Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование технологии культивирования вируса для производства инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии культивирования вируса для производства инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота"

0 д на правах рукописи

УДК 619:616.98.578.083.2.825.1:636.1

1 ДЕН 1998

МАЙДЖИ ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности и Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Научные руководители:

■ заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор

Константин Павлович Юров В кандидат биологических наук Виктор Серафимович Иванов

Официальные оппоненты:

в заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Лев Петрович Дьяконов (ВИЭВ) И кандидат биологических наук Федор Петрович Курченко (ВГНКИ ветпрепаратов)

Ведущее учреждение - Московская Государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина.

Защита диссертации состоится «■£ ^» $ л 199 В г. в ¿1* на

заседании Диссертационного совета К 02di.28.01/при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко по адресу: Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан /иМ^Ь^ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г.Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Инфекционный ринотрахеит - одно из самых распространенных вирусных заболеваний крупного рогатого скота.

Экономический ущерб, приносимый сельскохозяйственному производству инфекционным ринотрахеитом /ИРТ/ складывается из снижения продуктивности, гибели молодняка, нарушения функции воспроизводства, а также затрат на ветеринарно - санитарные мероприятия.

Интенсивное изучение этого заболевания в нашей стране и за рубежом проводится с 50-х годов. Спектр научных исследований охватывает эпизоотологическую характеристику различных регионов, анализ клинических форм заболевания, выделение полевых изолятов вируса и определение пггаммовых различий, изучение структуры вириона, биологических свойств вируса и механизмов иммунной защиты организма, разработку лабораторной диагностики и средств специфической профилактики.

В настоящее время борьба с инфекционным ринотрахеитом основывается на вакцинопрофилалсгике. На вооружении ветеринарной практики существует ряд эффективных, и безопасных вакцин против ИРТ: живых и инактивированных, в моно- и ассоциированной форме, которые несмотря на создание субъединичных и рекомбинантных вакцин, продолжают оставаться превалирующими типами профилактических препаратов для ИРТ.

Технико-экономические показатели вакцин во многом зависят от выбора клеточного субстрата и метода культивирования вируса.

В нашей стране в производстве вакцин против ИРТ применяют технологию, основанную на репродукции вируса в монослое, главным образом, первично-трипсинизированных клеток, выращенных на поверхности стеклянных

ПрС«ЗПСД1ГТСЛ1*ИССТ1> \\ ТруДОСмКОСТЪ nunujin.iv и.мин

технологии является сдерживающим фактором для производства

инактивированных вакцин, изготовление которых требует значительно большего количества вирусного сырья, чем для живых препаратов.

Одним из перспективных направлений решения проблемы изготовления инактивированных противовирусных вакцин является использование в технологии производства методов крупномасштабного культивирования клеток и вирусов, среди которых наиболее распространенными и экономически выгодными являются методы размножения вируса в суспензии клеток и на поверхности микроносителей.

В связи с этим, при разработке технологии изготовления инактивированных вакцин против ИРТ приобретают актуальное значение вопросы изучения и совершенствования клеточных систем и методов для крупномасштабного культивирования вируса.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлось изыскание наиболее технологичного способа культивирования вируса ИРТ для производства инакгивированной вакцины.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ чувствительности к вирусу ИРТ различных культур клеток, перспективных для крупномасштабного выращивания.

2. Изучить методы крупномасштабного культивирования вируса ИРТ в суспензии клеток и на микроносителях.

3.Изыскать высокотехнологичный метод культивирования вакцинного штамма вируса ИРТ "ТК-А ВИЭВ приемлемый для изготовления инакгивированной вакцины.

4.0пределить условия хранения вакцинного вируса.

5.Испытать иммуногенную активность опытной серии инактивированной вакцины.

Научная новизна исследования.

1 .Изучены условия культивирования вируса ИРТ в различных клеточных системах. Установлены пермессивные условия для репродукции возбудителя в зависимости от вида клеточных культур, индивидуальных особенностей животных-доноров ( для первичных культур ), способа культивирования ( в монослое, суспензии и на микроносителях).

2. Показана принципиальная возможность репродукции вируса ИРТ в суспензии клеток и применения этой системы в биотехнологии.

3. Разработана технология культивирования вируса ИРТ на основе отечественного микроносителя, обеспечивающая получение высокоактивного материала, пригодного для изготовления инактивированной вакцины.

4. Установлены оптимальные параметры хранения вируса ИРТ шт."ТК-А ВИЭВ", позволяющие сохранить его биологическую активность.

Практическая значимость исследований.

Предложен способ культивирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК с использованием микроносителей, который обеспечивает высокий выход вирусного сырья для производства инактивированной вакцины против ИРТ. Материалы диссертации включены в нормативно - техническую документацию по производству инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции " Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов ", 1987 г. и одобрены Государственной межведомственной комиссией МСХ РФ по испытанию гетер::::ар:1^:х 5::слсг;г:сс;с;;х препараюв (ирш.лу! от 26 января 1993г., ВГНКИ).

Публикации научных исследований.

Результаты, представленные в диссертации опубликованы в 6 работах, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предложения. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами, 4 рисунками и 5 фотографиями. Список литературы содержит 205 источников на русском и иностранных языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Вирусы.

В работе использовали вакцинный штамм вируса ИРТ "ТК-А ВИЭВ", для контрольного заражения - эпизоотический штамм "Оренбург", полученные из ВГНКИв 1980г.

Культуры клеток.

В исследованиях применяли первично-трипсинизированные культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), почки теленка (1ТГ), тестикул бычков (ГБ), а также следующие перевиваемые линии клеток :

ПСГК, СЭК, ТЭК, Ь-41, ПМС, та, ПО-2, ПЭАК, СПЭВ, СУ, МДВК, ВНК-21/13, МДСК, ПТ-80.

Культуры клеток получали и поддерживали в лабораториях противовирусных препаратов и культуры тканей ВНИИТИБП .

Хранение клеток осуществляли в жидком азоте (-196°) с использованием в • качестве криопротектора диметилсульфоксида /ДМСО/.

Размножение вируса.

Культивирование вируса ИРТ в стационарном монослое клеток проводили общепринятыми методами, суспензионное культйвиройание - в лабораторных аппаратах спиннерного типа емкостью 0,5-Зл, снабженных подвесными мешалками. Для размножения вируса ИРТ в суспензии использовали перевиваемые линии клеток BHK-21/I3 и ПТ-80, а также питательные среды, содержащие 2-3% аминопептида или сыворотки эмбриона коров, не содержащей антител к вирусу ИРТ.

Культивирование вируса ИРТ на микроносителях осуществляли в перевиваемых культурах клеток ПТ-80 и МДВК с использованием аппаратов спиннерного типа и микроносителей (МН) "Цитодекс-3" фирмы Fine Chemicals и отечественных МН "ВИ-3", изготовленных во ВНИИТИЕП ( Иванов ВЛГ., авт. свид., 1988 ).

Определение инфекционного титра вируса.

Инфекционный титр определяли по цитопатическому действию в пробирочных культурах клеток методом десятикратных разведений вируса. Титр вируса вычисляли по Риду и Менчу и выражали в тканевых цитопатических дозах (ТЦДзо/мя).

Серологические исследования.

Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных определяли в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток ПТ-80 с постоянной дозой вируса 1000 ТЦД5одщ. и двукратными разведениями сыворотки. !

В некоторые эксперименты включали контрольную лиофилизированную сыворотку телят с активностью (1,54 +- 0,096)^ЭД5о/да, откалиброванную против 3,26 + 0,21^ТЦДзо/мх (п=56) . Результаты выражали по индексу нейтрализации (ИН) относительно контрольной сыворотки.

Подопытные животные.

'"■""' Для оценки антигенной активности вирусных образцов использовали морских свинок. Животных двукратно иммунизировали по 0,5 мл подкожно с интервалом в 14 дней, сыворотку крови исследовали на наличие антител к ВИРТ в реакции нейтрализации. ' Изучение иммуногешшх свойств опытной серии инактивированиой ' вакцины против ИРТ проводили в эксперименте на 6 телятах Калининской области, которых двукратно вакцинировали с последующим контрольным заражением.

Реизолнция вируса. ■ Вирус ИРТ выделяли из материала носовых секретов на первичных культурах клеток ПЭК и ПТ по стандартной методике.

Электронно-микроскопические исследования.

Электронно-микроскопические исследования проводили в секторе электронной микроскопии ВНИИТИБП (зав. сектором, канд. вет. наук,Б.Е.Блехерман ).

Статистическая обработка результатов.

Результаты обрабатывали статистически по методу Фишера-Стьюдента. Для параллельных экспериментов применяли разностный метод Стьюдента. ' Эксперименты по оптимизаций условий хранения вируса ИРТ обрабатывали • методом регрессионного анализа в лаборатории экономики ВНИИТИБП (канд. ' ' "физ:- мат.наук,А А.Маслак).

- РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Выбор чувствительных культур клеток к вирусу ИРТ для крупномасштабного культивирования.

Основными требованиями , предъявляемыми к культурам клеток, используемым при крупномасштабном культивировании, являются

экономичность технологий выращивания клеток и высокая чувствительность к вирусу.

Исследование чувствительности различных культур клеток' к вирусу ИРТ проводилось рядом отечественных и зарубежных авторов. Вирус ИРТ размножается во многих гомологичных и гетерологичных культурах клеток (Madin S.N. et äl, 1956; Konles V.R., 1967; Femm M. et al, 1981; Franko E. et al, 1970; Зудилина З.Ф., 1970; Закутский Н.И. и др., 1992 ) . Однако показатели инфекционности в различных источниках не всегда равнозначны, что, по-видимому, связано с качеством клеток, особенностями используемого штамма и биологической вариабельностью экспериментов. Невозможность одновременного анализа широкого спектра культур и нестандартность условий постановки опытов, обусловленная изменением РН поддерживающей среды, концентрации клеток и другими факторами, привела нас к необходимости выбора тест-культуры для сравнительной оценки чувствительности исследуемых культур к вирусу ИРТ.

По предварительной оценке одной из высокочувствительных к ВИРТ является перевиваемая линия клеток ПТ-80, полученная в ВИЭВ в 1985г. Дьяконовым Л.П. с соавторами, в результате длительного субкультивирования и Направленной селекции первично-трипсинизированной культуры клеток почки теленка. 1

Клетки ПТ-80 обеспечивали хороший рост в монослое, были неприхотливы к качеству используемых питательных сред. При многочисленных элекгронно-микрйскопических исследованиях этой линии клеток не было выявлено посторонних спонтанных контаминантов (Блехерман Б.Е., 1981-1982гг). * В лаборатории противовирусных препаратов ВНИИТИБП был создан прс;п5сдс75скный лрииСанк клеток ITT-8U. С целью '"определения возможности использования этих клеток в качестве тест-культуры

проводили титрование лиофилизированного вируса ИРТ штамм "ТК-А ВИЭВ" в пробирочном монослое клеток ПТ-80 различных ступеней криобанка.

При исследовании 2, 6 и 12 пассажа каждой ступени банка было показано, что чувствительность клеток ПТ-80 к вирусу ИРТ практически не изменяется, по крайней мере, на уровне 12 пассажей. 3 ступень криобанка было принято считать рабочей и использовать клетки ПТ-80 в качестве тест-культуры из этой ступени до 12 пассажа включительно. Тест - культура ПТ-80 в дальнейшем включалась во все сравнительные эксперименты для оценки инфекционной активности вируса ИРТ.

Для определения наиболее чувствительных к вирусу ИРТ кулыур клеток , пригодных для изготовления инактивированных вакцин был проведен сравнительный анализ первично-трипсинизированных клеток ПТ, ПЭК, ТБ и 14 перевиваемых линий клеток: ТЯ, ТЭК, ПТ-80, ВНК-21/13, ПО-2, СЭК, МДСК, МДВК, ПЭАК, СУ, ПСГК, ПМС, СПЭВ, Ь-41 относительно тест-культуры.

В опытах использовали вирус ИРТ штамм "ТК-А ВИЭВ" 2 пассажа в ПТ-80 с титром 7,0 - 715^ТЦД5о/т. • Исследование проводили методом параллельного титрования в испытуемой культуре и тест-культуре ПТ-80. Результаты выражали в относительных единицах по индексу чувствительности 5= Т / Р , где £ - обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД отмечается в 50% испытуемого пробирочного монослоя, р -обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД обнаруживается в 50% монослое клеток ПТ-80.

Чувствительность первичных клеток и их субкультур к вирусу ИРТ.

В производстве живых вакцин против ИРТ используется технология культивирования вируса в монослое первично-трипсинизированных Культур клеток. Трудоемкость технологического процесса затрудняет использование первичных клеток для изготовления инактивированных препаратов, требующих накопления больших объемов вакцинного вируса. Представляло интерес

изучить возможность использования в производстве не только первичных клеток, но и их субкультур. В связи с этим, был проведен анализ чувствительности различных первично-трипсйнизированных культур клеток почки эмбриона коровы и телят, а также их субкультур к вирусу ИРТ.

Исследование чувствительности первично-трйпсинизированных клеток и их субкультур на уровне 3 пассажей, полученных от 17 доноров, показало, что наряду с высокочувствительными культурами клеток (1=1,0 - 10,0 ) отдельные расплодки обладают низкой чувствительностью и поддерживают репродукцию вируса на уровне 5,0 - 5,5^ТЦД5о/мл. .

Эти данные согласуются с исследованиями Елск и. 81аиЬег (1983), который отметил вариации титров В ИРТ в различных первичных культурах клеток, и, по-видимому, связаны с индивидуальными особенностями животных - доноров первичных клеток.

Попытка создания криобанка субкультур из высокочувствительных линий не привела к успеху, так как клетки плохо субкультивировались. После замораживания удалось восстановить только 4 линии из 10.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что использование первичных клеток и их субкультур в технологии производства инактивированных вакцин ограничивается различной чувствительностью к вирусу.

Чувствительность перевиваемых линий клеток к вирусу ИРТ.

Применение перевиваемых линий клеток в технологии производства вакцинных препаратов имеет ряд преимуществ : возможность постоянного хранения в виде матричных культур, однородность по клеточному составу и стабильная чувствительность к вирусам.

В настоящее время накоплен достаточный материал, свидетельствующий о безопасности биоппепарятоп пптопянпчу о использсЬ—"¡г;.:

перевиваемых клеток в медицинской и ветеринарной практике (РеШсиат /.С. е1 а1, 1982 НогоёпсеапиР.А.,1981).

Был проведен сравнительный анализ относительно тест-культуры ПТ-80 различных перевиваемых клеток. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Проведенными исследованиями установлено, что линии клеток МДСК, СУ, Ь-41, ПСГК, ПЭАК, ПМС, СПЭВ практически не чувствительны к вирусу ИРТ. Чувствительность клеток ПО, СЭК, и ВНК-21 ниже чувствительности ПТ-80 в 100-300 раз.

Таблица 1. Чувствительность перевиваемых линий клеток к

вирусу ИРТ.

Наименование клеток. Индекс чувствительности к вирусу ИРТ относительно ПТ-80.

та 1,0-4,2

ТЭК 1,0-2,0

ПТ-80 1,0

ВНК-21/13 0,01 - 0,005

ПО-2 0,02 - 0,003

СЭК 0,01 - 0,003

МДСК 0,0001 -0,00001

мдвк 0,8-1,1

ПЭАК, СУ, ПСПС, ПМС, 0

СПЭВ, Ь-41.

Перевиваемые линии клеток МДВКД'К, ТЭК и ПТ-80 были определены как наиболее чувствительные к ВИРТ. Инфекционный титр ВИРТ в культурах ТЯ,

ТЭК и МДВК был равен или выше (2-5 раз) активности вируса в ПТ-80, что соответствовало 7,0 - 7,51§ТЦД5о/т.

При выращивании культур клеток "ГО и ТЭК отмечалась неустойчивость культуральных характеристик, что затрудняло их использование. Клетки МДВК и ПТ-80 формировали выраженный и устойчивый клеточный пласт при высоком коэффициенте пересева и были выделены для крупномасштабного культивирования вируса ИРТ.

Изыскание оптимальных способов культивирования вакцинного штамма вируса ИРТ.

Стабильность, воспроизводимость и экономичность технологии производства противовирусных препаратов во многом определяется не только выбором клеточного субстрата, но и методикой культивирования.

Недостатками распространенного метода культивирования в матрасных колбах является трудоемкость при крупномасштабном изготовлении вакцин и низкая производительность труда. По сравнению с обычным способом, суспензионный и псевдосуспензионный методы обладают рядом преимуществ, основными из которых, по нашему мнению, являются получение высокой плотности клеточной и вирусной популяции при минимальных затратах сред и материалов и высокой производительности труда.

С целью выбора наиболее технологичного способа культивирования вируса ИРТ для производства инактивированной вакцины в сравнительных экспериментах исследовали различные методы выращивания вируса ИРТ шт. "ТК-А ВИЭВ" - в монослое, суспензии и на микроносителях.

Размножение вируса инфекционного ринотрахеита в суспензии клеток.

Исследования по культивированию различных вирусов в суспензии перевиваемых клеток показали эффективность и экономичность этого метода. Ввиду высокой чувствительности ко многим вирусам и высокой'потенции роста в суспензии широкое применение получили клетки ВНК-21. Многолетние

исследования по оптимизации условий культивирования вируса ящура в суспензии ВНК-21 показали высокую производительность этого метода (Пономарев А.П. и др., 1995; Saha S.N., Sen А.К.Д990).

Одной из наших задач было изыскание оптимальной системы для культивирования вируса ИРТ в суспензии клеток.

В качестве модели суспензионного культивирования использовали клеточную систему ВНК-21.

Перевиваемые клетки ВНК-21/13 успешно культивировались в суспензии с 3-кратным приростом без предварительной адаптации. В наших экспериментах установлена относительно низкая чувствительность этой культуры клеток к ВИРТ 4,5 - 5,3 lgTIXTJзоаи. по сравнению с контрольной системой ПТ-80 7,0 - 7,5%ТЦД5в/мл. более чем в 100 раз (таблица 1).

С целью повышения чувствительности клеток ВНК-21 к вирусу ИРТ было проведено адаптационное пассирование вируса, включающее прямые и перемежающие пассажи вируса в ВНК-21/13 и первично-трипсинизированных клетках эмбриона коровы (ПЭК).

В одном из вариантов ограниченного перемежающего пассирования вируса в культурах клеток ВНК-21 и ПЭК ( 6 пас. ВНК-21 и 5 пас. ПЭК ) произошло резкое повышение инфекционного титра вируса, который далее не изменялся в 11 прямых пассажах ВНК-21 и накапливался на уровне 6,315 ± 0,128^ТЦД5о/ш1. ( n=10, р < 0,05), таблица 2.

При параллельном культивировании в клетках ВНК-21/13 адаптированного и нативного вируса в 5 последовательных пассажах была показана статистически достоверная разность титров - 1,105 ± 0,18 lgTIXIbo/un ( п=10, р<0,05 ), что позволило нам константировать 10-кратное повышение чувствительности клеток ВНК-21 к ВИРТ в результате адаптации.

Культивирование вируса ИРТ в суспензии клеток ВНК-21 проводили с вирусом, прошедшим адаптационное пассирование. Использовали вирус, репродуцированный в монослое ВНК-21 с титром 6,З^ТЦД<о/ил . Заражающая доза вируса в различных экспериментах варьировала от ОД до 2 ^ТЦД50/„ . В процессе культивирования отбирали пробы для исследования инфекционной и антигенной активности.

В наших экспериментах на модели клеток ВНК-21 был применен • традиционный метод суспензионного культивирования: выращивания клеток в суспензии, а затем заражения суспензионной культуры и культивирования вируса. Для сравнительных экспериментов клетки, выросшие в монослойной культуре, отделяли от стекла, осаждали центрифугированием, осадок заражали и после адсорбции, равные части инфицированных клеток культивировали стационарным и суспензионным способом. Инфицированный монослой клеток ВНК-21 служил контролем.

Результаты сравнительных экспериментов показали, что вирус ИРТ накапливается в суспензионной системе клеток ВНК с инфекционным титром 4,89 ±0,16 ^ТЦДдамл ( п=8, р < 0,05 ), таблица 2, что в 7 - 14 раз уступает соответствующим показателям в монослое ( доверительный интервал между значениями титров вируса ИРТ , репродуцированного в монослое и суспензии ВНК-21/13 составляет 0,987 ± 0,1521дТЦД50/мл , п = 8 , р < 0,005).

При исследовании антигенной активности проб вируса, выращенного в суспензии и монослое ВНК-21/13, вируснейтрализующие антитела обнаруживались в разведениях сыворотки 1: 2 и 1 : 6 - 1 : 8 , соответственно, ,( таблица 2 ).

Сравнительно низкая продуктивность суспензионной системы ВНК-21, на наш взгляд, может рассматриваться как показатель незавершенности процесса адаптации вируса ИРГ к клеткам ВНК-21. В свою очередь, повышение активности вируса после ограниченного адаптационного пассирования

позволяет предположить, что потенциальные возможности использования клеток ВНК-21 для промышленного культивирования вируса ИРТ не исчерпаны, и эта система требует дальнейшего более глубокого изучения.

Попытки культивировать клетки ПТ-80 в суспензии оказались безуспешными. Однако, для клеток ПТ-80 была отмечена способность длительное время сохраняться в суспензии. При исследовании динамики накопления вируса ИРТ в переживающей суспензии клеток ПТ-80 и монослое мы не выявили существенных отличий, что позволило использовать суспензионную культуру ПТ-80, также как и монослойную, в качестве контроля в сравнительных опытах аналогично способу, описанному выше для системы сравнительных экспериментов ВНК-21 (монослой - суспензия). Клетки ПТ-80 размножали в монослое, переводили в суспензию и инфицировали вирусом, инфицированные клетки далее культивировали суспензионным и монослойным способами.

Результаты сравнительных экспериментов по культивированию вируса ИРТ в суспензионных системах клеток ВНК-21 и ПТ-80 представлены в таблице 2.

Проведенными исследованиями было показано, что вирус ИРТ размножается в суспензии клеток ПТ-80 в титрах 7,017 ±. 0,304^ТЦД5о/на , не уступающим значениям, полученным в монослое (различия в титрах достоверно незначимы ). Антигенная активность вируса, репродуцированного в суспензии ПТ-80, также практически не отличалась от показателей, полученных в монослое. Уровень антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных исследуемыми антителами, составил 1:16-1:32.

Результаты опытов подтвердили высокую продуктивность клеток ПТ-80 и явились свидетельством принципиальной возможности использования суспензии клеток для получения высокоактивного вируса ИРТ.

Таблица 2. Инфекционная и антигенная активность вируса ИРТ, репродуцированного в различных клеточных'системах.

монослой ВНК-21 суспензия ВНК-21 контроль

монослой ПТ-80 суспензия ПТ-80

инфекционный титр в ^ТЦД

исходный вирус

5,21 ±0,177 (п=10, р<0,05) 4,89 + 0,16 (п=8, р<0,05) 7,27 ±0,2 (п=7,р<0;05) 7,017 + 0,304 (п=6, р<0,05)

адаптированный вирус

6,315 ±0,128 (п=10, р<0,05)

Вируснейтрализующие АТ в сыворотке крови иммунизированных морских свинок.

1:6-1.8 0 -1:2 1:16-1:40 1:16-1:32

Культивирование вируса ИРТ в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК на микроносителях.

Низкие биологические показатели для вируса ИРТ в суспензии клеток ВНК-21 и невозможность применения культуры клеток ПТ-80 для суспензионного культивирования не позволили нам использовать суспензионный метод в технологии изготовления инактивированной вакцины против ИРТ.

Метод микроносителей обладает преимуществами как суспензионного, так и монослойного культивирования и применяется для поверхностно-зависимых клеток, позволяя получать культуры объе.мом несколько сотен литпоп при

концентрации 5-бмлн клеток в 1мл. В настоящее время метод микроносителей испытан для выращивания практически всех видов клеток.

В лаборатории противовирусных препаратов ВНИИТИБП исследованы различные типы микроносителей: ДЭАЭ-сефадекс А-50, Цитодекс-1, 2, 3 типа и отечественные микроносители Циголар-2 и ВИ-3 (Иванов B.C.,1988).

На поверхности микроносителей Щгголар-2 и ВИ-3 через 7-8 суток формировался мощный клеточный пласт. Урожай при этом составлял 4-5 х 105 кл/см2, что более чем в два раза превышало урожай клеток на стеклянной поверхности в стационарных условиях (Иванов B.C. и др.,1987).

В соответствии с поставленной задачей - определить наиболее эффективный метод культивирования вируса ИРТ шт.'"ТК-А ВИЭВ", было проведено сравнительное исследование выращивания вируса в перевиваемых линиях клеток ГТГ-80 и МДВК на микроносителях и в стационарном монослое.

В экспериментах использовали вирус ИРТ 2 пассажа в культуре клеток ПТ-80 с титром 7,2 lgTHHso/va, микроносители ВИ-3 и Цитодекс-3. Постановка опытов включала следующие операции: клетки выращивали в монослое, после отделения от стекла равные части суспензии высевыли в культуру микроносителей и контрольные флаконы. Контролем служили обычные монослойные культуры клеток ПТ-80 и МДВК. Рост клеток на поверхности микроносителей контролировали методом отбора проб и просмотром на предметном стекле с помощью светового микроскопа. Клетки на микроносителях и стационарный монослой 5-кратно промывали и заражали с адсорбцией, инфицирующие дозы - 0,1 -1,0 ТЩЬо/и и 0,001 - 0,0005 ТЩЬоли.

При культивировании клеток на микроносителях лучшие результаты были получены для МН ВИ-3 .Клеточный монослой, сформированный на поверхности микроносителей, отличался большей устойчивостью при многократном промывании культуры МН перед заражением и длительном культивировании вируса.

Динамика накопления вируса ИРТ на микроносителях практически не отличалась от контроля. Максимальные тигры вируса ( 7,5 - 7,6 lg ТЦД;о/ш ) в системе МН были отмечены в культурах клеток ДТ-80 и МДВК через 33 -48 час. при множественности заражения - 0,1 - 1,0 ТЦД50/И и соответствовали значениям, полученным в контроле ( 7,5- 7,7 ^ТЦД50(мл )• В перевиваемой линии клеток МДВК на микроносителях вирус ИРТ штамм "ТК-А ВИЭВ" накапливался несколько медленнее по сравнению с ПТ-80 с разницей в 8-12 часов.

Уровень антител к ВИРТ при использовании множественности заражения 0,1-1,0 ТЦД.вд/м составил 1:40 - 1:48, что практически не отличалось от данных, полученных для вируса, выращенного в монослое ПТ-80.

Для вируссодержащего материала с инфицирующей дозой 0,001 -0,005ТЦД5о/ю были установлены более низкие значения инфекционности и антигенности - 6,5- 6,8 lgTLUiso/im и 1:32 соответственно.

Таким образом, результаты исследований показали, что культивирование вируса ИРТ в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК на отечественных микроносителях ВИ-3, позволяет получать вируссодержащий материал, обладающий высокой биологической активностью.

Данные электронной микроскопии продемонстрировали полноценность вируса, выращенного в клетках ПТ-80 и МДВК на поверхности МН.

Подтверждением наших исследований, проведенных в 1986-1987гг. (Иванов B.C. и др., 1987), явилось сообщение Lesko j. and Veber P. (1993), которые предложили использовать суспензионную культуру клеток МВДК на микроносителях Gelaspher для крупномасштабного культивирования вируса ИРТ. Выход клеток МДВК на микроносителях был в 4 раза выше, чем в стационарных ус-поти™, z урожай вируса в суспензии МН - в 10 раз выше и составлял - 8,33 - 8,5 ^ТЦД50/Ш. \ ' ' -

Изучение условий хранения вируса ИРТ Для производства инактивированшн вакцины.

В производстве противовирусных препаратов возникает необходимость накопления резервного фонда вируссодержащего материала, пригодного для использования как в качестве посевного пула, так и в качестве вакцинного сырья. Поэтому, вопрос о возможных сроках и условиях хранения вируса имеет большую практическую значимость.

Имеющиеся литературные данные по сохраняемости вируса ИРТ весьма разноречивы, что затрудняет их использование для конкретной биологической системы, особенно при крупномасштабном производстве.

С целью определения оптимального режима хранения вируса ИРТ, выращенного псевдосуспензионным способом на микроносителях, было проведено исследование инфекционной и антигенной активности вируса в процессе хранения при различных температурных режимах.

Работу проводили с вирусом ИРТ штамм "ТК-А ВИЭВ", репродуцированным в монослое клеток ПТ-80 на микроносителях ВИ-3. Вирус с титром 6,7 - 7,2 lg ТЦД50/МЛ расфасовывали во флаконы и помещали на хранение при температурах -40°, -20°, -4° и +4°С. Через определенные интервалы времени пробы вируса размораживали и исслёдовали на инфекционную и антигенную активность. Срок хранения - 100 - 120 суток:

Исследование состояло из 5 экспериментов, поэтому для сопоставимости результатов во всех сериях анализировалось относительное изменение титрг вируса S/So, где S - инфекционная активность вируса, а S0 - исходное значение инфекционного титра.

Статистический анализ результатов исследований позволил ' определит зависимость инфекционной активности вируса от температуры и длительносп хранения. Была найдена следующая зависимость: *

Б/ 5„= -0,65 -0,021 1-0,0161 (1)

Коэффициент множественной детерминации И2 = 0,63. Уравнение ( 1 ) характеризует скорость инактивации вируса ИРТ шт. " ТК-А ВИЭВ " в процессе хранения без консерванта (Я2 = 0,63) и позволяет определить средние параметры снижения инфекционной активности вируса, выращенного на МН при температурах +4°, -4°, -20° и -40°С. В соответствии с данной зависимостью допустимая потеря инфекционности через 100 суток (срок хранения) при температуре -40° составила 2,1 ^ТЦД5о/м.ъ при -20° - 2,4318ТЦД50/м, при -4° - 2,681ёТЦЦ5о/ш и +4° - 2,811ёТЦД50/*л (И2 = 0,63).

Исходя то представленных данных, в течение месяца при температурах 20° и -40°С сохраняется в среднем 10-30% первоначальной инфекционной активности вируса. •

Антигенная активность вируса оказалась более стабильной при хранении. Результаты по изучению антигенной активности вируса ИРТ шт.,'ТК-А ВИЭВ" в процессе хранения представлены в таблице 3.

Таблица 3. Антигенные свойства вируса ИРТ в

процессе хранения.

Продолжительность хранения (в сутках) Титры антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных вирусом ИРТ в процессе хранения (индекс нейтрализации )

+4° -4и -20" -40и

0 0,87 - 0,95 0,87 - 0,95 0,87 - 0,95 0,87 - 0,95

- 40 0,62 - 0,80 0,78 - 0,90 0,90-1.08 0,65 - 0,70

..;■■■ 74 0,48-0,65 0,68 - 0,72 0,75 - 0,87 ^ 0,58-0,68

120 0,32 - 0.37 - П М - П -7П 0,7о - 0,90 и,Э5 - 0,63

Согласно представленным данным, через 120 суток хранения при +4°,-4°, -20° и -40°С антигенная активность вируса ИРТ сохраняется в пределах 36,738,9%; 73,6-74,7%; 89,6-94,7%; 63,2-66,3% от первоначатьного уровня, соответственно.

Следует отметить, что при -40°С данные показатели снижались быстрее, чем при-4° и-20° С.

Проведенные исследования указывают на достаточно хорошую сохраняемость в течение 4 месяцев при -20°С антигенной активности вируса ИРТ шт."ТК-А ВИЭВ". Это позволяет считать целесообразным использование этого режима в технологии изготовления инактивированной вакцины.

Вирус, полученный в системе клеток ПТ-80 и МДВК на микроносителях, был использован для изготовления опытной серии инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3.

Оценка иммуногенности опытной серии препарата была проведена в эксперименте на телятах.

Исследование иммуногенности опытной серии инактивированной вакцины в опыте на телятах.

, В эксперименте использовались 6 телят массой 110-115кг из хозяйств Калининской области.

Животные были серонегативны к ВИРТ, не имели температурной реакции до вакцинации. Трех телят вакцинировали подкожно в дозе 5мл вирусом ИРТ, выращенным с использованием технологии микроносителей г инактивированным бетапропиолактоном, 3 других животных служим контролем. Вторую вакцинацию проводили через 27 дней. Для контрольной заражения использовали вирус ИРТ штамм "Оренбург"с титром 7,О^ТЦД5о/мл i дозе 2,5-3,0 мл интраназально.Через 8 и 27 дней после 2 вакцинации и через 1: дней после контрольного заражения пробы сыворотки крови исследовали i

реакции нейтрализации. Смывы из носовой полости исследовали на вирусовыделение после контрольного заражения на 3,4, 5, 6,7 и 10 сутки.

Согласно полученным данным, специфические антитела к ВИРТ обнаруживались на 8 сутки после иммунизации (1:3,5 - 1:11). Повторная вакцинация стимулировала резкий подъем уровня антител к вирусу ИРТ - 1:35 -1:105. На 15 день после контрольного заражения отмечался новый всплеск активности сыворотки к вирусу ИРТ (1:320 -1:520).

У всех телят контрольной группы, зараженных вирусом ИРТ, регистрировалась лихорадка с повышением температуры тела до 41° и симптомы острого респираторного заболевания. При этом, выделение вируса с носовыми секретами фиксировали в течение 7 суток. Привитые животные реакции на заражение не проявляли, и лишь от одного теленка, иммунизированного вакциной, на 3 день удалось реизолировать вирус ИРТ, в последующие 4,5, 6,7 и 10 дай вирус не обнаруживался.

Отрицательные результаты выделения вируса ИРТ в носовых секретах вакцинированных телят свидетельствуют о наличии у них выраженного секреторного иммунитета.

Следовательно, результаты исследований показали, что предлагаемая вакцина обладает достаточно высокой иммуногенной активностью для телят.

Таким образом, разработана технология культивирования вируса в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК, выращенных на микроносителях отечественного производства, что обеспечивает высокие технологические и экономические показатели крупномасштабного производства инактивированной вакцины против ИРТ на основе штамма "ТК-А ВИЭВ".

ВЫВОДЫ

1. Первичные культуры клеток крупного рогатого скота отдельных доноров различаются по своей чувствительности к вирусу ИРГ. В связи с этим, отработана тест-система на основе перевиваемых клеток ПТ-80 для стандартизации технологии выращивания штамма "ТК-А ВИЭВ" - возбудителя ринотрахеита крупного рогатого скота.

2. На модели перевиваемой линии культуры клеток ВНК-21 при адаптации вируса ИРТ с использованием перемежающего культивирования в первичных клетках ПЭК установлена возможность повышения титра вируса более, чем в 10 раз.

3. В сравнительном аспекте отработаны способы культивирования вируса ИРТ в различных клеточных системах: в монослое, суспензии клеток и на микроносителях. Показано, что способы выращивания вируса ИРТ в суспензии клеток и на микроносителях являются наиболее технологичными и перспективными для изготовления инактивированных вакцин.

4. Размножение вируса ИРТ в перевиваемых линиях культур клеток ГГГ-8С и МДВК на микроносителях отечественного производства обеспечивает получение вируссодержащего сырья высокой биологической активности, Предложенный способ положен в основу промышленной технологии производства инактивированноЙ вакцины.

5. Определены оптимальные условия хранения вируса ИРТ штамм "ТК-А ВИЭВ". Установлено, что хранение вакцинного вируса при -20° в течении А месяцев обеспечивает сохранение его антигенной активности.

6. Инактивированная вакцина, изготовленная из вируса ИРГ, выращенной в перевиваемых культурах клеток ПТ-80 и МДВК на микроносителях, имел; высокие иммуногенные свойства при испытании на телятах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Иванов B.C., Силаев С. А., Пинюкова Л.С., Майджи О.В., Козменко З.А., Лютикова Л.И. Культивирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в суспензии эксплантатов.// Тез. докл. II Всес.конф. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов,М., 1981, с.21-22.

2.Иванов B.C., Кузнецов П.П., Майджи О.В., Лютикова Л.И., Поздняков A.A., Пухова Н.М. Определение чувствительности культур клеток к вирусу ИРТ крс. // Передовой и научно-производственный опыт в биологической промышленности, Щелково, 1985, №1, с. 1-4.

3. Иванов В. С., Кузнецов П. П.Ю Майджи О.В. // К вопросу использования культуры клеток ВНК-21/13 для репродукции вируса ИРТ.//Тез. докл. П1 Всес.конф. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, М., 1987, с.10-12.

4.Иванов B.C., Кузнецов П.П., Майджи О.В., Хайкина Л.С., Пухова Н.М. Микроносители для культивирования клеток и вирусов ИРТ в аппаратах суспензионного типа. // Тез.докл. Методы получения и анализа биохимических реактивов, Рига, 1987, с.98.

5. Иванов B.C., Хайкина Л.С., Майджи О.В. Результаты исследований по конструированию сухой инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3 из вирусов, репродуцированных в монослое перевиваемых линий клеток ПТ-80 и МДВК на микроносителях.// Тез. докл. V Всерос. конф. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, М.,1996, с.50-51.

6. Ревякина Е.М., Шуляк А.Ф., Майджи О.В., Юров К.П. Иммунный ответ у животных на введение вакцины "Тривак ВИЭВ". // Ветеринария, №6, 1998, с.25-27.

7. Иванов B.C., Майджи О.В. Изучение условий хранения вируса ИРТ, репродуцированного в монослое перевиваемых клеток ПТ-80 . на микроносителях ( в печати).

8. Юров К.П., Шуляк А.Ф., Петрова О.Г., Майджи О.В. Распространение инфекционного ринотрахеитк и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в различных регионах России (в печати ).

Размножено в Типографии "РОТЭКС" 100 экз. Заказ №. № Цена договорная.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Майджи, Ольга Владимировна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.Коваленко

На правах рукописи

Майджи Ольга Владимировна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

профессор К.П.Юров

кандидат биологических наук, В.С.Иванов

Москва - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения об инфекционном ринотрахеите крупного

рогатого скота.................................................9

2.2. Характеристика вируса „и его основные свойства..................11

2.3. Профилактика инфекционного ринотрахеита.....................16

2.4.Методы крупномасштабного производства противовирусных препаратов.................................................26

2.5. Заключение................................................33

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы.........................................35

3.1.1. Вирусы...................................................35

3.1.2. Культуры клеток, питательные среды и растворы.................35

3.1.3. Приготовление первично-трипсинизированных культур

клеток..................................................36

3.1.4. Культивирование клеток перевиваемых линий..................37

3.1.5. Криогенизация клеточных культур...........................38

3.1.6. Суспензионное культивирование клеток......................39

3.1.7. Размножение клеток на микроносителях......................40

3.1.8. Культивирование вируса ИРТ..............................,41

3.1.9. Определение инфекционного титра вируса....................41

3.1.10. Подопытные животные...................................42

3.1.11. Реакция нейтрализации.................................. .43

3.1.12. Реизоляция вируса ИРТ...................................43

3.1.13 Электронно-микроскопические исследования.................44

3.1.14. Статистическая обработка результатов...................44

3.2. Результаты исследований.................................45

3.2.1. Выбор чувствительных культур клеток к вирусу ИРТ для крупномасштабного культивирования....................45

3.2.1.1. Исследование перевиваемой линии клеток ПТ-80, как тест-культуры к вирусу ИРТ.............................46

3.2.1.2. Чувствительность первичных культур клеток и их субкультур к вирусу ИРТ.............................. 47

3.2.1.3. Чувствительность перевиваемых линий клеток к вирусу ИРТ.................................................49

3.2.2. Изыскание оптимальных способов культивирования вакцинного штамма вируса ИРТ.........................51

3.2.2.1. Размножение вируса инфекционного ринотрахеита

в суспензии клеток..................................52

3.2.2.2. Культивирование вируса ИРТ в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК на микроносителях...............59

3.2.3. Изучение условий хранения вируса ИРТ для производства инактивированной вакцины........................... 69

3.2.4. Исследование иммуногенности опытной серии инактивированной вакцины в опыте на телятах...........73

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................77

5. ВЫВОДЫ..................................................92

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...........................93

7. ЛИТЕРАТУРА.............................................94

8. ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕННЫХ НАЗВАНИЙ

AT - антитела

БОЕ - бляшкообразующая единица

BHV-1 - bovine herpes virus-1

ВИРТ - вирус инфекционного ринотрахеита

ВД - вирусная диарея

в/м - внутримышечно

ГЛА - гидролизат лактальбумина

Г - гуанин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

и-РНК - информационная рибонуклеиновая кислота

ИН - индекс нейтрализации

и/н - интраназально

ИРТ - инфекционный ринотрахеит

КМК - крупномасштабное культивирование

кл - клетка

крс - крупный рогатый скот

МН - микроносители

ПГ-3 -парагрипп-3

РН - реакция нейтрализации

ТЦД - тканевая цитопатическая доза

ФБР - фосфатный буферный раствор

Ц - цитозин

ЭД - эффективная доза

1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Инфекционный ринотрахеит - одно из самых распространенных вирусных заболеваний крупного рогатого скота.

Экономический ущерб, приносимый сельскохозяйственному производству инфекционным ринотрахеитом /ИРТ£ складывается из снижения продуктивности, гибели молодняка, нарушения функции воспроизводства, а также затрат на ветеринарно-санитарные мероприятия.

Интенсивное изучение этого заболевания в нашей стране и за рубежом проводится с 50-х годов. Спектр научных исследований охватывает эпизоотоло-гическую характеристику различных регионов, анализ клинических форм заболевания, выделение полевых изолятов вируса и определение штаммовых различий, изучение структуры вириона, биологических свойств вируса и механизмов иммунной защиты организма, разработку лабораторной диагностики и средств специфической профилактики.

В настоящее время борьба с инфекционным ринотрахеитом основывается на вакцинопрофилактике. На вооружении ветеринарной практики существует ряд эффективных и безопасных вакцин против ИРТ: живых и инактивирован-ных, в моно- и ассоциированной форме, которые несмотря на создание субъединичных и рекомбинантных вакцин, продолжают оставаться превалирующими типами профилактических препаратов для ИРТ.

Технико-экономические показатели вакцин во многом зависят от выбора клеточного субстрата и метода культивирования вируса.

В нашей стране в производстве вакцин против ИРТ применяют технологию, "основанную на репродукции вируса в монослое, главным образом, пер-вично-трипсинизированных клеток, выращенных на поверхности стеклянных флаконов. Низкая производительность и трудоемкость используемой технологии является сдерживающим фактором для про-

изводства инактивированных вакцин, изготовление которых требует значительно большего количества вирусного сырья, чем для живых препаратов.

Одним из перспективных направлений решения проблемы изготовления инактивированных противовирусных вакцин является использование в технологии производства методов крупно-масштабного культивирования клеток и вирусов, среди которых наиболее распространенными и экономичными являются методы размножения вируса в суспензии клеток и на поверхности микроносителей.

Настоящая работа посвящена изучению различных клеточных систем и совершенствованию методов крупномасштабного культивирования вируса ИРТ.

Цель и задачи исследований.

Целью наших исследований явилось изыскание наиболее технологичного способа культивирования вируса ИРТ для производства инактивированной вакцины.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ чувствительности к вирусу ИРТ различных вультур клеток, перспективных для крупномасштабного выращивания.

2. Изучить методы крупномасштабного культивирования вируса ИРТ - в суспензии клеток и на микроносителях.

3. Изыскать высокотехнологичный метод культивирования вакцинного штамма вируса ИРТ "ТК-А ВИЭВ", приемлемый для изготовления инактивированной вакцины.

4. Определить условия хранения вакцинного вируса.

5. Испытать с целью оценки эффективность опытной серии инактивированной вакцины.

Научная новизна работы.

1. Изучены условия культивирования вируса ИРТ в различных клеточных системах. Установлены пермессивные условия для репродукции возбудителя в зависимости от вида клеточных культур, индивидуальных особенностей животных-доноров (для первичных культур),способа культивирования (в монослое, суспензии и на микроносителях).

2. Показана принципиальная возможность репродукции вируса ИРТ в суспензии клеток и применения этой системы в биотехнологии.

3. Разработана технология культивирования вируса ЙРТ на основе отечественного микроносителя, обеспечивающая получение высокоактивного вируссо-держащего материала, пригодного для изготовления инактивированной вакцины.

4. Установлены оптимальные параметры хранения вируса ИРТ шт. "ТК-А ВИЭВ", позволяющие сохранить его биологическую активность.

Практическая значимость.

Предложен способ культивирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и МДВК с использованием микроносителей, который обеспечивает высокий выход вирусного сырья для производства инактивированной вакцины против ИРТ. Материалы диссертации включены в нормативно-техническую документацию по производству инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов", 1987 г. и одобрены Государственной межведомственной комиссией МСХ РФ по испытанию ветеринарных биологических препаратов (прот.№1 от 26 января 1993г., ВГНКИ).

Публикации.

Результаты, представленные в диссертации опубликованы в 6 работах, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предложения. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами, 4 рисунками и 5 фотографиями. Список литературы содержит источника на русском и иностранных языках (205).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения об инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота.

Инфекционный ринотрахеит - широко распространенное вирусное заболевание крупного рогатого скота, которое характеризуется преимущественно ка-тарально-некротическими поражениями слизистых оболочек респираторного и генитального трактов.

Заболевание начали диагностировать в 50 гг. нашего столетия после публикаций Schraeder R.J. and Moys M.D. (1954) и Mckercher D.G. et al (1954).

B1956 r. Madin S.H., York C.J., Mckercher D.V. впервые выделили вирус в культуре ткани почки крупного рогатого скота и экспериментально воспроизвели болезнь.

В нашей стране об аналогичной болезни впервые сообщил в 1940г. Ф.М.Пономаренко и назвал ее инфекционным катаром верхних дыхательных путей. Н.Н.Крюков с соавторами (1970) выделили вирус в культуре клеток от телят откормочного хозяйства Тамбовской области и воспроизвели заболевание различными способами.

Инфекционный ринотрахеит может протекать с различной симптоматикой и проявляться в форме респираторного синдрома, выраженного инфекционным ринитом, бронхопневмонией у телят и катаром верхних дыхательных путей ( Coates J.W., 1973; Dannecher С. 1980; Bratanovic J. et al, 1964; Mohanty S.B., 1978); менингоэнцефалитов у телят (Bagust T.J., Clark L., 1972), вульвовагини-тов у коров и баланопоститов у быков (Theodoridis А., 1978; Kendrick J.W. and M.C.Enteek, 1967), маститов (Greig A.S. and Bannister G.L., 1965) и абортов у коров (Ower N.V. et al, 1964). Гистологически изменения в эпителии имеют вид пузырьков и пустул, что и обусловило название болезни.

В естественных условиях инфекционный ринотрахеит поражает крупный рогатый скот всех пород и возрастов, особенно тяжело протекает у молодняка.

Источником инфекции служат больные животные. Заражение происходит контактным, интраназальным, воздушно-капельным путем, а также через инфицированные корма.

Заболевание характеризуется высокой контагиозностью и проявляется в острой, хронической и латентной форме.

Острая респираторная форма инфекции отличается внезапным повышением температуры тела до 41-42°, гиперемией слизистой оболочки носа и трахеи, угнетением, болезненным кашлем, ринитом.

При генитальной форме поражаются наружные половые органы, что может стать причиной бесплодия . Инфицированная вирусом сперма вызывает эндометриты. (LombaF. étal, 1976).

После естественного переболевания у животных может возникнуть латентная инфекция, которую трудно установить. Способность вируса вызывать латентную инфекцию является одной из особенностей заболевания и связана с персистенцией вируса в организме хозяина (Hassain A. et al, 1995; Rock D.L., 1974). Латентный вирус может реактивироваться при лечении кортикостерои-дами (Davies D.H. and Duncan J.R. 1974). Спорадическая реактивация происходит также посредством естественных механизмов, включающих стрессовые факторы.

Неблагоприятные факторы внешней среды имеют большое значение в возникновении и течении инфекции (Mîhajloviê et al, 1972; Reed D.E. et al, 1973).

Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота распространен во всех странах мира с развитым промышленным скотоводством (Dannacher U. et al, 1975; Hafez S.M. et al, 1975; Johnston L.A.Y., 1964; Rampton C.S. and Jessett D.M., 1976; Фарботко Г.Э., 1994; Христовски M. и др., 1990; Horner G.W., 1990; Mehrotra M.L., Shukla D., 1991; Rosadio R.H. et al, 1993; Wuyckhuise L.van et al, 1994).

Заболеваемость в восприимчивом стаде составляет от 15-30% (Хараламби-ев X., Симов Н., 1971) до 100% (Anspaugh V., 1970).

В неблагополучных по ринотрахеиту хозяйствах экономические убытки могут достигать значительных размеров из-за снижения мясной и молочной продуктивности, отставания в росте и развитии телят после переболевания, абортов у коров, в случае осложнений секундарными инфекциями - падежа животных, а также расходов, связанных с ликвидацией и профилактикой болезни.

Серологическими исследованиями были обнаружены специфические антитела к вирусу ИРТ в сыворотке крови различных животных - оленей, буйволов, свиней, коз, овец. (Ehow T.L., Davis R.W., 1964; Onstad О. et al, 1967; George Т., Philpott M., 1972; Nelson D R., 1972; Sandeep-Guüani, Shaima R., 1995), что свидетельствует о широкой циркуляции вируса ИРТ в природе.

2.2. Характеристика вирусами его основные свойства.

Вирус инфекционного ринотрахеита принадлежит к семейству Herpesviridae (Armstrong J.А. et al, 1961), подсемейству А1рЬаЬефе8утпае (Б.Г.Орлянкин, 1995) и соответствует морфологическим особенностям представителям этой группы вирусов.

Структура вириона. Вирионы герпесвирусов - частицы округлой формы, диаметром 120 - 200 нм, молекулярной массой более 1000 МД. Состоят из четырех структурных компонентов: нуклеоида, капсида, мембраны (тегумента ), покрывающей капсид и наружной оболочки.

Нуклеоид, содержащий ДНК - тороидальной формы, окружен икосаэдри-ческим капсидом, состоящим из 162 капсомеров. Мембрана представляет собой асимметрично расположенный вокруг капсида электронно-плотный материал. Наружная оболочка вириона имеет типичное липопротеидное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8нм (Скалинский Е.И., Иванова Г.А., 1969). В некоторых случаях наблюдается два и более нуклеокап-сида, заключенных в общую оболочку. До 80% вирусных частиц не имеют обо-

лочки, отсутствие которой приводит к значительному снижению инфекционности вируса (Smith К.О., 1964).

Геном вирусов группы герпес представлен двуспиральной ДНК, состоящей из 120-220 тысяч пар нуклеоидов, доля Г+Ц составляет 35-75% (Б.Г.Орлянкин, 1995). Молекула ДНК присутствует в двух изомерных формах (J.E.Farley, 1980) и состоит из 2 ковалентносвязанных компонентов - длинного L и короткого S компонента (Cornel Fracfel et al, 1993). Характерной особенностью генома является наличие уникальных повторяющийся последовательностей на концах и внутри генома. Значительная часть ДНК находится в кольцевой форме.

Очищенные вирионы герпесвирусов содержат от 15 до 35 видов структурных белков (Б.Ройзман, У.Баттерсон, 1989), из которых 8-11 -гликопротеины. Гликопротеины содержат вируснейтрализующие антигенные детерминанты и детерминанты, индуцирующие комплемент-зависимый лизис инфицированных клеток, и являются основными иммуногенными компонентами вируса. Из 33 структурных белков ВНУ-1 13 ассоциированы с вирусной оболочкой, 14 - с нуклеокапсидом ( Bolton D.C. et al, 1983).

Герпесвирусы быстро инакгивируются органическими растворителями, некоторыми энзимами, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами, нагреванием при 50-56°. Вирус хорошо сохраняется при низких температурах и в лиофилизированном состоянии, проявляет стабильность в зоне РН 6-9. (В.Н.Сюрин, Н.В.Фомина, 1979).

Особенности репродукции вируса. Полный инфекционный цикл вируса ИРТ состоит из адсорбции вирусной частицы на клеточной стенке, проникновения внутрь клетки, дезинтеграции вируса, синтеза вирусных компонентов, сборки вирионов и высвобождения сформированного вируса из клетки.

Заражение начинается с прикрепления вируса к специфическим клеточным рецепторам. За связывание вируса с рецепторами чувствительных клеток ответственны гликопротеины оболочки. Прикрепление вирусной частицы активизи-

рует белок, находящийся на поверхности вируса и вызывающий слияние вириона с плазматической мембраной клетки (Б.Ройзман, У.Батерсон, 1983). Лишенный оболочки капсид транспортируется к порам в ядерной мембране, через которые вирусная ДНК попадает в нуклеоплазму.

Транскрипция и репликация вирусной ДНК происходит в ядре. Вирусная ДНК транскрибируется в ходе репродуктивного цикла клеточной РНК-полимеразой при участии на всех стадиях цикла вирусных факторов. Основная масса ДНК синтезируется по механизму катящегося кольца (НаттегзсЬпиЛ \¥. е! а1, 1988) - замыкания в процессе репликации линейной молекулы ДНК в кольцо, а затем ее разрезания.

Отличительной особенностью герпесвирусов является большое количество ферментов, вовлеченных в синтез ДНК, к числу которых относятся ДНК-связывающий белок и ДНК - полимераза (Б.Ройзман, У.Баттерсон, 1989). В я