Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

Гребенникова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней"

Гребенникова Татьяна Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНА ЧИМЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ

03.00.06-вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Гребенникова Татьяна Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И Ф УНКЦИОНАЛЬНО ЗНА ЧИМЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ

03.00.06-вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

¿2.171М

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении НАРВАК, г. Москва

Научный консультант: Заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации ,

доктор биологических наук, НЕПОКЛОНОВ Евгений Анатольевич

Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор УРЫВАЕВ Леонид Викторович

Профессор

доктор биологических наук, ГРУЗДЕВ Константин Николаевич

Профессор

доктор биологических наук, ВАЛИХОВ Алексей Федорович

Ведущее учреждение:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится 21 ноября 2005 года в /-€^Часов на заседании Диссертационного совета Д 001.20.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан октября 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Н.П.Косякова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Работа посвяшена комплексному молекулярно-генетическому исследованию вируса, вызывающего репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС).

РРСС - инфекционное заболевание, которое обнаружено 1987 г. в Северной Каролине, США (Keffaber 1989) и Канаде (Dea S. et al. 1990) РРСС называли также загадочной болезнью свиней (mystery swine disease) В настоящее время РРСС является эндемичным заболеванием во многих, если не во всех странах с промышленным свиноводством (Goyal S. М. 1993) . Практически все страны мира, включая Россию, США и страны Западной Европы, несут огромные экономические потери сгт этого респираторного и репродуктивного синдрома свиней.

Заболевание выражается множеством клинических проявлений, но двумя наиболее характерными являются патология ор1анов дыхания и репродукции. Течение РРСС может сильно отличаться по проявлению признаков: от полного отсутствия клинической картины до выраженных признаков репродуктивных и респираторных нарушений. Респираторные расстройства, как правило, наиболее сильно выражены у поросят всех возрастов и проявчяются в виде неспецифических лимфомононуклеарных пневмоний (Halbur P. G. et al. 1996b и ip) Нарушения репродуктивной функции наблюдаются, в основном, у ремонтных свинок и свиноматок, инфицированных во время с>поросности (Christianson W. Т. et al. 1993; Mengehng W L et al. 1994). При эгом наблюдаются аборты, рождение мертвых или ослабленных поросят (Christianson W. Т. et al 1992; Terpstra С. et al. 1991), иногда гибель свиноматок (Zimmerman J J. et al. 1997a). Считают, что в неблагополучных хозяйствах РРСС способствует усилению других инфекционных заболеваний респираторного комплекса (Galina L. et al 1994; Carvalho L et al 1995;SolanoG etal 1995; Van Alstine W G. et al. 1996).

Вирус РРСС относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, порядка Nidoviroles (Cavanagh D. 1997). Предполагается, что вирус распространился из Канады в США. Происхождение вируса неизвестно. Различают два типа вируса РРСС: американский и европейский. Предполагают, что европейский и американский типы вируса имеют различные эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются (Nelson Е. A, et al, 1993; Wensvoott G. et al. 1992).

Вирус РРСС проникает в клетки иммунной системы, главным образом, в макрофаги (Wens\oort G. et al 1991; Voicu I L et al. 1994, Rossow K. D. et al. 1995; Rossow R. D. et al. 1996, Molitor T. \V. et al 1996) Быстрому распространению вируса способствует его

длительная персистенция в организме зараженных животных (Benfield DA et al 1997), его ирису! ствие в сперме (Christopher-Hennings J. et al. 1995, Swenson S L et al 1994). высокая контагиозность (Mengeling W L etal 1998).

Из-за сходства клинических признаков РРСС с признаками заболеваний, вызываемых другими вирусными или бактериальными патогенами, для точной диагностики РРСС требуются специфические лабораторные методы. Серологические тесты включают иммуноферментный анализ, реакцию нейтрализации и непрям} ю реакцию иммунофлюоресценции (Yoon I J. et al. 1992, Dea S et al 2000, Witte S В et al 2000) Вир>с выявляют с использованием иммуногистохимического анализа, окрашивания при помощи флюоресцирующих атител, методом поличеразной цепной реакции и выдепения вируса в культуре клеток (Paton D L eta!. 1992, Suares Р etal 1994, Christofer-Hennings J etal 1995, Mengeling W. L et al 1995). Секвенирование генома вируса РРСС позволяет, с определенной степенью точности, определить родство между разными штаммами

Для установления в хозяйствах стабильной ситуации относительно репродуктивного и респира горного синдрома свиней используют как частичную депопуляцию стада, так и его полную замену (в странах Европы и Америки), а также вакцинацию Для специфической профилактики РРСС используются, в основном, живые и инактивированные вакцины (Б. Г Орлянкин и др 2000) В настоящее время разрабатываются субъединичные и ДНК-вакцины, проводятся активные исследования иммунною ответа животных. Тем не менее, эффективность применения вакцин на практике в условиях широкого распространения и дтительной персистенции полевых штаммов вируса РРСС достоверно не подтверждена. В настоящее время не существует вакцины, которая эффективно защищала бы животных от заболевания. Более того, использование живых вакцин часто приводит к заболеванию животных из-за реверсии вакцинного штамма вируса к дикому типу (Smedegaar G. et al. 1997).

циркулирующих вир)сов РРСС Внрус-нейтрализующие антитела появляются поздно, через 3-4 нечели после инфицирования (Yoon K-J et al. 1995, l.oemba H D. et al 1996, Ostrowski M et al 2002) Известно, что гуморальный иммунный ответ организма на присутствие вируса РРСС не обеспечивает эффективной зашиты.

Очевидно, что для создания эффективных средств профилактики данного заболевания необходимы фундаментальные исследования В частности, необходимо подробное мопекулярно-генетическое исследование этого патогена, выявление генетических детерминант вирулентности вируса РРСС. Для разработки стратегии профилактики РРСС требуется комплексное изучение инфекционного процесса, включая выяснение особенностей патогенеза и также подробное молекулярное исследование вирусных изолятов, циркулирующих на территории России и пограничных с ней государств

Цель и задачи исследования

Работа посвящена комплексному молекулярно-генетнческому анализу вируса РРСС, в частности, выявлению функционально значимых генетических мутаций

Целью работы было подробное молекулярно-генетическое исследование вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и выявление детерминант вирулентности

Лля достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести исследование распространения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней на территории России и Белоруссии.

2. Разработать комплекс средств лабораторной диагностики РРСС, основанных на выявлении вируса и антител к нему:

- Разработать тест-системы для выявления вируса РРСС с использованием ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени на основе отечественных реагентов;

- Разработать набор реагентов для опреде пения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов, полученных из отечественных изолятов вируса РРСС.

3. Провести широкие производственные испытания разработанных отечественных тест-систем для выявления вируса РРСС и специфических антител.

4. Провести подробные молекулярные исследования полевых изолятов, циркулирующих на территории России и Белоруссии, методом прямого секвенирования и филогенетического анализа гена, кодирующего белок нуклеокапсида вируса РРСС.

5. Провести сравнение in vivo свойств трех различных вариантов североамериканскою штамма вируса РРСС NADC8: вирулентного штамма NADC8-2, атгенуированного варианта, полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8-251, а также промежуточного варианта, выделенного от свиньи после частичной реверсии атгенуированного вируса -NADC8-252P.

6. Определить полную первичную структуру геномов у трех штаммов вируса РРСС: вирулентного штамма NADC8-2, его аттенуированного мутанта, пол; ченного пассированием в культуре клеток (NADC8-251), а также частично ревертировавшего вируса (NADC8-252P)

7. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного штамма NADC8-251 и частично ревертировавшего NADC8-252P и на основе проведенного анализа определить функционачьно значимые участки генома, потенпиачьно ответственные за аттенуацию вируса, а также молекулярные детерминанты, связанные со свойствами вирулентности

8. Разработать стратегию и осуществить конструирование системы обратной генетики для внесения целенаправленных генетических изменений в РНК-геном вирусов РРСС, основанной на библиотеке полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма NADC8-251.

9. Получить рекомбинантные вирусы путем трансфекции перевиваемой культуры клеток in vitro, охарактеризовать их вирусологическими методами. Подтвердить генно-инженерное происхозденле вируса определением первичной структуры его генома

Научная новнзна работы

До начала комплексных исследований (1997-1998 гг) не было сведений о распространении вируса РРСС на территории Российской Федерации и пограничных с ней государств. В рамках данной работы бы по проведено обследование свиноводческих хозяйств России и Белоруссии на наличие антигел против вируса РРСС. Впервые было установтено широкое распространение вируса на территории этих государств Проведен подробный молекулярный анализ первичной структуры геномов полевых изолятов вируса РРСС. выделенных на территории Российской Федерации и Белоруссии Это позволило нам оценить степень вариабельности геномов вирусов, циркулирующих на данной территории, и разработать средства лабораторной диагностики РРСС. Были созданы и утверждены отечественные тест-системы для проведения комплексной лабораторной диагностики РРСС.

основанные на выявлении компонентов вируса и антител к нему Отечественных тест-систем ло этого разработано не было.

Впервые были подробно исстедованы молекулярные основы вирулентности и аттенуации вируса РРСС На основании исследования полной первичной структуры геномов трех вариантов вируса РРСС вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного варианта NADC8-251 и его ревертанта, образовавшегося в результате одного пассажа в организме свиньи NADC8-252P, обнаружены участки генома, которые могут играть ропь в приобретении вирулентности вирусом РРСС Впервые найдены генетические детерминанты вирулентности вируса РРСС.

Впервые создана библиотека полноразмерных инфекционных копий генома вируса РРСС, состоящая из 32 плазмид, для изучения фундаментальных генетических характеристик представителей рода Arienvirus методами обратной генетики Полноразмерные копии генома аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС собраны и клонированы в Ecoli. На основе полученных генноинженерных конструкций синтезированы РГПС-геномы и получены рекомбинантные инфекционные вирусы с минимальными различиями в первичной структуре генома по сравнению с родительским штаммом NADC8-251. Создание библиотеки, а не единичной инфекционной копии вируса РРСС, позволило успешно преодолеть трудности, связанные с нестабильностью генома вируса РРСС Таким образом, создана система обратной генетики, позволяющая проводить генетические манипуляции с вирусным РНК-геномом, что ранее было невозможно.

Впервые проведены исследования микроэлементного состава клеток MARC-145, инфицированных и не инфицированных вирусом РРСС, для определения воздействия вируса на биологическую систему. Определены специфические изменения микроэлементного профиля биологической системы.

Практическая значимость

широкомасштабные производственные испытания Результаты испытаний позволяют рекомендовать разработанные тест-системы для использования в хозяйствах Российской Федерации и пограничных с ней государств Тест-система для определения вируса РРСС методом ПЦР в реальном времени в настоящее время проходит комиссионные испытания Полученные результаты позволяют надеяться на то, что данная тест-система будет использоваться для широкого мониторинга хозяйств на наличие вируса РРСС.

Наличие инфекционных копий вируса РРСС, полученных на основе библиотеки полноразмерных геномов, позволит вносить генетические изменения в вирусный РНК-геном и получать вирусы с новыми свойствами.

Основные положения, пыноснмые на занпму

1 Подтверждение распространения вируса РРСС на территории России и Беторуссии, определением антител к вирусу на основе серологического анализа сывороток крови свиней

2 Создание и характеристика комплекса новых средств лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов' тест-систем для выявления вируса РРСС с использованием ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени и набора реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов.

3 Доказательство эффек1ивн0сти разработанных тест-систем для выявления вируса РРСС и антител к нему, полученных на основе отечественных реагентов в ходе масштабных производственных испытаний.

4 Оценка генетического разнообразия и генотипирование полевых изолятов вируса, циркулирующих на территории России и Белоруссии, и их филогенетический анализ

5. Экспериментальное подтверждение степени вирулентности или аттенуации трех вариантов полевого изолята КАОС8' высоковирулентпого КАЭС8-2, атгенуированного вируса КАОС8-251, а также вируса-ревертанта - ЫАЭС8-252Р.

6. Сравнительный анализ трех почноразмерных геномов, включающий анализ генов вирусных белков и регуляторных последовательностей вирусов ЫАОС8-2, КАОС8-25| и ИАПС8-252Р. Выявление потенциальных молекулярных детерминант, связанных со свойствами вирулентности вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

7 Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома атгенуированного штамма КАОС8-251 для исследования функциональных участков вирусного генома методами обратной генетики

8 Характеристика бибтиотеки инфекционных копий генома вируса РРСС и отбор рекомбинантного вируса РРСС со свойствами, приближенными к родительскому штамму иАОС8-251

Апробация результатов исследования: Материалы исследования доложены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ вирусологии им Д. И Ивановского, Научно-технического совета НПО НАРВАК, на Международной научно-практической конференции РУДН, Москва, 2004 г, на 7-м международном симпозиуме по исследованию положительно-цепочечных РНК-содержащих вирусов, Сан-Франциско, США, 2004 г., на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветеринарных лабораторий субъектов РФ, Брянск, 2004, на 82-й и 84-й конференциях по болезням животных (CRWAD), Сент-Луис и Чикаго, США, 2001 г. и 2003 г , на конференции ВНИИЖЗ, Владимир, 2003 г, на Международной научно-практической конференции по болезням животных, Покров, 2003 г., на 17-м международном конгрессе ветеринарных вирусологов, Эймс, Айова, США, 2002 г, на 20-й конференции Американского общества вирусологии, Мэдисон, Висконсин, США, 2001 г., на XVI Менделеевском съезде по обшей и прикладной химии в Москве, 1998 г , на Симпозиуме МЭБ (OIE), Бирмингем, Великобритания, 1998 г, на международной конференции АТВ'92, Милан, Италия, 1992 г.

И>бликацин по диссертационной работе. По теме диссертации опубликовано 26 работ в периодических изданиях, материалах научных конференций, приняты к печати 4 работы.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на ^03> страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов' обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, приложения и список литературы, содержащий источников. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 39 рисунками

Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту Заслуженному вет. врачу РФ. дб.н Е. А. Непоклонову, д.б.н. Т. И. Алиперу, д.б.н. А Д. Забережному, профессору Б. Г Орлянкину, Заслуженному деятелю науки РСФСР, профессору В. А Сергееву, дбн А В. Сыроешкину, профессору В Менгелингу и д-ру К. Лагеру (NADC, Ames, USA) за разностороннюю научно-методическую помощь в работе. Автор приносит глубокую благодарность кб.н М. И. Мусиенко, к.б.н В. В Цибезову, В. С. Богдановой, В В Грабовецкому, О. В Елисеевой, H И Потаповой, А В. Байбак, к б н А. H

Власовой и к.б.н. К. П. Алексееву, совместно с которыми были выполнены отдельные фрагменты представленной работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Клеточные линии. Клеточные линии MARC-145 (субклон клеточной линии МА-104) и ВНК-21 были любезно предоставлены Dr. W. L Mengeling (Национальный институт болезней животных (NADC), США). Рекомбинантные штаммы бакуловирусов выращивали в клетках насекомых Spodopterafi-ugipedra (клеточные линии Sf-9, Sf-21). Клетки выращивали с использованием ростовой среды ТС-100 ("Life Technology", США), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коровы (СЭК) и гентамицин в концентрации 50 ед/мл при 27°С. В качестве поддерживающей использовали среду ТС-100, содержащую 5% СЭК. Для препаративного получения рекомбинантных антигенов использовали суспензионную или монослойную культуру клеток Sf-21, а также культуру клеток High-Five, адаптированную к росту в бессывороточной среде SF-900 ("Life Technology", США).

Полевые изоляты вируса РРСС. Двенадцать полевых изолятов вируса РРСС были получены из различных регионов центральной России и Белоруссии в период 1992-2000 г. г. (таблица 1).

Таблица 1. Полевые изоляты вируса РРСС, полученные из различных областей России и Белоруссии, используемые для секвенирования и филогенетического анализа.

Наименование изолята Место отбора образца

201 Rus, 92 Центральная Россия, 1992

202 Rus,01 Центральная Россия, 2001

203 Rus, 01 Центральная Россия, 2001

204 Rus, 01 Сибирь, Россия, 2001

205 Rus, 01 Сибирь, Россия, 2001

206 Rus, 01 Алтайский край, 2001

207 Bel, 01 Толочинский район, Беларусь, 2001

208 Bel, 01 Дубровецкий район, Беларусь, 2001

209 Rus, 86 Приморский край, Россия, 1986

210 Bel, 01 Оршанский район, Беларусь, 2001

211 Rus, 01 Центральная Россия, 2001

212 Bel, 01 Лепельский район, Беларусь, 2001

Изотаты были исследованы на антигенную специфичность, с использованием моноклональиых антител WBE6 (специфичные к европейскому генотипу вируса РРСС) и SDOW17 (j ниверсальнме, специфичные для двух генотипов вируса РРСС) Проверку на присутствие других вирусов осуществляли методом ГТЦР В качестве референтного штамма европейского типа внр}са РРСС был использован референтный штамм Leh'stad (предоставил Dr. Т Drew. Центральная ветеринарная лаборатория (CVL), г Вейбридж, Великобритания) В качестве положительного контроля американского типа вируса РРСС был использован штамм NADC8 (предоставил Dr. W L. Mengeling, Национальный институт болезней животных, (NADC), США).

Штаммы вируса РРСС и условия их культивирования. Штамм NADC8 вируса РРСС был вьшепен из сыворотки крови поросенка недельного возраста (К. Lager 1997). Вирус клонировали медодом предельных разведений и исследовали вирусологическими, серологическими и молекулярными методами Вирус адаптировали к размножению в перевиваемой культуре клеток методом серийного пассирования Вирусный материал после выделения в культуре клеток MARC-145 и однократного пассирования (пассаж 2) был использован в настоящей работе под названием NADC8-2. При экспериментальном заражении свиней была установлена высокая вирулентность NADC8-2 (W. Mengeling и др 1996, К Lager и др. 1997, К. Lager и др. 1999). После дополнительных 249 пассажей был получен высоко аттенуированный вирусный штамм NADC8-25I (пассаж 251), который при экспериментальном заражении свиней не вызывал клинических признаков болезни (W. Mengeling, 2003). "Пассаж 252Р" был получен через 28 дней после заражения свиньи штаммом NADC8-25I путем выделения вируса из крови и однократного пассирования в культуре клеток. Персистенция вируса в организме свиньи в течение 28 дней соответствует 84 циклам его репликации. Изолят NADC8-252P также является аттенуированным (в меньшей степени, чем NADC8-251), однако он полностью утерял высокую эффективность репродукции в культуре клеток, сравнявшись по этому показателю со штаммом NADC8-2.

Эксперименты с животными. Из 4-недельных поросят (гибрид Yorkshire х Chester White), выращенных в обычных условиях, сформировали 4 группы по 16 животных и поместили их в разные изоляторы в Национальном центре болезней животных (Эймс, США) Поросятам вводили интраназально вирус РРСС в дозе 2 х 10* ТЦИД50: штамм NADC8-2 (группа 4), NADC8-252P (группа 3); NADC8-251 (группа 2) и контрольный безвирусный материал (группа 1) По 4 животных из каждой группы были убиты методом внутривенного введения пентобзрбитала на 3, 10, 17 и 35-й дни после заражения Вирулентность

испочьзованных для заражения изолятов вируса РРСС оценивали, учитывая следующие параметры проявление клинических признаков РРСС, уровень и продолжительность вирусной репродукции, наличие вируса в сыворотке крови, сероконверсия животных, титры антител к вирусу РРСС в ИФА.

Выделение РНК из клеточных культур, зараженных вирусом РРСС. Суммарную РНК выделяли из моиослоя зараженных вирусом клеток с использованием тризола (Trizol, "Life Technology", США) по методике производителя.

Выделение РНК для ОТ-ПЦР проводили с использованием разработанного нами набора для выделения РНК с использованием неорганического носителя (Т В Гребенникова 1999)

Источники генов белка нуклеокапсида (N). В качестве источника гена белка N европейского варианта РРСС использовали РНК полевого изоляга "201 Rus 92" , выделенною из сыворотки крови свиньи, полученной в Воронежской области. Изолят вируса РРСС "201 Rus 92" был выделен в 1992 г. проф Б Г. Орлянкиным, генотипирован и адаптирован к перевиваемой клеточной линии MARC-145. В качестве источника гена белка N американского варианта вируса РРСС использовали РНК штамма NADC8-2.

Синтез рекомбинантного белка нуклеокапсида (rN) в экспрессионной системе рЕТ. Для получения рекомбинантной экспрессионной плазмиды использовали вектор рЕТ23Ь* (Novagen, США). Ген N-белка (ORF7) получали методом ОТ-ПЦР Очищенный продукт ОТ-ПЦР после расщепления эпдонуклеазами Bam HI и HindlH встраивали в векторную плазмиду под контроль промотора фага Т7 таким образом, что нуклеотидная последоватетьность, кодирующая шесть аминокислотных остатков гистидина. принадлежащая векторной плазмиде, оказалась на З'-конце гена белка N в одной рамке считывания Получающийся в результате экспрессии рекомбинантный белок содержал на С-коние шесть аминокислотных остатков гистидина, что дает возможность очищать продукт методом металло-аффинной хроматографии.

Для синтеза белка нуклеокапсида вируса РРСС использовали штамм Е coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, США) В хромосому этих бактерий включена копия гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем промотора lacUV5 Ген белка нуклеокапсида находится в экспрессионной плазмиде под контролем промотора фага Т7 Индукция экспрессии гена происходит при добавлении в ростовую среду IPTG, блокирующего репрессию гена Т7 РНК-полимеразы Трансформацию штамма Е coli BL2I(DE3)pLysS рекомбинантной плазмидой pET23b+-ORF7 с последующей индукцией проводили с использованием методики фирмы-производитепя (Novagen, Мэдисон, Висконсин, США).

Синтез рекочбинантного белка нуклеокапсида (rN) в бакуловирусной системе экспрессии "Bac-to-Bac" Для получения рекомбинантной донорной плазмиды использовали вектор pFastBacHTa ("Life Technology", США). Ген белка N (ORF7) амплифицировали методом ОТ-ПЦР. По сайтам рестрикции BamHI и Hindlll продукт ОТ-ПЦР встраивали в плазчиду pFastBacHTa. Перед полилинкером плазмида содержит последовательность, кодирующую 6 гистидинов, что позволяет очищать полученный после экспрессии продукт методом метал то-аффинной хроматографии Для получения рекомбинантной бакуловирусной ДНК использовали штамм Ecoli DHlOBac ("Life Technology", США), нес}щие геном бакуловируса в составе внехромосомного репликона (бакмиды) В этих бактериях содержится также плазмида-помощник с геном транспозазы Бакмида содержит короткую последовательность, гомологичную бактериальному транспозону Tn7 (mini-attTn7). Плазмида pFastBacHTa содержит экспрессионную кассету, фланкированную последовательностями Тп7. Рекомбинация между участками Тп7 и вставка ORF7 в геном бакуловируса происходит в клетках штамма Е coli DHlOBac после трансформации рскомбинантными донорными плазмндами pFastBacHTa/ORF7.

На основании цветного теста отбирали рекомбинантные клоны. Наличие вставки ORF7

в рекомбинантной бакмиде проверяли методом ПЦР. Выделение ДНК из рекомбинантных

бакмид осуществляли по методике фирмы-изготовителя ("Life Technology", США). Очищенные рекомбинантные бакмиды использовали для трансфекции культуры клеток. Трансфекцию проводили с использованием липофекгина ("Life technology", США) по методике изготовителя Рекомбинантный вирус хранили при +4°С в среде, содержащей 2% СЭК.

Очистка рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса РРСС.

Очистка в денатурирующих условиях Клеточная или бактериальная масса была собрана ннзкоскоростныч центрифугированием и промыты фосфатно-солевым буфером (рН 7,4). Затем собранные клетки лизировали при интенсивном перемешивании в буфере (8 М мочевина, 0,1М ЫаН2Р04, 0,01 М Трис, рН 8,0). Полученный раствор центрифугировали при 13 ООО g в течение 15 мин при +4°С, надосадок смешивали с 2 мл уравновешенной лизирующим б\фером носителя фирмы «TALON» («TALON Metal Affinity Resin», США) и инкубировали в теченне 20 мин при комнатной температуре. Для промывки носителя использовали буфер (8 М мочевина, 0,1M NaH;P04, 0,01М трис) рН 8,0 и рН 7,0. Элюцию проводили при разной кислотности раствора (рН от 6,3 до 4,5). Концентрацию белка в препаратах определяли спектрофотометрически

Очистка в неденатурирующих условиях Клеточную или бактериальную массу лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1, 300 мМ NaCI. 10 мМ имидазола, 1 мМ PMSF, 1% тритона Х-100 рН 8,0. Полученный лизат разрушали с использованием ультразвукового дезинтегратора 3 раза по 30 сек и центрифугировали при 10 000 g в течение 1 ч. Супернатант отбирали и смешивали с Ni-NTA агарозой из расчета 1 г бакмассы на 1,5 мл Ni-NTA агарозы. Затем инкубировали во льду в течение 2 ч при перемешивании и 16-18 ч при +4°С Агарозу промывали буферами, содержащими повышающиеся концентрации имидазола (10, 20, 50 мМ соответственно). Элюцию проводили буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Концентрацию белка в препаратах определяли спектрофотометрически

Оценка антигенной активности рекомбинантного белка нуклеокапсида. проводилась методом непрямого ИФА с использованием моноклональных антител \VBE6 или SDOW17 и референтных сывороток.

Сыворотки. Использовали ранее проверенные на наличие специфических антител к вирусу РРСС с использованием набора «HerdChek enzyme-linked immunosorbent assay» фирмы IDEXX, (США). Использовали сыворотки крови от свиней, полученные из ЗАО «Омский Бекон», а также референтные отрицательные сыворотки, полученные от Dr S. Belak (Национальный институт ветеринарии, Швеция).

Антитела к рекомбинантному белку нуклеокапсида в сыворотках свиней определяли методом непрямого ИФА. В качестве антигена для сорбции на планшет применяли очищенный рекомбинантный белок rN Результаты ИФА выражали в виде величины К:

К = (Ас-Ас,,)/ (А„ол - Аотр)х 100,

где: Ас - поглощение при Х= 450 nm в лунке с исследуемой сывороткой,

А0тр - поглощение при 450 nm в лунке с отрицательной сывороткой АПол - поглощение при 7-450 nm в лунке с положительной сывороткой

Амплификация генома вируса РРСС методом обратной транскрипциии и амплификации (ОТ-ПЦР). Реакцию ОТ-ПЦР проводили в одной пробирке (Sellner LN et al. 1994) Реакционная смесь, конечным объемом 100 fil, содержала 1 fig РНК, lOOpmol каждого праймера, 2 5 ед полимеразы TaqI (Life Technology, Grend Island, США), по 250 цМ каждого dNTP, 2,5 ед. обратной транскриптазы MMLV (Life Technology, Grend Island, США), 10 мМ Tris-HCI, (рН 9 0 при 25°С), 50 мМ KCI, 0.1% Triton Х-100, 1 5 мМ MgCh Использовали следующие параметры ОТ-ПЦР: 50°С- 1 час - 1 цикл ОТ, 94°С - 30 с, - 50-54°С - 30 с, 72°С -60-90 с (для последнего цикла - 7 минут) - 25 циклов ПЦР.

ПЦР хпя диагностических чередований проводили в объеме 25 |il Реакционная смесь содержала 5 РНК, выделенной на неорганическом носителе, 10 pino! каждого праймера, по 250 jiM каждого dNTP, 0.63 ед полимеразы Taql, 0,063 ед. обратной транскриптазы MMLV (Ufe Technology, Grend Island, США), 10 мМ Tris-HC!, (pH 9 0 при 25°С), 50 мМ KCl, 0 1% Triton Х-100. 1.5 мМ MgCh Использовали следующие параметры ОТ-ПЦР: 50°С- 1 ч - 1 цикл ОТ, 94°С - 30 с. 54°С - 30 с, 72°С - 30 с (для последнего цикла - 7 минут) - 25 циклоп ПЦР Для проведения "гнечловой ПЦР" в > ачествс матрицы использовали 5 реакционной смеси посте прореления ОТ-ПЦР Соотнои -ние циклов амплификации и реамплифнкации било 1 1

Праймеры для определения РНК вируса РРСС и филогенетических исследований разрабатывали на основании еравнеч ия первичной структуры геномов референтных штаммов вируса РРСС Lelystad (европейский тип вируса 1'РСС) и VR2332 (американский тип вируса РРСС) с использованием компьютерных программ AssemblyLign (Oxford Molecular Group PLC, США), Oligo версия 4.0, Amplify версия 1.0. Праймеры для диагностических исследований методами ПЦР и ПЦР в реальном времени были разработаны на участки гена, кодирующего нуклсокапсидный белок вируса РРСС (ORF7)

Амплификация генома вируса РРСС методом ПЦР в реальном времени. Для конструирования тест-системы ПЦР в реальном времени использовали данные о первичной структуре геномов референтных штаммов Lelystad и VR2332. Для ПЦР использовали универсальные праймеры. специфические к американскому и европейскому генотипам вируса РРСС. После проведения ПЦР в реальном времени попучали фрагменты 105 п н (для европейского штамма вируса РРСС) и 96 п н (для американского штамма вируса РРСС) Дифференциацию проводили с пгчощыо молекулярных олигонуклеотидных зондоп, с различными флуоресцентными красителями на 5' концах Реакционная смесь конечным объемом 25|i!, содержала 2-5ц1 РНК, выделенной на неорганическом носителе, по 300 цМ каждого dNTP, 400 пМ каждого праммера, 100 пМ каждого зонда, 0,63 ед. полимеразы Taql (Life Technology, Grend Island, США), 0,125 ед обратной транскриптазы AMV-RT (Life Technology, Grend Island. США), 10 ед рекомбинантного RNAsin, 10 мМ Tris-HCI, (pH 9 0 при 25°C), 50 мМ KCl. 0 1% Triton X-100, 1.5 мМ MgCl2 и 60 nM ROX. Использовали следующие параметры ОТ-ПЦР 48°С- 30 мин, &5°С - 10 мин, - ОТ и 40 циклов ПЦР (95°С -15 с, 60"С - 1 мин (для последнего цикла - 7 мин). Реакцию ОТ-ПЦР проводили в одной пробирке Для определения чувствительности ис юльзовали 1000, 100, 10, 1 ТЩЬо/мл Полученный результат регистрировали на экране монитора (ABI prism, США).

Определение нуклеотндпой последовательности продуктов амплификации генома вируса РРСС. Геномы вирусов были амплифицировачы в виде 14 перекрывающихся фрагментов для каждого вируса. Продукты ПЦР бьки очищены в агарозном геле, с использованием набора для очистки продуктов ПЦР (Gcncclean. США) и секпенированы Язя получения усредненной (consensus) последовательности каждый нуклеотид был подтвержден как минимум в результате анализа 2-х независимых продуктов ПЦР на двух цепях ДНК. Праймсры для получения продуктов амплификации и се> венирования были разработаны на основании анализа первичной структуры геномов двух референтных штаммов вируса РРСС' 16244В и VR2332. Они располагались на расстоянии примерно 200 нуклеотидов по каждой цепи ДИК, так что расстояние между соседними пранмерами на соседних цепях было примерно 100 нуклеотидов. Определение первичной crpyi>туры проводили на автоматическом сскпенаторе ДНК (ABI 377, CUJA) и анализировали с использованием компьютерных программ MacVector/AssemblyLign (Oxford Molecular Group PLC. США)

Определение первичной структуры концевых фрагментов генома раличных штаммов вируса РРСС. Продукты амплификации концевых участков трёх вирусных геномов штамма NADC8 были получены на матрице вирусной РНК с использованием наборов 3' RACE и 5'RACE (Life Technologies, США) по методике производителя Вирусную РНК выделяли из монослоя зараженных вирусом клето-. с использованием тризола (Trizol, "Life Technologies,", США) Продукты ПЦР были клонированы в Е coli по стандартной методике. Отбирали по 15 независимых клонов для каждого продукта ПЦР Каждый отобранный клон секвенировалн для определения точной последовательности 5' и З'-концов генома вируса. Определение первичной структуры провопили на автоматическом секвенаторе ДИК (ABI 377, США) и анализировали с использованием компьютерных программ.

Компьютерный анализ последовательностей генома вируса РРСС. Анализ первичной ырукт)ры геномов проводили с по-'->щыо компьютерных программ MacVcctor/AssernbljI ign (Oxford Molecular Group PLC, ( II1A) версия 6 0 Филогенетическое родство определяли с помощью пакета компьютерных лрограмм PHYI IP версия 3 ^с Для филогенетического анализа па основе генетических дистанций применяли так называемый cncighbor-jonine» мсгод (I cKrnslcin 1989) Построение филогенетических деревьев проводили с использованием программ DRAW IRLE и DNAGI'AMM. а также пакета программ DNASTAR

Спорка полнора¡мерной копни вирусного генома Для сборки генома использовали век гор pACYCI77 (New England Biolabs, CUJA) Вектор модифицировали, улалив фрагмент,

ограниченный сайтами ресгрикции Aval, Xhol Были синтезированы комплементарные олигонуклеотнзы. образовавшие после отжига полилинкер, содержащий следующие сайты-Aval-BamHI-Xbal-Xmal-Spel-XhoI. Фрагмент встроили в плазмиду pACYC177 и получили вектор pACYC177(MCS+), содержащий менее 2 тыс нуклеотидных пар, пригодный для сборки вирусного генома. Сборка вирусного генома осуществлялась последовательным переклонированием 3-х фрагментов вирусного генома и прямым клонированием продукта ГИДР (4-го фра| мента)

Синтез потноразмерной геномной РНК вируса РРСС. Плазмидную ДНК переводили в линейною форму с использованием рестрикцчонной эндокуклеазы Spei (Life Technology, США). Линейную ДНК обрабатывали протеиназой К для удаления РНКаз и других ингибиторов транскрипции. Реакция транскрипции проводилась с помощью набора -Megascript™ High Yield Transcription Kit (Ambion, США) в соответствии с инструкцией производителя. Реакция транскрипции останавливалась добавлением 8М раствора LiCl до концентрации ЗМ После перемешивания и инкубации при -20°С в течение I часа центрифугировали при +4°С, при 13-14000 g в течение 15 минут. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в воде, свободной от нукпеаз (15-20 ц1). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически.

Трансфекция клеток MARC-145 и ВНК-21 геномной РНК вируса РРСС. Реакцию проводили в соответствии с методикой производителя по следующей схеме: 2 ng очищенной РНК смешивали со 100 pi DMEM; в отдельной пробирке смешивали 7-12 ц1 CellFECTTN* Reagent (Life Technologies, США) с 100 ц1 DMEM. Оба раствора смешивали между собой и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 минут. Клетки промывали бессывороточной средой DMEM. К смеси, содержащей комплекс CellFECTIN^Reagent-PHK, добавляли 1.8 ml бессьгаороточной среды DMEM и наслаивали на промытый буфером PBS клеточный монослой. Клетки инкубировали в COj-инкубаторе при 37°С 10-24 ч Затем меняли РНК-содержащую среду на 4-5 ml ростовой среды. Ростовая среда содержала глутамин (0.3 mg/ml), антибиотики (пенициллин и стрептомицин в стандартных концентрациях) и 5-7% FBS (Life Technologies, США).

Этктропорация клеток MARC-145 и ВНК-21 геномной РНК вируса РРСС. Однодневный клеточный монослой, полученный с одного культурального матраса (75 смг), отбирали с использованием трипсина (4.5 ml), трипсин нейтрализовали DMEM (9 ml). Клетки осаждали центрифугированием при 1500-2000 g, 15 минут при +4°С и дважды промывали lxPBS Клеточный осадок ресуспеняировали в 1.5 ml однократного PBS (или

Hypoosmolar Electroporation buffer, Eppendorf, Германия) Помешали 400-450 (il клеточной суспензии в кювету для элекгропорации эукарисгг (расстояние между электродами 2-4 мм) и добавляли 13-15 ц1 очищенной РНК. Кювету помешали в электоропоратор (Eppendorf. Германия) и пропускали импульсный разряд со следующими параметрами электропораишг напряжение - 500V, время - 220ns, число импульсов - 1. После извлечения кюветы из электропоратора добавляли в кювету 0.5-1 ml DMEM. В культуральный матрас (25 cv~) добавляли 5 ml DMEM и смесь из кюветы Инкубировали в течение 12 ч при 37°С в СОг-инкубаторе.

Выявление вируса РРССв клеточных культурах. Определение РНК вируса РРСС проводили с использованием ПЦР. Иммунофлуоресцентный анализ был использован для обнаружения вирусных белков и динамики накопления вируса при пассировании. Зараженные культуры клеток (2-й и 3-й пассаж) либо замораживали-оттаивали, либо снимали монослой трипсином. Капля суспензии клеток в ростовой среде помещалась на предметное стекло. Для адсорбции клеток на поверхности стекла проводилась инкубация при 37°С, в течение 2 часов в СОгинкубаторе После адсорбции промывали клетки PBS и фиксировали в ацетоне (5 минул при -20°С), просушивали, добавляли 25 сыворотки крови свиньи, специфичной к американскому типу вируса РРСС (разведение 1:10 в PBS) или моноклональные антитела SDOW17. Инкубировали 30 мин при 37°С в СО 2-инк> баторе. Промывали два раза PBS и высушивали в термостате при 37°С Добавляли 25 ц1 иммунофлуоресцентного конъюгата (anti swine IgG FITC-labeled, разведение 1-100) ("KPL"', США) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С в С02-инкубаторе Результаты учитывали в иммунофлуоресцентном микроскопе под водной или PBS-глицериновой иммерсией.

Проведение микроэлементного анализа инфицированных и неинфицированных клеточных культур. По 1 ml культуральной среды и суспензии клеток с отмытого монослоя (1,5 106 клеток/ml) растворяли в равном объеме царской водки (смесь HCl и HNO) в соотношении 3 1) и инкубировали в течение 1 суток в полипропиленовых пробирках при комнатной температуре Далее минерализацию образцов проводили под давлением в микроволновой печи MDS2000 в тефлоновых бомбах при следующем режиме' 2 мин 20 с -при 80% мощности, 5 мин - при 100% мощности Во всех опытах вели обработку и последующий анализ независимых экспериментов Параллельно микроэлементный анализ проводили в неинфицированных клетках и образцах свежей ростовой среды для учета содержащихся в ней микроэлементов

Содержание металлов в минерализованных образцах определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрометра «SpectrAA-800» с электротермической атомизацией и эффектом Зеемана по протоколу фирмы "Vanan" с модификациями по результатам международной интеркалибрации с лабораторией MEL МАГАТЭ (Монако). Источником излучения служили одноэлементные лампы с полым катодом SpectrAA фирмы "Varían". Ток ламп для элементов Ni, Cu - 4,0 mA для Al - 10mA; Mn, Zn - 5,0 mA; для Cr - 7,0 mA. Ширина щели монохроматора составляла при измерении Al, Ni, Cu, Zn - 0,5 nm, а при измерении Cr, Fe, Mn - 0,2 nm. Осуществляли релим коррекции базовой линии и горячий впрыск - 80 °С. Использовали следующие длины волн (резонансные линии) и модификаторы: Al - ¡1=396,2 nm, Mg(N03)2; Ni - X=232,0 nm, Mg(N03)2; Cr - X=357,9 nm, Mg(N03)2; Mn - Я=279,5 nm, Mg(N03)2; Fe - b=248,3 nm, Mg(NOJ2; Cu - ÍU327,4 nm, Pd(N03)2; Zn - Я=307,б nm, Mg(N03)2. Относительное стандартное отклонение при определении с доверительной вероятностью 0,95 не превышало 20%, Средние относительные ошибки результатов трех-пяти повторных измерений указаны на рисунке II.

2. 2. Результаты исследований

Разработка методов диагностики РРСС

В качестве первого шага, направленного на разработку средств диагностики РРСС, было проведено изучение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии Были проанализированы 342 сыворотоки крови свиней, полученные из 46 хозяйств России и Белоруссии в 1993-2001 г.г. Были проанализированы 29 районов из 23-х областей России и 16 районов из 6-и областей Белорусси и Для обнаружения специфических антител против вируса РРСС на начальном этапе испо шзовали коммерческий набор «HerdChek enzyme-linked immunosorbent assay» фирмы IDEXX (США). Результаты анализа показали широкое распространение вируса РРСС в хо^йствах России (79%) и Белоруссии (81%) (таблица 2)

Таблица 2. Результаты проведенного мониторинга хозяйств России и Белоруссии на наличие антител к вирусу РРСС.

Страна Определение антител к вирусу РРСС с использованием набора «HerdChek enzyme-linked immunosorbent assay»

Общее к-во проб Положительных Отрицательных

Россия 224 111 94

Белоруссия 118 73 45

Необходимо отметить, что антитела к данному вгрусу встречались практически во всех возрастных группах животиых, включая 2-3-дневных поросят, лоросят-отьемышей и супоросных свиноматок.

После проведения данного мониторинга было сде/ано заключение о необходимости разработки отечественных средств выявления вируса РРСС и антител к нему.

При разработке средств определения вируса мы учгтывали, что вирус РРСС отличает высокая вариабельность. У двух типов вируса (американского и европейского) наблюдается вариабельность первичной структуры генома до 60%. Обширные территории Российской Федерации позволяли предполагать наличие обоих генотипов вируса. Поэтому для конструирования универсальной тест-системы для опргделения РНК вируса РРСС мы выбрали модификацию ОТ-ПЦР, называемую "множественной" Такая модификация ПЦР позволяет определять два различных генотипа вируса в одной реакции. Известно, что РРСС является генерализованной инфекцией. Для выявления РКК вируса используют такие пробы, как кровь, сперма, органы и ткани организма. Содержангс; вируса в данных образцах может быть очень низким, следовательно, необходимо было разработать высокочувствительную методику определения. Использовали «гнездовую ПЦР» которая в несколько раз повышает чувствительность реакции в сравнении с одностадийной ОТ-ПЦР. Аналитическая чувствительность тест-системы позволяла выявлять 10 копий РНК в пробе. Диагностическая чувствительность тест-системы ПЦР составляла примерно 1-10 ТЦДзо/мл. Разработанную тест-систему сравнивали с тест-системой Центральной Европейской референтной лаборатории (Вейбридж, Великобритания) с использованием более 300 образцов. Получили 100% совпадение положительных и отрицательных проб.

Были проведены широкие производственные испытания отечественной тест-системы для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом ПЦР и утвержден комплект документации (наставление по применению от 07. 10. 02 № 13-5-02/599 и ТУ № 9388-002-42418073-02) для использования разработанной тест-системы в диагностических лабораториях.

В ходе широкого производственного испытания в течение 2002-2004 гг были исследованы образцы крови, спермы и органов свиней различных возрастов из 41 района России и 19 районов Белоруссии. В 49% хозяйств Российской Федерации обнаружили вирус РРСС, в Белоруссии мы зарегистрировали наличие вирус: в 53% хозяйствах (рисунок 1). При подсчете положительных и отрицательных результатов, мы получили 16% положительных проб в России, и 30% - в Белоруссии (таблица 3). Исследование поросят разных возрастов

показали, чго сред» них был обнажен вчрус в 26% случаев в России и в 35% с><)Чаео к Белоруссии (табп,<иа 3). По данньм исследователей ш Kopeii, у поросят с респир, сорными заболеваниями vOnap} живали вир)с РРСС в 12 - 42% случаев (Harn:s et al. 2001, Choi et al 2002, Kim el ai 7003) Как в России, так и в Белоруссии больший процент выявляе гости вируса РРСС пр: \одится на порос it, по сравнению с выявляемое гью у взрослых животных.

Россия Белоруссия

49% 51% 53% 47%

Ш Выявлен вирус РРСС □ Не выявлен вирус РРСС

41 хозяйство 19 м зяйств

Рисунок 1 Результаты выявления вируса РРСС в хозяйствах России и Белоруссии.

Таблица 3. Реззльтагы определения вируса РРСС мешдом 1ЩР и сыворотках кроип и органа-; животных я хс ,яйсгоах России и Белоруссии

Опре; t-ление вируса РРСС методом ПЦР

ОбШ( к-во проб Положительных ¡ Отрицательных

К-во 1 % К-во %

Взрослые животные

Россия 2024 324 I 16 1700 84

Белоруссия 300 90 1 30 210 70

Поросята

Россия 1020 265 1 26 74

Белоруссия 350 РЗ ¡ i5 2?7 65

Исследования показали, 4iO чувствительность и специфичность разработанной тест-системы позволяют с успехом определять РНК ¿ир\са РРГС в сперме животных, что явпяеття существенным нреимуи гстпом метода ПЦР.

В ходе исследования бы а также разработана тест-система для определения РНК вируса РРСС методом ПЦР в per ¡ьном времени (Real time PCR) Название офажает общий смысл новой модификации Рез льтал ПЦР в реальном времени можно регисгрнровать в процессе реакции, в каждый момент времени. Кроме двух пряймеров, тест-сиоема ПЦР в

реальном времени содержит дополнительный зонд, комплементарный внутреннему участку фрагмента. К зонду ковалентно пришиты два химических соединения- флуоресцентная метка («reporten») и гаситель флуоресценции («quencher»). В ходе синтеза ДНК зонд подвергается гидролизу за счет 3'-5* экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taql. что приводит к количественному увеличению флуоресцентного сигнала. Регистрируя прирост интенсивности свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии -электрофореза Тест-система на основе ПЦР в реальном времени, представленная в данном исследовании, состоит из пары универсальных праймеров для опредепения РНК европейского и американского генотипов и двух зондов Один зонд комппементарен (гомологичен) фрагменту генома американского генотипа вируса и содержит FAM в качестве флуоресцентною красителя Другой зонд комнлсмсп гарен фрашемту генома европейского генотипа вируса и содержит другой флуоресцентный краситеть - VIC. Данная тест-система на основе ПЦР в реальном времени является универсальной, в ходе одной реакции можно определить РНК двух генотипов вируса РРСС. Аналитическая чувствительность ПЦР в реальном времени для разработанной тест-системы составляет 10 копий РНК в пробе Диагностическая чувствительность ПЦР в реальном времени не ниже, чем чувствительность «гнездовой ПЦР», и составляет 1 ТЦДя/мл. Это дает возможность рекомендовать разработанную методику для проведения массовых диагностических исследований в хозяйствах.

Было показано, что с использованием ПЦР в реальном времени можно провозить количественное определение вируса РРСС. Для сравнительной калибровки использовали плазмиду, содержащую полноразмерный геном вируса РРСС. На магрице плазмиды был проведен синтез полноразмерной РНК вируса РРСС. Количество РНК измеряли спектрофотометрически, затем раститровывали (в десятикратных разведениях). Проводили ПЦР в реальном времени на матрице РНК в различных разведениях

Для построения калибровочного графика использовали величину Ст, так называемого порогового цикла (номер первого цикла, в котором происходит увеличение флуоресцентного сигнала репортерной группы по сравнению с уровнем фонового сигнала (рисунок 2 а). После построения калибровочной зависимости величины Ст от исходного количества копий стандартов (LogN) для каждого из стандартов, можно вычисти ib неизвестное исходное количество копий в анализируемых образцах с помощью интерполяции (рисунок 2 б)

10* копий

10'копий 10е копий 105 копий 10*копий

I01 копий

102 копий

:ч

Рисунок 2 Результаты ПЦР в реальном времени на матрице референтной полноразмерной РНК вируса РРСС в 10-кратных разведениях (от 109 до 102 копий плазмиды) (а). Калибровочный график, построенный на основании диаграммы «а», позволяющий определять количество вируса в пробе (б).

На следующем этапе исследовали молекулярные характеристики вирусных изолятов, выделенных in хозяйств России и Белоруссии и проводили сравнительный анализ первичной структуры их геномов Из 12 хозяйств России и Белоруссии были выделены вирусные изоляты (таблица 1) в культуре клеток альвеолярных макрофагов

Для филогенетического анализа мы использовали ген нухлеокапсидного белка (ORF7), который отличается большей консервативностью первичной структуры, нежели остальной [еном. С другой стороны, в области гена ORF7, наряду с консервативными областями, существуют вариабельные области, сравнение которых позволяет проводить филогенетические исследования вирусных изолятов

Как видно из рису нка 3, все изоляты вируса РРСС можно подразделить на две большие группы американский генотип и европейский генотип. Филогенетические исследования показали, что все выделенные нами вирусные изоляты на территории России и Белоруссии, относятся к европейскому генотипу вируса. Даже поверхностный анализ указывает, что выделенные нами изоляты близки к вирусам, циркулирующим в Испании Не было выделено ни одного изолята американского генотипа вируса РРСС

К сожалсншо, в настоящее время не разработано единой международной системы для изучения филогенетических отношений между штаммами вируса РРСС. Попробуем оценить полученные результаты Если изучить филогенетическую дендрограмму (рисунок 3) подробнее, то все европейские штаммы вируса РРСС делятся на две большие подгруппы

Рисунок 3 Филогенетические отношения штаммов вируса РРСС, выделенных на территории России и Белоруссии и штаммов, выделенных в Европе и Америке (полевые изоляты из России и Белоруссии обведены рамкой)

France 11 VI, IX UK N01 France 225 NL Boiter 10 UK NY4

UK HA1

LELYSTAD VIKL Poland 24 07,3 07 Denrnari: 11192 UK BEI IX LEI France

Spam VACCJNF France 151,296 Poland 11 07 Poland 4 07 UK NY) LTCIJ UKH2 France 292 Spain 5710CL Spam 25344,2228 Spam 4606 Spain РОЗ 5,5999 Spain 3211 Spam 2156 Spain AV30,92VO*8 Spain 705 Spam NL3-I Spam 8d <a

Spam

203 Rus.1l

209 RiK 86

206 Rus, 01 202 Rus.OI 2I2 Bel.Ol

207 Bel, 01 20! Rus.92 2ll Rir>,0l

208 Bel,0!

204 Rus.OI

210 Bel,0l

205 Rus.OI USILI USIA6 Chrna la l>S3927,ISUl US KYI

US MOI US SOI US lAI

Canada 807/94. QuS Canada IAF E.\P China MDQl LSMNl Thailand Fl I USU79 US KSl

USJSl'55 I5UI US 1894, ISU2 DK S16/1 NADC8 Denmark 350 DK 516.2 US 1SU22 China SI US NeM Canada PAS l/SNFI US VR2332

В одну подгруппу входят штаммы вируса РРСС, выделенные в Германии, Франции, Веи!Кобр1гтании. Голландии и Польше В эту же подгруппу входит испанский вакцинный штамм Другую подгруппу составляют полевые нзоляты вируса РРСС, выделенные в Испании, России и Белоруссии.

Итак, первичная структура гена, кодирующего белок нуклеокапсида большинства российских и белорусских полевых изолятов, ближе всего к первичной структуре испанских изолятов вируса РРСС. Подгруппа, включающая российские, белорусские и испанские полевые изоляты также показывает некоторую неоднородность. В ней можно различить две более мелкие с;бгруппы. В одну входят испанские изоляты, 4 российских изолята (выделенных из центральной России, Алтайского края, и Приморского края) Во вторую субгруппу входят только белорусские и российские изоляты Полученные данные совпадают с результатами исследования, проведенного во Всероссийском институте защиты животных (ФГУ ВНИИЗЖ, Владимир). Так, выделенные в институте российские штаммы вируса РРСС, также принадлежали к европейскому генотипу (Ап<3гееу V. в. е1 а). 1997).

Более подробные филогенетические исследования были проведены с использованием данных о первичной структуре геномов некоторых европейских генотипов вируса (рисунок 4) с испотьзованнем данных Центральной Европейской референтной лаборатории (Вейбридж, Великобритания).

Прежде всего, необходимо отметить, что мы наблюдали довольно высокую консервативность гена ОИЕ7 у изолятов европейского генотипа, выделенных на территории России и Белоруссии. Вирусы, изолированные на территории России и Белоруссии, можно разделить на три отдельные подгруппы В первую субгруппу входят изоляты, циркулирующие на террютрии центральной России, на территории Алтайского края и вирус, полученный из Приморья, из образцов 1986 года Все они оказались близки к европейскому штамму Ье1уйа<5, который в настоящее время считается референтным штаммом, и также к другим испанским штаммам вируса РРСС Они близки и к штаммам ЦК и 1/К Ь2, изолированным в Великобритании. Следовательно, в 90-х годах на территории Приморья циркулировал штамм, родственный штамму Ье^Ы. выделенному в 1991 году в Нидерландах. Ко второй субгруппе можно отнести штамм, цирку лирующий в Сибири Он также близок к испанским и английским изолятам В третью субгруппу входят изоляты, циркулирующие на территории центральной России, а также все белорусские изоляты Они имеют близкие филогенетические отношения с испанскими вирусными изотятами, а также в этой субгруппе есть один родственный изолят 1Ж НА 1, вылетенный на территории Великобритании.

I- грв

(I_ Sr»

I— Spam NU I

Spam 5a Spsm M

Рисунок 4 Филогенетические отношения штаммов вируса РРСС, выделенных на территории России и Белоруссии (выделены) и штаммов, выделенных в Европе (данные о первичной структуре генов европейских изолятов предоставлены Dr Т. Drew и Dr. Т. Stadejek).

Spam 6«

НИ

203 Rai, Ol 211 Rus, 01 201 Rus, 92

207 Bel.Ol 210 Bel, 01 212 Bel. 01

- UKHAI 208 Bel, 01

г-гГ

UKNOl

204 Rus, 01

205 Rus, 01

Spam AV30 Spam 92V058

Spain 705

УК BEI

Spain 21344 SpunS7IOCL

Spain 5999 Spain POU

Poland 24 07

Poland 3 07

Poland 4 07

Spain 3211

Интересно, что на территории центральной России в 1992 и в 2001 г.г. циркулировали близкородственные вирусы, входящие в третью подгруппу Вирусы, изолированные в Польше,

имеют бот ее отдаленные филогенетические отношения ко всем российским и белорусским штаммам, представленным в данном исследовании.

С нашей точки зрения, нельзя с уверенностью утверждать, что на территории России и Белоруссии циркулирует только европейский тип вируса РРСС Возможно, в дальнейшем мы сможем выделить изоляты американского типа вируса РРСС. Применение живых вакцин на основе американского штамма вируса РРСС в Дании привело к его распространению на севере Европы (Bother A. et al. 1997, Madsen К. G. et al. 1998).

В настоящее время, в Европе циркулируют как европейские, так и американские штаммы вируса (Bother A et al. 1997, Madsen К G. et al 1998) С другой стороны, в Америке были обнаружены европейские штаммы вируса РРСС (Bautista Е. М. et.al. 1993; Dewey С et al. 2000) Было сообщение о выделении североамериканского изолята в России (Андреев В. Г и др 1999), однако данное сообщение, представленное в тезисах конференции, не получило развитие в дальнейших публикациях.

Для проведения мониторинга хозяйств на территории России и Белоруссии.была разработана универсальная тест-система для определения антител к вирусу РРСС. Для этого были получены рекомбинантные белки нуклеокапсида (N) вируса РРСС американского и европейского типов в двух системах экспрессии - эукариотической (бакуловирусной) и прокариотической (Е Coli) (рисунок 5) Высокие титры антител к белку N обнаруживают у всех больных животных (Plana-Duran et al 1997; Wootton et al, 1998; Dea et al 2000; Witte et al. 2000), поэтому данный белок использовали для диагностики. Рекомбинантные белки были очищены с использованием аффинной хроматографии, идентифицированы в иммунохимических реакциях с реферегггными моноклональными антителами и проверены в иммуноферчентном анализе. В качестве компонента тест-системы для диагностики антител к вирусу РРСС был использован рекомбинантный белок нуклеокапсила вируса РРСС европейского типа, синтезированный в системе экспрессии Е coli

В результате был разработан универсальный набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС в сыворотках больных и переболевших животных методом ИФА «РРСС-СЕРОТЕСТ». Были проведены широкие производственные испытания тест-системы и утвержден комплект документации (наставление по применению от 12.18 05 № 1-1.5/01446 и ТУ № 9388-012-42418073-04) для использования разработанной тест-системы в диагностических лабораториях.

система экспрессии Ecoli (рЕТ)

СЖР7 Американский генотип

(ЖР7 Европейский генотип

Клонирование

Бакуловирусная система экспрессии

hii»i$iiiiMiL

Рекомбинантный белок

Трансфекция клеток насекомых 1

Рекомбинантный белок

Очистка рекомбинантных белков методом метапло-аффинной хроматографии

Рисунок 5 Получение рекомбинантных белков нуклеокапсида в прокариотнческой и бакуловирусной системах экспрессии (схема)

Сравнительный анализ результатов определения антител к вирусу РРСС набором фирмы ГОЕХХ (США) и «РРСС-СЕРОТЕСТ» (Россия) свидетельствует о хорошей корреляции между ними значения чувствительности и специфичности набора «РРСС-СЕРОТЕСТ» составляют, соответственно, 94,8% и 95,3% Однако, набор фирмы ГОЕХХ

(США) разработан с использованием цельного вирусного антигена. Применение в наборе «РРСС-СЕРОТЕСТ» рекомбинантного антигена позволяет избавиться от ложноположительных реакций, а, следовательно, повысить качество набора. Разработанный набор реагентов прошел широкие производственные испытания, зарегистрирован для использования в России, утверждена постоянная документация. «РРСС-СЕРОТЕСТ» с успехом используется как в Институте вирусологии им. Д И. Ивановского, так и в региональных ветеринарных лабораториях России и Белоруссии и в отделе иммунологии НПО НАРВАК.

Выявление и анализ геномных детерминант вирулентности вируса РРСС

До настоящего времени не существовало данных о том, какие именно участки генома вируса РРСС отвечают за утрату или возникновение вирулентности вируса РРСС. Отсутствие таких знаний не дает возможности разработать стратегию целенаправленного конслруирования эффективной вирусной вакцины Нам представлялось возможным определить такие участки путем сравнения первичной структуры геномов вирулентного NADC8-2, аттенуированного NADC8-251 и промежуточного по вирулентности NADC8-252P вирусов, производных от одного родительского штамма вируса РРСС NADC8 (см. материалы и методы).

Перед началом экспериментов необходимо было исследовать in vivo свойства трех исследуемых вариантов штамма NADC8 вируса РРСС (таблица 4) Каждую группу из 16 животных заражали вирусами NADC8-251, NADC8-252P и NADC8-2, в дозе 2x10* ТЦИДзд. Контрольной фуппе интраназально вводили безвирусный материал По 4 животных из каждой группы были убиты на 3, 10, 17, и 35 день, отобраны сыворотки крови и проанализированы на наличие вируса РРСС (Таблица 4А) и на наличие антител Против вируса РРСС (Таблица 4В) Перед заражением (день 0) специфических антител в сыворотках животных обнаружено не было

Животные практически не имели клинических признаков после интраназапьного заражения вирусом NADC8-25I в дозе 2 х 10* ТЦИДзО- Схожие данные были описаны в предыдущих исследованиях (Mengeimg В et al 2003) Для изучения аттенуированных вариантов вируса РРСС важна доза и способ введения вируса, так при введении вируса внутримышечно в дозе 2 х 106 ТЦИД» развивается вирусная инфекция (Lager К. et al 2002, Mengeling В et al 2003).

Таблица 4 Сравнение in vivo свойств трех различных пассажей штамма NADC8 вируса РРСС'пассажи 2,251. 252Р.

Таблица 4А: Эффективность выделения вируса от зараженных животных Указано количество положительных животных / количество протестированных животных (в скобках

усредненный тит] з вируса, -logio)

День после заражения

Материал для заражения 3 10 17 35

Безвирусный материал 0/4(0 0) 0/4 (0 0) 0/4 (0 0) 0/4 (0 0)

251 0/4 (0.0) 0/4 (0 0) 0/4 (0.0) 0/4 (0.0)

252Р 1/4 (0.4) 1/4(0.2) 2/4 (0.9) 0/4 (0.0)

2 3/4 (2.8) 4/4 (3.6) 3/4 (3.0) 0/4 (0.0)

Таблица 4В: Эффективность обнаружения антител к вирусу РРСС у зараженных животных. Количество сероположительных животных /количество животных, протестированных на антитела к вирусу РРСС Положительной считается сыворотка с величиной оптической плотности в ИФА по отношению к положительному контролю Б/Р >

День после заражения

Материал для заражения 3 10 17 35

Безвирусный материал 0/4 (0 000) 0/4 (0.000) 0/4 (0 000) 0/4 (0 000)

251 0/4 (0.000) 0/4 (0.000) 0/4 (0 000) 0/4 (0 000)

252Р 0/4 (0 000) 0/4 (0 000) 1/4(0.317) 3/4 (0 850)

2 0/4 (0.000) 3/4 (0 904) 4/4 (0.766) 4/4(1.280)

Итак, после исследования вирусных штаммов на стандартной модели животных обнаружили, что они располагаются по степени вирулентности в следующем порядке (по убыванию) NADC8-2, NADC8-252P, NADC8-251 Мы предположили, что различия в характере протекания вирусной инфекции в группах животных, зараженных разными вирусами, связаны с генетическими изменениями, накопленными в ходе пассирования штамма NADC8 вируса РРСС. Для проверки этой гипотезы была определена попная первичная структура геномов всех трех вариантов штамма NADC8 (рисунок 6).

Геномы трех вариантов штамма NADC8 полностью соответствовали описанной модели генома артеривирусов (Allende. R и др 1999, Nelsen. С J и др 1999, Snijder, F. J, Meulenberg, J.J M 1998) Они содержали две больших открытых рамки считывания ORFIa и ORFlb, расположенных сразу после 5'-концевой нстранслируемой области (5' NCR) На стыке ORFla и ORFlb присутствовал семичленный участок ("slippery") сдвига рамки 5*-

UUUAAAC-3'. расположенный между нуклеотидами 7677 и 7683, на 4 нуклеотнда выше стоп-кодона UAG в рамке ORFla.

Геном вируса РРСС 15453 нуклеотида

■ N Т- I I I I I ■

Прямое секвенирование 14 фрагментов ПЦР

Полная первичная структура генома

Рисунок 6 Схема определения полной первичной структуры генома вируса РРСС Остальные открытые рамки считывания (ORF 2-7) расположены после ORFlb, а за ними находится З'-концевая нетранслируемая область (3' NCR) и участок полиаденилирования В участках 5' NCR и 3' NCR различий между геномами 3 вариантов штамма NADC8 не обнаружено (рисунок 7, таблица 6 ).

2-J 14' 6 ,

-lb - - ГЗ Ч 5 1 т\р

5' NCR

"slippery"

3' NCR

Рисунок 7 Схематичное изображение генома вируса РРСС. Участки 5' NCR, 3' NCR и "slippery" являются консервативными для трех вариантов вируса NADC8.

При сравнении геномов NADC8-2 и ЫАВС-8-251 обнаружено 50 нуклеотидных различий и 3-нуклеотидная делеция. Из них 22 мутации были "молчащими", те не приводи™ к аминокислотным заменам, остальные 28 вызвали замены аминокислот Не найдено различий в последовательности №р6 (часть ORF1a) Молчащие мутации найдены в №р8 и №р11, они не приводят к изменению аминокислот вируса РРСС. Изменения

аминокислот найдены в Nspl, Nsp2, Nsp3, Nsp5 и Nsp7. Трехнуклеотидная делеция в ORF 1а (нуклеотиды 3763-3765) приводит к потере лейцина в Nsp2. Нуклеотидные замены в ORFlb привели к аминокислотным заменам в Nsp9, NsplO, и Nspl2. Анализ мутаций в структурных генах (ORF 2-7) показал, что только в ORF3 все мутации были молчащие. Другие мутации вызывали по одной или более аминокислотных замен в структурных белках gp2, gp4, gp5, М, и N (таблица 5). В третьем столбце таблицы показаны только нуклеотиды и аминокислоты, которые отличаются у штаммов NADC8-251 и NADC8-252P.

Таблица 5. Нуклеотидные и аминокислотные замены штамма КАИС8 вируса РРСС на разных пассажах (2, 251, и 252р). Н = Нуклеотид. АК. = Аминокислота. Серым отмечены молчащие мутации.

Пассажи штамма NADC- 8 вируса РРСС

2 251 252Р

Ген Белок Позиция нуклеотида H. АК. Н АК. Н. AK

ORF 1а Nspl 755 G D А N

801 G R А Н

837 А Е А Е G G

840 О G О G Т V

Nsp2 1628 А 1 G V

1877 А Е G G

««©г»,? Л -Й

штл е, H/K,..,,, Ш1 ' / . .c; , - - * Ü.

2504 о D А N

2607 А N С Т

^f2740, у G" ' " ' Р^

"%?>:zm о Т*>' ' РвЙЯ» L>

. С - D l)

3245 G А А Т

3763-3765 ТТА L Делеция Делеция Делеция Делеция

3767 Т F А L

3914У -.ух^л ^ifV L "

Nsp3 у "437? J, , ? г* •

•i- у?. , лУ-'.'Ч -т. Ii Uli -tat- дал?.

4777 G я А К

5021 G А А т

iUf'jj^ ^ 'Ч^ГЩ

Nsp4 5825 G R G R D(C/A) P/Q

Nsp5 Ш ^«JfAä^, Ш&Ж w-

6357 т F С s T F

Nsp7 7300 G V А i

NspS ж-г. ггуия "'ifSlgST^ л* л 1 ^t-T* 3

Nsp9 8946 С н т Y

."S? 9061 #*?£ ЛШ4М ЙШШ

9306 А т G А

9363 G V С L

Количество и разнообразие нуклеотидных замен, обнаруженных в геномах вирусов NADC8-2 и NADC8-251, вполне согласуются с литературными данными других исследователей, которые сравнивали аттенуированный вирус РРСС с родительским вирусом дикого типа (Allende R. et al. 2000, Yuan S. et al. 2001) (таблица 6). Так при сравнении родительского вируса и аттенуированного после 70 пассажей in vitro было найдено 44 нуклеотидные замены (Yuan S. et al. 2001). После подробного анализа локализации мутаций не было обнаружено определенных участков генома, ответственных за аттенуацию вируса.

Первичные структуры геномов NADC8 пассажей 251 и 252Р отличались лишь в 8 позициях (Таблицы 5 и 7). Две из этих мутаций в позициях 9061 (ORFIa) и 12333 (ORF2) были молчащими. Три нуклеотидных отличия в позициях 6357 (ORFla), 9735 (ORFlb) и 14440 (ORF6) приводили к изменениям аминокислотной последовательности белков Nsp5, NsplO, и М соответственно. Эти мутации были прямыми реверсиями к генотипу NADC8-2. Три остальные мутации в позициях 837, 840 и 5825 (все в ORF 1а) привели к появлению новых аминокислот в белках Nspl и Nsp4. ¡ РОС.

33 _

¿sssa*/

Таблица 6 Количество и локализация мутаций, накопленных штаммами РРСС и УЛ-

Участок генома Количество нуклеотидных отличий Процент гомологии между родительским и атгенуированным вирусами

NADC8 VR-2332 NADC8 VR-2332

5'-UTR 0 2 100 99.5

ORFla 22 15 99.7 99.8

ORFlb И 13 99.7 99.7

ORF2 1 4 99.9 99.5

ORF3 2 4 99.7 99.1

ORF4 3 2 99.7 99.6

ORF5 6 2 99.0 99.7

ORF6 2 3 99.6 99.4

ORF7 3 0 99.2 100

З'-UTR 0 0 100 100

Таблица 7. Нуклеотидные и аминокислотные отличия, обнаруженные между вариантами

штамма МАОС8 (пассажи 251 и 252Р). Для сравнения приведены данные по _ штамму NADC8 -2 Серым отмечены молчащие мутации. _

NADC8 -2 NADC8-251 NADC8-252p

Ген Нуклеотид- белок Нуклео- Амино- Нуклео- Амино- Нуклео- Амино-

ная позиция тид кислота тид кислота тид кислота

генома

РРСС

ORFla 837 Nspl А Glutamic Acid A Glutamic Acid G Glycine

ORFla 840 Nspl G Glycine G Glycine T Valine

ORFla 5825 Nsp4 G Arginine G Arginine D(C/A) Proline/Gluta mine

ORFla 6357 NSP5 T Phenylalanine С Serine T Phenylalanine

ORFlb 9061 Nsp9

ORFlb 9735 NsplO С Proline T Serine C Proline

ORF2 12333 GP2

ORF6 14440 M А Threonine G Alanine A Threonine

Мутации в нуклеотидных позициях 837 и 840 приводят к замене аминокислот в домене №р1(3, содержащем подобную папаину цистеиновую протеазу. Мутация в позиции 5825 вызывает изменения на участке между сайтами расщепления химотрипсин-подобных сериновых протеаз в белке №р4. Мутация в позиции 6357 локализована недалеко от сайта расщепления химотрипсин-подобной протеазы в белке №р5. Мутация в нуклеотидной

позиции 9735, локализованная в ORFlb, приводит к замене ачинокиспоты в белке NspIO, содержащем цинк-связывающий и хеликазиый домен Последняя мутация в позиции 14440 ORF6 приводит к изменению аминокислоты в связанном с мембраной районе (аминокислоты 18-34) белка М

Существует ряд научных публикаций с анализом полной или частичной первичной структуры генома вируса РРСС (Suares Р et а! 1996, Shen S. et al 2000, Stadejek Т. et al 2002) Однако тишь в единичных публикациях анализируются геномные изменения, ассоциированные с аттенуацней вируса РРСС или с приобретением аттенуированным вирусом виру пентных свойств Мутации в ORF1 у вируса РРСС, связанные с реверсией к вирулентному фенотипу, были описаны ранее (Nielsen Н S et al. 2001) Были найдены две реверсии к родительскому генотипу одна была локализована в подобной папаину цистенновой протеазе Nsp1 ß домена, другая - в хеликазном домене белка NspIO Найденную в настоящей работе реверсию в ORF6 описывали также другие исследователи и указывали на связь данной мутации с реверсией к вирулентности (Madsen К G 1998). По нашим данным, а также исследованиям, проведенным ранее, можно предположить, что мутации в белках Nsp I, NspIO, and М могут быть связаны реверсией аттенуированного штамма и приобретением им вирулентных свойств.

Таким образом, удалось найти, как минимум, 6 позиций, которые ответственны за приобретение свойств вирулентности вируса РРСС Для прямой экспериментальной проверки роли этих мутаций необходимо было создать полноразмерную инфекционную копию генома, для того, чтобы вести исследования вируса с использованием обратной генетики.

Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса РРСС

Нашей задачей было получениерекомбинантного аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС, который можно использовать в дальнейших фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов аттенуации вируса РРСС Ранее было описано конструирование единичных полноразмерных копий геномов вирулентного европейского штамма Lelystad (Meulenberg J J М et al 1998) и североамериканского штамма VR-2332 (Nielsen H S et al 2003) Однако полученные конструкции не используются широко для фундаментальных исследований Вероятно, в первичной структуре геномов рекомбинантных вирусов имелись существенные различия в сравнении с родительскими штаммами В ряде лабораторий сконструировали единственную копию вирусного генома в бактериальной

плазмиде Из-за необыкновенно высокой генетической изменчивости вируса РРСС, такая инфекционная копия содержала несовместимые с вирусной репродукцией дефекты Чтобы избежать подобной ситуации, в нашей работе использована стратегия создания библиотеки полноразмерных вирусных геномов и отбор самых биологически активных из них для дальнейших исследований.

Плазмидный вектор pACYC177 (New England Biolabs, США) был изменен таким образом, чтобы в нем содержались сайты уникальных рестрикционных эндоиуклеаз, необходимые для сборки полноразмерного вирусного генома Для получения полноразмерной копии вирусного генома использовали стратегию, представлениу ю на рисунке 8

5' Xmal BamHI Xmal_Xbal_Xmal УШ„

'602 1151 2209 10917 14822 /

SspI-T7 BamHI Xbal_Xmal "

1258 b.p. 5425 b.p.

BamHI_Xbal

\ 10745 b.p..

/ XmaKA^Soel

ч /

Рисунок 8. Схема получения полиоразмерной копии генома вируса РРСС в плазмидном векторе рАСУС177(МС8+)

Вирусный геном был предварительно секвенирован и определена его рестрикционная

карта. На основании данных рестрикционного анализа полноразмерный вирус (15330

нуклеотидов) был получен в виде 4 фрагментов ПЦР Три фрагмента (5'-концевой, 3'-

концевой и ХЬаЬХшаГ) были предварительно клонированы в векторе рСЯ4-Торо (Ргоп^а,

США) и секвенированы для того, чтобы убедиться в том. что первичная структура

полученных фрагментов соответствует родительскому штамму NADC8-251. Как и ожидалось, пришлось секвенировать более 10 копий каждого фрагмента, чтобы отобрать те, которые не содержали мутаций. В отобранных фрагментах, встроенных в вектор, содержались две замены, которые впоследствии были использованы как молекулярные маркеры для тестирования рекомбинантного вируса и отличия его от родительского штамма.

Фрагменты были переклонированы в векторе pACYC177(MCS+). После этого был получен фрагмент BamHl-Xbal (10700 пар оснований) методом «l.ong-PCR» (Gluchov А. I. 1991). Данный ПЦР-фрагмент был клонирован в векторе pACYC177(MCS+) без предварительного секвенирования. В результате была получена библиотека плазмид, содержащих полноразмерную копию вирусного генома. Данные плазмиды отличались по первичной структуре клонированного фрагмента BamHl-Xbal.

Для того чтобы исключить наличие существенных изменений в первичной структуре полноразмерных геномов вируса РРСС, плазмиды были проверены с использованием рестрикционных эндонуклеаз Aatll, BamHI, Xbal, Xmal, Spei, Xhol, EcoRI, Hindlll, Kpnl, а также методом ПЦР. Из 450-ти клонов только 32 содержали все предполагаемые сайты рестрикции, а следовательно, имели первичную структуру, подобную родительскому штамму. Эти плазмиды использовали в дальнейшем.

Плазмиды были использованы для транскрипции РНК in vitro и трансфекции клеточных линий ВНК-21 и MARC-145. На рисунке 9 представлены результаты выявления белков рекомбинантного вируса РРСС (1-й пассаж) методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Как видно из представленного рисунка, вирусные частицы начинают формироваться, начиная с первого пассажа после трансфекции.

Рисунок 9. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток MARC-145 (а) и клеток, зараженных рекомбинантным вирусом, полученным на основе полноразмерной ДНК-копии вируса РРСС (б).

Двадцать пдазмид были использованы для транскрипции РНК in vitro. После проверки 20 плазмид было обнаружено 9 различных плазмид, с которых после трансфекции РНК образовывались полноценные вирусные частицы, начиная с первого пассажа после трансфекции (или электропорации) (рисунок 10).

Пассаж 1 Пассаж 2 Пассаж 3 Пассаж 4 Пассаж 5

Рисунок 10 Накопление вирусных частиц рекомбинантного вируса РРСС, полученного на матрице плазмиды №257, начиная с 1 пассажа. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток MARC-145.

Следует заметить, что из 450 копий геномов только 9 оказались способными к репликации Это значит, что вероятность получить вирус, способный к репродукции, при работе с одной единственной конструкцией составляет 2% Таким образом, стратегия создания библиотеки геномов вируса РРСС оправдала себя. Проведено секвенирование четырех из девяти полноразмерных инфекционных копий генома вируса РРСС. Подробный анализ геномов, показал, что первичная структура ДНК плазмиды №257 наиболее приближена к таковой у родительского штамма вируса РРСС. Изучение штаммов с различными ростовыми характеристиками и известными изменениями в первичной структуре генома позволит дополнительно выявить набор функционально значимых мутаций в вирусном геноме. Таким образом, создана конструкция кДНК, позволяющая вносить генетические изменения в вирус РРСС.

Для дальнейшей характеристики in vitro рекомбинантных штаммов вируса РРСС были использованы биохимические подходы.

Проведение микроэлементного анализа клеточной культуры MARC-145 до и после инфицирования штаммами вируса РРСС различной вирулентности

Изучение микроэлементного статуса, как маркера заболевания, широко используется в современной медицинской микроэлементологии (Bargellini A.et al, 2003, Kalkan A et al 2002, Adachi S Et al. 1991, Andrasi E 1993, Скальный А. В, 2004). Восприимчивость к вирусным

инфекциям связывают обычно с условиями питания, в том числе, и минерального, что увеличивает защитные свойства иммунной системы (Basset et al 1999, Domingo 1997, Beck 1998) Ослаблением/усилением иммунитета объясняют и комбинированное действие вирусов и ряда rf-элементов (Ilback, Lindh et al 1995, Chou et al 1999). Поэтому мы попытались провести оценку действия вирусов РРСС различной вирулентности на биологическую систему (культуру клеток) Такой подход, безусловно, не позволяет изучить механизм действия вируса, но помогает выявить феноменологические проявления инфекционного процесса.

Определяли содержание семи микроэлементов (AI, Cr, Mn, Ni, Fe, Cu, Zn) в клетках и в ростовой среде. Зараженные кпетки культивировали в течение 3-х суток, по достижении эффективного заражения монослоя. Наличие вируса в инфицированных клетках было подтверждено в ПЦР и ПЦР в реальном времени В исследуемой культуре через 3 дня после инфицирования концентрация вируса составляла не менее 106 ТЦДзо/мл. На рисунке 11 показаны диаграммы содержания каждого микроэлемента в незараженных клетках (1 колонка), в клетках, зараженных аттенуированным штаммом вируса РРСС NADC8-251 (2 колонка), а также в клетках, зараженных вирулентными штаммами NADC8-252P и Lelystad (3 и 4 колонка, соответственно). Из представленных данных видно, что при инфицировании клеток, вирулентные штаммы вируса РРСС вызывают увеличение на порядок содержания таких элементов, как хром, марганец, никель, железо и снижение содержания алюминия в 2-3 раза. Инфицирование аттенуированным штаммом приводит или к обратной реакции -снижению на порядок содержания Мп и Ni, или практически не влияет на концентрацию AI, Cr, Fe Инфицирование штаммами NADC8-251 и NADC8-252P вируса РРСС практически не влияет на концентрацию Си в клетках, при инфицировании штаммом Lelystad концентрация меди незначительно уменьшается. Концентрация цинка при инфицировании любым штаммом РРСС незначительно увеличивается в (1,5-2 раза).

Действия инфекционного агента или иного фактора на метаболизм микроэлементов необходимо оценивать не только по величинам их стационарной концентрации в биомассе, но и по интенсивности метаболических потоков "клетка (организм, популяция) - внешняя среда" Такие потоки у добно характеризовать по коэффициенту накопления микроэлемента, который рассчитывается как соотношение концентрации микроэлемента в клетке к концентрации элемента во внешней среде (ростовой среде). Коэффициенты соединяют ломаной кривой и называют ее микроэлементным профилем Вид микроэпементных профилей дтя биологической системы является специфичным и постоянным для каждого

вида (Матвеева И С. и др 2003), мы предположили, что можно зафиксировать изменение данного профиля после заражения вирусом РРСС

Рисунок И. Содержание микроэлементов в клетках перевиваемой клеточной линии MARC-145, контрольной культуры (на рисунке - «контроль») и культуры, зараженной вирусом РРСС - штаммом NADC8-251 (на рисунке - «251») NADC-252P (на рисунке - «252р»), Lelystad.

На рисунке 12 представлены микроэлементные профили культуры клеток почек обезьяны MARC-145 до и после инфицирования европейским (Lelystad) и американским штаммами вируса РРСС (NADC8-252P), а также аттенуированным штаммом вируса РРСС (NADC8-251).

Если сравнить первичную струюуру белков штаммов NADC8-251 и NADC8-252Р, можно найти только шесть аминокислотных различий (таблица 7) Эти отличия приводят к изменению вирулентности вируса и одновременно связаны с изменением микроэлементного профиля клеточной линии после заражения. Особенно это показательно для никеля, железа и марганца: наблюдается уменьшение их концентраций при заражении аттенуированным штаммом и наоборот, увеличение их концентраций при инфицировании вирулентными штаммами Lelystad либо NADC8-252Р (рисунки И, 12).

Увеличение концентрации ¿/-элементов можно объяснить возможной индукцией при вирусной инфекции синтеза четаллотионеинов (Ilback, Glynn et al, 2004),

связывающих ионы металлов с высокой аффинностью Гипераккумуляция никеля, как способ защиты от вирусной инфекции, была описана для растений (Davis et al, 2001).

Рисунок 8. Коэффициент концентрирования микроэлементов в клетках (по отношению к концентрации микроэлемента в ростовой среде) контрольной культуры MARC-145 (на рисунке - «К») и культуры, зараженной вирусом РРСС - штаммами NADC8-251 («251»), NADC-252P («252р»), Lelystad («leí»).

Полученные результаты можно использовать, прежде всего, для первичной характеристики in vitro рекомбинантных штаммов вируса РРСС Эффект специфического изменения микроэлементных профилей клеточной культуры MARC-145 после инфицирования штаммами вируса РРСС, предполагает также возможность дополнительной стратегии коррекции микроэлементного статуса, а именно' использование антагонизма в действии вирулентных или аттенуированных штаммов или дополнительной регуляцией промоторов генов металлотионеинов.

Суммируя результаты исследования, необходимо отметить, что поставленные задачи бы in выполнены. Результатом исследования было комплексное изучение генома вируса РРСС Проведено филогенетическое исследование изолятов, циркулирующих на территории России и Бепоруссни На основании полученных данных бып разработан комплекс средств

диагностики РРСС тсст-системы для определения вируса и антител к нему Секвенирование полноразмерных геномов и сравнение их структурно-функциональных участков позволило определить потенциальные детерминанты вирулентности генома РРСС Разработана стратегия и сконструирована система обратной генетики для дальнейшего изучения генома артеривирусов Полученные результаты отражены в публикациях В список также включены статьи, в которых описана оптимизация условий и экспериментальные подходы, примененные в представленном исследовании

3. ВЫВОДЫ

1. Установлено широкое распространение вируса РРСС на территории России и Белоруссии. В 41 хозяйстве Российской Федерации антитела к вирусу РРСС были обнаружены в 79%. В 19 хозяйствах Белоруссии антитела к вирусу РРСС были найдены в 81%.

2. Разработана и внедрена тест-систсма для обнаружения вируса РРСС американского и европейскою i сношпов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) Диагностическая чувствительность тест-системы составляла 1-10 ТЦЦ50/ мл.

3. Подтверждена постоянная циркуляция вируса РРСС на территории России и Белоруссии в рамках широких производственных испытаний тест-системы для определения РНК вируса РРСС методом ПЦР в 2002-2004 г.г. В России из 41 исследованною района в 16-ти был обнаружен вирус РРСС у свиней различных возрастных групп. В Белоруссии в 10 из 19 районов бил обнаружен вирус РРСС

4. Разработана тест-система на основе 11ЦР в реальном времени (' Real-time PCR") для определения РНК вируса РРСС. Показана принципиальная возможность количественного определения вируса РРСС в культурах клеток и материале от больных животных. Диагностическая чувствительность тест-системы составляла 1 ГЦДзо/ мл.

5. Вирусные изоляты, выделенные на территории России и Белоруссии, относятся к европейскому генотипу вируса и близки к вирусам, циркулирующим в Испании, согласно филогенетическим исследованиям с использованием гена белка нукпеокапсида вируса РРСС.

6. Показано, что рекомбинантные белки нуклеокапсида американского и европейского типов, полученные в эукариотической (бакуловирусной) и прокариотической (Е coli) системах экспрессии могут быть использованы в качестве специфических компонентов диагностической тест-системы.

7. Разработан и внедрен набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантного белка нуклеокапсида, полученного в системе экспрессии Е. coli.

8. Исследование in vivo свойств полевого изолята вируса РРСС NADC8-2, аттенуированного вируса, полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8-251, а также промежуточного варианта, выделенного от свиньи после частичной реверсии аттенуированного вируса - NADC8-252P, на стандартной модели животных, показало, что три исследованных варианта штамма NADC8 вируса РРСС располагаются по степени вирулентности в следующем порядке (по убыванию): NADC8-2, NADC8-252p, NADC8-251.

9. Для выявления функционально значимых участков генома проведено сравнение первичной структуры геномов трех вариантов штамма вируса РРСС NADC8 размером 15453 нуклеотида. При сравнении геномов NADC8-2 и NADC8-251 обнаружено 50 нуклеотидных различий, 22 из которых не приводили к замене аминокислоты, и 3-нуклеотидная делеция. Геномы штаммов NADC8-251 и NADC8-252P отличались лишь в 8 позициях, при этом две из замен были молчащими. Выявлено 6 потенциальных генетических детерминант вирулентности вируса РРСС

10. Создана и охарактеризована экспериментальная модель для изучения функционально значимых участков РНК-генома артеривирусов. Для этого сконструирована библиотека из 32 клонов полиоразмерных копий геномов аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС под контролем промотора Т7 в плазмидном векторе Е coli на основе плазмиды pACYC177 с уникальным сайтом множественного клонирования. На основе полученных плазмид синтезированы инфекционные РНК-геномы штамма NADC8-251 вируса РРСС и получены инфекционные вирусы Генно-инженерное происхождение вирусов подтверждено секвенированием.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1 Тсст-система для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) Технические условия 1У № 9388-002-42418073-02

2. Наставление по применению тест-системы для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реакции (1ЩР). Утверждено Департаментом Ветеринарии МСХ РФ 07. 10. 02, № 13-5-02/599

3. Набор реагентов для выявления антител к вирусу репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) иммуноферментным методом «РРСС-СЕРОТЕСТ». Технические условия ТУ № 9388-012-42418073-04

4. Наставление по применению набора реагентов для выявления антител к вирусу репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) иммуноферментным методом «РРСС-СЕРОТЕСТ». Утверждено Россельхозпадзором 12. 18. 05 № 1-1.5/01446.

5. Тест-систсма для количественного обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом ПЦР в реальном времени ПД утверждена директором НПО НАРВАК и находится на межведомственных комиссионных испьааниях.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гребенникова Т. В., Забережный А. Д, Верховский О А , Орлянкин Б. Г., Атипер Т И , Непоклонов Е. А. - Создание средств лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) // 2005. -Ветеринария. -10

2 Гребенникова Т. В Метол полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике и мониторированни лечения инфекционных заболеваний. //- М. - Изд-во РУДН. -2005.-с. 1-39.

3 Гребенникова Т. В, Матвеева И С., Мусиенко М.И., Забережный А Д., Сыроешкин А В. Изменение содержания микроэлементов в клетках MARC-145 при их заражении штаммами вируса РРСС различной вирулентности // 2005. -Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - принята к публикации

4 Богданова В. С, Цибезов В В., Грабовецкий В. В., Елисеева О. В, Гребенникова Т. В., Верховский О. А., Забережный А.Д, Алипер Т И. Применение иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивного и респираторного синдрома свиней в сыворотках крови животных // 2005. - Вопросы вирусологии. - принята к пу бликации.

5 Богданова В. С., Грабовецкий В. В , Костина Л. В. Гребенникова Т В. Синтез растворимой формы рекомбннантного белка нуклеокапснда вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) и применение его для выявления специфических антител к вирусу // 2005 - Международный конгресс «Современные проблемы генетики». -Брянск

6 Гребенникова Т. В. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний // глава в книге «Микробиология» под ред. А С Лабннской и В. Г. Жуховицкого - М. - 2005, в иечати.

7. Grebenniko\ а, Т. V, Clouser, D.F., Vorwald, А.С , Musienko, M.I., Mengeling, W L., Lager, К. M. Wesley, R. D , Biketov, S.F., Zaberezhny, A.D., Aliper. T.I., Nepoklonov, E.A. -Genomic Characterization of Virulent, Attenuated and Revertant

Passages of a North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain// 2004. - Virology. - V. 321 - N 2. - P. 383-390.

8. Гребенникова Т. В., Забережный Л. Д , Мусиенко М. И , Mengeling W L , Lager. KM. , Алипер Т. И. , Пепоклонов ЕЛ- Анализ геномных детерминант вирулентности и создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома // 2004 - Вопросы вирусологии. - 3 - стр. 56-63.

9. Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Гибадулин Р. А, Мусиенко М. И., Богданова В С , Забережный А. Д., Алипер 'Г. И., Непоклонов Е. А.- Синтез к антигенные свойства рекомбинантных белков американского и европейского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) в бакуловируспой системе.// 2004. - Вопросы вирусологии. - 2. - стр. 37-42.

10. Гребенникова Т. В , Забережный А Д, Власова А. Н., Мусиенко М. И., Соколов М А., Грабовецкий В В., Цибезов В. В., Богданова В. С., Орлянкин Б. Г., Алипер Т.И, Непоклонов F. А - Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС)// 2004. - Молекулярная генетика, микробиология и вирусология -2 -стр. 37-40

11 Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A.D, Musienko, M.J., , Mengeling W.L., Lager, KM., Alipcr, T.I. , Nepoklonov, E.A. Library of Infection cDNA Genome of the Attenuated strain of North amerycan porcine rcproducti\ e and respiratory syndrome virus // 2004. - Symposium on Positive Strand RNA viruses. - May 27 - June i. -San Francisco, California, USA. - P.95.

12.Балышев A.B., Плетенева T.B., Гребенникова T.B., Сыроешкин A.B. Влияние исследуемой фармацевтической композиции на основе 7.п2' с глицином на выработку естественных киллеров// Здоровье и образование в XXI веке. Материалы V Международной научно-практической конференции . - М : Изд-воРУДН 2004.-С. 36

13. Орлянкин Б Г, Гребенникова Т. В., Ллипер 1. И., Непоклонов Е. А -Специфическая профилактика репродуктивного и респираторного синдрома свиней // 2004. - Ветеринария. - 11. - стр. 3-5.

14 Забережный А. Д., Гребенникова Т. В. - Применение молекулярных методов в диагностике и профилактике вирусных болезней - 2004. - Материалы Всероссийского совещания-семинара директоров ветеринарных лабораторий субъектов Российской Федерации - Брянск. - 1 -4 ноября 2004 г. - стр. 83-94

15.Балышев А.В, Гребенникова Т.В., Сыроешкин A.B. Обоснование противотуберкулезного действия нового гп2+-содержащего препарата (микроэлементные профили, клеточный иммунитет, неспецифическая резистентность)// 2004 - Микроэлемента в медицине Т 5 - Вып 4. - С. 6-8.

16 Алексеев К. П, Грабовецкий В. В, Гибалулин Р А, Мусиенко M И., Гребенникова Т. В , Алипер Т. И., Непоклонов Е. А., Забережный А. Д. -Получение рекомбинантных вирусных белков в бакуловирусной системе экспрессии для их дальнейшего использования в качестве специфических компонентов диагностических тест-систем на основе ИФА // «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» - Владимир. - 30-31 октября 2003.-Р. 180-185.

П.Гребенникова Т. В., Мусиенко М. И., Алипер Т И., Непоклонов Е. А, Забережный А. Д - Создание полноразмерной инфекционной копии генома аттенуированного штамма вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) американского типа// «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных».- Владимир, октябрь 2003 - Р. 164-169.

18 Grebenniko\ a. T.V., Musienko, M.I, Mengcling, W L , Lager, K. M Zaberezhny, A D , Aliper, TI , Nepoklonov, E A. -An Infectious Genomic cDNA Clone of the Attenuated PRRSV Strain of North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.// 84"d Annual Meeting, Conference of Research Workers in Animal Disease, (CRWAD) - 2003. - Chicago, USA, Novemberl 1-13.

19 Власова A. H. Гребенникова Т. В., Алипер Т. И, Непоклонов Е А., Забережный А. Д. - Разработка и применение тест-системы на основе ПЦР для

детекции и дифференциации Европейского и Американского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.// Труды "Между народной научно-практической конференции по болезням животных. Ветеринарные н медицинские аспекты зооантропонозов". - 2003. - Покров - С. 405-410.

20.Vlasova A. N., Risatti G., Grebennikova, Т. V., Zaberezhny, A. D, Aliper, Т. I., Nepoklonov, Е. A. Infectious genomic copy of the Russian vaccine strain of Classical Swine Fever (Hog Cholera) virus // 2002. 17Л Congress of the International Pig Veterinary Society, Iowa, Ames, USA, June 2-5, P. 324.

21. Tsybezov, VV., Vlasova A. N., Grebennikova, Т. V., Drew, T.W., Zaberezhny, A. D , Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A. Indirect ELISA test for detection of antibodies against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus based on recombinant nucleoprotein from European type of the virus // 2001. CRWAD 82n<l Annual Meeting, St. Louis, Missouri, USA, Novemberll-13 , P. 179

22.Grebennikova, Т. V., Clouser, D. F, Vorwald, A C., Zaberezhny, A. D . Biketov, S. F., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A., Mengeling, W. L. Entire genomic sequencing of the Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain NADC-8 from 3 different passages.// 2001. 20th Annual Meeting ASV, Madison, Wisconsin. July 2125, P. 194.

23. Grebennikova, Т. V., Zaberezhny, A. D., Paton D. J., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A.Complete Nucleotide Sequence of the Vaccine Strain «Cs» of Classical Swine Fever Virus. // Сборник научных работ специалистов НПО НАРВАК. - Москва, 2001.-С. 261-278.

24. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Сергеев В.А., Бикетов С.Ф., Алипер Т. И, Непоклонов Е. А. Генетическая характеристика вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней: Сравнительный анализ первичной последовательности генов поверхностных гликопротеинов Е™, El, Е2.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, Nb2 1999. - С. 34-40.

25. Сыроешкин А В., Гребенникова Т.В Реализация принципа Кюри в локально анизотропных средах: особенное га ферментативного ката таза с участием Н^-

ЛТТаз и ДНК-полимераз// XVI Менделеевский съем по общей и прикладной химии Химия живого. - Москва, 1998. - С 153-154

26. Grebenniko\ а, Т. V , Zaberezhny, A. D., Paton D J , McGoldrick, А , Aliper. Т. 1 , Nepoklonov, Е A Sequencing analysis of the Classical Swine Fe\cr Virus// 1998. Oie symposium on Classical Swine Fever (Hog Cholera) Birmingham (United Kindom), 9-10 July, p. 53.

27 Grebennikova. Т. V, Glukhov, A I., Chistyakova, L G., Kiselev, V. i, Severin, E. S Detection of Interleukin-2a and Determination of MDR-1 Gene Expression by Combined Re\ erse transcription and Amplification Using Thermus Thermophilus DNA Polymerase// 1995 Molecular Biology. V 29, N. 4, part 2. p 542-547

28 Glukhov, A T , Grebennikova, T V , Kiselev. V 1 , Se\erin, E. S Detection of CD-4 Receptor mRNA by Combined Reverse transcription and Amplification Using Thermus Thermophilus DNA Polymerase// 1995 Molecular Biology, V 29, N 4, part 2, p 942-949.

29. Glukhov, A I., Grebennikova, Т. V., Kiselev, V I Use of thermostable Tet-z DNA Polymerase in RNA detection by coupled RT/PCR reaction. // 1992. ATB'92 Conference, Milan, 24-27 November

30. Glukhov, A. I., Trofimova, M. E., Gordeev, S. A., Grebennikova, Т. V., Vinogradov, S. V, Kiselev, V. I., Kramarov, V. M. PCR amplification of phage lambda DNA sequences using thermostable DNA Polymerase.// 1991. Molecular Biology, V. 25, p 1602-1610.

Поди, в печ. 12.10.05r. Формат издания 60x88/16 Б\м. Тлп.

Объем Усл. Печ. л. 1.5_Тираж 100 экз._Заказ 290

Отпечатано в Ф1ТП «ЭКСПЛОР» Москва, 107139, Орликов пер., д.З, тел. 207-80-52

í í

i f

(

Л. •

120443

РНБ Русский фонд

2006-4 22422

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гребенникова, Татьяна Владимировна

Введение

Актуальность темы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Заболевание, вызываемое вирусом РРСС.

1.2 Таксономическая характеристика вируса РРСС.

1.3 Ультраструктура и морфогенез вируса РРСС.

1.3.1 Репликация вируса in vivo и in vitro.

1.3.2 Структура вириона вируса РРСС.

1.4 Геномная организация вируса РРСС.

1.5 Неструктурные белки вируса РРСС (белки репликативного комплекса).

1.5.1 Неструктурные белки, кодируемые ORF 1а.

1.5.2 Неструктурные белки, кодируемые ORF lb.

1.6 Основные структурные белки вируса РРСС.

1.6.1 Нуклеокапсидный (N) белок.

1.6.2 Основные оболочечные белки.

1.6.2.1 М белок.

1.6.2.2 Главный поверхностный гликопротеин (GP5).

1.6.3 Минорные структурные белки вируса РРСС.

1.6.3.1 Гликопротеин GP2.

1.6.3.2 Гликопротеин GP4.

1.6.3.3 Гликопротеин GP3.

1.7 Геномная изменчивость вируса РРСС.

1.7.1 Геномная изменчивость неструктурных белков.

1.7.2 Геномная изменчивость главных негликозилированных структурных бежов.

1.7.3 Геномная изменчивость главного оболочечного гликопротеина.

1.7.4 Геномная изменчивость минорных вирусных гликопротеинов.

1.8 Методы диагностики РРСС.

1.9 Методы специфической профилактики РРСС.

1.10 Применение методов обратной генетики для создания вирусов с новыми свойствами.

1.11 Изучение микроэлементных профилей металлов для характеристики физиологического состояния биологической системы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней"

Актуальность темы

Работа посвящена комплексному молекулярно-генетическому исследованию вируса, вызывающего репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС).

РРСС - инфекционное заболевание, которое обнаружено 1987 г. в Северной Каролине, США (Keffaber 1989) и Канаде (Dea S. et al. 1990). РРСС называли также загадочной болезнью свиней (mystery swine disease). В настоящее время РРСС является эндемичным заболеванием во многих, если не во всех странах с промышленным свиноводством (Goyal S. М. 1993). Практически все страны мира, включая Россию, США и страны Западной Европы, несут огромные экономические потери от этого респираторного и репродуктивного синдрома свиней.

Заболевание выражается множеством клинических проявлений, но двумя наиболее характерными являются патология органов дыхания и репродукции. Течение РРСС может сильно отличаться по проявлению признаков: от полного отсутствия клинической картины до выраженных признаков репродуктивных и респираторных нарушений. Респираторные расстройства, как правило, наиболее сильно выражены у поросят всех возрастов и проявляются в виде неспецифических лимфомононуклеарных пневмоний (Halbur P. G. et al. 1996b и др.). Нарушения репродуктивной функции наблюдаются, в основном, у ремонтных свинок и свиноматок, инфицированных во время супоросности (Christianson W. Т. et al. 1993; Mengeling W. L. et al. 1994). При этом наблюдаются аборты, рождение мертвых или ослабленных поросят (Christianson W. Т. et al. 1992; Terpstra С. et al. 1991), иногда гибель свиноматок (Zimmerman J. J. et al. 1997a). Считают, что в неблагополучных хозяйстьах РРСС способствует усилению других инфекционных заболеваний респираторного комплекса (Galina L. et al. 1994; Carvalho L. et al. 1995; Solano G. et al. 1995; Van Alstine W. G. et al. 1996).

Вирус PPCC относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, порядка Nidovirales (Cavanagh D. 1997). Предполагается, что вирус распространился из Канады в США. Происхождение вируса неизвестно. Различают два типа вируса РРСС: американский и европейский. Предполагают, что европейский и американский типы вируса имеют различные эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются (Nelson Е. A. et al. 1993; Wensvoort G. et al. 1992).

Вирус PPCC проникает в клетки иммунной системы, главным образом, в макрофаги (Wensvoort G. et al. 1991; Voicu I. L. et al. 1994; Rossow K. D. et al. 1995; Rossow R. D. et al. 1996, Molitor T. W. et al. 1996). Быстрому распространению вируса способствует его длительная персистенция в организме зараженных животных (Benfield D. A. et al. 1997), его присутствие в сперме (Christopher-Hennings J. et al. 1995, Swenson S. L. et al. 1994), высокая контагиозность (Mengeling W. L. et al. 1998).

Из-за сходства клинических признаков PPCC с признаками заболеваний, вызываемых другими вирусными или бактериальными патогенами, для точной диагностики РРСС требуются специфические лабораторные методы. Серологические тесты включают иммуноферментный анализ, реакцию нейтрализации и непрямую реакцию иммунофлюоресценции (Yoon I. J. et al. 1992, Dea S. et al 2000, Witte S. B. et al. 2000). Вирус выявляют с использованием иммуногистохимического анализа, окрашивания при помощи флюоресцирующих антител, методом полимеразной цепной реакции и выделения вируса в культуре клеток (Paton D. L. et al. 1992, Suares P. et al. 1994, Christofer-Hennings J. et al 1995, Mengeling W. L. et al. 1995). Секвенирование генома вируса PPCC позволяет, с определенной степенью точности, определить родство между разными штаммами.

Для установления в хозяйствах стабильной ситуации относительно репродуктивного и респираторного синдрома свиней используют как частичную депопуляцию стада, так и его полную замену (в странах Европы и Америки), а также вакцинацию. Для специфической профилактики РРСС используются, в основном, живые и инактивированные вакцины (Б. Г. Орлянкин и др. 2000). В настоящее время разрабатываются субъединичные и ДНК-вакцины, проводятся активные исследования иммунного ответа животных. Тем не менее, эффективность применения вакцин на практике в условиях широкого распространения и длительной персистенции полевых штаммов вируса РРСС достоверно не подтверждена. В настоящее время не существует вакцины, которая эффективно защищала бы животных от заболевания. Более того, использование живых вакцин часто приводит к заболеванию животных из-за реверсии вакцинного штамма вируса к дикому типу (Smedegaar G. et al. 1997).

Таким образом, несмотря на значительный прогресс в изучении вируса, РРСС остается загадочной болезнью и в настоящее время. Роль иммунного ответа в патогенезе РРСС недостаточно изучена. Известно, что при контакте с вирусом у свиней вырабатываются вирус-специфические антитела (Gorcyca D. Е. et al. 1995; Gorcyca D. E. et al. 1996; Hesse R. A. et al. 1996, Mengeling et al. 1996). Предполагается также, что в определенных условиях выработка антител может усиливать фагоцитоз (antibody dependent enhancement, ADE) и увеличивать репликацию вируса (Christianson W. Т et al. 1993; Yoon K.-J. et al. 1996). Эти данные косвенно свидетельствуют о значительных антигенных вариациях среди циркулирующих вирусов РРСС. Вирус-нейтрализующие антитела появляются поздно, через 3-4 недели после инфицирования (Yoon K-J et al. 1995, Loemba H. D. et al. 1996, Ostrowski M. et.al. 2002). Известно, что гуморальный иммунный ответ организма на присутствие вируса РРСС не обеспечивает эффективной защиты.

Очевидно, что для создания эффективных средств профилактики данного заболевания необходимы фундаментальные исследования. В частности, необходимо подробное молекулярно-генетическое исследование этого патогена, выявление генетических детерминант вирулентности вируса РРСС. Для разработки стратегии профилактики РРСС требуется комплексное изучение инфекционного процесса, включая выяснение особенностей патогенеза и также подробное молекулярное исследование вирусных изолятов, циркулирующих на территории России и пограничных с ней государств.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа посвящена комплексному молекулярно-генетическому анализу вируса РРСС, в частности, выявлению функционально значимых генетических мутаций.

Целью работы было подробное молекулярно-генетическое исследование вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и выявление детерминант вирулентности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Разработать набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов, полученных из отечественных изолятов вируса РРСС.

5. Провести сравнение in vivo свойств трех различных вариантов североамериканского штамма вируса РРСС NADC8: вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного варианта, полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8-251, а также промежуточного варианта, выделенного от свиньи после частичной реверсии аттенуированного вируса -NADC8-252P.

6. Определить полную первичную структуру геномов у трех штаммов вируса РРСС: вирулентного штамма NADC8-2, его аттенуированного мутанта, полученного пассированием в культуре клеток (NADC8-251), а также частично ревертировавшего вируса (NADC8-252P).

7. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного штамма NADC8-251 и частично ревертировавшего NADC8-252P и на основе проведенного анализа определить функционально значимые участки генома, потенциально ответственные за аттенуацию вируса, а также молекулярные детерминанты, связанные со свойствами вирулентности.

9. Получить рекомбинантные вирусы путем трансфекции перевиваемой культуры клеток in vitro, охарактеризовать их вирусологическими методами. Подтвердить генно-инженерное происхождение вируса определением первичной структуры его генома.

Научная новизна работы

До начала комплексных исследований (1997-1998 г.г.) не было сведений о распространении вируса РРСС на территории Российской Федерации и пограничных с ней государств. В рамках данной работы было проведено обследование свиноводческих хозяйств России и Белоруссии на наличие антител против вируса РРСС. Впервые было установлено широкое распространение вируса на территории этих государств. Проведен подробный молекулярный анализ первичной структуры геномов полевых изолятов вируса РРСС, выделенных на территории Российской Федерации и Белоруссии. Это позволило нам оценить степень вариабельности геномов вирусов, циркулирующих на данной территории, и разработать средства лабораторной диагностики РРСС. Были созданы и утверждены отечественные тест-системы для проведения комплексной лабораторной диагностики РРСС, основанные на выявлении компонентов вируса и антител к нему. Отечественных тест-систем до этого разработано не было.

Впервые были подробно исследованы молекулярные основы вирулентности и аттенуации вируса РРСС. На основании исследования полной первичной структуры геномов трех вариантов вируса РРСС: вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного варианта NADC8-251 и его ревертанта, образовавшегося в результате одного пассажа в организме свиньи NADC8-252P, обнаружены участки генома, которые могут играть роль в приобретении вирулентности вирусом РРСС. Впервые найдены генетические детерминанты вирулентности вируса РРСС.

Впервые создана библиотека полноразмерных инфекционных копий генома вируса РРСС, состоящая из 32 плазмид, для изучения фундаментальных генетических характеристик представителей рода Arterivirus методами обратной генетики. Полноразмерные копии генома аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС собраны и клонированы в E.coli. На основе полученных генноинженерных конструкций синтезированы РНК-геномы и получены рекомбинантные инфекционные вирусы с минимальными различиями в первичной структуре генома по сравнению с родительским штаммом NADC8-251. Создание библиотеки, а не единичной инфекционной копии вируса РРСС, позволило успешно преодолеть трудности, связанные с нестабильностью генома вируса РРСС. Таким образом, создана система обратной генетики, позволяющая проводить генетические манипуляции с вирусным РНК-геномом, что ранее было невозможно.

Практическая значимость

Итогом проведенных исследований была разработка полного комплекса методов лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов. Разработаны тест-системы для определения РНК вируса РРСС методами ПЦР и ПЦР в реальном времени. Разработан также набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС методом ИФА. Тест-системы успешно прошли лабораторные испытания. Тест-система для определения РНК вируса РРСС методом ПЦР и набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС методом ИФА получили все необходимые сертификационные документы и прошли широкомасштабные производственные испытания. Результаты испытаний позволяют рекомендовать разработанные тест-системы для использования в хозяйствах Российской Федерации и пограничных с ней государств. Тест-система для определения вируса РРСС методом ПЦР в реальном времени в настоящее время проходит комиссионные испытания. Полученные результаты позволяют надеяться на то, что данная тест-система будет использоваться для широкого мониторинга хозяйств на наличие вируса РРСС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Подтверждение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии, определением антител к вирусу на основе серологического анализа сывороток крови свиней.

2. Создание и характеристика комплекса новых средств лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов: тест-систем для выявления вируса РРСС с использованием ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени и набора реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов.

3. Доказательство эффективности разработанных тест-систем для выявления вируса РРСС и антител к нему, полученных на основе отечественных реагентов в ходе масштабных производственных испытаний.

4. Оценка генетического разнообразия и генотипирование полевых изолятов вируса, циркулирующих на территории России и Белоруссии, и их филогенетический анализ.

5. Экспериментальное подтверждение степени вирулентности или аттенуации трех вариантов полевого изолята NADC8: высоковирулентного NADC8-2, аттенуированного вируса NADC8-251, а также вируса-ревертанта - NADC8-252P.

6. Сравнительный анализ трех полноразмерных геномов, включающий анализ генов вирусных белков и регуляторных последовательностей вирусов NADC8-2, NADC8-251 и NADC8-252P. Выявление потенциальных молекулярных детерминант, связанных со свойствами вирулентности вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

7. Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма NADC8-251 для исследования функциональных участков вирусного генома методами обратной генетики.

8. Характеристика библиотеки инфекционных копий генома вируса РРСС и отбор рекомбинантного вируса РРСС со свойствами, приближенными к родительскому штамму NADC8-251.

Апробация результатов исследования

Материалы исследования доложены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, Научно-технического совета НПО НАРВАК, на Международной научно-практической конференции РУДН, Москва, 2004 г., на 7-м международном симпозиуме по исследованию положительно-цепочечных РНК-содержащих вирусов, Сан-Франциско, США, 2004 г., на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветеринарных лабораторий субъектов РФ, Брянск, 2004, на 82-й и 84-й конференциях по болезням животных (CRWAD), Сент-Луис и Чикаго, США, 2001 г. и 2003 г., на конференции ВНИИЖЗ, Владимир, 2003 г., на Международной научно-практической конференции по болезням животных, Покров, 2003 г., на 17-м международном конгрессе ветеринарных вирусологов, Эймс, Айова, США, 2002 г., на 20-й конференции Американского общества вирусологии, Мэдисон, Висконсин, США, 2001 г., на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии в Москве, 1998 г., на Симпозиуме МЭБ (OIE), Бирмингем, Великобритания, 1998 г., на международной конференции АТВ'92, Милан, Италия, 1992 г.

Благодарности

Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту д.б.н. Е. А. Непоклонову, д.б.н. Т. И. Алиперу, д.б.н. А. Д. Забережному, проф. Б. Г. Орлянкину, заслуженному деятелю науки РСФСР, проф. В. С. Сергееву, д.б.н. Сыроешкину, проф. В. Менгелингу и д-ру К. JIarepy (NADC, Ames, USA) за разностороннюю научно-методическую помощь в работе. Автор приносит глубокую благодарность к.б.н. М. И. Мусиенко, к.б.н. В. В. Цибезову, В. С. Богдановой, В. В. Грабовецкому, О. В. Елисеевой, Н. И. Потаповой, А. В. Байбак, к.б.н. А. Н. Власовой и к.б.н. К. П. Алексееву, совместно с которыми были выполнены отдельные фрагменты представленной работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Загадочная болезнь свиней (mystery swine disease), болезнь синего уха -так в конце 80-х и начале 90-х называли репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС), вызываемый вирусом PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus). Заболевание было впервые обнаружено в 1987 г. в Северной Каролине, США, после чего оно быстро распространилось по всей стране (Keffaber 1989; Loula 1991), в Канаде (Dea et al. 1990), Японии (Shimizu et al. 1994), Германии (Lindhaus and Lindhaus 1991), в Нидерландах (Wensvoort et al. 1991), Англии (White 1991), Франции и Испании, (Meredith 1992), Дании (Botner et al. 1994), в'других регионах мира (Meredith 1995). При анализе сывороток свиней из коллекций прошлых лет в Онтарио (Канада) обнаружили антитела к вирусу в образцах 1979 г. в 2 хозяйствах и в 1980 г. в 8 хозяйствах (Carman et al. 1995), а в Айове (США) антитела обнаружили, начиная с 1985 г. (Zimmerman et al. 1997). Это свидетельствует о циркуляции вируса в поголовье свиней задолго до официального установления болезни.

Существует гипотеза, что вирус распространился из Канады в США. Происхождение вируса неизвестно. Различают два типа вируса РРСС: американский и европейский. Предполагают, что европейские и североамериканские типы вируса имеют различные эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются (Nelson et al. 1993; Wensvoort et al. 1992).

Вирус PPCC был выделен впервые в 1991 г. в Нидерландах (г. Лелистад) на культуре альвеолярных макрофагов поросят (PAMs). Выделенный штамм вируса получил название Lelystad (Wensvoort et al. 1991). В 1992 году в США вирус был выделен на перевиваемой линии клеток АТСС CL2621, производной от перевиваемой линии клеток почки обезьяны. (Benfield et.al. 1992; Collins et al. 1992).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гребенникова, Татьяна Владимировна

4. ВЫВОДЫ

2. Разработана и внедрена тест-система для обнаружения вируса РРСС американского и европейского генотипов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Диагностическая чувствительность тест-системы составляла 1-10 ТЦД50/ мл.

3. Подтверждена постоянная циркуляция вируса РРСС на территории России и Белоруссии в рамках широких производственных испытаний тест-системы для определения РНК вируса РРСС методом ПЦР в 2002-2004 г.г. В России из 41 исследованного района в 16-ти был обнаружен вирус РРСС у свиней различных возрастных групп. В Белоруссии в 10 из 19 районов был обнаружен вирус РРСС.

4. Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени ("Realtime PCR") для определения РНК вируса РРСС. Показана принципиальная возможность количественного определения вируса РРСС в культурах клеток и материале от больных животных. Диагностическая чувствительность тест-системы составляла 1ТЦЦ50/ мл.

6. Показано, что рекомбинантные белки нуклеокапсида американского и европейского типов, полученные в эукариотической (бакуловирусной) и прокариотической (Е. coli) системах экспрессии могут быть использованы в качестве специфических компонентов диагностической тест-системы.

10. Создана и охарактеризована экспериментальная модель для изучения функционально значимых участков РНК-генома артеривирусов. Для этого сконструирована библиотека из 32 клонов полноразмерных копий геномов аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС под контролем промотора Т7 в плазмидном векторе E.coli на основе плазмиды pACYC177 с уникальным сайтом множественного клонирования. На основе полученных плазмид синтезированы инфекционные РНК-геномы штамма NADC8-251 вируса РРСС и получены инфекционные вирусы. Генно-инженерное происхождение вирусов подтверждено секвенированием.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1. Тест-система для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Технические условия ТУ № 9388-00242418073-02

2. Наставление по применению тест-системы для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Утверждено Департаментом Ветеринарии МСХ РФ 07. 10. 02, № 13-5-02/599

5. Тест-система для количественного обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) методом ПЦР в реальном времени. НД утверждена директором НПО НАРВАК и находится на межведомственных комиссионных испытаниях.

1. 12. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней был открыт сравнительно недавно (примерно 20 лет назад). Загадочная болезнь свиней (mystery swine disease), болезнь синего уха - так в конце 80-х и начале 90-х называли заболевание, вызываемое данным вирусом. Вирус РРСС был отнесен к семейству Arteriviridae рода Arterivirus, порядка Nidovirales.

В настоящее время хорошо изучено строение вириона вируса РРСС (Cavanagh D. 1997) и его геномная организация (Conzelmann К. К. et al. 1993, Meulenberg J. J. M. et al. 1993).

Изучение молекулярных и антигенных характеристик вируса РРСС позволило выделить два генотипа вируса РРСС: американский и европейский. В научной литературе генотипы вируса РРСС также называют подтипами. Геномы вируса РРСС европейского и североамериканского генотипа сильно различаются (50-80% гомологии на нуклеотидном уровне), поэтому существует гипотеза о том, они имеют различные эволюционные истории (Nelson et al. 1993; Wensvoort et al. 1992).

Вирус РРСС научились культивировать in vivo с использованием первичной культуры альвеолярных макрофагов поросенка (Wensvoort G. et all. 1991) и с использованием субклонов MARC-145 и CL2621 перевиваемой клеточной линии МА-104 обезьяньей почки (Bautista Е. М. et all. 1993, Benfield D. A. et all. 1992, Kim H. S. et all. 1993).

Подробные исследования как структурных, так и неструктурных белков вируса РРСС (эпитопное картирование, изучение антигенной вариабельности, исследования имунного ответа на различные протеины и т. д.) позволили получить знания о их структуре и функциях. Эти знания явились основополагающими в изучении молекулярной биологии данного вируса. Не до конца выяснена роль оболочечных гликопротеинов вируса РРСС в присоединении вируса к пермиссивным клеткам, вирусном патогенезе, апоптозе, феномене повышенной антительной зависимости, гуморального и клеточного иммунного ответа и защиты. В настоящее время ведется получение моноклональных антител к минорным структурным гликопротеинам и к конформационно зависимым эпитопам главного оболочечного гликопротеина для изучения биологических функций разных структурных компонентов вируса.

Изучение первичной структуры геномов аттенуированных и вирулентных штаммов вируса РРСС проводится в настоящее время для определения участков генома, отвечающих за вирулентность вируса РРСС (Nielsen HS et al. 2001, Grebennikova, T.V. et al. 2004).

Разработаны средства определения вируса РРСС молекулярными методами (Van Woensel et al. 1994; Kono et al. 1996; Spagnuolo-Weaver et al. 2000, Власова АН и др. 2003), а также определения антител к данному вирусу (Nelson ЕА et al. 1994, Mengeling WL. et al. 1995, Yoon K.- J. et al. 1995, Loemba HD., et al. 1996, Гребенникова Т. В. и др. 2004).

Однако, несмотря на обширные знания о возбудителе и заболевании, респираторный и репродуктивный синдром свиней остается загадочной болезнью свиней и в настоящее время. Как и двадцать лет назад, если вирус РРСС циркулирует в хозяйстве, от него невозможно избавиться. В настоящее время общепризнана следующая схема распространения вируса в хозяйствах. Вирус РРСС попадает в хозяйство, начинается заболевание. Через некоторое время происходит "адаптация" вируса РРСС, он постоянно циркулирует в хозяйстве. Следующую вспышку заболевания можно ожидать при заносе другого штамма вируса РРСС или после мутации существующего в хозяйстве вируса.

В нашей стране, в странах Европейского союза и в США данное заболевание наносит существенный экономический ущерб. В настоящее время не существует универсального эффективного средства профилактики РРСС. Для профилактики РРСС используют инактивированные и живые вакцины. Инактивированные вакцины могут быть использованы в хозяйствах, свободных от РРСС. Инактивированные вакцины могут быть использованы в составе многокомпонентных вакцин для профилактики инфекционных заболеваний свиней, поражающих органы респираторного тракта. Данные вакцины могут помочь в частичном контроле респираторных заболеваний в хозяйствах (Орлянкин Б. Г. 2000, 2004). Применение живых вакцин осложняется высокой вариабельностью вируса РРСС. Так в Дании в 1996 г. применение живой вакцины RespPRRS/Repro привело к заражению 40% свиней в результате реверсии вакцинного вируса к дикому типу (Smedegaar et al. 1997).

Трудности в создании эффективных средств профилактики данного заболевания обусловлены особенностями формирования иммунного ответа к РРСС. Вирус-нейтрализующие антитела появляются поздно, через 3-4 недели после инфицирования (Yoon K-J et al. 1995, Loemba HD et al. 1996, Ostrowski et.al. 2002). Известно, что гуморальный иммунный ответ организма на присутствие вируса РРСС не является эффективным. Ситуация осложняется высокой генетической изменчивостью данного вируса.

Очевидно, что для создания эффективных средств профилактики данного заболевания необходимы новые подходы. Одним из таких подходов является создание системы обратной генетики для вируса РРСС. В настоящее время разработаны инфекционные кДНК клоны для вируса РРСС (Meulenberg et.al. 1998; Grebennikova et.al. 2003; Nielsen et.al. 2003). С использованием полноразмерных копий вируса РРСС можно, с одной стороны исследовать факторы вирулентности и механизмы патогенности данных вирусов, а с другой стороны - конструировать вакцинные штаммы вируса РРСС с улучшенными антигенными характеристиками.

В качестве другого подхода предлагается рассмотреть воздействие вируса РРСС на биологические системы (клеточная культура, организм животного) для создания дополнительных средств профилактики РРСС. Было обнаружено, что при изучении содержания металлов (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb) в бактериях (Bacillus subtillis, Mycobacteria tuberculosis, Rhodococcus ridichrous) растениях (Allium aflatuense) и у человека, вид микроэлементных профилей является видоспецифичным, и постоянным. Однако он зависит от физиологического состояния клетки/организма (Матвеева И. С. и др. 2003), и при попадании в организм патогена (вируса или бактерии) постоянство этого профиля нарушается. Следовательно, изучение микроэлементных профилей клеточных культур, инфицированных и не инфицированных вирусом РРСС, может помочь разработке микроэлементной композиции для дополнительной профилактики репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Клеточные линии.

Клеточные линии MARC-145 (субклон клеточной линии МА-104) ВНК-21 были любезно предоставлены Dr. W. Mengeling (Национальный институт болезней животных (NADC), США).

Рекомбинантные штаммы бакуловирусов выращивали на культуре клеток насекомых Spodoptera frugipedra (клеточные линии Sf-9, Sf-21). Клетки выращивали во флаконах, с использованием ростовой среды ТС-100 ("Life Technology", США), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коровы (СЭК) и гентамицин в концентрации 50 ед./мл при 27°С. В качестве поддерживающей использовали среду ТС-100, содержащую 5% СЭК.

Для препаративного синтеза рекомбинантных антигенов использовали суспензионную или монослойную культуру клеток Sf-21, а также культуру клеток High-Five, адаптированную к росту в бессывороточной среде SF-900 ("Life Technology", США).

Полевые изоляты вируса РРСС

Одиннадцать полевых изолятов вируса РРСС были получены из различных регионов центральной России и Белоруссии в период 1992-2000 г. Один полевой изолят был получен из материала, отобранного в 1986 г. в Приморском крае. Изолят 1992 г., был выделен из биологического материала, полученного из центральной России проф. Б. Г. Орлянкиным. Полевые изоляты вируса РРСС были получены из легочных смывов поросят с подозрениями на РРСС. Из образцов легочных смывов проводили выделение вируса в культуре альвеолярных макрофагов и с использованием клеточной линии MARC-145. Клетки выращивали в 24-луночных планшетах, с использованием ростовой среды ЕМЕМ ("Life Technology", США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки КРС (СЭК) и гентамицин в концентрации 0,05 мг/мл. В образцах, в которых наблюдали цитопатический эффект, отбирали культуральную среду и пассировали. Третий пассаж использовали для исследования на присутствие специфической РНК вируса РРСС. Проверку на присутствие других вирусов осуществляли методом ПНР.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гребенникова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова JI.C. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органопатология)// М.: Медицина. -1991. С. 496.

2. Басоло Ф., Пирсон Р. Механизмы неорганических реакций. М.: Мир. -1971.-592 с.

3. Байбиков Т. 3., Гусев А. А., Яременко Н. А., Дудникова Н. С., Гаврилова В. Л., Кукушкин С. А., Курман И. Я., Ковалишин В. Ф., Рахманов А. М. Репродуктивно-респираторный синдром свиней. -Ветеринария. 2001. - № 3. - С. 18-24.

4. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. М.: Наука.- 1985.-С. 350.

5. Вернадский В.И. О химическом элементарном составе рясок (Lemna) как видовом признаке. ДАН СССР. - 1931. С. 148-152.

6. Вернадский В.И. Химическое строение биосферы Земли и ее окружения// М.: Наука. 1987. - С. 340.

7. П.Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. "Механизмы токсического действия неорганических соединений"// М.: Медицина. 1989. - С. 272.

8. Забережный А. Д. Применение технологии рекомбинантных инфекционных геномов в изучении РНК-содержащих вирусов// Вопросы вирусологии

9. З.Ионы металлов в биологических системах. Амбивалентные свойства нуклеотидов/ Ред. X. Зигель. -М.: Мир. 1982. - С. 168.

10. Плетенева Т.В. Прогнозирование экологической опасности неорганических соединений по их физико-химическим свойствам: Автореф. дис. доктора химических наук. М., 1993. - С. 84.

11. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине.- М.: Издательский дом «ОНИКС 21 век»: Мир.- 2004. С. 272.

12. Сусликов В.П. Геохимическая экология болезней: В 4 т. Т.З. Атомовитозы. М.: Гелиос АРВ, 2002. - С. 546.

13. Туманова А.Л., Еременко А.И. Микроэлементозы и их влияние на возникновение и клинику диабетических, атеросклеротических и сосудистых нейроретинопатий Краснодар, 2002, 228 с. ISBN 5-22504166-3

14. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов. М: Мир. -1983.- С. 414.

15. Adachi S, Takemoto K, Ohshima S, Shimizu Y, Takahama M. Metal concentrations in lung tissue of subjects suffering from lung cancer //Int Arch Occup Environ Health. 1991. -V. 63(3).-P.l93-197.

16. Ahl R, Pensaert M, Robertson IB, Terpstra C, van der Sande W, Walker KJ, White M, Meredith M. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blue-eareddisease)// Vet Rec-1992.- V. 130.P 87-89.

17. Albina, E., Madee, F., Cariolet, R. and Torrison, J. Immune response and persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm units// Vet. Rec.- 1994. V. 134. - P. 567-573.

18. Andrasi E, Suhajda M, Saray I, Bezur L, Ernyei L, Reffy A. Concentration of elements in human brain: glioblastoma multiforme //Sci Total Environ. -1993.-№139- P.399-402.

19. Anke M., Groppel В., Kronemann H., Grun M. Nickel an essential element// IARC Sci. Publ. - 1984. - V. 53. - V. 339-365.

20. Andreyev VG, Scherbakov AG, Pylnov VA, Gusev AA Genetic heterogenesity of PRRSV in Russia// Proceedings of the International Symposium on PRRS andAujeszky's Disease. 1999. - Ploufragan, France, June 21-24. - P. 211-212.

21. Anke M., Groppel В., Kronemann H., Grun M. Nickel an essential element// IARC Sci. Publ. - 1984. - V. 53. - V. 339-365.

22. Appanna V.D., Hamel R. Aluminum detoxication mechanism in Pseudomonas fluorescens is dependent on iron// FEMS Microbiol. Lett. -1996. V. 143. - No. (2-3). - P. 223-228.

23. Bal W, Kasprzak KS. Induction of oxidative DNA damage by carcinogenic metals //Toxicol Lett. 2002. - №28. - P.55-62

24. Bargellini A., Piccinini L., De Palma M., Giacobazzi P., Scaltriti S., Mariano M., Roncaglia R., Borella P. Trace elements, anxiety and immune parameters in patients affected by cancer// Trace Elem. Med. Biol. 2003. -V. 17. - Suppl. l.-P. 3-9.

25. Baron T, Albina E, Leforban Y, Madec F, Guilmoto H, Plana Duran J, Vannier P Report on the first outbreak of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) in France. Diagnosis and viral isolation// Ann Rech Vet. 1992. - V. 23. - P. 161-166.

26. Baron, M.D., and Barrett, T.1997. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol/7 U 1265-1271.

27. Bassett S.E., Di Bisceglie A.M., Bacon B.R., Sharp R.M., Govindarajan S., Hubbard G.B., Brasky K.M., Lanford R.E. Effects of iron loading on pathogenicity in hepatitis С virus-infected chimpanzees// Hepatology. -1999. -V. 29. No 6. P. 1884-1892.

28. Bautista EM, Molitor TW Cell-mediated immunity to porcine reproductive andrespiratory syndrome virus in swine// Viral Immunol. 1997. - V. 10. -P. 83-94.

29. Bautista EM, Meulenberg JJM, Choi CS, Molitor TW Structural polypeptidesof the American (VR-2332) strain of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus// Arch Virol. 1996. - V.141. -N.l.-P. 357-365.

30. Bautista EM, Suarez P, Molitor TW T ell responses to the structural polypeptides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Arch Virol.- 1999.-V. 144.-P. 117-134.

31. Beck M.A. The influence of antioxidant nutrients on viral infection// Nutr Rev. 1998. - V. 56. - No 1. - Pt 2. - P. S140-S146.

32. Belak, S. and Thoren, P. Molecular diagnosis of animal diseases: some experience of the past decade// Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. - V. 1. N.4. -P. 89-98.

33. Beliakova T.M., Guseinov A.N., Ponarina M.V. Ecologic aspects of thecirculation of carcinogenic PAH and heavy metals in the geochemical landscapes of the Ural River basin //Eksp Onkol. 1988. - №10(6). - P.62-66.

34. Beyer, J., Fichtner, D., Schirrmeier, H., Polster, U., Weiland, E. and Wege, H. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): kinetics of infection in Lymphatic organs and lungs// J. Vet. Med. 2000. - V. 47. -P. 9-25.

35. Bilodeau R, Dea S, M artineau GP, Sauvageau R Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec// Vet Rec. 1991. - V. 129. - P. 102103.

36. Botner, A., Strandbygaard, В., Sorensen, K.J., Have, P., Madsen, K.G., Madsen E.S., Alexandersen, S. Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine// Vet Rec. -1997.-V. 141.-P. 497-499.

37. Boyer, J.C., Haenni, A.L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses//Virology. 1994. - V. 198. P. 415-426.

38. Bridgen, A., and Elliott, R.M.1996. Rescue of a stgmented negative-strand RNA virus entirely from cloned complementary DNAs// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. -P. 15400-15404.

39. Butt T.R., Sternberg E.J., Gorman J.A., Clark P., Hamer D., Rosenberg M., Crooke S.T. Cooper metallothionein of yeast, structure of the gene, and regulation of expression// Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. - V. 81. - P. 33323336.

40. Clarke, D.K., Sidhu, M.S., Johnson, J.E.,and Udem, S.2000. Rescue of mumps virus from cDNA . J. Virol.74, 4831-4838.

41. Carlson J. Encephalomyocarditis virus (EMCV) as a cause of reproductive and respiratory disease in swine// American Association of Swine Practitioners Newsletter. 1992. - V. 4. - P. 23.

42. Carpenter D.O., Matthews M.R., Parsons P.J., Hori N. Long-term potentiation in the piriform cortex is blocked by lead// Cell. Mol. Neurobiol. 1994. - V. 14. -No. 6. - P. 723-733.

43. Carvalho, L., Segales, J., and Pijoan, C. 1995. Effect of PRRSV on subsequent Pasteurella multocida challenge in pigs. Proc 2nd Int Symposium on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Copenhagen, Denmark p. 20.

44. Castrucci, M.R., and Kawaoka, Y. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein// J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 2725-2728.

45. Cavanagh, D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae.il Arch. Virol. 1997. - V. 142. - P. 629-633.

46. Chan S., Gerson В., Subramaniam S. The role of copper, molybdenum, selenium, and zinc in nutrition and health// Clin. Lab. Med. 1998. - V. -18.-No. 4.-P. 673-685

47. Cheng L, Liu S, Dixon K. Analysis of repair and mutagenesis of chromium-induced DNA damage in yeast, mammalian cells, and transgenic mice// Environ. Health Perspect. 1998.-V. 106.-P. 1027-1032.

48. Christianson W. Т., Collins J. E., Benfield D. A., Harris L., Gorcyca D.E., Chladek D.W., Morrison R.B., Joo H.S. Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows// Am J Vet Res. 1992. - V. 53. - P. 485—488.

49. Christianson, W.T., Choi, C.S., Collins, J.E., Molitor, T.W., Morrison, R.B., and Joo, H.S. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in mid-gestation sows and fetuses. //-1993. Can J Vet Res. - V. 57. - P. 262-268.

50. Choi C, Kim J, Kang IJ, Chae C. Concurrent outbreak of PMWS and PDNS in a herd of pigs in Korea//Vet Rec. 2002. - V. 151.-N. 16.-P. 484-5.

51. Chou H.Y., Peng T.Y., Chang S.J., Hsu Y.L., Wu J.L. Effect of heavy metal stressors and salinity shock on the susceptibility of grouper (Epinephelus sp.) to infectious pancreatic necrosis virus// Virus Res. 1999. V. 63. No 1-2.-P. 121-129.

52. Conzelmann, K.K., Visser, N., Van Woensel, P., Thiel, H.J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group// Virology. 1993. - V. 193. - P. 329-339.

53. Cornaglia E, Wilson L, Laganiere L, Lallier R, Dea S. PRRS serological monitoring : a new competitive ELISA. Proceedings of the International Symposium on PRRS and Aujeszky's Disease// Ploufragan, France. -1999. June 21-24. - P. 137-138.

54. Coutelier JP, Van Snick J Neutralization and sensitization of lactate dehydrogenase-elevating virus with monoclonal antibodies// J Gen Virol. 1988. - V. 69. - P. 2097-2100.

55. Damelin L.H., Vokes S., Whitcutt J.M., Damelin S.B., Alexander J.J. Hormesis: a stress response in cells exposed to low levels of heavy metals// Hum. Exp. Toxicol. 2000. - V. 19. - No. 7. - P. 420-430.

56. Da Silva E.M., Soares A.M., Moreno A.J. The use of the mitochondrial transmembrane electric potential as an effective biosensor in ecotoxicological research// Chemosphere. 1998. - V. 36. - No. 10. - P. 2375-2390.

57. Davis M.A, Murphy J.F., Boyd R.S. Nickel increases susceptibility of a nickel hyperaccumulator to Turnip mosaic virus// J. Environ. Qual. 2001. -V.30.-No l.-P. 85-90.

58. Dea S, Bilodeau R, Athanassious R, Sauvageau R, Martineau GP Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebec: isolation of an enveloped virus serologically-related to Lelystad virus// Can Vet J. -1992.-V. 33.-P. 801-808.

59. Dea S, Sawyer N, Alain R, Athanassious R Ultrastructural characteristics and morphogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus propagated in the highly permissive MARC-145 cell clone// Adv

60. Exp Med Biol. 1995. - V. 380. - P. 95-98.

61. Denac H, Moser C, Tratschin JD, Hofmann MA An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen// J Virol Methods. 1997.-V. 65.-P. 169-181.

62. De Vries AAF, Chirnside ED, Bredenbeek PJ, Gravestein LA, Horzinek MC, Spann WJ.M All subgenomic mRNAs of equine arteritis virus contain a common leader sequence// Nucleic Acids Res. 1990. -V. 18. -N. 3.-P. 241-3 247.

63. De Vries AAF, Chirnside ED, Horzinek MC, Rottier PJM Structural proteins of equine arteritis virus// J Virol. 1992. - V. 66. - P. 6294-6303.

64. De Vries AAF, Post SM, Raamsman MJB, Horzinek MC, Rottier PJM The two major envelope proteins of equine arteritis virus associate into disulfide-Hnked heterodimers// J Virol. 1995. - V. 69. - P. 4668-4674.

65. De Vries AAF, Raamsman MJ, van Dijk HA, Horzinek MC, Rottier PJM The small envelope glycoprotein (Gs) of equine arteritis virus folds into three distinct monomers and a disulfide-linked dimmer// J Virol. 1995. -V. 69.-P. 3441-3448.

66. De Vries AAF, Horzinek MC, Rottier PJM, de Groot RJ The genome organization of Nidovirales: Similarities and differences between Arteri-, Того-, and Coronaviruses// Semin Virol. 1997. - V. 8. - P. 33-47.

67. Den Boon JA, Snijder EJ, Chirnside EDS, de Vries AAF, Horzinek MC,

68. Spaan WJM Equine arteritis virus is not a Togavirus but belongs to the Coronavims-like superfamily//J Virol. 1991. -V. 65. - P. 2910-2920.

69. Dixon N.E., Gazzola T.C., Blakeley R.L., Zermer B. Jack bean urease (EC 3.5.1.5). A metalloenzyme. A simple biological rolefor nickel?// J. Am. Chem. Soc. 1975. -V. 97. -No. 14. -P. 4131-4133.

70. Domingo E. RNA virus evolution, population dynamics, and nutritional status// Biol. Trace Elem. Res. 1997. - V. 56. - No 1. - P. 23-30.

71. Dominguez M.C., Sole E., Goni C., Ballabriga A. Effect of aluminum and lead salts on lipid peroxidation and cell survival in human skin fibroblasts// Biol. Trace Elem. Res. 1995. - V. 47. - No. (1-3). - P. 57-67.

72. Drew, T. W., Meulenberg, J. J. M., Sands J. J., Paton D. Production, characterization and reactivity of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 1361-1369.

73. OO.Drewitt PN, Butterworth KR, Springall CD, Moorhouse SR. Plasma levels of aluminium after tea ingestion in healthy volunteers //Food Chem Toxicol. 1993.-№31(1).-P.19-23.

74. Drew T. W., Lowing J. P., Yapp F. Variation in open reading frames 3,4 and 7 among porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in UK// Vet. Microbiol.- 1997. V.55. - P. 209-221.

75. Egli, C., Thur, В., Liu, L. and Hofmann, A. Quantitive TaqMan(RT-PCR for detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J. Virol. Meth. -2001.-V. 98.-P. 63-75.

76. Ermolli M., Menne C., Pozzi G., Serra M.A., Clerici L.A. Nickel, cobalt and chromium-induced cytotoxicity and intracellular accumulation in human hacat keratinocytes// Toxicology. 2001. - V. 159. - No (1-2). - P. 23-31.

77. Ezaki В., Sivaguru M., Ezaki Y., Matsumoto H., Gardner R.C. Acquisition of aluminum tolerance in Saccharomyces cerevisiae by expression of the BCB or NtGDIl gene derived from plants// FEMS Microbiol. Lett. 1999. -V. 171.-No. 2.-P. 81-87.

78. Faaberg KS, Even C, Palmer GA, Plagemann PJW Disulfide bonds betweentwo envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus are essential for viralinfectivity// J Virol V. 1995. - V. 69. - P. 613-617.

79. Faaberg KS, Plagemann PJW ORF3 of lactate dehydrogenase-elevating virus encodes a soluble, nonstructural, highly glycosylated and antigenic protein//Virology. 1997.-V. 227. P. 245-251.

80. Fields Virology, 4th edition. Eds: D.M. Knipe, P.M.Howley. Acad.Press, 2002.

81. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O.G., Palese, P., Brownlee, G.G., and Garcia-Sastre, A. Resuce of influenza A virus from recombinant DNA// J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 9679-9682.

82. Gagnon CA, Dea S Differentiation between porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragments length polymorphism of their ORFs 6 and 7 genes// Can J Vet Res. 1998. - V. 62. - P. 110-116.

83. Gassen, U., Collins, F. M., Duprex, W. P., and Rima, В. K. Establishment of a rescue system for canine distemper virus// J.Virol. 2000. - V. 14. - P. 10737-10744.

84. Glaser AL, de Vries AAF, Dubovi EJ Comparison of equine arteritis virus isolates using neutralizing monoclonal antibodies and identification of sequence changes in Gl associated with neutralization resistance// J

85. Gen Virol. 1995. - V. 76. - P. 2 223-2 233.

86. Godeny EK, Chen L, Kumar SN, Methven SL, Koonin EV, Brinton MA Complete genomic sequence and phylogenetic analysis of the lactate-dehydrogenase-elevating virus (LDV)// Virology. 1993. -V. 194. - P. 585-596.

87. Goldberg R.L., Kaplan S.R., Fuller G.C. Effect of heavy metals on human rheumatoid synovial cell proliferation and collagen synthesis// Biochem. Pharmacol. 1983. - V. 32. - No. 18. - P. 2763-2766.

88. Goldberg, T. L., Weigel, R. M., Hahn, E. C. and Schreba, G. Association between genetic, farm characteristics and clinical disease in field outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Prev. Vet. Med.-2000.-V. 43.-P. 293-302.

89. Gonin P, Mardassi H, Gagnon CA, Massie B, Dea S A nonstructural and antigenic glycoprotein is encoded by ORF3 of the IAF-Klop strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Arch Virol. 1998. -V. 143.-P. 1927-1940.

90. Gonin P, Pirzadeh B, Gagnon CA, Dea S Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein// J Vet Diagn Invest. -1999.-V. 11.-P. 20-26.

91. Gorcyca, D., Schlesinger, K., Chladek, D., Behan, W., Poison, D., Roof, M., and Doitchenoff, D. 1995. RespPRRS: A new tool for the prevention and control of PRRS in pigs. Proc 26th Annual Meeting Am Assoc Swine Practitioners pp. 1-22.

92. Goyal SM Porcine reproductive and respiratory syndrome// J Vet Diagn Invest. 1993. - V. 5. - P. 656-664.

93. Granero S., Domingo J.L. Levels of metals in soils of Alcala de Henares, Spain: human health risks //Environ Int. 2002. - №28(3). - P.l59-164.

94. Graske A., Thuvander A., Johannisson A., Gadhasson I., Schutz A., Festin R., Wicklund G.A. Influence of aluminium on the immune system an experimental study on volunteers// Biometals. - 2000. - V. 13. - N. 2. - P. 123-133.

95. Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I.,

96. Gruca S., Wisniewski H.M. Cytochemical study on the effect of aluminum on neuronal Golgi apparatus and lysosomes// Acta Neuropathol. 1984. -V. 63.-No. 4.-P. 287-295.

97. Halbur PG, Paul PS, Janke ВН. Viral contributors to the porcine respiratory disease complex// In proceedings of the 24th Annual Meeting of the American association of Swine practitioners. 1993. - Kansas city, Missouri, USA. - P. 343-350.

98. Hart B.A., Gong Q., Eneman J.D., Durieux-Lu C.C. In vivo expression ofmetallothionein in rat alveolar macrophages and type II epithelial cells following repeated cadmium aerosol exposures// Toxicol. Appl. Pharmacol. 1995. - V. 133.-No. l.-P. 82-90.

99. Hartwig A., Beyersmann D. Comutagenicity and inhibition of DNA repair by metal ions in mammalian cells// Biol. Trace Elem. Res. 1989. - V. 21. -P. 359-365.

100. Hesse, R.A., Couture, L.P., Lau, M.L., Dimmick, S.K., and Ellsworth, S.R. Efficacy of Prime Рас PRRS in controlling PRRS reproductive disease: Homologous challenge. // Proc 27th Annual Meeting Am Assoc Swine Practitioners. 1996. - P. 103-105.

101. Hesse, R.A., Couture, L.P., Lau, M.L., Wunder, K.K., and Wasmoen, T.L. Efficacy of Prime Рас PRRS in controlling PRRS reproductive disease: Heterologous challenge. // Proc 27th Annual Meeting Am Assoc Swine Practitioners. 1996. - P. 107-110.

102. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y, Hobom, G., and Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 6108-6113.

103. Horter, D. C., Pogranichniy, R. M., Chang, C.-C., Evans, R. В., Yoon, K.-J. and Zimmerman, J. J. Characterisation of carrier state in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection// Vet. Microbiol. -2002.-V. 86.-P. 213-228.

104. Hurley L.S., Keen C.L., Baly D.L. Manganese deficiency and toxicity: effects on carbohydrate metabolism in the rat// Neurotoxicol. 1984. - V.5. -No. l.-P. 97-104.

105. Jungwirth A., Paulmichl M., Lang F. Cadmium enhances potassium conductance in cultured renal epitheloid (MDCK)cells// Kidney Int. 1990. -V. 37.-No. 6.-P. 1477-1486

106. Kalkan A, Bulut V, Avci S, Celik I, Bingol NK. Trace elements in viral hepatitis// J. Trace Elem. Med. Biol. 2002. - V. 16. - No 4. - P. 227-230.

107. Kapur V., Elman M. R., Pawlovich Т. M., Murtaugh M. P. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the Midwestern United State// J. Gen. Virol. 1996. - V. 77. - P. 1271-1276.

108. Karul A.B., Karadag F., Yensel N., Altinisik M., Altun C., Cildag O. Should chronic obstructive pulmonary disease outpatients be routinely evaluated for trace elements?// Biol. Trace Elem. Res. 2003. - V. 94. No 1. P. 41-48.

109. Keffaber KK. Reproductive failure of unknown etiology// ASSP Newsletter . 1989. - V. 1. - P. 1 -9.

110. Kim, H.S., Kwang, J., Yoon, I.J., Joo, H.S., Frey, M.L. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogenous subpopulation of MA-104 cell line// Arch. Virol. 1993. -V. 133.-P. 477-483.

111. Kim J, Choi C, Chae C. Pathogenesis of postweaning multisystemicwasting syndrome reproduced by co-infection with Korean isolates of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus// J Comp Pathol. 2003. - V. 128. -N.l.-P. 52-59.

112. Kitasato N. Comparative test for cytotoxicity of hexavalent and trivalent chromium in primary cultures of hepatocytes// Arch. Exp. Med. 1989. - V. 62.-No. 1. — P.53-57.

113. Kono, Y., Kanno, Т., Shimizu, M., Yamada, S., Ohashi, S., Nakamine, M. and Shirai, J. Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs// J. Vet. Met. Sci. 1996. -V.58.-N 10.-P. 941-946.

114. Kostitsyn Yu.A. Sources of Rare Metals in Peraluminous Granites: A Review of Geochemical and Isotopic Data //Geochemistry International (Geokhimiya). 2001. - Vol. 39, Suppl. 1 -P.43.

115. Kozlovskii A.G., Zhelifonova V.P., Vinokurova N.G., Ozerskaia S.M. Effect on microelements on biosynthes of secondary metabolites in the fungus Penicillium citrinum Thom VKM F-1079 // Mikrobiologiia. 2000. -№ 69(5). - P.642-646.

116. Kreutz LC, Mengeling WL Baculovirus expression and immunological detection of the major structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Vet Microbiol. 1997. - V. 59. - P. 1-13.

117. Kwang J, Kim HS, Joo HS Cloning, expression, and sequence analysis of the ORF4 gene of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus

118. MN-lb// J Vet Diagn Invest. 1994. - V. 6. - P. 293-296.

119. Lager, K.M., Mengeling, W.L., Brockmeier, S.L. Homologous challenge of porcine reproductive and respiratory syndrome virus immunity in pregnant swine// Vet. Microbiol. 1997. - V 58. - P.l 13-125.

120. Lager, K.M., Butler, J.E. Midgestation fetal PRRSV infection did not induce an immunotolerant state// In Proc 17th Int Pig Vet Society, Ames, Iowa, USA. 2002. - V. 1. - P. 273.

121. Lai, c. J., B. Zhao, H. Hori, and M. Bray. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus// Proc.Natl. acad. Sci USA. 1991. - V. 88. -P. 5139-5143.

122. Loemba HD, Mounir S, Mardassi H, Archambault D, Dea S Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the procine reproductive and respiratory syndrome virus// Arch Virol. 1996. - V. 141.-P. 751-761.

123. Loula, T. Mystery pig disease// Agry practice. 1991. - v. 12. - P. 23-34.

124. Le Gall, A., Legeay, O., Bourhy, H., Arnauld, C., Albina, E., Jestin, A. Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF 7) of the porcinereproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)// Virus Res.- 1998. -V. 54.-P. 9-21.

125. Li K, Chen Z, Plagemann PGW The neutralization epitope of lactate dehydrogenase-elevating virus is located on the short ectodomain of the primary envelope glycoprotein// Virology. 1998. - V. 242. - P. 239-245.

126. Liu YT, Chen Z. A retrospective lung cancer mortality study of people exposed to insoluble arsenic and radon //Lung Cancer. 1996. - №14 (Suppl 1). - P.137-148.

127. Liu J., Kershaw W.C., Klaassen C.D. The protective effect of metalllothionein on the toxicity of various metals in primary hepatocyte culture// Toxil. Appl. Pharmacol. 1991. - V. 107. - P. 27-34.

128. Loemba HD, Mounir S, Mardassi H, Archambault D, Dea S Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the procine reproductive and respiratory syndrome virus// Arch Virol. 1996. - V. 141.-P. 751-761.

129. Magar R, Larochelle R, Nelson EA, Charreyre С Differential reactivity of a monoclonal antibody to the membrane protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Can J Vet Res. 1997. - V. 61. - P. 6971.

130. Mardassi H, Mounir S, Dea S. Identification of major differences in the nucleocapsid protein genes of a Quebec strain and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J Gen Virol.1994.-V. 75.-P. 681-685.

131. Mardassi, H., Mounir, S., Dea, S. Molecular analysis of the ORFs 3 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Quebec reference strain//Arch. Virol.- 1995.-V. 140.-P. 1405-1418.

132. Mardassi H, Massie B, Dea S Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Virology. 1996. - V. 221. - P. 98-112.

133. Meng X-J, Paul PS, Halbur PG, Morozov I Sequence comparison of open reading frame 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J Gen Virol .1995.-V. 76.-P. 3181-3188.

134. Meng X-J, Paul PS, Morosov I, Halbur PG A nested set of six or seven subge-nomic mRNAs is formed in cells infected with different isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J Gen Virol. 1996. -V. 77.-P. 1265-1270.

135. Meng, X. J. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implication for current vaccine efficacy and future vaccine development// Vet. Microbiol. 2000. - 74. - P. 309-329.

136. Mengeling WL, Vorwald AC, Lager KM, Brockmeier SL Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome// J Vet Diagn Invest . -1995.-V. 7.-P. 3-16.

137. Mengeling, W.L., Vorwald, A.C., Lager, K.M., Brockmeier, S.L. Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure// Am. J. Vet. Res. 1996. -V. 57.-P. 834-839

138. Mengeling, W.L., Lager, K.M., and Vorwald, A.C. An overview on vaccination for porcine reproductive and respiratory syndrome. // Proc 23rd Allen D. Leman Swine Conf. -1996. P. 139-142.

139. Mengeling, W.L., Lager, K.M., Vorwald, A.C., Koehler, K.J. Strain specificity of the immune response of pigs following vaccination with various strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Vet.

140. Microbiol.-2003.-V. 93.-P. 13-24.

141. Meulenberg JJM, De Meijer EJ, Moormann RJM Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence// J Gen Virol.-1993.-V. 74. P. 1697-1701.

142. Meulenberg J. J. M., Petersen-den Besten, A., de Kluyver, E. P., Moormann R. J. M., and Wensvoort, G. Characterization of proteins encoded by ORF2 to 7 of Lelystad virus// Virology. 1995. - P. 206:155163.

143. Meulenberg JJM, van Nieuwstadt AP,van Essen-Zandbergen A, Langeveld JPM Post-translational processing and identification of a neutralization domain of the GP4 protein encoded by 0RF4 of Lelystad virus// J Virol. 1997. - V. 71. - P. 6061-6067.

144. Meulenberg JJM, Petersen-Den Besten A, De Kluyver E, van Nieuwstadt A, Wensvoort G, Moormann RJM Molecular characterization of Lelystad virus// Vet Microbiol.- 1997.-P. 55. P.197-202.

145. Meulenberg JJM , Bos-de-Ruijter R, van de Graaf R, Wensvoort G, Moormann RJM Infectious transcripts from cloned genomic-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J Virol. 1998. -V. 72.-P. 380-387.

146. Molitor T.W., Xiao J., and Choi C.S. 1996. PRRS virus infection of macrophages: regulation by maturation and activation state. Proc 27th Annual Meeting Am Assoc Swine Practitioners pp. 563-569.

147. Morozov I, Meng XJ, Paul PS Sequence analysis of open reading frames (ORFs) 2 to 4 of a US isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// ArchVirol. 1995.- V. 140. - V. 1313-1319.

148. Moormann R. J. M., Van Gennip H. G. P., Miedema G. K. W., Hulst M. M., Van Rijn P. A. Infection RNA transcribed from an engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus// J. Virol.- 1996. V. 70.-P. 763-770.

149. Murtaugh, M. P., Elam, M.R., Kakach, L.T., 1995. Comparizon of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus.// Arch. Virol. 1995. - V. 140.-P. 1451-1460.

150. Nelsen С J, Murtaugh MP, Faaberg К Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison; divergent evolution on two continents//J Virol. 1999. - V. 73. - P. 270-280.

151. Nelson, E.A., Christopher-Hennings, J., Drew, Т., Wensvoort, G., Collins,

152. J.E., Benfield, D.A. Differentiation of US and European Isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies// J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31. - P. 3184-3189.

153. Nelson EA, Christopher-Hennings JT, Benfield DA Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus// J Vet Diagn Invest. 1994. - V. 6. - P. 410-415.

154. Nemery B. Metal toxicity and the respiratory tract //Eur Respir J. 1990.-V. 3(2). -P.202-219.

155. Nielsen, H.S., Oleksiewicz M.B., Forsberg R., Stadejek Т., Botner A., Storgaard T. Reversion of a live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations// J. Gen. Virol. -2001.-V. 82. -P.1263-1272.

156. Paton DJ, Brown IH, Edwards S, Wensvoort G 'Blue ear' disease of pigs// Vet Rec. 1991. - V. 128. - P. 617.

157. Paton, D. J., Brown, I. H., Scott, A. C., Done, S. H. and Edwards, S. Isolation of a Lelystad virus-like agent from British pigs and scanning electronic microscopy of infected macrophages// Vet. Microbiol. 1992. -V. 33.-P. 195-201.

158. Pirzadeh B, Dea S Monoclonal antibodies to the ORF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrome virus define linear neutralizing determinants// J Gen Virol. ~ 1997. V. 78. - P. 1 867-1 873.

159. Pirzadeh B, Dea S Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus// J Gen Virol. 1998. - V. 79. - P. 989-999.

160. Pirzadeh B, Gagnon С A, Dea S Genomic and antigenic variations of porcine reproductive and respiratory syndrome virus major envelope GP5 glycoprotein// Can J Vet Res. 1998. - V. 62. - P. 170-177.

161. Plagemann PGW, Moenning V Lactate dehydrogenase elevating virus,equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus: a new group of pos.itive-stranded RNA viruses// Adv Virus Res. 1992. - V. 41. - P. 99192.

162. Plagemann PGW Lactate dehydrogenase elevating virus and related viruses// In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM (eds) Field's Virology. -1996. 3rd ed. Lippincott-Raven Philadelphia, P. 1105-1120.

163. Pleschka S, Jaskunas R, Engelhardt OG, et al. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus// J Virol 1996. - V. 70. - P. 41884192.

164. Pol JM, Wagenaar F Morphogenesis of Lelystad virus in porcine lung alveolar macrophages // A ASP Newsletter. 1992. - V. 4. P. 29.

165. Pol JMA, Wagenaar F, Reus JEG Comparative morphogenesis of three PRRS virus strains// VetMicrobiol . 1997. - V. 55. - P. 203-208.

166. Pomeranz A, Dolfin T, Korzets Z, Eliakim A, Wolach B. Increased sodium concentrations in drinking water increase blood pressure in neonates // J Hypertens. 2002.- №20(2). - P.203-207.

167. Porath J., Carrie A., Konoby V., Belfrage G. Metal chelate affinochromatography, a new approach to protein fractionation// Nature. -1975.-V. 258.-P. 598-599.

168. Raithel HJ, Schaller KH, Kraus T, Lehnert G. Biomonitoring of nickel and chromium in human pulmonary tissue //Int Arch Occup Environ Health.1993. №65(Suppl 1). - P. 197-200.

169. Rao K.S. Effects of aluminium salts on synaptosomal enzymes an in vitro kinetic study// Biochem. Int. - 1990. - V. 22. - No. 4. - P. 725-734.

170. Roberts, A, and Rose, J. K. Recovery of negative-strand RNA viruses from plasmid DNAs: A positive approach revatilizes a negative field// Virology. -1998.-V& 247.-P. 1-6.

171. Rodilla V., Miles A.N., Jenner W., Hawksworth G.M. Exposure of cultured human proximal tubular cells to cadmium, mercury, zinc, and bismuth: toxicity and metfllothionein induction// Chem. Biol. Interact. 1998. - V. 115. - P. 71-83.

172. Rossow, K.D., Collins, J.E., Goyal, S.M., Nelson, E.A., Christopher-Hennings, J. and Benfield D.A. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs// Vet. Pathol. -1995. V. 32. -N.4. - P. 361-373.

173. Roth HP. Development of alimentary zinc deficiency in growing rats is retarded at low dietary protein levels // J Nutr. 2003. -№133(7). - P.2294-2301.

174. Rottier PJM, Welling GW, Welling-Wester S, Niesters HGM, Lenstra JA,

175. Van derZeijst Predicted membrane topology of the coronavirus protein El// Proc Natl Acad Sci USA. 1986.-V. 81.-P. 1421-1425.

176. Rudolf E., Peychl J., Cervinka M. Toxic effects of chromium acetate hydroxide on cells cultivated in vitro// Altern. Lab. Anim. 2001. - V. 29. -No. 2.-P. 163-177

177. Ruggli N., Tratschin J.-D., Mittelholzer C., Hofmann M. A. Nucleotide1sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA// J. Virol. 1996. -V. 70.-P. 3478-3487.

178. Rukgauer M, Zeyfang A Chromium determinations in blood cells: clinical relevance demonstrated in patients with diabetes mellitus type 2. Biol Trace Elem Res 2002 Jun;86(3): 193-202

179. Samecka-Cymerman A., Kempers A.J. Bioindication of heavy metals with aquatic macrophytes: the case of a stream polluted with power plant sewages in Poland //J Toxicol Environ Health A. 2001. - №62(1). - P.57-67.

180. Sarnow, P. Role of 3'-ends sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro// J. Virol. 1989. - V. 63. - P. 467-470.

181. Segales, J. and Domingo, M. Porcine circovirus type 2 infection: postweaning multisystemic wasting syndrome and other condidions// Proceedings of the 17th IPVS congress, Ames, Iowa, USA. 2001. - V 1. -P. 35-42.

182. Sellner, L.N., Coelen, R.J., Mackenzie, J.S. Sensitive detection of Ross River virus a one-tube nested RT-PCR// J. Viol. Methods. 1994. - V. 49. -P. 47-58.

183. Senft V, Racek J, Motan J, Krizek M, Bejckova H, Kohout J. An evaluation of the influence of therapeutic interventions on serum trace element levels in groups of patients// J. Trace Elem. Med. Biol. 2003. - V. 17. - No 1. - P. 7-11.

184. Shenkin A. The role of minerals and trace elements in relation to long-term health and chronic disease// Nestle Nutr. Workshop Ser. Clin. Perform.

185. Programme. 2004.- V. 9. - P. 169-181.

186. Seoane A.I., Dulout F.N. Genotoxic ability of cadmium, chromium and nickel salts studied by kinetochore staining in the cytokinesis-blocked micronucleus assay// Mutat. Res. -2001. V. 490. No. 2. P. 99-106.

187. Shibata I., Urino, K., Mori M. Serological property and replication in cell cultures of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in Japan// J. Vet. Med. Sci.- 1996. V. 58. - P. 805-807.

188. Schnell, M. J., Mebatsion, Т., and Conzelmann, К. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA// EMBO J. 1994. V 13. - P. 4195-4203.

189. Schott E.J., Gardner R.C. Aluminum-sensitive mutants of Saccharomyces cerevisiaell Mol. Gen. Genet. 1997. - V. 254. - No. 1. - P. 63-72.

190. Schroder A, van Loon AA, Goovaerts D, Teifke JP, Mundt E VP5 and the N terminus of VP2 are not responsible for the different pathotype of serotype I and II infectious bursal disease virus// J Gen Virol 2001. - V. 82 (Pt 1).-P. 159-69.

191. Shopsis C. Antagonism of cadmium cytotoxicity by differentiation inducers// Cell. Biol. Toxicol. 1994. - V. 10. -No. 3. P. 191-205.

192. Shukla G.S., Chiu J, Hart B.A. Cadmium-induced elevations in the gene expression of the regulatory subunit of gamma-glutamylcysteine synthetase in rat lung and alveolar epithelial cells// Toxicology. 2000. - V. 151. - No. (1-3).-P. 45-54.

193. Smedegaard G., Madsen, E., Alexandersen, S. Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine // Vet. Rec. 1997. - Vol. 141. -P. 497-499

194. Smith A, Chaieb S, al Aql A, Alsalhi M, Nayfeh MH. Observation of assembly of fluorescent Si nanoparticles under the influence of electric current //J Nanosci Nanotechnol. 2002. - V. 2(5). - P.471-473.

195. Snijder, E. J., Wassenaar, A. L. M., Spaan, W. J. M. & Gorbalenya, A. E. The arterivirus Nsp2 protease// Journal of Biological Chemistry. 1995. -V. 270.-P. 16671-16676.

196. Snijder, E.J., Meulenberg, J.J.M. The molecular biology of arteriviruses// J. Gen. Virol. 1998. - V. 79. - P. 961-979.

197. Snijder EJ, van Tol H, Pedersen KW, Raamsman MJB, de Vries AAF Identification of a novel structural protein of arteriviruses// J Virol. -1999.-V. 73.-P. 6335-6345.

198. Snyder C.A., Valle C.D. Lymphocyte proliferation assays as potential biomarkers for toxicant exposures// J. Toxicol. Environ. Health. 1991. - V. 34.-No. l.-P. 127-139.

199. Solano, G., Segales, J., and Pijoan, C. 1995. Interaction between Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (PRRSV) and Haemophilus parasuis. Proc 2nd Int Symposium on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Copenhagen, Denmark p. 21.

200. Stadejek, Т., Stankevicius, A., Storgaard, Т., Oleksiewicz, M.B., Belak, S.,

201. Drew, T.W., Pejsak, Z. Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Eastern Europe: towards a common ancestor for European and American viruses// J. Gen. Virol. -2002. V. 83.-P. 1861-1873.

202. Stern RM. Cancer incidence among welders: possible effects of exposure to extremely low frequency electromagnetic radiation (ELF) and to welding fumes //Environ Health Perspect. 1987. - №76. - P.221-229.

203. Storgaard, Т., Oleksiewicz, M., Botner, A. Examination of the selective pressures on a live PRRS vaccine virus// Arch. Virol.- 1999. V. 144. - P. 2389-2401.

204. Suarez P, Diaz-Guerra M, Prieto C, Esteban M, Castro JM, Nieto A, Ortin J Open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis// J Virol. 1996. - V. 70. P. 2 876-2 882.

205. Suarez P, Zardoya R, Prieto C, Solana A, Tabares E, Bautista JM, Castro JM Direct detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reverse polymerase chain reaction (RT-PCR)// Arch Virol. 1994. - V. 135. P. 89-99.

206. Sur JH, Doster AR, Osario FA (1998) Apoptosis induced in vivo during acute infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Vet Pathol. 1998. - V. 35. - P. 506-514.

207. Suzuki K.T., Rui M., Ueda J., Ozawa T. Production of hydroxyl radicals by copper-containing metallothionein: roles as prooxidant// Toxicol. Appl. Pharmacol. 1996. - V. 141. - P. 231-237.

208. Swain C., Chainy G.B. In vitro stimulation of chick brain lipid peroxidation by aluminium, and effects of tiron, EDTA and some antioxidants// Indian J. Exp. Biol.-2000.-V. 38.-No. 12.-P. 1231-1235.

209. Tamai K.T., Gralla E.B., Ellerby L.M., Valentine J.S., Thiele D.J. Yeast and mammalian metallothioneins functionally substitute for yeast copper-zinc superoxide dismutase// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - V. 90. - P. 8013-8017.

210. Terpstra C, Wensvoort G, Pol JMA Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch's postulates fulfilled// Vet Q. 1991. -V. 13.-P. 131-136.

211. Troncoso J.C., Hoffman P.N., Griffin J.W., Hess-Kozlow K.M., Price D.L.

212. Aluminum intoxication: a disorder of neurofilament transport in motor neurons// Brain Res.- 1985.-V. 342.-No. l.-P. 172-175.

213. Van Alstine, W. G. Isolation of SIRS virus from nursery pigs of two herds without current reproductive failure// Proc. Annu. Meet. Livest. Confer. Inst. -1992.-V. l.-P. 253-259.

214. Van Berlo MF, Horzinek MC and Van Der Zeijst BAM Equine arteritis virus-infected cells contain six polyadenylated vims-specific RNAs// Virology. 1982. - V. 118. -P. 345-352.

215. Van der Meer, Y., van Tol, J. G., Krijnse Locker, J. and Snijder, E. J. ORFla-encoded replicase subunits are involved in the membrane association of the arterivirus replication complex// J. Virol. 1998. - V. 72. - N 8. - P. 6689-6698.

216. Van Rijn PA., Wellenberg GJ., Hakze-van der Honing R., Jacobs L., Moonen PL., Feitsma H. Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative RealTime PCR technology// J. Virol. Methods. 2004. - V. 120. -N.2.-P. 151-160.

217. Van Woensel, P., Van der Wouw, J. and Visser, N. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by polymerase chain reaction// J. Virol. Meth. 1994. - V. 47. - P. 273-278.

218. Venugopal В., Luckey T.D. Metal toxicity in mammals// N.Y.: Plenum Press. 1978.-V.2.-P. 409.

219. Versiek J, Cornelis R. Normal levels of trace elements in human blood plasma and serum //Analytica chimica acta. 1980. - N116. - P.217-254.

220. Vezina SA, LoembaH, Fournier M, Dea S, Archambault D Antibody production and blastogenic response in pigs experimentally-infected with porcine reproductive and respiratory syndrome viru// Can J Vet Res. -1995.-V. 60.-P. 94-99.

221. Venugopal В., Luckey T.D. Metal toxicity in mammals. N.Y.: Plenum Press. - 1978.-V.2.-409 p.

222. Vlasova, A., G. Risatti, T. Grebennikova, A. Zaberezhny, T. Aliper, E. Nepoklonov. Infectious Genomic Copy of the Russian Vaccine Strain oftVi

223. Classical Swine Fever (Hog Cholera) Virus// The 17 Congress of the International Pig Veterinary Society (IPVS). Ames, Iowa, USA. - 2002 7 - V. 1. - P. 324.

224. Von Heijine G. A new method for predicting signal sequence cleavage sites// Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14. - P. 4683-4690.

225. Voicu I. L, Silim A, Morin M, Elazhary MASY Interaction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with swine monocytes// Vet Rec. 1994. -V. 134. - P. 422-423.

226. Wen CG, Pang GY, Huang SQ. Significance of the serum level of Cu, Zn, Mn, Cr and Ni in acute leukemia //Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 1989. - V. 28. - N. 12. - P.734-736, 768-769.

227. Wensvoort G, Terpstra C, Pol J, White M. Blue ear disease of pigs// Vet Rec.- 1991.-V. 128.-P. 574.

228. Wensvoort G Lelystad virus and porcine epidemic abortion and respiratory syndrome. Vet Res. 1993. - V. 24:. - P. 117-124.

229. Whelan, S. P., Ball, L. A, Barr, J. N., and Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 8388-8392.

230. Williams R. An introduction to the biochemistry of zinc //C.F. Mills, (ed.). U.K. 1978. - P. 15-31.

231. Wlostowski T. Involment of metallothionein and cooper in cell proliferation//Biometals. 1993. -V. 6. - P. 71-76.

232. Wooten, S., Yoo, D., Rogan, D. Full-length sequence of a Canadian porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolate // Arch. Virol. -2000. V. 145.-P. 2297-2323.

233. Wooton, J. С and Federhen, S. Statistics of local complexity in amino acidsequences and sequence database// Computers and Chemistry. 1993. - V. 17.-P. 149-163.

234. Wootton SK, Nelson EA, YooD. Antigenic structure of the nucleocapsid proteinof porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Clin Diagn Lab Immunol. 1998. - V. 5. - P. 773-779.

235. Yamakoshi Y, Sueyoshi S, Miyata N. Biological activity of photoexcited fullerene //Mini Rev Med Chem. 1999. - №117. - P.50-60.

236. Yoo D., Welch SK., Lee C., Calvet JC. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and potential as vaccinevectors// Vet. Immunol. Immunopathol. 2004. - V. 102. - N. 3. - P. 143154.

237. Yoon, K.J., Wu, L.L., Zimmerman, J.J., Hill, H.T., and Piatt, K.B. Antibody-dependent enhancement (ADE) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in pigs.// Viral Immunol1996.-V. 9. P. 51-63.

238. Yount B, Curtis KM, Baric RS Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model// J Virol. 2000. — V.74. - N 22. - P. 10600-11.

239. Yuan, S., Mickelson D., Murtaugh M.P., Faaberg K.S. Complete genome comparison of porcine reproductive and respiratory syndrome virus parental and attenuated strains// Virus Res. 2001. - V.74. - P. 99-110.

240. Zhang Y, Sharma RD, Paul PS. Monoclonal antibodies against conformationally dependent epitopes on porcine reproductive and respiratory syndrome virus// Vet Microbiol. 1998. - V. 63. P. 125-136.

Информация о работе

Гребенникова, Татьяна Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы