Оптимизация технологии культивирования вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий при разработке ассоциированной вакцины

Каримуллина, Ильсияр Габделгазизовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация технологии культивирования вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий при разработке ассоциированной вакцины
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация технологии культивирования вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий при разработке ассоциированной вакцины"

На правах рукописи

КАРИМУЛЛИНА ИЛЬСИЯР ГАБДЕЛГАЗИЗОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

ПАРАГРИППА - 3, ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ХЛАМИДИЙ ПРИ РАЗРАБОТКЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ

03.00.07 -микробиология

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Казань -2004

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (г. Казань).

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Гумеров Вали Галеевич

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РТ, доктор ветеринарных наук, профессор Угрюмова Валентина Степановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гильмутдинов Рустем Якубович

заслуженный деятель науки Российской Феде-реции, доктор ветеринарных наук, профессор Сафин Марат Абдрахманович

Ведущее учреждение:

ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИИЗЖ)

Защита состоится ЛСО^Л-_200^. в^^часов на заседании

диссертационного совета Д - 220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (420075, г. Казань, Научный городок - 2, ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИВИ'

Автореферат разослан

« /I » Отъ^ЛЯ-

2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

В.И. СТЕПАНОВ

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Сохранность молодняка сельскохозяйственных животных является одним из основных факторов обеспечения рентабельности животноводства. Однако эффективность развития его сдерживается из-за широкого распространения инфекционных заболеваний молодняка крупного рогатого скота различной этиологии. Особое место занимают инфекционные болезни респираторных органов, которые представляют группу разнородных патологий, отличающихся чрезвычайным множеством причин, включающих широкий спектр различных факторов. Основной причиной данных болезней молодняка являются инфекционные агенты, в том числе вирусы, бактерии, хламидии и другие, вирулентность которых повышается на фоне неблагоприятных условий содержания и кормления животных (Мищенко В.А. и соавт., 2000; 2003).

Многие исследователи считают, что основная роль в развитии респираторных заболеваний принадлежит вирусам и, прежде всего, вирусам парагрип-па-3, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, которые регистрируются во многих регионах нашей страны (Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1979; Гаф- . фаров Х.З., 1986; Закутский Н.И., 1998; Шипицын А.Г., 1998; Высокопоясный А.И., 2000).

В подавляющем большинстве случаев респираторные заболевания у телят протекают как смешанные инфекции. В связи с этим диагностика, а также проведение специфических и организационно-хозяйственных мероприятий должна быть комплексной.

Для специфической профилактики вирусных инфекций применяются живые и инактивированные вакцины. В последние годы в связи с тем, что живые вакцины из аттенуированных штаммов вызывают персистенцию и являются потенциально опасными в плане возможной реверсии вирусов в организме привитых животных, усилия зарубежных и отечественных ученых направлены на разработку безопасных и эффективных инактивированных препаратов для специфической защиты от этих инфекций (За Ш.И ** . , Гаффаров

Х.З., Гумеров В.Г., 2000).

Несмотря на достижения в развитии клеточной биотехнологии (Катингер X., Шейрер У., 1989; Курносов А.Н. и соавт., 1990) производство вирусного сырья на перевиваемых клетках для изготовления противовирусных препаратов до настоящего времени испытывает определенные трудности. Широко распространенный способ пристеночного выращивания клеток в матрасах ввиду малой производительности и большой трудоемкости мало пригоден для промышленного использования (Сергеев В.А., 1976). В этом отношения наиболее универсальным является роллерный способ получения клеток в круговом монослое, однако он требует тщательной отработки режимов культивирования для конкретных клеточных линий, чтобы обеспечить максимальную реализацию их ростового потенциала (Тарасов В.Н., 1990; Закутский Н.И., 1998).

1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы: разработать технологию крупномасштабного выращивания вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины.

Основные задачи:

1.Провести клинико-эпизоотологические исследования и серологический мониторинг респираторных инфекций крупного рогатого скота;

2.Изучить культурально-морфологические и биологические свойства производственных и эпизоотических штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий крупного рогатого скота;

3.Изучить факторы, влияющие на уровень накопления вирусов ПГ-3 и ИРТ в перевиваемых линиях культур клеток и хламидий в куриных эмбрионах, а также изыскать оптимальные параметры их выращивания;

4.Изготовить экспериментальные образцы инактивированной ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота и изучить их антигенность на лабораторных животных;

5. Изучить иммуногенность ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза в остром опыте на телятах.

1.3. Научная новизна. Проведены клинико-эпизоотологические исследования и серологический'мониторинг респираторных инфекций крупного ро-

гатого скота в 96 - и хозяйствах Поволжья и Урала. На основании полученных данных впервые доказана доминирующая роль вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий в респираторной патологии телят вышеуказанных регионов.

Впервые по результатам изучения биологических свойств отобраны производственные и эпизоотические штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для конструирования ассоциированной инактивированной вакцины. На основании изучения параметров культивирования этих возбудителей разработаны оптимальные условия крупномасштабной технологии их выращивания.

Проведена оценка антигенной и иммуногенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота на кроликах и телятах.

1.4. Практическая значимость. Практическая значимость работы заключается в следующем:

- на основании анализа литературы, клинико-эпизоотологических исследований и результатов серологического мониторинга установлено, что основными этиологическими агентами респираторных заболеваний телят в хозяйствах Поволжья и Урала являются вирусы парагриппа-3, инфекционного ри-нотрахеита и хламидий;

- на основании изучения культуральных и биологических свойств вирусов ПГ-3, ИРТ отобраны высокоактивные штаммы («ТМ-50» и «ТК-А»), а также чувствительные к ним перевиваемые линии культуры клеток (МДВК и TR);

-теоретически и экспериментально обоснованы технологические параметры выращивания вирусов ПГ-3 и ИРТ на культурах клеток МДВК и TR, а также хламидий на КЭ, обеспечивающие необходимый уровень накопления антигенов для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины;

-разработана технология крупномасштабного выращивания вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против вышеуказанных возбудителей;

-в опытах на кроликах доказана более высокая антигенная активность эмульсионного варианта ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3,

ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота по сравнению с ГОА- вариантом биопрепарата;

-доказана высокая протективность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота в остром опыте на телятах.

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: отчетных научных конференциях Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (Казань, 1999-2003 г.г.); Республиканской научно-производственной конференции «Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии» (Казань, 1999 г.); международной конференции «Инфекционные и инвазионные болезни» (Казань, 2000г.); Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, посвященной 30- летию института (Щелково, 2000г.); Втором съезде ветеринарных врачей республики Татарстан (Казань, 2001г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Ульяновск, 2003г.)

1.6. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в которых изложены основные положения выполненной работы.

1.7. Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты.

- результаты исследований позволили составить нормативно технические документы: « Технические условия » на ассоциированную инактивированную вакцину против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС, утвержденные директором ВНИВИ 18.12.2001г.; «Временное наставление по применению вакцины», утвержденное начальником ГУВ КМ РТ 20.01.03 г.;

- изучение клинико-эпизоотологических особенностей респираторных заболеваний телят и проведение серологического мониторинга в неблагополучных хозяйствах Поволжья и Урала;

-результаты изучения культурально-морфологических и биологических свойств производственных и эпизоотических штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и

хламидий крупного рогатого скота;

- выявление факторов, влияющих на уровень накопления вирусов ПГ-3 и ИРТ на перевиваемых линиях культур клеток, хламидий - на куриных эмбрионах;

- данные по разработке технологии крупномасштабного выращивания вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для изготовления ассоциированной инак-тивированной вакцины;

- изготовление экспериментальных образцов ассоциированной инак-тивированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота и изучение их антигенной и иммуногенной активностей на кроликах и телятах.

1.8. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают титульный лист, введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения. Список литературы включает 153 работы отечественных и 59- иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 6 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 1999-2003 годы в лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань) и неблагополучных по пневмоэнтеритам телят хозяйствах республик Татарстан, Чувашия, Удмуртия, Башкортостан, Марий Эл, а также Кировской, Самарской и Пензенской областей в соответствии с утверждёнными планами научно-исследовательских работ.

В процессе выполнения работы были использованы следующие штаммы микроорганизмов: вирус инфекционного ринотрахеита - вакцинный штамм

«ТК-А (ВИЭВ)-В 2»; эпизоотические штаммы «4016», «АК-4», «К3-32», «МР-7» и «КА-9»; вирус парагриппа - 3 - референтный штамм «ГГТК-2»; эпизоотические штаммы «ТМ-50» и «ТЛ - 5»; вирус диареи - эпизоотический штамм «ТАП »; возбудители хламидиоза крупного рогатого скота - производственный штамм «250»; эпизоотические штаммы «МЗ», «СК».

Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки крупномасштабного культивирования вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий при изготовлении ассоциированной инактивированной вакцины основывалось на анализе литературных данных, а также проведением клинико-эпизоотологических исследований и серологического мониторинга при респираторных инфекциях КРС.

Клинико-эпизоотологические исследования в неблагополучных по респираторным заболеваниям телят хозяйствах проводили общепринятыми методами.

Серологический мониторинг основывался на выявлении специфических антител к вирусам ПГ-3 в РТГА, ИРТ и ВД в РВН, аденовирусу в РНГА и хламиди-ям в РСК.

Изучение биологических свойств вирусов и бактерий является одним из необходимых условий при создании вакцинных препаратов. В связи с этим при разработке ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хла-мидиоза КРС нами проведены опыты по отбору из числа производственных и эпизоотических вирусов и хламидий наиболее перспективные для изготовления препарата.

При отборе штаммов микроорганизмов были изучены следующие их биологические свойства: устойчивость при разных температурных режимах; гемагтлю-тинирующие и гемадсорбирующие свойства; антигенная активность на лабораторных животных; выход вирусного белка в единицу объёма вируссодержащей культуральной жидкости.

С целью изучения сохраняемости вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий их выдерживали в течении 1 месяца при разных температурных режимах: и минус 40°С. При этом инфекционную активность производственных и эпизооти-

ческих штаммов вирусов определяли путем титрования на культуре клеток МДВК и TR, хламидии - на куриных эмбрионах по общепринятым методикам.

Гемагглютинирующие свойства вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидии изучали путем постановки РГА с 1% -ой суспензией эритроцитов.

Гемадсорбирующие свойства вирусов ПГ-3 и ИРТ определяли на культуре клеток МДВК и TR с использованием 0,5% взвеси эритроцитов морской свинки. РГА и изучение гемадсорбирующих свойств проводили по общепринятой методике (3. Лярский, 1980).

С целью изучения антигенных свойств штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хлами-дии крупного рогатого скота были изготовлены микросерии моновалентных эмульсионных вакцин из каждого испытуемого штамма. Антигены кроликам вводили внутримышечно в дозе 1,0 см3. Активность полученных антисывороток изучали в реакциях РВН, РТГА и РСК через 1 месяц после иммунизации.

Электронномикроскопическое изучение ультраструктуры штаммов вирусов и хламидии проводили методом негативного контрастирования. С этой целью очищенные и концентрированные материалы контрастировали фосфорновольфрамо-вой кислотой (ФВК). Полученные препараты исследовали при инструментальном увеличении х 30000 - 50000 электронного микроскопа УЕМ - 100 В (Япония).

В опытах по изучению чувствительности к вирусам ПГ-3 и ИРТ различных культур клеток были использованы перевиваемые линии : почки эмбриона коровы (МДВК), почки собаки (МДСК), почки свиньи (РК-15), почки африканской зеленой мартышки (Vero) , языка эмбриона коровы (ПЯЭК), почки эмбриона свиньи (ППЭС) и трахеи эмбриона коровы (TR).

Заражение 2-3 суточной культуры клеток (после формирования монослоя) эпизоотическими и вакцинными штаммами вирусов ПГ- 3 и ИРТ в дозе 3-4 lg ТЦД50/МЛ проводили после смены ростовой среды на поддерживающую. Инфицированные культуры клеток инкубировали при температуре 37 ± 0,5 °С до появления цитопатических изменений.

Культуры клеток, на которых происходило максимальное накопление вирусов, были использованы для изготовления ассоциированной вакцины.

При оптимизации условий культивирования штаммов вирусов ПГ-3 и ИРТ были изучены следующие параметры: возраст культуры клеток, посевная концентрация клеток, дозы заражения, состав питательной среды, смена среды в момент заражения культуры клеток, коэффициент заполнения бутылей, скорость вращения роллерных бутылей, рН среды культивирования, температура культивирования, продолжительность выращивания, количество пассажей клеток и вирусов.

Концентрацию и жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева по общепринятому методу (Р.Адамс, 1983).

Наработку биомассы вирусов ПГ-3 и ИРТ при изготовлении экспериментальных образцов ассоциированной инактивированной вакцины проводили на перевиваемых линиях культур клеток TR и МДВК на промышленной роллерной установке для культивирования клеток и вирусов в бутылях диаметром 130 ± 2мл и высотой 375 ± 3 мм «типа четверть», а также на роллерной установке промышленного типа, разработанной и изготовленной во ВНИИВиМ с использованием 96 стеклянных 3-литровых бутылей (Буреев И.А. и сотр., 1990). Получение биомассы хламидий осуществляли путём заражения 6-7 дневных куриных эмбрионов в желточный мешок и 9 - 11 дневных - в аллантоисную полость. Очистку вирусных частиц от клеточного дебриса осуществляли центрифугированием (3 тыс. об/мин -20 минут) после 3 -х кратного замораживания и оттаивания. Вирусный материал с инфекционной активностью 7,5 ^ ТЩЬо/мл и выше, а также с гемагглютинирую-щей активностью не ниже 1:32 для вируса ПГ-3 использовался для изготовления вакцины. Вируссодержащая культуральная жидкость с низким инфекционным титром подвергались концентрированию ПЭГ-6000. Биомассу хламидий получали на развивающихся куриных эмбрионах путем заражения в желточную и алланто-исную полости. Очистку и концентрирование их осуществляли согласно ранее разработанной технологии. Инактивацию вирусов и хламидий проводили 10% раствором формальдегида, в конечной концентрации -0,2% при температуре 37 °С в течение 48 часов. Полноту инактивации проверяли путем 3 -х кратного пассирования вирусов на культуре клеток, хламидий - на куриных эмбрионах.

Стандартизацию антигена вирусов ПГ-3 и ИРТ осуществляли путем замера белка на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 235 и 280.

Конечная концентрация белка в суспензии вирусного материала должна быть в пределах 1,6-2,1 мг/мл.

Для приготовления серии ассоциированной вакцины использовали смесь стандартизированных антигенов вирусов ПГ-3 и ИРТ и ресуспендировали им осадок концентрированных алюмокалиевыми квасцами хламидиосодержащий материал.

Масляный адъювант смешивали со стандартизированной вирусно - хлами-дийной смесью и эмульгировали на коллоидной мельнице.

Для проведения сравнительных опытов по изучению антигенной активности ассоциированной вакцины были изготовлены экспериментальные серии препарата, где вместо масляного адъюванта использовали гидроокисьалюминий.

Контроль стерильности экспериментальных серий ассоциированной вакцины в отношении грибов и бактерий осуществляли путем высева их на МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро. Среды с посевами выдерживали при температуре 37°С, среду Сабуро при 20±4°С. Учет результатов посева проводили окончательно через 10 дней.

Безвредность опытных серий вакцин определяли на белых мышах массой 1516 гр по 10 голов на каждую серию. Препараты вводили подкожно в дозе 0,25см3 справа и слева в области лопаток и наблюдали за ними в течение 16 суток. Вакцину считали безвредной, если в течение этого времени не наблюдалось заболевания и гибель животных.

Изучение антигенной активности экспериментальной серии ассоциированой вакцины проводили на взрослых кроликах массой 2-2,5 кг. Препараты вводили двукратно с интервалом 14 дней в дозах по 1,0 см3 подкожно в области спины. Вакцины считались иммуногенными, если они стимулировали накопление в сыворотках крови животных противопарагриппозных-3 антител в титрах 1:160-1:320 в РТГА, противогерпесвирусных антител 1:16-1:32 в РВЫ и противохламидийных антител 1:10-1:20 в РСК.

Для сравнительной оценки антигенной активности инактивированных вакцин против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота было сформировано 3 группы кроликов по 3 животных в каждой: 1-ая группа - кролики, вакцинированные ГОА вакциной; 2-ая группа - кролики, вакцинированные эмульсионной вакциной; 3-ья группа - (контрольная) не вакцинированные животные.

Вакцины кроликам вводили по 1,0 см3 внутримышечно в область бедра, а через 20 дней животных ревакцинировали в той же дозе. Перед первой вакцинацией и далее через каждые 7 дней у животных отбирали пробы крови. Сыворотки исследовали на наличие специфических антител к вирусам ПГ-3 в РТГА, ИРТ в РВН и к хламидиям в РСК. Титры антител выражали в Ь^.

Изучение иммуногенной активности ассоциированной вакцины проводилось на 9 телятах черно-пестрой породы 3-4 месячного возраста. С этой целью 6 голов телят (опытная группа) были вакцинированы ассоциированной инактивированной вакциной против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота в дозе 1,0 см3 в области шеи. Три контрольные телята (не вакцинированные) были подвергнуты обработке полиспецифической сывороткой против вышеуказанных возбудителей в дозе 0,5 см3 на 1кг массы животных. В течение 40 дней опытные и контрольные телята находились в хозяйстве. По истечении этого срока все животные были завезены в лабораторию контроля и индикации возбудителей вирусных и хлами-дийных инфекций ВНИВИ и подвергнуты контрольному заражению эпизоотическими штаммами возбудителей ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота.

У всех животных до заражения и в течение 20 дней после него ежедневно определяли температуру тела, пульс и частоту дыхательного движения. Кроме того, с целью реизоляции введенных возбудителей в первые 15 дней с момента инфицирования от животных брали пробы носовых и глазных истечений. В дальнейшем этими материалами инокулировали культуру клеток TR и МДВК, а также - развивающиеся куриные эмбрионы.

Взятие крови на серологические и гематологические исследования проводили до заражения, а также на 6-ой и 20 дни после инфицирования эпизоотическими штаммами. На 22-ой день после заражения провели контрольный убой

по I теленку из каждой группы для патоморфологических исследовании. Данные исследования проводили совместно с доктором ветеринарных наук кафедры па-танатомии КГАВМ Авзаловым Ф.З.

Отдельные этапы по культивированию хламидий, а также серологические исследования проводили совместно с профессором Хамадеевым Р.Х., с.н.с. Евсти-феевым В.В. и Хусаиновым Ф.М.

Статистическую обработку цифрового материала, полученного в ходе исследований, проводили согласно методическим рекомендациям "Математическая обработка экспериментального материала на программируемых микрокалькуляторах типа "Электроника" - МК-56 (Тукшаитов Р.Х., 1984).

3. Результаты исследований

3.1. Клинико-эпизоотологические исследования и серологический мониторинг респираторных заболеваний КРС в неблагополучных хозяйствах

Клинико - эпизоотологическими исследованиями было установлено, что пневмоэнтериты чаще регистрируются в осенне-зимний и зимне-весенний периоды в комплексах по откорму КРС или племенных хозяйствах, где комплектация стад происходит за счет хозяйств-поставщиков. Клинические признаки у больных телят характеризовались повышением температуры тела до 41-42 °С, снижением аппетита, появлением сухого кашля, истечениями из носовой полости, нередко из глаз, отмечалась диарея, учащение пульса и дыхания. Иногда у животных развивался серозный конъюнктивит и ринит. Позднее истечения из носа становились слизисто-гнойными. Учитывая то обстоятельство, что на современном этапе ведения животноводства, связанное с уменьшением числа крупных комплексов, все более актуальным становится борьба с респираторными инфекциями в репродук-торных хозяйствах.

Проведен серологический мониторинг в 96-и неблагополучных по респираторным заболеваниям телят хозяйствах 9-и республик и областей Поволжья и Урала. Результаты исследований показали, что наибольший процент положительно реагирующих проб сыворотки крови выявлен к вирусу ПГ-3 (76,0 %), ИРТ (31,4%) и хламидиям (28,0 %). Учитывая это обстоятельство, антигены вышеука-

занных инфекционных агептов были включены в состав разрабатываемой ассоциированной вакцины.

3.2. Изучение культурально-морфологических и биологических свойств производственных и эпизоотических штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий Одним из важных критериев оценки биологических свойств микроорганизмов является изучение их стабильности при разных температурах. Опыты показали, что все штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий не теряли свою инфекционную активность в течение 1 месяца (срок наблюдения) при температуре - 40°С, а при температуре 4-8°С в эти же сроки их исходные титры или сохранялись или уменьшались всего на 0,25-0,5 lg ТЦД 5 О/мл. Следует также отметить, что при 37°С сопровождалось быстрое их снижение и к 30 -му дню они полностью утрачивали инфекционную активность.

Антигенную активность производственных и эпизоотических штаммов вирусов и хламидий изучали на кроликах. Анализ результатов исследований показал, что эпизоотический штамм «ТМ-50» вируса ПГ-3 был более иммуногенен, чем производственный штамм «ПТК-2» и эпизоотический «ТЛ-5». При изучении антигенной активности 6-и штаммов вируса ИРТ было установлено, что штаммы «ТК-А», «КА-9» и «КЗ-32» интенсивнее вызывали выработку антител у кроликов, чем - «4016», «МР-7» и «АК-4».

При исследовании сывороток крови лабораторных животных в РСК к хлами-диям установлено, что все 3 штамма - «250», «МЗ» и «СК» имели одинаковую антигенную активность.

При изучении гемагглютинирующих свойств производственных и эпизоотических штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий было установлено, что ни один из штаммов вируса ИРТ и хламидий не вызывали агглютинацию эритроцитов морской свинки. В то же время все 3 штамма вируса парагриппа-3 агглютинировали 1%-ные эритроциты морской свинки и вызывали их диффузную адсорбцию на культуре клеток TR.

При разработке инактивированных вакцин большую роль играет не только инфекционная активность вируса на культуре клеток, но и концентрация вирус-специфического белка в культуральной вирусной биомассе. Результаты проведенных нами исследований показали, что в штамме «ТМ-50» вируса ПГ-3, «ТК-А» и «МР-7» вируса ИРТ наличие белка в вируссодержащей культуральной жидкости было на 1,2 -3,6 мг/мл выше, чем в остальных исследованных штаммах.

Опыты по изучению ультраструктуры штаммов вируса ПГ-3 и хламидий показали, что эпизоотические и производственные штаммы не имели существенных различий по морфологическим характеристикам.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в вируссодержащей культуральной жидкости ИРТ могут присутствовать 4 вида вирионов: безоболочные - «голые» вирионы; с суперкапсидной оболочкой; «полные» - с оптический-плотным нуклеотидом и «пустые» - с прозрачной сердцевиной.

Суперкапсидная оболочка вирионов в основном определяет вирулентность и иммуногенность герпесвирусов. Если в вирусной биомассе, используемой для изготовления инактивированного препарата, содержится хотя бы 10% вирионов с суперкапсидной оболочкой, то этого достаточно, чтобы индуцировать в организме животного синтез вируснейтрализующих антител.

Электронномикроскопическими исследованиями 6- и штаммов вируса ИРТ было установлено, что наибольшее число оболочных вирионов (50%) выявлялись в популяции вакцинного штамма «ТК-А». При количественном подсчете вирусных частиц в других штаммах вируса ИРТ было установлено, что популяции эпизоотических штаммов «АК-4» и «МР-7» состояли из оболочных вирионов на 40%, «4016» и «КЗ-32» на- 25% и «КА-9» - на 10%.

Таким образом, опыты по изучению культурально- морфологических и биологических свойств эпизоотических и производственных штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий позволили нам отобрать наиболее перспективные из них для изготовления ассоциированной вакцины. Это штаммы «ТМ-50» вируса ПГ-3, «ТК-А» - ИРТ и «250» хламидий.

33. Изучение чувствительности различных линий культур клеток к вирусам ПГ-3, ИРТ и хламидиям КРС

Выбор эффективных биологических моделей для наработки высокоурожайной биомассы микроорганизмов является одним из ключевых моментов при разработке средств диагностики и специфической профилактики инфекционных заболеваний животных.

В связи с этим нами были изучены чувствительность к эпизоотическим и производственным штаммам вирусов ИРТ и ПГ-3 клеточные линии различного происхождения. Результаты исследований показали, что все 4 штамма вирусов ИРТ и ПГ-3 хорошо репродуцировались в перевиваемых линиях культуры клеток МДВК и ТЯ, сохраняя высокую инфекционную активность во всех последующих пассажах.

Все известные штаммы хламидий хорошо размножаются в развивающихся куриных эмбрионах. Учитывая это обстоятельство, а также полученные нами отрицательные результаты по адаптации и культивированию эпизоотических («МЗ» и «СК») и производственного «250» штаммов хламидий в культурах клеток МДВК, ТЯ и ФЭК, наработку их биомассы проводили на куриных эмбрионах.

Таким образом, оптимальными биологическими моделями для получения биомассы вирусов ПГ-3, ИРТ являются культуры клеток МДВК и ТЯ, а к хлами-диям - куриные эмбрионы.

3.4. Изучение факторов, влияющих на накопление вирусов в культуре клеток

Отбор высокочувствительных биологических моделей и стабильных при культивировании в них с высокими инфекционными и антигенными активностями штаммов вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий позволили нам в дальнейшем направить усилия на разработку крупномасштабной технологии их выращивания. С этой целью изучали влияния на накопление вирусов способов культивирования (стационар, роллер), возраст культуры клеток, посевную концентрацию, условия инфицирования клеток, дозы заражения, продолжительность культивирования и др. Результаты комплексных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Оптимальные условия роллерного культивирования вирусов ПГ - 3 и ИРТ на культурах клеток МДВК и TR

Ks п/п Наименование параметров Культур Щ а клеток (ВК Культура клеток ТТ1

шт. ТК-А вируса ИРТ шт. ТМ-50 вируса ПГ-3 шт. ТК-А вируса ИРТ шт. ТМ-50 вируса ПГ-3

1 Скорость вращения роллерных бутылей (об/час.) 10-11 10-11 10-11 10-11

2 Посевная концентрация клеток (тыс/см3) 110-130 110-130 110-120 100-110

3 Возраст культуры клеток (сутки) 2-3 2-3 3-4 3-4

4 Доза заражения (ТЦД50/мег*а) 0,2-1,0 0,3 -1,0 0,2-1,0 0,3-1,0

5 рН среды культивирования 7,2±0,2 7,2±0,2 7,2±0,2 7,2±0,2

6 Продолжительность выращивания (час) 36-48 64-72 40-64 72-96

7 Температура культивирования (С) 37±0,5 37±0,5 37±0,5 37±0,5

8 Питательная среда Игла МЕМ с глута-мином и антибиотиками ГЛА - 50%, Игла МЕМ -40%, среда 199-10%

9 Смена среды в момент заражения культуры клеток 2 — 3 х кратная промывка монослоя, контакт вируса с клеткой без среды 30-45 мин.

10 Коэффициент заполнения бутылей 0,17-0,19 0,17-0,19 0,16-0,18 0,16-0,18

11 Инфекционная активность вирусов (1й ТЦДДо см3) 6,5-8,0 6,75-7,8 6,5-7,75 6,75- 8,0

Полученные результаты при оптимизации условий культивирования производственного штамма «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса ИРТ и эпизоотического штамма «ТМ-50» вируса ПГ-3 позволили использовать их в качестве исходных данных и разработать эффективную крупно-масштабную технологию производства вирусного сырья.

3.5. Изготовление и контроль экспериментальных образцов ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС

Анализ данных литературы и результатов, проведенных эпизоотологических и серологических исследований, показал полиэтиологичность респираторных заболеваний телят. Учитывая вышеизложенное, нами проведены опыты по разработке ассоциированной инактивированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ранотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота. Как известно при изготовлении инактивированных вакцин против вирусных болезней животных широко используются адъюванты минерального (гидроокись алюминия), растительного (сапонины) и искусственного (масленые) происхождения. Исходя из вышесказанного, нами были изготовлены два варианта ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС. В первом препарате в качестве адьюванта использовали ГОА, а во 2-ом - минеральное масло с ланолином. Технологический процесс изготовления вакцин включал в себя следующие этапы: 1) приготовление матровых рас-плодок вирусов ПГ-3 и ИРТ для заражения культуры клеток МДВК и TR, а также суспензий для инфицирования куриных эмбрионов; 2) выращивание клеток в соответствующих оптимальных условиях и подготовка куриных эмбрионов соответствующего возраста и кондиций в объеме, позволяющим получить необходимую производственную партию биомассы; 3) репродукция и сбор биомассы вирусов пара-гриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий; 4) инактивация расплодки вирусов и хламидий; 5) осветление, концентрирование, стандартизация антигенов по белку; 6) составление производственной серии ассоциированной вакцины; 7) расфасовка вакцины во флаконы и контроль ее стерильности безвредности и иммуноген-ной активности на лабораторных животных. Следует также отметить, что важным этапом при изготовлении инактивированных вакцин является контроль биопрепаратов. Проведенные нами контроли различных серий ассоциированной вакцины на стерильность, безвредность, полноту инактивации и антигенную активность показали, что биопрепараты соответствуют требованиям, предъявляемым к инактивиро-ванным вакцинам.

3.6. Изучение антигенной активности ассоциированной инактивиро-ванной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС

Антигенную активность двух вариантов (ГОА и эмульсионная) вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС изучали на кроликах, результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика уровней антител у кроликов после введения вакцин против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота

№ п/п групп Вид использованной вакцины Уровень антител к вирусу ПГ - 3 в РТГА (^2)

Дни исследования

0 7 14 Ревакцинация 21 30 60 90

1 ГОА - вариант вакцины 1,3 1,8 2,8 4,2 7,0 6,8 6,0

2 Эмульсионный вариант вакцины 1,0 1,6 2,4 4,0 8,5 8,8 8,4

3 Контрольные кролики 2,0 2,0 1,6 1,3 1,0 0,6 0,5

Уровень антител к вирусу ИРТ в РВН(1о§2)

1 ГОА — вариант вакцины 0 1,4 2,6 3,5 4,0 3,7 3,1

2 Эмульсионный вариант вакцины 0 0 3,0 4,6 6,4 6,4 6,2

3 Контрольные кролики 0 0 0 0 0 0 0

Уровень антител к хламидиям в РСК (1о£г)

1 ГОА - вариант вакцины 1,6 1,9 2,8 3,2 4,0 3,9 3,5

2 Эмульсионный вариант вакцины 1,7 1,8 3,5 3,8 5,0 6,0 5,5

3 Контрольные кролики 2,2 2,0 2,0 1,4 1,2 1,0 0,8

Результаты исследований показали, что у всех кроликов после введения вакцин происходит нарастание титров специфических антител, которые достигают максимального значения к 2-3 -м месяцам. При этом антитела у животных к вирусу ПГ-3 были на 6,2-8,2 1о^, к вирусу ИРТ на 3,7 - 6,4 и к хламидиям на 2,9-5,0 1с^2 выше, чем у контрольных не вакцинированных кроликов. Установлено, что эмульсионный вариант ассоциированной инактивированной вакцины обладал более высокой иммуногенной активностью, чем ГОА вакцина.

3.7 Оценка иммуногенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота на телятах

Изучение иммуногенности ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС проводили в остром опыте на 3-4 -х месячных телятах. В ходе опыта у животных изучали клинический статус, а также проводили серологические, вирусологические и патологоанатомические исследования. Клинические наблюдения показали, что однократная вакцинация телят не вызывала повышения температуры тела и на месте инъекции препарата не выявлялись патологические изменения. После экспериментального заражения животных эпизоотическими штаммами вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий только у 2-х телят опытной группы на 2-3 сутки наблюдали незначительное повышение температуры. У всех животных из контрольной группы отмечался подъем температуры тела до 40,6°С, которая сохранялась в течении 18 суток с момента инфицирования.

Вирусологические и бактериологические исследования клинических материалов, взятых из опытных групп телят, дали отрицательные результаты. Следует отметить, что все использованные эпизоотические штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для заражения невакцинированных животных выделялись с носовыми секретами в период клинического проявления респираторного заболевания.

Результаты серологических исследований показали, что практически у всех животных до вакцинации либо отсутствовали антитела к вирусам и хламидиям

или они выявлялись в титрах ниже диагностического уровня. При исследовании сывороток крови через 1,5 мес. после вакцинации был выявлен подъем уровня антител, который колебался в пределах к вирусу ПГ-3 в РТГА; 3,0-5,0

- к хламидиям в РСК. Серологическими исследованиями, проведенными после заражения животных, установлено увеличение титров антител к вирусам ПГ-3 до 1:2560, к ИРТ- 1:128 и хламидиям - 1:80 у опытных групп телят. У контрольных животных они достигали лишь диагностического уровня.

Результаты гематологических исследований показали, что у всех животных на 6-ой день после заражения эпизоотическими штаммами вирусов и хламидий как в опытной, так и в контрольной группах происходило снижение уровня гемоглаби-на, а также количества эритроцитов в крови. На 20-й день исследования все эти показатели достигали первоначального уровня. Следует отметить, что у телят контрольной группы на протяжении всего опыта наблюдался лейкоцитоз.

Патологоанатомическими исследованиями, проведенными на 22 -ой день после заражения, было установлено, что у вынужденно убитых животных из опытной группы видимых патологических изменений в органах и тканях не обнаружено. Однако при исследовании трупа теленка из контрольной группы была выявлена типичная картина респираторной патологии.

Лабораторные испытания в остром опыте на телятах ассоциированной инак-тивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС показали, что биопрепарат стерилен, ареактогенен и обеспечивает формирование иммунитета, способного защитить животных от экспериментальной парагриппозной, герпесвирус-ной и хламидийной инфекции.

Таким образом, анализ литературы, а также проведение клинико-эпизоотологических и серологических исследований показал полиэтиологичность респираторных заболеваний телят в неблагополучных хозяйствах Поволжья и Урала, где основными этиологическими агентами являются вирусы ПГ-3, ИРТ и хламидий.

На основании изучения культуральных и биологических свойств отобраны высокоактивные производственные и эпизоотические штаммы вирусов ПГ-3 и ИРТ, а также чувствительные к ним перевиваемые линии культуры клеток.

Изучены технологические параметры выращивания вирусов ПГ-3 и ИРТ на культурах клеток МДВК и ТЯ, а также хламидий на КЭ, которые позволили разработать технологию крупномасштабного получения их биомассы.

По проведению проведенных исследований изготовлены экспериментальные образцы ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хла-мидиоза КРС. Лабораторные испытания показали стерильность, безвредность и высокую антигенную и иммуногенную активность биопрепарата.

На основании результатов исследований разработаны нормативно-технические документы: «Технические условия» на ассоциированную вакцину, утвержденные директором ВНИВИ 18.12.2001 г. и «Временное наставление по применению биопреперата», утвержденное начальником ГУВ КМ РТ 20.01.2003 г.

4. Выводы

1. На основании клинико-эпизоотических и лабораторных исследований в 96 наблагополучных по респираторным заболеваниям телят хозяйств Поволжья и Урала установлен их смешанный характер и высокая конверсия специфических антител к вирусам ПГ-3(76%), ИРТ(31,4%) и хламидиям (28%).

2. Эпизоотический штамм «ТМ-50» вируса ПГ-3, выделенный в неблагополучном хозяйстве, а также производственные штаммы «ТК-А (ВИЭВ)- В2» вируса ИРТ и «250» - хламидий по своим культурально-морфологическим и биологическим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым к антигенам микроорганизмов, используемым для изготовления ассоциированных инактивированных вакцин.

3. Перевиваемые линии культур клеток МДВК и ТЯ, обладая высокой чувствительностью и являясь оптимальными моделями для культивирования вирусов ПГ-3 и ИРТ, позволяют накапливать высокоактивные антигены для конструирования ассоциированной вакцины.

4. Разработана опытно-промышленная технология выращивания эпизоотического штамма «ТМ-50» вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в роллерной культуре перевиваемых клеток TR с высокой биологической активностью (6,75-8,0 lg ТЦД 50/см3), включающая следующие параметры; скорость вращения - 11 об/час; посевная концентрация - 100-110 тыс/см3; возраст культуры клеток - 3-4 сутки; множественность заражения - 0,3-1,0 ТЦД 50/кл; смена питательной среды (ГЛА-50%, Игла МЕМ-40%, среда 19910%) перед заражением (контакт вируса с клеткой 30-45 мин.); коэффициент заполнения - 0,17±0,02; температура культивирования - 37±0,5°С; рН -7,2±0,2; продолжительность выращивания - 72-96 часов.

5. Разработана опытно-промышленная технология выращивания производственного штамма «ТК-А (ВИЭВ) - В2» вируса ИРТ крупного рогатого скота в роллерной культуре перевиваемых клеток МДВК с высокой биологической активностью (6,5-8,0 ^ТЦД 50/см3), включающая следующие параметры: посевная концентрация клеток -110-130 тыс/см3; возраст культуры клеток - 2-3 суток; доза заражения - 0,2-1,0 ТЦД 50/кл; смена питательной среды Игла MEM с глутамином-1% перед заражением (контакт вируса с клеткой 30-45 мин); коэффициент заполнения - 0,18±0,02, рН - 7,2±0,2; температура культивирования - 37±О,5°С; продолжительность выращивания -36-48 часов.

6.Контроль экспериментальных серий ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота на стерильность, безвредность, вирулентность, антигенность и иммуногенность показал, что биопрепараты соответствуют требованиям, предъявляемым к инактивированным вакцинам.

7.Сравнительное испытание ГОА и эмульсионной вакцин показало, что последняя обладает более высокой антигенной активностью; при этом минеральное масло является перспективным адьювантом при конструировании эмульгированных вакцин.

8.Испытание на антигенность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза на кроликах после двукратного введения обеспечивало максимальную выработку специфических антител (к 2-3 мес.) в титрах 8,8 log2 к вирусу ПГ-3 в РТГА, 6,4 log2 к вирусу ИРТ в РН и 6,0 log2 к хламидиям в РСК.

9. Испытание иммуногенности на телятах ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота показало, что она в дозе 1,0 см3 обеспечивает формирование иммунитета, способного защитить животных от вирусно-хламидийной инфекции и возможность использования вакцины в ветеринарной практике.

5. Практические предложения

1. Технические условия на:«Ассоциированную вакцину против парагриппа-З, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инак-тивированную эмульсионную», утвержденную директором ВНИВИ, 18 декабря 2001.

2. Временное наставление по применению ассоциированной эмульсионной вакцины против парагриппа-З, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота, утвержденное Начальником Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан 20.01.2003.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гумеров В.Г., Каримуллина И.Г., Угрюмова B.C., Равилов А.З. Разработка схемы гипериммунизации животных доноров ассоциированной вакциной для изготовления полиспецифической сыворотки //Матер. конф.« Актуаль. пробл. животноводства и ветеринарии. - Казань, -1999.- С.25.

2. Гумеров В.Г., Каримуллина И.Г., Матвеева Л.И. Оптимизация условий рол-лерного культивирования вирусов ПГ-3 и ИРТ на перививаемых линиях культур клеток //Матер. конф.« Актуаль. пробл. животноводства и ветеринарии». - Казань,/ -1999.-С.25

3. Гумеров В.Г., Матвеева Е.Л., Шошокин В.А, Каримуллина И.Г., Матвеева Л.И., Гизатуллина А.С. Изучение ультраструктуры вакцинного и эпизоотического штаммов вируса ИРТ. // Матер.междун. конф.« Инфекционные и инвазионные болезни».- Казань,-2000. - С. 49-50.

4. Каримуллина И.Г. Чувствительность различных культур клеток к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота// Матер, междун. конф. « Инфекционные и инвазионные болезни».- Казань,-2000. - С. 71.

5. Гумеров В.Г., Хамадеев Р.Х., Каримуллина И.Г., Хусаинов Ф.М., Угрюмова B.C., Равилов А.З. Изучение иммуногенности ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС на телятах в остром опыте. // Тезисы докл. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково, - 2000. -С.43-45.

6. Гумеров В.Г., Хамадеев Р.Х., Каримуллина И.Г., Хусаинов Ф.М., Угрюмова B.C., Равилов А. З. Специфичекая профилактика смешанных респираторных инфекций молодняка крупного рогатого скота. // Труды второго съезда врачей Респ. Татарстан. -Казань, - 2001. -С. 150-152.

7. Гумеров В.Г., Ахметсафин Р.Г., Каримуллина И.Г., Угрюмова B.C., Равилов А.З., Коннов М.Н. Серологический мониторинг вирусных респираторных инфекций телят.// Матер, междун. науч. практ.конф. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». -Ульяновск, - 2003. - С. 146.

Подписано в печать 09.04.2004г. Заказ №43. Формат 60 х 84 1/16

Усл. п. л. 1,0 Офсетный участок ВНИВИ (г. Казань)

и-78 64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каримуллина, Ильсияр Габделгазизовна

Введение.

1.Обзор литературы.

1.1. Этиологическая структура респираторных заболеваний телят.

1.2. Технология культивирования вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для изготовления средств специфической профилактики респираторных инфекций крупного рогатого скота.^

1.3. Специфические меры борьбы и профилактики респираторных заболеваний телят.

Собственные исследования.

2. Материалы и методы исследований.

2.1.Штаммы микроорганизмов.

2.2. Культуры клеток.

2.3. Питательные среды и растворы.

2.4. Куриные эмбрионы.

2.5. Подопытные животные

2.6. Аппаратура для культивирования.

2.7. Клинико-эпизоотологические исследования респираторных заболеваний телят.

2.8. Серологические исследования.

2.9.Изучение биологических свойств вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий и оптимизация параметров их культивирования.

2.10. Изготовление лабораторных образцов ассоциированной инактиви-рованной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота.

2.11. Оценка антигенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза на кроликах.^

2.12. Изучение антигенных и иммуногенных свойств ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза на телятах.

2.13. Статистическая обработка результатов исследований.

3. Результаты исследований.

3.1. ЬСпинико-эпизоотологические исследования и серологический -мониторинг ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах.

3.2. Изучение и оптимизация параметров культивирования вирусов

ПГ-3, ИРТ и хламидий крупного рогатого скота.

3.2.1. Изучение культурально — морфологических и биологических свойств производственных и эпизоотических штаммов вирусов

ПГ- 3, ИРТ и хламидий.

3.2.2. Изучение чувствительности различных линий культур клеток к вирусам ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота.

3.2.3. Изучение факторов, влияющих на накопление вирусов в культурах клеток и хламидий в куриных эмбрионах.

3.3; Изготовление экспериментальных образцов ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота и изучение их антигенной активности на кроликах.

3.4. Контроль качества экспериментальных серий ассоциированной инактивированной эмульсионной: вакцины,против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота.

3.5. Оценка иммуногенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота на телятах.

4. Обсуждение результатов исследований.

5. Выводы.

6. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация технологии культивирования вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий при разработке ассоциированной вакцины"

Актуальность темы. Сохранность молодняка сельскохозяйственных животных- является одним из основных факторов- обеспечения рентабельности животноводства. Однако эффективность развития его сдерживается из-за широкого распространения, инфекционных заболеваний молодняка крупного рогатого * скота различной этиологии. Особое место-занимают инфекционные болезни респираторных органов, которые представляют группу разнородных: патологий, отличающихся.чрезвычайным; множеством причин, включающих широкий спектр различных факторов. Основной; причиной: данных болезней; молодняка являются; инфекционные агенты, в том числе вирусы, бактерии,. хламидии и: другие, вирулентность которых повышается на фоне неблагоприятных условий содержания и кормления животных (Мищенко В:А. и сотр., 2000; 2003) .

Респираторные болезни являются основной причиной потерь среди телят послеотъемного периода. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов, заболевания' органов дыхания у телят превалируют над всеми- остальными болезнями (Данилевский В.М., 1985; Конопелько ПЯ., Клименков К.П:, 1987; Равилов А;3., Гаффаров Х.З:, Гумеров В.Г.,2000; Басова Н.Ю.,2002; Bruson D.G;,1996).

Многие исследователи считают, что основная роль в развитии респираторных заболеваний; принадлежит вирусам: и,, прежде всего, вирусам парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, которые регистрируются во многих регионах нашей страны (Сюрин В:Н., Фомина Н.В., 1979; Гаффаров Х.З., 1986; Закутский Н.И., 1998; Шипицын А.Г.,1998; Высокопоясный А.И., 2000).

Для специфической профилактики вирусных инфекций применяются; живые и инактивированные вакцины. В последние годы в связи с тем, что живые вакцины! из аттенуированных штаммов вызывают персистенцию и являются потенциально опасными в плане возможной; реверсии вирусов в организме привитых животных, усилия, зарубежных и отечественных ученых направлены на разработку безопасных и эффективных инактивированных препаратов для специфической защиты от этих инфекций (Закутский; Н.И: и сотр., 1997; Равилов А.З., Гаффаров Х.З;, Гумеров В.Г., 2000).

Несмотря на достижения в развитии клеточной биотехнологии (Катингер X.; Шейрер У., 1989; Курносов;А.Н. и сотр., 1990) производство вирусного сырья г на перевиваемых клетках для изготовления противовирусных: препаратов до настоящего времени испытывает определенные трудности: Широко распространенный; способ пристеночного выращивания; клеток в матрасах ввиду малой производительности и большой трудоемкости мало пригоден для промышленного использования (Сергеев; В1А.,1976).В этом отношении наиболее универсальным является роллерный способ» получения клеток в круговом; монослое, однако он требует тщательной отработки режимов культивирования для» конкретных клеточных линий, чтобы обеспечить максимальную реализацию их ростового? потенциала (Тарасов В.Н.,1990; Закутский Н:И;, 1998).

Цель исследований: Разработать технологию крупномасштабного выращивания вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для» изготовления ассоциированной инактивированной вакцины.

Основными задачами исследований являлись:

3.Изучить факторы, влияющие на уровень накопления вирусов ПГ-3 и ИРТ в перевиваемых линиях культур клеток и хламидий в куриных эмбрионах, а также, изыскать оптимальные параметры их выращивания;

5 .Изучить иммуногенность ассоциированной инактивированной! вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза в остром опыте на телятах.

Научная новизна:

Проведены клинико-эпизоотологические исследования и серологический мониторинг респираторных инфекций крупного рогатого скота в 96 — и хозяйствах Поволжья и Урала. На основании полученных данных подтверждена доминирующая роль вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий в респираторной патологии телят вышеуказанных регионов.

Впервые по результатам изучения биологических свойств отобраны производственные и эпизоотические штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для конструирования ассоциированной инактивированной вакцины. На основании изучения параметров культивирования этих возбудителей предложены оптимальные условия крупномасштабной технологии их выращивания.

Практическая значимость::

Практическая значимость работы заключается в следующем:

-теоретически и экспериментально обоснованы технологические параметры выращивания; вирусов ПГ-3 и ИРТ на культурах клеток МДВК и ТЯ, а также хламидий на КЭ, обеспечивающие необходимый' уровень накопления антигена для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины;

-разработана технология крупномасштабного; выращивания; вирусов ПГ-3, ИРТ и хламидий для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против вышеуказанных возбудителей;

-в опытах на кроликах: доказана более высокая антигенная активность эмульсионного варианта ассоциированной инактивированной вакцины против; ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота по сравнению с ГОА- вариантом биопрепарата;

-доказана; высокая протективность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота в остром опыте на телятах.

-результаты проведенных исследований позволили составить нормативно-технические документы: «Технические условия» на ассоциированную * вакцину против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза- крупного рогатого скота, утвержденные директором ВНИВИ 18 декабря 2001г.; «Временное наставление по применению вакцины», утвержденного начальником Главного управления ветеринарии кабинета Министров республики Татарстан 20 января 2003г.

На защиту выносятся следующие основные положения:

- данные клинико-эпизоотологических особенностей проявления респираторных заболеваний телят и результаты проведения серологического? мониторинга в неблагополучных хозяйствах Поволжья и Урала;

- определение культурально-морфологических и биологических свойств производственных и эпизоотических штаммов вирусов. ПГ-3, ИРТ и хламидий крупного рогатого скота;

- данные по разработке технологии крупномасштабного выращивания вирусов ПГ-3, ИРТ и: хламидий для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины;

- изготовление экспериментальных образцов ассоциированной инактивированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита И; хламидиоза крупного рогатого скота и оценкам их антигенной и иммуногенной активностей на кроликах и телятах.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены на: отчетных научных конференциях Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (Казань, 1999-2003 г.г.); Республиканской научно-производственной конференции «Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии» (Казань, 1999г.); международной конференции «Инфекционные и инвазионные болезни» (Казань, 2000г.); Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, посвященной 30-летию института (Щелково, 2000г.); Втором съезде ветеринарных врачей республики Татарстан (Казань, 2001г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Ульяновск, 2003г.)

Публикация результатов исследований:

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают титульный лист, введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения. Список литературы включает 158 работ отечественных и 59 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 6 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каримуллина, Ильсияр Габделгазизовна

5.Выводы

1. На основании клинико-эпизоотических и лабораторных исследований в 96 неблагополучных по респираторным заболеваниям телят хозяйств Поволжья и Урала установлен их смешанный характер и высокая конверсия специфических антител к. вирусам ПГ-3(76%),. ИРТ(31,4%) и хламидиям (28%).

2. Эпизоотический штамм «ТМ-50» вируса ПГ-3,. выделенный в неблагополучном хозяйстве, а также производственные штаммы «ТК-А (ВИЭВ)- В2» вируса ИРТ и «250» - хламидий по своим куль-турально-морфологическим и биологическим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым антигенам микроорганизмов, используемым для изготовления ассоциированных инактивированных вакцин.

3. Перевиваемые линии культур клеток МДВК и TR, обладая высокой чувствительностью и являясь оптимальными моделями для культивирования вирусов ПГ-3 и ИРТ, позволяют накапливать высокоактивные антигены для конструирования ассоциированной вакцины.

4. Разработана опытно-промышленная технология выращивания эпизоотического штамма «ТМ-50» вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в роллерной культуре перевиваемых клеток TR с высокой биологической активностью (6,75-8,0 lg ТЦД 5О/см3), включающая следующие параметры; скорость вращения 11 об/час; посевная концентрация 100-110 тыс/см ; возраст культуры клеток 3-4 сутки; множественность заражения 0,3-1,0 ТЦД 50/кл; смена питательной среды (ГЛА-50%, Игла МЕМ-40%, среда 199-10%) перед заражением (контакт вируса с клеткой 30-45 мин.); коэффициент заполнения 0,17±0,02; температура культивирования 37±0,5°С; pH 7,2±0,2; продолжительность выращивания 72-96 часов.

5. Разработана' опытно-промышленная технология выращивания производственного штамма «ТК-А (ВИЭВ) - В2» вируса ИРТ крупного рогатого скота в роллерной культуре перевиваемых клеток МДВК с высокой биологической активностью (6,5-8,0 lgTUA 50/см3), включающая, следующие параметры:, посевная концентрация: клеток 110-130 тыс/см ; возраст культуры клеток 2-3 суток; доза заражения 0,2-1,0 ТЦД 50/кл; смена питательной среды Игла MEM с глутамином-1 % перед заражением (контакт вируса с клеткой 30-45 мин); коэффициент заполнения 0,18±0,02, рН 7,2±0,2; температура культивирования 37±0,5°С; продолжительность выращивания 36-48 часов.

6. Контроль экспериментальных серий ассоциированной инактивиро-ванной< вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота на стерильность, безвредность, вирулентность, антигенность и иммуногенность показал, что биопрепараты соответствуют требованиям, предъявляемым к инактивированным вакцинам.

7.Сравнительное испытание: ГОА и эмульсионной; вакцин показало, что последняя обладает более высокой антигенной активностью; при этом минеральное масло является перспективным адъювантом при конструировании эмульгированных вакцин.

8 Испытание на: антигенность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза на кроликах после двукратного введения обеспечивало максимальную выработку специфических антител (к 2-3 мес.) в титрах 8^8 log2 к вирусу ПГ-3 в РТГА, 6,4 log2 к вирусу ИРТ-в РН и 6,0 log2 к хламидиям в РСК.

9. Испытание иммуногенности на телятах ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота показало, что она в дозе 1,0 см обеспечивает формирование иммунитета, способного защитить животных от вирусно-хламидийной инфекции и-возможность использования вакцины в ветеринарной практике.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Технические условия на: «Ассоциированную вакцину против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированную эмульсионную», утвержденную директором ВНИВИ, 18 декабря 2001.

2. Временное наставление по применению ассоциированной эмульсионной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота, утвержденное начальником Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан 20 января 2003.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каримуллина, Ильсияр Габделгазизовна, Казань

1. Азаренко B.C., Музычин С.И., Корольков В.И;, Андросов В.А. К вопросу эпизоотологии: вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота.// Актуаль. вопросы вет. вирусологии. Тез. и докл. 5 Всесоюзн. вет. вирусолог, конф.- Казань, 1980. -С. 17-18.

2. Андреев Е.В., Белоконь B.C., Ракитянская Т.П. и сотр. Распространение парагриппа КРС в.УССР.// Тез. докл. Всесоюз. межвуз. науч. конф. по вет. вирусологии. -М., 19731 -Т.2. -С.46.

3. Атамась В.А., Масленникова С.И. Смешанная инфекция у телят вызванная вирусом, парагриппа-3; и аденовирусом.// Инфекц. и инваз. болезни с.-х. животных и птиц. -Одесса, 1983.-С.8-12.

4. Багданос И.И., Гельжинис A.B., Тамашаускене Б.И. Серологические исследования больных респераторными заболеваниями телят.// Актуал. вопросы вет. вирусологии. Тез. докл. конф. -Казань, 1980.-C.48i

5. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период. // Бюл. ВНИИ экспер. вет. -1983-№ 50. -С.6-8.

6. Бакулов И.А., Юрков Г.Г., Ведерников В:А., Песковацков А.П. Метод эпизоотологического исследования. В кн.:: Актуал. вопр. общей эпизоот. Труды Всесоюзн. конф. по общей эпизоот. М.: МВА, 1974,-Т.74, -С.41-48.

7. Ю.Басова Н:Ю. Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота инфекционной этиологии в условиях Северного Кавказа.// Автореф. дис. д-ра. вет. наук.- Краснадар, 2002.

8. Беляков И.М. Диагностика внутренних незаразных болезней сельскохозяйственных животных. -М.: Колос,1975.,

9. Белоусова Р.В., Нургазиев Р.Х., Фролов B.C., Корольков В.И. Аденовирусная инфекция крс.//Ветеринария.-1989.-№1.-С.29.

10. Борисевич В.В. Хламидиоз крупного рогатого скота и особенности хирургической патологии? при этой инфекции.//Сб.науч.тр. Ленинградского вет. ин-та.-1990. №105.-С. 15-22.

11. Бортничук B.A. Выделение вирусных агентов от поросят больных пневмонией.// Акт. вопр. вет.вирусологии. Тез: докл. Всесоюзн. конф.-М., 1965,-4.2.-С. 104.

12. Бортничук В., Попович Г. Выделение хламидий от сельскохозяйственных животных и их идентификация.// Микробиологический журнал.-1991 .Т.43 .№2-С. 183-187.

13. Бурдов Г.Н., Марасинская Е.И., Крысенко Ю.Г. Вирусные инфекции крупного рогатого скота. // Ветеринарный врач.- 2001.-№3. -С.38-39.

14. Вечеркин A.C., Зудилина З.Ф., Крюков H.H. Антигенная совместимость вирусов парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита в организме телят.//Труды ВИЭВ:-М., 1981.-Т.53.-С.26-28.

15. Воронин Е.С., Кис И., Сюрин В.Н., и др. Экспериментальное воспроизведение вирусных пневмоэнтеритов телят.//Сб. науч.тр.МВА,-1979.-T.108.-C.76-82.

16. Высокопоясный А.Н., Басова Н.Ю., Шахов A.F., Шипицын А.Г. Респираторные болезни телят на Кубани. // Ветеринария.- 2000. -№12. -С 8-11.

17. Гард С. Химическая инактивация вирусов.// Природа вирусов. -М., 1958i — С.134-157.

18. Гаффаров Х.З. Энзоотия хламидийного энцефаломиэлита у телят.// Актуальные вопросы вет.вирусологии. Тез.докл. 5 Всесоюзн. вет. вирус, конф.-Казань, 1982.-С.22.

19. Гаффаров Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов.//Дис . д-ра. вет. наук. -Казань, 1986.-С.455.

20. Гаффаров Х.З., Иванов A.B., Непоклонов E.A., Равилов А.З. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят. -Казань, 2002. -С.342-490:

21. Гаффаров Х.З., Митрофанов П.М. Выделение микоплазм от телят, больных бронхопневмоний.// Матер, докл. научн. конф., посвященной 95-летию Казанского ветеринарного института им. Н.Э. Баумана. Казань, 1968.

22. Гаффаров Х.З., Боровик P.B. Способ изготовления микоплазменного антигена для иммунологических реакций.//- Авт. свид. СССР. Ткл.с12 К1/00;№588237,заявл. 3.06.741-№2031271,опубл. 1.02.78.

23. Гаффаров Х.З., Фридман Э.А. Изучение гриппа крупного рогатого скота в Среднем Поволжье.// В кн.: Актуальные проблемы ветеринарной;вирусологии.- Владимир, 1976.-Ч. 1 .-С.208-210.

24. Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко A.B., Татарчук А.Т., Кушнир Н.И., Котенева С.В;, Ветров; Г.К., Сергеев- А.Н. Распространение ; вирусных респираторных; болезней крупного » рогатого скота.// Ветеринария.- 2003.-№3. -С. 17-21.

25. Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко A.B., Татарчук А.Т., Кушнир Н.Щ Котенова C.B., Ветров Г.К.,. Сергеев А.Н. Распространение вирусных респираторных болезней крупного s рогатого скота.//Ветеринария. -2002:-№3.-С. 17-21.

26. Гнутов И.Н. Клиника и диагностика генерализованной; формы хлами-диоза зоанозной природы у людей.// Автореф; дис. д-ра. мед. наук -М., -1981.

27. Гуненков В.В;, Халенов Г.А., Сюрин В.Н. Вирусные и хламидозойные респираторные и кишечные: инфекции крупного рогатого скота: //Животноводство и ветеринария. М. -Том.№8.-1975. -С.5-131.

28. Данилевский В.М. Бронхопневмония телят: этиология, диагностика. Профилактика и лечение.// Ветеринария.- 1985.-№ 1. -С. 16-19.

29. Дилекторский В.В;, Яшкова Г.Н.Современное представление о роли хла-мидий в потологии урогенитального тракта.- М., Медицина, 1994'.

30. Евстифеев В.В. Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики при;хламидиозе свиней.// Дис. .канд. вет. наук. -1998.

31. Ефремов М.М., Широбокова М.М., Воронов А.Н. Этиология острых желудочно-кишечных болезней поросят в; крупных свинокомплексах.// Тез.докл.Всесоюзн. науч.конф. по пробл.эпизоот.- Казань, 1983.-С.112.

32. Жестеров В.И. Оптимизация условий выращивания ПГ-3 КРС в перевиваемой культуре клеток.//Диагн. профилак. и меры борьбы с особо опасными и экзоотич. болезнями ж-ых.: Матер. Междунар.-практ. конф. -Покров,1998. -С.115-116.

33. Жестеров В.И., Юрков С.Г. Современные аспекты крупно-масштабного культивирования клеточных субстратов и вирусов. //Вет. и мед. аспекты зооантропонозов.-Ч.1,2. -Покров, 2003.-С.З8-40.

34. Калугина И:А; Особенности культивирования и развития: хламидий в перевиваемых культурах клеток парнококопытных.//Докл. 4 совещ. культ, клеток жив. и чел. Цитология.-Пущино.-1994.-№ 6.-С.522-523.

35. Караваев Ю.Д., Калугина И.А., СусскийЕ.В. Культуральная инактивиро-ванная : вакцина: против хламидиоза животных.//Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов.Сб. науч., трудов.-Щелково, 2000.-C.122-123.

36. Карпуть И.М. Влияние техногенных факторов на качество молозива и развития болезней молодняка.// Акт.пробл. патол. с.-х. ж-ых : : Матер. Междунар. науч.-практ. конф.- Минск, 2000. С.483-486.

37. Катингер Х.,Шейрер У. Биотехнология клеток животных.- М;,-1989.-Т.1.

38. Коннов Н.М. Изучение различных клинических форм инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. //Тез. докл., Респ.научно-технич. конф. по проблемам ветеринарнии и зоотехнии.- Казань, 1980: -С.58-601

39. Коннов Н.М:, Гаффаров Х.З., Равилов А.З. и др. Инфекционный ринотра-хеит баланопастит у откормочных быков.// Науч. тр. Ордена Ленина Казанского Государственного ветеринарного института им. Н.Э. Баумана.-Т. 133, 1980.-С.9-12:

40. Коннов Н.М., Гаффаров Х.З., Равилов А.З; Культивирование вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота вперививаемой линии клеток ВНК-21.//Актуал. вопр.вет. вирусол. Тез. докл. 5-й Всесоюз.конф.-Казань, 1980.-C.170h

41. KOHHOB H.Mi Этиологическая структура респираторных; инфекций телят в промышленных комплексах и разработка средств их пассивной профилактики И; разработка средств их пассивной профилактики и лечения. //Дис. канд. вет наук.- Казань, 1982.-С. 184-188.

42. Конопаткин A.A. Эпизоотологические проблемы смешанных инфекций в современном животноводстве.// Патол.органов дыхания и пищеварения с.-х: животных.- M., 1983.-C.3-9.

43. Крысенко Ю.Г. Клинико-эпизоотологические особенности и специфическая профилактика хламидиоза и смешанных респираторныхинфекций круп. рог. скота в Удмуртской Республике.//Автореф. дис. канд. вет наук. -Казань,2003.

44. Крюков H.H. Инфекционный ринотрахеит-пустулезный вульвовагинит крупного рогатого скота.// Итоги науки и техн.ВИНИТИ АН СССР. Животноводство и ветеринария.- 1980.-T. 13. -С.32-113.

45. Крюков H.H., Зудилина З.Ф., Вечеркин A.C. Иммуногенность ассоциированной вакцины против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС.//Тр. ВИЭВ.- М., 1983.-Т.57. -С.23-25:

46. Крюков H.H., Шуляк А.Ф. Ранняя устойчивость телят к инфекционному ринотрахеиту.//Ветеринария.- 1990.-№ 9. -С.28.

47. Крюков: Н.М. Научные принципы специфической профилактики вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота. // Труды ВИЭВ. М., 1981. - Т. 53.-С.13-20.

48. Куриленко А.Н., Крупальник B.JI. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных.-М.,- Колос, 2000. -С. 111-119, 144.81 .Курносов А.Н; и сотр.,//Вопросы ветеринарной вирусологии и микробиологии. -Покров, 1990.

49. Лебедева Е.П.,Кленина Н.В., Антонов B.C. Защитные свойства молозива; в первые 10 дней жизни.// Проб. вет. иммунол. -М:, Агропромиздат.-1985. С.58-60.

50. Лещинская Н.П. и сотр. Вакцинация против респираторно-синцитиаль-ной инфекции.//Вопр. вирусологии.- 1986.-№ 5.-С.517.

51. Мартынова Р.В., Шаткин A.A., Щербакова H.H. Диагностическое выделение гальпровий(хламидий) в куриных эмбрионах при трахоме, паратрахоме и другой этиологически родственной патологии.//Сб. Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных.-М.,-1979.-С.36-40.

52. Масимов H.A. О роли бактерий при респираторных заболеваниях телят в откормочных хозяйствах.//Сб. науч. трудов MB А.- Т.116.-М:,1980. -С.51-52:

53. Миронова Л. Л., Преображенская Н.К., Шитикова Г.С. и сотр.

54. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка-субстрат для;биотехнологии.// Биотехнология.- 1998. № 5. -С.25-31.

55. Митрофанов n.Mi Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ними.// Метод, рекомендации. Новосибирск, 1980. -С.35.

56. Митрофанов П.М. Клиника? и; патогенез хламидиоза.// Ветеринария. 1980.-№ 6. -С.36-39.

57. Митрофанов П.М. Актуальные проблемы респираторных болезней телят в Сибири.//Науч.-техн. бюл. СО ВАСХНИЛ;-1983.-№40.-С.З-9.

58. Митрофанов П.М:, Семенов В.А., Хамадеев Р.Х. Хламидиоз крупного рогатого скота. // Методич. рекомендации. Чебоксары, 2001. -G.11-1.7.

59. Мищенко В.А., Костыркин. Ю.А., Яременко H.A., Лисицин В.В., Ручнов Ю.Е., Гетманский О.И. Вакцинация ^новорожденных телят против ИРТ и ПГ-3 КРС.// Ветеринария. -2003.-№7.-С. 19-22.

60. Мшценко В.А., Захаров В.Н:, Кухаркина О.В., Жбанова Т.В., Никешина Т.Б., Лисицин В.В., Павлов Д.К.//Акт. пробл. инфек. патологии ж-ых.// Матер.Межд. научн. конфер. посвящ. 45-летию Ф.Г.У. «ВНИЗЖ» 3 0-31 окт.2003 г.- Владимир.-С.77-82.

61. Мищенко B.A. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС.//Акт. Пробл. инфекц-ой патол. животных. Мат.межд. научн. конф. посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». Владимир, 2003.

62. Мищенко BIA.,Гусев А.А;, Яременко H.A. и сотр. Особенности респираторных инфекций телят.// Ветеринария.- 2000.-№ 9. -С.5-6.

63. Мищенко В.А. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС. // Акт. пробл. инфекц-ой патологии ж-ых. Мат. межд. науч. конф. Владимир, 2003. -С.73-77.

64. Мищенко В;А;,Лисицин В.В., Костыркин Ю.А., Ручнов Ю.Е., Гетманский О.И. // Акт. пробл. инф-ой патологии ж-ых. Мат. межд. науч. кон-фер: Владимир, 2003. -С.82-84.

65. Музычин С.И., Шишко В.В., Дроздова JI.B. Контроль поствакцинального иммунитета при парагриппе-3 у телят путем определения уровня местных секреторных антител.// Микроорганизмы в сельском хозяйстве. -1983.-С.85.

66. ЮО.Музычин С.И: Факторы секреторного иммунитета при; вакцинации телят вакциной «Бивак » против парагриппа 3 и инфекционного ринотрахеита.// Вет. наука произ-ва: Минск, 1986.-№ 25. - С.3-5.

67. Нехуров Л.Б. Парагрипп-3 и аденовирусная инфекция крупного рогатого скота в Бурятской АССР.//Науч.-техн. бюлл. СО ВАСХНИЛ.-1983. -№40.-С. 16-20.

68. ЮЗ.Оболадзе Д.Б. Чувствительность вируса аборта овец к физико-химическим факторам.//Мат. Закавказской науч. конф. по вопр. ветер, и жи-вотн.-Тбилиси, 1971.-С.359-360.

69. Ю4.0гнянов Д;, Сербосов В., Александров Е., Макаева-Симонова Е. Имму-нофлуоресцентная диагностика вирусного аборта овец.//Вет. мед. науки. -1967.-№4.-С.53-58.

70. Ю5.0сидзе Н.Г., Шехватов А.Г. Изучение и адаптация вакцинного штамма ИРТ-2/81 к наиболее чувствительным перевиваемым культурам клеток.

71. Новое в технологии пр-ва и перераб. продукции животноводства. Тез. докл. Волгоград, 1996. -С.77-79.

72. Преображенская Э.А., Денисенко В Н. Иммунный статус коров-матерей и телят.//Акт., вопр. инфекционных и инвазионных болезней ж-ых. Сб. науч. тр. М., 1993. -С.90-94:

73. Петрова O.F., Глотов A.F. Особенности эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота на Урале. //Акт. вопр. ветеринарии: Тез.докл. 1 -и науч.-практ. конф. факульт. вет. медицины НГАУ. Новосибирск, 1997.-С 51-52.

74. Петрова О.Г., Татарчук А.Т., Сапожникова Н.Л., Стригалева Н:И: Острые респираторные вирусные инфекции КРС, в хозяйствах Свердловской области. // Ветеринарный врач. -2000.-№4. -С.86-90.

75. П.Петрова O.P. Острые респираторные вирусные инфекции; крупного рогатого скота в : племенных хозяйствах Среднего Урала и оптимизация системы противоэпизоотических мероприятий.//Автореф. дис. докт. вет. наук.-М., 2002.-С. 12-28.

76. Петрова О.Г., Татарчук А.Т., Сапожникова H.JI., Шевченко Н.И., Хаматов М.Ф. Глотов А.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в Свердловской области.// Ветеринария.- 2002.-№2. —С. 11-15.

77. Равилов А.З., Гафаров Х.З., Гумеров В.Г. Чтобы обеспечить надежную защиту молодняка. //Ветеринарный врач.-2000.-№ 4. -С.74-81

78. Пб.Ревякина Е., Шуляк А.Ф., Майджи О.В., ЮровК.П. Иммунный ответ у животных на введение вакцины Тривак ВИЭВ.// Ветеринария.-1998. -№ 6. -С.25-27.

79. Садиков В.Е. Пневмоэнтериты // Профилактика инфекционных болезней крупного рогатого скота:.-М;, 1982. -С.105-136.

80. Сизов И., Бостанджиева Р. Изоляция на аденовирусы от бронхопневмо-ничи телята. // Ветер, мед. науки: -Т.20. -№ 5-6.- 1983.-С.52-56.

81. Симонова Э.Г., Закутский Н.И., Середа А.Д., Жестеров В.И;, Вишняков И.Ф. Ультраструктура и морфогенез вакцинного штамма ТК-А вируса; ИРТ КРС. //Ветеринария.- 1997.-№ 10. -С.15-18.

82. Сисягин П.Н., Реджепова Г.Р., Убитина И.В., Зоткин Г.В. Профилактика вирусных; респираторных болезней телят.//Мат. межд. науч-практ.конф. Актуаль.пробл. болезней молодняка в соврем, условиях. -Воронеж, 2002.-С.38-40.

83. Сметанин М.А. Особенности течения гриппа у крупного рогатого скота в хозяйствах Среднего Поволжья.// В кн.: Диагност, зараз, заболев, с.-х. животных.- Казань, 1982. -С.45-47.

84. Соколов С.Г. Ринотрахеитно-пастерилезная инфекция у телят и ее вакцинопрофилактика.//Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с.-х. животных. Тез.докл.республ. научно-произв. конф. -Минск, 1990.-С.90-91.

85. Стеценко B.L Краешков Г.А., Коновалов В.Н. 1ммуноморфолопчнг ре-акцп телят на введение аерозолю вакцини проти парагриппу 3 (ПГ-3).//Ветеринария. -Кшв, 1992. Вип.67.-С.65-68.

86. Сухарев О.И., Гладченко Н.Р. Диссеминация и персистирование вирусов ИРТ, ПГ-3,ВД-БС в организме телят при экспериментальном зара-жении.//Сб.науч.тр. ВГНКИ вет. препарат.-М., 1981.-С. 87-92.

87. Сюрин В.Н:, Фомина Н.В. Частная вирусология.//Справочная книга. -М., Колос.- 1979. -С.472.

88. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.Н.', Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998. -С.242-243

89. Тарасов В.Н.// Сборник ВИВИТИ,1990.-№19.

90. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих.// Методы культивирования клеток. JL: Наука, 1987. -С.44-63.

91. Тшценко В.П. Аденовирусная инфекция как этиологический? фактор респираторного синдрома телят в промышленных комплексах. // Сб. науч.трудов. MB А. -Т.116. -М., 1980. -С.48-51.

92. Тукшаитов Р.Х. Математическая обработка экспериментального материала на программируемых микрокалькуляторах типа «Электроника»-МК-56. //Методич. рекомендации.- М., 1984. -С.28.

93. УгрюмоваВ.С., Равилов А.З. Дезинфектанты широкого спектора действия при зооантропонозах хламидийной и вирусной этиологии.//Мат. Все-союзн.конф.-Львов, 1988.-С 105-106.

94. Фельдман И.И. Теория и практика профилактики диареи (колибакте-риоза) и энзоотической бронхопневмонии, телят разрывом эпизоотической цепи.//Болезни телят и меры борьбы с ними. -Новосибирск, 1983. -С.3-17.

95. Федюк В.И., Лысухо А.С. Лечение и профилактика респираторных болезней телят.//Ветеринария.-1997.-№7-С.20-22.

96. Фомин Ю.В., Петрова И.А., Иванова Г.А., Фоменко Н.В. Воспроизведение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в. эксперименте.// Важнейшие исследования по изучению заболеваний с.-х. животных. Сб. науч. трудов,- М., 1973;-Т.70.-С. 108-109.1

97. Хазипов Н.З., Равилов А.З. Хламидиозы сельскохозяйственных животных.// В кн.: М., Колос, 1984. -С.70-95.

98. Хамадеев5 Р.Х. Методы лабораторной! диагностики.//Хламидиозы сельскохозяйственных животных. М., Колос, 1984.-C. 152-1931

99. Хамадеев Р.Х. Хламидиозные аборты и мертворождаемость;у свиней в промышленных: комплексах.//Акт. вопр. инф. патол. в пром. животноводстве. Сб. науч. трудов КВИ.-Казань,.1987.-С.32-35.

100. Хамадеев Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней (Эпизоотология, диагностика, специфическая профилактика и меры борьбы).//Дис. док. вет. наук. Казань, 1990.-С.514.

101. Хамадеев Р.Х., Равилов А.З. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и патогенность их для человека.// ЖМЭиМ .- 1997. -№ 1. -С.96-97;-С.99-101.

102. Харламбиев Х.Е. Ринотрахеитни энзоотии при импортирани крави. // Ветер.сборник.- 1974.- Т.72.-№ 10. -С.17-20.

103. Христовски М.,Бошнаковски 1.,Ашанин Р.,Митров Д. Компаративно испитуванье на IBR/IPV преку крвен серум и млеко со ELISA и SN -тест. Югославия. Макед.ветер. Прегл.-1993.-Г.22.бр.1/2.

104. Цветков П., Петков К., Огнянов Д. Серологични проучваня на вирусе на мукозната болест-вируна диарея по говедата:// Ветер, мед. науки, 1982-Т.19.-№4.-С.29-35.

105. Шаткин A.A. Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы. //К.Здоровье, 1983.-С.198.

106. Шафикова P.A. Оптимизация условий культивирования возбудителя аборта овец в культуре клеток.// Научные основы технологии промыш. произ-ва вет. биопрепаратов. Тезисы докл. конф. -М.,-1983.-С.21-22.

107. Шафикова P.A. Физико-химические и биологические свойства хлами-дий.// Хламидиозы сельскохозяйственных животных. М., Колос.-1984. -С.14-33.

108. Шафикова P.A. Иммунобиологическая характеристика хламидий, усовершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов.// Автореф. дис. докт. вет. наук.- Казань, 1991.-С.29-30.

109. Шахов A.F., Першина С.И., Лебедев М.И. Инфекционные заболевания КРС проявляющиеся респираторными и конъюнктивальными синдромами. Матер.конф.-2001 .-С. 107-108.,

110. Шехватов А.Г. Эпизоотология и профилактика инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота в хозяйствах Волгоградской области. // Новое в технол. произ-ва и переработки продукции животноводства. Тез. докл. -Волгоград; 1996. -С.79-80.

111. Шипицын А.Г., Басова Н.Ю., Кучерявенко A.B. Диагностика бронхопневмоний телят.//Акт. пробл. болезней молодняка в совр. условиях. Матер.межд. науч-практ. конф.- Воронеж, 2002.-С.673.

112. Штрауб О.Х. Инфекции крупного рогатого скота вызываемые вирусами герпеса. -M., 1981.-С.207.

113. Щербань Г.П., Фирсова Г.Д:, Воскресенская Т.Г. Хламидиоз сви-ней.//Ветеринария.-1978.-№9.-С.55-58.

114. Юрков С.Г., Курносов А:Н., Витина С.А., Зуев В.В.,Кушнир С.Д., Ани-симова JI.Hi Универсальная роллерная технология культивирования; перевиваемых клеток животных.//Ветеринария.-1995.-№9. -С.29-34.

115. Ярных Е.В. Биологические свойства сухой вирус-вакцины против пара-гриппа-3 крупного рогатого скота.//ТрудьтВИЭВ.- Москва, 1981.- Т.53. -С.21-25.

116. Ahl R.,Straub О.С. Comparison of interferon production in cattle after intranasal infection with parainfluenza-3 live vaccine and avirulent IBR|IPV — herpesvirus.!! Zbl.Vet.-Med.B.1985.-Bd.32.-S.407-416.

117. Alexandersen S. Advantages and disadvantages of using live vaccines.//Acta Vet. Scand. 1996- Suppl.-90. P.89-100.

118. Anagrnoste В.,Sarateanu D;,Surdan C.,Sordok G. Repartita germinilor orni-tosa-psittacozici in onl de gaina embrionat.||Studii si secretari intramicro-biol.||Acod R.P.R.-1962.-Vol.l3.6.-P.725-730.

119. Anderko R., Blauärmel H., Seiodel HI Die Beziehung des Antikörpermangelsyndroms zum Aufzuchtergebnis von Kölbern im K-O-Ab-schnitt.-Mh. Veter.Med.- 1982.B.37.10.-S.369-372.

120. Baby Y. The Chlamydia and its identification. ||Livestok Adsiver.- 1987, 12.-P.41

121. Baldierz H., Nikolajczuk M., Zielinski J.-Medl Wet.,1982.B37.№8-9.-S.439-441.

122. Barrera M., Nada. J., Nunes A. et al. Evaluation de una vacuna inactivada, contra el virusIBR | IPV. ||< REN.Salua anim: 1996; V.181 №3.-P. 145 150.

123. Boothby J.T., Jasper D.E., Zinkl J.C.,Thomas C.B., Dellinqer J.D.II Amer.J.Vet.Res.-1983 .V44:5.-P.831 -838.

124. Brownlie J., Clurke M.C.,Howard C.J. Experimental production of fatal mucosal disease in cattle.-Vet.Res.-19841V.l 14.22.-P.535-536.

125. Brownline J.,Nobiron II,Thompson I.,Collins M.E. Bovine virus (BVDV). Pathogenesis and vaccines.||2nd Int.Vet.Vaccines and Diagn.conf.-Oxford, 2000.-P.39.

126. Bryson D.G. Infectious bovine respiratory disease-emerqinq issues and progress towards control.||Proc.l9; World Buiatrics Coud.-Edinburqh, 1996.V. 1. -P.1-8.

127. Bryson D.G., Mc.Nulty M.S., Logan E.F1, Cuch P.F. Respiratery syncytial virus pneumonia in young calves: clinical and patholoqic findings.-||Amer. J: Vet.Res.-19831 V.44.9.-P. 1648-1655.

128. Burraqe T.,Kramer E.,Brown F; Inactivation of viruses by aziridines.-Basel.Karqer, 1999.102.-P.131-139.

129. Dusham PJ.K.,Hassard L.E. Prevalence of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis,parainfluenza-3,lovine respiratory syncytial,and bovine viral diarrhea viruses in cattle in Saskatchewan and Alberta.||Canad.Vet.J. -1990. V.31.-P.815-820.

130. Ellis J.A.,Yonq Choon,Yonq C. Sistemic adverse reactions in young Simmental calves following administration of a combination: vaccine.||-Ca-nad. Vet. J.-1997.-V.3 8.1 .-P.45-47.

131. Fodor L. Use of a combined vaccine containing farmspecific bacterium strains and parainfluenza-3 virus for the prevention of respiratory diseases of cattle.11 Maqyarallatorv.Lapja.-1993.-V.48. 5.- P.276-279.

132. Frankena K., Franken P., Vandehoek J;, Koskamp G.,Kramps J.A. Problemility of detectinq antibodies to bovine herpesvims 1 in bulk milk after the introduction of a positive animal on to a* neqative farm.||Veter.Rec. -1997. V. 140.4.-P.90-92.

133. Francis R.D.,Gordon F.B. Cultivation of viruses of the psittacosis group in the allantois of chik embryos.||Proc.Sos.Exp.Biol.-1975.-V.59.-P.270-272.

134. GardS. Theoretical consideration in the inactivation of viruses by chemical means.||Ann.Acad.Sci.-1960.-V.83.-P.513-760.

135. Garlick B., Avery R.J. Inactivation of New-castl disease virus by b-propiolactone.|| Arch. Virol.-1976.-V.52.1-2.-P. 175-179.

136. Ghram A., Reddy P.G., Morrill J.L. et al. Bovine herpesvirus-1 and parainfluenza-3 virus interactions: clinical and immunological response in calves.||Canad.J. of Vet.Res.-1989.V.53.1.-P.62-67.

137. Gibbs E.P.J. Rweyemamu M.M. Bovine herpes-virus.||Vet.Bull.-1977. V.47.-P.417-425.

138. Horsh F. Epizootologic, Pathogenese und Infection-sabwehr bei den chlamydieninfectionen bei der wiederkauer-wissen-schafte. ||Zschr. Humbold-univer.-sitat. -Berlin, 1980. 1.-S.5-9.

139. Köves B., Belak S.,Varga J. Parainfluenza-3 virus oktaniiszerepe egy gaz-dasag borjainak legzöszervi megbetege-desciben.- ||Maqyar allatorv. -Lapja, 1983 .B.38.1.-S. 14-17.

140. Kruse P.E. The importance of colostral; immunoglobulins and their absorption from the intestine of the new born animals.|| Ann. rech.vet.- 1985.V.14.4. -P.349-353.

141. Kubin G. Fectstellung der infektiösen Rhinotracheitis (IBR) des Rindes in: Osterreich.||Wientierärztl.Mschr.-1982.B.69.5.S. 145-148.

142. Liao Y.K.,Lu Y.S.jChiu S.Y.et ali The development of multivalent inactivated vaccines composed of infectious bovine rhinotracheitis, bovine viral diarrhea and parainfluenza-3 viral antigens.||Proc.Soc.Exp.Biol. -1975.-V.59. -P.270-272.

143. Li-Zi-Kua, Ju-Li-Wen, Li-Li-Jin. Discovery of extracellular multiple from of Chlamydia trachomatis in the tissue culture.||Chlin.Med.-1994.V.107. 9.-P.683-685.

144. Linon P. Suites contentieuses de la vente de genisses importées et reconnues infectees de rhino-tracheite.||Rev.Med.veter.- 1979. V.130.8-9.-P.1179-1192.

145. Luqovic B.,Cajavec S.,Cvetnic S; Stability of infections bovin rinotracheitis monovalent vaccine (RI-Vac) and infectious bovine rinotracheitis and parainfluenza-3 bivalent vaccine (RIPAVAK R). ||Vet Arhiv.-1984.-V.54.4 -P. 183-188.

146. Marshall R.L., Frank L.H. Nautralizing Antibodi in serum and nasi secretions of calves exposed to parainfluenza-3 .-Virus.Amer. J.Vet.Res.-1971. V.32.11.-P. 1699-1706.

147. Meyer K.F., Edolik B. PLV-group (Bedsonia infections).|| Amer. Pull.Hcalth Ass.-1964.-P.603-639.

148. Meszaros J. Bekacmpfung der virus> bedingten Atmungs-und Verdaungekrankheiten der Kaelber in Ungarn.Mh.Veter.Med.- 1983. B.35.19. -S.730-732.

149. Mozaffari-Nezhad H., Kita J. Antibody appearance of parainfluenza-3 virus in cattle population in West Azarbaijan province.-Pol.Arch.Veter.-1980. V.21.4.-P.473-476.

150. Mrozek M. Bacteriologische Untersuchungen zum Vorcommen von Chlamydia psittaci in Genitaltrakt und in Kotproben von Bullen. || Inaug.-Diss.-Hannover. 1989.-S.119.

151. Msolla P.M.,Wisemann A., Allan E.M.,Selman J.E. Experimental infection ofcattle of different ages with infectious bovine rhinotracheitis virus (Straihen strain). || J. Comp. Patholak.-1983. V. 93. 2. P. 205 210.

152. Nisbet D.I. Enzootic abortion in ewes. Transmission of the disease.|| J.Vet: Rec.-1959.-Vol. 62.-P.251-259.

153. Novak S. Virus PI-3 a bovine adenovirusy ako patogenhe agens pri ochoreni teliat.||Veterinarstvi, 1982. V.32.2. -P.75-76.

154. Pritchard D. Current research on calf pneumonia.-Veter.ann.(Bristol), 1980. V.20.-P. 189-203.

155. Rola J.,Zmudzinski J. Ocena testu ELISA do wykrywania przeciwcial dla wirusa BHV l.||Med.weter.-1997.R.53.31-S. 148-150.

156. Schachter J.,Dawson C.R. Human clamydial infections.|| P.G.S. Publ.Comp Inc.Littlton,Masachusetts.-Ch. 11 .-P. 122.

157. Schirrmeier H.,Bergnann H.,Meyer U. Pathogenese und Immunogenese bei virusbedingten respiratorischen Erkrankungen des Kalbes.||Monatsh Veteri-narmed.-1982.B.37.24.-S.949-955.

158. Servais L. La Belqique entname un proqramme d\ eradication de 1. IDR.||Elevages belqes.-1996. 10.-P.9-14.

159. Shimizu T. Isolation of Mycoplasma bovis from calf pneumonia in Japan.-Jap.S.Vet.Sci.-1982. V.44.6.-P.981-983.

160. Shulc L. If you think a live IBR, BVD, PI-3 vaccine is more effective than killed-think again.||Beef.- 1987. V.24.4.-P.563.

161. Spire Mark F. Theory and practice if immunoprohylaxis in cattle.llJ.Amer.Vet.Med.Assoc.- 1982. V. 181.10.-P. 1158-1161.

162. Stalheim Ole H.V. Mycoplasmal respiratory diseases of ruminants: a review and updata.||J.Amer.Vet.Med.Assoc.-1983. V.182.4.-P.403-406.

163. Straub O.C. The IBR-IPV disease complex.||Vet.Med.Rev.-1983. 2.-S.119-131.

164. Straub O.C. Infectios bovine rhinotracheitis virus.||Virus Infectios of Rhinotracheitis. -Amsterdam, 1990.-V.9.-P.71-108.

165. Tinapp D. Rindergrippe-was ist zu tum? ||Rinderwelt.-1983. B.8.2.-P.48-50.

166. Towhsend J., Duffus W.P.H.,Willians D.G.L.The effect of cattle on the in vitro production of interferon by peripharal blood mononuclear cells. || J.Comp.Path.-1988.-V.99.2.-P. 169-185.

167. Wassel M.S., Soad S.A., Girgis S. et al. Trial for preparation and evaluation of a combined vaccine for IBRV, BVDV, PI-3V. P.multocida and P.haemolytica in Eqypt.||Assiut.Vet.Mtd.J.-1996.-V.35. 70.-P. 130-143.

168. Wijaska T. Effect inactivation on polypeptide structure of transmissible gastroenteritis virus on its immunogenetic properties.||Bull.Vet.inst.Pulawy. -1979.-V.23. 3-4.-.62-80.

169. Yomamoto K.,Yale J.||Biol.Med.l983.-V.56.- P.783.

170. Zoizelier B. Diagnostico de las chlamydiasis animals y sus problemas. || Gas.Veter.-1973.-Vol.35.-278. -P.388-413.

Информация о работе

Каримуллина, Ильсияр Габделгазизовна
кандидата биологических наук
Казань, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Оптимизация технологии культивирования вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидий при разработке ассоциированной вакцины - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы