Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и генетические маркеры аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и генетические маркеры аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите"

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет»

48

52902

Биктагирова Эльнара Маулетовна

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ АУТОИММУНИТЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЦИТАРНОМ ТИРЕОИДИТЕ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л 5 СЕН 2011

Казань-2011

4852902

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета

Научный консультант:

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Абрамова Зинаида Ивановна доктор медицинских наук, профессор Вагапова Гульнар Рифатовна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет (г. Казань)

Защита состоится 22 сентября 2011 года в « 13°° » часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

Автореферат разослан "22" августа 2011 г.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КФУ к. 104, отдел аттестации, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 проф. Абрамовой 3. И., факс: (843) 238-76-01

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор биологических наук

Абрамова З.И

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Хронический лимфоцитарный тиреоидит (аутоиммунный тиреоидит (АИТ), тиреоидит Хашимото) - одно из наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы (1ЦЖ), частота которого среди взрослого населения колеблется от 6 до 11% (Валдина Е.А., 2001; Балаболкин М.И., 2002, Зефирова Г.С., 1999, Петунина H.A.. 2002). Исследования последних десятилетий указывают на мультифакторную природу данного заболевания (Davies T.F, 1998), но вопросы этиологии и патогенеза, терапии и прогноза заболевания не получили еще своего окончательного решения (Дедов И.И., 2003).

В настоящее время известно, что в основе развития аутоиммунных заболеваний, в том числе и АИТ, лежит нарушение процессов программируемой клеточной гибели, в частности апоптоза (Квачева Ю.Е., 2002; Петрищев И. Н., 2008). Интерес к апоптозу обусловлен тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом тех сигнал-проводяших систем (интерлейкины (IL), интерфероны, нуклеазы), изменение которых имеет патогенетическое значение для АИТ. Тем не менее, механизмы диерегуляции апоптоза в условиях реализации аутоиммунитета еще недостаточно исследованы (Недосекова Ю.В., 2009).

Рядом авторов показано, что маркером нарушения функционирования иммунной системы, приводящих к развитию и прогрессировапию аутоиммунных заболеваний (АИЗ), являются аутоантитела (ААТ) к ДНК, которые, вероятно, и являются причиной деструкции тканей и органов, нарушая уровень физиологического апоптоза (Невинский Г.А., 2000, Сучков C.B., 2001). Различия в клинико-иммунологической картине АИТ (эу-, гипо- и гипертиреоз), видимо, связаны с феноменом гетерогенности ААТ (Сучков C.B., 2001), обладающих различными уровнями специфичности. Тем не менее, до настоящего времени нет единой точки зрения относительно причин и характера иммунных сдвигов, приводящих к утрате контроля над образованием ААТ и появлением, с одной стороны, абзимов с каталитическим и цитотоксическим эффектом, а с другой - ААТ к ДНК лишенных указанных свойств.

Кроме того, немаловажным фактором развития АИТ лежит изменение со стороны иммунокомпетентных регуляторньих Т-клсток, генетический дефект которых, спровоцированный экзогенным воздействием, ведет к срыву их толерантности (Абрамова H.A., 2006). На сегодняшний день существует более 100 генетических маркеров, которые тем или иным образом ассоциированы с развитием аутоиммунных патологий ЩЖ (Кандрор В.И., 2001). При этом фенотипическое проявление генетического полиморфизма в значительной мере зависит от генофонда

и условий жизни каждой конкретной популяции, чем и объясняется противоречивость данных по ассоциации полиморфизма генов-кандидатов с риском развития АИТ.

Таким образом, на сегодняшний день представляется актуальной комплексная оценка биохимических и генетических факторов нарушения аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите среди населения Республики Татарстан (РТ). В связи с вышесказанным,

целью данного исследования является характеристика аутоиммунного процесса при хроническом лимфоцитарном тиреоидите и выявление генетических факторов риска развития данной патологии у населения РТ.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать процесс аутоиммуннитета и апоптоза при хроническом лимфоцитарном тиреоидите по содержанию специфических (аннексии V, TRAIL и TNF-a) и неспецифических (AT к нативной ДНК (нДНК), денатурированной ДНК (дДНК)) маркеров.

2. Исследовать наличие ДНК-гидролизующей активности AT к ДНК в сыворотке крови больных хроническим лимфоцитарным тиреоидитом и здоровых лиц.

3. Изучить связь между показателями активности аутоиммунитета: уровня органоспецифических (AT к тиреоглобулину (АТ-ТГ), AT к тиреопероксидазе (АТ-АТ-ТПО)) и неспецифических AT к ДНК с функциональным состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.

4. Изучить ассоциацию полиморфизмов: -318С/Т, -1661A/G и +49A/G гена CTLA-4, -1858С/Т гена PTPN22, -308A/G гена TNF-a, -609G/T, -1135Т/С гена TNF-RI, +196T/G, del 15bp гена TNF-R2, +3953СУГ гена IL-ip, -590СУГ гена ¡1-4, -174C/G гена IL-6 с риском развития хронического лимфоцитарного тиреоидита и степенью активности аутоиммунного процесса у населения РТ.

Научная новизна

Впервые охарактеризован процесс программируемой клеточной гибели при хроническом лимфоцитарном тиреоидите по трем специфическим маркерам: аннексии V, TRAIL и TNF-a. Показано, что при АИТ в стадии гипертиреоза имеет место TRAIL-индуцированный апоптоз с преобладанием некротических процессов.

Показано преобладание ААТ к денатурированной ДНК (AT к дДНК) в сыворотке крови больных АИТ, при этом общий пул AT к ДНК характеризовался изменением степени ДНК-гидролизующей активности и субстратной специфичности в процессе течения заболевания.

Исследована генетическая предрасположенность к хроническому лимфоцитарному тиреоидиту у населения РТ по 12 полиморфизмам 8 генов, продукты которых принимают участие в регуляции иммунного ответа.

Впервые проведен комплексный анализ по выявлению биохимических и генетических маркеров нарушения аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.

Научпо-практичеекая значимость работы

Данные, полученные в результате исследования, могут служить основой для формирования групп повышенного риска развития АИТ и разработки дифференцированных программ профилактики и ранней диагностики заболевания у конкретного человека с учетом данных генотипирования.

Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, генетики популяций, медицины и могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Функциональное состояние ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите зависит от характера патологического процесса - апоптоз/некроз, что отражается в кластеризации специфических (АТ-ТГ, АТ-ТПО) и неспецифических (AT к ДНК) ААТ, а также в изменении степени гидролитической активности и субстратной специфичности AT к ДНК в процессе течения заболевания.

2. Повышенный уровень TRAIL отражает преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами при АИТ в стадии гипертиреоза.

3. Генетическими маркерами активации апоптоза и индукции аутоиммунитета при АИТ с высокой активностью аутоиммунного процесса являются полиморфизмы генов TNF-a и его рецепторов, IL-lfl, ¡L-4 и CTLA-4.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского государственного университета (Казань, 2008 г.); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (памяти В.Г. Винтера) (Казань, 2009); Симбиозе-2009 (И Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов) (Пермь, 2009 г.); Всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии (тиреоидология, нейроэндокринология, эндокринная хирургия)» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010); Международной конференции «European Human Genetics Conference 2010» (Швеция, 2010); И Международной научно-практической конференции «Новые

концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, среди которых 2 публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК.

Струюура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включает 17 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, включающего 233 ссылок, из которых 57 - на отечественные и 176 на зарубежные работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили образцы сыворотки венозной крови и ДНК, выделенной из лейкоцитов венозной крови стандартным фенол-хлороформенным методом (Маниатис Т., 1984) 298 женщин", группу больных с диагнозом АИТ составила 161 женщина в возрасте от 20 до 60 лет, группу контроля - 137 здоровых доноров. Обе группы были сформированы на базе иммунологической лаборатории ГУ МКДЦ (г. Казань).

Диагноз хронического лимфоцитарного тиреоидита устанавливался эндокринологом на основании результатов ультразвукового исследования и оценки функционального состояния ЩЖ, по содержанию тиреотропного гормона, свободного тироксина и свободного трийодтиронина и определения титра АТ-ТПО и АТ-ТГ в сыворотке крови. Степень активности аутоиммунного процесса оценивалась по концентрации АТ-ТПО в сыворотке крови.

Дополнительным критерием при постановке диагноза служили данные по иммунофенотипированию лимфоцитов (определение на поверхности лимфоцитов венозной крови маркеров дифференциации (CD4+/CD8V)), проведенные методом проточной цитофлюориметрии на проточном питометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson», США) с применением пакетного анализа «MultiSet TM» и коммерческого набора «Multitest IMK Kit» («Becton Dickinson», США).

Как больные АИТ, так и лица группы контроля, представляли собой смешанную популяцию РТ и не состояли друг с другом в кровном родстве. Все лица дали информированное согласие на участие в исследовании.

Определение уровня специфических маркеров апоптоза. Определение уровня аннексина V, TNF-a, и TRAIL в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов согласно инструкции фирмы—производителя («Bender MedSystem», Vienna, Austria).

Регистрацию продуктов проводили на спектрофотометре «Multiskan» (КНР) в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (ОП4?0).

Определение уровня неспецифических маркеров апоптоза. Определение уровня ААТ к нативной (AT к нДНК) и AT к дДНК проводили методом ИФА согласно методике, предложенной Саттаровой с соавт. (Саттарова Л И.. 2000). Регистрацию продуктов проводили на спектрофотометре «Multiskan» (КНР) в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (ОП45о).

Определение ДНКазной активности антител к ДНК проводили в реакции in vitro с использованием в качестве субстрата коммерческий препарат ДНК плазмиды pBR322, выделенной из штамма E.coli XL-lBlue (ООО «СибЭнзим», г.Москва).

Реакцию гидролиза проводили в динамике, отбирая пробы через кратные промежутки времени при 37°С. ДНК-гидролизующую способность антител к ДНК оценивали по превращению суперскрученной ДНК плазмиды pBR322 в кольцевую и линейную формы. Оценку результатов гидролиза плазмидной ДНК pBR322 осуществляли методом электрофореза в агарозном геле с последующей визуализацией бромистым этидием с использованием гель документирующей системы Chemi Doc™ XRS (Bio-Rad Laboratories, США).

Генотипирование полиморфных локусов проводили методом аллель-специфичной ПЦР и ПДРФ-анализа с использованием праймеров, предложенных в работах (Allen R.A., 2001; Miterski В., 2004; Velaga M.R., 2004; Lie-Ying Fan, 2005; Wen Kuo, 2005; Ni- Glossop G.R., 2005; Wang L., 2007; Nariman K., 2009) на амплификаторах «Терцик» (НПФ «ДНК - технология», г. Москва) и «MyCycler» (BioRad Laboratories, США).

Продукты амплификации и рестрикции анализировали электрофорезом в нативном полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей визуализацией бромистым этидием с использованием гель-документирующей системы Chemi Doc™ XRS (BioRad Laboratories, США).

Статистический анализ. Для сравнения данных применяли дисперсионный анализ, используя критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса (Лакин Г.Ф., 1990; Акберова Н.И., 2004), с поправкой Бонферрони (Акберова Н.И., 2004). Взаимосвязь между параметрами оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (Лакин Г.Ф., 1990). Статистическую обработку выполняли с помощью пакета программ «Excel Office 2003».

Статистическую обработку данных по генотипированию проводили с помощью программы UNPHASED версии 3.1.5 (Frank Dudbridge, 2006, MRC Biostatistics Unit Robinson Way Cambridge CB2 0SR, UK, находиться в режиме свободного доступа (http://homepages.lshtm.ac.uk/frankdudbridge/software/unphased/)).

Значимость различий между группами по частотам встречаемости аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов оценивали по критерию х2 ПРИ уровне значимости р=0,05. Для оценки связи полиморфных локусов с развитием АИТ рассчитывали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительных интервалов для ОШ

(ДИ0Ш).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика процесса программируемой клеточной гибели и аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите

Специфические маркеры апоптоза. К настоящему времени показана взаимосвязь между нарушениями регуляции процесса апоптоза и генезом аутоиммунных тиреопатий. Наибольший интерес вызывает регулирующее влияние на апоптоз биологически активных веществ, прежде всего цитокинов (Fas, TRAIL, TNF-а и др.) (Попов Л.С., 2004). Причем, TRAIL опосредует как апогггоз тиреоцитов, так и цитотоксических аутореактивных лимфоцитов (Nakahara М., 2009). TNF-a является гомологом FasL, что свидетельствует о его высокой апоптогенной активности.

Биохимические изменения при апоптозе включают транслокацию фосфатидилсерина (PS) с внутренней стороны плазматической мембраны лимфоцитов. Связываясь с PS на поверхности клетки, аннексии V, конъюгированный с флуорохромом, также служит маркером апоптоза (Gerke V., 2002).

В связи с этим, нами охарактеризован процесс апоптоза на основании количественной оценки трех специфических маркеров: аннексии V, TNF-, TRAIL (табл. 1).

По результатам наших исследований, показано достоверное повышение уровня TRAIL в сыворотке крови у больных АИТ с гипертиреозом по сравнению со здоровыми лицами.

Таблица 1. Средний уровень Аннекина V, TNF-a и TRAIL в сыворотке крови больных А ИТ (А ИТ«+») и группы условно здоровых лиц (АИТ «-»)_

АИТ «+» M±SD

Аннексии V, пг/мл TNF-a, пг/мл TRAIL, нг/мл

Гипертиреоз 0,258±0,0012 6,8±1,02 60,2*20,07*

Гипотиреоз 0,257±0,0014 2±13,18 45,5±19,3

Эутиреоз 0,257±0,0014 3,05± 18,44 41,6±14,7

АИТ«-» 0,258±0,001 1,89±16,48 39,38±11,6

'Достоверность различий (р<0,05) по сравнению с контрольной группой

М - среднее значение, SD — стандартное отклонение

Различий, достигших статистической достоверности между уровнем содержания TRAIL у больных АИТ с гипотиреозом, эутиреозом и условно здоровых доноров не выявлено, однако необходимо отметить тенденцию к снижению уровня TRAIL в сыворотке крови больных АИТ: гипертиреоз > гипотиреоз > эутиреоз, а

также разброс индивидуальных показателей уровня TRAIL у больных АИТ с гипотиреозом и эутиреозом Возможно, увеличение экспрессии TRAIL при гипертиреозе сопровождается ростом чувствительности клеток и их готовности к запуску программы гибели. Это позволяет предполагать, что уровень TRAIL может являться критерием оценки активности аутоиммунного процесса. Повышение концентрации TRAIL и TNF-a в сыворотке крови как маркера некробиотических состояний было отмечено в ряде работ (Котович М.М., 2003; Хараева З.Ф., 2011).

Выявленные нами наиболее высокие показатели TRAIL у больных АИТ в состоянии гипертиреоза, по-видимому, отражают преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами у этой группы пациентов. С этих позиций отсутствие различий в уровнях TRAIL при АИТ в стадии эутиреоза и у здоровых лиц может служить положительным прогностическим критерием. С другой стороны, более низкое содержание TRAIL в сыворотке крови у больных АИТ в состоянии гипо- и эутиреоза может свидетельствовать об интенсивности образования домена смерти DR-5, который активно связывает TRAIL в связи с чем снижается его концентрация в сыворотке крови. В результате индукции TRAIL-опосредованного апоптоза происходит гибель тиреоицитов, в связи с чем, может повышаться концентрация FasL, что лишний раз обосновывает необходимость параллельного исследования маркеров апоптоза в других биологических объектах, помимо сыворотки крови.

Усиление синтеза TNF-a является ключевым фактором активации иммунокомпетентных клеток при ряде аутоиммунных заболеваний (Sooiy А, 2002). Повышение концентрации TNF-a, наряду с повышением содержания TRAIL в сыворотке крови, многими исследователями рассматривается в качестве маркера некробиотических состояний (Котович М.М., 2003; Хараева З.Ф., 2011).

Нами обнаружена тенденция к повышению содержания TNF-a в сыворотке крови больных АИТ, не достигшая уровня статистической достоверности. Максимальное повышение уровня TNF-a в сыворотке крови при АИТ наблюдалось у пациентов в состоянии гипертиреоза (табл. 1). Таким образом, повышение TNF-a в сыворотке крови больных АИТ с гипертиреозом еще раз подтверждает тезис о возможном преобладании некротических процессов над апоптотическими у этой группы пациентов. Если судить по степени разброса индивидуальных показателей TNF-a при гипотиреозе (95% ДИ 0,99-5,61)- и эутиреозе (95% ДИ 2,59-5,9), то можно предположить, что уровень этого цитокина отражает зависимость функционального состояния ЩЖ от характера патологического процесса (апоптоз или некроз) в тиреоидной ткани.

По специфическому маркеру апоптоза аннексину V показано отсутствие значимых различий (табл. 1). Полученные данные частично согласуются с

результатами исследования Космачевой С.М. с соавт. (2004), которые показали отсутствие отличий в индукции апоптоза лимфоцитов у больных АИТ с эутиреозом и здоровых лиц.

Таким образом, установлено, что при хроническом лимфоцитарном тиреоидите имеет место TRAIL индуцированный апоптоз. Выявление максимального повышения уровня TRAIL при АИТ с гипертиреозом отражает преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами. Что согласуется с данными большинства исследователей, которые указывают на деструктивную природу гипертиреоза при АИТ (Volpe R., 1991; Балаболкин М.И., 2007).

Неспецифические маркеры апоптоза. Исследованиями ряда авторов было показано присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунными тиреопатиями ДНК-связывающих AT, проявляющих ДНКазную активность (Невинский Г.А., 2000; Бреусов A.A., 2001; Сучков C.B., 2002) и их определение рекомендовано для скрининга АИЗ (Коликова Ю.О., 2003). В настоящее время установлено, что AT к ДНК, обладая гидролизующими свойствами ферментов, способны выступать в роли мощного регулятора апоптоза, скорость которого при хроническом лимфоцитарном тиреоидите многократно увеличивается (Кандрор, 2001), т.е. тиреоциты активно подвергаются данному процессу.

В связи с этим, нами проведена оценка уровня AT к нДНК и дДНК в группе больных АИТ по сравнению с контрольной группой здоровых лиц (табл. 2).

Таблица 2. Средний уровень AT к нДНК и дДНКу больных АИТ и у здоровых

AT к нДНК, оп.ед. AT к дДНК, оп.ед.

M±SD 95% ДИ M±SD 95% ДИ

АИТ«+» 0,89±0,25 0,2-0,5 0,94±0,33' 0,34-0,41

АИТ«-» 0,84±0,18 0,16-0,48 0,79±0,19 0,23-0,34

'Достоверность различий (р<0,05) по сравнению с контрольной группой

М - среднее значение, SD — стандартное отклонение

По результатам наших исследований, у больных АИТ показана тенденция к увеличению ДНК-связываюших AT, специфичных к нДНК (р>0,05) и достоверное повышение AT к дДНК по сравнению с группой контроля (р<0,05). При этом, преобладание AT к дДНК отмечено в группах больных с эу- и гипотиреозом (84,7% и 85% соответственно), и у 75% больных в состоянии гипертиреоза.

Подобные результаты были получены в работе Pedro A.B. с соавт. (2006), которые также показали преобладание AT к дДНК в сыворотке больных АИТ, но только в состоянии эутиреоза (90% случаев). Возможно, это связано с тем, что дДНК более иммуногенна, чем нДНК. Предполагается, что в процессе аутоиммунизации к геномной ДНК первыми из общего пула сывороточных AT образуются AT к дДНК, но в дальнейшем по мере накопления соматических мутаций среди АТ-продуцируюших B-лимфоцитов наблюдается процесс созревания специфичности в

10

направлении от анти-дДНК к анти-нДНК. Следовательно, определение антител только к дДНК позволяет выявить возникновение заболевания в более ранние сроки (Сучков C.B.. 2004; Kubota Т., 2002).

Учитывая роль ДНК-абзимов (ДНК-связывающих аутоантител с ДНК-гидролизующими свойствами) в патогенезе АИЗ и программированной клеточной гибели (Сучков C.B., 2002), обнаруженные AT к ДНК были изучены на наличие каталитической активности в зависимости от функционального состояния ЩЖ.

Методы определения каталитической активности иммуноглобулинов пока недостаточно адаптированы для определения ферментативной активности цельных сывороток (Сучков C.B.. 2001). В данной работе ДНКазная активность AT к ДНК оценивалась по их способности превращать субстрат - суперспиральную ДНК pBR322 (I форма) - в кольцевую (II форма) и линейную (III форма) формы (рис. 1 ).

-П форма

-111 форма

-1 форма

Время инкубации, ч

M 0 0.5 I 2 4 fi 8 12 24

Рис. 1. Электрофореграмма определения ДНК-гидролизующей способности AT к ДНК у больного АИТ с гипертиреозом в динамике. Дорожка 1- рВЯ322+гидролизующий буфер ТЕ; 2-10- субстрат pBR322+ сыворотка больного АИТ в стадии гипертиреза.

Анализ результатов гидролиза субстрата AT к ДНК больных указывает на более высокую гидролитическую активность AT к ДНК и их субстратную специфичность к одноцепочечной ДНК (рис. 2А). Однако гидролитическая активность и специфичность AT к ДНК изменяется в зависимости от функционального состояния ЩЖ и течения заболевания (рис. 2).

Так, например, при гидролизе субстрата AT к ДНК у больных АИТ с гипертиреозом по мере увеличения времени инкубации снижается количество суперскрученной ДНК (I форма), и нарастает количество продуктов ее расщепления: образование кольцевой формы ДНК (II форма) продолжается на протяжении 24 часов и появление линейной формы ДНК (III форма) через 6 часов от начала инкубации.

При гидролизе ДНК плазмиды AT к ДНК у больных АИТ с гипотиреозом также снижается количество суперскрученной ДНК (I форма), и нарастает количество продуктов ее расщепления, однако линейная ДНК (III форма) появляется позднее, через 12 часов инкубации, что свидетельствует о более низкой гидролитической активности AT к ДНК и их меньшей степени сродства к одноцепочечной ДНК.

У больных в состоянии эутиреоза линейная ДНК появляется также позднее, чем у больных АИТ в стадии гипертиреоза, и через 24 часа гидролиза появляются

короткие олигонуклеотиды, что указывает на появление субстратной специфичности АТ к двунитевой ДНК.

А - Гипертиреоз

г время инкубации/!

Б - Гипотиреоз

время инкубации,1ч

В - Эутиреоз

Рис. 2. ДНК-гидролизуюшая способность А к ДНК у больных АИТ с гипертиреозом (/ гипотиреозом (Б), эутиреозом (В) в динамик

—ф— Кольцевая (II форма) - -д.— Суперскрученная (I форма) - И- Линейная (III форма) —х— Олигонуклеотиды

Таким образом, полученные данные указывают на изменение степени гидролитической активности АТ к ДНК и их субстратной специфичности у больных с АИТ, что, возможно, является отражением динамики и степени выраженности патологического процесса. Так, появление субстратной специфичности АТ к ДНК к двуцепочечной ДНК у больных АИТ в стадии эутиреозом можно расценивать как маркер нормализации процесса программируемой клеточной гибели.

Выявление связи между показателями активности аутоиммунитета: уровня органоспецифических АТ-ТГ, АТ-ТПО, неспецифических АТ к ДНК и функциональным состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите Одним из диагностических критериев постановки диагноза хронического лимфоцитарного тиреоидита является обнаружение специфических антитиреодных АТ, таких как АТ-ТГ и АТ-ТПО (Дедов И.И. и др., 2003). В нашем исследовании различная степень повышения титров АТ-ТГ и АТ-ТПО имела место у всех больных АИТ. Однако, согласно некоторым исследованиям, АТ-ТПО являются малоспецифичными для АИТ и могут обнаруживаться как при других заболеваниях ЩЖ, так и у 3-26% здоровых лиц (Кпш^еп Ы., 1999; Ьас1еп5оп Р.\У., 2000), тогда как АТ-ТГ могут запускать механизм образования иммунных комплексов, приводить к

деструктивным изменениям в ЩЖ и снижению ее функции (Калинин А.П., 1994). С другой стороны, в качестве чувствительного, но неспецифичного скрининга АИТ, используется выявление AT к ДНК (Коликова Ю.О., 2003), и антиядерных AT (антинуклеарный фактор) (Ghazeeri GS, Kutteh W.. 2001).

Данных о взаимовлиянии органоспецифичных (АТ-ТГ, АТ-ТПО) и неспецифичных (AT к ДНК) AT и их комплексной диагностической значимости, особенно при различных клинических вариантах течения АИТ, недостаточно. В связи с этим, нами проведен корреляционный анализ между содержанием AT к ДНК и специфических AT в общей выборке больных АИТ и у больных с различным функциональным состоянием ЩЖ.

По результатам анализа в общей группе больных АИТ установлена прямая корреляционная зависимость между уровнем АТ-ТГ и AT к нДНК (Rs=0,38, р<0,05), и обратная - между уровнем АТ-ТПО и AT к дДНК (Rs=0,2, р<0,05), тогда как корреляционной зависимости между уровнем содержания AT к дДНК и АТ-ТГ, а также AT к нДНК и АТ-ТПО не выявлено.

Полученные результаты частично согласуются с немногочисленными данными литературы, поскольку в работах некоторых авторов показана прямая корреляционная зависимость между АТ-ТПО и AT к нДНК при АИТ (Анчикова O.A., 2008).

Однако, при проведении корреляционного анализа в группах больных АИТ, разделенных в зависимости от функционального состояния ЩЖ (гипо-, эу- и гипертиреоз) обнаружен различный характер корреляционной зависимости между специфическими и неспецифическими ААТ (рис. 3).

Так, при гипертиреозе обнаружена прямая корреляционная зависимость высокой степени между уровнем AT к ДНК, как к нативной, так и денатурированной, и уровнем АТ-ТГ и АТ-ТПО. В состоянии гипотиреоза наблюдалась прямая корреляционная зависимость низкой степени между AT к нДНК, и обратная - между AT к дДНК и АТ-ТГ, а при эутиреозе усиливалась обратная корреляция между AT к нДНК и дДНК с одной стороны, и AT к ТПО - с другой, не достигшая уровня статистической достоверности.

Возможно, одновременное повышение специфических и неспецифических ААТ при гипертиреозе свидетельствует о высокой активности аутоиммунного процесса с преобладанием некротических процессов над апоптотическими, которые, в свою очередь, могут вызывать повреждение тиреодных клеток и усиливать аутоиммунные реакции. Отсутствие корреляционной зависимости между всеми показателями ААТ при двух других клинических проявлениях АИТ предполагает нормализацию процессов программированной клеточной гибели в сторону апоптоза

различной степени интенсивности (например, отсутствие зависимости между АТ-ТГ и АТ к ДНК при эутиреозе).

АТ к ТГ и АТ к ДНК АТкТПОиАТкДНК

Гипертиреоз 600 ; » 4 г 400 - 1*5=0,97 / 2 ; "<0'°5, / / Й5=0,98 \/ Р<0,05 200 - / ' ■ V > / ♦ ' А 0,5 1 1,5 2 АТк ДНК, оп.ед 600 ■ * А | 1*5=0,97 , а <00 р<о,оз / . \ / ' Р */ 1 Ч*=0,98 н 20° # / ^ р<0,05 / ' 0 ------------—- - —А 0.5 1 1.5 2 АТк ДНК,оп.ед.

Гипотиреоз 4000 ■ : -А ♦ *»♦ А * § 3000 . , 1*5=0,28 -.2000 ; ^<>,04 ^ : Т5 / 0.5 1,5 2.5 АТ к ДНК, оп.ед. 1600 : ^0,13 р>0,05 |юоо -; V' »ГУ V1 „4, А о р>0,05 Е р ^ __^ ^^ * * ♦ »» * 4 . «<1 ф»» • ♦А**. А А о -.......»« ------------------- 0.5 1 1,5 2 2,5 АТ к ДНК, оп.ед.

Эутиреоз 4000 ^ ] сзооо ) ♦ 4 3 ! и-гооо -! Я5=О,2 К5=-0,1 ¡1 : врХ),05 р>0,05 "чооо\ / ! ♦ * * | / * о ■ «г —— 0,5 1 1,5 2 2,5 АТк ДНК, оп.ед. 1500 . |1000 : ♦» «4М4» А 1«! | 1*5-0,02 0 1 р>о,р5 ^7„0;01 1 ' . 1 , рХМК Е®00!*^ V / < . ц » \ « / о ■ -^^¿Лш^^гл 1 ж 0,5 1 1,5 2 2,5 АТ к ДНК, оп.е д.

« АТ-ТГ и АТ к нДНК -Линейный (АТ-ТГ и АТк нДНК) ж АТ-ТГ и АТ к дДНК --Линейный (АТ-ТГ и АТ к дДНК) « АТ-ТПО и АТ к нДНК -Линейный (АТ-ТПО и АТк нДНК) а АТ-ТПО и АТ к дДНК --Линейный (АТ-ТПО и АТк дДНК)

Рис.3. Корреляционный анализ между уровнем содержания АТ-ТГ, АТ-ТПО и АТ к нДНК, дДНК при различных клинических проявлениях АИТ (пшертиреоз, гипотиреоз, эутиреоз).

Кроме того, полученные данные, возможно, объясняются феноменом кластеризации ЛАТ (выявление различных сочетаний антитиреоидных AT) и изменением функциональных свойств ААТ (появление АТ-ТГ и АТ-ТПО с протеолитической активностью) (Wen W., 2007; Андреева A.B.. 2011) в процессе естественной эволюции хронического лимфоцитарного тиреоидита, либо на фоне проводимой терапии. При этом активность ААТ с протеолитической активностью обнаруживает корреляционную зависимость с тяжестью клинической картины АИТ, а также с явлениями дисфункции и разрушения ЩЖ (Андреева A.B., 2011). Однако данный вопрос требует дальнейшего детального исследования.

Генетические факторы риска развития хронического тшфоцитарного тиреоидита

На сегодняшний день предполагается, что одним из факторов развития аутоиммунных эндокринных заболеваний являются нарушения Т-клеточного звена. Методом проточной цитометрии нами показано достоверное увеличение доли субпопуляции CD4+ лимфоцитов в группе больных АИТ, по сравнению со здоровыми (р<0,05) (рис.4 ). Среднее соотношение Т-лимфоцитов CD4+/CD8+ у больных было в 2 раза выше (Me 2,05, ДИ 1,22-0.89) по сравнению с контрольной группой (Me 0,99, ДИ 0,009-0.01), т.е. обнаружен дефицит Т-супрессоров (CD8+) и активация Т-хелперов (CD4+).

А Б

Th/Ts=0,99

■У

*

CD8-PE

CDS-РЕ

Рис.4 Содержание Т-хелперов (Th) (CD4'- APC) и Т-супрессоров (Ts) (CD8+- РЕ) в крови у здоровых лиц (А) и у больных АИТ (Б)

Согласно современным представлениям, дисбаланс Т-лимфоцитов обусловлен генетическим дефектом Т-супрессоров, что приводит к их взаимодействию с антигенами, которые индуцируют синтез антител рецепторного аппарата фолликулярного эпителия, оказывают повреждающее действие на тироциты (Кравец Fi.Б., 2010). На сегодняшний день существует более 100 генетических маркеров, которые тем или иным образом ассоциированы с развитием аутоиммунных патологий ЩЖ (Кандрор В.И., 2001), однако их фенотипическое проявление зависит от

генетической предрасположенности индивида и условий жизни каждой конкретной популяции.

В связи с этим, нами проведен анааиз ассоциации 12 полиморфных маркеров 8 генов-кандидатов с риском развития АИТ у населения РТ (табл. 3). Все изученные нами полиморфизмы находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (р>0,05).

Таблица 3. Характеристика полиморфных вариантов генов-кандидатов

Ген Полиморфизм Функция продукта Локализация

СТЬА-4 -1661ААЗ (ге45 53808) Ингибирование активации Т-лимфоцитов промотор

-318С7Т (гз5742909) промотор

+49АЛЗ (ге23 1775) Экзон 1

РТРШ2 -1858С/Т (ге2476601) Ингибирование активации Т-лимфоцитов Экзон 14

ТОР-а -308АЮ (ге 1800629) Провоспалительный цитокин, участвует в регуляции апоптоза промотор

ТОТ-Я! -609С/Т (ге4149570) Участие в передаче сигнала апоптоза промотор

-1135 Т/С (ге800692) промотор

Т№-К2 +196ТЛЗ (ге 1061622) Участие в передаче сигнала апоптоза Экзон 6

ь1е! 15 Ьр Экзон 10

1Ь-1|} +3953СТ (гб! 143634) Провоспалительный цитокин, индуцирует экспрессию М-а и др. Экзон 5

1Ь-4 -590С/Т (гэ2243250) Противовоспалительный цитокин, ингибирует аутоиммунные реакции промотор

1Ь-6 -174СЛЗ («1800795) Провоспалительный цитокин промотор

По результатам сравнительного анализа было показано отсутствие ассоциации с риском развития АИТ полиморфизмов: -318С/Г гена СТЬЛ-4, -1858С/Т гена РТРN22, -609С/Т гена ТЫ ПИ, +196Т/0 гена Г,\'№2, -590СУГ гена И-4, -1740/6 гена ¡1-6, тогда как БЫР -1661АЛЗ и +49АЛЗ гена СТ1А-4, -308АЛЗ гена ТОТ-а, -1135Т/С гена ГЛОТ?/, с1е115Ьр гена ТИРЯ2, +3953С/Т гена /£-//?, вносят вклад в формирование генетической предрасположенности к хроническому лимфоцитарному тиреоидиту у населения РТ (табл. 4).

Таблица 4. Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным

маркерам изученных генов среди больных АИТ и лиц группы контроля

Аллель/ Частота ош Аллель/ Частота ОШ

встречаемости Р встречаемости Р

АИТ«+» АИТ «-» АНТ «+» | АИТ«-»

-1661 Л/С гена СТ1А-4 -174С/С гена И-6

Л 0,732 0,806 0,81 - с 0,589 0,603 0,721 -

в 0,267 0,193 0,04* 1,52 в 0,41 0,396 0,721 -

АА 0,472 0,615 0,78 СС 0,387 0,357 0,597 -

АО 0,519 0,371 0,04 - ев 0,403 0,493 0,128 -

0,007 0,012 0,83 1,83 во 0,209 0,149 0,187 -

-318 С/Т гена СТ1Л-4 -308 /УС гена ТТУГ-я

С 0,867 0,898 0,61 - А 0,54 0,79 8,17-Ю"8 03

Т 0,133 0,102 0,86 - в 0,45 0,21 8,17-Ю8 3,18

сс 0,742 0,803 1 - АА 0,27 0,62 5,2-10"' 0,09

ст 0,250 0,191 0,87 - Ав 0,53 0,34 0,005 3,52

тт 0,008 0,006 0,89 - 0,19 0,04 0,00068 10,85

+49 А/С гена СПА-4 -1135 Т/С гена TNF.H1

А 0,489 0,652 0,76 - с 0,72 0,48 4,85-10 2,84

в 0,511 0,348 0,012 2,0 т 0,27 0,51 4,85-109 0,35

АА 0,214 0,373 0,89 - сс 0,58 0,24 1,04-10"* 5,04

АО 0,550 0,557 1 - тс 0,28 0,46 0,001 0,25

0,237 0,07 0,001 4,04 тт 0,13 0,28 0,002 0,19

1858 С/Т гена РТРЫ22 -609С/Т гена ГЛТ-Я/

С 0,87 0,88 1 - в 0,69 0,67 0,79 -

Т 0,12 0,11 1 - т 0,3 0,32 0,79 -

СС 0,78 0,77 1 - ее 0,42 0,4 0,78 -

ст 0,17 0,21 0,89 - вт 0,54 0,55 0,85 -

тт 0,036 0,0062 0,55 - тт 0,037 0,04 0,83 -

+3953С/Т гена Я.-7/? +196Т/С Гена Т1ЧР-Я2

С 0,63 0,48 0,0003 1,87 в 0,45 0,5 0,31 -

т 0,365 0,52 0,0003 0,53 т 0,54 0,49 0,32 -

СС 0,32 0,233 0,084 - се 0,17 0,26 0,11 -

ст 0,61 0,49 0,048 6,5 от 0,55 0,46 0,21 -

тт 0,058 0,27 4,95-10"4 0,15 тт 0,26 0,26 0,93 -

-590С/Т гена 11^4 ¡пв/йе! 15 Ьр гена 77УГ-Л2

С 0,67 0,68 0,753 - 1 0,6 0,58 0,62 -

т 0,32 0,31 0,753 - О 0,39 0,41 0,63 -

СС 0,47 0,46 0,88 - II 0,41 0,25 0,01 0,7

ст 0,4 0,44 0,47 - ГО 0,38 0,65 4,95-10 5 0,35

тт 0,128 0,093 0,37 - оо 0,2 0,08 0,01 1,41

Ген СТЬА-4 Молекулы С'П.Л-4 играют важную роль в аутотолерантности: при представлении антигенпрезентирующими клетками аутоантигена, связывание СТЬА-4 ведет к апоптозу Т-клеток и отсутствию иммунного ответа

Одними из наиболее диагностически значимых полиморфизмов данного гена являются однонуклеотидные полиморфизмы (8ЫР) в положении -1661 А/О и -318С/Т промоторной области гена, влияющих на экспрессию гена, а также транзиция аденина

на гуанин в положении +49 экзона 1 (+49A/G), приводящая к снижению функциональной активности белка CTLA-4.

Проведенный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфным вариантам гена CTLA-4 показал статистически значимое увеличение доли гомозиготного генотипа GG и аллеля G по полиморфному локусу +49A/G в группе больных АНТ, а также гетерозиготного генотипа A/G и аллеля G полиморфизма -1661A/G (ОШ=1.84. ДИош 2,31-1,4 и ОШ=1,52, ДИош 2,0-1,1 соответственно). Вероятно, в основе полученной нами ассоциации данного полиморфизма -1661A/G лежит увеличение концентрации растворимой формы рецептора CTLA-4.

Изученные полиморфизмы гена CTLA-4 расположены в одном гене, и это может служить причиной их возможного сцепления. В связи с этим, нами проведен анализ ассоциации с риском развития АИТ носителей различных сочетаний генотипов трех полиморфизмов гена CTLA-4 (рис. 5).

Из возможных 27 сочетаний, для популяции РТ было выявлено 13, при этом самый высокий риск наблюдается при одновременном присутствии гетерозиготных генотипов по промоторной области и гомозиготного по полиморфному аллелю G экзонной части гена (0111=7,87 ДИ 2,03-3,25), а сочетание генотипов по нормальным аллелям гена обладает протективным действием (ОШ= 0,25 ДИ 1,21-1,89)

0,4

»4 „ч „ч λ tf в?

□ АИТ"-" ЕАИТ"+"

Рис. 5 Распределение частот сочетаний генотипов по полиморфизмам -1661A/G, -318С/Т, и +49A/G гена CTLA-4 в группах больных АИТ (АИТ+) и контроля (АИТ-).

Геи TNF-a и его рецепторов TNF-R1 и -R2. Другим геном-кандидатом рассматривается ген TNF-a, продукт которого относится к классу противовоспалительных цитокинов, играющих значимую роль в развитии воспалительных реакций, участвующий в активном формировании соединительной ткани и способствующий индукции некроза и апоптоза различных клеток организма.

Известно более 30 полиморфных вариантов гена, но наибольший интерес вызывает полиморфизм -308G/A, локализованный в промоторной области гена. Замена гуанина на аденин в данном случае приводит к повышению экспрессии гена in vitro (Bidwell J., 1999).

Нами показано, что аллель G, генотипы GG и AG ассоциированы с повышенным риском развития АИТ (ОШ=3,18, ДИ0Ш 2,0-4,9; ОШ=Ю,85, ДИ0Ш 3,4134,4; ОШ=3,52, ДИош 1,92-6,4 соответственно).

Основной биологический эффект от TNF-a достигается путем связывания его с двумя рецепторами - TNFR1 и TNFR2 - на поверхности клеток (Gupta R., 2007). Потенциальное влияние полиморфизмов генов данных рецепторов обуславливается тем, что они, связываясь с TNF-a, выступают в роли «нейтрализаторов» циркулирующего цитокина (Van Zee K.J., 1992). С другой стороны, TNF-рецепторы могут выступать источником TNF-a, и, как следствие, продлевать его действие (Aderka D., 1992).

Продуктом гена TNF-R1 является белок-рецептор р55, экспрессирующийся на всех нуклеарных клетках организма и регулирующий каскад регуляторных реакций (Bridjes S., 2002). Одним из наиболее значимых SNP данного гена являются полиморфизмы -609G/T, -1135Т/С, влияющие на экспрессию гена.

В ходе исследования, по полиморфизму -1135Т/С нами показано достоверное увеличение аллеля С (ОШ=2,84; ДИ0Ш 1,9-4,05) и гомозиготного генотипа СС (0111=5,04; ДИ0Ш 2,5-9,9) в группе больных АИТ, тогда как аллель Т (0ш=0,35; ДИ0Ш 0,24-0,5) и генотипы СТ и ТТ оказывают протективное действие в отношении развития АИТ (ОШ=0,25; ДИ0Ш 0,14-0,44 и ОШ=ОД9; ДИош 0,1-0,39, соответственно).

TNF-R2 преимущественно экспрессируется на клетках миелоидного происхождения, особенно стимулированных Т и В лимфоцитами. На протяжении последних лет проведен целый ряд исследований ассоциации полиморфизмов гена TNF-R2 с развитием АИТ в различных популяциях, однако эффект от функциональных полиморфизмов, в том числе и от +196T/G экзона 6, не до конца понятен (Bridjes S., 2002). Также, в 5'-нетранслируемом регионе найден инсерционно-делеционный полиморфизм (ins/del) в 15 п.н., локализованный в позиции между -363 и -349. Предположительно, в данном регионе находится сайт связывания фактора транскрипции (Beltinger, 1996).

Сравнительный анализ ассоциации данного полиморфного локуса с риском развития АИТ показал значимые различия только по полиморфизму ins/del 15bp. Так, в группе больных показано увеличение доли гомозиготного генотипа DD на фоне достоверного увеличения гетерозиготного генотипа ID в группе контроля. Таким образом, генотип DD оказывает предрасполагающее, а генотип ID - протективное в

отношении АИТ действие (ОШ=1.41; ДИош 0,59-3,36 и 01Б=0,35; ДИош 0,19-0,65 соответственно).

Ггн Я.-//?. 1Ь-1р - провоспалительный цитокин, инициирующий и регулирующий иммунный ответ, вовлекается в развитие многих аутоиммунных заболеваний, в том числе и тиреопатий (АИТ, болезнь Грейвса (БГ) и др.), поскольку воздействует непосредственно на тиреоидные клетки. Под его контролем находится регуляция экспрессии тиреоид-специфичных белков (тиреоглобулина и тиреопероксидазы) (Ка\уаЬе У., 1989).

Изученный нами полиморфизм +3953СУТ находится в 5 экзоне данного гена, приводит к замене цитозина на тимин в положении +3953 нуклеотидной последовательности.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по данному полиморфизму показал значимое увеличение доли аллеля С (р=0,0003) и гетерозиготного генотипа СТ (р=0,048) в группе больных АИТ, тогда как в группе условно здоровых лиц наблюдалось достоверное увеличение доли аллеля Т (р=0,0003) и гомозиготного генотипа ТТ (р-4,95-10~6). Расчет показателей относительного риска показал, что носители генотипа СТ более, чем в 6 раз, подвержены к развитию аутоиммунного поражения ЩЖ (ОШ= 6,05, 95% ДИ0щ 2,592,97), тогда как генотип ТТ носит протективный характер (0ш=0,15, 95% ДИоШ 0,060,38).

Таким образом, полиморфизмы генов, продукты которых запускают каскад реакций программируемой клеточной гибели (Я.-//?, ТЫГ-а, ТЫГ-Ш и ТЫГ-И2) и нарушения иммунной толерантности (СТ1А-4), являются генетическими факторами риска развития АИТ у населения РТ.

Поскольку исследованные нами гены вовлечены в регуляцию Т-клеток, которые, в свою очередь стимулируют В-клетки к выработке специфических антител к компонентам ЩЖ (АТ-ТГ и АТ-ТПО) и неспецифических антител к ДНК, в группах больных провели оценку среднего уровня показателей АТ-ТГ и АТ-ТПО, а также уровня АТ к нативной и денатурированной ДНК среди носителей разных генотипов изучаемых полиморфных маркеров (табл. 5).

В ходе исследования показано, что повышение уровня АТ-ТГ (свыше 30 МЕ/мл) наблюдалось у носителей генотипов АО, СО и генотипа СО полиморфизмов -1661АЛЗ и +49Л/0 гена СТЬА-4 соответственно, генотипа СС полиморфного локуса -1135Т/С гена ТЫП11 и генотипа ТТ полиморфизма -590С/Т гена 11-4. Стоит отметить, что носители генотипа Ай полиморфного локуса +49АЛЗ гена СПА-4; генотипа АА полиморфизма -ЗО8АЛЗ гена ТпТ-а и генотипа ТТ полиморфного варианта +3953С/Т гена /£-//? характеризуются нормальными значениями уровня указанных АТ (до 30 МЕ/мл).

Повышение уровня ЛТ-ТПО более 1000 МЕ/мл отмечалось у носителей гомозиготного по аллелю G генотипа полиморфного локуса -1661A/G гена CTLA4: -308A/G гена TNF-a\ а также у носителей генотипа II ins/del 15bp гена TNF-R2 и генотипа СС полиморфизма -1135Т/С гена TNF-R, в то время как носители гетерозиготных генотипов СТ и ID полиморфных локусов -1135Т/С гена TNF-RI и del 15bp гена TNF-R2 соответственно характеризовались выработкой специфичных АТ-ТПО в пределах нормы (до 100 МЕ/мл).

Таблица 5. Генетические маркеры, ассоциированные с повышенной выработкой органоспецифических аутоантител_

АТ-ТГ, ОШ АТ-ТПО, ОШ

Полиморфизм Генотипы До 100 мЕд/мл (N) Больше 100 мЕд/мл (выше N) До 30 мЕд/мл (N) 30-1000 мЕд/мл Больше 1000 мЕд/мл

-1661A/GreHa CTLA-4 АА AG GG 0,41 1,56 2,54 - - 3,61

+49A/G гена CTLA-4 АА AG GG 0,4 1,12 - 1,3 -

-308A/G гена TNF-a АА AG GG 0,31 - - 1,3 -

-1135Т/С гена TNF-R1 СС СТ ТТ - 4,0 0,33 - 2,35

dell5bp гена TNF-R2 II ID DD - - 0,23 - 1,03

+3953С/Т гена IL-ip СС СТ ТТ 0,19 - - - -

-590С/Т гена 1L-4 СС СТ ТТ - 2,79 - - -

Поскольку антитела к ДНК имеют патогенетическое значение, оказывающее повреждающее действие и сопровождающееся развитием типичной воспалительной реакции (Дядык А.И. и др., 2009), а продукты исследованных нами генов участвуют как в ингибировании активации Т-лимфоцитов (СЛЪА-4 и РТРЫ22), так и в воспалительных реакциях, нами проведена оценка влияния полиморфных маркеров на уровень выработки АТ к ДНК при АИТ.

В результате исследования значимые различия в уровнях АТ к ДНК между носителями отдельных генотипов обнаружены только по полиморфному маркеру -1661 гена СТ1А4 (рис. 6).

Рис.6. Распределение частот генотипов в группе больных (АИТ'+") по полиморфному локусу -1661 А/С гена СТЫ-4 по уровню содержания АТ к нДНК и дЦНК

Как показано на рисунке, у носителей гетерозиготного генотипа GG наблюдается достоверное повышение уровня AT к дДНК по сравнению с уровнем AT к нДНК (р<0,005, 95%ДИ 0,06-0,12). несмотря на то, что в целом содержание AT к ДНК у таких индивидуумов ниже, по сравнению с носителями других генотипов.

Таким образом, в данном исследовании показано, что патогенетическими звеньями иммунологического нарушения хронического лимфоцитарного тиреоидита являются пути индукции программируемой клеточной гибели и генетический фактор, лежащий в основе нарушения регуляции Т-клеток, что, возможно приводит к бесконтрольной выработке не только тиреоидспецифических AT, но и AT к ДНК. При этом клиническое проявление АИТ (гипертиреоз, гипотиреоз, эутиреоз) характеризуется наличием разной субстратной специфичности ДНК-абзимов. При хроническом лимфоцитарном превалирующим фактором индукции апоптоза является цитокин TRAIL. Также показано, что значительный вклад в генетическую предрасположенность к данному заболеванию вносят полиморфные варианты -1661A/G и +49A/G гена CTLA-4, -308A/G гена TNF-a, -1135Т/С гена TNFR1, dellSbp гена TNFR2, +3953С/Т гена IL-ip.

ВЫВОДЫ

1. При хроническом лимфоцитарном тиреоидите имеет место TRAIL-индуцированный апоптоз, причем в стадии гипертиреоза повышенный уровень TRAIL, TNF-a отражают преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами.

2. Хронический лимфоцитарный тиреоидит характеризуется значимым повышением уровня AT к дДНК. ДНК-гидролизующая активность AT к ДНК меняется в динамике патологического процесса и влияет на функциональное состояние ЩЖ.

3. Хронический лимфоцитарный тиреоидит характеризуется кластеризацией органоспецифических (АТ-ТГ, АТ-ТПО) и неспецифических (AT к ДНК) при разной активности аутоиммунного процесса и функционального состояния ЩЖ.

4. Маркерами генетической предрасположенности к развитию АИТ являются полиморфные локусы -1661A/G и +49 A/G гена CTLA-4\ -308A/G TNF-a\ TNFR1 -1135 Т/С, TNFR2 del 15bp; +3953 С/Т гена IL-Iß.

5. Уровень AT (АТ-ТГ, АТ-ТПО и AT к дДНК) зависит от носительства определенных генотипов полиморфных локусов -1661A/G, +49 A/G гена CT LA 4: -308A/G гена TNF-a; -1135 Т/С гена TNFR1; del 15bp гена TNFR2; +3953 С/Т гена 1L-lß\ -590С/Т гена IL-4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биктагирова, Э.М. Влияние полиморфизмов генов CTLA-4 и PTPN22 на риск развития аутоиммунного тиреоидита среди населения Республики Татарстан/ Э.М. Биктагирова, O.A. Кравцова, Л.И. Саттарова, Г.Р. Вагапова // СПб РО РААКИ Медицинская иммунология-2010,Т. 12, № 1-2, стр. 103-114

2. Биктагирова, Э.М. Ассоциация полиморфизмов генов IL-lß, IL-4 и IL-6 с формированием генетической предрасположенности к аутоиммунному тиреоидиту / Э.М. Биктагирова, Л.И. Саттарова, Г.Р. Вагапова, O.A. Кравцова// СПб РО РААКИ Медицинская иммунология -2011,Т. 13, № 6, С.603-608

3. Камалетдинова (Биктагирова), Э.М. Полиморфизм R620W гена PTPN22 как маркер предрасположенности к аутоиммуному тиреоидиту / Э.М. Камалетдинова (Биктагирова), O.A. Кравцова // Итоговая научно-образовательская конференция студентов Казанского государственного университета 2008 г.: сборник статей / ред. Кондратьева И.Г. - Казанский государственный университет - Казань: Издательство Казанского университета, 2008. - С. 15-17

4. Биктагирова, Э.М. Полиморфизм R620W гена PTPN22 как маркер предрасположенности к аутоиммунному тиреоидиту среди населения Республики Татарстан / Э.М Биктагирова, О.А Кравцова.// Симбиоз-2009:материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая 2009 г.Пермь) /ред. Ившина И.Б, Литвиненко Н.И./ Перм.гос.ун-т. - Пермь. - 2009. - С. 193-194.

5. Biktagirova, Е. М. Association of CTLA4 gene polymorphisms with autoimmune thyroiditis in Tatar population/ E. M Biktagirova., L.I.Sattarova, O.A. Kravtsova // European journal of human genetics. - June, 2010 - Vol.18, Supp. 1. -European Human Genetics Conference, Gothenburg, Sweden - P.220

6. Биктагирова. Э.М. Ассоциация полиморфных локусов генов CTLA4 и PTPN22 с риском развития аутоиммунного тиреоидита среди населения Республики

г

Татарстан/ Э.М. Биктагирова, O.A. Кравцова, Л.И. Сатарова Г.Р. Вагапова // Материалы научно-практической конференции «Становление и достижения Биохимической школы Казанского университета». - Казань. - 2009. - С.21-22

7. Биктагирова, Э.М. Ассоциация полиморфных вариантов генов цитокинов ( TNF-a, ILlb, IL4, IL6), CTLA4 и PTPN22 с риском развития аутоиммунного тиреоидита в популяции Республики Татарстан / Э.М. Биктагирова, O.A. Кравцова, Л.И. Сатарова, Г.Р. Вагапова // Меджународная научно-практическая конференция «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (17-18 мая). Материалы конференции -Казань. -2010,.-С.8-13.

8. Биктагирова, Э.М. Влияние полиморфизмов генов CTLA-4 и PTPN22 на риск развития аутоиммунного тиреоидита среди населения Республики Татарстан/ Э.М. Биктагирова, O.A. Кравцова, Л.И. Саттарова, Г.Р. Вагапова // Всероссийский конгресс «Современные технологии в эндокринологии» (тиреодология, нейроэндокринология, эндокринная хирургия) (23-26 ноября, 2009). Сборник тезисов. - Москва - 2009. - С.364.

9. Биктагирова, Э.М. Ассоциация полиморфных вариатов генов цитокинов (TNF-a, ILlb, IL4, IL6), CTLA4 и PTPN22 с риском развития аутоиммунного тиреоидита в популяции Республики Татарстан / Э.М. Биктагирова, Е.В. Вавилова, O.A. Кравцова, Л.И. Саттарова, Г.Р. Вагапова // Бюллетень федерального центра сердца, крови и эндокринологии им.В.А. Алмазова. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных оргаиов»(20-22 мая). Под ред. Шляхто Е.В. Санкт-Петербург. - 2010.- №2 - С.30-31

10. Биктагирова, Э.М. Полиморфизм генов TNF-a и его рецепторов как генетический фактор нарушения программируемой клеточной гибели при аутоиммунном тиреоидите / Э.М. Биктагирова, E.H. Чухловина, Л.И. Саттарова, Г.Р. Вагапова, З.И. Абрамова, O.A. Кравцова // II Меджународная научно-практическая конференция «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли». Материалы конференции .Под.ред.Зыятдинова К.Ш.- Казань: ИД «Меддок» - 2011. - С.3-5.

Подписано в печать 19.08.2011. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Договор №9 от 19.08.2011. Тираж 100.

Лаборатория оперативной печати Казанского педагогического колледжа 420087, г. Казань, ул. Даурская, дом 30, ком. 49 а. 420036, г. Казань, ул. Побежимова, 47а, тел. 571-14-29.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Биктагирова, Эльнара Маулетовна

Список используемых сокращений ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУТЫ

1.1. Современные представления о патогенезе хронического лимфоцитарного тиреоидита

1.2. Роль апоптоза в патогенезе АИТ

1.3 . Аутоантитела к ДНК в норме и при патологии

1.3 .1. Возможные. механизмы реализации повреждающего действия каталитических аутоантител к ДНК при аутоиммунной патологии

1.3.2. Механизм участия- ДНК-абзимов в патогенезе аутоиммунного синдрома!

1.4. Генетические факторы риска развития АИТ '

1.4.1 Полиморфизм генаповерхностного антигена цитотоксических:

Т-лимфоцитов СТЕА-4 • ■ '.

1.4.2. Полиморфизм гена пр'отеинтирозин фосфатазы РТРШ

1.4.3 Полиморфизм-гена фактора некроза опухолей-альфа и его рецепторов

1.4.4 Полиморфизм генов цитокинов и их роль в аутоиммунитете ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ*

Глава 2 МАТЕРИАЛЕ! И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реактивы и оборудование

2.2. Объекты исследования

2.3 Приготовление раствора ДНК морского ежа

2.4 Определение АТ к нативной и денатурированной ДНК методом иммуноферментного анализа

2.4.1 Подбор оптимальной концентрации конъюгата

2.5 Опредление ДНКазной активности АТ к ДНК

2.6 Электрофоретический анализ гшазмидной ДНК рВЯ322 в агарозном геле

2.7 Иммунофенотипирование лейкоцитов методом проточной' цитометрии

2.8 Материалы и методы генотипирования

2.8.1. Выделение ДНК

2.8.2. Постановка ПЦР

2.8.3. Рестрикционный анализ

2.8.4. Разделение продуктов амплификации и рестрикции 66 2.9. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Характеристика процесса программируемой клеточной гибели и аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите

3.2. Выявление связи .между показателями активности аутоиммунитета: уровня специфических АТ-ТГ, АТ-ТПО, неспецифических АТ к ДЕК и функциональным состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите •

3.3 Генетические факторы риска развития хронического лимфоцитарного тиреоидита 80 •

3.3.1 Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов с уровнем АТ у больных АИТ "

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические и генетические маркеры аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите"

Проблема хронического лимфоцитарного тиреоидита (аутоиммунного тиреоидита (АИТ), тиреоидита Хашимото) до настоящего времени остается, актуальной, так, как вопросы этиологии, патогенеза, морфологии, классификации, диагностики, терапии и прогноза заболевания не получили еще своего окончательного решения (Дедов И. И, с соавт., 2003). АИТ считается одним из наиболее распространенных заболеваний- щитовидной железы (ЩЖ), частота которого среди взрослого «населения колеблется от 6 до 11% (Балаболкин М.И, 2002, Зефирова Г.С., 1999, Петунина Н.А., 2002).

В. настоящее время известно, что в основе развития аутоиммунных заболеваний, в том числе и АИТ, лежит нарушение процессов программируемой клеточной гибели, в частности апоптоза (Квачева Ю.Е., 2002; Петрищев Н.Н., 2008). Интерес к апоптозу обусловлен тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом тех сигнал-проводящих систем (интерлейкины (IL), интерфероны, нуклеазы), изменение которых имеет патогенетическое значение для АИТ. Тем не менее, механизмы дисрегуляции апоптоза в условиях реализации аутоиммунитета еще недостаточно, исследованы (Недосекова Ю.В., 2009). Salmaso С. с соавт. (2002) одними из первых указали, на связь активации, апоптоза и поражением ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.

Наибольший интерес вызывает регулирующее влияние на апоптоз биологически активных веществ - цитокинов, прежде всего, Fas, TRAIL, TNF-a (Попов JI.C. и др. 2004), опосредующих программированную клеточную гибель тироцитов, под воздействием цитотоксичечских Т-лимфоцитов, экспрессирующих лиганды FasL, TRAIL, . TNF-a). Причем,TRAIL опосредует как апоптоз тиреоцитов, так и цитотоксических аутореактивных лимфоцитов (Nakahara М., et al., 2009). Имеются данные, что высокие показатели TRAIL могут отражать преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами при ряде аутоиммунных заболеваний (Хараева З.Ф. с соавт., 2011). TNE-a является гомологом FasL, что свидетельствует о его высокой апоптогенной активности.

Одним из нерешенных вопросов является • определение роли специфических; антитиреоидных аутоантител (ААТ) в механизме: развития ЛИТ. В настоящее; время» показано существование антител (AT) к. тиреоглобулину (ТЕ) и тиреопероксидазе; (ТГЮ) с каталитическим ресурсом (абзимы), способных проявлять активность сходную с активность классических* протеаз' (Андреева А.В. с соавт, 2011). Такого рода AT являются одним из инструментов тонкого контроля над динамикой аутоиммунного; воспаления, и связанных, с воспалительными* процессами дисфункции и деградации ЩЖ (Исаева М.А. с соавт., 2009; Bulow P.I. et all, 2005) ' • : -ч." / . Рядом авторов показано, что маркером нарушения функционирования' иммунной . системы,, приводящих . к- развитию и прогрессированшо аутоиммунных заболеваний (АИЗ), являются ААТ к ДНК, которые,,вероятно, и являются причиной. деструкции тканей и- органов, нарушая уровень физиологического апоптоза (Невинский F.AV с соавт;, 2000,, Сучков; С.В: с соавт., 2001). Различия; в клинико-иммунологической; картине АИТ (эу-, гипо- № гипертиреоз),. видимо; связаны с феноменом гетерогенности ААТ. (Сучков С.В., с; соавт., 2001), обладающих различными уровнями специфичности. Тем не. менее, до настоящего времени нет единой точки зрения относительно причин и характера иммунных сдвигов, приводящих к утрате контроля над образованием ААТ и появлением; с одной стороны,, абзимов с каталитическим и цитотоксическим эффектом, а с другой - AT к ДНК лишенных указанных свойств. В этом плане определенный интерес представляют исследования AT к ДНК и их ДНКазной активности в зависимости' от степени выраженности аутоиммунного процесса; и функционального состояния 1ЦЖ при APIT

Следует, подчеркнуть, что механизм развития АИТ со специфическим дефицитом Т-лимфоцитов супрессоров (GD8+). Bi частности, в своих исследованиях R. Volpe (1997), показал, что АИЗ ЩЖ возникают в результате; нарушения регуляторных процессов в самой иммунной системе н это нарушение частично связано с наследственным дефектом антиген-специфических Т-супрессоров и влиянием факторов окружающей среды на иммунорегуляцию:

Кроме того; немаловажным фактором развития ЛИ Г лежит изменение со; стороны иммунокомпетентных; регуляторных Т-клеток, генетический' дефект; которых, спровоцированный?экзогенным!воздействием; ведет к срыву их толерантности (Абрамова Н.А., 2006); Генеалогические и близнецовые" исследования показали, что АИТ относится к категории мультифакторных патологий, с наследственной предрасположенностью. На сегодняшний день существует более 100 генетических- маркеров,- которые; тем; или иным образом.ассоциированы с развитием аутоиммунных патологий ЩЖ (Кандрор В.И., 2001). При этом фенотипическое проявление- генетического полиморфизма в значительной мере зависит от генофонда и условий жизни каждой конкретной: популяции, чем и. объясняется противоречивость данных по ассоциации полиморфизма генов-кандидатов. с риском,развития АИТ.

Таким образом, на. сегодняшний^ день, представляется актуальной комплексная оценка биохимических и генетических факторов нарушения аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите среди населения Республики Татарстан (РТ). В связи с вышесказанным, целью данного исследования является характеристика аутоиммунного процесса при хроническом лимфоцитарном; тиреоидите и выявление генетических факторов риска развития данной патологии у населения РТ. В соответствии с целью; были поставлены следующие задачи:, 1. Охарактеризовать процесс аутоиммунитета и апоптоза при. хроническом лимфоцитарном тиреоидите по содержанию специфических (аннексии V, TRAIL и TNF-a) и неспецифических (AT к нДНК, дДНК) маркеров.

2. Исследовать наличие ДНК-гидролизующей активности AT к ДНК в сыворотке крови больных хроническим лимфоцитарным тиреоидитом и здоровых лиц. >

3. Изучить, связь, между показателями активности аутоиммунитета: уровня- специфических (AT кс тиреоглобулину (АТ-ТГ), ÀT к тиреопероксидазе (АТ-ТПО)) и неспецифических (AT к ДНК)« с функциональным: состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.

4. Изучить ассоциацию полиморфизмов: -318G/T, -1661A/G и +49A/G гена CTLA-4, -1-858C/T гена PTPN22, -308A/G:генаTNF-a, -609G/T, -1135Т/С гена TNF-RU +196T/G, deilSbp гена TNF-R2, +3953G/T гена IL-lfi, -590С/Т гена IL-4, -11 АС/G vcuix IL-6 с риском развития АИТ и степенью активности аутоиммунного процесса у населения РТ.

Научная новизна Впервые охарактеризован процесс программируемой клеточной« гибели, при хроническом лимфоцитарном-, тиреоидите; по; трем специфическим, маркерам : аннексии V, TRAIL и TNF-ш Показано; что при АИТ в стадии гипертиреоза имеет место TRAIL-индуцированный апогггоз с преобладанием некротических процессов.

Показано преобладание AT к денатурированной ДНК (AT к дДНК) в . сыворотке крови больных АИТ, при этом общий пул AT к ДЬЖ характеризовался изменением степени ДНК-гидролизующей активности и субстратной специфичности в процессе течения;заболевания.

Исследована генетическая , предрасположенность к хроническому лимфоцитарному тиреоидиту у населения РТ по 12 полиморфизмам 8 генов, продукты которых принимают участие в регуляции иммунного ответа.

Таким; образом, впервые проведен комплексный анализ по выявлению биохимических и генетических маркеров нарушения: аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.

Научно-практическая значимость работы

Данные, полученные в результате исследования, могут служить основой для формирования; групп повышенного риска развития АИТ и разработки дифференцированных программ профилактики и ранней? диагностики; заболевания, у конкретного человека с учетом данных генотипирования.

Материалы исследования; представляют интерес в области биохимии; генетики популяций; медицины; и могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах-.

Положения, выносимые на защиту:

1. Функциональное состояние.ЩЖ при хроническом лимфоцитарном; тиреоидите.зависит от характера патологического процесса - апоптоз/некроз, что отражается " в кластеризации специфических (АТ-ТГ, . АТ-ТПО) и неспецифических (AT к ДЕК). ААТ, а также в изменении степени' гидролитической активности и субстратной' специфичности AT к ДНК в . процессе течения заболевания.

2. Повышенный уровень TRAIE отражает, преобладание; некротических' процессов . над апопготическими механизмами.; при, АИТ в стадии гипертиреоза.

3. Генетическими маркерами- активации апоптоза и, индукции аутоиммунитета при АИТ с высокой активностью аутоиммунного: процесса' являются полиморфизмы генов TNF-a и его рецепторов, IL-lf3, IL-4 и CTLA-4. •

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на: итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского государственного университета (Казань, 2008 г.); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (памяти B.F. Винтера) (Казань, 2009); Симбиозе-2009 (II

Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов) (Пермь, 2009); Всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии (тиреоидология, нейроэндокринология, эндокринная хирургия)» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010); Международной конференции «European Human Genetics Conference 2010» (Швеция, 2010); II Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, среди которых 2 публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК.

ГЛАВА ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Биктагирова, Эльнара Маулетовна

выводы

1. При хроническом лимфоцитарном тиреоидите имеет место TRAIL-индуцированный апоптоз, причем в стадии гипертиреоза повышенный уровень TRAIL, TNF-a отражают преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами.

2. Хронический лимфоцитарный тиреоидит характеризуется значимым повышением уровня AT к дДНК. ДНК-гидролизующая активность AT к ДНК меняется в динамике патологического процесса и влияет на функциональное состояние ЩЖ.

3. Патологический процесс при хроническом лимфоцитарном тиреоидите определяется кластеризацией органоспецифических (АТ-ТГ, АТ-ТПО) и неспецифических (AT к ДНК) при разной активности аутоиммунного процесса и функциональном состоянии ЩЖ.

• - 4. Маркерами генетической предрасположенности к "развитию АИТ являются полиморфные локусы -1661A/G и +49A/G, а также сочетания генотипов CT/AG/GG по полиморфным локусам -318С/Т, -1661A/G и +49A/G гена CTLA-4; -308A/G TNF-a; TNFRJ -1135 Т/С, TNFR2 del 15bp; IF 1/3 +3953 С/Т гена.

5. Уровень AT (АТ-ТГ, АТ-ТПО и AT к дДНК) зависит от носительства определенных генотипов полиморфных локусов -1661A/G, +49 AJG гена CTLA-4; -308A/G гена TNF-a; -1135Т/С гена TNF-R1; del 15bp гена TNF-R2; +3953 С/Т гена/1,-7/?; -590С/Т гена IL-4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

АИТ — это мультифакторное, полигенное заболевание, развивающееся в результате комплексного воздействия факторов окружающей среды.

Анализ данных литературы свидетельствует о сложности механизмов возникновения АИТ. К настоящему времени показана роль апоптоза в патогенезе аутоиммунных заболеваний ЩЖ, в том числе и АИТ. Между тем механизмы его дисрегуляции в условиях реализации аутоиммунитета еще-недостаточно исследованы. Показано также, что ДНК-абзимы обладая уникальными каталитическими и цитотоксическими свойствами, играют определенную роль аутоиммунных и опухолевых заболеваниях, претендуя при этом на роль дополнительного инструмента в диагностике, в частности и АИТ. Таким образом, патогенетическая • роль ДНК-абзимов и физиологический смысл их каталитической активности до настоящего времени остаются невыясненными и требуют проведения» фундаментальных исследований, которые могут внести вклад в понимание механизмов развития^ некоторых форм аутоиммунной патологии (Сучков C.B. с соавт., 2002). Предполагается, что на основе ДНК-абзимов возможно создание средств имуннодиагностики нового поколения, позволяющих давать количественную оценку опосредованному абзимами апоптозу и интерпретировать полученные данные в рамках нерешенных клинических задач (Сучков C.B. с соавт., 2002; Friboulet A., et al.,., 1999).

Согласно некоторым данным, центральным патогенетическим звеном в развитии АИТ служит частичный дефект иммунологичского надзора, возникающий на фоне имеющейся генетической предрасположенности (дефекты в системе гистосовместимости HLA). Лимфоциты интенсивно инфильтрируют ткань ЩЖ, в итоге возникает деструкция тиреоцитов, что впоследствии клинически проявляется гипотиреозом. В ткани самой железы при АИТ выявляются также В-лимфоциты, которые вырабатывают антитела к высвобождающимся антигенам, например тиреопероксидазе и тиреоглобулину.

Исследования последних исследования показали, что одни из важнейших локусов предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям лежат именно в области генов НЬА (6р21) и СТЪА-4 (2q31-q33) и примерно наполовину определяют генетическую предрасположенность к патологии.

В последние десятилетия во всем мире ведутся активные поиски по выявлению ассоциации полиморфных вариантов с риском развития аутоиммунных заболеваний ЩЖ.

В Республике Татарстан подобные исследования ранее не проводились, поэтому характеристика биохимических маркеров аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите и выявление генетических факторов риска развития данной патологии у населения нашего края, учитывая масштабы распространения АИТ, является особенно актуальным на сегодняшний день. Исследования механизмов развития АИТ могут способствовать разработке новых методов терапии, ранней диагностики, выявлению лиц с повышенным риском заболеваний.

В проведенном нами научном исследовании предпринята попытка выявления биохимических и генетических маркеров аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реактивы и оборудование

1. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) - 0,5 М;

2. Натрий хлористый (КаС1) - 0,2 М;

3. Магний хлористый (]\^С12 ) - 0,2 М;

4. Сахароза - 1 М;

5. Глицерин;

6'. Тритон Х-100;

7. Трис-ОН

8. Трис-НС1 — 1 М (рН 7.6, 8.0); .

9. Насыщенный фенол, рН 7.8;

10. Хлороформ/изоамиловый спирт (24:1);

11. Этанол 96%, 70%, 10%; "

12. Протеиназа Р - 10 мкг/мл; Додецилсульфат натрия (БОБ) - 10%;

13. 40% акриламид;

14. 10% персульфат аммония;

15. 10% и 20% глицерин;

16. ТЕМЕД;

17. 1 ОхТВЕ (0.04 М трис, 0,089 М борная кислота, 0,05 М ЭДТА);

18. Фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ) (0,01М фосфатный буфер, рН 7,2; 0ДМ ШС1; 0,05% твин-20);

19. Гидролизующий буфер (25мМ трис-НС1, 5мМ М^С12-6Н20, 50 мМ №С1; рН 7,5));

20. Цитратный буфер (ОДМ фосфат - 0,05М цитратный буфер; рН

5,0);

21. 1%Ш03;

22. 0.012 М. А§Ж)з;

23. 0.28 М Ма2С03 + 3 8% формальдегид;

24. 10% СН3СООН;

25. Конъюгированные с пероксидазой диагностические антитела против IgG человека (конъюгат);

26. ДНК плазмиды pBR322 (Москва, ООО «СибЭнзим»)

27. Высокополимерная ДНК морского ежа ;

28. Тетраметилбензидин (ТМБ)

29. Набор для ИФА. В составе:

• Планшет с иммобилизованными моноклональными антителами к TNF-a ;

Калибровочная сыворотка; Контрольный образец, содержащий TNF-a; Конъюгат № 1 - биотинилированные антитела к TNF-a; Конъюгат №2- стрептавидин- пероксидаза хрена; • . Раствор для разведения сывороток (РРС);

Раствор для предварительного разведения конъюгата №1.(РПРК); Раствор для разведения конъюгата №2 (РРК2); Концентрат фосфатно-сблевого буферного раствора с твином; Субстратный буферный раствор (СБР); Стоп - реагент

30. ИФА набор для количественного определения человеческого Анненксина V (Bender MedSystems, Vienna, Austria, Europe);

31. ИФА набор для количественного определения человеческого TRAIL (Bender MedSystems, Vienna, Austria, Europe)

32. Дистиллированная вода;

3 3. Морозильник/холодильник; 34. Водяная баня на 95°С;

35. Термостат;

36. Микроцентрифуга на 10000-14000 об./мин;

37. Программируемый термоциклер MyCycler (производство Bio-Rad Laboratories, США);

38. цитометр FACSCalibur ("Becton Dickinson", США);

39. Спектрофотометр "NanoDrop 2000e" (Thermo Scientific, США)

40. Камера для вертикального электрофореза;

41?. Камера для: горизонтального электрофореза (производство Ilelicon, Россия)

42. Стандартные; источники тока для электрофореза (Эльф-4 и 8) (ДНК-технология, Россия); '

43. Гель документирующая система Chemi Doc™ XRS (производство В i o-Rad Laboratories, США); , "

44. рН-метр (Китай, «Mellter-Toledo»)

45. Пробирки типа " Eppendorf " на 1,5: и 2,0 мл;

46: Пробирки для ПЦР на 0.6 мл;

47. Полистироловые 96-луночные планшеты (США, Linbro) •

48. Прибор для сканирования планшетов; • ;"

49. Multitest IMKKit для цитометра ("Becton Dickinson", США)

Полуавтоматические микропипетки на 2-20 мкл и 20-200 мкл. ;.

2.2. Объекты.исследования

Материалом для: исследованиям служили образцы сывороток крови; и ДНК от 298 женщин. Группа больных АИТ, включающая 161 пациента, и группа контроля, состоящая из 137 человек, были сформированы на базе Межрегионального клинико-диагностического центра (ГУ МКДЦ) (г. Казань). Диагноз АИТ устанавливался на основании результатов ультразвукового исследования ЩЖ в режиме серой шкалы и цветового допплеровского картирования, ' данных прицельной . тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультразвукового исследования, определения уровней АТ-ТПО и АТ-ТГ, оценки функционального состояния ЩЖ, по содержанию ТТГ, свободного тироксина (св/ТО и свободного трийодтиронина (св.Т3) в сыворотке крови, которые определялись, иммунохемилюминисцентным методом наборами «Immulite» на автоматическом анализаторе «Immulite» («Diagnoctic Products Corporation»,

Лос-Анжелес, США) в иммунологической лаборатории МКДЦ. Степень активности аутоиммунного процесса оценивалась по концентрации АТ к ТПО в сыворотке крови (табл. 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Биктагирова, Эльнара Маулетовна, Казань

1. Абатуров, А.Е. Хронический аутоиммунный тиреоидит у детей /

2. A.Е. Абатуров, Л.Л. Петренко, О.Н. Герасименко, Е.А; Агафонова, И. Л; Высочина, Е.Л. Кривуша, OÍA. Ермолаева // Журн. Здоровье ребенка 2009 -№1 (16). - С.25-28

3. Абрамова, H.A. Зобогенные вещества и факторы (обзор литературы) / H.A. Абрамова, В.В. Фадеев, Г.А. Герасимов, Г. А. Мельниченко // Клин и экспер тиреодология. 2006. -Т2. - №1. - С.21-32.

4. Акберова, . Н.И. Сравнение данных. II Непараметрическйе критерии значимости / Н.И. Акберова. Казань: Издательство КГУ, 2004. -50 с. ' '

5. Балаболкин, М.И. Фундаментальная и клиническая тиреоидология: Учеб. пособие / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская.— М.: Медицина. 2007.— 816 с. ■

6. Барановский; А.Г. ДНК-. и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита / А.Г. Барановский,

7. B.Г. Матюшин, A.B. Власов, В.Г. Забара, В.А. Наумов, Р. Жьеже,. В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 12. - С. 1590-1599

8. Браверманн, Л.И. Болезни щитовидной железы / Под ред. Л.И. Браверманна // Пер. с англ. М: Медицина. - 2000; - 140-158,. 347-354, 359377. т.

9. Виноградова, C.B. Роль полиморфизма генов цитокинов в развитии заболеваний печени / C.B. Виноградова // Сучаснагастроентерология. 2004. - Т. 5. - № 19. - С. 15—20.1

10. Виноградова, Ю.Е. Аутоиммунный тиреоидит при заболеваниях системы крови / Ю.Е. Виноградова; А.П. Шинкаркина, А.М. Поверенный // Тер. арх. 2003. - 75 (12). - С.83-92.

11. Герасимов, Г.А. Заболевания щитовидной железы / Г.А. Герасимов // Здоровье: 1999 - №9 - С. 23-27

12. Данилевский, М.А. Хронический аутоиммунный тиреоидит / М.А. Данилевский // Клиническая эндокринология. 2002. - №7. - С. 56-61.

13. Дедов, И.И. Диагностика, лечение и профилактика узловых форм заболеваний щитовидной железы / И.И. Дедов, Е.А. Трошина, Г.Ф. Александрова // Руководство для врачей. 1999. - «Берлин - Хеми АГ». - 96 с.

14. Дедов, И.И. Клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению аутоиммунного тиероидита увзрослых / И.И. Дедов // Клин, тиреоидол.- 2003. №1 (1) - С. 24.

15. Животский, Л.А. Популяционная биометрия / Л.А. Животский. -М.: Наука, 1991.-С. 270.

16. Зефирова, Г.С. Аутоиммунный треоидит и методыss

17. Калинин, А.П. Иммунологические аспекты аутоиммунного' тиреоидита / А.П. Калинин, Е.Е. Потемкина, В.Н. Пешева // Пробл. эндокринол. 1994. - №1. - С.56-58.

18. Кандрор, В.И. Молекулярно-генетичёские аспекты тиреоидной патологии. / В.И. Кандрор // Проблемы эндокринологии. 2001. - №5. - С. 310.

19. Кит, Ю.А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? / Ю.А. Кит, Д.В.Семенов, Г.А. Невинский // Молекул, биол. 1995. - Т.29. - № 4. - С. 893-906.*

20. Козырь, A.B. ДНК-гидролизующие антитела при лимфопролиферативных заболеваниях / A.B. Козырь, A.B. Колесников, Е.И.

21. Яхнина, И.А. Асцатуров, Е.Ю. Варламова, Е.В. Кириллов // БЭБМ. 1996. -№ 2. - С. 204-209.

22. Коликова, Ю.О. Аутоантитела к ДНК в сыворотке крови здоровых лиц / Ю.О.Коликова// Дис. канд. биол. наук.- Казань. 2003.

23. Котова, Г.А. Болезни эндокринной системы: Руководство для врачей Тиреоидиты / Г.А. Котова // под ред. акад. РАМН И.И. Дедова. М.: Медицина, 2000. - С. 295-302:

24. Котович, М.М. Роль этиотропной и патогенетической терапии в клинической и морфологической эволюции хронических гепатитов у детей/ М.М. Котович // автореф. дис. д-ра мед. наук. М., 2003. - 27 с.

25. Кравец, Е.Б. Об апоптозе лимфоцитов крови при аутоиммунных тиреопатиях / Е.Б. Кравец, О.И. Уразова, Ю,В. Недосекова, A.B. Рогалева // Проблемы эндокринологии. 2010. - №3. - С. 16-20

26. Марри, Р., Ереннер, Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Ереннер, П. Мейес, В. Родуэлл // Пер. с англ.: М.: Мир. -1993.-384 с.

27. Маянский, Д.Н. Клеточно-молекулярные механизмы формирования цирроза-печени / Д.Н. Маянский, A.A. Зубахин // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.— 1998.— № 6.— С. 6—13.

28. Мисиков, В.К. Каталитические аутоан-тйтела при рассеянном склерозе: патогенетические и клинические аспекты 7 В.К. Мисиков, М.В. Кимова, О.М. Дурова, А.Е. Еабибов, C.B.Сучков, И.ИВоробьев, H.A. Пономаренко // БЭБМ. 2005. - № 1. - С. 98-101.

29. Молоствов, Е.С. Иммунологические аспекты патогенеза аутоиммунного тиреоидита / Г.С. Молоствов, Л.И. Данилова // Медицинские новости. 1997. - №4. С.3-10

30. Моргунов, Л.Ю. Влияние отдельных внутренних болезней на течение аутоиммунного тиреоидита / Л.Ю. Моргунов // Дис. канд. мед. наук. М. 2004.

31. Наумова, Т.Е. ДНК-абзимы при аутоиммунной патологии в клинике и эксперименте / Т.Е. Наумова, О.М. Дурова, A.F. Габибов, З.С. Алекберова, C.B. Сучков // Научно-практическая-ревматология. 2003. - № 1. -С. 11-14.

32. Невзорова, Т.А. Особенности ДНК-гидролизующей активности антител при системной красной волчанке / Т.А. Невзорова, Д.А Темников, В.Г. Винтер // Биохимия.-2003.-Т: 68.-№ 12.-С. 161-6-1623.

33. Невинский, Г.А., Природные каталитически активные; антитела.1 (абзимы) в норме и" при патологии / Г.А. Невинский, T.F. Канышкова, В.Н: Бунева // Биохимия. 2000. - Т. 65. - С, 1-473-1478

34. Невинский, Г.А. Каталитически активные антитела и их возможная биологическая функция? / Г.А.Невинский, Т.Г. Канышкова, Д:В.Семенов; В:Н: Бунева II Вести. РАМН.- 2001.-№2.-С. 38-45.

35. Недосекова, Ю.В: Роль апоптоза в развитии. аутоиммунных; заболеваний щитовидной железы / Ю.В.,Недосекова, О.И. Уразова, Е.Б. Кравец, А.В Чайковский.// Бюллетень сибирской медицины. 20091 - №1. гС. 64-71

36. Петунина, H.A. Диагностика и лечение аутоиммунного тиреоидита / H.A. Петунина // Проблемы эндокринологии.— 2002.— Т. 48. -№6.—С. 16-21.

37. Пол, У. Иммунология / У.Пол // Пер. с англ.: М.: Мир. - 1987-1988.-476 с.

38. Попов JI.C. Генетически- программированная смерть клеток (апоптоз)./ Л.С. Попов, Л.И. Корочкин // Генетика. 2004. - 2. - С. 149-166.

39. Пономаренко, H.A., К вопросу о каталитической активности "аутоантител при рассеянном склерозе / H.A. Пономаренко, О.М. Дурова^ И.И. Воробьев; C.B. Сучков, А.Г. Габибов // ДАН. 2004. - Т. 395, № 6. - С. 839842.

40. Пономаренко, H.A. Каталитическая активность нативных антител ' у мышей с аутоиммунными нарушениями / H.A. Пономаренко, Е.С. • Александрова,- И.И. Воробьев, О.М. Дурова, A.B. Козырь, А.В: Колесников // '• ДАН. 2000. - Т. 375, № 2. - С. 256-259.

41. Ройт, А., Бростофф, Дж. Иммунология- / А. Ройт, Дж. Бростофф // . Пер. с англ.: М.: Мир. - 2000. - 592 С.

42. Рябичева, Т.Г. Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа / Т.Г. Рябичева, H.A. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ю. Рукавишников // Новости «Вектор-Бест». 2004. - №4 (34) -С. 24-29.

43. Сучков, C.B. Сравнительное исследование каталитических (ДНК-гидролизующих) и цитотоксических свойств анти-ДНК аутоантител / .C.B.Сучков // БЭБМ. 2001. - Т. 131, № 5. - С. 560-563.

44. Сучков, С.В. ДНК-абзимы и их клиническое значение при, СКВ' / С.В.Сучков, А.Г.Габибов, З.О.Алекберова, Ы.В. Гнучев //Тер. архив. 2001. -№ Ю.-С. 58-65. , ;

45. Сучков, С.В: Феномен кросс-реактивности ДНК-абзимов и его значение1 для механизмов цитотоксичности-и апоптоза- / С .В ¿Сучков; А.Г. Габибов, Н.В. Гнучев // Онтогенез. 2001. - Т. 32. - № 5. -- С. 348-352.

46. Сучков, С.В. Протабзимы и их будущее в практической медицине ш биотехнологии- / С.В:Сучков, О.М.Дурова, Ф.Ы.Палеев, Т.Е.Наумова, К.Г.Цагурия, М:Г. Байсугуров, А.Н. Хитров, А.Г. Габибов // Медицинская иммунология. 2003; - Т. 5. - № 3-4. - С. 272-273.

47. Царегородцева, ' Т.М. Цитокины в гастроэнтерологии / Царегородцева'Т.М., Серова,Т. И. М1: Анахарсис, -2003; - 50 с.

48. Шилин, .Д.Е. Исследование антитиреоидных: антител и-тиреоглобулина в диагностике .и контроле терапии заболеваний щитовидной железы / Д.Е. Шилин // Проблемы эндокринологии. 1995. - Т.41. - №3. -. С. 17-23. . .

49. Уразова, О .И. Апоптоз нейтрофилов и ммунорегуляторные цитокины при ау гоиммунных тиреопатиях/ О.И.Уразова, Е.Б. Кравец, В .В. Новицкий, В.Н. Кузнецова, А.В. Рогалева' II Клиническая ш экспериментальная тиреоидология. 2007. - ТЗ; - №4.- С.49-53

50. Хараева, З.Ф. Особенности Т№;-индуцированного апоптоза у больных с парентеральными гепатитами.и герпетической инфекцией / З.Ф. Хараева, М.Р. Иванова; А.А. Шевченко // Фундаментальные исследования. -№7. -2011. -С. 152-154.

51. Amino, N. Transient neonatal thyroid dysfunction / N. Amino // Nippon Naibunpi Gakkai Zasshi. 1987. -20;63. - P. 1543-72.

52. Aboyussef, M. The Value of the Anti-nuclear Antibodies / M. Aboyussef// ASJOG. 2004. - №1. - P. 68-71.

53. Aderka, D. Variation in'serum levels of the soluble TNT receptors among healthy individuals / D. Aderka, H. Engelmann, Y. Shemer-Avni, V. Hornik, A. Galil, B. Sarov and D. Wallach // Lymphokine Cytokine Res. 1992. -11 - P. 1-57-159

54. Alarcon-Segovia, D. Antinuclear antibodies: to penetrate or not to penetrate,' that was the question / D. Alarcon-Segovia // Lupus. 2001. - Vol. 10(5).-P. 315-318.

55. Amoura, Z. The role of nucleosomes in lupus / Z. Amoura, S. Koutouzov, J.C. Piette // Curr. Opin. Rheumatol. 2000. - Vol. 12. - № 5. - P. 369-373

56. Amundsen, S. Genetic analysis of the GD28/CTLA4/ICOS (CELIAC3) region in coeliac disease / S. Amundsen, A. Naluai, H. Ascher // Tissue Antigens.- 2004-Vol.64.-P. 593-599

57. Ahmed, S. Association of CTLA-4 but not CD28 gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus in the Japanese population / S. Ahmed, K. lhara, H. Nakashima//Rheumatology. 2001-Vol. 40.-P. 662-667.

58. Ashkenasi, A. Death Receptors: Signaling and Modulation / A. Ashkenasi, V.M. Dixit I I Science 1998. - №281. - P. 1305-1308.

59. Arscott, P. L. Apoptosis and thyroiditis / P. L. Arscott, J. R Jr. Baker // Clin Immunol Immunopathol. 1998. - №87 (3). - P. 207-17.

60. Asghar S.S. Therapeutic inhibition of the complement-system / S.S. Asghar, M.C. Pasch // Front. Biosci. 2000. - Vol.5, № 8. - P. 63-81.

61. Abbas, A.K. Functional diversity of helper T lymphocytes / A.K. Abbas, K.M. Murphy, A. Sher // Nature. 1996.- Vol.383. - P. 787-793.

62. Bazzoni, F The tumor necrosis factor ligand and receptor families / F. Bazzoni, B.N. Beutler // Engl J Med. 1996. — 334. - P. 1717-1725.

63. Biancone, L. Deambrosis I., Camussi G. Lymphocyte costimulatory receptors in renal disease and'transplantation / L. Biancone //J. Nephrol.- 2002-Vol.5.-P.7-16.

64. Bidwell, J: Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases I J. Bidwell, L. Keen, G. Gallagher If Genes and Immunity. 1999. 1. -P. 3-19.

65. Bougacha-Elleuch, N. Analysis of MHC genes in a Tunisian isolatewith autoimmune thyroid diseases: implication of TNF-308 gene polymorphism / N. Bougacha-Elleuch, A. Rebai, M: Mnif// J. Autoimmun. 2004. - Vol. 23.- P. 75-80

66. Bugawan, T.L. Association and interaction of ILR4, IL4 and IL 13 loci with type 1 diabetes among Filipinos / T.L. Bugawan, D.B. Mirel, A.M.Valdes, A. Panelo, P. Pozzilli, H.A.Erlich // Am J Hum Genet. 2003. - Vol.72. - P. 15051514

67. Brix T.H. What is the evidence of genetic factors in the etiology of Graves' Disease / T.H. Brix, K. Kyvic,*L. Hegedus // Thyroid. 1998. - Vol.8. -P.627-634.

68. Baranovsky, A.G., Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis / A.G.

69. Baranovsky, N.A. Ershova, V.N. Buneva, T.G. Kanyshkova, A.S. Mogelnitsky, B.M. Doronin, A.N. Boiko, E.L Gusev, O.O. Favorova, G.A. Nevinsky // Immunol. Lett. 2001. - Vol. 76, N 3. - P. 163-167.

70. Beltinger C.P. Physical mapping and genomic structure of the human TNFR2 gene / C.P. Beltinger, S. John,' WER. Ollier, A. Silman, J. Worthington // Genomics.-1996.-35(1).-P.94-100

71. Bland, J.M. and Altaian, D. Statistics Notes the odds ratio / J.M. Bland, D, Altman // British medical journal. 2000. - № 320(7247). - P. 1468.

72. Bowes, J., Barton, A. Recent advances in the genetics of RA susceptibility / J. Bowes J., A. Barton // Rheumatology. 2008'. - №47. - P.399• 402.

73. Brinkman, B.M. Allele-specific quantification of TNF A transcripts in rheumatoid arthritis / B.M. Brinkman B.M.T.W. Huizinga, F.C. Breedveld, C.L. Verweij // Hum.Genet. 1996. - №. 97. - P. 813-818.

74. Brinkman, B.M., Relevance of the tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) -308 promoter polymorphism in TNF alpha gene regulation / B. M. B.M. Brinkman, D. Zuijdeest, E.L. Kaijzel, F.C. Breedveld, C.L. Verweij // J.Inflamm. -1995.-№.46.-P. 32-41.

75. Brinkman, B.M., Allele-specific quantification of +3953C/T ILlß transcripts in rheumatoid arthritis / B.M. Brinkman, T.W. Huizinga, F.C. Breedveld, C.L. Verweij //Hum.Genet. 1996. - №. 97. - P.813-818.

76. Chen, C.T. Lack of association between interleukin-4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid diseases amongst Taiwanese Chinese./ R.H. Chen, C.T. Chang, T:Y. Wang, C.H. Tsai, F J. Tsai// Proc. Natl.Acad. Sci.-1975.-№72.-P. 3666-3670.

77. Charon, A. PTPN22: Its role in SLE and autoimmunity / A. Charon,

78. A. Chung A., Lindsey Criswell // Autoimmunity. 2007. - №40 (8): - P.582 -590. •.". . ' ',

79. Chung, A., Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease7 A. Chung // Eur. Respir. J. 2001. - Vol. 18 (Suppl. 34). - P. 50-59.

80. Carswell, E.A., An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors / E.A. Carswell, 1,.J. Old, R.L. Kassel, S. Green, N. Fibre and

81. B. Williamson//Proc. Natl.Acad. Sci. 1975. -№72. - P. 3666-3670.90. . Cook, H.T. , Complement; deficiencies, lupus and apoptosis / H.T. Cook // Adv. Nephrol. Neckcr Hosp. 2001. - N 31. - P. 29-41. •

82. Christen, U. Initiation of autoimmunity / U. Christen, M.G von Herrath // Curr. Opin. Immunol. 2004: - V. 16. - P. 759-767.

83. Dighiero, G. Critical self-epitopes are key to the understanding: of selftolerance and autoimmunity / G. Dighiero, N.R. Rose7/ Immunollogy Today. -1999. -V.20 (9). P. 423-428.

84. Drexhage, HA. The spectrum of thyroid autoimmune;. diseases: pathogenetic mechanisms / H.A. Drexhage // Thyroid international. — 1994. №6. -P. 55.

85. Fiers, W., Tumor necrosis factor. Characterization at the molecular, cellular and in vivo level / W. Fiers // FEBS Lett. 1991, - 22; 285(2). - P. 199212. '

86. Giordano, C Potential involvement. of fas and its ligand: in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis / C.Giordano, G. Stassi, R. De Maria // Science:- 1997. Vol. 275. - P. 960-963 ■ ; \

87. Gabibov, A.G. Disease association and cytotoxic effects of DNA-hydrolyzing'autoantibodies / AiG.Gabibov, A.V. Kozyr, A.V.Kolesnikov // Chem Immunol. 2000. - №77.- P. 130-56.

88. Gabibov, A.G. DNA-hydrolyzing autoantibodies / A.G. Gabibov, G.V. Gololobov, O.I. Makarevich, D.V. Schourov, E.A. Chernova, R.P. Yadav // , Appl. Biochem. Biotechnol. - 1994. - Vol.47. - P. 293-302.

89. Ghazeeri, G.S. Autoimmune factors in reproduction failure / G.S. Ghazeeri, W.H. Kutteh // Cur Opin Obstet Gyn. 2001. - 13 (3). - P. 287-291.

90. Gregersen, P.K. Discordance for autoimmunity in monozygoyic twince /P.K. Gregersen // Artliritis Rlieum. • 1993: 36.-P.l 185.-1192

91. Gribben, J G. CTLA4 mediates antigenspecific apoptosis of human T cells / J.G. Gribben, G.JiFreeman, V.A. Boussiotis //Proc.Natl.Acad:Sci. USA. -1995-Vol.92.-P. 811-815

92. Hajilooi, M.M Circulating ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, P-selectin, and TNFRII in patients with coronary artery disease / M.M. Hajilooi; A. Sanati, A.

93. Ahmadieh, A. Ghofraniha, A. Massoud // Immunol Invest. 2004. - 33(3). - 263275.120: Harbo, H. CTLA4 promoter and exon 1 dimorphisms in multiple sclerosis / H. Harbo, E. Celius, F. Vartdal //Tissue Antigens.- 1999-Vol.L-P.1 106110.

94. Heward, J.M. No Association of an Inerleukin 4 gene promoter polymorphism with Graves'Disease in the UK / J.M. Heward, R. Nithiyananthan, A. Allahabadia // J of Clin Endocrinol Metab. 2001. - Vol. 86(8); - P. 38613863.

95. Hunt P.J. Cytokine gene polymorphisms in autoimmune thyroid disease / P.J'. Hunt, S.E. Marshall, A.P. Weetman // J Cli Endocrinol Metab. -2000. Vol.85. -P:l984-1988

96. Hidaka, Y. Increase in peripheral natural killer cell activity in patients with autoimmune thyroid disease / Y. Hidaka, N. Amino, Y. Iwatani, T. Herrera D.R., Avalos D.E., R. Herrera Esparza // Rev. Rheum. Engl. 1997. - Vol.64. - № 2.-P. 82-88.

97. Homann, D. Lack of intrinsic CTLA-4 expression has minimal effect on regulation of antiviral T-cell immunity / D Homann, W. Dummer, T. Wolfe, E.

98. Rodrigo, A.N., Theofilopoulos, MB. Oldstone, M.G. von Herrath // J Virol; — 2006/- 80(1).-P. 270-280.

99. Isenberg, D. Induction of anti-DNA antibodies: commentary on article by Satake ct al. / D. Isenberg, D. Lupus. Katz, P. Maddison. R. Watts, L. Tucker, A. Cooke//-2001.-Vol. 10. -№ l.-P. 63-65.

100. Ishii, T. Neither IL-1 beta, IL-1 receptor antagonist, nor TNF-alpha polymorphisms are associated with susceptibility to COPD / T. Ishii; T. Matsuse,

101. S: Teramoio //Respir. Med: 2000. Vol. 94. -№ 9. P. 847-851. /.• 130; Itoh; N. A novel protein, domain reguired for apoptosis: Mutational analysis of human Fas antigen I N, Itoh, S. Nagata // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268.-P. 10932-10937

102. Jaume; J C. Evidence for genetic transmission of-thyroid peroxidase: autoantibody epitopic "finger-prints" / J.C. Jaumo, J. Guo, D.L. Pauls // J. Clin. Endocrinol Metab. 1999. 84. - P. 1424-1431

103. Karandikar, N.J; CTLA-4 downregulates epitope spreading and: mediates remission in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis / N.J.

104. Kandror, G. Trigger:factor, is.induced:upon;cold;shock;and; enhances viability of Escherichia coli at low temperatures / .0. Kandror, A. L. Goldberg // Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. - №13 - 94(10). - P. 4978-4981.

105. Kouki, T. CTLA-4 gene polymorphism at position 49 in exon 1 reduces the ingibitory function of CTLA-4 and contributes to the pathogenesis of Graves' disease / T. Kouki, Y. Sawai, C. Gardine //J. Immunol- 2000-Vol. 165. -P. 6606-611.

106. Kroeger, K.M. The -308 tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphism effects transcription / K.M. Kroeger , K.S. Carville, L.J. Abraham // Mol.Immunol. 1997. - №. 34. - P. 391-399.

107. Kotsa, K.A. CTLA-4 gene polymorphism is associated with both Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis / K.A. Kotsa, A.P. Weetman // Clin. Endocrinol (Oxf) 1997 - №46 - P. 551-554

108. Kawabe, Y. Eguchi K, Shimomura C, et al. Interleukin-1 production and action in thyroid tissue / Y. Kawabe // J Clin Endocrinol Metab. 1989. -Vol.69.-P. 1174

109. Kelso, A. Cytokines: principles and prospects / A. Kelso // Immunol Cell Biol. 1998. - Vol.76. - P. 300-317

110. Kopf, M. Immune responses of IL-4JL-5, IL-6 deficient mice / M. Kopf, G. Le Gros, A.J. Coyle ed. M. Kosco-Vilbois, F. Brombacher // Immunol Rev. 1995. - Vol.148. - P. 45-69.

111. Kost, E.R. The role of tumor necrosis factor receptors in tumor necrosis factor-a-mediated cytolysis of ovarian cancer cell lines / E.R. Kost, T.J.

112. Herzog, L.M. Adler, S. Williams, D.G. Mutch// Am J Obstet Gynecol. 1996. -174.-P. 145-153.

113. Knudsen, N. Validation of ultrasonography of the thyroid gland for epidemiological purposes / N. Knudsen, B. Bols, I. Buelow // Thyroid. 1999. -Vol. 9 (11).-P. 1069-1074.

114. Kubota, T. Mechanisms of anti-DNA antibody production / T. Kubota // Mod. Rheumatol. 2002. - Vol.12. - P. 300-304.

115. Kuhtreiber, W.M. Central role of defective apoptosis in autoimmunity / W.M. Kuhtreiber, T. Hayashi, E.A. Dale, D.L. Faustman // J Mol Endocrinol. -2003.-31(3).-P. 373-399

116. Kuo, N.W. TNF-857T, a genetic risk marker for acute anterior uveitis / N.W. K,uo, P.A. Lympany, V. Menezo, A.L. Lagan, S. John, T.K. Yeo, S. Liyanage, R.M du Bois., K.I. Welsh, S. Lightman // Invest Ophthalmol Vis Sci. -2005. 46(5). -P. 1565-1571.

117. Ladenson, P.W. American Thyroid' Association Guidelines for Detection of Thyroid Dysfunction / P.W. Ladenson, P.A. Singer, K.B. Ain // Arch Intern Med.-2000.-V. 160.-P. 1573-1575.

118. Leonen, W.A.M. Editorial overview: CD27 and (TNFR) rela- tives in the immune system: their role in health and disease / W.A.M. Leonen // Semin. Immunol. 1998. - 70. - P. 417-422.

119. Lie-Ying Fan Genetic association of cytokines polymorphisms with autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis in the Chinese / Lie-Ying Fan, Xiao-Qing Tu // World J of Gasteroenterology. 2005. - Vol.11(18).- P. 27682772

120. Logtenberg, T. How unique are pathogenic anti-DNA autoantibody V regions? / T. Logtenberg // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6. - P. 921-925.

121. Magistrelli, G.A. Soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells / G.A. Magistrelli, P.

122. Jeannin, N. Herbault, A. Benoit De Coignac, J.F. Gauchat, J.Y. Bonnefoy, Y. Delneste // Eur. J. Immunol. 1999. - №29 (11). - P. 3596-602

123. Marsters, S.A. Identification of a ligand for the death-domain-containing receptor Apo3 / S.A. Marsters, J.P Sheridan., R.M. Pitti, J. Brush, A. Goddard, A. Ashkenazi // Curr Biol. 1998. - 23; 8(9): - P. 525-528.

124. Mariotti, S. Antithyroid peroxidase autoantibody in thyroid disease / S. Mariotti, P. Caturegli, P. Piccolo, G. Barbesino and A. Pinchera// Clin Endocrinol Metab. 1990. - 71. - P. 661-669.

125. McGuire, W<. Severe malarial' anemia and cerebral malaria are associated with different tumor necrosis factor promoter alleles / W. McGuire, J.C. Knight, C.E. Allsopp, B.M. Greenwood, D. Kwiatkowski // J. Infect. Dis. 1999. -№.19.-P. 287-290.

126. Mitsiades, N. Fas ligand is present in tumors of the Ewing's sarcoma family and is cleaved into a-soluble form by a metalloproteinase / N. Mitsiades, V. Poulaki, V. Kotoula, A. Leone, M. Tsokos // AmJ Pathol. 1998. - №153(6). - P. 1947-56.

127. Monestier, M. Autoantibodies to nucleosomes and histone-DNA complex. / M. Monestier // Methods. - 1997. - Vol. 11. - № 1. - P. 36-43.

128. Marshall, E. Cytokine Gene Polymorphisms in Autoimmune Thyroid Disease/ E. Marshall, A.P. Kalinoglou // Arthritis Rheum. 1993. - № 36. - P. 1185-1192

129. Newton, R.C. Therapeutic potential and strategies for inhibiting tumor necrosis factor / RiC. Newton, and C.P. Decicco // J. Med. Chem. 1999. - Vol. 42. -P. 2295-2314.

130. Nagata, S The Fas death factor / S Nagata, P. Golstein // Science. -1995. 10. - 267(5203).-P. 1449-1456.

131. Nathan; G. Catalytic antibody bridges innate and adaptive immunity / C. Nathan, //- Science. -2002.- Vol. 298. № 5601. -P. 2143-2144.

132. Nathan; C. Points; of control; in inflammation / C. Nathan- // Nature. -2002. Vol. 420. - № 6917. - P. 846-852.

133. Ostrov, D.A., Structure of murine CTLA-4 and its role in modulating T cell responsiveness / D.A. Ostrov, W. Shi, J.C. Schwartz, S.C. Almo, S.G. Nathenson// Science. 2000. -27. - 290(5492). - P. 816-819.

134. Park, B.L. Association between in terleukin 6 promoter variants and chronic hepatitis B; progression / B.L. Park, H.S. Lee, Y.J; Kim;// Exp. Mol. Med.— 2003.— Vol. 35:— № 2.— P. 76-82.

135. Paul, S. Natural catal^ic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment / S. Paul, L. Li, R. Kalaga, P. Wilkins

136. Stevens, FJ. Stevens, A. Solomon // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - № 25. -P. 15257-15261.

137. Paul, S. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptideby human autoantibody / S. Paul, DJ. Voile, C.M. Beach, D.R. Johnson, M.J. Powell, R.J. // Massey Science 1989. - Vol. 244. - P. 1158-1162.

138. Pauls, D.L. Complex« Segregation analysis of antibodies to thyroid peroxidase in Old Amish families / D.L. Pauls, M. Zakarija // Am. J. Med. Gen. -1993.-№47.-P. 375-379

139. Pedro, A.B. Association of circulating antibodies against double-stranded and single-stranded DNA with thyroid autoantibodies in Grave's disease and Hashimoto's thyroiditis patients/ A.B. Pedro, J.H. Romaldini, C. Americo, K.

140. Takei.// Exp.Clin Endocrinol Diabet. 2006. -114 (1). - P 35-8. •

141. Peng, S.L. Perforin protects against autoimmunity in lupus-prone* mice: / S.L. Peng, J. Moslehi, M.E. Robert, J/Craft // J. Immunol. 1998. - Vol. 160. -№ 2. -P: 652-660.

142. Pinckard, J.K. Constitutive shedding of both p55 and p75 murine TNF receptors in vivo / J.K. Pinckard, K.C. Sheehan, C.D. Arthur and R.D. Schreiber // J. Immunol. 1997. -158. - P. 3869 - 3873.

143. Pisetsky, D.S." Immune response to DNA in systemic lupus erythematosus / D.S. Pisetsky // Isr. Med. Assoc. J. 2001. Vol. 3. -No. 11.-P. 850853.

144. Pisetsky, D.S. The immunologic properties of DNA / D.S. Pisetsky // J. Immunol. 1996. - Vol.156. -P. 421-431.

145. Pollard, M. Cell death, autoantigen cleavage, and autoimmunity / M. Pollard//Arthritis.Rheum. 2002. - №46. - P. 1699-1702

146. Prokaeva, T. DNA-hydrolyzing autoantibodies in autoimmune pathologies / T. Prokaeva, Alekberova Z., Schurov D., G. Gololobov, A. Gabibov //Lupus. 1995.-Vol.4. - Suppl.2.-P. 162.

147. Purkayastha, S. Multifunctional antigens of A. fumigatus and specific antibodies / S: Purkayastha, T. Madan, A. Shah, H.G. Krishnamurthy, P.U. Sarma // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. - Vol. 83. - № 1-3. - P. 271-283.

148. Raz, E. Cross-reactions of anti-DNA autoantibodies with cell surface proteins / E. Raz, H. Ben-Bassat, T. Davidi, Z. Shlomai, D. Eilat // Eur. J. Immunol. 1993. - Vol. 23. - №2. - P. 383-390.

149. Sakao, S. Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism with low attenuation areas on high-resolution CT in patients with COPD / S. Sakao, K. Tatsumi, H. Igari // Chest. 2002. V. 122. 2.P. 416-420.

150. Salmaso, C. Costimulatory molecules and autoimmune thyroid diseases/ C. Salmaso, D.Olive, G.Pesce, M. Bagnasco// Autoimmunity. 2002. -3*5(3).-P. 159-167

151. Soory, M Hormone mediation of immune responses in the progression of diabetes, rheumatoid arthritis and periodontal diseases / M. Soory // Curr.Drug. Targets Immune Endocr.Metabol. Disord. 2002. - №2. - Vol. 1. - P. 13-25

152. Shuster, A.M., DNA hydrolyzing autoantibodies / A.M Shuster, G.V. Gololobov, O.A. Kvashuk, A.E. Bogomolova, I.V. Smimov, A.G. Gabibov // Science 1992. - Vol. 256. - P. 665-667.

153. Steward; J.J. Theory and treatment of the X-inactivation chimera in female-prevalent autoimmune disease / J.J. Steward // Arch Immunol Ther Exp. 1999.-№47.-P. 399-406 . ^

154. Suppiah, V. Polimorphisms: in IL4 and ;K,-4 receptor genes and multiple sclerosis: a study in Spanish-Basque, Northern Irish and Belgian populations / V. Suppiah, A. Goris, I. Alloza / Int J Immunogenet. 2005. -Vol.32.-P. 383-388 " . - ;

155. Shen, G.Q. Anti-DNA, antihistone, and aritinucleosome antibodies in systemic lupus erythematosus and.drug-induced lupus / G.Q. Shen, Y. Shoenfeld, J.B. Peter // Clin. Rev. Allergy Immunol. 1998. - Vol.16. - № 3. -P. 321-324.

156. Sinohara, H: Does catalytic activity of Bence-Jones proteins contribute to the pathogenesis of multiple myeloma? / H. Sinohara, K. Matsuura // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. - Vol. 83. - № 1-3. - P. 85-92:

157. Spatz, L., Studies on the structure, regulation, and pathogenic potential of anti-dsDNA antibodies Iliev / L.Spatz, A.V., L. Jones, M. Irigoyen, A.Mahheimer Lory //.- Methods. 1997. - Vol. 11. - № 1. - p. 70-78.

158. Suzuki, N. Development of pathogenic anti-DNA antibodies in patients with systemic lupus erythematosus / N Suzuki, S. Mihara, T. Sakane // FASEB J. 1997. - Vol. 11.-P. 1033-1038.

159. Schwartz, J.C., JC Structural basis for co-stimulation by the human CTLA-4/B7-2 complex / J.C. Schwartz, X. Zhang, A.A. Fedorov, S.G. Nathenson, S.C. Almo//Nature. -2001. -29. 410(6828). -P.604-608.

160. Tan, E.M. Pathophysiology of antinuclear antibodies in systemic lupus erythematosus and related diseases / E.M Tan // Adv. Dent. Res. 1996. -Vol.10.-P. 44-46.215. Tait, K. F. The genetics of autoimmune endocrine disease / K. F. Tait,

161. S. C. Gough // Clin Endocrinol (Oxf). 2003. - №59(1). - P.: 1-11.216.' Todd, J.A. Genetic analysis of type 1 diabetes using whole genome approachesV/Proc Nat Acad Sci USA.- 1995-Vol.92.-№19.-P.8560-8565.

162. Tokushige, K. Influence of TNF gene polymorphism and HLADRB1 haplotype in- Japanese patients with chronic liver disease caused by HCV / K. Tokushige, N. Tsuchiya, K. Hasegawa // Am. J. Gastroenterol.— 2003.— Vol. 98.—N1.—P. 160-166.

163. Volpe, R. Autoimmune thyroiditis / G.N. Eds. Burrow, J.H. Oppenheimer, R. Volpe // Philadelphia, W. B. Sounders Company. 1989. - P. 191-207.

164. Wang, X.H: Correlation of IL-4 and 11,-13 gene polymorphisms with asthma and total serium IgE levels / X.H. Wang, Zhao W, S.G. Liu, X.P. Feng // Zhonghua Tie He He Hu Xi Za Zhi. 2009. - Vol.32. -P. 161-164. Chinese.

165. Weetman, A.P. Autoimmune: thyroiditis: predisposition andi pathogenesis / A.P; Weetman // Clin Endocrinol Oxf. 1992. - Vol.3 6(4). - P. 307-323

166. Weetman, AP. Affinity purification of IgG subclasses and the distribution^ of thyroidrantibody reactivity in Hashimoto's thyroiditis; / A.P. Weetman, C.M. Black, S.B. Cohen // Scand J Immunol. 1989/ - Vol.30. - P.73

167. Wilson, A.G. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation / A.G. Wilson, J.A. Symons, T.L. McDowell, H.O. McDevitt, G.W. Duff// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997. -№.94.- P. 3195-3199. ' ".

168. Wikinson, R.W. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a flow cytometry-based assay using fluorophores / R.W. Wikinson, A.E. Lee-MacAiy, D. Davies // J. Immunol. Meth. 2001. Vol. 258. - № .1-2.- P: 183-191.

169. Wilson, A.G. Effects of a polymorphism +3953C/T IL 1(3 promoters on transcriptional activation / A.G. Wilson, J:A. Symons, T.L. McDowell, HiO. McDevitt, G.W. Duff// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997. - № 94. - P: 31953199.

170. Xu, Y. Fc gamma Rs modulate cytotoxicity of anti-Fas antibodies: implications for agonistic antibody-based therapeutics / Y. Xu, A.J. Szalai, T. Zhou // J. Immunol. 2003. Vol. 171. - №.2. - P. 562-568.

171. Yu, L. Humoral autoimmunity / L. Yu, Eisenbarth G.S. //. Adv. Exp. Med. Biol. 2004. - Vol. 552. - P. 247-267.

172. Yong Ho Lee, Association Between Interleukin 1 Polymorphisms and Rheumatoid Arthritis Susceptibility: A Metaanalysis / Yong Ho Lee, Jong Dae JI, and Gwan Gyu Song. // J Rheumatol. 2009. - Vol. 36. - P. 12-15

173. Zhang, W. Isolation of human anti-idiotypes broadly cross reactive with anti-dsDNA antibodies from patients with Systemic lupus erythematosus / W: Zhang, T. Winkler, J.R. Kalden, Reichlin M. // Scand. J. Immunol. - 2001. -Vol.53.-№ 2.-P.192-197.

174. Zhang, D.L. Association of two polymorphisms of tumor necrosis factor gene with acute severe pancreatitis / D.L. Zhang, J.S. Li, Z.W. Jiang, B.J Yu, X.M. Tang // J. Surg. Res. 2003. - Vol. 112. - P. 138-143