Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение спектров аутоантител при инсулинзависимом сахарном диабете и стрептозотоциновом диабете крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение спектров аутоантител при инсулинзависимом сахарном диабете и стрептозотоциновом диабете крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ЭНДОКРИНОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР . (директор - академик РАМН проф. Дедов И.И.)

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНДОКРИНОЛОГИИ (директор - академик РАМН, проф. Акмаев И.Г.)

0 д На правах рукописи

ГОРСКОВА Валентина Александровна

ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРОВ АУТОАНТИТЕЛ ИРИ ИНСУЛИНОЗАВИСИМОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И СГРЕПТОЗОТОЦИНОВОМ ДИАБЕТЕ КРЫС

03.00.04 . биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАМН проф. Ю.А. Панков

Москва 1996

Работа выполнена в Эндокринологическом Научном Центре РЛЫН Директор - академик РАМН, профессор И. И. Ледов

Научный руководитель: академик РАМН, профессор Ю. А. Панков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р. С. Тишенина

доктор биологически* наук, профессор А. А. Булатов

Ведущее учреждение - Московский Государственный Университет

им.. К Е Ломоносова

Защита диссертации состоится "28" июня 1995 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д. 001.13.01 при Эндокринологическом Научном Центре РАМН (117036, Москва, ул. Дм. Ульянова, д. 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЭНЦ РАМН Автореферат разослан "24" мая 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

а Я. Игнатков

- 1 -

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. -Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД) -одна из наиболее распространенных эндокринопатий, сосудистые осложнения которой нередко приводят больных к инвалидности в социально активном периоде их жизни. Сложившаяся в конце 80-х концепция аутоиммунного патогенеза этого заболевания дала основание предполагать, что продромальный период ИЗСД длится от нескольких месяцев до нескольких лет и может быть' обнаружен по наличию маркеров антиостровко-вого аутоиммунитета - анти-В-реактивных Т-лимфоцитов и/или аутоанти-тел (ауАТ). Это создает перспективы доклинической диагностики ИЗСД на основе надежных иммунных маркеров, поиск которых ведется в первую очередь среди ауАТ к антигенам й-клеток. Решение этой задачи осложнено' тем, что популяции ауАТ у больных ИЗСД и лиц группы риска заболевания крайне гетерогенны и могут включать антитела как к тка-неспецифичным, так и к общетканевым аутоантигенам (ауАТ) В-клеток, причем любые из этих антигенов потенциально способны провоцировать развитие 'заболевания. Дополнительные трудноати создает отсутствие адекватных стандартизованных и широкодоступных методов выявления большинства сопутствующих заболеванию типов ауАТ, что не позволяет вести широкие проспективные исследования, объединять и согласованно интерпретировать данные, полученные в разных лабораториях.

Наконец, появляется все больше наблюдений того, что ауАТ,являющиеся, скорее всего, вторичными в патогенезе ИЗСД, оказываются первичными в патогенезе его поздних осложнений* а значит могут служить иммунными маркерами последних.

Таким образом, создание адекватных и доступных методов выявления ауАТ и изучение спектра ауАТ, сопутствующих развитию ИЗСД, во всем его диапазоне является одной из наиболее актуальных проблем теоретической и практической диабетологи...

Дель и задачи исследования. Настоящее исследование преследовало целью изучение диагностического и прогностического значения состава популяций ауАТ, сопутствующих ИЗСД. В задачи исследования входило: 1) создание адекватных методов определения аутоантител на базе имму-ноферментного анализа (ИФА); 2) комплексное обследование состояния гуморального иммунитета у диабетических больных и лиц группы риска ИЗСД и сопоставление его с наблюдаемым у лиц общей популяции и при заболеваниях, неассоциированных с ИЗСД; 3) изучение динамики марке-

ров гуморального аутоиммунитета, сопутствующих развитию диабета, индуцированного у крыс несколькими субдиабстогенными дозами стрептозо-тоцина.

Научная новизна работы Впервые показано, что в сыворотках крови людей всегда присутствуют естественные ауАТ, относящиеся к иммуноглобулинам класса 6, которые специфично взаимодействуют с антигенами микросом и поверхности разных типов клеток, в силу чего различия между позитивными и негативными по соответствующим типам ауАТ сыворотками определяются не по качественному, а по количественному признаку. Предложены универсальный критерий серопозитивности для ИФА ауАТ к антигенам микросом, поверхности клеток и ДНК, а также относительная единица измерения уровня естественных ауАТ в негативных сыворотках. . ( Впервые обнаружена адаптивная реакция гуморального аутоиммунитета на хирургическое вмешательство по поводу раковых опухолей желудочно-кишечного тракта, описана ее динамика и показано, что она может быть использована в качестве своеобразной мэдели для изучения имму-нореактивности и оценки эффективности и адекватности методов выявления естественных ауАТ.

Впервые выявлены половые различия в частотах антиостровковых ауАТ и ауАТ к фибробластам человека и гипофизарным клеткам крысы, а также различия в составах ансамблей ауАТ, у разновозрастных групп больных ИЗСД. Поскольку подобного рода иммунологическая гетерогенность ИЗСД может являться следствием его этиопатогенетической гетерогенности, можно предполагать, что не только ауАТ к антигенам островковых клеток, но и ауАТ к некоторым антигенам фибробластов ц гипофизарных клеток могут относиться к иммунным маркерам этого типа диабета.

Исследованы составы ансамблей ауАТ больных тиреоидитом Хашимото и 2-х разных клинических групп больных НИЗСД, впервые выявлены их характерные особенности.

Изучена динамика маркеров гуморального аутоиммунитета при стреп-тозотоциновом диабете крыс. Впервые показано, что антиостровковые ауАТ могут появляться в циркуляции дважды, причем ауАТ 1-ой генерации, появляющиеся на ранних сроках развития диабета, являются свидетелями уничтожения островковых клеток иммунными, клетками. Антиост'-ровковые ауАТ 2-ой генерации (как и ауАТ к 5 типам клеток других тканей и ДНК) непосредственно с иммунопатологическим процессом, ведущим к развитию стрептозотоцинового диабета, не связаны.

Впервые обнаружено, что в'развитии почечной нефропатии при стреп-тозотоциновом диабете активно участвует гуморальный аутоиммунитет,

причем ауАТ к антигенам базальных мембран нефронов, появляющиеся в циркуляции одновременно с антиостровковыми ауАТ первой генерации, могут служить маркерами начала ее развития.

Научно-практическая ценность работы. На основе разработанного иммуноферментного метода определения антител к микросомам тиреоидной Т1сани человека создан диагностикум, прошедший клинические испытания и разрешенный МЗМП РФ к производству, который несколько лет широко используется в клинической практике здравоохранения России.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на симпозиуме Латвийского научного общества эндокринологов .Рига,1988), на 3-м Всесоюзном съезде эндокринологов (Ташкент,1989), на 4-м Есесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), на 8-ой конференции Эстонского научного общества эндокринологов (Таллин,1990), на 26-м съезде Европейской ассоциации по изучению диабета (Дублин,1991), на 14-м съезде Международной федерации диабетологов (Вашингтон,1991), на 9-м Международном конгрессе по эндокринологии (Ницца,1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами ч 13 рисунками; библиографический указатель включает 336 публикаций, в том числе - 284 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования служили сыворотки крови людей и крыс. При выполнении работы исследовали 774 сыворотки, в том числе: 650 - людей; 124 - крыс.

Стрептозотоциновый диабет моделировали на самцах крыс Вистар массой 180-190 г. Подопытным крысам (группа СТЦ) внутрибрюшинко вводили 4 дня подряд стрептоэотоцин (СТЦ) из расчета 40 мг на 1 кг массы (суммарная доза 160 мг/кг на животное), растворенный в 0,2 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 5,0), содержащего 0,9Z NaCl, и при 1-ой инъекции суспендированный с 50 мкл полного адъюванта Орейнда. Параллельно, ксНгрольным крысам делали 1-у инъекцию суспензии растворителя СТЦ и полного адъюванта Фрейнда (£50 и 50 мкл на животное, соответственно) и 3 инъекции растворителя СТЦ (250 мкл на животное). 'На 8-й, 13-й, 19-й. 35-й и 105-й дни по 6-8 животных иг обеих групп (СТЛ и

контрольной) декапитировали, причем половине из них за 24 часа до декапитации отменяли кормление, а остальным режим питания не меняли. Сыворотки крови собирали индивидуально для каждого животного и хранили до использования при -20 С. Параллельно отделяли поджелудочную железу и почки, и передавали эти ткани для иммуноморфологических и электронномикроскопических исследований на кафедру патологической анатомии 1-го ЛСГФ 1-го ММИ имени И. М. Сеченова.

Используемые в качестве антигенного материала в иммуноферментном анализе микросомальные фракции щитовидной (МФГ) и поджелудочной же-л«з ( МПЖ) человека, а также диафрагмальной (МДМ) и глазной мышц (МГМ) свиньи выделяли из свежезамороженных тканей, а микросомы печени крыс (МПК) из ткани, полученной in situ от интактных животных и перфузированной фосфатно-буфернной смесью - ФБС (0,01 M натрий-фосфатный буфер, содержащий 0,15 M NaCl, рН 7,4). Выделение вели по методу Мариотти (Marlottl et al,1979) в одной из его поздних модификаций (Gardes et al,1986).

Перфузированную ФБС печень крыс использовали также и для выделения ДНК, которое проводили по методу Мармура (Магшг Z. ,1961) в его современной модификации (Романов и др, 1980).

Клетки, используемые в качестве антигенного материала в ИФА, периодически выделяли соответствующими методами перви-шых культур и в виде суспензий живых клеток предоставляли для работы сотрудники лаборатории биологических исследований гормональных соединений ИЗЭиХГ - А. В, Чернушкина (фибробласты и нефроны неонатальных крыс, а также нефроны плодов человека - ФБК, НПК и НПЧ, соответственно), Е В. Садовникова ( островковые клетки неонатальных. крыс - ОКК), В. И. Гудошников ( гипофи-зарные клетки неонатальных крыс - ГКК). Помимо того суспензии первичной культуры клеток печени половозрелых крыс (КПК) предоставляла Т. Г. Вишнякова - сотрудница лаборатории эндокринологии МГУ, первичной культуры фибробластов кожи человека (ФБК), полученной от доноров зрелого возраста - Е. Е. Сафронова, сотрудница лаборатории генной токсикологии МГНЦ РАМН,первичной культуры островковых клеток эмбрионов свиньи (ОКС) - А. В. Тимофеев, сотрудник отдела физиологии клетки НИИБТ МЗРФ. Инсу-линомные клетки крысы - ИНК (перевиваемая культура RIN-5AH-12) были' предоставлены сотрудниками Центрального института диабетологии (ГДР).

Иммобилизовали клетки всех перечисленных типов по Кондратьеву с соавт. (Кондратьев и др,1986), используя ОКК для определения ауАТ к поверхности островковых клеток - АПОК, а ОКС, ИНК, ФБК, ФБЧ, ГКК и КПК - для определения АОКС, АИНК, АФБК, АФБЧ, АГКК И АКПК, соот-

ветственно.

Скрининг сывороток как людей, так и экспериментальных животных, на всех использованных антигенах вели по стандартной схеме (Панков и др. ,1990; Горскова и др. ,1990; Горскова и др. ,1991), обязательно используя среднестатистичесческие негативные пробы - СНП. При скрининге сывороток людей СНП служил пул равных объёмов сывороток 51 донора, при скрининге сывороток крыс - пул 45 сывороток интактных крыс.

Эмпирические частоты отдельных типов аутоантител как и частоты их попарных сочетаний, а также частоты ансамблей ауАТ разной численности во всех случаях представляли в процентах от общего числа обследованных в группе..

Частоты сочетаний аутоантител, ожидаемые при их случайных совпадениях, рассчитывали исходя из теоремы о произведении вероятностей (Гмурман,1977).

Статистическую обработку результатов проводили по Стьюденту (Зайцев, 1973). Коэффициенты корреляции и их достоверность определяли при помощи стандартной компьютерной программы "Statgraph".

При графическом представлении данных использовали пакеты прикладных компьютерных программ "Vorks'V'Microsoft Excel" и "Harwardgraph".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Иммуноферментный анализ А ПО К, АМАТ (ауАТ к антигенам микросом тиреоидной ткани человека) и АДНК.

Определение основных физико-химических условий ИФА. Поскольку характерной чертой ИЗСД является крайне низкий уровень содержания ауАТ в сыворотках больных, то методы их выявления должны обладать максимально высокими чувствительностью и эффективностью, что среди доступных современных методов определения антител в наибольшей степени способен обеспечить ИФА.

Известно, что эффективность ИФА зависит от следующих физико-химических параметров: 1) состава буферов, которые должны обеспечивать крайне низкий уровень неспецифической сорбции иммуноглобулинов (Ig) сывороток и конъюгата на носитель в ходе анализа; 2) способа иммобилизации антигенов на полистирол, который должен обеспечивать отсутствие их неконтролируемой десорбции с носителя и сохранность антигенной активности; 3) сбалансированных соотношений всех основных реагентов на каждом этапе анализа. При этом, все эти основные параметры в

каждом конкретном варианте ИФА должны быть подобраны эмпирически (Пантелев и др,1987). Отсюда при разработке каждого из вариантов ИФА ауАТ было необходимо провести определение оптимальных условий анализа, • т. е. подобрать необходимую систему буферов, определить способ иммобилизации антигенов и найти нужные соотношения между плотностью антигенов на носителе и разведением тестируемых сывороток.

При имитации ИФА на полистироловых планшетах, блогарованных БСА, для сывороток, разведенных в отношении 1:100, было показано, что введение 1% БСА и 0,36 М NaCl в состав буфера разведения, основой которого служила ФБС, параллельно с использованием при откатках от сывороточных Ig и несвязавшихся Ig конъюгата ФБС, содержащей 0,05% Tween--20, обеспечивает крайне низкий уровень неспецифической сорбции Ig на полистирол и блокирующий его БСА в ходе ИФА (Горскова и др. ,1990). Исходя из этого, ту же систему буферов и то же разведение сывороток использовали для проведения ИФА во всех последующих экспериментах.

Способы иммобилизации микросом и ДЩ на полистирол. В результате опробирования нескольких способов иммобилизации на полистирол МФГ, было обнаружено, что при фиксации 0,1% раствором глутарового альдегида в течение 40 мин. при 20 С. микросом, адсорбировавшихся на пластик за 18 часов инкубации при 4 С, удается избежать десорбции этого антигена с носителя в ходе ИФА и обеспечить сохранность его антигенной активносности (Горскова и др,1990), и тем самым избежать основных недостатков ранее предложенных вариантов ИФА АМАТ (Scliardt et al, 1982; Ñamada et al,1985). Исходя из этого, разработанный способ иммобилизации ■ использовали во всех дальнейших экспериментам для иммобилизации всех типов микросом.

Для иммобилизации ДНК впервые применили один из наиболее эффективных из используемых при синтезе аффинных сорбентов способов' ее сшивания с носителями (0стерман,1985), т.е. высушивание раствора ДНК в лунках планшета и последующее облучение их ультрафиолетом через слой 96% этанола. Это было вызвано тем, что в ранее предложенных вариантах ИФА ауАТ к ДНК (АДНК) не удавалось создавать необходимую для высокоэффективного анализа плотность ДНК на полистироле (Smeenk,1986; Грищенко и др,1987), которую примененный способ позволил создать (Рис.1). Позднее было подтверждено (Калачников и др,1992), что этот способ иммобилизации позволяет прочно связать ДНК с любыми полимерными носителями, способными ее, сорбировать, в количествах значительно превышающих сорбционную емкость полимеров, а затем применять такие препараты как для гибридизационного анализа, так и для ИФА АДНК.

Определение оптимальной для ИФА плотности антигенов на полистироле. Как следует из представленных данных (Рис.1), полное насыщение полистирола антигенным материалом не всегда оптимально для анализа Достаточным является такое количество антигена, которое обеспечивает максимальные различия между позитивными и негативными образцами. Так, в ИФА АПОК - это плотность клеток 10-30 тыс на лунку, в ИФА АМАТ -плотность микросом от 0,8 до 5,6 мкг на лунку), что достигается при иммобилизации ШТ из суспензий, содержащих ее в концентрации от 10 до ICO мкг/мл), а в ИФА АДНК - такая конечная плотность ДНК, которая создается при нанесении 24-48 нг ДНК на лунку.

Рисунок 1. Зависимость связывания АПОК (А), АМАТ (В) и АДНК в ИФА от плотности соответствующих антигенов на полистироле.

А В С

По оси ординат - Е492; по оси абсцисс:-А - плотность ОКК. в тысячах на лунку; Б - десятичный логарифм концентрации |№Т (мкг/мл по ¿елку) в исходных суспензиях; С - количество ДИК в кг, нанесенное при иммобилизации на каздую лунку планшета. Нумерация кривых соответствует: Л - I - СНП, 2 - ЛПОК-негатиЕная сыворотка донора, 3 к 4 - -АПОК-пози-тивныо сиворотгл больны:: ИЗСД; В - I - СНП, 2 - АМАТ-негативнал сыворотка больного ДТЗ, 3 и 4 - АМАТ-позитивные сыворотки больных ДТЗ, пунктир - разведение сывороток 1:50; С - 1-3 - АДНК-позитнзные смяо-ротки, 4 и 5 - АДНК-негатиЕнис сыворотки.

При высокой плотности антигенов различия между позитивными и нега-тивнными сыворотками нивелируются, прежде всего, из-за того, что режим роста связывания ауАТ, как известно (Parsons,1981),зависит от их содержания в сыворотке. При невысоком содержании ауАТ, их связывание с возрастающий дозами, антигена в ИФА растет в линейном режиме, при высоком - в области высоких концентраций антигена эта линейность'нарушается в силу существенного снижения роста связывания ауАТ с антигенами. По литературным данным, подобное снижение роста связывания или высокодозовый "hook"-эффект, наблюдается во многих вариантах ИФА (Chambón, Bernard, 1986-, Masseyff, Perrua,1987; Masseyeff, 1989).

Поскольку в каждом из 3-х вариантов ИФА рост связывания Ig негативных сывороток с возрастающими дозами антигенов проходил в линей-ноу режиме, логично предположить, что подобная их активность является не столько следствием неспецифической сорбции Ig, нарастающей по мере увеличения плотности антигенов и, следовательно, сорбционной емкости их поверхности, сколько следствием того, что в этих сыворотках присутствуют ауАТ, специфично взаимодействующие с каждым из трех антигенов. Тем более, что это согласуется с литературными данными о том, что небольшие количества естественных АДНК всегда присутствуют в АДНК-негативных сыворотках людей (Сидорова,1993).

В дальнейшей работе использовали планшеты с плочлостью 00К - 2030 тысяч на лунку, КИТ - 2-3 мкг на лунку (создаваемую при иммобилизации из суспензий, содержащих 50 мкг/мл микросом), ДНК - 36 нг на лунку, являющуюся оптимальной для данных вариантов ИФА независимо от природы связывания иммуноглобулинов негативных сывороток.

Критерий серопозитивности. Как известно, большинство вариантов ИФА ауАТ не имеет общепринятого критерия серопозитивности. Наиболее часто позитивными в ИФА считают те из тестируемых сывороток, Е492 которых превышает сумму ME492+3SD, где МЕ492 является средним-значением Е492 нескольких негативных сывороток, a SD - среднеквадратичным отклонением. Это создает некоторую неопределенность, т. к. до сих пор не существует стандартных негативных сывороток для большинства вариантов ИФА, как не существует и единого представления о . том, какое число (п) негативных сывороток необходимо использовать при тестировании. С другой стороны, хорошо известно, что чем больше п, тем меньше SD, т.к. при n -»-co,SD -»-0, а значит, с увеличением числа негативных сывороток их ME492+3SD будет приближаться к МЕ492. Значит, более определенным должен быть такой критерий серопозитивности, который основан на сравнении Е492 тестируемых сывороток непосредствен-

,но с &Е402.

В одном из вариантов ИФА (Ястребова и др,1987) при представлении данных в качестве наиболее удобного способа математической обработки результатов для многочисленных (п>20) выборок предлагалось пользоваться отношением Е492 тестируемой сыворотки к Е492 постоянной контрольной пробы, которой служил пул сывороток доноров. Казалось целесообразным использовать этот способ и определить соотношение МЕ492+350 и МЕ492 в случае, когда ожидается, что число негативных сывороток будет крайне близким к максимально возможному (45) для одного планшета в нашем варианте ИФА. С этой целью в разных вариантах анализа использовали 45 сывороток доноров и так называемую среднестатистическую негативную пробу'(СНП), полученную путем объединения равных аликвот ' этих же сывороток. • Для каждого варианта ИФА рассчитывали среднее значение Е492 для всех 45 сывороток и отношение к нему или к Е492СНП суммы МЕ492+35а

Таблица 1. Соотношение МЕ492+350 и МЕ492 сывороток доноров при ■ скрининге в ИФА на различных типах мультиантигенов.

Тип антигена: Диапазон варьирования Е492 Среднее значение Е492 (ME492+SD) Е492 среднестатистической пробы (Е492СНП) Отношения:

ME492+3SD ME492+3SD

МЕ492 " Е492СНЛ"

ОКК 0,023-0,159 0,091+0,033 0,096 2,1 2,0

оке 0,042-0,271 0,106+0,037 0,099 2,0 2,2

ИНК 0,023-0,167 0,083+0,032 0,094 2,2 2,0

КПК 0,036-0,234 0,106+0,039 0,112 . 2,1 2,0

гкк 0,032-0,132 0,079+0,032 0,080 2,2 2,2

ФБК 0,038-0,260 0,101+0,044 0,120 2,3 1,9

ФБЧ 0,068-0,272 0,156+0,047 0,148 1,9 2,0

НПЧ 0,052-0,274 0,161+0,050 0,168 1,9 1,9

МФГ 0,100-0,405 0,276+0,088 0,284 1,9 1,9

МПЖ 0,125-0,333 0,205ТО,055 0,171 1,8 2,2

мпк 0,098-0,330 0,196*0,060 0,209 1,9 1,8

МДМ 0,089-0,364 0,187ТО,070 0,184 2,1 2,2

мгм 0,094-0,414 0,286+0,078 0,263 1,8 2,0

' ДНК 0,070-0,430 . 0,184+0,064 0,192 2,0 1,9

В результате (Табл.1) было обнаружено, что во всех случаях инди-

видуальные значения Е492 сывороток доноров варьируют в широком диапазоне, причем широта диапазона варьирования, а также значения МЕ492 и Е492СНП различны в зависимости от типа антигенов, использованных в анализе. Вместе с тем, .для каждого отдельного варианта значения МЕ492 и Е492СНП оказывались крайне близкими, а сумма МЕ492+ЗБ0 превосходила их в среднем в 2 раза. Тогда, если в любом из этих вариантов значение Е492 тестируемой сыворотки окажется превышающим сумму МЕ492+ЗБ0, то

отношение такого значения к ЫЕ492 или Е492СНП обязательно будет близко к 2. Следовательно, в любом из этих вариантов ИФА при скрининге в качестве критерия серопозитивности можно использовать отношение Е492 тестируемой сыворотки к Е492СНП, обозначив его как индекс тестирования (ИТ), и считая, что для позитивных сывороток ИТ >✓ 2,0.

Сопоставление ИФА АПОК и ИФА АМАТ с альтернативными методами определения ауАТ. Сопоставление непрямого иммунофлюоресцентного (НИФ) и ИИФА АПОК было проведено при участии Я. Ю. Кондратьева в 1987 году, в Центарльном институте диабета "Герхард Катч" (ГДР).

При определении АПОК в НИФ использовали суспензии живых инсулин-секретирующих ИНК линии RIN-5AH-T2. Определение вели немецкие коллеги разработанным ими вариантом этого анализа (Zlegler, ot al, 1989).

В скрининге и последуюушлх рескринингах использовали 60 сывороток больных ИЗСД. Те же сыворотки использовали и при параллельных с НИФ определениях АПОК двумя вариантами ИФА - с использованием ОКК и ИНК (ИФА-1 и ИФА-2, соответственно).

Результаты сопоставления анализов оценивали в процентах, исходя из формулы: 100(nl+n2)/n , где nl - число сывороток, негативное в обоих видах анализа (НИФ и ИФА-1 или НИФ и ИФА-2; ИФА-1 и ИФА-2); п2 - число сывороток, позитивных в обоих видах анализа, п - общее число сывороток.

Ito этой оценке совпадение результатов между обоими вариантами ИФА оказалось значительно выше, чем между НИФ и ИФА-1 или ИФА-2 - 851 против 63% или 67%, соответственно. Более высокой была и воспроизводимость результатов в ИФА - 90% и 95% против 85% в НИФ. При этом АПОК-позитивных по данным НИФ было 35%, а по данным ИФА-1 и ИФА-2 -25% и 27% сывороток, соответственно, и эти последние данные крайне близки к приводимым (28%) в более поздней работе (Lander et al,1989).

Расхождения в результатах, более значительные между НИФ и обоими вариантами ИФА, чем между ИФА-1 и ИФА-2, могли быть связаны как с различиями в чувствительности методов, так и в их специфичности. Это могло быть следствием таких физико-химических особенностей анализов, как возможные различия в представлении антигенов поверхности живыми и фиксированными клетками или различия в выявлении ауАТ с низким сродством к антигенам, которое в меньшей степени вероятно в ИФА (Бат-лер и др. ,1988), чем в НИФ, что может быть основной причиной, по которой частота АПОК по данным НИФ выше, чем по данным ИФА.

Вместе с тем, это могло быть следствием гетерогенности популяций АПОК в сыворотках больных ИЗСД, т. к. известно, что антигены инсули-

номных клеток сходны с антигенами нормальных островковых клеток,но не идентичны им (Karounos, Thomas, 1990), и в сыворотках (Зольных ИЗСД могут присутствовать ауАТ, распознающие только один тип клеток С Lander et al,1989; Giant et al,1992), что вероятно является основной причиной расхождения результатов в ИФА-1 и ИФА-2.

Впрочем, любое сравнение двух анализов.более объективно тогда, когда оно опирается на данные третьего, эталонного теста, которым не являются ни этот вариант НИФ, ни этот вариант ИФА, и который, к сожалению, до сих пор не существует. Тем не менее, проведенное сравнение оказалось небесполезным, так как позволило наметить пути дальнейшего совершенствования анализов АПОК.

При оценке эффективности ИФА АМАТ сопоставляли результаты 'независимых тестирований в НИФ и ИФА 167 сывороток, в число которых входили 82 сыворотки больных аутоиммунными тиреопатологиями (АИТП), 34 -эндокринной офтальмопатией (ЭОП), 7 - ИЗСД в сочетании с АИТП, 54 -доноров, здоровых на момент взятия крови.

Тестирование ранее разработанным в ИЗЭиХГ НИФ методом (Александрова и др,1981) было проведено сотрудницей ИЭЗиХГ Е. R Конновой. Скрининг и последующий рескриниг в ИФА были проведены по стандартной схеме, а кроме того 40 АУАТ-позитивных сывороток были раститрованы.

В итоге, в 88,7% случаев данные НИФ совпадали с данными ИФА (Горскова и др. ,1990). Несоответствие результатов анализов наблюдали только за счет большей частоты выявления АМАТ-позитивных сывороток в ИФА - 63,47. против 46,3%; 23,5% против 8,8%; 85,7% против 71,4% в выборках больных АИТП, ЭОП и ИЗСД в сочетании с АИТП, соответственно. При этом только 3 из 20 дополнительно выявляемых в ИФА АМАТ-позитивных сывороток были высокопозитивны по ауАТ к тиреоглобулину (АТГ), в 7 из них уровень АТГ был следовым, в остальных 10 этих аутоантител вовсе не содержалось, а значит, расхождения в результатах анализов не были связаны с выявлением "в ИФА не только АМАТ, но и АТГ, присутствовавших в большинстве (83%) исследованных АМАТ-позитивных сывороток.

С другой стороны, титры АМАТ в ИФА для этих 20 сывороток не превышали 1:1000, тогда как в случайно отобранном таком же количестве сывороток, позитивных по АМАТ и в НИФ и в ИФА, титр АМАТ оказался не ниже 1: 2000. Следовательно, частичное несовпадение данных обоих методов было связано с тем, что ИФА позволяет выявлять АМАТ-низкопозитив-ные сыворотки и, таким образом этот анализ не менее специфичен, но более чувствителен в сравнении с НИФ.

Активность негативных сывороток в различных вариантах ИФА, чувс-

твительность и адекватность этих вариантов анализа ауАТ. Характерной особенностью твердофазного ИФА ауАТ в сыворотках крови является то, что результат анализа представляет собой сушу специфичных и неспецифичных взаимодействий сывороточных Ig с антигенами и носителем. Специфичные взаимодействия определяются наличием соответствующих ауАТ, а неспецифичные - сорбционными свойствами антигенов и носителя, и'в конечном итоге отражают тотальный уровень содержания в сыворотках Ig того класса, к которому относятся анализируемые ауАТ. При этом, по мнению одних авторов, только позитивные сыворотки имеют соответствующие ауАТ, тогда как негативные проявляют в ИФА исключительно неспецифичную или фоновую активность (Халберт, Лин,1988). По мнению других авторов, активность негативных сывороток может быть следствием присутствия в них естественных ауАТ, высокоспецифично взаимодействующих с антигенами, причем в таких случаях результаты ИФА не коррелируют с тотальным уровнем содержания в сыворотках Ig соответствующего класса (Boscato, Stuart,1988).

При разработке каждого из вариантов ИФА были получены данные, заставлявшие предполагать, что в любом из зтих анализов активность негативных сывороток может определятся присутствием соответствующих естественных ауАТ. Проверить эти предположения можно было лишь экспериментально выяснив, зависят ли результаты анализа негативных сывороток в этих вариантах ИФА от того, в каком количестве сыворотки содержат IgG.

В экспериментах использовали 45 сывороток доноров, в каждой из которых определили уровень содержания IgG, а затем провели одновременно и скрининг тех же сывороток в различных вариантах ИФА, и имитацию анализа Результаты, полученные в каждом из вариантов ИФА или при его имитации, сопоставили в корреляционном анализе с данными о содержании в сыворотках IgG.

Как следует из данных корреляционного анализа (Табл.2), с уровнем содержания сывороточных IgG прямо коррелируют только лишь результаты имитации ИФА, отражающие уровень неспецифической сорбции IgG на носитель в ходе анализа. Результаты каждого из вариантов ИФА не зависят от уровня сывороточных IgG, следовательно любой из использованных антигенов не столько сорбирует IgG, сколько специфично взаимодействует с ними. Этот вывод подтверждается также тем, что прямо коррелируют результаты только тех вариантов ИФА, в которых использованы либо относительно видонеспецифичные антигены-гомологи - ОКК, ОКС и ИНК, либо эмбриогенетически близкородственные антигены - МДМ и МГМ. Таким обра-

- 13 -

Таблица 2. Коэффициенты корреляций (г) между содержанием

в сыворотках доноров (п-45) и ИТ, полученными при скрининге этих сывороток с использованием различных антигенов или имитации ИФА.

Анти-гены:

АНТИГЕНЫ:

ИНК

окк

ОКС ФБК

ФБЧ

КПК

НПЧ

ДНК

ЫФГ

МГМ "О"

ИНК ОКК ОКС ФБК ФБЧ КПК НПЧ ДНК

мот мдм

МГМ "О"

1,0 • **

0,80 1.0 А **

0,67 0,85 1,0

0,22 0,20 0,05 1,0

0,39 0,18 0,20 -0,10 1,0

0,19 0,17 0,15 0,10 0,16 1,0

0,38 0,42 0,44 0,13 0,16 0,24 1,0

0,35 0,16 0,08 0,28 0,10 0,39 0,25 1,0

0,02 -0,01 0,05 -0,21 0,25 0,09 0,41 0,01 1,0

0,43 0,33 0,39 0,28 -0,06 0,43 0,28 0,37 0,05 1,0

**

0,22 0,37 0,31 0,33 -0,04 0,22 0,33 0,29 0,15 0,79 1,0 -0,13 0,14 0,18 0,07 -0,12 0,07 0,15 -0,2 0,06 0,09 0,06 1,0

Сод

0,01 0,03 0,02 -0,13 0,08 -0,15 0,01 0,02 0,01 -0,1 0,1 0,68

Примечания: 1) Значение г для любой пары сопоставляемых параметров расположено на пересечении вертикального столбца и горизонтальной строки, обозначающих параметры,, образующие эту пару;

2)"О" - имитация ИФА на планшетах без антигенов;

3) символами * и ** помечены коэффициенты корреляций, достоверность которых (р) <0,05 и <0,01, соответственно.

эом, во всех исследованных вариантах ИФА активность негативнных сывороток не зависит от уровня содержания в них и определяется природой антигенов, а значит в сыворотках присутствуют естественные ауАТ, причем уровень содержания их невысок, индивидуально вариабелен и различен для каждого антигена, что и определяет величину ИТ в любом из анализов, а конечном итоге - уникальность всех этих тестов. Однако это не означает, что уникальность тестов связана с выявлением тех естественных ауАТ, которые взаимодействуют исключительно с тканеспеци-фичными антигенами клеток и микросом. Различия между тестами могут возникать также и из-за того, что общие естественным ауАТ эпитопы с разной плотностью представлены на использованных типф: клеток и микросом, что и определяет уникальность каждого из вариантов ИФА.

, Таким образом, чувствительность данных вариантов ИФА достаточно высока для того, чтобы выявлять тот невысокий уровень естественных ауАТ и его относительно незначительную индивидуальную вариабельность, которые характерны при отсутствии аутоиммунных патологий и наблюдаются в популяции, а значит индекс тестирования может быть использован не только в качестве критерия серопозитивности, но и в качестве относительной единицы измерения уровня содержания этих ауАТ. При этом диапазоны определения достаточно широки ц для выявления высокого уровня ауАТ, т.к. при скрининге значения ИТ потенциально могут варьировать от 0,1 до 20 и лишь десятая часть диапазона (от 0,1 до 2,0) приходится на область негативных определений. Следует особо подчеркнуть, что эта единица измерения пригодна только для негативных сывороток, т. к. только в этом случае зависимость между величиной ИТ и уровнем содержания в сыворотках ауАТ прямо пропорциональна. Поведение в анализе позитивных и, в особенности, высокопозитивных сывороток нередко яьля-«тся аномальным, поскольку связывание ауАТ с иммобилизованными ауАГ может проходить с эффектом Парсона, что приводит к нарушению прямой пропорции между ИТ и уровнем ауАТ. В силу этого оценивать уровень содержания ауАТ в позитивных сыворотках можно лишь используя традиционную относительную единицу - титр.

О высокой чувствительности этих вариантов ИФА говорят также полученные с их применением результаты наблюдений за гуморальной реак-г цией аутоиммунитета, вызываемой хирургическим вмешательством по поводу злокачественных новообразований, локализованных в желудочно-кишечном тракте (Горскова и др. ,1991). Так, при наблюдениях за группой из 12 онкологических больных, хирургические лечение которых не сопровождалось никакими иными иммуномоделирующими воздействиями, было об-

наружно, что гуморальная реакция аутоиммунитета в ответ на хирургическое вмешательство развивалась в 3 стадии (Рис.2), аналогичные тем, которые в 1936 году Галс Селье выделил и определил как типичные для неспецифичных адаптивных реакций, возникающих в ответ на разовое воздействие внешних факторов, т.е. стадии тревоги, резистентности и восстановления.

Рисунок 2. Динамика естественных ауАТ у онкологических больных в послеоперационном периоде

По оси ординат - ИТ; по оси абсцисс - дни обследования (0 - предоперационный, 1-21 послеоперационный периоды). Нумерация кривых соответствует данным, полученным при тестировании на антигенах: 1 - ДНК; 2 - ФБК; 3 - МПК; 4 - ШГ; 5 - ОНК; 6 - МПЖ; 7 - КПК; 8 - ГКК.

Стадия тревоги следовала непосредственно вслед за хирургическим вмешательством и длилась с 1 по 3 сутки послеоперационного периода лечения. Она характеризовалась отчетливой тенденцией к снижению уровня ауАТ, которое было достоверным в ИФА, проведенных с использованием в качестве антигенов ДНК, ОКК и ФБЧ (р<0,05 во всех трех случаях).

Стадия резистентности достигалась к 7-му дню, когда уровень естественных ауАТ по данным разных тестов повышался в 1,5-2,5 раза по отношению к предоперационному, причем повышение было достоверным во всех тестах (р<0,01 при тестировании с использованием в качестве антигенов ДНК или ОКК, ФЁЧ, КПК, ГКК и р<0,05 при использовании МПЖ или

МПК и МОТ). Длительность этой стадии составляла не менее 7-ми суток, поскольку наблюдаемое в отдельных тестах на 14-й послеоперационный день некоторое снижение уровня естественных ауАТ не было достоверным.

• Достоверное снижение уровня естественных ауЛТ, означавшее переход гуморальной реакции аутоиммунитета на стадию восстановления, было отмечено в каждом из тестов на 21 день послеоперационного периода лечения больных.

Следовательно, на хирургическое вмешательство гуморальный ауто-иммунитет отвечает неспецифичной адаптивной реакцией, которая явно не направлена против какой-то одной мишени, т.к. не имеется достоверных различий между данными разных тестов на каждый день наблюдения. Судя по тому, что послеоперационный период у больных протекал без осложнений и по окончанию курса лечения состояние здоровья было признано удовлетворительным, эта реакция является необходимой составляющей раневого иммунитета.

Таким образом, каждый из тестов способен адекватно отражать перепады уровня естественных ауАТ в пределах физиологической нормы реакции гуморального аутоиммунитета в ответ на иммуновозмущающие воздействия. Учитывая, что одной из вероятных причин развития ИЗСД пред-полагется такое нарушение нормы этой реакции, как невозможность достижения стадии восстановления (Cohen, Young, 1991), а эффективность и разрешающая способность любого из вариантов ИФА достаточны для того, чтобы'обнаружить подобное нарушение, можно заключить, что применение этих методов анализа ауАТ при изучении маркеров гуморального иммунитета-, сопутствующих развитию ИЗСД, вполне допустимо.

II. Спектры маркеров гуморального аутоиммунитета при сахарном диабете.

Частоты ауАТ в спектрах. При определении частот ауАТ использовали сыворотки двух разновозрастных групп больных ИЗСД. В группу 1-Д1 были включены больные, у которых ИЗСД манифестировал в возрасте, не превышающем 15 лет, в группу 2-Д1 - в возрасте от 16 лет и старше. Длительность клинического периода заболевания у больных обеих групп на момент исследования варьировала от 2 недель до 6 месяцев, но в среднем между группами достоверных различий не имела (Табл. 3). Инсулино-терапии подвергались все больные обеих групп.

Напротив, ни один из больных НИЗСД как в группе 1-Д2, так и в группе 2-Д2, не подвергался инсулинотералии на момент исследования.

Однако, некоторое время спустя инсулинотерапия была применена ко всем больным группы 2-Д2, поскольку по данным клинического обследования вторичная неэффективность сахаропонижающих пероральных препаратов у всех больных группы была следствием прогрессирующего снижения функциональной активности инсулярного аппарата. В силу этого группы больных НИЗСД рассматривались как две различные по степени риска ИЗСД группы, т. к. для больных группы 1-Д2 она оставлась неопределенной, тогда как для больных группы 2-Д2 составила 100%.

Иную группу риска ИЗСД представляли больные тиреоидитсм Хашимото (группа ТХ) - одного из заболеваний, которое нередко совместно с ИЗСД встречается в. составе аутоиммунных полиэндокринных синдромов.

Группы ПДВ (популяция детского возраста), ПЗВ (популяция зрелого возраста) и ОБ (онкологические больные) рассматривали как разновозрастные контрольные группы, т. к. ни один из входивших в группу ОБ больных не имел ни одного из известных аутоиммунных заболеваний, при том, что средний возраст больных этой группы был аналогичен таковому группы 1-Д2 (Табл.3).

Как следует из представленных данных (Табл. 4), за исключением АМАТ при ИЗСД наблюдались более высокие частоты большинства типов ауАТ, чем при ТХ, что не расходится с представлением об этом типе диабета как об аутоиммунной патологоии, характеризующейся высокой гетерогенностью маркеров гуморального аутоиммунита. Однако, если при ТХ абсолютно преобладающим типом ауАТ явились АМАТ - антитиреодные ауто-антитела, играющие одну из ведущих ролей в патогенезе этого заболевания, то при ИЗСД большинство больных обеих групп не имело таких анти-островковых ауАТ как АПОК, АИНК или АОКС, при том, что частоты их выявления достоверно не отличались от частот выявления ауАТ к поверхности большинства клеток других тканей и к ДНК Это может указывать на то, что на клинической стадии ИЗСД преобладающими в популяциях ауАТ к поверхности отровковых клеток являются ауАТ-свидетели, но не участники патологического процесса, уровень которых снижается вслед за исчезновением островковых клеток.

Однако не только длительность клинического периода ИЗСД может определять частоты выявления маркеров гуморального аутоиммунитета. Известно, что они могут значительно варьировать в зависимости от возраста больных на момент манифестации заболевания, их пола, расы и, чувствительности методов, исследования (МеиГе1с1,еЬ а1,1980;Сепшап, 1991; Пагз!1,е1 а1,1991).

Данные о частотах АИНК и АМАТ, полученные в нашем исследовании

Таблица 3. Общие характеристики групп обследованных лиц.

Группа Число, обе л. СП) Диагноз Возраст (М+т) лет Пол М/ 'ж Длительность заболевания (Ммп)

ПДВ 60 здоровы 9,3+0,5 1.8 -

ПЗВ 45 здоровы НД** нд -

1-Д1 56 ИЗСД 10,9+1,7 1.3 2,7+0,4 мес.

2-Д1 46 ИЗСД 28,2+1,4 0,8 2,9+0,5 мес.

1-Д2 67 НИЗСД 57,4+1,6 0,7 7,3+0,8 лет

2-Д2 30 НИЗСД, ВНСПП* 59,5+1,2 0,7 9,8+1,2 лет

ОБ ТХ 50 41 раковые опухоли жкт# тиреои-дит Ха-шимото 57,4+1,3 40,6+2,1 1.4 0 41 впервые обнаруженные 2,6+0,4 мес.

Характеристики и сыворотки предоставили:

Овчинников' В. А. МООД***Балашиха Кондратьев Я Ю. дагпК****Мэсква Щербачева Л. Н. , ИЗЭиХГ, Москва Смирнова О. М., ИЗЭиХГ, Москва

Гус М.И.

ЭРЭД*****,Тарту

Овчинников К А. МООД, Балашиха

Тесля а А. Краевой эндокринный дисп. Ставрополь

* Вторичная неэффективность сахаропонижающих пероральных препаратов, ** нет данных, **■* Московский областной онкологический диспансер, **** Центральный институт гемат логии и переливания крови,*****Эстонский республиканский эндокринный диспансер.

# Желудочно-кишечный тракт.

Таблица 4. Частоты (X) аутоантитед в поЯуляции, при сахарном диабете и некоторых других заболеваниях.

АУТ 0 А н т И Т Е Л А : Тота-

Группа АИНК АПОК АОКС АФБК АФБЧ АКПК АНПЧ АДНК АМАТ АГКК льно:

ПДВ 4,0 6,0 4.0 8.0 6,0 4,0 8,0 6,0 4,0 12,0 26,0

ПЗВ 4,4 8,9 6,7 8,9 6,7 2,2 6,7 2,2 2,2 И.1 28,9

1-Д1 32,1 39,3 33,9 19,6 23,2 25,0 19,6 25,0 23,2 33,9 71,4

2-Д1 26,1 32,6 34,7 19,6 32,6 28,3 26,1 39,1 21,7 43,6 76,1

1-Д2 не 16,4 22,4 9,0 19,4 7.5 16,4 25,4 20,9 35,8 70,1

иссл

2-Д2 не 26,7 36,7 35,3 33,3 10,0 46,7 30,0 13,3 40,0 76,7

иссл

ОБ 6,0 6,0 не не 12,0 6,0 не 12,0 6,0 14,0 36,0

иссл иссл иссл

ТХ 17,1 14,6 14,6 12,2 24,4 12,2 29,3 12,2 68,3 не 78,0

иссл

Таблица 5. Достоверность различий (р) между частотами аутоантител у больных ИЗСД, НИЗСД и в популяции.

Ауто- Достоверность различий (р) между частотами ауАТ для групп:

анти-

тела: ПДВ и ПЗВ И 1-Д1 и ПЗВ и ПЗВ и 1-Д2 и 2-Д1 и 2-Д1 И

1-Д1 2-Д1 2-Д1 1-Д2 2-Д2 2-Д2 Ч-Д2 2-Д2

АИНК <0,001 <0,001 >0,05 н 1 и с след о в а н Н 0

АПОК <0,001 <0,01 >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05

АОКС <0,001 <0,001 >0,05 <0,01 <0,01 >0,05 >0,05 >0,05

АФБК >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,01 <0,01 >0,05 >0,05

АФБЧ <0,01 <0,001 >0,05 <0,05 <0,01 >0,05 >0,05 >0,05

АКПК <0,001 <0,001 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,01 <0,05

АНПЧ <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,001 <0,01 >0,05 <0,05

АДПК <0,01 <0,001 >0,05 <0,001 <0,01 >0,05 >0,05 >0,05

АМАТ <0,01 <0,01 >0,05 <0,001 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05

АГКК <0,01 <0,001 >0,05 <0,001 <0,05 .>0,05 >0,05 >0,05

* Достоверных различий не обнаружено - р >0,05.

Таблица 6. Распределение частот (X) аутоантител у больных сахарным диабетом в зависимости от пола обследованных.

Г р у п п ы обе ледов а н н ы х :

ПДВ 1-Д1 2-Д1 1-Д2 2-Д2

Пол Число жен. 18 ^ жен. 24 т жен. 25 жен. 40 муж. 12 жен. 18

АИНК 0 11,1 34,4 29,2 19,0 32,0 не исслед. не исслед.

АПОК 3,1 11.1 43,8 33,3 42,9 24.0 18,5 15,0 25,5 27,8

АОКС 0 11,1 34,3 29,2 57,1 16,0 25,9 20,0 33,3 38,9

АФБК АФБЧ 3,1 0 16," а 16,7 21,9 28,1 16,7 8,3 19,0 а 42,9 20,0 24,0 14,8 18,5 5,0 20,0 25,0 16,7 38,9 а 50,0

АКПК 3,1 5,6 31,3 16,7 28,6 28,0 3,7 10,0 8,3 11.1

АНПЧ 3,1 16,7 25,0 37,5 33,3 20,0 18,5 15,0 50,0 44,4

АДНК АМАТ 3,1 0 11,1 11,1 28,1 21,9 20,8 25,0 42,9 23,8 36,0 20,0 33,3 7,4 20,0 *а 30,0 16,7 0 38,9 ** 27,8

АГКК 9,4 16,7 40,1 25,0 57,1 32,0 33,3 40,0 33,3 44,4

Примечание: Символами * помечены частоты, различия между которыми у ...ужчин и женщин в группе достоверны (* или ** -р<0,05 или <0,01, соответственно).

(Табл. 4) не расходятся с доложенными ранее относительно кавкаэоидов Европы, больных ИЗСД (Neufeld et al,1980; Kokkonen et al,1982;Salardi et al,1984; Ramachandran et al,1985; Mandrup-Poulsen, 1988; Lander et al,1989; Abdullah et al,1990; бгоор et al.1391). Помимо того, представленные данные о частотах АМАТ в популяции зрелого возраста, при НИЗСД и тиреоидите Хашимото также не расходятся с приводимыми в литературе для подобных групп кавкаэоидов Европы (Dawkins,1985; Mercier, Rocheman,1989; Groop et al,1991), что является очередным свидетельством в пользу адекватности примененных методов исследования ауАТ.

Однако сопоставить полученные данные с литературными по всему спектру ауАТ для каждой из групп обследованных оказалось невозможным, т. к. широкие исследования подобного рода ранее не проводились. Между тем у больных ИЗСД обеих возрастных групп частоты 9-ти из 10-ти исследованных маркеров (за исключением АФБК) оказались достоверно более высокими, чем в популяции, при том, что по частоте любого из остальных 9-ти маркеров эти группы достоверных различий между собой не имели ( Табл. 5), а частоты АДНК и АГКК были не ниже частот маркеров анти-островкого гуморального аутоиммунитета - АИНК, АПОК или АОКС (Табл. 4).

Не менее разнообразным оказался спектр ауАТ и у больных обеих групп НИЗСД, единственным общим отличием его от такового больных ИЗСД явилась лишь достоверно более низкая частота ауАТ к клеткам печени крыс. Основным отличием репертуаров ауАТ группы больных НИЗСД с вторичной неэффективностью сахаропонижающих пероральных препаратов от репертуаров всех остальных групп обследованных явились достоверно более высокие частоты ауАТ к нефронам плодов человека и ауАТ к фиброб-ластам крыс.

Однако более значительные межгрупповые различия были выявлены при анализе распределения частот ауАТ в зависимости от пола обследованных (Табл. 5). Так, если в популяции детского возраста частоты всех типов ауАТ были повышены у девочек, причем в случае АФБЧ это повышение было достоверным, то у больных ИЗСД детей такая тенденция наблюдалась только в случаях АМАТ и АИНК, частоты же всех других типов ауАТ были повышены у мальчиков. У больных ИЗСД зрелого возраста также отмечалась явная тенденция к повышению частоты АМАТ у женщин, а всех остальных типов ауАТ - у мужчин. При этом маркеры антиостровкового аутоиммунитета АПОК и АИНК, а кроме того ауАТ к фибробластам человека и гипофизарным клеткам крыс у больных ИЗСД мужчин встречались достоверно чаще, чем у женщин.

У больных НИЗСД группы 1-Д2, за исключением АМАТ остальные типы

ауЛТ встречались у мужчин и женщин с относительно равными частотами. Частота АМАТ была достоверно выше у женщин этой группы, как 'и у женщин группы 2-Д2. Помимо того, женщины группы 2-Д2 больных НИЗСД имели достоверно более высокую, чем у мужчин, частоту АФБЧ, причем и частоты остальных типов ауАТ у них явно были повышены.

В итоге общность между группами в этом анализе обнаружилась только в том, что женщины каждой группы имели более высокую частоту АМАТ, чем мужчины. Такой результат кажется вполне закономерным, поскольку АМАТ являются иммунным маркером аутоиммунных тиреопатологий, а эти заболевания в среднем в 7 раз чаще встречаются у женщин, чем у мужчин (Dawkins,1985).

Неожиданным кажется то, что при ИЗСД наблюдалось повышение частот большинства типов ауАТ у лиц мужского пола, причем достоверное в случае 2-х из 3-х маркеров антиостровкового гуморального аутоиммунитета в группе больных зрелого возраста, но не столь явное у детей. Неожиданным потому, что, как известно, к аутоиммунным заболеваниям более склонны женщины, чем мужчины (Denman,1991). Предполагается, что это связано с тем, что и иммунореактивность в норме (Schaurts et al,1991), и интенсивность иммунного ответа на ауАГ-мишени наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний (Ahmed et al, 1989) у женшин выше,- чем у мужчин, что в значительной степени определяется участием половых гормонов в регуляции ряда иммунных процессов (Rorles, Speisbergr, 1989; Demaine.1989; Furukava et al,1988). Однако, взаимоотношения между эстрогенами и иммунной системой в целом неоднозначны и могут вести не только к усилению, но и к подавлению некоторых иммунных ответов (Grossman, 1988).

С другой стороны, ИЗСД отличается от большинства аутоиммунных заболеваний тем, что в равной мере поражает и мужчин и женщин (Давиден-кова, Либерман, 1988). Однако, по недавним данным, полученным в итоге пятилетних наблюдений за заболеваемостью ИЗСД среди 951455 жителей Италии, среди приобретших заболевание в возрасте до 15 лет соотношение полов (ы:ж) составило 1:1,тогда как среди приобретших ИЗСД в зрелом возрасте - 1,8:1, причем это различие между возрастными группами было в высшей степени достоверно. По мнению авторов, эстрогены и анд-рогены либо в разной степени способны участвовать в патогенезе ИЗСД, либо играю? различные роли в зависимости от его этиологии, что может указывать на этиопатогенетическую гетерогенность этого типа диабета (Bruno et al. ,19П).

Интересно, что при исследовании экспериментального диабета мышей,

индуцированного ЁМС-вирусом, было показано, ч-'о самцы менее устойчивы к его диабетогенному действию, чем самки. При этом у 40% приобретших _ диабет самцов обнаруживались такие признаки участия иммунной системы в разрушении островковых клеток, как инсулиты или маркеры клеточного и гуморального антиостровкового аутоиммунитета, тогда как у приобретших диабет самок иммунная система, как правило, оставалась невовле-ченной в патогенез моделируемого заболевания. Однако у грызунов, моделирующих наследственный диабет - N0D-мышей и ВВ-крыс, среди приобретших заболевание животных преобладают самки, а не самцы (80-60% и 20-40%, соответственно), причем кастрация самцов - диабетогенна, тогда как кастрация са' ж - протективна (Rossini et al, 1984). Таким образом, роль половых гормонов в вовлечении иммунной системы в патогенез экспериментального диабета грызунов определенно связана с его этиологией, что дает основанния предполагать наличие аналогичной связи между ролью половых гормонов и этиологией ИЗСД.

Не исключено, что обнаруженные з данном исследовании половые различия в степени вовлеченности иммуной системы в патогенез ИЗСД в разновозрастных группах диабетических больных также могут свидетельствовать о его этиопатогенетической гетерогенности.

Распространенность ансамблей ауДТ и их состав при сахарном диабете. Ансамбли ауАТ или серопозитивность по нескольким типам ауАТ одновременно - нередкое явление у больных сахарным диабетом и тиреоди-дитом Хашимото, но не среди лиц общей популяции как детского, так и зрелого возраста (Рис.3). В популяции явно преобладают носители какого-либо одного типа ауАТ, общее число которых может достигать 20-30'"., с учетом того, что малочисленные ансамбли, т. е. состоящие из 2-3 типов ауАТ, представлены в основном ауАТ к антигенам-гомологам, таким как различные типы островковых клеток или фибробластов, и те же типы ' ауАТ обязательно еходят в состав выявляемых довольно .редко многочисленных ансамблей, состоящих из 4-9 типов ауАТ (Рис.4).

Среди больных ТХ преобладали носители малочисленных ансамблей . ауАТ, причем по составу ансамбли принципиально отличались от тех, что были обнаружены у лиц общей популяции, прежде всего тем, что обязательно включали АМАТ, а из других типов ауАТ - либо ауАТ к нефронам и/или фибробластам (10 из 15 случаев), либо ауАТ к тем или иным типам островковых клеток (5 из 15 случаев). В редких случаях состав малочисленных ансамблей дополняли ауАТ к гепатоцитам, другие же из исследованных типов ауАТ в составе таких ансамблей не встречались (Рис.4).

к

Рисунок 3. Частоты (X) ассамблей аутоантитвд в популяции, при тиреоидите Хашмото и при сахарном диабете.

40 35

зо

25 20 15 10 5 О

ПДП П38 ТХ 1-Д1 2Д1 1-Д2 Пи оси ординат - проценты, по оси абсцисс -Нумерация маркировки столбиков соответствует: 1 пов ауАТ, 2 - ансамбли Из 2-3 типов ауАТ, 3 - отдельные ауАТ.

2-Д2

группы' обследованных. - ансамбли из 4-10 ти-

Рисунок 4. Схемы составов ансамблей аутоантител.

Группа ПДВ • 0 0 Tgynna 1-Д1 Группа 2-Д1 ООО 0 Группа 1-Д2 - 0 0 Группа г-)Щ -ООО

00 ■ 00 0 0 ООО 0 - 00 0 -00 0 0

000000 ООО • 0 0 00 ООО 0 0 ■ -ООО 0 -00 ООО

000000 ООО 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1, ООО 0 ООО со ■ -00 00 0 -00 0 00

0000 0 0 • 0 0 0 00 -00 0 00 ■ -00 00 ООО

12345678910 ■ 00000 ООО ■ ООО 00 00 -0 0 00 00 • -00000 0 0

ООО 00 00 ■ ООО ООО 00 ■ -ООО 00 00 ■ - 0 00 0 0

Группа ПЗВ ■ ООО 00 ООО ■ ООО 000000 • -00 0 00 ■ -00000 0

00 ■ ООО 000000 00 0 0000 • -00 00 00 • - ООО 0 0

00 ■ 000000000 оооооооо - 0 00 00 -ООО 0000

00 000000000 0 0 ООО -00 0 ООО -00 0 0

00 0 0 0000 • ООО 00000 • -00 00 0 0 • - 0 0

■ 00 00 • 0000 ООО 0 00 0 0 -0 0 0 0 0 ■ - 0 00

• ООО 00 0 0 ■ООО ООО 0 00 0 0 0 •- 0 0 00 0 00

—1 L.l II II 1 1 1. • 00 ООО • ООО 0 0 -00 0 ООО

12345678910 • 00 00 00 0 0 - 00 0 ■ - 0 00

• 00 0 ■ 0 0 ■ 7 0 0 - 00 0

Tgynna ТХ • 00 • 0 0 ■ 0 0 ■ - 0 0 - 0 0

• 0 0 0 ■ 00 0 0 - 0 0 - 0 ' 0

■ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

■ 00 0 0 0 0 00 0 0 12345678910

■ ООО ■ 0 0 0 0 ООО 0 00

• 00 0 0 0 ООО 0 - 0 00

■ 00000 00 0 0 0- 0 0

• 00000 00 0 0 0 00 ■ - 0 00

• 0000000 0 00 0000 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

■ 000000 00 00 0 00 12345678910

■ 000000 0 0 0 0 0

• 0 00 00 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

ООО 0 0 12345678910 •

ООО 0 0

О О о о О О О

о

00 о о о о о

1 I I I I 1 I I I

123456739

_ixii i i i i i i

12345678910

По оси ординат - каждому делению шкалы соответствует состав ансамбля одной сыворотки, по оси абсцисс -аутоантитела: 1 - АИНК, 2 - АПОК, 3 - АОКС, 4 - АМАТ, 5 - АФБК, б - АФВЧ, 7 - АКПК, 8 - АНПЧ, 9 - АДНК, 10 -АГКК. Символ "О" указывает аутоантитела, входящие в состав ансамбля, символ "-" означает отсутствие данных.

Столь четкое разделение составов малочисленных ансамблей на 2 подгруппы не может быть чисто случайным и, скорее всего, указывает на определенную "сцепленность" гуморальных иммунньг; аномалий,которая может лежать в основе развития нередко отягчающих ТХ сердечно-сосудистых и почечных патологий с одной стороны, и транзиторных гипергликемий с другой. Однако для определения степени надежности подобного способа прогнозирования осложнений ТХ необходимы проспективные исследования.

Состав многочисленных ансамблей ауАТ у больных ТХ также был относительно упорядочен. Наряду с АМАТ в составах 4 из. 5 таких ансамблей обязательно присутствовали АИНК, АПОК, АФБК и АДНК. Не исключено, что это особая подгрупп? больных ТХ, наиболее, чем другие, предрасположенных к развитию аутоиммунных синдромов, одним из компонентов которых может являться ИЗСД.

Группы больных сахарным диабетом по частотам выявления ансамблей ауАТ и их составу значительно отличались не только от групп популяции или больных ТХ, но и друг от друга Так, среди больных ИЗСД обеих групп и больных НИЗСД группы 2-Д2 явно преобладали носители ансамблей, но не отдельных типов ауАТ, как это наблюдалось среди больных НИЗСД группы 1-Д2 (Рис.3). Вместе с тем, среди больных'ИЗСД зрелого возраста преобладали носители многочисленных ансамблей ауАТ, частота выявления которых была несколько выше, чем среди больных ИЗСД детского возраста.

Независимо от численности, состав ансамблей'ауАТ у больных сахарным диабетом был значительно вариабельнее и хаотичнее, чем у больных ТХ (Рис. 4), причем ни один из исследованных типов ауАТ не являлся обязательно присутствующим в составе ансамблей. Как правило, чем чаче встречались те или иные ауАТ у диабетических больных любой из четырех групп, тем чаще такие ауАТ обнаруживались в составах ансамблей. Исключением из этого правила явилась только группа 2-Д1, где в составе ансамблей ауАТ наиболее часто встречались- АДНК (18 из 28 случаев), тогда как преобладающим типом ауАТ в группе являлись АГКК (Табл. 4). Вместе с тем, остальные типы ауАТ в этой группе, как и в трех остальных, в составах ансамблей обнаруживались пропорционально тотальной частоте их выявления, а это могло указывать на то, что при сахарном диабете состав ансамблей ауАТ определяется чисто индивидуально и не несет той информации, которая могла бы характеризовать определенную группу больных ИЗСД или НИЗСД.

Не исключено, что этот "иммунный хаос" возникает в ответ на некоторую дисгармонию регуляции углеводного обмена,, которая, как хорошо

известно, наблюдается :три сахарном диабете обоих типов в силу того, что терапия, применяемая как при ИЗСД, так и при НИЗСД, способна компенсировать дефицит инсулина, но не способна полностью восстановить

с

гармоничность естественной регуляции углеводного обмена, что может отражаться на состоянии гуморального аутоиммунитета у диабетических больных. Во всяком случае, это показывает, что взаимоотношения между обменно-эндокринным и иммунным компонентами патологии при сахарном диабете сложны, и состояние гуморального аутоиммунитета у больных является итоговой результирующей этих сложных взаимоотношений.

Тем не менее, соответствующий статистический анализ показал, что некоторые пары ауЛТ встречаются в составе ансамблей достоверно чаще, чем при возможных случайных их совпадениях (р<0,05 во всех случаях), причем и сами такие пары и их количество обнаруживали определенные межгрупповые различия как больных ИЗСД, так и больных НИЗСД. Так, в группе 1-Д1 было обнаружено пять подобных пар: АПОК+АИНК, АПОК+АОКС, АОКС+АФБЧ, АОКС+АНПЧ, АФБЧ+АНПЧ, тогда как в группе 2-Д1 - только две: АПОК+АОКС и АОКС+АДНК. В группе 1-Д2 больных НИЗСД к таким парам относились АПОК+АОКС, АПОК+АФБЧ, АПОК+АГКК, АОКС+АГКК, АФБЧ+АГКК, а в группе 2-Д2 они не встречались.

Степень достоверности полученных данных повышает также то,, что в популяции детского или зрелого возраста, а также у онкологических больных эмпирические частоты любых попарных сочетаний ауАТ не имели достоверных отличий от частот, ожидаемых при их случайных совпадениях. Практически токе самое наблюдалось и у больных ТХ, .поскольку не была случайно совпадающей только одна пара антиостровковых ауАТ -ЛИНК+АГКЖ.

Очевидно, что нередко обнаруживаемая "сцепленность" антиостровковых ауАТ означает, что эти ауАТ взаимодействуют с неким общим для разных типов островковых клеток антигеном. Это позволяет предположить, что, популяции ауАТ больных ИЗСД детского возраста могут состоять преимущественно из полиреактивных' ауАТ, которые способны взаимо1 действовать как с антигенами разных типов островковых клеток,так и с антигенами нефронов и фибробластов. При этом подобная полиреактивность ауАТ, свойственна только этой группе диабетических больных, т. к. если у 'больных ИЗСД зрелого возраста или больных НИЗСД группы 1-Д2 и имеются полиреактнвные ауЛТ, то они взаимодействуют с несколько иными антигенными эпитопами или даже антигенами остовковых клеток, т. к. их дополнительными кижнями являются ДНК и антигены гипофизарных клеток, соответственно. Очевидно, что ¡1 это предположение может быть подт-

верждено только путем идентификации соответствующих антигенов островковых и гипофизарных клеток, а также нефронов и фибробластов, потому, прогнозировать развитие инсулиновой зависимости у больных НИЗСД на основании АПОК-, АОКС- или АИНК-позитивности несколько преждевременно. Тем более, что обнаруженное у больных НИЗСД группы 2-Д2, т.е. группы в ' которой все больные приобрели абсолютную инсулинозависи-мость, отсутствие "сцепленности" между антиостровковыми ауАТ, или между ними и ауАТ к антигенам других тканей, показывает, что это наиболее смешанная в этиопатогенетическом отношении .группа, что согласуется и с литературными данными по этому вопросу (Бгоор е1 а1. ,1990; бгорр еЬ ,1991).

Однако, нззависимо от того.верны или ошибочны высказанные предположения, результаты этого статистического анализа однозначно показали, что каждая из 4-х групп диабетических больных либо имела характерные только для нее пары ауАТ, встречающиеся в составе их ансамблей достоверно чаще, чем при случайных совпадениях, либо могла характеризоваться их отсутствием. Следовательно, несмотря на ту хаотичность составов ансамблей ауАТ, которая наблюдается при сахарном диабете, удается обнаружить некоторую определенную связь между их составом и типом диабета, а кроме того, наблюдать и .внутритиповые различия, что может означать только одно - и при ИЗСД, и при НИЗСД этиология гетерогенности маркеров гуморального аутоиммунитета непосредственно связана с этиологией диабета, и может являться свидетельством этипатоге-, нетической гетерогенности.каждого из типов спонтанного сахарного диабета.

III. Феномены аутоиммунитета при развитии диабета крыс, вызванного несколькими субдиабетогенными дозами ст'рептозотоцина.

Развитие СТЦ-диабета характеризовалось устойчивостью постпранди-альной гипергликемии, т. к. при регулярном кормении содержание глюкозы в крови СТЦ-крыс было достоверно более высоким, чем у контрольных животных (Табл.7 ),начиная с 4-го дня по окончанию введения индукторов диабета и на протяжении всего дальнейшего периода наблюдения (р<0,01 во всех случаях). Вместе с тем, санпрандиальная гликемия у СТЦ-крыс оставалась в.пределах нормы вплоть до окончания эксперимента.

Подобная динамика содержания глюкозы в крови при развитии муль-тидозового СТЦ-диабета была описана Б. Рипакаиа С соавторами, модели-

Таблица 7. Гликеши и инсулинемия у крыс при стрептозотоцнновоы диабете.

Дни эксперимента Глюкоза (М+m), мМ ИРИ (М+т), мхЕ/мл Глюкоза (М+т), мМ ИРИ (М+m), икЕ/ил

Контроль СТЦ Контроль СТЦ Контроль СТЦ Контроль СТЦ

1 8 13 19 •35 105 6,65* 6,27+0,99 7,33+0,09 5,51+0,26 5,77+1,28 5,95+0,15 +0,32 32,88+2,26 30,37+0,32 19,77+2,39 17,97+7 39 22,97+3,16 28,45" 22,13+4,63 30,34+6,11 17,80+9,15 34,01+2,68 27,95+1,78 +3,24 14,58+3.41 20,87+1,98 15,58+1,31 8,90+0,41 2,22+0,97 4,25» 4,07+0,55 6,30+0,89 2,27+0.53 3,40+0,67 4,20+0,70 +0,55 5,40+0,58 4,37+0,32 1,80+0,31 3,20+0,01 4,83+1,35 16,89* 10,63+2,49 25,33+6,55 9,16+0,91 10,33+3,52 10,88+3,30 '+1,66 6,34+1,45 9,86+0,51 3,67+2,51 6,85+1,67 3,72+1,02

Режим питания Регулярное кормление Отмена кормления за 24 часа до взятия кров::

Примечание. Символом * помечены показатели, определенные у 10 шшистных крыс той же партии. ^

-л

Таблица 8. Аутоантитсла, тканевые депозиты в циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) у крыс при ■

стрептозотоциновом диабете.

Дни экспери цента Частоты (%) СТЦ-крыс, позитивных по аутоантителам: Депозиты IgG, частоты (%) ЦИК, (М+m), ыкг/мл

АПОК АИНК АНПК АФБК АКПК АГГОС АДНК островки ПЖ почки Контроль СТЦ

1 0» 0» 0* 0* 0* 0* 0* н.д. н.д. 21,86*+0,94

8 0 0 0 0 0 0 0 н. д. н. д. 23,18+1,32 20,39+1,0

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18,58+1,01 24,87+2,75

19 50 83,3 50 0 0 0 0 83,3 50 18,20+0,71 22,93+2,53

35 0 0 60 0 0 . 0 0 0 60 24,85+2,13 29,82+4,87

105 100 100 100 100 100 100 100 0 100 24,92+2,50 48,33+3,82

Примечание. Символом * помечены показатели, определенные у 20 ингактных крыс той же партии.

решавшими диабет у КОМ-мышей среднего возраста, причем в их эксперименте постпрандиальная гипергликемия при санпрандиальной нормоглике- . мии наблюдалась у диабетических животных более 6-ти месяцев (Гипака-ха Б. ,е1 а1. ,1988). Другими авторами было показано, что при развитии СТЦ-диабета у С57ВЬ/КзЗ-мышей санпрандиальная гипергликемия наблюдается только после того, как уровень ИРИ падает до 1-2Х от исходного, но не при менее выраженной гипоинсулинемии (ВоппеУ1е-М1е1зеп V. ,еС а1.,1984). Вероятно подобное падение КРИ необходимо и для того,чтобы обеспечить санпрандиальную гипергликемию и при моделировании СТЦ-диабета на крысах, т. к. в нашем эксперименте уровень ИРИ у диабетических животных снижался постепенно и был достоверно более низким (р<0,01), чем у контрольных крыс, только начиная с его 35-го дня (Табл.7). На момент окончания эксперимента уровень ИРИ составлял в среднем 15Х от исходного, чего было достаточно для поддержания санпрандиальной нормогликемии у СТЦ-крыс, как это наблюдалось и пои развитии СТЦ-диабета у мышей V. Воппеу:е-Ше1Беп с соавторами.

Постепенность снижения ИРИ и появление маркеров антиостровково-го гуморального аутоиммунитета, а кроме того - ауАТ к поверхности нефронов, отмеченное на 19-й день эксперимента (Табл. 8), указывали на то, что в патогенез СТЦ-диабета вовлечена иммунная система. Это было подтверждено и при гистологическом исследовании поджелудочной железы и почек экспериментальных животных, проведенном на кафедре патологической анатомии 1-го ММИ им. Сеченова

По данным этого исследования (Варшавский и др,1990), начиная с 19-го дня эксперимента у СТЦ-крыс, но не у контрольных животных обнаруживались инсулиты, т. е. инфильтрованные лимфоцитами и макроф: -гами островки Лангерганса ПЖ. При этом у йсех АПОК- и АИНК-позитивных СТЦ-крыс (и только у них) изредка встречались островки, на периферии которых имелись очаговые отложения 1дгВ. В более поздние сроки СТЦ-диабета подобных островков с отложениями обнаружить не удалось.

На 35-й день ■ эксперимента у СТЦ-крыс наряду с инсулитами имелись частично деградировавшие островки, эндокринные клетки которых были замещены фиброзной тканью, а на 105-й день встречались прему-щественно частично деградировавшие островки.

Гистологическое обследование почек показало, что первые морфологические изменения появляются исключительно у АНПК-позитивных СТЦ-крыс, причем в каждом таком случае, на-19-й день эксперимента со стороны клубочков. Эти-изменения характеризуются появлениями депозитов

на базальных мембранах капилляров (БЫК) и в меаангии клубочков, а на ультраструктурном уровне - отложением субэндотелиальных и ' параме-эангиальных депозитов. Очаговые отложения на тех же структурах нефронов обнаруживаются во все последующие дни'эксперимента у АНПК-по-зитивных крью (и только у них) вплоть до его окончания, когда почечная ткань имела уже ярко выраженные дистрофические изменения вплоть до баллонной дистрофии извитых канальцев.

Поскольку иммунопатологические феномены антипочечного аутоимму-нитета строго коррелировали и предшествовали морфопатологическим изменениям почечной ткани, можно предположить, что гуморальный аутоим-мунитет играет ьедущую роль ь патогенезе диабетической нефропатии.

Следует заметить, что сходные морфопатологические изменения почечной ткани наблюдали ранее не только при СТЦ-диабете крыс (Болта еЬ а1. ,1988;) и мышей (Гипакаиа е1 а1. ,1988), но и у больных с диабетической нефропатией, у которых нередко обнаруживают также и д позиты иммуноглобулинов на БМК и в мезангии клубочков (Шулутко ,1987), т.е. на тех же структурах нефронов, на которых они были обнаружены у СТЦ-криа. Бесспорно, данные, полученные при моделировании диабета у животных нельзя полностью экстраполировать на' патологию человека, поскольку при СТЦ-диабете АНПК появляются, скорее всего, в ответ на локальные повреждения мембран нефронов в самые ранние сроки его развития, которые, как это было показано (Ки еЬ а1. ,1986), вызывает прямое нефротокснчное действие СТЦ. Вместе с тем, только ауАТ, фиксирующиеся на базальных мембранах нефронов посредством комплемент-зависимого лизиса мембран были способны вызвать те глубЬкие поражения почечной ткани, которые наблюдались на поздних сроках СТЦ-диабета. Во всяком случае, полученные результаты прямо указывают на участие гуморального аутоиммунитета в,развитии диабетической нефропатии и позволяют предположить, что циркулирующие ауАТ к антигенам базальных мембран нефронов могут служить маркерами начала ее развития не только при мультидозовом СТЦ-диабете крыс, но и при сахарном диабете человека.

Вместе с тем, данные гистологического исследования поджелудочной железы СТЦ-крыс не только подтверждали участие иммунной системы в патогенезе диабета, но и показывали, что ведущая роль в отторжении П-клеток принадлежит (щеточному аутоиммунитету, т. к. островковне отложения иммуноглобулинов встречались эпизодически и довольно редко, тогда как инфильтрация островков иммунными клетками была перманентной. Это согласуется с современными представлениями о патогенезе мультидозового СТЦ-диабета, поскольку несмотря на то, что в некото-

рых вариантах моделей этого диабета удаетсл наблюдать появление ци-тотоксичных антиостровковых ауАТ (Ziegler et al. , 1984; McEvoy et al. ,1987), в подавляющем большинстве вариантов либо не наблюдаете? никакой реакции гуморального аутоиммунитета на индуцированную СТЦ гибель ß-клеток (Riley et(al-..,1981), либо она появляется несколько позже реакции клеточного аутоиммунитета (Itoh et al,1984; Rossini et al, 1984; McEvoy et al,1987; Wilson, Eisenbarth,1990).

Вместе с тем, эти данные позволяют предположить, что если анти-островковые ауАТ первой генерации, т.е. обнаруженные в циркуляции СТЦ-крыс в ранние сроки диабета, могли являться свидетелями аутоиммунной антиостровкощвй агрессии, то антиостровковые ауАТ следующей генерации явно не имели к ней непосредственного отношения, поскольку к этому времени (105-й день эксперимента) основнная масса й-клеток уже была разрушена. Учитывая, что в поздние сроки СТЦ-диабета в циркуляции присутствовали не только антиостровковые ауАТ, но и ауАТ к антигенам поверхности клеток других тканей (Табл.8), а кроме того -и к плазматическим антигенам, т. к. уровень циркулирующих иммунных комплексов у СТЦ-крыс был достоверно более высоким (р<0,01), . чем у контрольных животных, вполне вероятно, что индукторами образования этих ауАТ явились иные, чем в ранние сроки диабета, антигены. Не исключено, что этими антигенами могли служить гликоэилированные формы общетканевых и плазматических белков, которые нередко встречаются в составе иммунных комплексов, обнаруживаемых и у диабетических животных и у больных сахарным диабетом (Krug et al. ,1990). Во всякое случае, очевидно, что за исключением может быть только АНПЧ, все остальные ауАТ вторичны в патогенезе СТЦ-диабета, как очевидно и тт, что гуморальный аутоиммунитет способен на подобную "мультиреактив-ность" даже при сочетанном общем иммуносупрессирующем действии гипергликемии и гипоинсулинемии, и это необходимо учитывать при изучении диагностического и прогностического значения маркеров гуморального аутоиммунитета у больных ИЗСД'и НИЗСД.

выводы

1. Разработаны высокочувствительные, спечифичные, надежные и доступные методы иммуноферментного определения аутоантител к микросомальной фракции тиреоцитов и к ДНК, и оптимизирован иммуноферментный анализ аутоантител к поверхности островковых клеток.

2. Показано, что во всех разработанных иммуноферментных методах определения антител в качестве критерия серопозитивности можно использовать индекс тестирования (ИТ), определяемый величиной отношения Е492 исследуемой сыворотки к Е492 среднестатистической негативной1 пробы, которой может служить пул сывороток доноров. Величины ИТ негативных сывороток лежат в интервале от ОД до 1,9; позитивных - в интервале от'2,0 до 20.

3. При использовании в иммуноферментом анализе в качестве антигенов цельных клеток, микросом или ДНК активность негативных сывороток определяется присутствием в них естественных аутоантител, специфично взаимодействующих с этими антигенами. Относительной единицей измерения уровня содержания естественных аутоантител в сыворотках может служить ИТ.

4. Высокая гетерогенность маркеров гуморального аутоиммунитета характерна не только для ИЗСД, но и для НИЗСД, что указывает на вторич-ность данного состояния гуморального аутоиммунитета в патогенезе сахарного диабета.

5. Показано, что имеется определенная связь между типом диабета и распределением антиостровковых аутоантител по полу, а также между типом диабета и составами ансамблей аутоантител, кроме того наблюдаются и внутритиповые различия тех же характеристик, которые показывают, что происхождение гетерогенности маркеров гуморального иммунитета непосредственно связано с этиологией диабета и может являться свидетельством этиопатогенетической гетерогенности как НИЗСД, так и ИЗСД.

6. При многодозовом стрептозотоциновом диабете крыс, характеризовавшемся устойчивой постпрандиальной гипергликемией при санпрандиальнои

нормогликемии на фоне постепенно нарастак.эй гипоинсулинемии, высс кая гетерогенность маркеров гуморального аутоиммунитета наблюдаете на самых поздних сроках его развития и не связана непосредственно аутоиммунной агрессией против fi-клеток.

7. Аутоантитела к поверхности островковых клеток на ранних сроках развития стрептоаотоцинового диабета наблюдаются эпизодически, тогда как инвазия островков Лангерганса иммунными клетками наблюдается перманентно, что указывает на ведущую роль клеточного аутоиммунитета в его патогенезе.

8. Циркулирующие аутоантитела к поверхности нефронов как и депозиты иммуноглобулинов на базальных мембранах капилляров и мезан-гии клубочков при стрептозотоциновом диабете крыс наблюдаются перманентно и являются иммунными маркерами начала развития нефро-патии иммунопатологического генезиса, т. к. их появление предшествует патоморфологическим изменениям почечной ткани, что может быть использовано для ранней диагностики'диабетической нефропатии при сахарном диабете человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ;

1. Горскова Е А. ,Кеда Ю. М. .Панков Ю. А. Конкурентные взаимодействия аутоантител человека и.крысы с антигенами поверхности островковых клеток поджелудочной железы неонатальных крыс при клиническом и экспериментальном диабете. - Тез. докладов симпозиума Латвийского научного общества эндокринологов "Актуальные проблемы диагностики и лечения эндокринных заболеваний". - Рига, 1988.- 4.1, С. 29-30.

2. Горскова В. А. , Кеда Ю. IL , Крюкова И. В., Бирюкова М. П. , Коннова Е. В. Определение аутоантител (ауто-АТ) к микросомальному антигену тиреоцитов человека твердофазным иммуноферментным методом (т-ИФА) при некоторых эндокринных патологиях. - Тез. докладов 111 Всесоюзного эндокринологического съезда. - Ташкент, 1989. - О. 433.

3. Горскова В. А. , Кеда Ю. М. , Крюкова И. В. , Коннова Е. В. , Базарова Э. Е , Панков Ю. А. Иммуноферментный метод определения аутоантител к мик-росомальным антигенам тиреоцитов человека. - Пробл. эндокринол., 1990. - Т. 36. - N. 6. - С. 8-11.

■1. Горскова Е А. .Евменов В. Ф. .Зайцева Т. С, .Овчинников В. А.'.Огай С.

t

В. Влияние хирургического вмешательства и внутрисосудистого облучения кроэи гелий-неоновым лазером на состояние гуморального 'ауто-иммунитета у онкологических больных.-Хирургия. , 1991. -Ы. 9. -С. 92-97.

5. Горскова В А. .Кондратьев Я. Ю. ,Гус М. И. .Касымов У. А. .Овчинников

B. А. Состояние гуморального аутоиммунитета при неинсулинозависимом (тип II) сахарном диабете. Тез. докладов 11 Всероссийского съезда эндокринологов. - Челябинск, 1991.- С. 84-85.

6. ■ Варшавский А. А. , Пономарев А. Б. , Базарова А. В. , Карелин А. А. , Панков XI А. .Кондратьев Я Ю. .Кеда Ю. М. .Горскова В. А. Морфология диабетической нефропатии при экспериментальном диабете, вызванном низкими дозами стрептозотоцина. - Архив патологии, 1990. - Т. 52. 7. -

C. 43-48.

7. Кеда Ю. М. .Горскова К А. .КондратьевЯ Ю. .Садовникова а В. .Панков Ю. А. Динамика эндокринных показателей и маркеров гуморального аутоиммунитета при экспериментальном диабете, индуцированном дрс Гным введением стрептозотоцина. Тез. докладов симпозиума Латвийского научного общества эндокринологов "Актуальные проблемы диагностики и лечения эндокринных заболеваний". - Рига, 1988,- 4.1, С. 73-74.

8. Кеда К1 М. .Горскова Е А. .Кондратьев Я Ю. .Садовникова Е Е .Панков Ю. А. Циркулирующие аутоантитела к поверхности островковых клеток (АПОК) при индуцированном дробным введением стрептозотоцина диабете крыс. Тез. докладов III Всесоюзного эндокринологического съезда. - Ташкент, 1989.- С.237.

9. Крюкова И. Е , Бирюкова М. П. , Кеда Ю. М. , Горскова Е А. , Матвеева Л. С. , Кандрор Е И. Нарушение регуляции антителообразования при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Тез. докладов IV Всесоюзного съезда патофизиологов. - Кишинев, 1989.- Т. 1, С. 179.

10. Огай С. Е , Овчинников Е А. .Горскова Е А. .Зайцева Т. С. Возможности применения лазерной терапии у больных раком пищевода и желудка. Тез. докладов Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы лечения рака пищевода и желудка". - Казань, 1991,- С. 53-54.

11. Панков К1 А. ,Чехранова М. К. ,Кеда Ю. М. .Горскова Е А. .Кондратьев Я. Ю, Молекулярно-биологические аспекты патогенеза сахарного диабета. - Вестник АМН СССР, 1989.- N.5.- С. 5-16.

12. Панков Ю. А. .КондратьевЯ ¡0. .Горскова Е А. ,Кеда Ю. М. .Осипова Т. А. . Арбузова М. И. , Садовникова Н. Е , Федотов Е П. Гипоинсулинемия, гипергликемия и циркулирующие аутоантитела к островковым клеткам при развитии стрептозотоцинового диабета у крыс. - Пробл. эндокринол. , 1990.

- T. 36. - N. 2. - C. 70-73.

13. Gorskova V. .Kondratiev Y. .Gus M. ,Keda Y. .Sadovnikcva N. .Komolov I. .Gudoshnikov V. .Kalits I. Autoantibody repertoire in Estonian type 2 (non-insulin-dependent) diabetic patients. - Acta endocrinologi-ca, 1990.- V. XII.- P. 67.

14. Kondratiev Y. , Kasymov U., Gorskova V., Pankov Y. Various organ-specific autoantibodies in impaired glucose tolerance and type 2 diabetes mellitus. - Acta endocrinologica, 1990.- V. XII.- P. 79.

15. Kondratiev Y. .Gorskova V. ,Gus M. .Sadovnikova N.. .Balabolkin M. , Komolov I. .Gudoshnikov V. .Dedov I. Different patterns of humoral immunological markers in type 2 diabetic patients with and without secondary drug fail lure. - Diabetes, 1991.- V. 40 (suppl.l).- P. 33A.

16. Kondratiev Y. .Gorskova V. ,Gus M. Sex-difference in antibody res-ponce to islet-cell specific and non-specific antigens in diabetes mellitus.- 9-th International Congress of Endocrinology, 1992,Nice, France.-(Abstract). - P. 376.

17. Kuraeva T. L. ,Dedov I. I. .Lebedev N. B. .Kondratiev Y. Y., Yasdowsky V. V. .Gorskova V. A. .Sergeev A. S. , Maximova V. P. HLA-DR and humoral autoimmunity in DIDMOAD syndrome. - Diabetes research and clinical practice, 1991.- V. 14 (suppl.l).- P.S42.

18. Pankov Y. .Gorskova V. .Kondratiev Y. ,Keda Y. .Krjukova I. Type I diabetes and autoimmune thyroid diseases: cross-reactive autoantibodies binding to islet cell and thyroid microsomal antigens.- Diabe-tologia, 1991.- V. 34 (suppl.2).- P. A192.

/