Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Гаврилова, Вера Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов"

На правах рукописи

ГАВРИЛОВА Вера Львовна

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.06 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0031Т5В4 1

Владимир-2007

003175841

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Байбиков Тауфик Закарьевич

Официальные оппоненты. доктор ветеринарных наук, профессор

Русалеев Владимир Сергеевич,

ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир,

доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП»), г Щелково Московской области

Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный Центр

качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»), г Москва

Защита диссертации состоится «20» ноября 2007г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «18» октября 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник ГМ Семенова

1. Общая характеристика работы Актуальность темы Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозное заболевание, наносящее ощутимый экономический ущерб свиноводству Оно характеризуется поздними абортами, преждевременными опоросами или прохолостами у супоросных свиноматок, рождением мертвых или нежизнеспособных поросят, гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у поросят разных возрастных групп [В А Мищенко, 1995, Т 3 Байбиков,2000]

РРСС был впервые зарегистрирован в свиноводческих хозяйствах США и Канады в 1986-1987гг, а возбудитель заболевания был выделен с помощью первичной культуры альвеолярных макрофагов свиней (AMC) в 1991 году В последующее десятилетие это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством [W Т Christiansen and Н S Joo,1994, KD Rossow,1998]

Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus [S Dea et al ,2000, D Themen et al ,2000] Для вируса РРСС характерна генетическая и антигенная вариабельность [ТВ Гребенникова и др ,2004, R Forsberg et al ,2002, S Indic,2005] Ежегодно в различных странах мира выделяют новые изоляты вируса РРСС, только в Испании их насчитывают свыше 66 [S Pesch et al ,2005] На основании генетических и антигенных отличий изоляты разделяют на две генетические группы американскую и европейскую [X J Meng et al, 1995, С J Nelsen et al ,1999, S К Kleiboeker et al ,2005] По данным GenBank (банк генетических последовательностей) и литературы, в Юго-Восточной Азии, в том числе и в Китае, в последнее время циркулирует вирус РРСС американского генотипа, вызывающий болезнь свиней, сходную по течению и клиническому проявлению с классической чумой свиней (быстрое распространение, заболеваемость до 100%, смертность - 25-50%) [К Tian et al ,2007] Во многих лабораториях разработаны и совершенствуются различные серологические и молекулярно-биологические методы диагностики РРСС [В В Куриннов,1995, А В Каньшина,2004]

РРСС изучается с 1991 г во многих странах мира, а в России и других странах СНГ он известен только с 1993 г [В А Мищенко,1995, А А Коломыцев,1996] Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток [О В Суханова, 1997, Н С Дудникова и др ,2002]

Вирус РРСС очень изменчив - генетические различия между российскими изо-лятами составляют до 17% [В Г Андреев и др,1999, А В Щербаков и др ,2003] В связи с этим, выделение новых изолятов вируса РРСС, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах России, изучение и использование их для оптимизации средств диагностики и специфической профилактики являются актуальными задачами

Цель и задачи исследования Основной целью исследования являлось выделение и изучение культуральных свойств изолятов вируса РРСС и оценка возможности их использования для приготовления диагностических и вакцинных препаратов Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- выделить изоляты вируса РРСС, циркулирующие в свиноводческих хозяйствах России,

- изучить особенности репродукции вируса РРСС в различных системах культивирования с использованием референтных штаммов,

- изучить культуральные и антигенные свойства выделенных изолятов по сравнению с известными штаммами вируса РРСС,

- оптимизировать и модифицировать методы лабораторной диагностики РРСС с использованием реакции нейтрализации (РН), непрямой реакции иммунофлюорес-ценции (НРИФ), непрямой реакции гемагглютинации (РНГА) и непрямого варианта ИФА,

- оценить возможность применения оптимизированных и модифицированных серологических реакций для оценки антигенной активности вакцин,

- исследовать сыворотки крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС от экспериментально зараженных и вакцинированных против РРСС животных,

- провести серомониторинг по РРСС в России

Научная новизна исследований Новизна исследования состоит в том, что

- выделен и адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145 изолят вируса РРСС «Кемеровский-96»,

- изучены иммунобиологические свойства изолята «Кемеровский-96», который был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов (ФГУ «ВГНКИ»), используемых в ветеринарии и животноводстве, под наименованием штамм «КПР-96»-ДЕП и предложен для использования в качестве производственного,

- на основе штамма «КПР-96» созданы моно- и ассоциированная вакцины против РРСС,

- для оценки антигенной активности вакцин против РРСС рекомендованы модифицированные серологические реакции РН, НРИФ, РНГА и ИФА

Научная новизна исследования подтверждена тремя патентами Российской Федерации

- Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г ),

- Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г),

- Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г)

Практическая значимость исследований Результаты исследований вошли в нормативную документацию

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30 06 1999г (изменения внесены 01 04 2005г ),

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-004955272005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30 06 2006г

Кроме того, результаты исследований использованы при подготовке следующих методик и методических указаний, которые одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

1 «Методика постановки реакции нейтрализации для ретроспективной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» (1995г )

2 «Методические указания по выявлению и титрованию специфических антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ)» (1999г)

3 «Методические указания по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу репродукгивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г )

4 «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репро-дуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментнго анализа» (2000г)

Публикация научных исследований По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

Апробация работы Материалы диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах научных конференций «Современные аспекты ветеринарной патологии животных» (Владимир, 1998г), «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999г), «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000г), «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005г), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (Иваново, 2005г), «Проблемы инфекционной патологии свиней» (XIV Московский Международный ветеринарный конгресс, Москва, 2006г ), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 1994-2006гг

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно В выполнении отдельных этапов работы принимали участие доктор ветеринарных наук Ш К Куляшбекова (раздел 2 2 11), кандидат ветеринарных наук С А Кукушкин (разделы 2 2 1 4, 2 2 3 1), кандидат ветеринарных наук И А Тетерин (раздел 2 2 4 4), кандидат ветеринарных наук А И Егорова (раздел 2 2 5 3), кандидат ветеринарных наук И Я Курман (раздел 2 2 5 4), за что автор приносит им сердечную благодарность

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты выделения из патологических материалов вируса РРСС и его адаптации к различным культурам клеток,

- оптимизация и модификация лабораторных диагностических реакций с использованием РН, НРИФ, РИГА и ИФА для серодиагностики РРСС,

- результаты обнаружения вируса РРСС при помощи НРИФ в патологических материалах, полученных от экспериментально инфицированных или переболевших свиней,

- оценка антигенной активности вакцин против РРСС с помощью РН, НРИФ, РИГА и ИФА,

- результаты исследований на наличие антител к вирусу РРСС в сыворотках крови, полученных от свиней из хозяйств и от экспериментально зараженных животных, в РН, НРИФ, РИГА и ИФА

Структура и объем работы Диссертация изложена на 168 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения Список используемой литературы включает 256 источников, из которых 213 на иностранных языках Работа иллюстрирована 3 рисунками и 35 таблицами

Исследования по диссертационной работе являются частью комплексных тем НИР «Проведение исследований по разработке и освоению в условиях производства средств и методов борьбы с особо опасными и карантинными болезнями и инфекциями сельскохозяйственных животных» (государственный контракт №808/26) и «Совершенствование методов диагностики и профилактики инфекционных заболеваний свиней» (шифр «Ветеринарное благополучие» 3-02), которые выполнялись в 1994-2006гг в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003г -ФГУ «ВНИИЗЖ», г Владимир)

2. Собственные исследования Материалы и методы

Вирусы В работе использовали следующие штаммы вируса РРСС

- европейский прототипный штамм Lelystad (Нидерланды), полученный из Центральной ветеринарной лаборатории (Великобритания, Weybridge), с 1 по 8 пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и с 1 по 5 пассажи в AMC,

- американский штамм NVSL (США), полученный из США (National Animal Disease Center UIDA, Agricultural Research Service, Arnes, Iowa, 50010, USA), с 1 по 12 пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и с 1 по 5 пассажи в AMC,

- вакцинный штамм «БД» (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»), полученный в лаборатории болезней свиней ФГУ «ВНИИЗЖ», с 1 по 20 пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145,

- производственный штамм «KITP-96» (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»), полученный в лаборатории болезней свиней ФГУ «ВНИИЗЖ», с 1 по 70 пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145

В экспериментальной работе использовались также изоляты вируса РРСС, выделенные из патологических материалов от свиней

Культуры клеток Для культивирования вируса РРСС применяли следующие культуры клеток альвеолярные макрофаги свиней, которые отбирали от клинически здоровых поросят в возрасте 4-6 недель, перевиваемую культуру клеток почки эмбриона макаки - резус МА-104 и ее клон MARC-145, перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки Vero, полученные в 1994г из США (National Animal Disease Center XJIDA, Agricultural Research Service, Arnes, Iowa, 50010, USA), с 1 по 20 пассажи, и другие

Сыворотки и питательные среды Для культивирования перевиваемых культур клеток использовали ростовые среды на основе минимальной среды Игла (Sigma, США), питательные среды полусинтетическую (ПСП) и синтетическую (ПСС) При определении стерильности вирусного материала и полученного препарата согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические Методы биологического контроля стерильности» применяли бактериальные среды мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, среду Китга-Тароцци и агар Сабуро

Подопытные животные. В лабораторных опытах использовали свиней пород крупная белая и ландрас

- поросят-сосунов разного возраста с массой тела 1 5-8 0 кг - 23 шт ,

- подсвинков 2-4 мес возраста с массой тела 15-30 кг - 146 шт ,

- супоросных свиноматок с массой тела 100-120 кг - 2 шт

Для изучения безвредности и иммуногенной активности вакцин кроме свиней использовали лабораторных животных

- кроликов пород советская шиншилла и серебристый с массой тела 2 0-2 5кг -175 шт,

- морских свинок двухцветных с массой тела 250-300 г - 40 шт ,

- белых мышей беспородных с массой тела 18-21 г - 230 шт

Вакцины В лабораторных исследованиях по оценке антигенной активности вакцин использовали эмульсионные инактивированные вакцины на основе минераль-

ного масла фирмы «ESSO» Marcol-52 и масляного адъюванта фирмы «Seppic» Моп-tanide ISA-70 моновалентную против РРСС и ассоциированную против РРСС и пар-вовирусной инфекции свиней (ПВИС) вакцины

Серологические методы исследования Для проверки активности и специфичности сывороток крови животных, специфичности антигенов вируса РРСС применяли РН, НРИФ, РНГА и ИФА (по методикам ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных») и коммерческий набор ИФА, фирмы «IDEXX» (США)

Получение специфических сывороток крови Для получения специфических к вирусу РРСС сывороток крови животных проводили их иммунизацию препаратами, содержащими антигены вируса штаммов Lelystad, NVSL, «БД» и «КПР-96», культивируемого в первичной культуре клеток АМС или перевиваемой культуре клеток MARC-145 Активность сывороток определяли в РН, НРИФ, РНГА и ИФА

Обработка полученных результатов Для вычисления среднего арифметического и среднего квадратического значений, или стандартного отклонения, использовали компьютерные программы Microsoft Excel 2003 и Origm 0 5

2.2 Результаты собственных исследований Культивирование вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и альвеолярных макрофагах свиней

Перевиваемая культура клеток MARC-145, клон культуры клеток почки эмбриона макаки-резус - МА-104, была получена из научно-исследовательского центра здоровья животных, штат Айова (США) в 1994 году и до настоящего времени успешно поддерживается в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

После получения перевиваемой культуры клеток MARC-145 перед нами встала задача по изучению ее ростовых свойств и условий культивирования В процессе выращивания и пересева перевиваемой культуры клеток MARC-145 мы адаптировали ее к нашим условиям культивирования (питательным средам, сывороткам, глютамину, промывочным и диспергирующим растворам, подготовленной по принятой у нас технологии обработки посуде и др ) Выращивание культуры клеток MARC-145 проводили в стеклянных матрасах объемом 50 и 1500 см3 при заполнении их клеточной суспензией на 1/5 и на 1/7 от их объема, соответственно

В процессе адаптирования перевиваемой культуры клеток MARC-145 были подобраны подходящие для ее культивирования питательные среды, количество глкуга-мина и сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки), посевная концентрация клеток и установлен оптимальный уровень pH (7 2-7 4) питательной среды Суспензию клеток MARC-145 с различной концентрацией вносили по 200 см3 в четыре клинских матраса, затем через 10 часов - еще в четыре клинских матраса (чтобы можно было наблюдать за формированием монослоя через 2, 14, 16, 18, 20 и 22 часа после посева) Наблюдение за культурой клеток проводили каждые 2 часа в течение дня Результаты исследований по выявлению оптимальной посевной концентрации клеток MARC-145 представлены в таблице 1

Таблица 1

Результаты изучения влияния посевной концентрации клеток MARC-145 на

скорость формирования и качество монослоя

п=6

Концентрация клеток, тыс кл/см3 Время формирования монослоя клеток, часы Оценка монослоя клеток

75+5 108±6 неудовлетворительный

95±5 84±6 удовлетворительный

130±20 60+5 хороший

225+25 36±5 удовлетворительный

350±50 24±2 неудовлетворительный

Данные таблицы 1 показывают, что качественный монослой культуры клеток MARC-145 получали через 60+5 часов при посевной концентрации 130+20 тыс кл/см3 При использовании более низкой посевной концентрации клеток монослой формировался позднее и не был сплошным Применение высокой посевной концентрации приводило к формированию плотного монослоя через сутки после посева и вытеснению клеток на поверхность монослоя

При испытании влияния ростовых питательных сред (RS-3M, Игла, 199, ПСП и смеси питательных сред в равных пропорциях ПСП+ПСС) на скорость и качество формирования монослоя клеток MARC-145 в данные среды добавляли 10% сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки), 0 3-1 0 мг/см3 глютамина и вносили суспензию клеток MARC-145

При использовании питательной среды 199 монослой был плотный и ровный (через 2 дня после посева) Питательные среды RS-3M и Игла также обеспечивали формирование хорошего сплошного монослоя, но на 1-2 суток позже, чем при ис-

пользовании питательной среды 199 Применение питательных сред ПСП и ПСП+ПСС приводило к образованию изолированных зон роста клеток, которые не всегда смыкались в сплошной монослой через 4 дня после посева клеток

Особенности репродукции вируса РРСС в альвеолярных макрофагах свиней и в перевиваемой культуре клеток MARC-145 Известно, что вирус РРСС подразделяется на две геногруппы европейскую и американскую, между которыми имеется определенная генетическая и антигенная связь и существенные отличия Прототипным представителем европейского генотипа вируса РРСС является штамм Lelystad, одним из типичных американских штаммов -NVSL [А В Щербаков, 2003, X J Meng et al, 1995, С J Nelsen et al ,1999]

На первом этапе исследования изучали особенности репродукции данных штаммов в первичной культуре AMC и перевиваемой культуре клеток MARC-145

В перевиваемой культуре клеток MARC-145 первые признаки ЦПД вируса штамма Lelystad в виде сферических образований клеток (конгломератов), приподнимающихся над поверхностью монослоя, отмечали через 1-2 дня после инокуляции вируса Уплотнение оболочек клеток, образование цитоплазматических выростов на поверхности клеток, потерю клетками части цитоплазматического вещества, и, вследствие этого, их сморщивание (пикноз клеток), слияние от двух до пяти клеток (образование симпластов) наблюдали спустя 2-3 дня Разрушение межклеточных связей и дезагрегацию клеток отмечали через 3-4 дня после инфицирования Отслоение клеток от субстрата регистрировали через 4-5 дней и объединение симпластов в сетчатую структуру (псевдосинцитий) - через 4-7 дней после внесения вируса Титры вируса от второго к восьмому серийному последовательному пассажу возрастали от 2 75±0 25 до 5 28±0 32 lg ТЦД50/см3

Максимальное накопление вируса на уровне 4 88±0 12 - 5 25+0 25 lg ТЦД50/см3 отмечали через 48-72 часа после инокуляции, когда появлялись в клеточном монослое пикнотические клетки с цитоплазматическими выростами и формировались симпла-сты из слившихся 2-5 клеток Через 24 часа, как и после 96 часов, титры вируса были низкими - в пределах от 1 87+0 13 до 2 75±0 25 lg ТЦД5о/см3

При проведении культивирования вируса РРСС, штамма Lelystad, в монослое культуры клеток MARC-145, выращенном в роллерах, титры вируса составляли

5 78+0 22 ТЦД50/см3, что превышало накопление вируса РРСС по сравнению с мо-нослойным стационарным методом культивирования на 0 5-1 0 ^ ТЦД5о/см3

Перевиваемую культуру клеток МАКС-145 инфицировали вирусом РРСС, штамма ЫУЭЬ, также, как и вирусом штамма Ьс1уз1ас1 при получении первого пассажа на выращенный монослой клеток наносили 1 см3 вируссодержащей суспензии, при проведении следующих серийных последовательных пассажей в клинские матрасы с клеточным монослоем вносили по 10 см3 культурального вируса РРСС ЦПД вируса РРСС, штамма ЫУЭЬ, в культуре клеток МАЯС-145 отличалось от ЦПД вируса штамма Ье1уз1аё В данном случае не наблюдали образования симпластов и их объединения в псевдосинцитий, а отмечали только формирование сферических скоплений клеток, приподнимающихся над монослоем, затем округление, пикноз клеток и отслоение их от поверхности матраса Наибольшее накопление (5 25±0 25 ^ ТЦД50/см3) вируса РРСС, штамма ИУБЬ, было установлено через 120 часов после инокуляции, когда ЦПД вируса проявлялось примерно на половине поверхности монослоя

На следующем этапе изучали особенности репродукции вируса РРСС, штаммов Ье1уз1аё и ИУБЬ, в культуре АМС

АМС получали от клинически здоровых поросят-отьемышей в возрасте от 6 до 8 недель вымыванием их из отпрепарированных легких раствором ФБР (рН 7 2) с добавлением рабочей концентрации антибиотиков (гентамицина в дозе 0 8 мг/см3)

Цитопатическое действие вируса РРСС, штамма Ье1уз1ас1, в культуре АМС проявлялось в виде уплотнения макрофагов, склеивания их между собой в конгломераты, образования симпластов из слившихся 2-3 клеток, отсоединения макрофагов от субстрата и их лизиса в течение 1-4 дней (количество клеток в поле зрения ежедневно резко сокращалось) Титры вируса РРСС, штамма Ье1уз1ас1, на протяжении пяти пассажей существенно не менялись и составляли 5 5-6 5 ТЦД50/СМ3

Первые признаки ЦПД вируса РРСС, штамма >4У8Ь, наблюдали в АМС в виде формирования конгломератов из клеток в течение от 32+4 до 56+6 часов после инокуляции Затем отмечали слияние 2-3 клеток в симпласты - от 40±4 до 70±5 часов, отслоение клеток от субстрата - от 72+5 до 96+4 часов после инокуляции Лизис клеток происходил через 92±4-120±6 часов после инокуляции вируса Титры вируса РРСС, штамма МУЭЬ, на протяжении 5 пассажей также изменялись незначительно и были в пределах от 5 75±0 25 до 6 50±0 50 1% ТЦД50/см3

Таким образом, вирус РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, хорошо репродуцировался в культуре клеток AMC Пассажирование вируса этих штаммов в культуре AMC на протяжении 5 пассажей не приводило к существенному повышению титра и сокращению сроков проявления ЦПД вируса

Оптимизация непрямой реакции иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса РРСС

Непрямую реакцию иммунофлюоресценции (НРИФ) оптимизировали с использованием вируса РРСС, штамма Lelystad, и перевиваемой культуры клеток MARC-145 Серопозитивные к вирусу РРСС сыворотки крови отбирали от подсвинков, зараженных вирусом штамма Lelystad интратрахеально

В результате исследования при помощи НРИФ перевиваемых культур клеток МА-104, MARC-145 и Vero, инфицированных вирусом РРСС различных штаммов, не выявили существенных отличий в интенсивности свечения инфицированных клеток Различия между штаммами Lelystad (европейского генотипа) и NVSL (американского генотипа) обнаружили только в проявлении ЦПД вируса РРСС в данных перевиваемых культурах клеток ЦПД вируса РРСС в перевиваемых культурах клеток обоих штаммов на первой стадии развития было сходным формирование сферических скоплений инфицированных вирусом РРСС клеток (конгломератов), приподнимающихся над поверхностью монослоя (рис 1) Вторая стадия развития ЦПД вируса в культурах клеток была характерна только для вируса РРСС, штамма Lelystad клетки, инфицированные вирусом, сливались в симпласты, которые затем объединялись в псевдосинцитий Третья стадия развития ЦПД вируса в данных культурах клеток была общей для обоих штаммов монослой клеток разрушался, клетки округлялись, становились пикнотичными и отслаивались от поверхностей культуральных сосудов (рис 2) В ходе оптимизации НРИФ [Т Н Weiler and А Н Coons, 1954] были подобраны режимы и условия постановки реакции применительно к нашим задачам В результате была оптимизирована НРИФ, позволяющая выявлять антиген вируса РРСС в пробах, приготовленных из различных органов и тканей инфицированных животных с использованием перевиваемой культуры клеток MARC-145 или AMC На первых этапах оптимизации данной реакции использовали в качестве испытуемого материала пробы органов и тканей, полученные от инфицированных вирусом штамма Lelystad и неза-

раженных подсвинков. Параллельно реакцию ставили с использованием культураль-ного вируса штамма Lelystad. Положительный результат (цитоплазматическое свечение) получали только в препаратах, приготовленных из инфицированных вирусом штамма Lelystad клеток или клеток, в которые вносили вируссодержащую органную суспензию. Максимальное количество клеток с цитоплазматическим флюоресцирующим свечением получали при культивировании вируса в клетках MARC-145 или AMC в течение 18-22 часов. В неинфицированных (нормальных) клетках флюоресцирующего цитоплазматического свечения не наблюдали, что являлось отрицательным результатом. Не было свечения при окрашивании инфицированных вирусом РРСС клеток одним только конъюгатом (кроличьей антисвиной флюоресцирующей сывороткой), или только одной серопозитивной сывороткой крови. Не наблюдали свечения как инфицированных вирусом РРСС, так и неинфицированных клеток без нанесения на них стандартных сывороток крови и конъюгата. Для контрастирования препаратов использовали водный раствор Эванса голубой в разведении 1:10б.

Специфическое свечение комплекса антиген+антитело+антиантитело, меченное ФИТЦ, в цитоплазме клеток, инфицированных вирусом РРСС, выявленное при помощи НРИФ (окуляр х10; объектив х40)

Рис. 1. Сферические скопления клеток MARC-145, инфицированных вирусом РРСС, штамма Lelystad

Рис. 2. Одиночные клетки MARC-145, инфицированные вирусом РРСС, штамма NVSL

Таким образом, оптимизация НРИФ заключалась в подборе оптимальных сроков культивирования вируса РРСС в AMC и перевиваемой культуре клеток MARC-145, в проведении различных этапов реакции при комнатной температуре, установлении оптимальных сроков инкубирования на препаратах сывороток крови, конъюга-та и контрастирующего раствора

Затем определяли уровень накопления вируса РРСС в различных органах подсвинка, экспериментально инфицированного вирусом штамма Lelystad Вирус был адаптирован к культуре клеток MARC-145 Для этих целей серонегативного поросенка интратрахеально заражали вирусом в объеме 5 см3 с титром 4 75 lg ТЦД5о/см3 Через 72-96 часов после заражения у него отмечали повышение температуры тела до 40 9°С На четвертые сутки животное убили и от него отобрали пробы различных органов и тканей для вирусовыделения в культуре клеток MARC-145 и исследования на наличие вируса в непрямой реакции иммунофлюоресценции Результаты этих исследований представлены в таблице 2

Таблица 2

Результаты обнаружения вируса в органах подсвинка, экспериментально

инфицированного культуральным вирусом РРСС, штамма Lelystad

Исследуемый материал Титр вируса (lg ТЦД 50/см 3) Результаты исследований в НРИФ

Сгусток крови, сыворотка крови, макрофаги, легкие, миндалины и щитовидная железа 3 00+0 25 -3 75±0 25 +

Тестикулы, заглоточные и подчелюстные л/у, головной мозг и продолговатый мозг, печень, сердце и селезенка 2 00±0 25 -2 75+0 25 +

Слизистые оболочки носа, глотки и языка, почки, слюнные и поджелудочная железы 1 25±0 25 -1 50±0 25 +

Скелетные мышцы вирус не выделен вирус не обнаружен

Примечание, л/у - лимфоузлы, «+» наличие признака

Из результатов, приведенных в таблице 2, видно, что вирус РРСС удалось обнаружить во всех исследованных органах и тканях, за исключением скелетной мускулатуры Вирус в наиболее высоких титрах (от 3 0 до 3 75 ^ ТЦД 5о/см3) накапливался в крови, макрофагах, легких, миндалинах и щитовидной железе В низких титрах вирус был обнаружен в слизистых оболочках носа, глотки и языка, почках, слюнных и поджелудочной железах, в которых его титр не превышал 15^ ТЦД50/см3 Кроме то-

го, наличие вируса РРСС в данных органах и тканях подтвердили и с помощью НРИФ

Выделение и изучение иммунобиологических свойств полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих среди свинопоголовья на территории России

С использованием альвеолярных макрофагов свиней исследовали 8 проб пат-материала, полученного из различных регионов страны, и 2 пробы из Белоруссии Было проведено 13 пассажей вируса, затем образцы каждого пассажа исследовали в НРИФ и ПЦР С использованием этого метода было выделено пять полевых изолятов вируса РРСС в культуре AMC «Кемеровский-96», «Пермский-99», «БР-01», «БР-03» и «Ботово-02» Следует отметить, что выделение вируса РРСС наиболее успешно было при использовании системы биопроба - AMC донора - культура AMC

Затем проводили выделение и адаптацию вируса РРСС к перевиваемой культуре клеток MARC-145 С этой целью исследовали 85 проб патологического материала, поступивших из 63 хозяйств 31 региона России, и 4 пробы из Белоруссии, а также пробы от поросят, экспериментально зараженных некоторыми изолятами вируса РРСС, и изоляты, выделенные в AMC Для вирусологического исследования отбирали от инфицированных поросят AMC, кровь, легкие, лимфоузлы, миндалины, слюнные железы, селезенку, почки, печень, сердце и головной мозг

Все пробы культивировали в культуре клеток MARC-145 до 25 пассажа Полученные пробы идентифицировали на наличие вируса РРСС в НРИФ с использованием референтных серопозитивных к вирусу штамма Lelystad сывороток крови свиней, а также в ПЦР Результаты выделения некоторых изолятов вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145 представлены в таблице 3

Из результатов, приведенных в таблице 3, видно, что с 1 по 11 пассажи наблюдали проявление ЦПД вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145, инфицированной 3 изолятами («Белгородский-96», «Смоленский-96» и «Воронежский-96») Цитопатические изменения в культуре клеток MARC-145, инфицированной изолятами «Нижегородский-95» и «Нижегородский-96», отмечали с 1 по 12-13 пассажи На протяжении 20-25 пассажей наблюдали ЦПД вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145, инфицированной изолятами «Новосибирский-96» и «Кеме-ровский-96» После проведения ряда пассажей изолятов вируса РРСС в культуре кле-

ток MARC-145 наличие вируса РРСС было подтверждено в НРИФ и при помощи ПЦР в пробах, полученных из шести областей России Белгородской, Кемеровской, Нижегородской, Новосибирской, Смоленской и Воронежской Шесть изолятов («Бел-городский-96», «Воронежский-96», «Нижегородский-95», «Нижегородский-96», «Но-восибирский-96» и «Смоленский-96») 1-10 пассажей и один изолят («Кемеровский-96») 25 пассажа были выявлены в НРИФ и ПЦР

Таблица 3

Результаты адаптации некоторых изолятов вируса РРСС _к перевиваемой культуре клеток MARC-145_

Название изолята № пассажа Проявление ЦПД Результаты

в культуре клеток исследования в

НРИФ ПЦР

«Белгородский-96» 1 +++ + +

4 +++ + +

11 ++ + -

«Кемеровский-96» 5 +++ + +

25 ++++ + +

«Нижегородский-95» 3 +++ + +

12 ++ + -

«Нижегородский-96» 2 +++ + +

13 ++ + -

«Новосибирский-96» 10 +++ + +

20 ++ + -

«СмоленскиЙ-96» 2 +++ + +

11 ++ + -

«Воронежский-96» 2 +++ + +

4 +++ + +

11 ++ + -

Примечание степень поражения монослоя клеток MARC-145 вирусом РРСС «+»- 10%, «++»- 25%, «+++»- 40%, «++++»- 55%, «+» положительный результат, «-» отрицательный результат, ПЦР ставили совместно с к б н В Г Андреевым

В результате проведения 25 пассажей только изолят «Кемеровский-96» вируса РРСС был адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145 Результаты исследования свидетельствуют, что к перевиваемой культуре клеток MARC-145 в течение длительного культивирования можно адаптировать лишь единичные отечественные изоляты вируса РРСС

В результате проведенных исследований было изучено влияние различных условий и способов культивирования вируса изолята «Кемеровский-96» на его накопление в перевиваемой культуре клеток MARC-145 (табл 4)

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что максимальные титры вируса РРСС (5 28+0 22 lg ТЦД so/см3) регистрировали при заражении трехсуточного клеточного монослоя MARC-145 и культивировании вируса в течение 96 часов после инокуляции

Вирус изолята «Кемеровский-96» имел высокие титры в перевиваемой культуре клеток MARC-145 в 25 пассаже - 5 63±0 13 lg ТЦД5о/см3, поэтому его подвергли дальнейшему изучению В результате проведенного исследования при помощи метода ПЦР-секвенирования установили, что вирус изолята «Кемеровский-96» относится к европейской генетической группе Отсутствие контаминации вируса изолята «Кемеровский-96» другими вирусами, микоплазмами, грибами и бактериями было подтверждено при помощи электронной микроскопии (доктором биологических наук А П Пономаревым) и в ПЦР (кандидатом биологических наук А В Щербаковым)

Таблица 4

Результаты накопление вируса РРСС в зависимости от возраста монослоя клеток MARC-145 и срока культивирования вируса

п=4

Штамм вируса РРСС Возраст монослоя клеток, сутки Титр вируса РРСС (^ ТЦД 5о/см*) в различные сроки после инокуляции (часы)

36 48 72 96

«Кемеровский-96» 3 2 77±0 23 3 63±0 37 511±0 14 5 28+0 22

4 1 83±0 17 3 37±0 13 4 56±0 24 416±0 34

5 1 25+0 25 2 67±0 33 3 21±0 29 3 37±0 13

При использовании роллерного способа культивирования вируса изолята «Кемеровский-96» в перевиваемой культуре клеток MARC-145 титры вируса были на уровне 6 29±0 21 lg ТЦД 50/см3

Изучение иммунобиологических свойств вируса РРСС, изолята «Кемеровский-96», на подсвинках показало, что он является слабовирулентным для подсвинков, так как у животных наблюдали лишь незначительное повышение температуры тела (до 40 7°С) на 2-4 сутки после инфицирования Других каких-либо клинических признаков у экспериментальных поросят не отмечали

Проведенные исследования показали, что вирус изолята «Кемеровский-96» может быть использован для изготовления вакцинных препаратов, так как он хорошо репродуцируется в клетках MARC-145, является слабовирулентным, свободным от

контаминации возбудителями других инфекций и обладает более высокой антигенной активностью по сравнению с вирусом РРСС других штаммов

Результатами всестороннего изучения вируса изолята «Кемеровский-96» явились составление на него соответствующего паспорта, присвоение ему статуса штамма и названия «КПР-96» (Кемерово-Победа-РРСС), депонирование в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ», внесение изменений в действующую нормативную документацию, позволяющих использовать вирус штамма «КПР-96» для производства инактивированных вакцин против РРСС

Оптимизация и модификация методов оценки антигенной активности вакцин против РРСС

Для ретроспективной диагностики РРСС нами были оптимизированы и модифицированы реакция нейтрализации (РН), непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) и непрямой вариант иммуно-ферментного анализа (ИФА) При постановке данных реакций мы оптимизировали температурный режим и сроки инкубирования компонентов системы антиген-антитело Модификация касалась использования в этих реакциях вместо вируса референтного штамма Lelystad оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»

Реакцию нейтрализации, на первых этапах исследования, ставили с использованием вируса РРСС референтного штамма Lelystad, генетически и антигенно сходного с вирусом штамма «КПР-96» За основу брали известную модификацию этой реакции, когда используют постоянную дозу сыворотки при различных разведениях вируса [Р Н Лукина, 1965, Р В Эпштейн-Литвак и др ,1995]

Для постановки реакции использовали перевиваемую культуру клеток MARC-145 и вирус штамма Lelystad, адаптированный к этой культуре клеток, с инфекционным титром не ниже 4 5+0 5 lg ТЦД50/см3 Для каждой испытуемой сыворотки вычисляли индекс нейтрализации (ИН), который определяли по разности логарифмических показателей титра вируса в присутствии нормальной и испытуемой сывороток Индекс нейтрализации до 1 0 логарифма считали отрицательным, от 1 1 до 1 6 - сомнительным, 1 7 и выше - положительным

В пробах сывороток крови, полученных от подсвинков через 14 дней после иммунизации, антител к вирусу РРСС не выявили (индекс нейтрализации < 1 0 lg) К 36

дню после иммунизации уровень антител повысился и индекс вируснейтрализующих антител в сыворотках крови подсвинков был в пределах от 2 38+0 12 до 3 17±0 33 lg, а в сыворотках крови иммунизированных кроликов — на уровне 2 36±0 14-2 50±0 50 lg Затем испытывали методику постановки реакции нейтрализации (РН) с постоянной дозой вируса (100-360 доз) Реакцию нейтрализации ставили классическим способом [РН Лукина, 1965,1J Yoon,1994] Испытуемые сыворотки разводили от 1 2 до 1 1024 и в каждую разведенную пробу добавляли в равном объеме 100-360 доз вируса и помещали на 1 час в термостат при 37°С

В сыворотках крови животных, полученных до иммунизации и через 14 дней после прививки, антитела к вирусу РРСС не были выявлены (<2 0 log2) В пробах, полученных от животных через 36 дней после иммунизации и более, титры антител колебались в пределах от 3 22+0 28 до 5 28+0 17 log2 у поросят и от 3 25+0 25 до 3 75±0 17 log2 у кроликов

Таким образом, проведенные исследования показали возможность выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов с использованием реакции нейтрализации, и в дальнейшем она была модифицирована и применена для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС

Непрямую реакцию иммунофлюоресценции [ТН Weiler and А Н Coons, 1954] ставили на перевиваемой культуре клеток MARC-145, которую инфицировали в начале работы вирусом штаммов Lelystad и NVSL, а затем оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»

Наличие изумрудного или салатово-зеленого вирусспецифического цитоплаз-матического флюоресцирующего свечения инфицированных вирусом РРСС клеток MARC-145 в разведениях сывороток крови 1 80 и выше принимали за положительный результат, при условии отсутствия свечения в препаратах с нормальной (незара-женной) культурой клеток

В сыворотках крови животных, отобранных до иммунизации, антитела к вирусу РРСС не были выявлены (<1 80) Через 21 день после прививки в пробах сывороток крови, полученных от подсвинков, выявляли антитела на уровне от 1 133+27 до 1 267+53, а от кроликов - от 1 80 до 1 107+53 Через 30 дней уровень антител в сыворотках крови подсвинков определяли в пределах от 1 427±107 до 1 533±107, в сыворотках крови кроликов - в пределах от 1 267±53 до 1 427±107

Затем оптимизированную и модифицированную НРИФ использовали для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС

При постановке реакции непрямой гемагглютинации [А Т Кравченко и М И Соколов, 1945, Р В Эпштейн-Литвак и др ,1995] в качестве эритроцитарного антигена использовали формалинизированные и танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные инактивированным вирусом РРСС Для данных целей сначала использовали вирус РРСС, штаммов 1х1уз1ас1 и МУБЬ, а затем оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»

Сыворотки крови считали серопозитивными к вирусу РРСС, если наблюдали агглютинацию эритроцитов в разведении сывороток крови 1 80 и выше, сомнительными - в разведении 1 40, серонегативными - в разведении 1 20

В сыворотках крови животных, отобранных до иммунизации, антитела к вирусу РРСС не были выявлены (<1 40) В пробах сывороток крови, полученных через 21 день после иммунизации от подсвинков, выявляли антитела к вирусу РРСС в пределах значений от 1 267+53 до 1 427±107, от кроликов - на уровне 1 107±53-1 133+27 Через 30 дней после иммунизации уровень антител в сыворотках крови подсвинков определяли в пределах значений от 1 533±107 до >1 640, а в сыворотках крови кроликов - на уровне 1 427±107 После этого РИГА была использована для ретроспективной диагностики РРСС

Непрямой метод иммуноферментного анализа [Н Рпете1,1980] оптимизировали и модифицировали для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС

Учет реакции проводили визуально, оценивая интенсивность окрашивания содержимого лунок микропланшета, или спектрофотометрически при длине волны 492 нм Титром сыворотки крови считали ее максимальное разведение, величина оптической плотности которого двукратно превосходила оптическую плотность в лунках с серонегативной к вирусу РРСС (отрицательный контроль) сывороткой крови Серопозитивными к вирусу РРСС считали сыворотки крови с титром 1 100 и выше

В сыворотках крови животных, полученных до заражения (иммунизации) и через 14 дней после иммунизации, антитела к вирусу РРСС не выявляли (<1 50) В пробах сывороток крови, полученных через 21 день после иммунизации подсвинков и далее, антитела к вирусу РРСС выявляли в сыворотках крови в пределах от 1 100 и до

1 1600 Обработка результатов, полученных при исследовании сывороток крови свиней, показала, что относительные чувствительность и специфичность разработанного метода к базовой реакции ИФА (сыворотки параллельно проверяли в коммерческом наборе ИФА фирмы «ГОЕХХ») составляли 95 1% и 95 6%, соответственно

В дальнейшем непрямой вариант ИФА был использован для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС

Оптимизированные и модифицированные тест-системы были использованы для контроля антигенной активности вакцин против РРСС (табл 5)

Таблица 5

Оценка антигенной активности вакцин против РРСС производства ФГУ «ВНИИЗЖ» с использованием различных серологических реакций

Реакция Исследовано вакцин, количество серий Вид животных Уровень антител в сыворотках крови животных

до вакцинации через 28-36 суток после иммунизации нормы ТУ

РН 5 кролики <2 0 1о£2 3 27-3 75 ^2 >3 01о§2

подсвинки <2 0 1с^2 3 22-4 75

РН (ИН) 5 кролики <1718 2 36-2 50 % >2 01ё

подсвинки <171§ 2 38-3 17 ^

НРИФ 26 кролики <1 80 1 267-1 420 >1 160

подсвинки <1 80 1 427-1 533

РИГА 46 кролики <1 20 1 320-1 427 >1 160

подсвинки <1 20 1 533-1 640

ИФА 6 подсвинки <1 50 1 200-1 800 >1 100

Примечание ИН - индекс нейтрализации

Как видно из таблицы 5, с использованием оптимизированных тест-систем было проконтролировано свыше 80 серий вакцин на серонегативных подсвинках и кроликах Исследование в разработанных реакциях сывороток крови кроликов и подсвинков, иммунизированных серийными вакцинами производства ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), выявило, что все они обладали достаточной антигенной активностью Уровень антител в сыворотках крови животных, отобранных через 28-36 суток после иммунизации, превышал нормы ТУ на вакцины

Разработанные серологические реакции применяли не только для оценки антигенной активности вакцин, но и для проведения серомониторинга РРСС в свиноводческих хозяйствах России (табл 6)

В период с 1994 по 2003 годы на наличие антител к вирусу РРСС при помощи серологичесих реакций РН, НРИФ, РНГА и ИФА было исследовано 22254 проб сывороток крови свиней, полученных из 127 неблагополучных по РРСС свиноводческих хозяйств, расположенных на территории 35 регионов России В результате проведенного исследования серопозитивными к вирусу РРСС были признаны 11411 проб сывороток крови свиней, что составляло 51 3% от общего количества проб и свидетельствовало о широком распространении РРСС

Таблица 6

Результаты исследования на РРСС в различных реакциях поступивших

из хозяйств сывороток крови свиней

Реакция Годы Исследовано

регионов хозяйств сывороток крови

всего проб из них положительных

кол-во %

РН 1994-1996 2-16 2-41 2288 618 27 0

НРИФ 1995-1999 15-31 30-99 9382 4156 44 3

РНГА 1998-2003 26-35 51 - 127 10035 6529 64 8

ИФА 2003 7 11 549 108 19 7

Всего 1994-2003 2-35 2-127 22254 11411 513

3. ВЫВОДЫ

1 Установлено, что оптимальным условием культивирования альвеолярных макрофагов свиней и перевиваемой культуры клеток MARC-145, необходимых для репродукции вируса РРСС, является использование питательных сред Игла, 199 или RS-ЗМ, содержащих 9-10% сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки) и 0 3-1 0 мг/см3 глютамина

2 Показано, что максимальное накопление вируса РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, в титрах 5 25-6 5 lg ТЦД50/см3 происходило в альвеолярных макрофагах свиней и монослойной культуре клеток MARC-145 после инкубирования в течение 36-72 часов при +37°С При использовании роллерного метода культивирования в культуре клеток MARC-145 титры вируса были выше на 0 5-1 0 lg ТЦД50/СМ3 по сравнению с монослойным стационарным методом культивирования

3 При вирусологических и иммунофлюоресцентных исследованиях на 4 сутки после инфицирования культуральным вирусом РРСС, штамма Lelystad, у поросят обнаружено наличие вируса в различных органах и тканях, за исключением мышечной

ткани Наибольшее накопление вируса отмечено в легких, лимфатических узлах, миндалинах, в крови и щитовидной железе

4 Изучены иммунобиологические свойства ряда изолятов вируса РРСС, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах России Изолят «Кемеровский-96» был адаптирован к культуре клеток MARC-145, он вызывал четко выраженное ЦПД и накапливался в титрах 5 25-5 5 lg ТЦД50/см3

5 Установлено, что выделенный изолят «Кемеровский-96» вируса РРСС относится к европейскому генотипу вируса РРСС, является специфичным, слабовирулентным и обладает более высокой антигенной активностью по сравнению с другими изученными штаммами вируса РРСС После изучения и паспортизации под наименованием «штамм «КПР-96»-ДЕП» он был депонирован в качестве производственного для изготовления иммунобиологических препаратов

6 Штамм «КПР-96»-ДЕП используется в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» для изготовления эмульсионных инактивированных вакцин против РРСС и широко применяется для диагностических целей

7 Установлено, что через 28-36 суток после однократной иммунизации в сыворотках крови подсвинков были выявлены антитела к вирусу РРСС на уровне 1 4271 533 в НРИФ, 1 533-1 640 в РИГА, 1 200-1 800 в ИФА и 1 10-1 28 в РН, что свидетельствует о достаточно высокой антигенной активности разработанных вакцин

8 С использованием референтных штаммов Lelystad и NVSL оптимизированы, а затем на основе отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»-ДЕП вируса РРСС модифицированы серологические реакции РН, НРИФ, РНГА и ИФА, которые используются для оценки антигенной активности вакцин и в серомониторинге РРСС Из 22254 исследованных полевых проб сывороток крови свиней серопозитивными к вирусу РРСС были признаны 11411 (513%), что указывает на широкое распространение РРСС в свиноводческих хозяйствах России

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты экспериментальной работы вошли в 4 методические рекомендации, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 2 НД (СТО), утвержденные МСХ РФ, и в 3 полученные патента на изобретения

3 «Методические указания по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г)

4 «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммунофер-ментнго анализа» (2000г)

5 Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30 06 1999г (изменения внесены 01 04 2005г)

6 Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-004955272005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30 06 2006г

7 Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивиро-ванная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г)

8 Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г )

9 Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г )

5. Список опубликованных работ по материалам диссертации

1 Особенности репродукции вируса РРСС в культуре клеток «MARC-145» / А А Гусев, Т 3 Байбиков, Ш К Куляшбекова, JIГ Жучкова, В JI. Гаврилова, С Г

Алехина // Вирусные болезни с -х жив-х Тез докл Всерос науч -практ конф -Владимир, 1995 -С 95

2 Экспериментальное заражение свиней вирусом РРСС ! Т 3 Байбиков, А А Гусев, Л Г Жучкова, H П Квашнин, A M Рахманов, В Л. Гаврилова, Е К Долгано-ва // Вирусные болезни с -х жив-х Тез докл Всерос науч -практ конф -Владимир, 1995 -С 185

3 Выявление антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в сыворотках крови в реакции нейтрализации / В.Л. Гаврилова, Т 3 Байбиков, А А Гусев, H С Дудникова // Пробл инфекц патологии жив-х Тез докл конф, посвящен 100-летию открытия вируса ящура-Владимир, 1997-С 116-117

4. Гаврилова, В Л. Выделение вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней из патологических материалов экспериментально инфицированных подсвинков / В.Л. Гаврилова, Т 3 Байбиков, H С Дудникова // Пробл инфекц патологии жив-х Тез докл конф, посвящен 100-летию открытия вируса ящура -Владимир, 1997 -С 116

5 Изучение респираторно-репродуктивного синдрома у экспериментально инфицированных подсвинков / Т 3 Байбиков, С А Дудников, H С Дудникова, Е К Долганова, В Л. Гаврилова // Пробл инфекц патологии жив-х Тез докл конф , посвящен 100-летию открытия вируса ящура -Владимир, 1997 -С 105-106

6 Особенности накопления вируса РРСС на культуре альвеолярных макрофагов / H С Дудникова, Т 3 Байбиков, В Л. Гаврилова, С А Дудников // Пробл инфекц патологии жив-х Тез докл конф, посвящен 100-летию открытия вируса ящура-Владимир, 1997 -С 112-113

7. Гаврилова В Л., Иммунофлюоресцентная диагностика репродуктивно - респираторного синдрома свиней / В Л. Гаврилова // Акт пробл с -х биотехнол Матер конф - пгт Гвардейский, 1998 - С 116

8 Изучение чувствительности первичных, перевиваемых культур клеток и куриных эмбрионов к вирусу РРСС / В Л. Гаврилова, С А Кукушкин, И Я Курман, Т 3 Байбиков //Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику Матер конф молодых ученых -Владимир, 2000 -С 23-25

9 Репродуктивно-респираторный синдром свиней / Т 3 Байбиков, А А Гусев, Н А Яременко, Н С Дудникова, В Л. Гаврилова, С А Кукушкин, И Я Курман, В Ф Ковалишин, А М Рахманов // Ветеринария -2001, № 3 -С 18-24

10 Иммунобиологические свойства штамма «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней / Т 3 Байбиков, И А Тетерин, С А Кукушкин, Е П Баборенко, В.Л. Гаврилова II Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов Матер Междунар науч -практ конф, посвящен 35-летию ВНИТИБП -Щелково, 2005 -С 179-183

11 Разработка и испытание эмульсионной инактивированной вакцины против ре-продуктивно-респираторного синдрома свиней из штамма «Кемеровский-96» / И А Тетерин, С А Кукушкин, Е П Баборенко, Т 3 Байбиков, В Л. Гаврилова, А В Канышша // Тр Федерального центра охраны здоровья жив-х -Владимир, 2005-Т 3-С 241-254

12 Гаврилова, В Л. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств штаммов вируса РРСС / В Л Гаврилова, И А Тетерин, С А Кукушкин // Ветеринарная патология -2006, №4 -С 86-90

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экземпляров, октябрь 2007 г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилова, Вера Львовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1. Общие сведения о репродуктивно-респираторном синдроме свиней.

1.1.1. Основные пути распространения, клинические признаки и патологоанатомические изменения при РРСС.

1.1.2. Локализация вируса РРСС в организме свиней.

1.2. Иммунобиологическая характеристика вируса РРСС.

1.2.1. Классификация, морфология и химический состав.

1.2.2. Генетическая, антигенная вариабельность и родство штаммов вируса РРСС.

1.2.3. Репродукция вируса РРСС in vivo и in vitro.

1.3. Культуральные свойства вируса РРСС.

1.3.1. Культивирование вируса РРСС в первичных и перевиваемых культурах клеток.

1.3.2. Титрование вируса РРСС с использованием различных культур клеток.

1.4. Методы диагностики РРСС.

1.4.1. Выделение и идентификация вируса РРСС.

1.4.2. Серологические методы диагностики РРСС.

1.5. Иммунитет при РРСС.

1.5.1. Клеточный иммунитет.

1.5.2. Гуморальный иммунитет.

1.6. Вакцины против РРСС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов"

Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозное заболевание, наносящее ощутимый экономический ущерб свиноводству. Оно характеризуется поздними абортами, преждевременными опоросами, прохо-лостами у свиноматок, рождением мертвых или нежизнеспособных поросят, гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у поросят разных возрастных групп [3,21].

РРСС был впервые зарегистрирован в свиноводческих хозяйствах США и Канады в 1986-1987гг., а возбудитель заболевания был выделен при помощи первичной культуры альвеолярных макрофагов свиней (AMС) в 1991 году. В последующее десятилетие это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством [75, 211].

Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus [82, 240].

Для вируса РРСС характерна генетическая и антигенная вариабельность [8, 118, 235]. Ежегодно в различных странах мира выделяют новые изоляты вируса РРСС, только в Испании их насчитывают свыше 66 [180]. На основании генетических и антигенных отличий изоляты разделяют на две генетические группы: американскую и европейскую [166, 216, 224]. По данным GenBank (банк генетических последовательностей) и литературы, в Юго-Восточной Азии, в том числе и в Китае, в последнее время циркулирует вирус РРСС американского генотипа, вызывающий болезнь свиней, сходную по течению и клиническому проявлению с классической чумой свиней (быстрое распространение, заболеваемость до 100%, смертность - 25-50%) [255]. Во многих лабораториях разработаны и совершенствуются различные серологические и молекулярно-биологические методы диагностики РРСС [14, 17].

РРСС изучается с 1991 г. во многих странах мира, а в России и других странах СНГ он известен только с 1993 г. [12, 21]. Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток [5, 40].

Вирус РРСС очень изменчив - генетические различия между российскими изо-лятами составляют до 17% [9, 117]. В связи с этим, выделение новых изолятов вируса

РРСС, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах России, изучение и использование их для оптимизации средств диагностики и специфической профилактики являются актуальными задачами.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось выделение и изучение культуральных свойств изолятов вируса РРСС и оценка возможности их использования для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить изоляты вируса РРСС, циркулирующие в свиноводческих хозяйствах России;

- изучить особенности репродукции вируса РРСС в различных системах культивирования с использованием референтных штаммов;

- изучить культуральные и антигенные свойства выделенных изолятов по сравнению с известными штаммами вируса РРСС;

- оценить возможность применения оптимизированных и модифицированных серологических реакций для оценки антигенной активности вакцин;

- исследовать сыворотки крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС от экспериментально зараженных и вакцинированных против РРСС животных;

- провести серомониторинг по РРСС в России.

Научная новизна исследований. Новизна исследования состоит в том, что:

- выделен и адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145 изолят вируса РРСС «Кемеровский-96»;

- на основе штамма «КПР-96» созданы моно- и ассоциированная вакцины против РРСС;

- для оценки антигенной активности вакцин против РРСС рекомендованы модифицированные серологические реакции: РН, НРИФ, РНГА и ИФА.

Научная новизна исследования подтверждена тремя патентами Российской Федерации:

- Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.);

Практическая значимость исследований. Результаты исследований вошли в нормативную документацию:

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.1999г. (изменения внесены 01.04.2005г.);

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-00495527-2005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.2006г.

1. «Методика постановки реакции нейтрализации для ретроспективной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» (1995г.)

2. «Методические указания по выявлению и титрованию специфических антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ)» (1999 г.)

3. «Методические указания по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г.)

4. «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментного анализа» (2000г).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах научных конференций «Современные аспекты ветеринарной патологии животных» (Владимир, 1998г.), «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999г.), «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000г.), «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005г.), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (Иваново, 2005г.), «Проблемы инфекционной патологии свиней» (XIV Московский Международный ветеринарный конгрьс" Москва, 2006г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 1994-2006гг.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие доктор ветеринарных наук Ш.К. Куляшбекова (раздел 2.2.1.1), кандидат ветеринарных наук С.А. Кукушкин (разделы 2.2.1.4, 2.2.3.1), кандидат ветеринарных наук И.А. Тетерин (раздел 2.2.4.4), кандидат ветеринарных наук А.И. Егорова (раздел 2.2.5.3), кандидат ветеринарных наук И .Я. Курман (раздел 2.2.5.4), за что автор приносит им сердечную благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты выделения из патологических материалов вируса РРСС и его адаптации к различным культурам клеток;

- оптимизация и модификация лабораторных диагностических реакций с использованием РН, НРИФ, РИГА и ИФА для серодиагностики РРСС;

- результаты обнаружения вируса РРСС при помощи НРИФ в патологических материалах, полученных от экспериментально инфицированных или переболевших свиней;

- оценка антигенной активности вакцин против РРСС с помощью РН, НРИФ, РНГАиИФА;

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 256 источников, из которых 213 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 35 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гаврилова, Вера Львовна

126 4. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что оптимальным условием культивирования альвеолярных макрофагов свиней и перевиваемой культуры клеток MARC-145, необходимых для репродукции вируса РРСС, является использование питательных сред Игла, 199 или RS-ЗМ, содержащих 9-10% сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки) и 0.3-1.0 л мг/см глютамина.

2. Показано, что максимальное накопление вируса РРСС, штаммов Lelystad и л

NVSL, в титрах 5.25-6.5 lg ТЦД50/см происходило в альвеолярных макрофагах свиней и монослойной культуре клеток MARC-145 после инкубирования в течение 36-72 часов при +37°С. При использовании роллерного метода культивирования в культуре клеток MARC-145 титры вируса были выше на 0.5-1.0 lg ТЦД50/см по сравнению с монослойным стационарным методом культивирования.

3. При вирусологических и иммунофлюоресцентных исследованиях на 4 сутки после инфицирования культуральным вирусом РРСС, штамма Lelystad, у поросят обнаружено наличие вируса в различных органах и тканях, за исключением мышечной ткани. Наибольшее накопление вируса отмечено в легких, лимфатических узлах, миндалинах, в крови и щитовидной железе.

4. Изучены иммунобиологические свойства ряда изолятов вируса РРСС, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах России. Изолят «Кемеровский-96» был адаптирован к культуре клеток MARC-145, он вызывал четко выраженное ЦПД и накапливался в титрах 5.25-5.5 lg ТЦД50/см3.

5. Установлено, что выделенный изолят «Кемеровский-96» вируса РРСС относится к европейскому генотипу вируса РРСС, является специфичным, слабовирулентным и обладает более высокой антигенной активностью по сравнению с другими изученными штаммами вируса РРСС. После изучения и паспортизации под наименованием «штамм «КПР-96»-ДЕП» он был депонирован в качестве производственного для изготовления иммунобиологических препаратов.

6. Штамм «КПР-96»-ДЕП используется в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» для изготовления эмульсионных инактивированных вакцин против РРСС и широко применяется для диагностических целей.

7. Установлено, что через 28-36 суток после однократной иммунизации в сыворотках крови подсвинков были выявлены антитела к вирусу РРСС на уровне 1:4271:533 в НРИФ, 1:533-1:640 в РНГА, 1:200-1:800 в ИФА и 1:10-1:28 в РН, что свидетельствует о достаточно высокой антигенной активности разработанных вакцин.

8. С использованием референтных штаммов Lelystad и NVSL оптимизированы, а затем на основе отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»-ДЕП вируса РРСС модифицированы серологические реакции РН, НРИФ, РНГА и ИФА, которые используются для оценки антигенной активности вакцин и в серомониторинге РРСС. Из 22254 исследованных полевых проб сывороток крови свиней серопозитивными к вирусу РРСС были признаны 11411 (51.3%), что указывает на широкое распространение РРСС в свиноводческих хозяйствах России.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты экспериментальной работы вошли в 4 методические рекомендации, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 2 НД (СТО) и в 3 полученные патента на изобретения:

4. «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммунофер-ментного анализа» (2000г)

5. Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.1999г. (изменения внесены 01.04.2005г.)

6. Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-004955272005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.2006г.

7. Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивиро-ванная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.)

8. Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираториого синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г.)

9. Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г.).

130

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилова, Вера Львовна, Владимир

1. Байбиков, Т.З. Репродуктивно-респираторный синдром свиней / Т.З. Байбиков // Вет. врач.-2000.-№2.-С.20-24.

2. Выделение вируса РРСС и его адаптация к перевиваемой линии клеток MARC-145 / Н.С. Дудникова, В.А. Пыльнов, Е.В. Гусева и др. // Ветеринария.-2002.-№6.-С.23-25.

3. Выделение и идентификация вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в Самарской области / И.Ф. Вишняков, Е.А. Балашова, О.В. Суханова и др. //Ветеринария.-1997.-№11.-С.16-19.

4. Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) / Т.В. Гребенникова, А.Д. Забережный,

5. A.Н. Власов и др. //Мол. ген., микробиол. и вирусол.-2004.- №2.-С.37-40.

6. Генетическое разнообразие вируса РРСС / А.В. Щербаков, В.Ф. Ковалишин,

7. B.А. Пыльнов и др. // Актуал. пробл. инфекц. патол. ж-ных: матер. Междунар. науч. конф., посвящен. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». Владимир, 2003.-С.150-155.

8. Груздев, К.Н. Мониторинг экономически значимых инфекционных болезней свиней в России / К.Н. Груздев, Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкин // Матер. Всерос. Вет. конгр.-М., 2006.-С.29-34.

9. Диагностика и специфическая профилактика РРСС / Б.Г. Орлянкин, Е.А. Непоклонов, Т.Н. Алипер и др. //Ветеринария.-2000.-№10.-С.16-19.

10. Иммунобиологические свойства изолятов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней / С.А. Кукушкин, Т.З. Байбиков, И.Я. Курман и др. // Вопр. вирусол.-2004.-Т.49, №2.-С.42-46.

11. ИФА для определения антител к вирусу РРСС / В.А, Мищенко, Н.Е. Камалова, Т.Б. Никешина и др. //Ветеринария.-1997.-№3.-С.28-30.

12. Каньшина, А.В. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис. . канд. вет. наук / Каньшина Ангелина Владимировна.-Владимир, 2004.-123с.

13. Кукушкин, С.А. Особенности течения и вакцинопрофилактика репродуктивно-респираторного синдрома свиней в Российской Федерации: дис. . канд. вет. наук / Кукушкин Сергей Анатольевич.-Владимир, 2000.-176с.

14. Кукушкин, С.А. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (эпизоотология, диагностика, специфическая профилактика) / С.А. Кукушкин // Пром. и племенное свиноводство.-2006.-№3.-С.60-61.

15. Курман, И.Я. Разработка технологии изготовления и контроля ассоциированной инактивированной вакцины против репродуктивно респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней: дис. . канд. вет. наук / Курман Игорь Яросла-вович.-Владимир, 2001.-160с.

16. Мищенко, В.А. Экологические особенности вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней / В.А. Мищенко, Е.В. Гусева // Пробл. инфекцю патологии жив-х: тез. докл. конф., посвящен. 100-летию открытия вируса ящура,-Владимир, 1997.-С.100.

17. Моноклональные антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней / JI.A. Глобенко, В.А. Мищенко, Т.В. Жбанова и др. // Вирусные болезни с.-х. жив-х: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Владимир, 1995.-С.52.

18. Панин, А.Н. Новое заболевание свиней, характеризующееся репродуктивно-респираторным синдромом / А.Н. Панин, Р.В. Душук // Ветеринария.-1994.-№6.-С.56-59.

19. Поствакцинальный иммунитет у свиней против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции // Экол. аспекты эпизоотол. и патол. жив-х: Междунар. науч.-произв. конф.-Воронеж, 1999.-С.112-114.

20. Разработка инактивированной вакцины против репродуктивно респираторного синдрома свиней / Б.Г. Орлянкин, Е.А. Непоклонов, Т.П. Алипер и др. // Науч. основы произ-ва вет. биол. препаратов: тез. докл.-Щелково, 2000.-С.89-91.

21. Результаты испытаний инактивированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней / В.А. Мищенко, В.М. Захаров, Д.Л. Кириченко и др. // Курской биофабрике и агробиологической промышленности 100 лет: тез. докл.-Курск, 1996.-С.218-219.

22. Репродуктивно-респираторный синдром свиней («синее ухо») /В.А. Мищенко, В.М. Авилов, В.М. Захаров и др. // Ветеринария.-1994.-№9.-С.22-24.

23. Репродуктивно-респираторный синдром свиней в России / В.А. Мищенко, В.М. Захаров, А.И. Дудников и др. // Пробл. инфекц. патол. жив-х: тез. докл. конф., посвящен. 100-летию открытия вируса ящура.-Владимир, 1997.-С.101-102.

24. Соколов, М.А. Биологические свойства штаммов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис. . канд. биол. наук. / Соколов Михаил Александрович.-М., 2004.

25. Суханова, О.В. Разработка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис. . канд. вет. наук. / Суханова Ольга Валентиновна.-Покров, 1997.

26. Тетерин, И.А. Разработка эмульсионной инактивированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней из штамма «КПР-96»: дис. . канд. вет. наук / Тетерин Илья Андреевич.-Владимир, 2000.-176с.

27. Юрков, С.Г. Совершенствование методики изготовления альвеолярных макрофагов свиньи / С.Г. Юрков // Ветеринария.-1996.-№1.-С.19-21.

28. A modified serum neutralization test for the detection of antibody to porcine reproductive and respiratopy syndrome virus in swine sera / I.J. Yoon, H.S. Joo, S.M. Goyal, T.W. Molitor // J. Vet. Diagn. Invest.-1994.-V.6, №3.-P.289-292.

29. A national serological survey to verify Australia's freedom from porcine reproductive and respiratory syndrome / M.G. Garner, L.J. Gleeson, P.K. Holyoake et al. // Aust. Vet. J.- 1997.-V.75, №8.-P.596-600.

30. A sensitive fluorescence in situ hybridization technique for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / L.L. Chueh, K.H. Lee, C.R. Jeng, V.F. Pang //J. Virol. Methods.-1999.-V.79, №2.-P.133-40.

31. Albina, E. Porcine reproductive and respiratory syndrome: ten years of experience (1986-1996) with this undesirable viral infection / E. Albina // Vet. Res.-1997.-V.28, №4.-305-352.

32. Allan, G.M. Porcine circoviruses: a review / G.M. Allan, J.A. Ellis // J. Vet. Diagn. Invest.-2000.-V.12, №1.-P.3-14.

33. An evaluation of disinfectants for the sanitation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus-contaminated transport vehicles at cold temperatures / S. Dee, J. Deen, D. Burns et al. // Can. J. Vet. Res.-2005.-V.69, №l.-P.64-70.

34. An evaluation of transmission of PRRSV and identification of PRRSV in mosquitoes / S. Otake, S.A. Dee, K.D. Rossow et al. // Proc. Allen D. Leman Swine Conf.-2001.-P.29.

35. An indirect fluorescent antibody test for the detection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera //1 J. Yoon, H.S. Joo, W.T. Christianson et al. //J. Vet. Diagn. Invest.-1992.-V.4.-P. 144-147.

36. An infectious cDNA clone of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / J.J. Meulenberg, J.N. Bos-de Ruijter, G. Wensvoort, R.J. Moormann // Adv. Exp. Med Biol.- 1998.-V.440.-P. 199-206.

37. An investigation of susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus between two genetically diverse commercial lines of pigs / A.L. Vincent, B.J. Thacker, P.G. Halbur et al. // J. Anim. Sci.-2006.-V.84, №l.-P.49-57.

38. Analysis of cellular immune response in pigs recovered from porcine respiratory and reproductive syndrome infection / Lopez Fuertes L, Domenech N, Alvarez В et al. // Virus Res.-1999.-V.64, №l.-P.33-42.

39. Analysis of national serological surveys for the documentation of freedom from porcine reproductive and respiratory syndrome in Switzerland / L.G. Corbellini, H. Schwermer, P. Presi et al. // Vet. Microbiol.-2006.-V.l 18, №3-4.-P.267-273.

40. Antibody production and blastogenic response in pigs experimentally infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus / S.A.Vezina, H. Loemba, M. Fournier et al. // Can. J. Vet. Res.-1996.-V.60, №2.-P.94-99.

41. Antibody-dependent enhancement of SIRS virus replication / C. Choi, W. Christianson, J. Collins et al. // American Assoc. Swine Pract. Newslet.-1992.-V.4.-P.30.

42. Antigenic structure analysis of glycosylated protein 3 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / YJ. Zhou, T.Q. An, Y.X. He et al. // Virus Res.-2006.-V.l 18, №l-2.-V.98-104.

43. Antigenic variability of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolates. Influence of vims passage in pig / A. Le Gall, E. Albina, R. Magar, J.P. Gauthier // Vet. Res.-1997.-V.28, №3.-P.247-257.

44. Association between genetic sequence homology of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and geographic distance between pig sites / E. Mondaca-Fernandez, M.P. Murtaugh, R.B. Morrison // Can. J. Vet. Res.-2006.-V.70, №3.-P.237-239.

45. Bautista, E.M. Cell-mediated immunity to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine / E.M. Bautista, T.W. Molitor // Viral. Immunol.-1997.-V. 10, №2.-P.83-94.

46. Blocking ELISA's for the distinction between antibodies against European and American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / K.J. Sorensen, B. Strandbygaard, A. Botner et al. //Vet. Microbiol.-1998.-V.60, №2-4.-P. 169-77.

47. Botner, A. Diagnosis of PRRS / A. Botner // Vet. Microbiol.-1997.-V.55, №1-4.-P.295-301.

48. Carter, Q.L. Interleukin-12 (IL-12) ameliorates the effects of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) infection / Q.L. Carter, R.E. Curiel // Vet. Immunol. Immunopathol.-2005.-V.107, №l-2.-P.105-18.

49. Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States / S.L. Ropp, C.E. Wees, Y. Fang et al. // J. Virol.- 2004.-V.78, №7.-P.3684-3703.

50. Characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus hemagglutinin / E.R. Jusa, Y. Inaba, M. Kouno et al. // J. Vet. Med. Sci.-1997.-V.59, №4.-P.281-286.

51. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332) /D.A. Benfield, E. Nelson, J.E. Collins et al. //J. Vet. Diagn. Invest.-1992.-V.4.-P.127-133.

52. Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection / K.J. Yoon, J.J. Zimmerman, S.L. Swenson et al. //J. Vet. Diagn. Invest.-199 5.-V.7, №3.-P.305-12.

53. Cho, H.J. An ELISA for porcine reproductive and respiratory syndrome: production of antigen of high quality / H.J. Cho, D. Deregt, H.S. Joo // Can. J. Vet. Res.-1996.-V.60, №2.-P.89-93.

54. Christianson, W.T. Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review / W.T. Christianson, H.S. Joo // Swine Health and Production.-1994.-V.2, №2.-P.10-28.

55. Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome / W.L. Mengeling, K.M. Lager, A.C. Vorwald et al. // Vet. Microbiol.-2003.-V.93, №l.-P.25-38.

56. Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus / H.J. Cho, B. McNab, C. Dubuc et al. // Can. J. Vet. Res.-1997.-V.61, №3.-P.161-166.

57. Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure / W.L. Mengeling, A.V. Vorwald, K.M. Lager et. al. // Am. J. Vet. Res.-1996.-V.57.-P.834-839.

58. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates / S. Dea, C.A. Gagnon, H. Mardassi et al. // Arch. ViroI.-2000.-V.145.-P.659-688.

59. Deciphering the involvement of innate immune factors in the development of the host response to PRRSV vaccination / A.R. Royaee, R.J. Husmann, H.D. Dawson et ah. //Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3.-P.199-216.

60. Dee, S.A. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation / S.A. Dee, H.S. Joo // Vet. Rec.-1994.-V.135, №l.-P.6-9.

61. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs with low positive or negative ELISA s/p ratios / L. Batista, S.A. Dee, K.D. Rossow et al. // Vet Rec.- 2004.-V.154, №l.-P.25-26.

62. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen by PCR / J. Christopher-Hennings, E.A. Nelson, J.K. Nelson et al. // J. Clin. Microbiol.-1995.- V.33, №7.-P.1730-1734.

63. Diagnostic testing for SIRS virus at the National Veterinary Service Laboratories (NVSL) / M. Frey, K. Eernisse, J. Landgraf et al. // American Assoc. Swine Pract. Newslet.-1992.-V.4.-P.31.

64. DNA vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity / Y. Jiang, S. Xiao, L. Fang et al. // Vaccine.-2006.-V.24, №15.-P.2869-2879.

65. Drew, T.W. A review of evidence for immunosuppression due to porcine reproductive and respiratory syndrome virus / T.W.Drew // Vet. Res.-2000.-V.31, №l.-P.27-39.

66. Drew, T.W. Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in eight European laboratories, using immunoperoxidase monolayer assay and enzyme-linked immunosorbent assay / T.W. Drew // Rev. Sci. Tech.-1995.-V.14, №3.-P.761-775.

67. Effect of challenge dose and route on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in young swine / K.J. Yoon, J.J. Zimmerman, C.C. Chang et al. //Vet. Res.-1999.-V.30, №6.-P.629-638.

68. Effect of heparin on a haemagglutinin of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / E.R. Jusa, Y. Inaba, M. Kono et al. // Res. Vet. Sci.-1997.-V.62, №3.-P.261-264.

69. Effect of heparin on infection of cells by porcine reproductive and respiratopy syndrome virus / E.R. Jusa, Y. Inaba, M. Kouno, 0. Hirose // Am. J. Vet. Res.-1997.-V.58, №5.-P.488-491.

70. Effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (isolate tw 91) on porcine alveolar macrophages in vitro / Chiou MT, Jeng CR, Chueh LL et al. // Vet. Microbiol.-2000.-V.71, №l-2.-P.9-25.

71. Efficacy of an inactivated PRRSV vaccine: induction of virus-neutralizing antibodies and partial virological protection upon challenge / G. Misinzo, P.L. Delputte, P. Meerts et al. // Adv. Exp. Med. Biol.- 2006.-V.581.-P.449-454.

72. Efficacy of an inactivated vaccine for prevention of reproductive failure induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus / J. Plana-Duran, M. Bastons, A. Urniza et al. // Vet. Microbiol.-1997.-V.55.-P.361-370.

73. Eichhorn, G. Study on the suitability of sow colostrum for the serological diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) / G. Eichhorn, J.W. Frost // Zentralbl Veterinarmed.-1997.-V.44, №2.-P.65-72.

74. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line / H.S. Kim, J. Kwang, I.J. Yoon et al. //Arch. Virol.-1993.-V.133, №3-4.-P.477-83.

75. Evaluation of an indirect fluorescent IgM antibody test for the detection of pigs with recent infection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / B.K. Park, H.S. Joo, S.A. Dee, C. Pijoan // J. Vet. Diagn. Invest.-1995.-V.7.-P.544-546.

76. Evaluation of the efficacy of two spanish attenuated-live virus vaccines against PRRS-induced reproductive disease / M. Scortti, R. Jimenez, C. Prieto et al. // 3rd Int. Symp. on PRRS and Aujeszky's Dis.-Ploufragan, France, 1999.-P.291-292.

77. Evaluation of the role of mallard ducks as vectors of porcine reproductive and respi-ratoiy syndrome virus / C. Trincado, S. Dee, K. Rossow et al. // Vet. Rec.-2004.-V.154, №8.-P.233-237.

78. Evidence of freedom from porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in Switzerland / N. Canon, L. Audige, H. Denac et al. // Vet. Rec.-1998.V.142, №6.-P.142-143.

79. Evolution of ORF5 of Spanish porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains from 1991 to 2005 / E. Mateu, I. Diaz, L. Darwich et al. // Virus Res.-2006.-V.l 15, №2.-P. 198-206.

80. Evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRSSV) during sequential passages in pigs / C.C. Chang, K.J. Yoon, J.J. Zimmerman et al. // J. Virol.-2002.-V.76.-P .4750-4763.

81. Experimental airborne transmission of PRRS virus / C.S. Kristensen, A. Botner, H. Takai et al. // Vet. Microbiol.-2004.-V.99, №3-4.-P. 197-202.

82. Fetal microscopic lesions in porcine reproductive and respiratory syndrome virus-induced abortion / K.D. Rossow, K.L. Laube, S.M. Goyal et al. // Vet. Pathol.-1996.-V.33.-P.55-99.

83. Fichtner, D. Experimental reproduction of the respiratory form of infection with the agent of epidemic late abortion of swine / D. Fichtner, J. Beyer, D. Leopoldt et al. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr.-1993.-V.106, №5.-S. 145-9.

84. Gammadelta lymphocyte response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus / M.R. Olin, L. Batista, Z. Xiao et al. // Viral Immunol.-2005.-V.18, №3.-P.490-499.

85. General overview of PRRS: A perspective from the United States / J.J. Zimmerman, K.J. Yoon, R.W. Wils, S.L. Swenson//Vet. Microbiol.-1997.-V.55.-P.187-196.

86. Genetic variability of PRRS virus in Austria: consequences for molecular diagnostics and viral quantification / S. Indik, F. Schmoll, W. Sipos, D. Klein // Vet. Microbiol.-2005.-V.107, №3-4.-P.171-178.

87. Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates / K. Key, G. Haqshenas. D.Guenette et al. // Vet. Microbiol.-2001.-V.83.-P.249-263.

88. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States / V. Kapur, M.R. Elam, T.M. Pawlovich et al. // J.Gen. Virol.-1996.-V.77, №6.-P. 1271-1276.

89. Genetic variation in the PRRS virus / M.P. Murtaugh, K.S. Faaberg, J. Lager et al. //Adv. Exp. Med. Biol.-1998.-V.440.-P.787-794.

90. Genetic variation of the prevailing porcine respiratory and reproductive syndrome viruses occurring on a pig farm upon vaccination / L Kiss, L. Sami, S. Kecskemeti, K. Hanada//Arch. Virol.-2006.-V. 151, №ll.-P.2269-2276.

91. Hemagglutination with porcine reproductive and respiratory syndrome virus / E.R. Jusa, Y. Inaba, M. Kohno et al. // J. Vet. Med. Sci.-1996.-V.58, №6.-P.521-527.

92. Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States / Y. Fang, D.Y. Kim, S.L. Ropp et al. // Virus Res.-2004.~V.100, №2.-P.229-235.

93. Hill, H.T. A comparison of the indirect fluorescent antibody test and the serum neutralization test for the detection of antibodies against PRRS virus / H.T. Hill, S.L. Swenson, J. Zimmerman // Proc. of the American Assoc. Swine Pract.-1993.-P.717.

94. Immune responses in pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) / E. Albina, L. Piriou, E. Hutet et al. // Vet. Immunol. Im-munopathol.-1998.-V.61, №1.-P.49-66.

95. Immune responses of pigs after experimental infection with a European strain of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus /1. Diaz, L. Darwich, G. Pappaterra etaI.//J. Gen. Virol.-2005.-V.86, Pt. 7.-P. 1943-1951.

96. Impact of genetic diversity of European-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains on vaccine efficacy / G. Labarque, K.V. Reeth, H. Nauwynck et al. //Vaccine.-2004.-V.22, №31-32.-P.4183-4190.

97. Impact of immunizations with porcine reproductive and respiratory syndrome virus on lymphoproliferative recall responses of CD8+ T cells / J. Bassaganya-Riera, B.J. Thacker, S. Yu et al. //Viral Immunol.-2004.-V.176, №l.-P.25-37.

98. In vitro susceptibility of macrophages to porcine reproductive and respiratory syndrome virus varies between genetically diverse lines of pigs / A.L. Vincent, B.J. Thacker, P.G. Halbur et al. // Viral Immunol.-2005.-V.18, №3.-P.506-512.

99. In vivo detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA by in situ hybridization at different times postinfection / J.-H. Sur, V.L. Cooper, J.A. Galeota etal. //J. Clin. Microbiol.-1996.-V.34.-P.2280-2286.

100. In vivo and in vitro studies on the immunobiology of PRRS / V. Ohlinger, B. Haas, A. Sallmuller et al. // American Assoc. Swine Pract. Newslet.-1992.-V.4.-P.24.

101. Indirect fluorescent IgM antibody response of pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome syndrome virus / H.S. Joo, B.K. Park, S.A. Dee, C. Pijoan // Vet. Microbiol-1997.-V.55, №l-4.-P.303-307.

102. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors / D. Yoo, S.K. Welch, C. Lee, J.G. Calvert // Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3.-P.143-154.

103. Isolation of a cytopathic virus from weak pigs on farms with a history of swine infertility and respiratory syndrome / I.J. Yoon, H.S. Joo, W.T. Christianson et al. // J. Vet. Diagn. Invest.-1992.-V.4.-P.139-143.

104. Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus / H.D. Loemba, S. Mounir, H. Mardassi et al. //Arch. Virol.-1996.-V.141, №3-4.-P.751-761.

105. Kreutz, L.C. Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome vims tropism / L.C. Kreutz // Virus Res.-1998.-V.53,№2.-P.121-128.

106. Kreutz, L.C. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through a low pH-dependent endocytic pathway / L.C. Kreutz, M.R. Ackermann // Virus Res.-1996.- V.42, №l-2.-P.137-147.

107. Laboratory investigation of PRRS virus infection in three swine herds / D. Zeman, R. Neiger, M. Yaeger et al. // J. Vet. Diagn. Invest.-1993.-V.5, №4.-P.522-528.

108. Laboratory model to evaluate the role of aerosols in the transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / S.A. Dee, J. Deen, L. Jacobson et al. // Vet. Rec.-2005.- V.156, №16.-P.501-504.

109. Lactate dehydrogenase elevating virus and related viruses / P.G.W. Plagemann, B.N. Fields, D.M. Knipe et al. // Fields Virology (3-rd ed), Lippincott-Raven, Philadel-phia.-1996.-P.l 105-1120.

110. Larochelle, R. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in paraffin-embedded tissues: comparison of immunohistochemistry and in situ hybridization / R. Larochelle, R. Magar // J. Virol. Methods.-1997.-V.63, №l-2.-P.227-235.

111. Larochelle, R. Differentiation of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotypes by in situ hybridization / R. Larochelle, R. Magar// J. Virol. Methods.-1997.-V.68.-P.161-168.

112. Larochelle, R. Evaluation of the presence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in packaged pig meat using virus isolation and polymerase chain reaction (PCR) method / R. Larochelle, R. Magar // Vet. Microbiol.-1997.-V.58, №l.-P.l-8.

113. Lee, S.M. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes / S.M. Lee, S.K. Schommer, S.B. Kleiboeker // Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3.-P.217-231.

114. Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad / G. Wensvoort, E.P. de Kluyver, J.M.A. Pol et al. // Vet. Microbiol.-1992.-V.33.-P.185-193.

115. Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) / G. Wensvoort, C. Terpstra, J.M.A. Pol, F. Wagenaar // European Comm. Seminar on the New Pig Dis.-Brussels, 1991.-P.8.

116. Lopez, O.J. Role of neutralizing antibodies in PRRSV protective immunity / O.J. Lopez, F.A. Osorio //Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3 .-P. 155-163.

117. Loving, C.L. Differential type I interferon activation and susceptibility of dendritic cell populations to porcine arterivirus / C.L. Loving, S.L. Brockmeier, R.E. Sacco // Immunology.--2007.-V. 120, №2.-P.217-229.

118. Loyal, S.M. Porcine reproductive and respiratory syndrome / S.M. Loyal // J. Vet. Diagn. Invest.-1993.-V.5.-P.656-664.

119. Lymphoid hyperplasia resulting in immune dysregulation is caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in neonatal pigs / C.D. Lemke, J.S. Haynes, R. Spaete et al. // J. Immunol.-2004.-V.172, №3.-P.1916-1925.

120. Meier, W. Characteristics of the immune response of pigs to PRRS virus / W. Meier, J. Wheeler, R.J. Husmann// Vet. Res.-2000.-V.31, №1.-P.41.

121. Meng, X.J. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development / X.J. Meng // Vet. Microbiol.-2000.-V.74.-P.309-329.

122. Mengeling, W.L. Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome / W.L. Mengeling, K.M. Lager, A.C. Vorwald // J. Vet. Diagn. Invest.-1995.-V.7, №1,-P.3-16.

123. Meulenberg, J.J. Infectious transcripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / J.J. Meulenberg, J.N. Bos-de Ruijter, R. van de Graaf et al. // J. Virol.-1998.-V.72, №l.-P.380-387.

124. Mice and rats (laboratory and feral) are not a reservoir for PRRS virus / C.C. Hooper, W.G. Van Alstine, G.W. Stevenson, C.L. Kanitz // J. Vet. Diagn. Invest.-1994.-V.6, №1.-P.13-15.

125. Miller, L.C. Apoptosis and porcine reproductive and respiratory syndrome virus / L.C. Miller, J.M. Fox//Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3.-P.131-142.

126. Murtaugh, M.P. Genetic variation in vaccine and field PRRS virus / M.P. Murtaugh, K.S. Faaberg // 3rd Int/ Symp. PRRS and Aujeszky's Dis.-Ploufragan,France,1999.-P.41.

127. Mutations within the nuclear localization signal of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein attenuate virus replication // C. Lee, D. Hodgins, J.G. Calvert et al. // Virology.-2006.-V.346, №l.-P.238-50.

128. Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus / G. Wens-voort, C. Terpstra, J.M.A. Pol et al. //Vet. Q.-1991.-V.13.-P.121-130.

129. Nelsen, C.J. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents / C.J. Nelsen, M.P. Murtaugh, K.S. Faaberg // J. Virol.- 1999.-V.73, №l.-P.270-280.

130. Nelsen, C.J. Structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRSSV) / C.J. Nelsen, J. Christopher-Hennings, D.A. Benfield // Adv. Exp. Med. Biol.-1995.-V.380.-P.321-323.

131. Nelson, E.A. Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus / E.A. Nelson, J. Christopher-Hennings, D.A. Ben-field//J. Vet. Diagn. Invest.-1994.-V.6, №4.-P.410-415.

132. Nielsen, J. Hematological and immunological parameters of 4 1/2-month old pigs infected with PRRS virus / J. Nielsen, A. Botner // Vet. Microbiol.-1997.-V.55, №1-4.-P.289-294.

133. Ohlinger V., Haas В., Sallmuler A. et. al. In vivo and in vitro studies on the im-munobiology of PRRS // Assoc. Swine Pract. Newsl.-1992.-V.4.-P.24.

134. Oleksiewicz, M.B. Effect of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) on alveolar lung macrophage survival and function / M.B. Oleksiewicz, J. Nielsen //Vet. Microbiol.-1999.-V.66, № 1.-P.15-27.

135. Outbreaks of porcine reproductive failure: Report on a collaborative field investigation / H.S. Hurd, E.J. Bush, W. Losinger et al. // J. Swine Health Prod.-2001 .-V.9, №3.-P.103-108.

136. Park, В.К. Pathogenesis of plague variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pregnant sows / B.K. Park, I.J. Yoon, H.S. Joo // Am. J. Vet. Res.-1996.-V.57.-P.320-323.

137. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in mid-gestation sows and fetuses / W.T. Christianson, C.S. Choi, J.E. Collins et al. // Can. J. Vet. Res.-1993.-V.57, №4.-P.262-268.

138. Pathogenic and humoral immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are related to viral load in acute infection / W. Johnson, M. Roof, E.Vaughn et al. //Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.102, №3.-P.233-247.

139. Pejsak, Z. Randomised, placebo-controlled trial of a live vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus in sows on infected farms / Z. Pejsak, I. Markowska-Daniel // Vet. Rec.-2006.-V.158, №14.-P.475-478.

140. Performance of ELISA antigens prepared from 8 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with homologous and heterologous antisera / H.J. Cho, S.C. Entz, R. Magar, H.S. Joo // Can. J. Vet. Res.-1997.-V.61, №4.-P.299-304.

141. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in intensive farrow-to-finish pig herds / W.B. Chung, M.W. Lin, W.F. Chang et al. // Can. J. Vet. Res.- 1997.-V.61, №4.-P.292-298.

142. Pesch, S. New insights into the genetic diversity of European porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) / S. Pesch, C. Meyer, V.F. Ohlinger // Vet. Mi-crobiol.-2005.-V.107, №l-2.-P.31-48.

143. Plagemann, P.G. Neutralizing antibody formation in swine infected with seven strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as measured by indirect

144. ELISA with peptides containing the GP5 neutralization epitope / P.G. Plagemann // Viral Immunol.-2006.- V. 19, №2.-P.285-293.

145. Plagemann, P.G. Peptide ELISA for measuring antibodies to N-protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / P.G. Plagemann // J. Virol. Methods.-2006.-V.134, №l-2.-P.99-l 18.

146. Pol, J.V.A. Comparative morphogenesis in three PRRS virus strains / J.V.A. Pol, F. Wagenaar, J.E.G. Reus // Vet. Microbiol.-1997.-V.55, №l-4.-P.203-208.

147. Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field / J. Ellis, E. Clark, D. Haines et al. // Vet. Microbiol.-2004.-V.98, №2.-P.159-163.

148. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) diagnostics: Interpretation and Limitations / J. Christopher-Hennings, K.S. Faaberg, W.L. Mengeling et al. // Swine Health and Production.-2002.-V.10, №5.-P.213-218.

149. Porcine reproductive and respiratory syndrome / D.A. Ben field, J.E. Collins, A.L. Jenny, T.J. Loula // Disease of swine.-7th ed.-Ames. Iowa, 1992.-P.756-762.

150. Porcine reproductive and respiratory syndrome / OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines: draft texts for comment by experts in Member Countries in 2002.- Paris, 2004.-Pt.l.-Ch.X.12.-P.l-14.

151. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): a ring test performed in Germany to assess RT-PCR detection methods / U. Truyen, S. Wilhelm, M.

152. Genzow, G. Schagemann // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public. Health.-2006.-V.53, №2.-P.68-74.

153. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus productively infects monocyte-derived dendritic cells and compromises their antigen-presenting ability / X. Wang, M. Eaton, M. Mayer et al. //Arch. Virol.-2007.-V.152, №2.-P.289-303.

154. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicates in testicular germ cells, alters spermatogenesis, and induces germ cell death by apoptosis / J.H. Sur, A.R. Doster, J.S. Christian et al. // J. Virol.-1997.-V.71, №12.-P.9170-9179.

155. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: a persistent infection / R.W. Wills, J.J. Zimmerman, K.J. Yoon et al. // Vet. Microbiol.-1997.-V.55, №l-4.-P.231-240.

156. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: description of persistence in individual pigs upon experimental infection / R. Allende, W.W. Laegreid, G.F. Kutish et al. // J. Virol.-2000.-V.74, №22.-P.10834-10837.

157. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: routes of excretion / R.W. Wills, J.J. Zimmerman, K.J. Yoon et al. //Vet. Microbiol.-1997.-V.57, Ш.-Р.69-81.

158. Porcine reproductive and respiratory syndrome: temperature and pH stability of Lelystad virus and its survival in tissue specimens from viraemic pigs / M. Bloemraad, E.P. de Kluijver, A. Petersen et al. // Vet. Microbiol.-1994.-V .42, №4.-P.361-371.

159. Positive inductive effect of IL-2 on virus-specific cellular responses elicited by a PRRSV-ORF7 DNA vaccine in swine / G. Rompato, E. Ling, Z. Chen et al. // Vet. Immunol. Immunopathol.-2006.-V.109, №l-2.-P.151-160.

160. Probability of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection as a function of exposure route and dose / J.R. Hermann, C.A. Munoz-Zanzi, M.B. Roof et al. //Vet. Microbiol.-2005.-V.110, №l-2.-P.7-16.

161. PRRS (blue-eared pig disease) in Great Britain / S. Edwards, I.B. Robertson, J. Wilesmith et al. //American Assoc. Swine Pract. Newslet.-1992.-V.4.-P.32-36.

162. Quasispecies variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during natural infection / T.L. Goldberg, J.F. Lowe, S.M. Milburn, L.D. Firkins // Virology.-2003.- V.317, №2.-V. 197-207.

163. Retention of ingested porcine reproductive and respiratory syndrome virus in house-flies / J.A. Schurrer, S.A. Dee, R.D. Moon et al. // Am. J. Vet. Res.-2005.-V.66, №9.-P.1517-1525.

164. Riber, U. In utero infection with PRRS virus modulates cellular functions of blood monocytes and alveolar lung macrophages in piglets / U. Riber, J. Nielsen, P. Lind // Vet. Immunol. Immunopathol.-2004.-V.99, №3-4.-P. 169-177.

165. Robertson, I.B. The epidemiology of PRRS in the United Kindom / I.B. Robertson //European Comm. Seminar on the New Pig Dis.-Brussels, 1991.-P.5.

166. Rossow, K.D. Porcine reproductive and respiratory syndrome / K.D. Rossow // Vet. Pathol.-1998.-V.35, №l.-P.l-20.

167. Rossow, K.D. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in neonatal pigs characterised by marked neurovirulence / K.D. Rossow, J.L. Shivers, P.E. Yeske et al. //Vet. Rec.-1999.-V.144, №16.-P.444-448.

168. Saliki, J.T. Serosurvey of selected viral and bacterial diseases in wild swine from Oklahoma / J.T. Saliki, S.J. Rodgers S.J., G. Eskew // J. Wildl. Dis.-1998.-V.34, №4.-P.834-838.

169. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low high virulence United States of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / X.J. Meng, P.S. Paul, P.G. Halbur etal. //J. Gen. Virol.-1995.-V.76.-P.3181-3188.

170. Serologic evidence incriminating a recently isolated virus (ATCC VR-2332) as the cause of swine infertility and respiratopy syndrome (SIRS) / R.B. Morrison, J.E. Collins, L. Harris et al. // J. Vet. Diagn. Invest.-1992.-V.4.-P.186-188.

171. Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome vims correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein / P. Gonin, B. Pirzadeh, C.A. Gagnon, S. Dea// J. Vet. Diagn. Invest.-1999.-V.ll, № 1.-P.20-26.

172. Seroprevalence of indirect fluorescent antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in selected swine herds / S.H. Cho, W.R. Freese, I.J. Yoon et al. II J. Vet. Diagn. Invest.-1993.-V.5, №2.-P.259-260.

173. Shedding of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in mammary secretions of sows / E.A. Wagstrom, C.C. Chang, K.J. Yoon, J.J. Zimmerman // Am. J. Vet. Res.-2002.-V.62.-P. 1876-1880.

174. Shibata, I. Experimental infection of maternally immune pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus /1. Shibata, M. Mori, K. Uruno // J. Vet. Med. Sci.-1998.-V.60, № 12.-1285-1291.

175. Shibata, I. Experimental reinfection with homologous porcine reproductive and res-piratoiy syndrome virus in SPF pigs /1. Shibata, M. Mori, S. Yazawa // J. Vet. Med. Sci.-2000.-V.62, №1.-P.105-108.

176. Slow-reacting and complement-requiring neutralizing antibody in swine infected with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus / E.R. Jusa, Y. Inaba, M. Kouno et al. // J. Vet. Med. Sci.-1996.-V.58, №>8.-P.749-53.

177. Spatial dispersal of porcine reproductive and respiratory syndrome virus-contaminated flies after contact with experimentally infected pigs / J.A. Schurrer, S.A. Dee, R.D. Moon et al. // Am. J. Vet. Res.-2004.-V.65, №9.-P.1284-1292.

178. Studies of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection in avian species / J.J. Zimmerman, K.J. Yoon, E.C. Pirtle et. al. // Vet. Microbiol.-1997.-V.55, №l-4.-P.329-336.

179. Studies on the carriage and transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by individual houseflies (Musca domestica) / S. Otake, S.A. Dee, R.D. Moon et al. // Vet. Rec.-2004.-V.154, №3.-P.80-85.

180. Subgenomic RNA7 is transcribed with different leader-body junction sites in PRRSV (strain VR2332) infection of CL2621 cells / K.S. Faaberg, M.R. Elam, C.J. Nelsen, M.P. Murtaugh // Adv. Exp. Med. Biol.-1998.-V.440.-P.275-279.

181. Supplementing drinking water with Solutein did not mitigate acute morbidity effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in nursery pigs / J. Escobar, T.L. Toepfer-Berg, J. Chen et al. // J. Anim. Sci.-2006.-V.84, №8.-P.2101-2109.

182. Temporal shedding and persistence of porcine reproductive and respiratorysyn-drome virus in boars / C. Prieto, C. Garcia, I. Simarro, J.M. Castro // Vet. Rec.-2004.-V.154, №26.-P.824-827.

183. The evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: quasispecies and emergence of a virus subpopulation during infection of pigs with VR-2332 / R.R. Rowland, M. Steffen, T. Ackerman, D.A. Benfield//Virology.-1999.-V.259.-P.262-266.

184. The genetic diversity of european type PRRSV is similsr to that of the North American type but is geographically skewed within Europe / R. Forsberg, T. Storgaard, H. Nielsen et al. // Virology.-2002.-V.299.-P.38-47.

185. The level of virus-specific T-cell and macrophage recruitment in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in pigs is independent of virus load / Z. Xiao, L. Batista, S. Dee et al. // J. Virol.-2004.-V.78, №11.-P.5923-5933.

186. The nuclear localization signal of the PRRS virus nucleocapsid protein viral replication in vitro and antibody response in vivo / C. Lee, D.C. Hodgins, J.G. Calvert et al. // Adv. Exp. Med. Biol.-2006.-V.581.-V.145-148.

187. The use of endogenous and exogenous reference RNAs for qualitative and quantitative detection of PRRSV in porcine semen / S. Revilla-Fernandez, B. Wallner, K. Truschner et al. //J. Virol. Methods.-2005.-V.126, №l-2.-P.21-30.

188. Tingstedt, J.E. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study / J.E. Tingstedt, J. Nielsen // Viral Immunol.-2004.-V.17, №4.-P.558-564.

189. Transmission of SIRS virus in convalescent animals to co-mingled penmates under experimental conditions / J. Zimmerman, T. Sanderson, K. Eernisse et al. // American Assoc. Swine Pract. Newslet.-1992.-V.4.-P.25.

190. Transplacental infection following exposure of gilts to porcine reproductive and respiratory syndrome virus at the onset of gestation / C. Prieto, P. Suarez, I. Simarro et al. //Vet. Microbiol.-1997.-V.57, №4.-P.301-311.

191. Typing of porcine reproductive and respiratopy syndrome viruses by a multiplex PCR assay / S.A. Gilbert, R. Larochelle, R. Magar et al. // J. Clin. Microbiol.-1997.-V.35.-P.264-267.

192. Valicek, L. Isolation and identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in cell cultures / L. Valicek, I. Psikal, B. Smid et al. // Vet. Med.-1997.-V.42, №10.-P.281-287.

193. Validation of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus / N.H. Ferrin, Y Fang, C.R. Johnson et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-2004.-V.l 1, №3.-503-514.

194. Van Alstine, W.G. Mystery swine disease in the United States / W.G. Van Alstine / European Comm. Seminar on the New Pig Dis.-Brussels, 1991.-P.13.

195. Van Woensel, P.A. Effect on viremia of an American and European serotype PRRSV vaccine after challenge with European wild-type strains of the virus / P.A. Van Woensel, K. Liefkens, S. Demaret//Vet. Rec.-1998.-V.142, №19.-P.510-512.

196. Virological and immunological responses to porcine reproductive and respiratopy syndrome virus in a large population of gilts / L. Batista, C. Pijoan, S. Dee et al. // Can. J. Vet. Res.-2004.-V.68, №4.-P.267-273.

197. Wensvoort, G. Lelystad virus and the porcine epidemic abortion and respiratory syndrome/G. Wensvoort// Vet. Res.-1993.-V.24.-117-124.

198. Wesley, R.D. Infection with Porcine reproductive and respiratoiy syndrome virus stimulates an early gamma interferon response in the serum of pigs / R.D. Wesley, K.M. Lager, ME Jr. Kehrli // Can. J. Vet. Res.-2006.-V.70, №3.-P.176-182.

199. Wills, R.W. Susceptibility of selected non-swine species to infection with PRRS virus / R.W. Wills, F.A. Osorio, A.R. Doster // Proc. Am. Assoc. Swine Pract.-2000.-P.411-413.

200. Yoon, K.J. Antibody-dependent enhancement (ADE) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in pigs / K.J. Yoon, L.L. Wu, J.J. Zimmerman et al. // Viral Immunol.-1996.-V.9, №l.-P.51-63.

Информация о работе

Гаврилова, Вера Львовна
кандидата биологических наук
Владимир, 2007
ВАК 03.00.06

Диссертация

Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы