Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ НУКЛЕОКАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ (РРСС) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ РРСС.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ НУКЛЕОКАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ (РРСС) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ РРСС."

¿¡-гзну

На правах рукописи

Алексеев Константин Петрович

Получение рекомбинантных н у кл со к а п с нд н ы х белков вируса репродуктнвно-респнраторного синдрома свиней (РРСС) и их применение в качестве специфических компонентов диагностической тест-системы для определения антител к вирусу РРСС.

03.00.03 —молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2003

Работа выполнена в Научщьиееледовяте-тьском институте вирусология н,м. Д, И. Ивановского РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, Непоклонов Евгений Анатольевич.

Официальные оппоненты;

Доктор биологаческих наук, профессор Ямникова Светлана Сергеевна

Доктор биологических наук, Кузнецов Дмитрий Павлович

Ведущая организация;

Всероссийский научно-нсследоват ел ьс кий институт ветеринарной вирусологии в микробиологии РАСХН.

Зашита со; гиится «Й» января 2004 г. На заседании Диссертационного сг Д 001.020.01 в институте вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМ' - яяргсу* т- -;"чмален 16, институт

. И,\ Г- .*. ■ >.;:. . ■■■ - ч ■

С диссертацией ■ -ко знакомч .-.■■• : с -ута вирусологи мм.

Д. И. Ивановско! ■' л ■т

Авюреферат рп. ::н ?<

Ученый секре-; Диссертационного совета доктор медицинских наук

Косякова Наталья Павловна.

I. Общая характер нети ка работы.

Актуальность работы.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - инфекционное вирусное заболевание, которое вспыхнуло в 1987 году в Северной Америке (Keffaber, 1989; Bîlodeau et al., 1991), а затем в Европейских странах (Paton et al, 1991; Baron et al., 1992). К настоящему времени репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) широко распространен в большинстве стран с развитым свиноводством, исключение составляют лишь Швейцария и Новая Зеландия (Seuberlich et al. 1992).

В ряде стран вирус РРСС признан самым экономически значимым для свиноводства патогеном (Meng, 2000). Так, в США до 60% экономических потерь свиноводства, связанных с инфекционными заболеваниями, обусловлены вирусом РРСС. Существенный ущерб свиноводству приносят прежде всего мертворождение, аборты, гибель поросят и снижение опоросов. Для РРСС характерна высокая контагиозностц способность к длительной бессимтомной перелете нции, что осложняет контроль и борьбу с заболеванием.

Возбудитель принадлежит к роду Arterivirus семейства Arteriviridae. Вирус РРСС представлен двумя типами, имеющими примерно 60% гомологи по нуклеотидной последовательности, - американским и европейским. Американские изоляты имеют более высокую вирулентность. С 1996 года, после применения в Дании живых вакцин против РРСС на основе вируса американского типа, американские изоляты появились на территории западной Европы (Bother et al-, 1997; Madseo et al., 1998), они встречаются так же в Китае и Японии (Shibata et al., 1996; Tong et al., 1999). Описано появление европейских изолятов на территории США- В России циркулирует вирус европейского типа, который присутствует в российских хозяйствах с 1990 года. До последнего времени не существовало полных данных по распространенности этого заболевания на территории нашей страны.

ЦНБ МСХА

В России до недавнего времени отсутствовали средства дня диагностики и эпизоотического мониторинга РРСС, разработка которых в условиях экспансии вируса по территории нашей страны представляется крайне актуальной. Серологические методы исследования представляются наиболее удобными для контроля за распространением вируса, так как персистенцня вируса может протекать бессимтомно, РНК вируса в сыворотке крови не всегда обнаруживается, но присутствуют антитела к вирусу РРСС. В этих условиях крайне важной задачей была разработка отечественной тест-системы на основе ИФА для определения антител к вирусу РРСС.

Культивирование вируса сопряжено с рядом сложностей. Многие изоляты размножаются только в первичной культуре альвеолярных макрофагов, изоляты европейского типа накапливаются в низких титрах. Не все первичные культуры альвеолярных макрофагов оказываются чувствительными к вирусу. Таким образом, затруднено получение вирусных антигенов, которые можно было бы использовать в качестве специфических компонентов диагностических: тест-систем на основе иммуноферментного анализа. В этих условиях актуальной задачей является получение рекомбинантных антигенов для использования в качестве компонентов тест-системы на основе метода иммуноферментного анализа (ИФА). В нашей работе была поставлена задача получения рекомбннантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС и разработки на его основе тест-системы для определения антител к вирусу РРСС.

Цель в задачи исследования.

Целью данной работы была разработка технологии получения рекомбинантных нукяеокапсидных антигенов вируса РРСС и создание на их основе иммунофермеятной тест-системы для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в сыворотке крови животных.

Для достижения указанной цепи были поставлены следующие задачи;

-2-

1. Провести предварительные исследования распространенности вируса РРСС на территории России и Белоруссии.

2. Разработать технологию и получить рекомбинантные нуклеокапсидные белки вируса РРСС американского и европейского типов.

3. Методом непрямого твердофазного ИФА сравнить между собой антигенную активность полученных рекомб инантных продуктов с использованием сывороток крови, полученных от иммунных и неиммунных животных.

4. Охарактеризовать рекомбинантные белки при их использовании в ИФА в качестве антигенов и сравнить результаты с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-набора аналогичной направленности (ЮЕХХ, США).

5. Разработать на основе полученных и охарактеризованных: рекомбкнантных антигенов иммуноферментнуго тест-систему для выявления антител к вирусу РРСС.

6. Определить диагностическую ценность разработанной тест-системы с использованием панели референтных положительных и отрицательных сывороток крови.

7. Внедрить разработанную тест-систему в ветеринарную практику.

Научная новизва работы.

В результате исследования проб из свиноводческих хозяйств России и Белоруссии установлено, что вирус РРСС распространен примерно в 70% обследованных хозяйств.

Разработана технология получения рекомбинантных нуклеокапсидных белков вирусов РРСС американского и европейского типов. Установлено, что, несмотря на существенные различия в первичной структуре, полученные рекомбинантные нуклеокапсидные белки вируса РРСС американского и европейского типов, имеют схожую антигенную активность в ИФА при исследовании сывороток крови свиней из хозяйств России и Белоруссии.

-3-

На основе рекомбинаитного нуклеокапсидното белка вируса РРСС европейского типа разработана иммуноферментная тест-система для определения антител к вирусу РРСС.

Разработанная технология получения рекомбинантных белков используется в лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И, Ивановского РАМН для создания новых средств иммунодиагностики вирусных инфекций животных и птиц.

Практическим значимость работы.

Разработана диагностическая тест-система на основе непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу РРСС. Материалы исследований вошли в нормативно-техническую документацию на изготовление набора для серодиагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом иммуноферментного анализа («РРСС-СЕРОТЕСТ»), утвержденную Департаментом ветеринарии Минсельхоза России в установленном порядке {ТУ № 93 88-ОИ-42418073-02; Временное наставление по применению набора № 13-5-02/600 от 07.10.02). В 2002 году ИФА-набор «РРСС-СЕРОТЕСТ», предназначенный для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотае крови, успешно прошел комиссионные испытания и в настоящее время используется различными ветеринарными лабораториями нашей страны для иммунологического мониторинга и ретроспективной диагностики РРСС, а также для изучения формирования и оценки напряженности пост вакцинального иммунитета против РРСС.

Основные положения, выносимые на защнгу.

1. Технология получения и иммунохимическая характеристика рекомбинантных антигенов американского и европейского типов вируса РРСС.

2. Результаты разработки тест-системы на основе непрямого твердофазного ИФА по выявлению антител к вирусу РРСС.

-4-

3. Результаты апробации разработанной иммуноферментной тест-системы в экспериментальных и производственных условиях.

Апробация работы.

Результаты исследования доложены и обсуждены на международной конференции «The 82nd Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases (CRWAD)» (Сент-Луис, Миссури, США, 11-13 ноября, 2001 г.), на семинаре «Диагностика XXI века» в рамках международной сельскохозяйственной выставки «Золотая осень» (Москва, 11 октября 2003 г.), на семинаре проводимым ФГОУ Российская Академия кадрового обеспечения АПК (Москва, 24 ноября 2003 г.), на межлабораторном совещании сотрудников ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И, Ивановского РАМН (Москва, 13 ноября 2003 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы две научные работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, цели и задач, материалов и методов; результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Объем работы составляет 120 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает в себя 143 источника.

Ц. Собственные исследования.

Материалы н методы.

В работе использованы любезно предоставленные Dr. Trevor Drew (Veterinary Laboratories Agency, Wey bridge, Великобритания) моноклональные антитела WBE6 (специфичны к нуклеокапсидному белку вируса РРСС европейского типа) и SDOWJ 7 (специфичны к нуклеокапсидному белку вируса РРСС обоих типов). Референтные негативные сыворотки из Швеции любезно предоставлены Dr. Sandor Beliak (National Veterinary Institute, Uppsala, Швеция). Также использованы сыворотки крови от свиней из хозяйств России и Белоруссии.

Набор специфических праймеров был разработан на основе опубликованных последовательностей геномов референтного европейского штамма Lelystad (Meulenberg et al. 1993) и американского штамма NADC-S (Grebennikova et al. 2001). Для разработки праймеров использовали программы MacVector (Accelrys Inc., США) и Amplify (Bill Angels, University of Wisconsin, США) для Macintosh. Амплифицнровали ген в совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с гнездовой системой праймеров. Список использованных в работе праймеров приведен в таблице 1.

Таблица 1. Перечень использованных в работа праймеров.

F7 j'-cgc cct aai tga ata get gac-3'

R7 5'-eta ggc cjtc aag tac att ctg g-3'

EuroF7 S'-attcEErtcxeiiCCggtaaaaaccaga-S *

EuroR? 5 '-ccgca^9ttaacttpcacoctgact-3'

EuroBacF 5 '-aataaffiatccffflCCffitaaaMccaga-3'

AmerF7 5'-attcgg£tccaaataacaacggcaag-3 *

AroerR7 5 '-ccgcaagcttaacttpcaccctgact-3'

AmerBacF 5 '-aafaagggtccficcaaataacaacERC-3'

MJ3R i '-CBSgaaacagctatgac-3'

Для получения рекомбинантной донорной плазмиды рРаз1ВасНТа {Хтчйп^еп, США) для системы экспрессии Вас-Ю-Вас мы разработали два

специфических праймера, AmerBacF и EuroBacF, которые являются внутренними смысловыми праймерами в гнездовой ПЦР, остальные специфичные к ORF7 праймеры, использованные в работе, были разработаны для диагностической ПЦР тест-системы (Власова и др. 2003).

Внутренние праймеры содержат на 5'-конце сайты рестрикции ВашН I и Hind III (в таблице 1 подчеркнуты) для последующего клонирования полученных амплификатов.

Для амплификации гена ORF7 вируса РРСС использовали в качестве материала культуру клеток MARC-145, зараженных штаммами вируса РРСС: NADC-8 или 45+ Воронеж.

ОТ-ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл - 50°С - 1час и 95°С - 5 минут; 5 «затравочных» циклов - 94ВС - 45 сек, 50°С - 45 сек, 72°С - 60 сек; 25 основных циклов - 94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 30 сек; завершающий цикл - 94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 50 сек. ПЦР с внутренними праймерами проводили по аналогичной схеме, исключая первый цикл.

Получение рекомбинантных плазмнд проводили методом рестрикции-лнгнрования. Для этого амплификаты очищали в агарозном геле с йодндом натрия н носителем (SÍOi) и обрабатывали рестриктазами в течение часа при 37°С. Фрагменты, очищенные в геле, использовали в реакции лигирования. Цитирование проводили в течение ночи при 16°С с лигазой Т4 (Fermentas, Литва).

Лигазной смесью трансформировали Rcoli, полученные клоны проверяли методом ПЦР и рестрикционным анализом. Положительные по рестрикционному анализу клоны использовали для определения нуклеотидной последовательности гена ORF7.

Наработку рекомбинантных нуклеокалсидных белков осуществляли с использованием системы экспрессии E.coU рЕТ (Novagen, США) и бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых Вас-:о-Вас (Invitrogen, США). Рекомбинантные продукты имели на своем конце б

-7-

гистидиновых остатков. Очистку рекомбинантных продуктов проводили методом металло-аффинной хроматографии согласно методике изготовителя Ni-NTA агарозы (Qiagen, США).

Экспрессию гена ORF7 в клетках ELcoli осуществляли по методике изготовителя (Novagen, США). Трансформацию рекомбинантной плазмидой экспрессионного штамма E.coli BL21(DE3) и индукцию проводили по стандартным методикам (Sambrook et al., 1989).

Трансфекцию клеток насекомых Sf-21 проводили при помощи реагента CeJlFECTIN (Invitrogen). Для этого на монослой клеток, промытый бессывороточной средой HyQ IPL-41 (Hyclone, США), наслаивали смесь, содержащую CellFECTTN и 5-10 мкл раствора бакмидной ДНК.

Осадок клеток лнзировали в буфере, содержащем 6М гуанидин шдрохлорида го расчёта 10 мл буфера на 1 г биомассы. Клеточный лизат осветляли центрифугированием, супернатант добавляли к Ni-NTA агарозе (1,5 мл), перемешивали и вносили в хроматографическую колонку. Не связавшийся с носителем белок отмывали буферами, содержащими повышающиеся концентрация нмидазола (10, 20, 50 мМ соответственно). Элюцию проводили буфером, содержащим 250 мМ нмидазола.

Специфичность очищенных продуктов подтверждали в реакции непрямого ИФА с моноклональными антителами и в иммуноблоте, для оценки чистоты рекомбинантных продуктов использовали электрофорез в ДСН-ПААГ.

Сравнение рекомбинантных антигенов друг с другом, а также результата анализы сывороток с использованием полученных антигенов и в тест-системе HerdChek ELISA компании ГОЕХХ (США) осуществляли в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови свиней. Чувствительность и специфичность разработанной экспериментальной тест-системы определяли с панелью положительных и отрицательных референтных сывороток.

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Анализ сывороток из хозяйств России и республики Беларусь на присутствие антител к вирусу РРСС

Было проанализировано более 700 сывороток свиней из 32 хозяйств 21-го административного района России и из 19 хозяйств 6-и административных районов Белоруссии. Для обнаружения специфических антител против вируса РРСС использовали коммерческий набор фирмы ШЕХХ (США). В результате исследований, антитела к вирусу РРСС были найдены в 37 хозяйствах из 51.

Таким образом, вирус распространен примерно в 70% хозяйств. Одновременно другими исследователями показано, что в этих хозяйствах циркулируют европейские изоляты вируса РРСС (Гребенникова и др. 2003). Однако, американские изоляты могут попасть на нашу территорию из Западной Европы или Китая, их появление на территории России возможно в случае применения в отечественных свиноводческих хозяйствах живых вакцин против вируса РРСС. Поэтому требовалось разработать универсальную тест-систему для выявления антител к вирусу РРСС. Для достижения этой цели были получены и охарактеризованы в реакциях непрямого ИФА рекомбинантные нуклеокапсидные белки американского и европейского типов вируса РРСС,

2. Создание геиноииженериых конструкций для экспрессии генов нуклсокансидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в клетках насекомых.

2.1. Амплификация генов нуклеокапсядного белка CORF7).

Для проведения ОТ-ПЦР были использованы универсальные для вирусов обоих типов праймеры F7 и R7. Для проведения второй стадии ПЦР использовали: праймеры AmerBacF и AmerR7 для штамма NADC-8; праймеры EuroBacF и EuroR7 для штамма 45+ Воронеж.

В результате проведения ОТ-ГЩР получены специфические фрагменты ДНК, соответствующие по размеру ожидаемым (3 н.п. для американского и 403 н.п. для европейского типов),

Обработанные рестриктазами фрагменты ДНК л и пировал и по липким концам с донор ной плазмидой pFastBacHTa.

2.2. Получение рекомбинантных донори ых плазм ид для бакуловирусной системы экспрессии, несущих ген ORF7.

Первым шагом на пути создания ре ш мб кнаншо го б акулов нрус н о го генома является получение донорной плазмиды pFastBacHTa, несушей ген ORF7. Донорная ллазмида включает в себя так называемую эхслреесионную кассет)' с сайтом для клонирования чужеродных генов, которая фланкирована последовательностями транспозона Тп7.

Методом рестрикции-л игирования амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в допорную плазмиду. Лигазной смесью трансформировали Е.соН, полученные клоны проверяли методом ПЦР и рестрищионньш

Рисунок 1. Проверка рекомбинантных лонорньи плазм ил pFastBacHTa'ORF 7 методом рестрикции, i Маркер молеку лярного веса ?V(Hmd Iii + EcoR I). 564 и.

2,3. Плззмнды, несущие вставку ORF7 европейского типа вируса РРСС, 4,5. Плазмиды, несущие вставку ORF7 американского типа вируса РРСС.

388/403 н.п.

анализом (рисунок I). Видно, что выреззвшиеся фрагменты ДШС расположены в геле ниже полосы 564 к л. маркера молекулярного веса,

- Ю-

соответствуя по размеру генам нуклеокапсида европейского {403 н.л.) и американского (388 н.п.) типов вируса РРСС.

Отобранные по рестрикционному анализу клоны использовали для определения нуклеотидной последовательности гена ORF7.

2.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7. кодирующих нуклеокапсидный белок.

Полученные ген но инженерные конструкции, несущие последовательности генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС, были секвенированы. Установлено, что рекомбинантные плазм иды несут последовательность, полностью идентичную ORF7 исходных штаммов.

2.4. Получение рекомбинантного 6акулавирусного генома,, нееvшего ген ORF7.

Следующим этапом работы было получение рекомбинантного бакуловирусного генома, несушего проверенные секвенированием гены ORF7 американского и европейского типов вируса.

Использованная нами система Bac-to-Bac отличается от классической бакуловирусной системы экспрессии одной значительной особенностью -получение рекомбинантного бакуловирусного генома происходит в E.coli, где геном бакуловируса находится в виде минихромосомы - бакмиды. Выделенная из E.coii ДНК рекомбинантного бакуловируса инфекционна и непосредственно используется для заражения клеток насекомых и получения в них экспрессии чужеродного гена. Это исключает стадию отбора рекомбинантных бакуловирусов на культуре клеток насекомых и упрощает работу исследователя.

Рекомбинантные донорные плазм иды pFastBacHTa/ORF7 с генами нуклеокапсидного белка американского и европейского типов были использованы для трансформации клеток E.coli DHIOBac, несущих

- И -

инфекционный геном б акуло вируса в виде бакмнды 130 тыс. н,п.), При рекомбинации между до норной плазм и до й и бакмидой экс пресс ионная кассета переносится прямо в ген 1ас2а-пептнда, Рекомбинантные колонии при этом остаются белыми на среде, содержащей Х-йа! и 1РТС. Через 48 часов после высева трансформированных бактерий на чашки Петри с селективной средой, на основании цветного теста были отобраны рекомбинантные колонии.

Рисунок 2, Проверка клеток DHlOBac, несущих ре комби нантный баку л о ви рус н ы ft геном, на предмет наличие в нем вставки гена ORF7.

1-5. Бакуловнрусный геном со вставкой ORF7 вируса РРСС европейского типа.

6-10. Бакуловнрусный геном со вставкой ÖRF7 вируса РРСС американского типа. Клоны 1 -9 положительные, клон 10 - отрицательный, 11. Маркер ДНК >У(НЫ 111 + EcoR I).

Ввиду невозможности проверки бакмнды на наличие вставки методом рестри кцион н о го анализа, для подтверждения присутствия вставки ORF7 колонии белого цвета анализировали методом ПЦР. Для этого использовали

один праймер, специфический для вставки, в нашем случае - EuroBacF или AmerBacF. Второй праймер, антисмысловой MI3R, специфичен для бакмиды, место его отжига находится на 603 нуклеотида ниже сайта рекомбинации.

На рисунке 2 представлены результаты проверки рекомбинантных колоний штамма E.coli DHlOBac, трансформированных плазмидами pFastBacHTa со вставкой генов ORF7 американского и европейского типов. Видно, что получены фрагменты ДНК нужного размера - около 1006 н.п. для ORF7 европейского и около 991 н.п. для ORF7 американского типа вируса.

Рекомбинантные бакмиды, наличие гена ORF7 в которых подтверждено методом ПЦР, использовали для трансфекции клеток насекомых.

3 Создание генной нженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокалсндного белка американского и европейского типов вируса РРСС в системе экспрессии в E.coli.

3.1 Амплификация генов нуклеокапси дно го белка (ORF7).

Для проведения ОТ-ПЦР были использованы универсальные для вирусов обоих типов праймеры F7 и R7. Для проведения второй стадии ПЦР использовали: праймеры AmerF7 и AmerR7 для штамма NADC-8; праймеры EuroF7 и EuroR7 для штамма 45+ Воронеж.

В результате амплификации полученные фрагменты ожидаемого размер - 388 н.п. для NADC-8 и 403 н.п. для 45+ Воронеж.

3.2. Получение рекомбинантных экспрессионных плазмндных векторов для системы экспрессии в клетках £.со/г. несущих гены ORF7-

Методом рестрикции-лигирования амплифицированный фрагмент встраивали в экспресс ионную плазмиду рЕТ-23Ь(+). Проверенные методом ПЦР клоны были использованы для выделения рекомбинатных шшмид. Получено четыре плазм иды. Выделенные плазм иды pET-23b(+)/ORF7 оказались положительными по рестрикупонному анализу.

3.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7,

Полученные рекомбинантные плазм иды pET-23b(+)/ORF7 были использованы для определения нуклеотидной последовательности ORF7. Показано, что рекомбинантные плазм иды несут последовательность, полностью идентичную ORF7 исходных штаммов.

3.4. Экспрессия генов нуклеокапсилных белков вируса РРСС американского и европейского типов в E.coli.

Принцип экспрессии гена ORF7 в E.coli заключается в следующем. В экспресс ионной плазмиде чужеродный ген находится под контролем промотора фага Т7. Хромосома клеток экспрессионного штамма содержит копию гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем промотора lacUV5. Индукция экспрессии гена происходит при добавлению в ростовую среду IPTG, снимающего репрессию гена РНК-полимеразы Т7.

Синтез рекомбннантного нуклеокапсидного белка (rN) контролировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ (рисунок 3). Видно, что после индукции преимущественно нарабатывался рекомбинантный продукт.

Собранную после индукции биомассу E.co!i использовали для выделения рекомбинантных белков методом металлоаффинной хроматографии.

4. Очистка и характеристика рекомбинантных нуклеокапсилных белков.

Для дальнейшего использования рекомбинантных продуктов в реакциях непрямого ИФА требовалась их очистка. Обе использованные системы экспрессии дают рекомбинантный продукт, имеющий на своем конце (N-конец в «Bac-to-Bac» и С-конец в системе экспрессии рЕТ) шесть гистидиновых остатков, Это позволяет очищать белок из клеточного лизата методом металлоаффинной хроматографии.

14 кД

Рисунок 3, Индукция экспрессии генов нуклеокапсидного белка в Е.соП

(система рЕТ). А - европейский тип гИ, В - американский тип гК 1- неиндуцированный материал, 2 - материал после индукции.

4.1. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из клеток насекомых,

Наблюдение за выходом белка с колонки осуществляли с использованием проточного спектрофотометра (ЬКВ Вготта, Швеция) при длине волны 280 нм. Активность полученных фракций анализировали методом непрямого ИФА с моноклональными антителами БГХЖ! 7.

Результаты первых опытов показали, что уже при отмывке с 50мМ имидазола происходит элюирование очищенного рекомбинантного нуклеокапсидного белка. Поэтому в дальнейшем было решено производить отмывку буферами, содержащими 10 и 20мМ имидазола, а элюировать продукт буфером, содержащим 250мМ имидазола. На рисунке 4 представлены полученные по данной методике профиль элюции и активность фракций при выделении нуклеокапсидного белка европейского типа. Видно, что сначала происходит смыв с колонки общего белка, в том числе выходит и

часть не связавшегося с носителем реком б и н ан тно го продукта. Затем следует небольшой пик оптической плотности при 280 нм, не сопровождающийся пиком активности соответствующих фракций в ИФА. Этот пик, видимо, соответствует белкам с относительно высоким содержанием гиствдиовых остатков. Затем, после добавления буфера элюции, происходит выход с колонки небольшого количества белка, имеющего высокую активность в реакции непрямого ИФА с моноклональными антителами. Этот пик соответствует рекомбинантному продукту.

№ фракции

Рисунок 4, Очистка рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС методом металлозффинной хроматографии и оценка его антигенной активности в непрямом ИФА Стрелками обозначены следующие этапы выделения:

1 - добавление клеточного лизата

2 - отмывка буфером, содержащим 20мМ имидазола

3 - добавление буфера элюции, содержащего 250мМ имидазола

Содержание белка во фракциях, полученных в результате элюшш. составило 0,822 мг. Исходный клеточный лнзат содержал 74 мг белка, выход очищенного продукта относительно общего белка составил, таким образом, 1,1%.

4.2. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из E.colt.

Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков из E.coli проводили аналогичным образом. Профиль элюшш н распределение активности по фракциям соответствовали данным, полученным для рекомбинантных нуклеокапсидных белков из бакуло вирус ной системы экспрессии.

Выход белка в системе экспрессии E.colt составил около 5,2% относительно общего содержания белка в лизате.

4.3. Иммунохимический анализ рекомбинантных продуктов.

Для подтверждения специфичности выделенных и очищенных продуктов мы провели ПААГ-электрофорез и иммуноблот с моноклональными антителами SDOW17 и \VBE6, На рисунке 5 приведены результаты анализа rN европейского типа.

На электрофоре грамме хорошо заметна специфическая полоса, соответствующая нуклеокапсидному белку (около 14 кДА), после индукции экспрессии гена ORF7 в E.coli, Видно, что методом металлоаффинной хроматографии получен гомогенный препарат рекомбннантного нуклеокапсидного белка.

На основании приведенных данных иммуноблота и данных по активности фракций в реакции с моноклональными антителами мы сделали вывод о специфичности полученных рекомбинантных продуктов.

94.6 кДа-- 1 2 3 4 5

66.2 кДа--

45 кДа--

31 „да--

21,5 кДа *

14,4 кДа .

Рисунок 5. Очистка рекомбинантных белков гЫ европейского типа и подтверждение их специфичности в реакции с моноклональными антителами WBE6 в иммуноблоте, Приведены результаты ПААГ-элекхрофореза rN из системы экспрессии рЕТ до (2) и после (3) очистки, специфичность продукта подтверждена в реакции иммуноблота (4), Приведен результат иммуноблота гЫ из системы экспрессии Вас-(о-Вас (5).

Для сравнения представлен маркер молекулярного веса (1).

4.4. Определение оптимального количества рекомбинантных нуклеокапсшдных белков для их использования в качестве антигенов в непрямом твердофазном ИФА.

В предыдущих экспериментах нами была подтверждена специфичность очищенного продукта. Очищенный антиген реагировал с моноклональными антителами в непрямом ИФА и в иммуноблоте. Следующим этапом является выбор оптимального разведения очищенного продукта для сорбции на 96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа.

Рисунок 6. Определение оптимальной концентрация гМ на планшете для иммуноферментного анализа методом непрямого ИФА с положительной (1) и отрицательной (2) сыворотками н разведен ни !:50.

^45(1

С [мкг/мл (

Для этого эксперимента были использованы положительная (тест-система ШЕХХ) и референтная отрицательная сывортка. Данные по зависимости оптической плотности (А450) от концентрации антигена, сорбированного на планшете для ИФА, показали, что при нанесении антигена в концентрации более 0,5 мкг/мл наступает насыщение поверхности плашки сорбированным рекомбннантным продуктом и его добавление в больших количествах почти не изменяет значения А^,

Для всех последующих экспериментов мы использовали для сорбции антиген в концентрация 0,5 мкг/мл.

В результате эксперимента с определением насыщаю шей концентрации ре комби н а нтн ого продукта при сенсибилизации 96-луночных планшетов для

-19-

ИФА, нами была выбрана оптимальная концентрация рекомбинантного нуклеокапсидного белка для его использования в качестве антигена в реакции непрямого иммунофермектного анализа.

5. Сравнение антигенной активности рекомбииаитных белков нуклеокапснда американского н европейского типов вируса РРСС и рекомбииаитных белков одного типа, полученных в разных системах экспрессии, в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней.

Сравнение различных антигенов имеет следующие цели. Необходимо было установить, как корреллируют результаты использования гИ американского и европейского в реакциях непрямого ИФА для оценки возможности и путей создания универсальной диагностической тест-системы, способной выявлять антитела к двум типам вируса. Также необходимо было сравнить активность антигенов одного типа из разных систем экспрессии для выбора той из них, которая будет использоваться при производстве диагностической тест-системы.

В реакции непрямого ИФА проверили восемьдесят попевых сывороток на четырех антигенах, сыворотки использовали в разведении 1:50.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции, полученные при сравнении активности антигенов в непрямом ИФА с сыворотками крови свиней (Р<0,05).

гЫ 45+ Воронеж, Вас-й>-Вас гИ 45+ Воронеж, рЕТ гИ 45+ Воронеж, Вас4о-Вас

г = 0,91 г = 0,94 г = 0,92

гЫ 45+ Воронеж, рЕТ г^АОС-Е, рЕТ гКЫАОС-8, Вас-1о-Вас

В литературе данные об активности рекомбинаитных нукпеокапсидных белков вируса РРСС одного типа с сыворотками животных, содержащих

-20-

антитела к вирусу другого типа, противоречивы. Не было однозначного ответа на вопрос о том, возможно ли создание универсальной тест-системы на основе рекомбинантного белка одного типа, или необходимо использовать смесь американского и европейского гМ.

Результаты, приведенные в таблице 2, демонстрируют высокую корреляцию антигенной активности как рекомбинантных нуклеокалснцных белков вируса РРСС одного типа из разных систем экспрессии, так и рекомбинантных нуклеокапсндных белков из вирусов разных типов. Для наглядности приведено сравнение результатов анализа полевых сывороток с американским и европейским гИ (рис. 7).

В результате этого эксперимента установлено, что, несмотря на существенные отличия в первичной структуре нуклеокапсндных белков американского и европейского типов, они ведут себя сходным образом в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови свиней. Установлено также,

Рисунок 7. Сравнение гМКАОС-8 и гК 45+ Воронеж из системы экспрессии в Е.соИ (коэфф. корр. 0,94).

Амо^п

1,0 -

2 о,8 Н «

а

04

о

т 0,6 -+

VI

-ч-

25 0.4 Ч

ц

0,2 -О А

♦♦V *

• V •

* *

00

\

0,2

—г-

0.4

I

0,6

гЫ ЫАЕС-8

—г~ о .в

— 1,0

1.2

430

что rN одного типа, полученные в разных системах экспрессии имеют сходную антигенную активность.

На основании полученных данных мы делаем вывод том, что каждый полученный rN в отдельности может быть использован в качестве специфического компонента тест-системы на основе ИФА. Однако, в связи с противоречивостью литературных данных, было решено провести более широкие исследования с каждым из полученных антигенов в параллели с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА сыворотками крови свиней и только после этого принять окончательное решение о том, какие рекомбинантные нуклеокапсндные белки будут использованы в диагностической тест-системе.

б. Сравнение результатов применения рекомбинантных нуклеокапсндных белков в качестве антигена в непрямом ИФА с результатами применения коммерческое тест-системы фирмы IDEXX для анализа сывороток крови иммунных и неиммунных свней.

В настоящее время в серодиагностике вируса РРСС не существует общепризнанного референтного метода, так называемого «золотого стандарта». Одной из самых распространенных коммерческих тест-систем на основе ИФА, применяемой повсеместно, является тест-система «HerdCheck» компании IDEXX (США). Ряд исследователей, разрабатывавших тест-системы для определения антител к вирусу РРСС на основе ИФА, использовали в качестве референтного метода тест-систему IDEXX (Witte et al., 2000; Seuberlich et al., 2002), которая и сейчас является самым распространенным коммерческим набором.

Результаты сравнения анализа сывороток тест-системой IDEXX и с применением рекомбинантных антигенов приведены в таблице 3. Получены высокие коэффициенты корреляции для всех нуклеокапсидных белков. Это подтверждает сходство их антигенных свойств.

Таблица 3, Коэффициенты корреляции при сравнении результатов непрямого ИФА с использованием полученных рекомбинантных антигенов и коммерческой тест-системы ШЕХХ (Р<0,05).

гМ 45+ Воронеж, рЕТ гИ45+ Воронеж, Вас-ь>-Вас гЫИАОС-Х, рЕТ г^АЕ>С-8, Вас-Ю-Вас

ШЕХХ 0,83 0,81 0,81 0,83

На основании результатов, полученных в разделах 5 и 6, сделан вывод о возможности использования любого из четырех полученных антигенов в качестве специфического компонента тест-системы на основе ИФА. Принято решение об использовании рекомбинантного нуклеокапсидного белка европейского типа, полученного в системе экспрессии Е.соИ в концентрации 0,5 мкг/мл, для дальнейшего использования в качестве антигена при производстве разработанной универсальной тест-системы.

Таким образом, разработана универсальная тест-система ИФА для определения антител к вирусу РРСС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС европейского типа. Разработан производственный регламент н временное наставление по использованию тест-системы.

7. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой ШЕХХ в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней и оценка «отсекающего» значения коэффициента связывания (Ксв).

7.1, Определение отсекающего значения коэффициента связывания.

Результаты иммуноферментного анализа сывороток выражаются коэффициентом связывания Ксв. Важным этапом при разработке новой тест-системы является определение так называемого «отсекающего» значения Ксв, определяющего границу между отрицательными и положительными

-23-

Рисунок 8. Определение отсекающего значения коэффициента связывания (Ксв) в опытах с положительными и отрицательными сыворотками.

1—I—Г

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Значение К (%).

В

1—I—I—I—I—I—I—I

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Значение К (%), А - результаты анализа положительны> сывороток В - результаты анализа референтных отрицательных сывороток.

сыворотками. Все сыворотки, значение Ксв для которых меньше «отсекающего», считаются отрицательными, тогда как сыворотки со значением Ксв равным или превышающем этот показатель считаются положительными.

Для определения этого значения мы использовали 435 референтных отрицательных сывороток и 30 полевых сывороток из хозяйств России н Белоруссии, которые сработали как положительные в наборе ШЕХХ. Результаты этого эксперимента приведены на рисунке 8. Видно, что значением Ксв, при котором минимально количество ложнопсшожительных и ложноотрицательных сывороток, является 30%.

На основании приведенных данных принято считать «отсекающим» значением Ксв 30%.

7.2. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой ГОЕХХ в реакциях непрямого ИФА с полевыми сыворотками.

Экспериментальный образец разработанной тест-системы использовали для сравнения с тест-системой ГОЕХХ на выборке из 44 полевых сывороток. Тест-система была изготовлена согласно производственному регламенту, анализ сывороток проводили согласно временному наставлению.

На рисунке 9 представлены результаты сравнения тест-системы с набором ШЕХХ на случайной выборке из 44 полевых сывороток из России н Белоруссии.

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что разработанная тест-система имеет высокий коэфнинент корреляции (г=0,8б,

Рисунок 9. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой ГОЕХХ

100- • •

80- • • * •

Ксв, НАРВАК 6040 - • • . • -• • • * • • • •• • • • • ••

200 - * * • •

1 • 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

5/Р, ЮЕХХ

Р<0,05) с коммерческой тест-системой ШЕХХ, признанной международным стандартом, и возможно ее производство и применение согласно разработанной документации.

8. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-снетемы.

Основными характеристиками любой тест-системы, являются ее специфичность и чувствительность Для определения этих параметров разработанной тест-системы использовали панель референтных сывороток: 435 референтных негативных сывороток из Швеция и 31 положительная в тест-системе ШЕХХ палевая сыворотка.

Результаты анализа этих сывороток суммированы в таблице 4. Чувствительность и специфичность вычисляли следующим образом:

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ = (—)*] 00% а+с

СПЕЦИФИЧНОСТЬ = {-~)Х\ 00% а + Ь

Таблица 4. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

Положительные по ШЕХХ Отрицательные референс-сыворотки

Положительные с рекомбинантным антигеном а 29 Ь $

Отрицательные с рекомбинантным антигеном с 2 <1 427

Значения чувствительности и специфичности составили 93,5 и 98% соответственно.

9, Испытание разработанной тест-системы на широкой выборке полевых сывороток.

В течение 2003 года разработанная система производилась НПО НАРВАК, различными ветлабораториями тест-система использована для постановки свыше 5000 анализов для обследования животных с целью иммунологического мониторинга поголовья, ретроспективной диагностики болезни и оценки напряженности поствакцинального иммунитета против РРСС. Также она применялась в лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН для анализа поступающих из хозяйств проб.

Таблица 5. Результаты исследований сывороток крови свиней с помощью разработанной тест-системы на присутствие антител к вирусу РРСС.

Регион Всего + -

Череповецкий р-н 121 60 61

Костромская обл. 110 26 84

Дмитровский р-н Московской обл. 355 1 354

Новосибирская обл. 13 12 1

Витебская обл., Белоруссия 15 12 3

Пермская обл. 61 34 27

Зарайский р-н Московской обл. 5 - 5

Томский р-н. 101 60 41

Белгородский р-н. 64 64 -

Нижегородская обл. 58 28 30

Итого 903 297 606

Результаты анализа приходящих из хозяйств сыворток приведены в таблице 5. Сыворотки получены из 10 хозяйств из различных регионов России и Белоруссии, видно, что в большинстве из них присутствуют

антитела к вирусу РРСС, что подтверждает данные о широком распространений вируса в свиноводческих хозяйствах двух стран.

Таким образом, разработанная тест-система внедрена в производство и успешно применяется для анализа сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС.

Выводы.

1. На основании проведенных исследований установлено широкое распространение вируса РРСС в различных свиноводческих хозяйствах {до 70% от числа обследованных) на территории Белоруссии и Российской Федерации.

2. Разработана технология получения рекомбинантных нуклеокапсидных белков вирусов РРСС, Установлено, что гены нуклеокапсидного белка вируса РРСС европейского (45+ Воронеж) и американского (ЫЛОС-$) типов эффективно экспрессировались в Е.соИ и бакуловирусной системе экспрессии, при этом выход рекомбинантного продукта составил 5,2% и 1,1% соответственно.

3. Установлено, что очищенные металлоаффинной хроматографией рехомбинанткые белки нуклеокапснда вируса РРСС имеют выраженные антигенные свойства, и могут быть использованы в качестве антигенов в непрямом твердофазном ИФА для выявления вирус-специфических антител.

4. Проведены сравнительные исследования рекомбииаитных белков нуклеокапснда вируса РРСС европейского и американского типов, полученных в прокариотнческой и эукариотнческой системах экспрессии. Показана сопоставимая антигенная активность рекомбинантных белков при их использовании в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе (г= 0,91-0,94,Р<0,05).

5. С учетом данных о преимущественной циркуляции на территории России изолятов вируса РРСС европейского типа, установлено, что рекомбинантный белок нуклеокапснда нз отечественного штамма 45+

-28-

Воронеж может быть использован для разработки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу РРСС.

6. Разработан метод непрямого твердофазного ИФА, предназначенный для выявления антител к вирусу РРСС. При исследовании панели референс-сывороток показана высокая чувствительность и специфичность диагностической тест-системы (93,5% и 98% соответственно). Установлена высокая степень корреляции результатов исследований полученных с помощью разработанного ИФА-набора («РРСС-СЕРОТЕСТ») и ЙФА-набора (IDEXX, США) аналогичной направленности (г= 0,86, Р< 0,05).

7. Установлено, что разработанный ИФА-набор «РРСС-СЕРОТЕСТ» может эффективно применяться для обследования животных с целью иммунологического мониторинга поголовья, ретроспективной диагностики болезни и оценки напряженности постваюшнального иммунитета против РРСС.

Спмеок работ« опубликованных по теме диссертация.

1. Алексеев К. П., Грабовецкий В. В., Гибадулин Р. А., Мусненко М. R, Гребенникова Т. В., Алипер Т. И„ Непоклонов Е. А., ЗабережныЙ А. Д. Получение рекомоинантных вирусных белков е баку.ювирусной системе экспрессии для их дальнейшего использования в качестве специфических компонентов диагностических тест-систем на основе ИФА. Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», Владимир, 30-31 октября 2003, 180185.

2. Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Гибадулин Р. А., Мусненко М И., Богданова В. С., ЗабережныЙ А. Д., Алипер Т. И., Непокпонов Е. А, Синтез и антигенные свойства рекомбинантных белков американского и европейского типое труса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) в бакуловирусной системе. Вопросы вирусологии, 2004, принято в печать,

-29- !

i

Принято к исполнению 17/12/2003 Исполнено 1 В/12/2003

Заказ № 467 Тираж:60 экз.

ООО «НАКРА ПР1ГНТ» ИНН 7727185253 Москва, Балаклавский Пр-т, 20-2-М (095)318-40-68 н'чтл'.аиюгеГеш. ги