, а, следовательно, и иммунного статуса пациентов с тенденцией к иммунодефициту.

На основании полученных результатов можно сделать общее заключение, что механизм цитотоксичности ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих AT класса IgG в культуре МНК здоровых лиц связан с нарушением струюуры ДНК хроматина клеток. Цитотоксичность и генотоксичность AT класса IgG к нДНК зависит от их физико-химических и иммунохимических свойств. Изменение свойств AT класса IgG к нДНК отражает нарушения в иммунной системе при АИЗ, и вариабельность субфракционного состава AT к ДНК может определять развитие и течение аутоиммунной патологии.

IgG-AT к нДНК вносят отрицательный вклад в развитие системных АИЗ, приводя к повышению уровня апоптоза здоровых иммунокомпетентных клеток крови человека.

выводы

1. Антитела к ДНК сывороток крови больных системной красной волчанкой на стадии обострения заболевания, ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом проявляют цигохоксичность, гепотоксичпость и изменяют метаболизм мононуклеарных клеток здоровых лиц ш vitro.

AT к ДНК сывороток крови здоровых доноров и больных системной красной волчанкой в период ремиссии заболевания значимого влияния на мононуклеарные клетки здоровых лиц irt vitro не оказывают,

2. Положительно заряженные низкоаффинные и высокоаффинные к нативной ДНК антитела класса IgG доноров и больных системной красной волчанкой на стадии обострения заболевания проявляют цитотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц и приводят к нарушению клеточного метаболизма Антитела класса IgG к нативной ДНК больных системной красной волчанкой на стадии обострения заболевания оказывают более выраженное негагавное влияние на жизнеспособность и метаболизм мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro;

3. Субфракции антител класса IgG к нативной ДНК больных системной красной волчанкой в период ремиссии заболевания значимого влияния на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro не оказывают,

4. Высокоаффинные антитела класса IgG к нативной ДНК больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом приводят к гибели мононуклеарных клеток здоровых лиц m vitro и нарушению клеточного метаболизма;

Цитотоксичные субфракции IgG-антител к нативной ДНК доноров, больных системной красной волчанкой на стадии обострения заболевания, больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом проявляют генотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitra. Антитела класса IgG к нативной ДНК приводят к гибели мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro путем апоптоза

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сабирзянова, A3. Влияние антител класса IgG к нативной ДНК на моноциты человека in vitro / А.З. Сабирзянова, Т.А. Невзорова // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2008. - Т. 150, кн. 2. - С. 186-200.

2. Сабирзянова, A3. Антитела к ДНК сывороток крови больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом проявляют генотоксичность в первичной культуре лимфоцитов здоровых лиц / А.З. Сабирзянова, Т.А. Невзорова // Современные проблемы науки и образования.-2011.-№5; URL: www.science-educatioani/99-4811.

3. Сабирзянова, А.З. Свойства антител к ДНК в культуре клеток 1 А.З. Сабирзянова, В.В. Иванова, А.Ю. Храмова, Т.А. Невзорова // Структура и динамика молекулярных систем (электронный журнал). - 2009. - №7. - часть А. - С. 32-42., http://ksu.ru/sdms/sod_7_2009.htm.

4. Сабирзянова, А.З. Экспресс-диагностикум аутоиммунных заболеваний на основе оценки свойств молекулярных маркеров крови / А.З. Сабирзянова, В.В. Иванова, Т.А. Невзорова // Материалы научно-практической конференции "Становление и достижения биохимической школы Казанского Университета (памяти В.Г. Винтера)" - Казань. -2009.-С. 103-104.

5. Ivanova, V.V. Dependence of the influence of antibodies to DNA on the cells from activity of immunoreactive fragments of IgG / V.V. Ivanova, A.Z. Sabirzanova, A.Yu. Chramova, T.A. Nevzorova II Abstracts of the 13й annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of borders» / Kazan, 2009. - P. 78-79.

6. Сабирзянова, A3. Оценка изменения ДНК иммунокомпетентных клеток после воздействия ДНК-гидролизуюших антител / А.З. Сабирзянова, А.Ю. Храмова, В.В. Иванова, Т.А. Невзорова П Материалы I Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» - Казань. - 2010. - С. 137-138.

7. Невзорова, Т.А. Антитела к ДНК в норме и при аутоиммунных заболеваниях / Т.А. Невзорова, А.З. Сабирзянова, В.В. Иванова, Р.Э. Мурадимова Н Материалы I Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» - Казань. - 2010. - С. 47-48.

8. Храмова, А.Ю. Влияние антител к ДНК на культивирование почек эмбриона свиньи (СПЭВ) в присутствии ультрафиолетового излучения in vitro / А.Ю. Храмова, В.В. Иванова, А.З. Сабирзянова, Т.А. Невзорова // Материалы I Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» - Казань. - 2010. - С. 102-103.

9. Сабирзянова, A3. Влияние антител класса IgG к нативной ДНК на иммунокомпетентные клетаи человека / А.З. Сабирзянова, Т.А. Невзорова // Материалы П Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» - Казань. - 2011. - С. 35-36.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 42000S, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, к. 104, отдел

аттестации, ученому секретарю Диссертационного Совета Д 212.081.08 профессору

Абрамовой З.И., факс: (843) 238-76-01, E-mail: lllv_alsusa@inbox.ru

Подписано в печать 11.01.12г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ № 1101/2. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабирзянова, Алсу Зуфаровна, Казань

61 12-3/657

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

На правах рукописи

Сабирзянова Алсу Зуфаровна

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук доцент, Т.А. Невзорова

Казань-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Системная красная волчанка 12

1.2. Этиология системной красной волчанки 13

1.3. Ревматоидный артрит 15

1.4. Этиология ревматоидного артрита 17

1.5. Биологическая роль аутоантител к ДНК

в норме и патогенезе аутоиммунных заболеваний 19

1.6. Каталитические ДНК-гидролизующие анитела

и их биологическая роль в организме человека 23

1.7. Влияние антител к ДНК на клетки организма 26

1.8. Апоптоз.

Роль апоптоза в иммунных процессах 32

1.9. Нарушение апоптоза при СКВ и РА 33 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 36 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 38

2.1. Объект исследования 38

2.2. Выделение AT к нДНК из крови человека 38

2.2.1. Получение сыворотки и осаждение AT сульфатом аммония 38

2.2.2. Обессоливание белков 39

2.2.3. Фракционирование антител сыворотки крови

на ДЭАЭ-целлюлозе 39

2.2.4. Получение субфракций AT к нДНК аффинной хроматографией на нДНК-целлюлозе микрокристаллической 40

2.3. Исследование влияния AT к нДНК на клетки in vitro 41

2.3.1. Выделение мононуклеарных клеток, лимфоцитов

и моноцитов из периферической крови человека 41

2.3.2. Исследование жизнеспособности клеток 41

2.3.3. Культивирование клеток в присутствии

сывороток крови человека 42

2.3.4. Культивирование клеток в присутствии

субфракций IgG-AT к нативной ДНК 42

2.3.5. Определение концентрации клеточного белка 43

2.3.6. Определение количества потребления

глюкозы клетками 43

2.3.7. Определение продукции

перекиси водорода моноцитами 44

2.3.8. Оценка уровня повреждения ДНК клеток 44

2.3.8.1. Оценка уровня повреждения ядерной ДНК

методом флуоресцентной спектрофотометрии 44

2.3.8.2. Оценка уровня повреждения ядерной ДНК

методом «ДНК-комет» 45

2.3.9. Оценка апоптоза клеток методом проточной цитометрии 47 2.4. Статистическая обработка результатов 48 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 49

3.1. Влияние AT сывороток на МНК здоровых лиц in vitro 49

3.2. Влияние AT сывороток

на моноциты здоровых лиц in vitro 50

3.3. Влияние субфракций IgG-AT к нДНК

на моноциты здоровых лиц 52

3.4. Генотоксичность субфракций IgG-AT к нДНК 66

3.5. Определение количества клеток на ранней стадии

апоптоза после инкубации с IgG-AT к нДНК 76

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 82

ВЫВОДЫ 107

ЛИТЕРАТУРА 108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ААТ - аутоантитело

АИЗ - аутоиммунное заболевание

AT - антитело

МНС (HLA) - главный комплекс гистосовместимости

нДНК - нативная дезоксирибонуклеиновая кислота

ИдК - индекс ДНК-комет

МНК - мононуклеарные клетки

РА - ревматоидный артрит

РФ - ревматоидный фактор

СКВ - системная красная волчанка

ФНО - фактор некроза опухоли

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭБ - этидий бромид

BAFF - B-лимфоцит активирующий фактор

CD - cell differentiation antigens или cluster definition (антигены кластеров

дифференцировки клеток)

CDR - гипервариабельный регион Ig

Ig - иммуноглобулин

PI - пропидий йодид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные заболевания (АИЗ) - это заболевания, возникающие вследствие гиперактивности иммунной системы, дисбаланса во взаимодействии ее звеньев и нарушения толерантности к молекулам собственного организма (Ройт, 2007).

Общим признаком АИЗ является гиперглобулинемия и избыточное образование широкого спектра ААТ (Насонов и Сура, 1988). Аутоантитела (ААТ) - это антитела (АТ), способные взаимодействовать хотя бы с одним аутоантигеном (антигеном собственных тканей).

При некоторых аутоиммунных патологиях, а также других заболеваниях и физиологических состояниях, таких как стресс, беременность наблюдается повышение содержания в крови больных аутоантител к нативной ДНК класса (^в-ААТ к нДНК), происхождение и биологическая роль которых на сегодняшний день остаются невыясненными.

Характерное повышение уровня 1^С-ААТ к нДНК в крови больных СКВ является одним из диагностических критериев данного заболевания. Российскими учеными было обнаружено, что АТ к ДНК при СКВ обладают ДНК-гидролизующей активностью (ОаЫЬоу е1 а1., 1994)

РА представляет собой наиболее распространенное АИЗ, поражающее 0,5-2% взрослого населения в работоспособном возрасте 35-55 лет (Каратеев, 2007). Было показано, что приблизительно у 25% пациентов с РА наблюдаются повышенный уровень АТ с ДНК-гидролизующей активностью (8исЬкоу, 2001; ваЫЬоу ег а1., 2006).

СКВ и РА снижают качество и продолжительность жизни населения,

поэтому входят в число важных биомедицинских и социальных проблем современности. К сожалению, с каждым годом число больных СКВ и РА возрастает (Арлеевская и др., 2010; Невзорова и Винтер, 2006).

Вероятно, развитие АИЗ является следствием сочетания многих факторов, среди которых в первую очередь необходимо выделить наследственную предрасположенность, гормональный статус человека и негативное воздействие физико-химических и биологических факторов окружающей среды. Согласно литературным данным, риск развития аутоиммунной патологии у родственников больных АИЗ в 2 раза выше, чем в остальной популяции (Silman and Pearson, 2002).

Вместе с тем ранняя диагностика СКВ и РА является сложной задачей, так как симптомы часто неспецифичны и могут наблюдаться при широком спектре как ревматических, так и неревматических заболеваний.

Для решения поставленной проблемы необходим поиск и анализ маркера, обладающего свойствами, специфичными для разных АИЗ, и отражающего изменение иммунного статуса человека задолго до развития полномасштабной картины патологического аутоиммунного процесса.

В ряде работ показано, что активность АИЗ (в частности, СКВ) не всегда коррелирует с уровнем ААТ к ДНК (Villalta et al., 2009; Becker-Merok et al., 2006). У многих пациентов с СКВ в период устойчивой ремиссии заболевания и отсутствии клинического синдрома сохраняется высокий уровень ААТ к ДНК по сравнению с нормой. Кроме того, повышенный уровень ААТ к ДНК наблюдается и при других АИЗ, например, РА с клиническими проявлениями, отличными от СКВ. Это наводит на мысль, что не только и не столько уровень, а в большей мере свойства ААТ к ДНК определяют течение патологического процесса при развитии АИЗ и могут

различаться при разнообразных аутоиммунных патологиях.

Большинство авторов поддерживают мнение о патогенетической роли гетерогенной популяции ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих ААТ класса IgG в аутоиммунитете (Reefman et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007; Kowal et al., 2004; Невзорова, 2005). Но не исключено, что ААТ к нДНК, как часть пула естественных ААТ, в норме выполняют защитную функцию, способствуя удалению трансформированных и пораженных вирусами клеток, аутоантигенов, образующихся при разрушении тканей, и поддерживая гомеостаз организма (Полетаев и Чурилов, 2009).

В исследованиях последних лет показано, что ААТ к ДНК способны не только связывать растворимые антигены и рецепторы на поверхности клеток, но и проникать через мембрану внутрь клеток, взаимодействовать с органоидами и локализоваться в ядре, влияя на метаболические процессы (Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Argüelles, 2006; Jang et al., 2009).

Предположительно, IgG-AAT к нДНК могут быть индукторами и участниками аутоиммунного синдрома, приводя к нарушению апоптоза клеток, следствием чего является увеличение содержания апоптотических телец и времени их циркуляции в кровотоке, что часто наблюдается при СКВ и является, по крайней мере, одной их причин утраты аутотолерантности иммунной системы (Lorenz et al, 2000).

Были поставлены задачи:

Научная новизна

Впервые на первичной культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц показано, что патогенетический потенциал поликлональных антител класса IgG к нативной ДНК может быть обусловлен изменением их физико-химических и иммунохимических свойств (суммарного заряда молекулы и аффинности к нативной ДНК) при развитии аутоиммунной патологии и отличается в разных группах системных аутоиммунных заболеваний.

Показано, что высокоочищенные свободные от иммунных комплексов антитела класса IgG к нативной ДНК здоровых доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходное влияние на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых лиц in vitro. Обнаружено, что положительно заряженные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в активной стадии заболевания обладают более выраженной цитотоксичностью и генотоксичностью по сравнению с антителами доноров.

Показано, что наряду с положительно заряженными низкоаффинными антителами, характерными для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания, высокоаффинные антитела класса IgG к нативной ДНК больных ревматоидным артритом проявляют цитотоксичность и генотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.

Практическая значимость

Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в норме, при различных аутоиммунных заболеваниях, а также на разных стадиях активности патологического процесса, проявляющееся в воздействии антител на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro, является специфическим маркером, отражающим изменение иммунного статуса, что может быть

использовано для создания тест-системы выявления нарушений работы иммунной системы человека.

Практическая значимость работы определяется возможностью использования субфракций антител класса ^О к нативной ДНК в качестве инструмента, позволяющего диагностировать, прогнозировать развитие и течение, проводить мониторинг состояния больных аутоиммунными заболеваниями и оценивать эффективность терапии с использованием культуры клеток.

Положения, выносимые на защиту

1. Механизм цитотоксичности ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих антител класса в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц связан с нарушением структуры ДНК хроматина клеток;

2. Цитотоксичность и генотоксичность антител класса к нативной ДНК зависит от их физико-химических и иммунохимических свойств. Изменение свойств антител класса к нативной ДНК отражает нарушения в иммунной системе при аутоиммунных заболеваниях;

3. Антитела класса ^О к нативной ДНК вносят отрицательный вклад в развитие аутоиммунных заболеваний, приводя к повышению уровня апоптоза здоровых иммунокомпетентных клеток крови человека.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на Всероссийской Конференции с элементами научной школы для молодежи «Структура и динамика молекулярных систем» (Казань, 2009), Научно-практической конференции биохимиков, посвященной памяти профессора В.Г. Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2009» (Казань, 2009), I Всероссийской виртуальной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010), I и II Международных научно-практических конференциях «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010, 2011). По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим перечнем ВАК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Системная красная волчанка

Системная красная волчанка (СКВ) - одно из наиболее тяжелых аутоиммунных заболеваний человека, характеризующееся неизвестной этиологией, широким разнообразием клинических и серологических нарушений, включая присутствие в крови людей, страдающих СКВ, в значительных количествах ААТ к нДНК, относящихся к иммуноглобулинам G (IgG) (Ardoin and Pisetsky, 2008).

В соответствии с системным характером СКВ клиническая картина заболевания обширна, многогранна и неоднозначна (Wajed et al., 2004).

При СКВ наблюдается системная дезорганизация соединительной ткани и генерализованное поражение сосудистого русла. При этом мукоидное набухание сочетается с фибринозными изменениями. Нарушение функции почек разной степени тяжести - от очагового доброкачественного гломерулита до диффузного мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита с протеинурией, наряду с патологическими изменениями сосудов и центральной нервной системы, является наиболее тяжелым поражением при СКВ (Scolding and Joseph, 2002).

Вся совокупность данных нарушений часто приводит к инвалидности и ранней смертности (Дядык, 2002).

Для СКВ характерно хроническое течение с чередованием периодов обострения и ремиссии. Наиболее часто данное заболевание поражает женщин репродуктивного возраста и встречается с вариабельной частотой в расовых и этнических группах (Gill et al., 2003; Ardoin and Pisetsky, 2008).

Особенностью СКВ является наличие феноменов, связанных с патологией ядер клеток крови. Специфическими для СКВ являются гематоксилиновые тельца, LE-клетки (Харгрейвса), которые представляют собой нейтрофилы, фагоцитировавшие разрушенные ядра других

лейкоцитов. При этом ядро самого нейтрофила отодвигается «включением» к периферии. «Феномен розетки» - предстадия LE-клетки, когда вокруг разрушенного ядра наблюдается скопление нейтрофилов.

Разрушение органов при СКВ является следствием отложения в них циркулирующих иммунных комплексов. Активируемые иммунными комплексами фагоциты высвобождают лизосомальные ферменты, повреждающие соединительную ткань, и вызывают воспаление. Продукты деструкции клеток, являющиеся неоантигенами, стимулируют образование новых ААТ и иммунных комплексов. Процесс вновь повторяется, образуя замкнутый круг и приводя к хроническому воспалению и полиорганной недостаточности (Ройт, 2007; Галактионов, 2004).

1.2. Этиология системной красной волчанки

Работы последних лет показывают, что предрасположенность к СКВ в первую очередь является результатом генетического полиморфизма регуляции иммунной системы.

Секвенирование генома человека, изучение семейной генетики, опыты на животных моделях позволили выделить гены-кандидаты предрасположенности лиц к развитию СКВ (таблица 1). Природ

Информация о работе

Сабирзянова, Алсу Зуфаровна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Цитоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных системными аутоиммунными заболеваниями в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы