Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование технологии изготовления вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии изготовления вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота"

На правах рукописи

НЕСТЕРОВ Александр Александрович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 5 АПР 2015

Владимир-2015

005567382

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Мищенко Владимир Александрович

Официальные оппоненты: Юров Константин Павлович - доктор

ветеринарных наук, профессор, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Л.Р. Коваленко», заведующий лабораторией вирусологии

Белоусов Василий Иванович — доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория», главный эксперт

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский и технологический институт биологической промышленности»

Защита состоится 2 июня 2015 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.arriah.ru ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир).

Автореферат разослан «01» апреля 2015 г. Учёный секретарь

диссертационного совета, ,, А/

кандидат биологических наук Жбанова Татьяна Валентиновна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы исследования. Современный уровень интенсификации скотоводства позволяет увеличить производство продуктов животноводства, что существенно снижает их себестоимость. Однако в связи с целым рядом причин экономического, социального и организационного порядка потенциал отрасли не используется полностью, а в отдельных хозяйствах производство мяса и молока является убыточным. Основной причиной сложившейся ситуации являются массовые заболевания животных, особенно в молодом возрасте [1,2].

По мнению многих исследователей, при большой концентрации на ограниченных площадях среди животных одновременно могут циркулировать несколько возбудителей инфекционных болезней, относящихся к разным таксономическим категориям. Установлено, что роль пускового механизма в возникновении болезней с ассоциативным течением принадлежит различным вирусам, и прежде всего инфекционному ринотрахеиту (ИРТ) [3, 4].

На территории нашей страны заболевание получило широкое распространение после массового завоза племенного скота в 70-е - 80-е годы прошлого столетия и в настоящее время регистрируется во многих субъектах Российской Федерации [5].

В условиях современного промышленного скотоводства одним из наиболее эффективных способов профилактики ИРТ КРС остается вакцинация. Успехи вакцинопрофилактики во многом зависят от типа и качества применяемых препаратов. Поэтому основным этапом разработки технологии изготовления вакцин против ИРТ КРС является подбор системы и условий культивирования, обеспечивающих получение вируса с высокой инфекционной и антигенной активностью.

1.2 Степень разработанности проблемы. Опубликовано значительное количество работ об успешном применении клеточных культур для культивирования вируса ИРТ КРС при изготовлении вакцин. В то же время совершенствование вакцин продолжается путем подбора новых клеточных систем и методов культивирования.

Несмотря на широкий спектр методов диагностики, вопрос усовершенствования и снижения трудоемкости РН, как золотого стандарта, продолжает оставаться актуальным.

1.3 Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось усовершенствование технологии изготовления и контроля инактивированных вакцин против ИРТ КРС.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: определить наиболее чувствительные культуры клеток и оптимизировать условия культивирования вируса ИРТ КРС;

отработать режим инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и подобрать масляный адъювант для изготовления вакцины против ИРТ КРС;

отработать условия очистки вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» для получения диагностических сывороток крови к вирусу ИРТ КРС на лабораторных животных;

усовершенствовать условия постановки реакции

микронейтрализации (РМН) ИРТ КРС;

провести анализ данных серологических исследований ИРТ КРС на территории РФ с помощью РМН.

1.4 Научная новизна результатов исследований.

Вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» впервые адаптирован к перевиваемой культуре монослойной линии клеток почки теленка (RBT). Определены оптимальные параметры культивирования.

Доказана возможность применения заменителя сыворотки (Fetal Clone II) для получения перевиваемых клеточных культур.

Оптимизированы способы контроля вирусного материала ИРТ штамм «ВНИИЗЖ» и антигенной активности инактивированных вакцин против ИРТ КРС.

Проведенный анализ данных серологических исследований о распространении ИРТ КРС на территории РФ за 2007-2014 гг. свидетельствует о факте наличия антител к вирусу ИРТ КРС в организме диких жвачных животных и верблюдов.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований:

Вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» впервые адаптирован к перевиваемой культуре клеток RBT. Изучены стадии взаимодействия возбудителя ИРТ КРС и клеточной культуры RBT.

Показана эффективность применения заменителя сыворотки при получении клеточных культур для культивирования вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и постановке РМН. Применение заменителя сыворотки позволило избежать контаминации микоплазмами и посторонними вирусами, а так же исключить ложные результаты РМН.

Проведенный с помощью РМН серологический анализ показал наличие антител к вирусу ИРТ КРС в сыворотках крови верблюдов, домашних и диких парнокопытных, что может свидетельствовать о межвидовой циркуляции возбудителя ИРТ КРС.

Разработаны: «Методика выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в реакции нейтрализации микрометодом», утвержденная директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010 году; «Методические рекомендации роллерного культивирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в перевиваемой культуре клеток ИВТ», утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011 году.

Результаты работы вошли в нормативную документацию, утвержденную директором ФГБУ «ВНИИЗЖ»:

СТО 00495527-0182 «Штамм «ВНИИЗЖ» вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Метод изготовления и контроля посевных материалов»;

СТО 00495527-0117 «Вакцина против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сорбированная инактивированная»;

СТО 00495527-0088 «Вакцина ассоциированная против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная»;

СТО 00495527-0125 «Вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и коронавирусной инфекции крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная»;

СТО 00495527-0151 «Вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная».

1.6 Методология и методы исследования. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных

материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали культуральный вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ», перевиваемые культуры клеток, растворы и питательные среды, бактериальные среды, антибиотики, раствор трипсина-версена (1:9), заменитель сыворотки. Вирусологические (титрование, культивирование вируса) и серологические (РТГА, ИФА, PH, РМН) методы исследований.

1.7 Положения, выносимые на защиту:

условия адаптации и культивирования вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в перевиваемой культуре клеток RBT;

режим инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и составления эмульсионных вакцин против ИРТ КРС;

условия очистки и концентрирования вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и получение высокоактивных специфических сывороток к нему;

усовершенствованные условия постановки реакции микронейтрализации (РМН) для обнаружения специфических антител против вируса ИРТ КРС в пробах сыворотки крови животных;

- результаты серологических исследований на наличие антител к вирусу ИРТ КРС в пробах сыворотки крови домашних и диких животных на территории РФ за 2007-2014 гг.

1.8 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.б.н. Думовой В.В., к.б.н. Кононовой C.B., к.в.н. Кононову A.B., к.б.н. Манину Б.Л., к.в.н. Авситидийскому Е.А. и к.в.н. Пузанковой О.С. за помощь в проведении отдельных этапов работы и консультативную помощь.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2007-2014 гг.); научно-практических конференциях: Научно-практическая конференция, посвященная 30-летию совета молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2010 г.); Международная научно-практическая конференция «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности РФ» (Покров, 2011 г.); III международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию образования аграрного факультета РУДН (Москва, 2011 г.); Международная

научно-практическая конференция «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2012 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.

1.10 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 23 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 268 источников, из которых 131 на иностранном языке. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. В работе был использован вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота штамм «ВНИИЗЖ» (патент на изобретение №2221040).

Культуры клеток. Основные вирусологические исследования выполнены с использованием производственной суспензионно-монослойной (ВНК-21/2.17) и перевиваемой стационарной линии клеток почки сирийского хомяка (ВНКстац), перевиваемых монослойных линий клеток почки теленка (RBT и MDBK), перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), культуры клеток эмбриональной почки макаки (Marc-145).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: поддерживающая среда Игла (pH 7,2—7,4), солевой раствор Хенкса (pH 7,1—7,2), заменитель сыворотки Fetal Clone II, RAA (Sigma, США), Байтрил 10% раствор, раствор амфотерицина, раствор трипсина (0,25%), раствор версена (0,02%), спирт-ректификат из пищевого сырья, дезинфицирующий раствор NaOH (2%) (или его эквивалент), фосфатно-буферный раствор (ФБР).

Культивирование и титрование вируса ИРТ КРС в клеточных культурах. Проводили заражение перевиваемых культур клеток вирусом ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ». Инфицированную клеточную культуру инкубировали

при температуре (37±1)°С. Инфекционную активность проверяли методом титрования.

Определение антител к вирусу ИРТ КРС в сыворотках крови в реакции микронейтрализации. Проводили в соответствии с методическими указаниями, утвержденными директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010 г.

Определение антител к вирусу ИРТ КРС в сыворотках крови в реакции непрямой гемагглютинации. Проводили с помощью набора эритроцитарного диагностикума для серодиагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) ТУ 10-19-327-92 согласно инструкции производителя.

Определение антител к вирусу ИРТ КРС в сыворотках крови животных в ИФА. Проводили согласно ГОСТ 25755-91 "Методы лабораторной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" согласно инструкции производителя.

Статистическая обработка результатов исследований. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, коэффициентов вариации, достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по методу Стьюдента-Фишера, расчет стандартных отклонений результатов определения титров вируса, выраженных в

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Изучение чувствительности различных перевиваемых клеточных культур для культивирования вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ». В работе использовали следующие культуры клеток: ЯВТ, ВНК-21стац., ВНК-21/2.17, СПЭВ, Магс-145. Вирус культивировали в каждой культуре на протяжении 4 пассажей. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» репродуцировался в КК ЯВТ, ВНК-21стац, ВНК-21/2.17, СПЭВ. Но наиболее чувствительной к заражению оказалась перевиваемая культура клеток ЫВТ. Титр вируса с 1 по 4 пассаж был на достаточно высоком уровне: 6,3±0,14, 6,5±0,23, 6,25±0,15 и 6,33±0,11 ^ ТЦЦ50/см3, соответственно. В культуре клеток ВНК-21стац, ВНК-21/2_17, СПЭВ инфекционная активность вируса была невысокой (3,33-5,1 ^ ТЦЦ50/см3). В культуре клеток Магс-145 вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» не репродуцировался. Поэтому в качестве системы

культивирования для вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» была выбрана клеточная культура КВТ.

Таблица 1 — Результаты изучения чувствительности перевиваемых клеточных культур к вирусу ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» (п=5)

Культура клеток № пассажа ЦПД Время культивирования, ч Титр вируса, 1йТЦЦ5о/см3

1 + 42-48 6,3±0,14

КВТ 2 ++ 44-47 6,5±0,23

3 +-Н-+ 45-48 6,25±0,15

4 ++++ 40-42 6,33±0,11

1 ++ 120 4,10±0,32

ВНК-21 2 + 120 3,91±0,21

стац. 3 ++ 120 3,53±0,31

4 + 120 3,67±0,34

1 ++ 120 4,6±0,32

ВНК-21/2- 2 ++ 120 5,1±0,35

17 3 + 120 4,67±0,30

4 + 120 4,92±0,25

1 + 120 3,95±0,30

СПЭВ 2 + 120 3,62±0,27

3 + 120 3,33±0,21

4 + 120 3,45±0,24

1 - 120 0

Магс-145 2 - 120 0

3 - 120 0

4 - 120 0

2.2.2 Определение оптимальных условий культивирования вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в культуре клеток 1ШТ. Были изучены стадии взаимодействия вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в культуре клеток ЯВТ в зависимости от времени культивирования, множественности заражения и уровня рН поддерживающей среды.

ЦПД вируса в клеточной культуре характеризовалось появление округлых клеток и образованием участков свободных от клеток (рисунок 1). Формирование подобной картины наблюдали через 48 ч культивирования, и она совпадала с высоким титром инфекционной активности вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» (до 6,94±0,24 ^ ТЦДзо/см3).

1) неинфици-

рованная

культура

2)культура через 18-20 ч после заражения

3)культура через 18-20 ч после заражения

4)культура через 18-20 ч после заражения

Рисунок 1 - ЦПД вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в клеточной культуре RBT (х40)

Известно, что накопление вируса в клеточных культурах во многом определяется множественностью (дозой) заражения. В связи с этим мы проводили 4 пассажа, используя - 0,8, 0,08 и 0,01 ТЦД50/кл. Инкубацию вируса прекращали при 70-80% поражения монослоя. Инфекционную активность вируса определяли методом титрования (рисунок 2). Как видно из представленных на графике результатов, наибольшее накопление вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» (до 7,0 lg ТЦЦ50/см3) отмечали при множественности заражения 0,08 lg ТЦД5о/кл.

о s

7,5 7 ,5 6 ,5 5 ,5

4

5

3

1 пассаж

2 пассаж

3 пассаж

4 пассаж

количество пассажей

-»-0,8 lg ТЦЦ50/кл.

0,08 lg ТЦЦ50/кл 0,01 lg ТЦД50/кл

Рисунок 2 — влияние множественности заражения на накопление вируса ИРТ

При культивировании вирусов большое влияние оказывает величина рН поддерживающей среды. Наиболее интенсивно вирус накапливался при рН 7,4.

(таблица 2). Изменение показателя рН поддерживающей среды в более щелочную или в кислую сторону влекло к снижению уровня накопления вируса.

Таблица 2 - Влияние величины рН поддерживающей среды на репродукцию вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в перевиваемой клеточной культуре ЮЗТ

(ч=3)

Величина рН поддерживающей среды Титр вируса ИРТ КРС, lg ТЦЦ50/см3

6,5 4,85±0,25

7,0 5,45±0,33

7,4 6,58±0,25

7,6 5,58±0,42

8,0 3,56±0,30

2.2.3 Культивирование вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» роллерным методом. Изготовление инактивированных вакцин требует большого объема вирусного сырья с высокой инфекционной активностью, и вопрос повышения урожайности вируса остается актуальным. Для достижения этой цели использовали -роллерную систему культивирования в сосудах объемом 3000 см3. Первоначально была определена оптимальная посевная доза клеток RBT для получения вируссодержащего материала вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ». В опытах использовали посевную концентрацию клеток от 30 до 180 тыс/см3 (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние посевной концентрации клеток ЯВТ на репродукцию вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» (п=3)

Посевная концентрация клеток, тыс/см3 Возраст культуры, ч Время культивирования, ч Титр инфекционной активности, lgTHZWcM3

30-50 72 72 4,50±0,15

80-100 72 48 6,93±0,06

150-180 72 48 5,85±0,18

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что при репродукции вируса ИРТ КРС в культуре клеток ИВТ максимальное его накопление наблюдали при посевной концентрации клеток 80-100 тыс. кл./см3. Увеличение или уменьшение концентрации клеток при посеве вело к ослаблению репродукции вируса.

В ходе дальнейших исследований изучали влияние времени культивирования и объема поддерживающей среды (200, 300 и 400 см3) на

репродукцию вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в культуре клеток ЯВТ роллерным методом (таблица 4).

Таблица 4 — Уровень накопления вируса ИРТ в культуре клеток ЯВТ в зависимости от срока культивирования и объема поддерживающей среды ____(п=3)

Объем среды, см3 Время, ч Развитие ЦПД Титр, ^ ТЦЦ5о/см3

200 24 + 4,82±0,25

48 ++ 4,45±0,33

72 мм 4,41±0,21

300 24 ++ 4,56±0,42

48 -н- 5,86±0,17

72 4 111 5,75±0,24

400 24 1111 7,45±0,25

48 1111 7,36±0,33

72 И 1 1 7,24±0,14

Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что при культивировании роллерным методом на репродукцию вируса оказывает влияние как объем поддерживающей среды, так и время культивирования. Наибольший титр вируса ИРТ КРС приходился на 24 ч культивирования при 400 см3 поддерживающей среды.

На следующем этапе сравнивали результаты культивирования вируса ИРТ роллерным и стационарным методами (таблица 5).

Таблица 5. - Влияние времени культивирования на инфекционную активность при стационарном и роллерном методе культивирования вируса ИРТ КРС в культуре клеток ЯВТ (п=3)

Стационарное культивирование | Роллерное культивирование

№ время средний титр время средний титр

пассажа культивирования, вируса ИРТ КРС, культивирования, вируса ИРТ КРС,

ч 1йТЦД50/см3 ч 1йТЦД50/см3

1 48 6,30±0,05 32 6,28±0,02

2 44 6,50±0,06 28 6,90±0,03

3 46 6,25±0,03 24 7,56±0,03

4 48 7,00±0,05 24 8,50±0,05

Полученные результаты показывают, что роллерный способ получения вируса ИРТ КРС штамм "ВНИИЗЖ" в культуре клеток ИВТ, по сравнению со стационарным, позволил сократить время культивирования до 24 ч, увеличить объем получаемого вирусного сырья с одного культурального сосуда в два раза и повысить титр инфекционной активности вируса на 0,5-1,0 ^ ТЦД50/см3.

2.2.4 Сравнение репродукции вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в перевиваемых культурах клеток ЛВТ и МБВК. В настоящее время в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для культивирования вируса ИРТ КРС применяют перевиваемую клеточную культуру МОВК. Было необходимым сравнить по степени накопления инфекционных частиц утвержденную (МОВК) и предлагаемую (ЯВТ) систему культивирования. Вирус культивировали роллерным методом в обеих культурах на протяжении 10 пассажей. Биологическую активность вируса определяли методом титрования. Результаты отражены на рисунке 3.

_номер пассажа_

I —♦— RBT —♦—MDBK I

Рисунок 3 — Биологическая активность вируса ИРТ КРС в перевиваемых клеточных культурах RBT и MDBK

Титр инфекционной активности вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в

перевиваемой культуре клеток RBT достигал максимальных значений к 4-8

пассажу (8,25-8,55 lg ТЦДэо/см3) и до десятого пассажа оставался примерно на

одном уровне. В то время как в перевиваемой культуре клеток MDBK

максимальный титр инфекционной активности наблюдали только к 5-6 пассажу

(7,85-8,15 lg ТЦД5о/см3) и, начиная с восьмого пассажа, титр постепенно

снижался. Таким образом, применение перевиваемой культуры клеток RBT

позволил получить достаточно активный вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» на

протяжении как минимум 10 пассажей.

2.2.5 Влияние состава ростовых сред при культивировании

клеточных культур на репродукцию вируса ИРТ КРС. При получении

клеточных культур одним из компонентов ростовой среды является сыворотка

крови КРС, которая нередко содержит антитела ко многим вирусам. Также

существует большая опасность, что сыворотка крови может быть

контаминирована микоплазмами и вирусами. Целью наших исследований была

разработка способа культивирования вируса ИРТ КРС, позволяющего исключить контаминацию и повысить уровень накопления вируса ИРТ.

Были проведены сравнительные исследования по использованию коммерческих серий сыворотки крови КРС, сыворотки крови плодов коров и заменителя сыворотки. По полученным данным, все использованные серии коммерческой сыворотки крови КРС содержали антитела к возбудителю ИРТ КРС, что снижало уровень его накопления.

Культивирование вируса ИРТ КРС проводили стационарным и роллерным способами в культурах клеток MDBK и RBT, выращенных в присутствии фетальной сыворотки и заменителя сыворотки (Fetal Clone II). Инфекционную активность вируса проверяли методом титрования в клеточной культуре RBT (таблица 6).

Таблица 6. - Зависимость репродукции вируса ИРТ КРС от ростового фактора

среды (п=5)

Культура клеток Использование сыворотки крови плода коровы Использование заменителя сыворотки (Fetal Clone)

% время культивирования, ч контаминация титр вируса, lg TLWm/cm3 % время культивирования, ч контаминация титр вируса, lg ТЦД50/см3

Стационарный метод культивирования

RBT 5 48 + 8,0±0,20 3 44 - 8,7±0,14

MDBK 5 55 + 7,0±0,22 10 48 - 7,3±0,10

Роллерный метод культивирования

RBT 5 24 + 8,5±0,10 3 24 - 9,0±0,11

MDBK 5 55 + 7,85±0,22 5 48 - 8,2±0,10

Результаты ПЦР показали: вирусный материал, полученный в клеточной культуре, выращенной с помощью Fetal Clone И, не контаминирован микоплазмами и вирусом ВД. Таким образом, использование заменителя сыворотки как ростовой фактор среды при культивировании перевиваемых клеточных культур, а также роллерный метод культивирования позволили получить вирусный материал с высокой инфекционной активностью, свободный от микоплазм и вирусов-контаминантов.

2.2.6 Отработка режима инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ». В процессе усовершенствования технологии изготовления инактивированной вакцины стояла задача разработать эффективные режимы инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ».

Для изучения инактивирующего действия АЭЭИ на вирус ИРТ КРС в вируссодержащую суспензию вносили инактивант в конечной концентрации: 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%. Процесс инактивации проводили при температуре (37±1)°С в течение 24 ч. Степень инактивации определяли путем заражения инактивированным вирусом культуры клеток КВТ (таблица 7).

Таблица 7 - Инактивация инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» АЭЭИ в течение 24 часов при температуре 37°С (п=3)

Пассаж Концентрация АЭЭИ, %

0,001 0,005 0,01 0,05 0,1

1 + + - - -

2 + + - - -

3 + + - - -

Примечание: «+»- наличие ЦПД вируса ИРТ

«-» - отсутствие ЦПД вируса ИРТ.

В результате проведенных исследований было установлено, что вирус ИРТ КРС полностью терял свою инфекционную активность через 24 ч инактивации, при конечной концентрации АЭЭИ 0,01%.

Далее исследовали динамику инактивации вируса. С этой целью определяли титр инфекционной активности до обработки инактивантом и далее, через заданные интервалы времени, отбирали пробы и оценивали их инфекционность в перевиваемой культуре клеток КВТ. Полученные результаты использовали для построения регрессионной модели (рисунок 4)

Рисунок 4 - Динамика инактивации вируса ИТР КРС штамм «ВНИИЗЖ» под воздействием 0,01% АЭЭИ при (37±1)°С

Полученные данные позволили определить ожидаемую остаточную инфекционность инактивируемого вируссодержащего препарата в любое заданное время. Провели вычисление показателя Ig'Vj, прогнозируемого вне диапазона фактических измерений (для] >12).

Приняв наиболее осторожные условия прогноза, а именно наименьшую возможную величину константы инактивации, определили, что через 24 ч воздействия инактиванта, ожидаемый показатель остаточной инфекционности вируса приближенно составит значение lg'V24=10-7,3 ТЦ50/СМ3. Такой прогноз практически исключал возможность обнаружения инфекционного вируса в инактивируемом материале. Таким образом, полученные результаты позволили считать, что использованная технология инактивации вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» достаточно надежна и может быть использована при изготовлении вакцины.

2.2.7 Подбор масляных адъювантов для изготовления эмульсионных вакцин против ИРТ КРС. Эффективность инактивированных вакцин во многом зависит от применяемых адъювантов. Для создания наиболее иммуногенной и ареактогенной вакцины против ИРТ КРС испытали следующие масляные адъюванты: Montanide ISA-70, ISA-206, ISM-1113, ISM-2214 (Seppic, Франция).

Экспериментальные образцы вакцин готовили из вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» с титром не менее 6,0 lg ТЦД50/СМ путем его смешивания с испытуемыми адъювантами. Готовые образцы вакцины в объеме 2,0 см3 вводили взрослым кроликам подкожно в область между лопатками двукратно с интервалом 14 дней. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение, обращая внимание на общее состояние животных и место введения. Через 28 дней после начала иммунизации отбирали пробы крови и проводили патологоанатомическое исследование кроликов. Сыворотки крови исследовали на наличие антител против вируса ИРТ КРС (таблица 8).

Из таблицы 8 видно, что наименьшая тканевая реакция была у кроликов, иммунизированных вакциной с адъювантом ISA-70. При патологоанатомическом вскрытии места введения вакцины каких-либо изменений не выявлено. Лимфоузлы не были увеличены. Однако при этом наиболее высокие титры антител имели сыворотки крови кроликов, иммунизированных вакциной с данным адъювантом.

Таблица 8 - Сравнительное изучение различных адъювантов (п=5)

№/№ Наименование адъюванта Адъювант, % Титр антител до вакцинации, log2 Титр антител на 28 день, log2 Степень реактогенности

1 ISA-206 70 отр. 6,47±0,25 ++

2 1SA-70 70 отр. 8,24±0,04 -

3 ISM-1113 60 отр. 4,65±0,33 +++

4 ISM-2214 60 отр. 4,12±0,28 +

5 контрольная группа: отр. отр. -

Примечание: «-»- отсутствует «++» - слабая

«+»- очень слабая «+++»- умеренная

Таким образом, можно сделать вывод, что наименее реактогенными и обладающими наибольшей антигенной активностью являются вакцины, изготовленные на основании адъюванта Montanide ISA-70.

2.2.8 Получение концентрированного вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и гипериммунных сывороток. Для точной диагностики и технологического контроля вакцин необходимо получать высокоактивные и специфические антигены и сыворотки.

Исходную вируссодержащую суспензию осветляли низкоскоростным центрифугированием при 700 g в течение 10 минут. Надосадок отбирали (элюат

1), а осадок ресуспендировали в буфере STE до объема, равного 1% объема исходного вирусного материала. Для освобождения оставшегося вируса из клеток проводили 1-кратное замораживание-оттаивание осадка. После чего его центрифугировали при 700 g в течение 10 минут. Полученный надосадок (элюат

2) смешивали с элюатом 1, а осадок (клеточный детрит) ресуспендировали в буфере STE. Данную процедуру проводили дважды. Исследования проводили с объединенными надосадками (элюаты 1, 2, 3). В объединенный надосадок добавляли 50% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 6% по сухому веществу. Смесь выдерживали 2 ч при температуре 4°С до формирования осадка. Осадок отделяли ценрифугированием при 6000 g в течение 30 минут и ресуспендировали в 1-0,5 % исходного объема в буфере STE. Далее, под полученную суспензию подслаивали 20% раствор сахарозы и центрифугировали при 10000 g в течение 2 ч. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в буфере STE (табл. 9). Таким образом, при концентрировании вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» с помощью ПЭГ-6000 с последующим ультрацентрифугированием через 20%-ю сахарозу титр

инфекционной активности вируса ИРТ составил 9,88±0,15 — 10,51±0,12 ^ ТЦД50/см3.

Таблица - 9 Концентрирование вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» (п=3)

Метод культивирования вируса Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦЦ50/СМ3

до концентрирования после концентрирования

Стационарный 7,31±0,37 9,88±0,15

Роллерный 8,76±0,18 10,51±0,12

Инактивированный концентрированный вирусный антиген смешивали с равным объемом масляного адъюванта Montanide ISA-70. Кроликов иммунизировали в дозе 2 см3 трехкратно по следующей схеме:

в подушечки задних лапок;

через 7-10 дней после первой иммунизации - в подколенные лимфоузлы;

через 21 день после первой иммунизации — внутримышечно.

Через 10-15 дней после окончания гипериммунизации доноров обескровливали. Сыворотку исследовали на наличие антител. Средний титр антител в сыворотке крови кроликов составил 11,6±1 1о§2. Полученные данные свидетельствуют о том, что выбранный способ гипериммунизации доноров позволяет получать специфические высокоактивные гипериммунные сыворотки.

2.2.9 Оптимизация условий постановки РМН при выявлении антител против вируса ИРТ КРС. Для количественного определения антител против вируса ИРТ КРС в сыворотке крови КРС широко используют РН в культуре клеток. Однако методика постановки такой реакции требует больших материальных и трудовых затрат. Целью наших исследований явилась оптимизация условий постановки РМН для выявления антител против вируса ИРТ КРС.

Для культивирования клеток 11ВТ использовали среду Игла (рН 7,0-7,2) с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС (или синтетического заменителя сыворотки).

На первом этапе определяли оптимальную посевную концентрацию клеток. Использовали суспензию культур клеток 1ШТ 100-200><103, 300-500x103 и 700-800х103 кл./см3.

В результате проведенных опытов установлено, что монослой полностью сформировывался уже через 24 ч в лунках, где концентрация клеток была 0,3-0,5х103 кл/см3.

На следующем этапе была разработана методика титрования вируса ИРТ КРС. На основании результатов предварительного титрования готовили рабочие разведения вируса (100, 200 или 300 ТЩЫсм3).

Перед исследованием сыворотки инактивировали в водяной бане при температуре 58°С в течение 30 минут. Затем готовили ряд последовательных разведений исследуемых сывороток с шагом 2, после чего вносили подготовленные рабочие разведения вируса. Планшет помещали в СОг-инкубатор на один час при температуре (37±0,5)°С при 5% С02- После этого вносили суспензию клеток в среде Игла по 0,1 см3. Планшет инкубировали при температуре (37±0,5)°С 5% ССЬ в течение 96 часов. Микроскопию проводили ежедневно, регистрируя лунки с выраженным ЦПД и/или лунки со сформировавшимся монослоем (таблица 10).

Таблица 10 - Исследования серопозитивных и серонегативных сывороток с разными дозами вируса в РМН

Сыворотки Титры антител при различных дозах вируса, 1ой2

100 200 300

Серопозитивные 9,5 9,5 9,5

Серонегативные 2,0 2,0 2,0

Видно, что рабочая доза вируса в пределах от 100 до 300 единиц являлась оптимальной. Негативные сыворотки при рабочих дозах 100-300 давали одинаковые отрицательные результаты.

Для определения достоверности результатов РМН проводили исследования сыворотки крови животных, вакцинированных и невакцинированных против ИРТ КРС в РМН, РН и ИФА (таблица 11).

Таблица 11 - Результаты выявления антител в сыворотке крови животных

№ Характеристика проб Количество проб, шт. Результат ИФА Уровень антител против вируса ИРТ КРС, 1о^2

РН РМН

1 от невакцинированных кроликов 20 отр. отр. отр.

2 от вакцинированных против ИРТ КРС кроликов 300 положительно 5,96±2 6,3 2±2

3 от вакцинированных против ИРТ КРС коров 300 положительно 5,77±2 6,00±2

Как видно из таблицы 11, результаты разных методов серологического исследования совпадают между собой.

Далее с помощью РМН проводили контроль антигенной активности вакцин (таблица 12).

Таблица 12 - Антигенная активность производственных серий ассоциированных вакцин, включающих в себя антиген ИРТ КРС в РМН (п=5)

№ Наименование вакцины Средний уровень антител в РМН, log2

1 ПГ-З+ИРТ+ВД эм. 5,8±1,0

2 ПГ-З+ИРГ+Корона эм. 4,9±1,2

3 ПГ-З+ИРТ эм. 4,4±0,8

4 ПГ-З+ИРТ сорб. 4,5±1,0

Проведенные исследования показали возможность выявления антител к вирусу ИРТ КРС в сыворотках крови животных в РМН.

Таким образом, РМН — специфичный, чувствительный и экономически выгодный метод серологической диагностики ИРТ КРС. Данный метод успешно применяли для контроля производственных серий вакцин.

2.2.10 Изучение эпизоотической ситуации. Оптимизированная РМН позволила провести серологические исследования по идентификации антител к вирусу ИРТ КРС у невакцинированных животных. Были исследованы 3081 проба сыворотки крови КРС молочных и мясных пород и других видов животных (овец, коз, верблюдов и др.) (таблица 13).

Таблица 13 - Результаты исследований сыворотки крови домашних жвачных животных на наличие антител к вирусу ИРТ КРС

Вид животного Количество проб Положительные к вирусу ИРТ антитела, % Количество хозяйств

КРС молочных пород 1778 43,4 102

КРС мясных пород 1082 73,0 34

Верблюды 30 50,0 2

Овцы 41 59,0 5

Козы 150 39,8 9

Всего 3081 35,30 152

Антитела к вирусу ИРТ КРС выявили в 43,4% проб сыворотки крови КРС молочных пород, в 73,0% — от животных мясных пород, в 50% проб сыворотки крови верблюдов, в 39,8% и 59% проб коз и овец, соответственно.

Кроме того, исследовали сыворотку крови и компрессионную тканевую жидкость от убитых свободноживущих диких животных (олени, лоси, косули и пр.) (таблица 16).

Таблица 16 - Результаты исследований проб сыворотки крови и тканевой жидкости диких жвачных животных на наличие антител к вирусу ИРТ КРС.

Вид животного Количество проб Положительные пробы, %

Олени 16 18

Лоси 28 57,1

Косули 13 38,5

Изюбры 5 40

Антилопы-Дзерены 17 17,6

Таким образом, результаты исследований сыворотки крови разных видов животных свидетельствуют о широком распространении вируса ИРТ КРС среди домашних и диких жвачных животных. Полученные данные являются основанием для их использования при разработке мероприятий по борьбе и профилактике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Вирус ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток RBT, что позволило получить вируссодержащий материал с инфекционной активностью более 7,0 lg ТЦД50/см3.

2. Оптимизированы условия роллерного культивирования вируса ИРТ КРС в перевиваемой культуре клеток RBT, что позволило сократить время культивирования до 24 часов и увеличить степень накопления вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» до 8,5-9,0 lg ТЦД50/см3.

3. Доказана эффективность использования заменителя сыворотки Fetall Clon II (как ростового фактора) для получения перевиваемой культуры клеток RBT.

4. Отработан режим инактивации культурального вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» и подобран масляный адъювант для составления инактивированных эмульсионных вакцин против ИРТ КРС.

5. Отработан режим очистки и концентрирования вируса ИРТ штамм «ВНИИЗЖ» и получены высокоактивные сыворотки крови к нему.

6. Усовершенствованы условия постановки реакции микронейтрализации, которая предложена в качестве основного метода контроля антигенной активности вакцин против ИРТ КРС.

7. Серологический анализ показал широкое распространение вируса ИРТ КРС среди домашних и диких жвачных животных на территории Российской Федерации. Антитела к вирусу ИРТ КРС выявили в 43,4% проб сыворотки крови КРС молочных пород, в 73,0% - от животных мясных пород, в 50% проб сыворотки крови верблюдов, в 39,8% и 59% проб коз и овец, соответственно, олени -18%, лоси -57%.

4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИРТ — инфекционный ринотрахеит КРС - крупный рогатый скот ЦПД - цитопатическое действие

BHK-21/2-i7- перевиваемая клеточная культура почек сирийского

хомячка, производственная линия Marc-145 - перевиваемая клеточная культура почки макаки резус MDBK — перевиваемая клеточная культура почки теленка RBT — перевиваемая клеточная культура почки теленка СПЭВ - перевиваемая клеточная культура почки эмбриона свиньи ГОА - гидрат окиси алюминия ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ НД - нормативная документация РМН - реакция микронейтрализации РН — реакция нейтрализации РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Герпесвирусные болезни животных / Закутский Н.И., Хухуров И.Ю., Жестерев В.И. и соавт. Владимир, "Фолиант", 2003. -282с.

2. Анализ причин выбытия крупного рогатого скота мясных пород / В.А. Мищенко, A.B. Мищенко, В.В. Думова [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2014. -№3. - С. 19-22.

3. ГОСТ 25755 - 91. Крупный рогатый скот. Методы лабораторной диагностики инфекционного ринотрахеита. - М.: Изд-во стандартов, 1992.

4. Исследование уровня антител против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом ИФА / Д.П. Кузнецов, А.Я. Самуйленко, C.B. Кузнецова [и др.] // Современные пробл. иммунологии, биотехнологии, генной и

клеточной инженерии в вет. медицине: тез. докл. Всесоюз. науч.-техн. конф. — М„ 1990.-С. 75-76.

5. Некоторые результаты изучения этиологии респираторных болезней телят в хозяйствах Московской области / A.B. Пчелников, C.B. Алексеенкова, K.JI. Диас Хименес, К.П. Юров // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. — 2015. - №1 - С. 16-18.

6. Антитела к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых у северных оленей / А.Ф. Шуляк, К.П. Юров, М.П. Неустроев, И.А. Касьянов // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных. / ВИЭВ. - М., 2006. - С. 423-424.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нестеров, A.A. Вирусные болезни органов воспроизводства /

A.A. Нестеров, В.А. Мищенко, В.В. Думова// Веткорм. -2011. - №6. - С. 37-38.

2. Распространение вируса ИРТ у жвачных животных / В.А. Мищенко, В.В. Думова, М.Ю. Киселев, A.A. Нестеров, A.B. Мищенко, И.Н. Бакунов // Ветеринария. - 2011. - №9. - С. 22-25.

3. Определение вируснейтрализующих антител против вируса инфекционного ринотрахеита в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации микрометодом / A.A. Нестеров, В.А. Мищенко, В.В. Думова [и др.] // «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности РФ» Материалы Междунар. науч.-практ. - Покров, 2011. - С. 115120.

4. Результаты ретроспективного изучения циркулирования вирусов у коз /

B.В. Думова, В.А. Мищенко, A.A. Нестеров [и др.] // Актуальные пробл. заразных болезней животных, микробиологии, биотехнологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. - Ульяновск, 2011.-С. 83-85.

5. Роллерное культивирование вируса ИРТ КРС в перевиваемой культуре клеток RBT / A.A. Нестеров, В.А. Мищенко, В.В. Думова [и др.] // Сборник статей III Междунар. науч.-практ конф., посвященной 50-летию образования аграрного факультета РУДН. - М„ 2011. - С. 344-345.

6. Проблема вирусных инфекций у диких жвачных животных / В.А. Мищенко, В.В. Думова, A.B. Мищенко, В.М. Захаров, И.Н. Бакунов,

М.Ю. Киселев, A.A. Нестеров // Ветеринария и кормление. - 2011. - №5. - С. 89.

7. Оптимизация способов определения противовирусных антител в молозиве и молоке коров / М.Ю. Киселев, В.В. Думова, A.B. Мищенко, В.А. Мищенко, A.A. Нестеров II Ветеринария и кормление - 2011. - №6. - С. 24-25.

8. Превалентность противовирусных антител в сыворотке крови КРС, свободно выпасающегося на естественных пастбищах / В.В. Думова, В.А. Мищенко, A.A. Нестеров [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2012. - № 1. - С. 18-19.

Подписано в печать 31.03.2015г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л.1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»