Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка тест-систем для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ШАРАФИЕВА РЕГИНА РАФИКОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

гс дпр 2013

Казань-2013

005057816

005057816

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

- кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник Гумеров Вали Галиевич

- доктор биологических наук, профессор зав. лаб. иммунологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности Хисматуллина Наиля Анваровна

- кандидат ветеринарных наук, доцент каф. микробиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины Нургалиев Фарит Муллагалиевич

ГНУ «Научно исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ»

часов на заседании

Защита состоится " 2013 г. в_

диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок -2, «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань)

Автореферат разослан АЛ^ 2013 г. и размещен на

официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук В.И.Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Инфекционный ринотрахеит - герпесвирусная инфекция крупного рогатого скота всех возрастных групп и пород, характеризующаяся разнообразием клинических форм проявления. В настоящее время, данное заболевание в силу своей высокой контагиозности, получила широкое распространение во всех странах мира с развитым животноводством. Так, например, относительное количество неблагополучных стад КРС во Франции составляет 10%, в Испании — 25%, в Великобритании и Германии - 50%, Италии - 60%, в Бельгии - 63%, в Нидерландах - 70% (Олейник A.B., 2007; Иванов A.B. и соавт., 2008; Юров К.П., 2011; Ackermann М., 1990).

В последние годы приходиться сталкиваться с субклиническим течением, обусловленным циркуляцией штаммов BHV-1 с пониженной вирулентностью или повышением в стадах количества животных, имеющих специфические антитела. В таких случаях первичная инфекция быстро принимает латентный характер, при котором в тройничном нерве и других сенсорных ганглиях персестирует вирусная ДНК, а инфекционных вирионов нет. Латентное вирусоносительство находится под постоянным иммунным контролем со стороны макроорганизма. При понижении резистентности организма происходит реактивация вируса из латентного состояния и его выделение во внешнюю среду. Кроме того, вирус может выделяться спонтанно. При этом может отмечаться обострение инфекции как с развитием клинических признаков, так и без них (Глотов А. В. и соавт., 2009; Мищенко В.А. и соавт., 2012; Timoney Р. J. et. al., 1971; Bagnst Р. J., 1972).

Учитывая вышеизложенное, успешная борьба с инфекционным ринотрахеитом КРС во многом зависит от быстрой и достоверной диагностики, основанной на применение высокоспецифических иммунохимических тест-систем. В этом направлении перспективными методами являются ИФА и иммуноблотинг.

1.2 Цель и задачи исследований

Целью данной работы являлось разработка иммунохимических тест-систем для серологической диагностики ИРТ КРС. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-провести биохимический и иммунохимический анализы референтного, вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС и изыскать способы выделения специфического антигена;

-оптимизировать иммуноферментную тест-систему для серологической диагностики ИРТ КРС;

-разработать метод иммуноблотинга для серологической диагностики герпесвирусной-1 инфекции КРС.

13 Научная новизна работы

Впервые проведен сравнительный анализ структурных вирусных полипептидов 4-х изолятов вируса ИРТ, выделенных от больных животных из неблагополучных по респираторным заболеваниям хозяйств Среднего Поволжья, референтного и 2-х вакцинных штаммов герпесвируса - 1 КРС.

Усовершенствован способ получения антигена герпесвируса-1 КРС, при разработке иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита.

Разработан- метод иммуноблотинга для серологической диагностики ИРТ КРС.

1.4 Практическая значимость работы

Внедрение в практику ветеринарных лабораторий усовершенствованной иммуноферментной тест-системы и разработанного метода иммуноблотинга для серологической диагностики герпесвируса-1 позволит решить проблему достоверной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Проведены лабораторные, межведомственные комиссионные и производственные испытания усовершенствованной тест-системы «ИФА-АНТИ-ИРТ» с положительным результатом.

Показано, -что разработанная иммуноферментная тест-система ИРТ обладает экспрессностью (5-6 ч), а также высокой чувствительностью и специфичностью.

Материалы исследований по разработке иммунохимических тест-систем вошли в утвержденные научно-нормативные документы.

1.5 Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 20032012гг., Всероссийских и Международных научных конференциях и симпозиумах (Казань, 2004, 2005, 2006, 2007, 2010; Владимир, 2004; Москва, 2005).

1.6 Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 1 статья -в издании, рекомендованном ВАК РФ.

1.1 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками. Список литературы содержит 239 библиографических источников, в том числе 67 зарубежных авторов. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

1.8 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Результаты полипептидного и иммунохимического анализов штаммов возбудителя ИРТ КРС и разработка способов фракционирования и очистки, специфических антигенных комплексов вируса.

2. Усовершенствованная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и результаты определения ее активности и специфичности в лабораторно-производственных условиях.

3. Разработка метода иммуноблотинга для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

Работа выполнена в период с 2003-2012 гг. в лаборатории вирусологии «ФЦТРБ-ВНИВИ», (№-госрегистрации 01200202602). Результаты исследований апробированы в неблагополучных по респираторным заболеваниям крупного рогатого скота хозяйствах.

Отдельные этапы опытов были выполнены с участием д.б.н. Коксина В.П., д.б.н. Матвеевой Е.Л. и к.б.н. Хаертынова К.С., которым выражаю искреннюю признательность.

2.1.1 Вирусы. В экспериментах использовали нижеследующие штаммы вируса ИРТ: референтный - «ТК - (ВИЭВ)»; вакцинные - «ТК-А (ВИЭВ)-В2» и «4016»; изоляты - «КА-9», «АК-4», «К3-32», «МР-7», выделенные в лаборатории вирусологии «ФЦТРБ-ВНИВИ», из клинических и патологических материалов, от вынужденно убитых и больных респираторными заболеваниями крупного рогатого скота.

2.1.2 Культура клеток. В опытах применяли: перевиваемые культуры клеток - почки эмбриона коровы, линия MDBK и трахеи эмбриона коровы, линия TR, а также питательные среды и растворы: 0,5% раствор гидролизата лактоальбумина на растворе Хенкса; среда Игла MEM (рН 7,57,6) с глютамином; синтетическая среда 199; сбалансированный раствор Хенкса по стандартной прописи рН 7,2-7,4; сыворотка КРС; питательные среды для бактериологических исследований: МПА, МПБ, МППБ, среда Эдварда и Сабуро,

2.1.3 Животные. В экспериментах использовали: 40 кроликов массой 2,0-2,5 кг; 15 морских свинок массой 0,45-0,50 кг; 100 белых беспородных мышей массой 16-20 г; 607 гол. крупного рогатого скота разных возрастных групп и пород.

2.1.4 Биопрепараты. В исследованиях применяли следующие биопрепараты: набор диагностикумов инфекционного ринотрахеита КРС, ФГУ «Курская биофабрика-фирма «БИОК»»; конъюгаты антивидовые иммунопероксидазные против ^ в кролика, лошади, быка, барана, свиньи, мыши и морской свинки Филиал «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва); набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом «ИРТ - серотест» ООО «Ветбиохим» Россия, (г. Москва).

2.2 Методы

2.2.1 Разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики ИРТ КРС

а) Получение антигена вируса ИРТ для изготовления иммуноферментной тест-системы.

Наработку вирусной биомассы проводили на культурах клеток МДВК, ТО. методом роллерного и стационарного культивирования. Заражение 23-х суточной культуры клеток (после формирования монослоя) вирусом ИРТ в дозе 0,1-1,0 ТЦД 50/клетка проводили после смены ростовой среды на поддерживающую. Инфицированные культуры клеток инкубировали 30-36 ч при температуре 37°С.

При отработке способов получения антигена вируса ИРТ из вируссодержащей жидкости были использованы 3 подхода:

Первый способ основывался на разрушении инфицированных клеток 3-х кратным замораживанием и оттаиванием, с последующим концентрированием вирусного материала ультрацентрифугированием при 9000Gg-60 мин; при 2-ом методе - вирусную биомассу обрабатывали ультразвуком на аппарате УЗДН-2Т при 22 кГц, 0,5 Ватт/см2 2 мин и

концентрировали ПЭГом - 6000 в концентрации 7%; третий способ заключался в обработке инфицированных клеток неионным детергентом тритон Х-100 и осаждение вирусных частиц насыщенным раствором сульфатом аммония. Очистку антигенов от клеточных фрагментов проводили путем ультрацентрифугирования через градиент плотности (2060%) сахарозы при 100000§ в течение 60 минут. Контроль степени очистки антигена вируса ИРТ осуществляли методом электронной микроскопии и проведения электрофореза в ПААГе.

б) Получение контрольных сывороток

Специфическую сыворотку для контроля антигенов герпесвируса-1, выделенных 3-я вышеперечисленными способами, а также для оценки активности экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы получали на кроликах по методу С.Б.ВаПеу (1984) в нашей модификации.

С целью получения контрольной положительной сыворотки крупного рогатого скота для иммуноферментной тест-системы были отработаны две схемы гипериммунизации шести серонегативных к ИРТ откормочных бычков (по 3 головы на каждую схему) в условиях хозяйства.

Первая схема иммунизации основывалась на 4-х кратном с интервалом 7 дней внутривенном введении вакцинного штамма «ТК-А (ВИЭВ) В-2» вируса ИРТ с инфекционной активностью 6,0 ^ ТЦД 50/мл. Антиген животным вводили в возрастающих дозах: 10,0; 20,0 и 40,0 мл/гол. На 30 день с начала гипериммунизации брали кровь для серологических исследований. Бычки, у которых выявлялись в высоких титрах антитела в РН и ИФА к антигену вируса ИРТ использовались в дальнейшем как доноры для получения контрольной положительной сыворотки.

Вторая схема иммунизации животных основывалась на 4-х кратном, с интервалом в две недели, внутримышечном введении в области средней трети шеи по 2,0 мл/гол концентрированного по белку (3,5-4,2 мг/мл) эмульсионного антигена вакцинного штамма «ТК-А (ВИЭВ) В-2» вируса

HPT. Взятие крови у бычков и получение сыворотки проводили через 60 дней после начала иммунизации.

в) Получение диагностических антител против Ig быка меченных пероксидазой.

Выделение иммуноглобулинов из сыворотки КРС и кроликов, иммунизация животных и конъюгация Ig пероксидазой проводили по общепринятой технологии (Фримель Г., 1987; Хисматуллина Н.А., 1989; Nakane Р.К. et.al., 1974).

Активность и специфичность полученного препарата проверяли с использованием сывороток крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, кроликов, морских свинок, мышей в ИФА и РДП.

г) Разработка лабораторного регламента изготовления и контроля тест-системы ИФА.

С целью определения оптимальной концентрации антигена ИРТ-Тр для сенсибилизации планшета проводили измерение количества белка на спектрофотометре.

В дальнейшем из основного вирусного материала на растворе КББ (рН 9,6-9,8) готовили рабочие дозы антигена в концентрациях 3, 5 и 10 мкг/мл.

С целью отработки оптимальных условий адсорбции антигена на иммунологические планшеты были апробированы 3 способа посадки: 1-инкубация антигена при 37°С 1-1,5 ч; 2- инкубация антигена при 4°С 16 -18 ч; 3- во влажной камере при 18-22°С в течение 16-18 часов.

На основе проведенных исследований разработан лабораторный регламент изготовления иммуноферментной тест-системы «ИФА-АНТИ-ИРТ».

Активность и специфичность экспериментальных серий тест-системы испытывали в ИФА с использованием контрольной специфической сыворотки лошади из коммерческого набора диагностикума ИРТ гипериммунных кроличьих сывороток, а также гипериммунных и полевых

сывороток крови КРС. В качестве контрольного теста использовали реакцию нейтрализации.

Непрямой вариант твердофазного ИФА проводили по обще принятой методике. Учет результатов ИФА осуществляли визуально по разнице в интенсивности окраски продукта реакции исследуемой контрольной проб, а также на спектрофотометре «BIO-Rad Model 680» фирмы «BIO-Rad» при : Длине волны 490 нм (ОП 490) по методу И.Н. Матвеевой (2008).

2.2.2 Электрофорез

Диск — электрофорез вирусного материала проводили в линейном градиенте (10-20%) концентрации полиакриламидного геля по Laembly (1970) в аппарате «ХайуКалур».

2.2.3 Иммуноблотинг

В опытах по оптимизации метода иммуноблотинга для выявления сероактивных полипептидов использовали очищенные в градиенте (2060%) плотности сахарозы вакцинный-«ТК-А (ВИЭВ)-В2», референтный «ТК-(ВИЭВ)» и эпизоотический «КА-9» штаммы вируса ИРТ. При постановке иммуноблота использовали сыворотку крови реконвалисцентов КРС с титром антител в РН 1:128, а также гипериммунную сыворотку кролика, иммунизированного очищенным антигеном штамма «КА-9» с серологической активностью 1:64 в реакции нейтрализации.

При постановке иммуноблота электроперенос фракционированных в ПААГе полипептидов на нитроцеллюлозную пленку (фильтры «Миллипор»-22 нм) проводили с использованием угольных пластин и хроматографической бумаги, пропитанной электродным буфером.

Для проведения иммуноблотинга использовали антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты против Ig КРС и кролика, филиала «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва.

2.2.4 Статистическая обработка результатов исследований Статистическую обработку цифрового материала, полученного в ходе исследований, проводили общепринятыми методами вариационной

статистики согласно критериям Стьюдента при помощи прикладных программ Microsoft Excel 2000.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Изучение структурных белков различных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита КРС

В лаборатории вирусологии «ФЦТРБ-ВНИВИ» выделены на культуре клеток 4 изолята из патологических материалов, взятых от больных респираторными заболеваниями как молодняка, так и взрослого крупного рогатого скота. На основании изучения ультраструктуры, культурально-биологических свойств, а также серологическими исследованиями они были идентифицированы как герпесвирус-1 КРС.

Проведен сравнительный анализ структурных вирусных полипептидов 4-х изолятов вируса ИРТ шт. «K3-32», «КА-9», «МР-7», «АК-4», референтного шт. «ТК-ВИЭВ» и двух вакцинных штаммов «ТК-А(ВИЭВ)В-2» и «4016».

При разделении лизатов 7 штаммов вируса ИРТ электрофорезом были выявлены 28 структурных вирусных полипептидов с молекулярными массами от 12 до 290 кД. В составе вирусных полипептидов присутствовали как мажорные - с молекулярными массами 290, 254, 206, 164, 145, 133,96,90,74,68, 54, 50, 46, 41, 37, 33, 31, 27,23, 20, 18, 14, 12 кД, так и минорные полипептиды с молекулярными массами 117, 105, 44,35,24, 17, 13 кД.

При анализе денситограмм электрофоретическош профиля вирусных структурных полипептидов во всех штаммах были выявлены основные полипептиды с молекулярными массами: 105,96,90, 74,68,54,50,46,41,33 и 31 кД.

Анализ спектра вирусных полипептидов не выявил качественных отличий между штаммами вируса ИРТ. Однако установлено некоторое сходство по количественному составу полипептидов с молекулярной массой 33, 31, 27 кД между референтным штаммом «ТК-ВИЭВ» с

вакцинным «ТК-А(ВИЭВ)-В2» и изолятами «МР-7», «АК-4», а также между вакцинным штаммом «4016» с изолятами «КА-9» и «К3-32». Данное сходство штаммов ранее было подтверждено электронномикроскопически-ми исследованиями. При этом установлено, что первые четыре штамма герпесвируса — 1 КРС на 40-50% состояли из вирионов с суперкапсидной оболочкой, а в трех последних штаммах вируса ИРТ их присутствие достигала 10-15%. Следует также отметить, что аналогичные результаты были получены Н.И. Закутским (1998) при изучении ультраструктуры вакцинных штаммов «ТК-А(ВИЭВ)-В2» и «4016» вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

С целью установления сходства и различия происхождения белковых фракций были проведены дополнительные исследования по выявлению сероактивных фракций 3-х штаммов («ТК-ВИЭВ», «ТК-А (ВИЭВ)-В2», «КА-9») вируса ИРТ в иммуноблотинге, с использованием специфической гипериммунной сыворотки кролика. При этом во всех трех штаммах были выявлены серопозитивные фракции к основным структурным вирусным полипептидам с молекулярными массами от 12 до 96 кД.

Учитывая сходство полипептидного состава, а также сероактивность в иммуноблоте иммунодоминантных фракций (96, 90, 74, 50, 46, 41,37, 35, 33, 27, 12 кД) различных штаммов герпесвируса — 1, в дальнейших опытах по получению антигена и сывороток для иммуноферментной тест-системы использовали штамм «КА-9».

Эпизоотический штамм «КА-9» депонирован в «ФЦТРБ-ВНИВИ».

3.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита КРС 3.2.1 Получение антигена вируса ИРТ крупного рогатого скота и оценка его активности в ИФА

При отработке способов получения антигена вируса ИРТ из инфицированных клеток были использованы 3 подхода: воздействия температуры, ультразвука, детергента на культуру клеток с дальнейшей

очисткой вирионов ультрацентрифугированием в градиенте плотности (2060%) сахарозы.

Электронно-микроскопические исследования показали, что при физико-химической обработке инфицированных вирусом ИРТ культуры клеток отмечаются вирионы как с суперкапсидной оболочкой, так и лишенные ее, что говорит о прочности связи полноценных вирионов вируса ИРТ с клеточными структурами.

При изучении активности антигенов, полученных тремя способами, в ИФА с использованием контрольных специфических сывороток установлено, что метод очистки клеточно- ассоциированного вируса ИРТ воздействием на инфицированные клетки раствором тритона X - 100 в условиях максимального сохранения структуры клеточных мембран позволяет получить вирусный материал в 1,4 — 2,2 раза в ИФА активней антигенов выделенных физическими методами.

Учитывая это обстоятельство в дальнейших опытах антиген (ИРТ-Тр) для иммуноферментной тест-системы получали методом химического воздействия на инфицированные клетки.

Установлено, что при ультрацентрифугировании вирусного материала ИРТ-Тр через ступенчатый градиент (20-60%) плотности сахарозы он разделяется на 3 фракции и осадок. Электронно-микроскопическими исследованиями каждой из полученных фракций было установлено, что в верхней полосе в основном содержался балластный клеточный белок. Фракции №2 была представлена «голыми» вирйонами с различной степенью заполненности калсида. При исследовании фракций №3 было установлено, что она в основном состояла из вирионов с суперкапсидной оболочкой. В осадке были обнаружены фрагменты клеточных мембран и единичные вирионы.

Контроль степени очистки антигена ИРТ-Тр от клеточных фрагментов осуществляли электрофорезом в ПААГе. Установлено, что в препаратах антигена очищенного в градиенте (20-60%) плотности сахарозы

присутствуют 20 полипептидов. При этом в пробах, обработанных только неионным детергентом отмечается присутствие 5-и полипептидов, которых нет в очищенном препарате, а в пробе,' частично очищенной на 20% подушке из сахарозы, присутствуют три лишних полипептида. Таким образом, в процессе предварительной очистки из антигенного препарата исчезают полипептидные фракции с молекулярными массами от 50 до 90 кД, а при очистке в градиенте концентрации (20 - 60%) сахарозы фракции (от 12,0 до 40 кД).

При исследовании в ИФА препаратов вируса ИРТ взятого на различных этапах очистки с использованием сывороток реконвалесцента КРС было установлено, что его концентрирование уже начинается при осаждении инфицированных клеток. На этапе химической обработки вирусного материала детергентом концентрирование было незначительным, так как целью этого этапа являлось высвобождение вируса из комплекса клеточных фрагментов. Наибольший эффект был получен при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Концентрация вирусного антигена в двух средних фракциях превосходила его содержание в вируссодержащей культуральной жидкости в 5-10 раз (за вычетом контроля).

3.2.2 Разработка рациональных схем гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов антигеном вируса ИРТ для получения контрольной положительной сыворотки для иммуноферментной тест — системы

С целью получения специфической контрольной сыворотки крови КРС для ИФА тест-системы были использованы 2-схемы гипериммунизации 6-ти серонегативных к вирусу ИРТ откормочных бычков антигенами герпесвируса-1 в условиях хозяйства.

Результаты исследований показали, что у животных в обеих группах выявлялись высокие титры антител к вирусу ИРТ как в РН от 1:64 до

1:128, так и в ИФА при разведение сывороток 1:400 величина ОП490 колебалась от 0,85 до 1,28.

В связи с этим обе схемы иммунизации рекомендуются нами для получения контрольной специфической сыворотки.

В опытах по получению специфической сыворотки к антигену вируса ИРТ на кроликах установлено рациональное использование более длительных сроков гипериммунизации животных.

3.2.3 Получение антшидовых антител против Ig быка для иммуноферментной тест-системы ИРТ крупного рогатого скота и оценка их специфичности в лабораторных условиях

Одним из ключевых компонентов любого иммуноферментного диагностического набора является конъюгат. С этой целью были проведены опыты по получению антивидовых антител против Ig быка меченных ферментом пероксидазой.

Результаты исследований показали, что опытный препарат не дает перекрестных реакций с сыворотками других видов животных и активность его в ИФА достигало величины ОГТ49о - 0,754±0,02 (Кс = 6,1), также как и у аналога ОП490 - 0,781±0,01 (Кс=6,3). Учитывая трудоемкость получения конъюгата в лабораторных условиях, нами было принято решение использовать в экспериментальном наборе иммуноферментной тесТ-системы «ИФА-АНТИ-ИРТ» препарат выпускаемый ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

3.2.4 Разработка лабораторного регламента изготовления и контроля иммуноферментной тест-системы для диагностики ИРТ крупного рогатого скота

На начальном этапе изготовления тест-системы были проведены опыты по определению оптимальной концентрации антигена вируса ИРТ и условий для сенсибилизации им иммунолощческих планшет.

Результаты опытов показали, что планшеты сенсибилизированные антигеном вируса ИРТ в концентрации 5 мкг/мл во влажной камере при

комнатной температуре в течение 16-18 ч обладают более высокой антигенной активностью. Следует также отметить, что при исследовании в ИФА иммобилизированных планшет через 3 года (срок наблюдения) при соблюдении условий хранения 4°С, плотно закрытая крышка, укупорены в полиэтиленовые пакетики) они сохраняли антигенную активность. При постановке ИФА с контрольной специфической сывороткой крупного рогатого скота было выявлено незначительное (0,5 - 1,0 снижение их активности.

3.2.5 Оценка специфичности антигена вируса ИРТ экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы ИФА-АНТИ-ИРТ

: Специфичность 3-х экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы проверяли с использованием гипериммунных сывороток, полученных к антигенам вирусов парагриппа-3, вирусной диареи - болезнь слизистых и аденовирусу 1-ой серогруппы, а также контрольной положительной и отрицательной сывороток из набора «ИФА-АНТИ-ИРТ».

Анализ результатов исследований показал, что при постановке ИФА величина ОП 490 при разведении контрольной положительной сыворотки к вирусу ИРТ 1:400 достигала уровня 1,212 (Кс=8,8). Следует отметить, что данный показатель с сыворотками полученными к вирусам ПГ-3, ВД-БС и аденовирусу колебался на уровне (0,204-0,245) близкой к величине ОП 490 (0,137) контрольной отрицательной сыворотки крупного рогатого скота. Это обстоятельство свидетельствует о высокой специфичности антигена вируса ИРТ в иммуноферментной тест-системе «ИФА-АНТИ-ИРТ».

3.2.6 Лабораторные и производственные испытания экспериментальных серий тест-системы «ИФА-АНТИ-ИРТ»

С целью изучения активности и специфичности экспериментальных серий тест-системы были проведены сравнительные опыты с коммерческим набором «ИРТ-серотест» (ООО «Ветбиохим» г. Москва).

Результаты исследований показали, что по активности и специфичности экспериментальные серии «ИФА-АНТИ-ИРТ» не уступают «ИРТ-серотест». При этом следует отметить, что тест-система разработанная в «ФЦТРБ-ВНИВИ», обладает рядом преимуществ: во-первых, положительная контрольная сыворотка в 1,5 раза более активней положительного контроля (К+) из коммерческого набора; во-вторых в состав набора «ИРТ-серотест» входит конъюгат, изготовленный фирмой «•^епаэа» (Испания), в то время как в опытных сериях тест-системы можно использовать экспериментальный конъюгат или препарат выпускаемый НИИЭМ им. И.Ф. Гамалеи, (г. Москва).

Дальнейшим этапом наших исследований являлось изучение специфичности и активности разработанных ИФА тест - систем для ретроспективной диагностики ИРТ крупного рогатого скота. С этой целью были происследованы вРНиИФА 601 проба сывороток крови, взятых от клинически здоровых, вакцинированных, больных и переболевших респираторными и генитальными формами герпесвирусной - 1 инфекцией КРС из 15 хозяйств республик Татарстан, Башкортостан, Марий Эл, Удмуртия, а также Ростовской, Липецкой и Самарской областей.

Анализ результатов производственных испытаний показал, что разработанная нами иммуноферментная тест - система обладает более высокой чувствительностью (1,1 - 2,3 раза) и активностью (на 3,6 - 5,2 1о{&) по сравнению с реакцией нейтрализацией.

При исследовании сывороток крови от вакцинированных животных установлено, что у КРС, привитого вакциной «Комбовак» на 6,8% в РН и на 7,6% в ИФА меньше выявляются положительно реагирующих проб сывороток к вирусу ИРТ, чем у вакцинированных «Ассоциированной вакциной против ПГ - 3, ИРТ и ВД-БС КРС» («ФЦТРБ - В НИВ И»), Следует также отметить более низкий уровень титров антител (на 1,2 1о§2 в РН и на 1,1 1о§2 в ИФА) у животных, вакцинированных коммерческим препаратом по сравнению с опытно-производственной вакциной.

Высокая активность и специфичность экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы ИРТ также подтверждены межлабораторными комиссионными испытаниями в «ФЦТРБ-ВНИВИ» и производственными испытаниями в вирусологическом отделе республиканской ветеринарной лаборатории г. Йошкар-Ола.

Таким образом, лабораторные и производственные испытания экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы для диагностики ИРТ показали ее высокую серологическую активность и специфичность, что позволяет рекомендовать данный препарат для серологической диагностики герпесвирусной-1 инфекции крупного рогатого скота.

3.3 Отработка метода иммуноблотинга для серологической диагностики ИРТ крупного рогатого скота

В опытах по постановке иммуноблота использовали референтный, вакцинный и эпизоотический штаммы вируса ИРТ, а также сыворотку крови реконвалесцента КРС, с серологической активностью 1:128 в реакции нейтрализации.

При постановке вестрн блота с использованием сыворотки реконвалесцента КРС, а также ранее проведенного иммуноблотинга с гипериммунной кроличьей сывороткой, была выявлена их реакция с 10 фракциями с молекулярными массами от 12 до 96 кД.

Анализ результатов иммуноблотинга с использованием фракционированных препаратов трех вышеперечисленных штаммов вируса ИРТ с сыворотками реконвалесцента КРС и кролика показал высокую сероактивность фракций 96, 90, 74, 50, 46, 41,35, 33, 27 и 12 кД.

Таким образом, при постановке заключительного серологического диагноза, критерием оценки наличия специфических антител к возбудителю ИРТ в сыворотке крови КРС методом иммуноблотинга могут служить 8 иммунодоминантных фракций с молекулярными массами 96,90,50,46,41,35,33 и 27 кД.

19

4 ВЫВОДЫ

1. При сравнительном анализе вирусных структурных полипептидов референтного, двух вакцинных штаммов и 4-х изолятов вируса ИРТ выявлено 28 полипептидов с молекулярными массами от 12 до 290 кД. Во всех семи штаммах герпесвируса-1 КРС присутствовали основные полипептиды с молекулярными массами: 105, 96, 90, 74, 64, 54, 50, 46, 41, 33 и 31 кД.

2. Оптимальным методом получения антигена вируса ИРТ КРС для иммуноферментной тест-системы является обработка вирусной биомассы 2%-ным раствором детергента тритон Х-100, с последующим осаждением белков насыщенным раствором сульфата аммония и дальнейшей очисткой антигена ультрацентрифугированием через 20-60% градиент плотности сахарозы.

3. Разработаны две схемы гипериммунизации КРС с целью получения контрольной специфической сыворотки для иммуноферментной тест-системы (ИФА-АНТИ-ИРТ): 1-ая схема - четырех кратное с интервалом семь дней, внутривенное введение вакцинного штамма вируса ИРТ; 2-ая схема - четырех кратное, с интервалом пятнадцать дней, внутримышечное введение концентрированного и эмульгированного в масляном адъюванте антигена вируса ИРТ.

4. Иммунологические планшеты иммобилизированные антигеном ИРТ-Тр в концентрации 5 мкг/мл в течение 16-18 ч при температуре 20±2°С во влажной камере сохраняли высокую серологическую активность в течение 3-х лет (срок наблюдения).

5. Лабораторными, межведомственными комиссионными и производственными испытаниями экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы (ИФА-АНТИ-ИРТ) доказана их высокая активность, специфичность и экспрессность при массовых серологических исследованиях.

6. Методом иммуноблотинга выявлено 8 иммунодоминантных полипептидов вируса ИРТ с молекулярными массами: 96, 90, 50, 46, 41,35, 33, 27 кД, с помощью которых можно выявить специфические антитела к герпесвирусу-1 при постановке заключительного диагноза на инфекционный ринотрахеит КРС.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке тест-систем для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота вошли в следующие нормативные документы утвержденные директором «ФЦТРБ-ВНИВИ»:

- Методические рекомендации по усовершенствованию способа получения антигена вируса ИРТ;

- Технические условия на «Тест-систему иммуноферментную для выявления антител к вирусу ИРТ КРС (ИФА-АНТИ-ИРТ)»;

- Инструкция по применению «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к ИРТ КРС».

6 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахметсафин Р.Г. Экспресс-диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота реакцией непрямой гемагглютинации / Р.Г. Ахметсафин, P.P. Шарафиева// Матер. Всероссийской научно-практич. конф. по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса. - Казань,2004.- С.5-6.

2. Ахметсафин Р.Г. Смешанные респираторные инфекции молодняка крупного рогатого скота / Р.Г. Ахметсафин, P.P. Шарафиева, В.В. Естифеев// Матер, научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» 29 июня 2007.- Казань, 2007.- С. 102104.

3. Ганиев И.М. Стимуляция пролиферации клеток в культуре и репродукции в них вирусов комбинированием сывороток крови разных видов животных / И.М. Ганиев, Н.И. Гурьянов, Р.Я. Гильмутдинов, ,В.Г, Гумеров, P.P. Шарафиева// Научные основы обеспечения защиты животных от экзотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Матер. Международного симпозиума 28-30 ноября 2005 г.- II Часть.- Казань, 2005. - С. 92-96.

4. Ганиев И.М. Эффективность комбинирования сывороток крови разных видов животных при наработке вирусной (ИРТ и ПГ-З) массы на перевиваемых культурах клеток / И.М. Ганиев, В.Г. Гумеров, Р.Я. Гильмутдинов, Н.И. Гурьянов, P.P. Шарафиева//Матер. Всеросс. конф. ВГНКИ «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспектива», 14-15 февраля 2Q05 г.- Москва, 2005. - С. 26-27.

5. Гумеров В.Г. Разработка диагностических тест-систем при инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота / В.Г. Гумеров, А.К. Галиуллин, Р.Г. Ахметсафин, P.P. Шарафиева, и др.// Научные основы обеспечения защиты животных от экзотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Матер. Международного симпозиума 28-30 ноября 2005 г.- II Часть.- Казань, 2005.-С.113-117.

6. Гумеров В.Г. Клинико-эпизоотологический и серологический мониторинг смешанных респираторных инфекций телят / В.Г. Гумеров, Р.Г. Ахметсафин, P.P. Шарафиева, Р.Х. Юсупов, и др.// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Казань, 2006. - Том 188,- С.83-89.

7. Гумеров В.Г. Изучение полипептидных профилей штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / В.Г. Гумеров, P.P. Шарафиева, В.П. Коксин // Матер. Всеросс. научно-практич. конф. Казань, 2007.- С. 16-17.

8. Шарафиева P.P. Индикация вируса инфекционного ринотрахеита КРС в биологическом материале методом иммуноблотинга / P.P. Шарафиева // Матер, научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» 29 июня 2007.- Казань, 2007.-С. 140-141.

Формат издания 60x84 1/15, V 1.0 пл., тир. 100 экз. заказ А 28 Отпечатано в типографии И.П.Чермяниной А.П.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Шарафиева, Регина Рафиковна, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

На правах рукописи ШАРАФИЕВА РЕГИНА РАФИКОВНА

04201357521

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник В.Г. Гумеров

Казань-2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген АТ - антитело

ВНИВИ - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт ВСЖ - вируссодержащая культуральная жидкость ГВ - герпесвирус

ГА-активность - гемагглютинирующая активность

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

^ в - иммуноглобулины класса О

ИРТ - инфекционный ринотрахеит

ИПВ - инфекционный пустулезный вульвовагинит

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

КРС - крупный рогатый скот

МОВК-культура перевиваемых клеток почки эмбриона коровы

ОП - оптическая плотность

ОФД - орто - фенилендиамин

РВЛ - республиканская ветеринарная лаборатория

РДП - реакция диффузной преципитации

РИА - радиоиммунный анализ

РИФ-реакция иммунофлюоресценции

РН - реакция нейтрализации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РП - реакция преципитации

РСК - реакция связывания комплемента

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РТГАд - реакция торможения гемадсорбции

СБ - субстратный буферный раствор

БОБ^а - додецилсульфат натрия

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин ТрХ-100- тритон Х-100

ТФ-ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ТЦД - тканевая цитопатогенная доза

ТЫ - культура перевиваемых клеток трахеи эмбриона коровы ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель

ФГБУ «ФЦТРБ» - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

ФСР - фосфатно-солевой раствор

ФСР - Т - фосфатно-солевой раствор с твином-20

ЦПД - цитопатическое действие

ЦПЭ -цитопатический эффект

СОДЕРЖАНИЕ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ........................ 6

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 10

2.1 Этиологическая роль герпесвируса-1 в возникновении ИРТ-ИПВ и клинико-эпизоотологические особенности их проявления............................................................... 10

2.2 Морфология и химический состав вириона герпесвируса - 1 крупного рогатого скота.................................................. 13

2.3 Методы лабораторной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.............................. 20

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................. 31

3.1 Материалы исследования............................................. 31

3.2 Методы исследования................................................... 32

3.2.1 Разработка иммуноферментной тест-системы для

серологической диагностики ИРТ КРС............................... 32

Получение антигена вируса ИРТ для изготовления

иммуноферментной тест-системы.................................... 32

Получение контрольных сывороток.................................... 34

Получение диагностических антител против

иммуноглобулинов быка, меченных пероксидазой................. 35

Разработка лабораторного регламента изготовления и контроля иммуноферментной тест-системы для серологической

диагностики ИРТ КРС.................................................. 36

Электрофорез............................................................. 38

Иммуноблотинг.......................................................... 39

Статистическая обработка результатов исследований........... 40

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............ 41

4.1 Изучение структурных белков различных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота......... 41

4.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота............................................... 48

4.2.1 Получение антигена вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и оценка его активности в ИФА..... 48

4.2.2 Разработка рациональных схем гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов антигеном вируса ИРТ для получения контрольной положительной сыворотки для иммуноферментной тест-системы.................................. 59

4.2.3 Получение антивидовых антител против ^ быка для иммуноферментной тест-системы ИРТ крупного рогатого скота

и оценка их специфичности.............................................. 61

4.2.4 Разработка лабораторного регламента изготовления и контроля иммуноферментной тест-системы для диагностики ИРТ крупного рогатого скота..................................................................................62

4.2.5 Оценка специфичности антигена вируса ИРТ экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы 64 ИФА-АНТИ-ИРТ..........................................................

4.2.6 Лабораторные и производственные испытания экспериментальных серий тест-систем ИФА-АНТИ-ИРТ..............65

4.3 Отработка метода иммуноблотинга для серологической

диагностики ИРТ крупного рогатого скота................................................71

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................75

6 ВЫВОДЫ......................................................................................................................................84

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................86

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................87

9 ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................................114

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышение продуктивности и сохранности сельскохозяйственных животных не выполнимо без обеспечения эпизоотического благополучия животноводства. Несмотря на значительные достижения в борьбе с инфекционными заболеваниями, ряд из них постоянно вызывают беспокойство ветеринарной службы.

Особое место в этом контексте занимает возбудитель инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота (КРС), который довольно широко распространен в большинстве стран мира (Петрова О.Г. и соавт., 2008).

В нашей стране инфекционный ринотрахеит КРС регистрируется практически во всех крупных животноводческих регионах и наносит значительный экономический ущерб, который слагается из снижения удоя молока у коров при острой форме течения болезни (до 50-60 %), яловости коров при вагинальной форме болезни (до 50 %), выбраковке и падежа телят до 20 % и более при осложнениях вторичной микрофлорой (Высокопоясный А.И., 2000; Мищенко В.А. и соавт., 2000; 2003; 2012; Гумеров В.Г. и соавт., 2003; Иванов A.B. и соавт., 2008; Лисицын В.В., 2010).

В связи с тем, что вирус ИРТ как и многие герпесвирусы способен формировать латентную инфекцию (Полянцев Н.И. и соавт., 2004; Будулов Н.Р., 2008), а также учитывая применение для профилактики ИРТ КРС большого числа живых и инактивированных вакцин, важное значение имеет точная и своевременная идентификация возбудителя, и вместе с тем в литературе отсутствует достаточное количество данных по идентификации штаммов герпесвируса-1 КРС на основе изучения ультраструктуры, биохимических характеристик вириона (Нефедченко A.B., 2002; Глотов A.B. и соавт., 2007; Олейник A.B., 2007; Timoney P.J. et. al., 1971; Bagnst P.J., 1972). В этой связи создание высокоспецифических иммунохимических тест-систем для диагностики ИРТ КРС остается

важной задачей ветеринарии. В этом направлении перспективным являются методы ИФА и иммуноблотинг.

Цель работы: Целью данной работы являлось разработка иммунохимических тест-систем для серологической диагностики ИРТ КРС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-провести биохимический и иммунохимический анализы референтного, вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС и изыскать способы выделения специфического антигена;

-оптимизировать иммуноферментную тест-систему для серологической диагностики ИРТ КРС.

-разработать метод иммуноблотинга для серологической диагностики герпесвирусной -1 инфекции КРС.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ структурных вирусных полипептидов 4-х изолятов вируса ИРТ, выделенных от больных животных из неблагополучных по респираторным заболеваниям хозяйств Среднего Поволжья, референтного и 2-х вакцинных штаммов герпесвируса -1 КРС.

Усовершенствован способ получения антигена герпесвируса-1 КРС, при разработке иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита.

Разработан метод иммуноблотинга для серологической диагностики ИРТ КРС.

Практическая значимость работы. Внедрение в практику ветеринарных лабораторий усовершенствованной иммуноферментной тест-системы и разработанного метода иммуноблотинга для серологической диагностики герпесвируса-1 позволит решить проблему достоверной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Проведены лабораторные, межведомственные комиссионные и производственные испытания усовершенствованной тест-системы «ИФА-АНТИ-ИРТ» с положительным результатом.

Показано, что разработанная иммуноферментная тест-система ИРТ обладает экспрессностью (5-6 ч), а также высокой чувствительностью и специфичностью.

Материалы исследований по разработке иммунохимических тест-систем вошли в утвержденные научно-нормативные документы.

Апробация результатов исследований. Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2003-2012гг., Всероссийских и Международных научных конференциях и симпозиумах (Казань, 2004, 2005, 2006, 2007, 2010; Владимир, 2004; Москва, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 1 статья - в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 .Результаты полипептидного и иммунохимического анализов штаммов возбудителя ИРТ КРС и разработка способов фракционирования и очистки, специфических антигенных комплексов вируса.

2.Усовершенствованная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и результаты определения ее активности и специфичности в лабораторно-производственных условиях.

3.Разработка метода иммуноблотинга для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками.

Список литературы содержит 235 библиографических источников, в том числе 84 зарубежных авторов. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Этиологическая роль герпесвируса-1 в возникновении ИРТ-ИПВ и клинико-эпизоотологические особенности их проявления

ИРТ-герпесвирусная инфекция КРС с разнообразными клиническими проявлениями, но с преимущественным поражением респираторных и половых путей (Мищенко В.А. и соавт., 2003; Глотов В.А. и соавт., 2006; 2009; Юров К.П. и соавт., 2007; Конопаткин А. и соавт., 2009; Олейник A.B., 2010; RoizmanB.et.al. 1992).

Впервые это заболевание было зарегистрировано в 1950 году Миллером в штате Колорадо (США) у откормочного скота. Несколько позже подобную инфекцию отмечали Schroeder R.J., Moys M.D. (1954) в штате Калифорния среди телят молочной фермы. В 1956 году Madin S.H. et. al., используя культуру клеток почки эмбриона коровы, из носовой слизи, взятой у больного теленка в острой стадии респираторного заболевания, выделили и идентифицировали вирус-возбудителя болезни, а затем экспериментально воспроизвели эту инфекцию на естественно восприимчивых животных (Бессарабов Б.Ф. и соавт., 2007).

В нашей стране заболевание, подобное инфекционному ринотрахеиту, было зарегистрировано Ф. М. Пономаренко в 1938 году и на основании клинических признаков и гистологических исследований описано как инфекционный катар верхних дыхательных путей (Гугушвили H.H. и соавт., 2001).

По данным ряда исследователей, вспышкам заболевания способствует большая концентрация поголовья крупного рогатого скота на ограниченных площадях, что является характерной особенностью современных методов ведения скотоводства (Крюков H.H., 1970, 1972; Хитрова А.Е. и соавт., 2003; Straub О.С., 1977; 1979). Однако, в мелких хозяйствах и при пастбищном содержании крупного рогатого скота, заболевание не причиняет существенного ущерба. Повышенная тенденция к перезаражению животных вирусом ИРТ на крупных комплексах во

многом связана с часто перемежающимися пассажами вируса, ведущими к повышению его вирулентности. Повышение вирулентности вируса путем быстрых пассажей на восприимчивых особях доказано также и при генитальной форме болезни (Подкопаев В.М. и соавт., 1985).

Большую опасность предоставляет абортивная форма болезни, которая трудно выявляется и может быть причиной эпизоотий. От инфицированной матери к плоду вирус передается либо непосредственно из материальной части плаценты в плодную часть через систему кровообращения, либо при прогрессирующем прохождении через плаценту от клетки к клетке. В последнем случае наличие специфических антител в организме коровы не препятствует инфицированию плода (Гончарова JI.B. 1997; Яковлев А. Е. и соавт., 2004; Полянцев Н.И. и соавт., 2004; Будулов Н.Р., 2008; Иванов А.В. и соавт., 2008; Durham P.J.K., 1974; Woernle Н., 1985).

Аборты у коров наблюдаются обычно в последнем триместре стельности; признаков подготовленности организма к отелу при этом не наблюдается. Каких-либо клинических симптомов, предвещающих аборт, обычно не отмечают. Однако, у абортировавших коров, как правило, случается переболевания какой-либо формы ИРТ-ИПВ за несколько недель до аборта (Подкопаев В.М. и соавт., 1985; Юров К.П. и соавт., 1998; Костыркин Ю.А., 2003).

Чрезвычайно опасным источником возбудителя инфекции являются быки-производители, у которых вирус длительное время может сохранятся в лимфатических фолликулах слизистой оболочки паха, препуция и пениса (Штрауб О.Х.,1981; Андреев Е.В. и соавт., 1985; Жидков С.А. и соавт., 2006; 2010; Будулов Н.Р., 2008; 2010; Юров К.П., 2011; Oirschot J.T. et. al, 1995; Noorqraf V., 1998; Shaik G., 1998). Особое значение ИРТ-ИПВ приобретает в племенных хозяйствах, где после переболевания племенные животные могут остаться носителями вируса и в дальнейшем стать источником возбудителя инфекции при эксплуатации на

Государственных племенных станциях (Глотов А.Г. и соавт., 2002). Такие быки как правило, периодически выделяют вирус со спермой, причем четкой закономерности в его выделении нет (Сюрин В.Н. и соавт., 1983; Глотов А.Г. и соавт., 1998; 2000; 2002; Петрова А.Г. и соавт., 1994; 2000; 2002; Астахова Т.С. и соавт., 2010; Pospisil Z., et. al., 1979). Поскольку генитальная форма заболевания передается при спаривании или при использовании контаминированной вирусом спермы, скрытое течение заболевания представляет особую опасность при распространении этой инфекции. Коровы могут заболевать инфекционным вульвовагинитом после случки с быками- производителями, у которых не было отмечено симптомов заболевания. Один больной бык за период активной деятельности может заразить около 40-50 тыс. коров и телок (Сюрин В.Н. и соавт., 1998; Самуйленко А .Я. и соавт., 2001; Петрова О.Г. и соавт., 2005; 2006; Юров К.П. и соавт., 2009; Гаффаров Х.З. и соавт., 2008; Конопаткин А. 2009).

В появлении болезни и распространении ее в стаде особую роль играют животные с различным иммунным статусом характерной особенностью возбудителя ИРТ является то, что вирус пожизненно сохраняется в клетках организма, несмотря на наличие гуморальных антител. При этом на фоне технологических стрессов у животных возможны реинфекции, как правило, без проявления видимых клинических признаков, но сопровождающиеся выделением вируса во внешнюю среду и заражением других воспримчивых животных (Фарботко Г.Э. и соавт., 1994; Печура Е.В., 2007; Pastoret P.P. et. al., 1985).

Известно, что вирус ИРТ КРС, как и многие герпесвирусы способен формировать латентную инфекцию после первичного острого переболевания. Латентное состояние вируса поддерживается в нервных ганглиях вблизи места его первичного проникновения: тройничном-после респираторного и сокральном-после полового. При этой форме болезни нарушен полный цикл репликации вирусных частиц, и они чаще

представлены в виде ДНК-копий, интегрированных с геномом клетки-хозяина (Сергеев В.А. и соавт., 2007; Салтыкова В.А. и соавт., 2008; Красиков А. и соавт., 2009).

Латентное состояние вируса находящегося под постоянным иммунным контролем со стороны макроорганизма, снижение или подавление которого различными эндо- и экзогенными факторами приводит к его реактивации и выделению через первично инфицированный орган во внешнюю среду. При этом вирус не теряет своей патогенности для восприимчивых животных (Глотов А.Г. и соавт., 1996; 2000; 2003; 2009; Петрова О.Г. и соавт., 1997; 2000; Закутский Н.И., 1998; Салтыкова В.А. и соавт., 2008; Л