Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы повышенной чувствительности тромбоцитов к действию тромбина при инсулинозависимом сахарном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы повышенной чувствительности тромбоцитов к действию тромбина при инсулинозависимом сахарном диабете"

РГ6 од

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

1 У СЕ&СТИТУТ БІОХІМІЇ ІМЕНІ О.В. ПАЛЛАДІНА

МАХНЕВИЧ ТАРАС РОМАНОВИЧ

УДК 577.158.1 +661.729:616.379-008.64

БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ПІДВИЩЕНОЇ ЧУТЛИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ДО ДІЇ ТРОМБІНУ ПРИ ІНСУЛІНЗАЛЕЖНОМУ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ

03.00.04- біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2000

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович, завідувач кафедри біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітнго ЛЕВИЦЬКИЙ Євген Леонідович,

головний науковий співробітник Інституту фармакологі та токсикології АМН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітн КУЧМЕРОВСЬКА Тамара Муратівна, старший науковий співробітник Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Провідна установа - Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренка АМН України (лабораторія молекулярних механізмів імунітету).

Захист відбудеться “П ” 2000 року о 14 год на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохін ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Автореферат розісланий 2000 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Кірсенко О.В.

кандидат біологічних наук

Актуальність теми. Іисулінзалежний цукровий діабет (ІЗЦД) проводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що изводить до формування ряду ускладнень, зокрема інтенсифікації процесів ідання крові при одночасному гальмуванні фібринолізу. Посилення коагуляції ові обумовлено збільшенням кількості фібриногену, фактора Віллєбранда, останням в’язкості крові та активації тромбоцитів (Єфімов А.С., 1994; абарчук 0.1., 1998).

Підвищена агрегаційна здатність кров’яних пластинок при цукровому ібеті є наслідком дії різних факторів. Так, зниження активності енілатциклази, яке спостерігається при високії} активності фосфоліпази А2, іукує перетворення арахідонової кислоти по циклоокснгеназному шляху з воренням тромбоксану ІЗ?. Сповільнення швидкості метаболізму N0, Убування активності основних ферментів антиоксидантного захисту та в’язана з цим інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) нзводить до зниження плинності плазматичної мембрани (Mazzanti L., 1997). ільшення кількості глікопротеїнових рецепторів на поверхні тромбоцитів, гєнсифікація обміну фосфоінознтидів, зростання внутрішньоклітинної

— гл 2+ ... .

пцентрацн Са спричиняє активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, гочовими ланками яких є протеїнкІнази та ліпідкінази (Winocour P.D., 1994). ісування механізмів активації і функціонування протеїнкІнази c-Src та сфатидилінозит 3’-кінази (РІ 3’-кіназа) дозволить розширити наші уявлення

о механізми розвитку гіперчутливості тромбоцитів при ІЗЦЦ.

Дослідження останніх років показали здатність нікотинаміду (НАм) переджувати або гальмувати розвиток ІЗЦД у дітей та знижувати ймовірність никнення діабету у мишей без ожиріння (Okamoto Н. 1993; Шишко П.И., 93). Постульовано декілька можливих біохімічних механізмів захисної дії Vm при ІЗЦД у людей та експериментальному стрептозотоцин- або алоксаи-іукованому діабеті у щурів і мишей. Згідно з одним із них центральна роль в осередкуванні дії нікотинаміду належить цикло-АОР-рибозі, метаболіту \D+, яка є вторинним посередником внутрішньоклітинного вивільнення Са2+ з іоплазматичіюго ретикулуму і глюкозо-індукованої секреції інсуліну [5-ітинами. НАм, інгібуючи полі-АБР-рибозополімеразу та знижуючи користання NAD+ у синтезі полі-АОР-рибози, відновлює функції ще не /йнованих (З-клітин (Великий Н.Н. и др., 1995). Важливим наслідком гдення НАм є зниження інтенсивності процесів ПОЛ, в основі якого лежить ітність НАм безпосередньо взаємодіяти з гідроперекисами ліпідів із юренням N-оксиду нікотинаміду (Pociot Е., 1993).

Оскільки вільнорадикальні процеси та реакції ПОЛ впливають на нкцію тромбоцитів і є тісно пов’язані з NAD- і NADP-залежними окисно-повними процесами в клітинах (Simplico Р. 1995), актуальним було з’ясувати

вплив НАм на тромбін-індуковану агрегацію, вміст продуктів ПОЛ активність ферментів антиоксидантного захисту в тромбоцитах хворих на 131 та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Даи робота є частиною фундаментальних досліджень науково - дослідік лабораторії “Радіаційної та молекулярної біології” Львівського націоиальног університету ім. Івана Франка за темами: “Діагностика та розробка засобі корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держ. реєстрац 0193V024092), “Інтегративна роль нікотинамідних коферментів в регуляц клітинного метаболізму в нормі та при дії екстремальних факторів” (№ деря реєстрації 0194V022438). Дослідження ефективності нікотинаміду в терапії і профілактиці діабету в групах ризику проводиться в рамках “Європейське програми дослідження впливу нікотинаміду при діабеті” (Europea Nicotinamide Diabetes Intervention Trial).

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було дослідити ступін тромбін-індукованого, тирозинспецифічного фосфорилювання внутрішньс клітинних сигнальних білків, інтенсивність процесу ПОЛ і активніст ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД та щурі із експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Оцінити впли нікотинаміду на агрегаційну здатність кров’яних пластинок при дані патології.

Відповідно до поставленої мети були сформульовані наступні завдання

1. Охарактеризувати особливості протікання тромбін-індукованої агрегац тромбоцитів, у хворих на ІЗЦД.

2. Дослідити роль внутрішньоклітинних сигнальних білків в активаці тромбоцитів при ІЗЦД:

- охарактеризувати процес фосфорилювання білків по залишка тирозину у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, після активації їх тромбіном;

- вивчити динаміку і механізм транслокації протеїнкІнази c-Src т регуляторної субодиниці РІ З’-кінази у цитоскелетну фракцію під час агрегаці тромбоцитів, стимульованої тромбіном у хворих на ІЗЦД,

3. Оцінити інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів т активність ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих н ІЗЦ Д, а також у тромбоцитах щурів із стрептозотоциновим діабетом.

4. Дослідити вплив нікотинаміду на тромбін-індуковану агрегацік інтенсивність процесів ПОЛ та функціонування системи антиоксидантноп захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, та у тромбоцитах щурів і стрептозотоциновим діабетом.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведени; досліджену встановлено підвищення рівня фосфорилювання по тирозину ряд; специфічних білків тромбоцитів у хворих на ІЗЦД та проаналізовано динамік; його зміни в процесі агрегації, індукованої тромбіном. Виявлен закономірності фосфорилювання білків кров’яних пластинок при даніі

тології свідчать про активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які гтучені у процес агрегації тромбоцитів.

Вперше продемонстровано динаміку перерозподілу внутрішньо-ітинного пулу ключових сигнальних білків: с-йгс-кінази та РІ З’-кінази у омбоцитах хворих на ІЗЦД між цитоплазматичною і цитоскелетною іакціями. З’ясовано роль їх БНЗ-доменів у тромбін-індукованій транслокації у ітоскелет. Встановлено, що процес транслокації с-Згс кінази у цитоскелетну іакцію діабетичних тромбоцитів опосередковується БЮ-доменом молекули :рменту. Посилення включення протеїнкінази с-Бгс у цитоскелетну фракцію у ов’яних пластинках при ІЗЦД свідчить про її активацію.

Вперше продемонстровано коригуючий вплив нікотинаміду на тромбін-пуковану агрегацію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту інтенсивність процесів ПОЛ у тромбоцитах людей хворих на ІЗЦД і у омбоцитах щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі дані вволяють охарактеризувати механізми розвитку гіперактивності тромбоцитів їй ІЗЦД як результат сукупної дії різних факторів. Порушення процесів зсфорилювання/дефосфорилювання сигнальних білків, зміни у /нкціонуванні с-Згс протеїнкінази та обміні З’-фосфоінозитидів, генсифікація процесів ПОЛ, що проходить на фоні інгібування ключових :рментів антиоксидантного захисту, сприяють розвитку гіперчутливості омбоцитів до дії тромбіну при цій патології. Оскільки введення нікотинаміду ричиняло зниження ступеня та швидкості тромбін-індукованої агрегації, [кликало зниження вмісту продуктів ПОЛ та нормалізувало активність :рментів системи антиоксидантного захисту у тромбоцитах при цукровому абеті, доцільно рекомендувати його застосування з метою попередження ізвитку судинних ангіопатій при ІЗЦД та на його основі вести пошук і ізробку нових хіміотерапевтичних засобів, скерованих на нормалізацію лікціональної активності кров’яних пластинок.

Матеріали дисертаційної роботи використовуються на кафедрі біохімії .віпського національного університету ім. Івана Франка та у Відділенні гуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН країни при читанні спецкурсів: “Молекулярні механізми інтеграції клітинного ;таболізму” та “Сигнальні механізми клітини”.

Особистий внесок здобувана. Експериментальна частина роботи іконана здобувачем самостійно. Автор особисто відібрав і критично юаналізував великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за мою проведеного наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму [рішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати. Аналіз та іговоренкя результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником зав. кафедри біохімії Львівського національного університету імені Івана ранка, д.б.н., проф. Великим М.М., та зав. відділу біохімії клітинної

диференціації Інституту біохімії ім, О.В.Палладіна НАН України, к.б Дробот Л.Б.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації бул представлені на IV Міжнародній студентській науковій конферени (м. Гданськ, Польща, 1996); Міжнародній науково-практичній конферени “Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії і технологій продуктів тваринництва” (м. Львів, 1997); VII Українськом біохімічному з’їзді (м. Київ, 1997); IV Міжнародній конференції з клінічні ендокринології Європейської Федерації Ендокринологічних досліджєи (м. Пултуськ, Польща, 1997); II Міжнародному з’їзді з молекулярної клітинної ендокринології (м. Турку, Фінляндія 1998); І Міжнародні конференції по вивченню шляхів трансдукції сигналу (м. Дубровнік, Хорваті

1998); V Міжнародній конференції “Біоантиоксидант” (м. Москва, Росія 1998

II конференції ім. Парнаса (м. Гданськ, Польща, 1998); VII Наукові конференції Польського діабетологічного товариства (м. Вроцлав, Польщ:

1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, яких 4 статті у фахових наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається : вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, результатів та ї обговорення, висновків і списку використаних джерел, який містить 19 найменувань. Обсяг роботи становить 135 сторінок. Дисертаці проілюстрована 7 таблицями та 19 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто механізми виникнення і розвитку ІЗЦД експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано фактор що впливають на агрегаційну здатність тромбоцитів. Описані сучасні уявлені про молекулярні механізми активації кров’яних пластинок, функціонувані антиоксидантної системи захисту та її роль у розвитку гіперчутливості до ; індукторів агрегації.

Матеріали і методи досліджень. Об'єктом досліджень були:

1) тромбоцити людей, хворих на важку форму ІЗЦД, ускладнену судиніт ангіопатіями;

2) тромбоцити щурів-самців із експериментальним стрептозотоцинови діабетом, масою 120-150 г, яких утримували в умовах віварію.

Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введення стрептозотоцину фірми “Sigma” в дозі 70 мг на кг маси тіла внутрішньочеревн Розвиток діабету контролювали за рівнем глюкози, який визначах глюкозооксидазним методом (Гончар М.В., 1998). Вплив нікотинамі/

досліджували під керівництвом і за участю завідувача кафедри клінічн* ендокринології Львівського державного медичного університету доктора ме, наук Сергієнка О.О. 5% розчин нікотинаміду вводили внутрішньом’язево по

і двічі на добу людям хворим на ІЗЦЦ протягом 14 діб (Обросова И.Г., 1987). Іурам з розвиненою гіперглікемією (14-16 ммоль/л) внутрішньом’язево юдили нікотинамід “Sigma” в дозі 200 мг на кг маси щодобово протягом 14

б.

Агрегаційну здатність тромбоцитів досліджували на автоматичному іалізаторі (НПФ “Биола”, Москва). Індуктор агрегації (тромбін) додавали до 'спензії тромбоцитів у концентрації 0.7 од/мл. Визначення активності тіероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.11) проводили за допомогою реакції дновлення нітротетразолію синього до нітроформазану (Чевари С., 1991). Вміст БК - позитивних продуктів визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу злонового діальдегіду з тіобарбітуровою кислотою (Тнмирбулатов Р.А., 1981). вень дієнових кон’югатів визначали за інтенсивністю поглинання лт’югованих дієнових структур гідроперекисів ліпідів при 233 нм (Гаврилов В, 1983). Глутатіонпероксидазну (ГПО, КФ 1.11.1.9) активність визначали за іеншенням концентрації відновленого глутатіону ■ (GSH) (Мойн В.И., 1986). ктивність глутатіонредуктази (ГР, КФ 1.6.4.2) оцінювали за зменшенням вмісту ADPH (Прохорова М.И. 1982). Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали за тенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію (Королюк М.А. >88).

Преципітацію білків лізатів тромбоцитів антитілами та рекомбінантними ормами 8НЗ-доменів сигнальних білків, кон’югованих з глутатіон-S-шісферазою (GST) проводили згідно (Frederic М. Ausubel et al. 1992). Білок-лкові взаємодії вивчали in vitro з використанням GST-кон’югованих форм іІЗ-доменіп c-Src кінази та р85а - регуляторної субодиниці РІ З’-кінази. Білки,

о специфічно зв’язались з тлутатіон-сефарозою, розділяли в градієнтному (5-?%) поліакриламідному гелі (ПААГ) і фарбували сріблом за стандартною етодикого.

Вестерн блотинг та Фа-Вєстерн блотинг білків проводили згідно етодичних рекомендацій (Frederic М. Ausubel et al. 1992).

Результати та їх обговорення.

1. Індукована агрегація тромбоцитів при ІЗЦД. Агрегацію тромбоцитів іалізували за змінами середнього радіусу агрегатів, що дає більш повну [формацію про поведінку клітин у розчині. На рис. 1.1 представлено типові юхфазні криві агрегації тромбоцитів, індукованої тромбіном. При порівнянні ара метр і в агрегації тромбоцитів у контролі та при ІЗЦД (табл. 1.1) ми бачимо,

[о у останніх зростав ступінь агрегації, який визначався як максимальне гачепня середнього розміру агрегатів після додавання тромбіну, зростала також івидкість агрегації у першій фазі процесу. Більше того, у 8 % пацієнтів у наших «шериментах спостерігалась спонтанна агрегація. Із рис. 1.1 видно, що регація кров’яних пластинок у другій фазі є значно посиленого, внаслідок гастання інтенсивності метаболізму арахідонової кислоти (Єфімов А.С.,

Сергієнко О.О., 1994). Підвищена чутливість тромбоцитів до дії тромбіну мо; пояснюватись, як підвищеною афінніспо рецепторів тромбоцитів до агоніст так і збільшеною концентрацією самих агоністів у плазмі крові (Мпосоиг Р.І 1994). Відомо, що глікозильовані білки та модифіковані активними метаболіта* кисню ліпопротеїни низької гусгини, концентрація яких у плазмі крові II) цукровому діабеті зростає (Галенок В.А., 1989), взаємодіють з рецептора» макрофагів, стимулюють синтез і секрецію специфічних цнтокінів (ФНП, ІЛ-ІФР-1)(Балаболкин М.М., 1997).

Час, свх

Рис. 1.1. Вплив нікотинаміду на громбін-індуковану агрегацію тромбоцитів хворих на 13ЦЦ.

Таблиця 1.1. Основні показники агрегації тромбоцитів крові людей хворих ІЗЦД (М+т, п= 15-18) __________________________________________________

Умови досліду Ступінь агрегації, відн. од Показник агрегації, відн. од Швидкість агрегації, відн.од/с

Контроль 17,4±1,5 337,4±1,3 0,50±0,05

ІЗЦД 22,4±1,3* 500,8±3,7* 0,69±0,06*

ІЗЦЦ+НАм 19,9+2,2** 396,0+3,8** 0,58±0,07

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05 ** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

Ці біологічно активні поліпептиди при взаємодії з рецепторами ендотеліальн клітин сприяють підвищеному синтезу позаклітинних сигнальних сполук, так як ендотелій-1, який є потужним вазоконстрикторним фактором і мо призводити до локального тромбозу. В ендотеліальних клітинах знижуеп

интез простацикліну І2. У той же час підвищений рівень глікозилювання білків тромбоцитах сприяє зростанню синтезу тромбоксану Аг (Балаболкин М.М., 997). Зміна співвідношення простацикліну І2 і тромбоксану А2 при збільшенні місту останнього є однією з причин підвищення функції тромбоцитів при .укровому діабеті (Єфімов А.С., 1994).

2. Дослідження молекулярних механізмів активації тромбоцитів у іацієнтів з діабетичними ангіопатіями

.1. Аналіз загального спектру фосфотирозинвмісних білків у тромбоцитах гри ІЗЦД. Адгезія тромбоцитів у місцях пошкодження судинної стінки, чи тимуляція агрегації розчинними агоністами плазми крові спричиняє іеорганізацію внутрішньої будови клітини. При цьому відбувається юлімеризація актинового цитоскелету, ініціюється процес скорочення ііозинових волокон, що супроводжується зміною форми тромбоцитів, екрецісю вмісту внутрішньоклітинних гранул та агрегацією. Процеси зосфорилювання і дефосфориліовання сигнальних молекул відіграють ключову юль у регуляції механізмів активації тромбоцитів.

1 2 3 4 5 6 7 8

0 0,5 1 4 0 0,5 1 4

Час інкубанії з тгюмбіиом. хи

Рис. 2.1.1. Імуноблотинг фосфотирозинвмісних білків лізатів тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ІЗЦД (треки 5-8), після стимуляції тромбіном (0.7 од/мл).

Порівнюючи інтенсивність процесів фосфорилювання у нестимульованих юрмалышх і діабетичних кров’яних пластинках (рис. 2.1.1, треки 1 і 5, зідповідно) ми показали, що останні володіють вищим вихідним рівнем фосфорилювання білків навіть за умов відсутності стимуляції тромбіном (трек

5). Особливо це стосується білків з мол. масою 120, 95 та 68 кДа, що може буї пояснене підвищенням концентрації як розчинних, так і нерозчинних ліганд інтегринів (фібриногену, фактору фон-Віллєбранда, колагену) у плазмі кро діабетичних пацієнтів (Ефимов А.С., 1989), а також збільшенням афінності' кількості самих рецепторів на поверхні клітин (Winocour P.D., 1994 Стимуляція тромбіном викликала швидку індукцію фосфорилювання багатьс білків по залишках тирозину. Зокрема, білки з мол. масою 125/120, 95, 68, 2 кДа формували першу “хвилю”, фосфорилювання яких по тирозину значі зростає вже після 0.5 хв стимуляції. Друга фаза фосфорилювання настава; після 1 хв стимуляції. Відбувалось зростання рівня фосфорилювання білків мол. масою 185/180, 125/120, 85, 56 кДа (рис.2.1.1). В експериментах час появ другої фази фосфорилювання відрізнявся (на 1 - 1.5 хв), однак завжди співпаде у часі з найбільшою інтенсивністю агрегації. Отримані результати свідчать пр активацію тромбін-залежних сигнальних механізмів тромбоцитів, асоційованії з тирозиновими протеїнкіназами при ІЗЦЦ. Однією з найбільш широк представлених фосфотирозинових протеїнкіназ у кров’яних пластинках є c-Si кіназа.

2.2. Дослідження змін у функціонуванні c-Src кінази та регуляторні субодиниці РІ З’-кінази у тромбоцитах при ІЗЦД. Відомо, що під ча стимуляції тромбоцитів тромбіном відбувається швидка активація c-Src кінази наступною транслокацією ферменту у цитоскелег (Clark Е.А., 1993; Fox J.B

Рис.2.2.1. Імуноблотинг с-Бгс кінази у тритон Х-100 розчинній фракці тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ІЗЦД (треки 5-8 після стимуляції тромбіном (0.7 од/мл).

Результати імуноблотингу с-Бгс кінази за допомогою поліклональних антитіл тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) т хворих на ІЗЦЦ (треки 5-8) показали (рис. 2.2.1), що у нестимульовани: тромбоцитах ізольованих з крові здорових донорів, основна кількість фермент зосереджена у тритон Х-100 розчинній фракції (трек 1). Після додаванії тромбіну, зменшення кількості протеїнкінази у детергент-розчинній фракці кров’яний пластинок (треки 2-4), відбувається поступово, пропорційно час; інкубації з тромбіном, що свідчить про транслокацію с-Бгс кінази у цитоскелеї При ІЗЦЦ рівень с-Бгс кінази у детергент-розчинній фракції нестимульовани; тромбоцитів був нижчим (трек 5) ніж у контролі, що свідчить про активацін

1996).

2 3 4 5 6 7

8

Ц£9 «ш ша *т» ЄгЗ<За5» 4»

0 0,5 1 4 0 0,5 1

Час інкубації з тромбіном. хв

4

ерменту і, як наслідок, перерозподіл пулу c-Src між цитоплазматичною і ітоскелетного фракціями. Дииаміка рівня c-Src кінази у детергент-розчинній ракції діабетичних тромбоцитів при дії громбіну мас чітко виражений фазний ірактер: зниження на ЗО сек і 4 хв та підвищення на 1 хв стимуляції у зрівнянні з контролем.

Відомо, що ЭНЗ-домени сигнальних молекул, взаємодіючи з пролін-ігатими ділянками білків, залучені у процес транспортування молекул до іецифічних компартментів у середині клітини, в тому числі і до цитоскелету Лаіагкеу К., 1995). Використання рекомбінангної, кон’югованої з GST, форми НЗ-домену c-Src кінази для дослідження зв’язування білків лізатів тромбоцитів

і vitro, стимульованих тромбіном, дозволило нам показати, що основна роль в ітеграції протеїнкінази c-Src у цитоскелет належить SНЗ-домену молекули ніс. 2.2.2).

0 0,5 1 4 0 0,5 1 4 GST

Час інкубації з тромбіном, хв Рис. 2.2.2. Електрофореграма білків лізатів тромбоцитів, що специфічно зв’язуються з ЯЮ-доменом c-Src кінази коньюгованим з GST, in vitro, після стимуляції тромбіном (0.7 од/мл). (1-4-тромбоцити здорових донорів; 5-8-хворих на ІЗЦД; 9- зв’язування білків лізатів тромбоцитів з GST).

Із рисунку видно, що при відсутності стимуляції зв’язування білків з SH3-оменом у контролі (трек 1) відсутнє. За цих же умов при ІЗЦД ми спостерігали соціацію БНЗ-домену c-Src кінази з білком з мол масою 70 кДа. Після тимуляції тромбіном контрольних тромбоцитів відбувалось поступове ростаїшя рівня зв’язування білків з рекомбінантним БНЗ-доменом (треки 2-4). 7 той же час динаміка асоціації білків з 5НЗ-доменом c-Src при ІЗЦД арактеризувалась фазним характером. Зв’язування з білками спостерігалось на

30 сек і на 4 хв стимуляції (треки 6, 8). Результати представлені на рис 2.2.2 корелюють з даними імуноблотингу с-Бгс кінази: при відсутносі взаємодії БЮ-домену з білками-мішенями основна кількість с-Бгс кіназ зосереджена у тритон Х-І00 розчинній фракції тромбоцитів (рис.2.2.1 Зниження рівня с-Бгс кінази у детергент-розчинній фракції нестимульовани діабетичних тромбоцитах (рис. 2.2.1, трек 5), може бути наслідком взаємод БЮ-домену з цитоскелетним білком з мол масою 70 кДа.

кДа 12 3456 78

Час інкубації з тромбіном, хв а

Рис. 2.2.3. Фа-Вестерн блотинг білків, що специфічно взаємодіють з GST-SH3/c-Src in vitro у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів, ізольованих з крові здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ІЗЦЦ (треки 5-8) після стимуляції тромбіном (0.7 од/мл) - (а); динаміка взаємодії GST~SH3/c-Src зі специфічними білками - (б).

Більш детальну інформацію про взаємодію БНЗ-домену с-Бгс-кшази і білками тромбоцитів ми отримали методом Фа-Вестерн блотингу. Нам встановлено, що БНЗ-домен вказаної протеїнкінази специфічно взаємодіяв білками з мол. масою 125 та 70 кДа (рис.2.2.3а). Рівень зв'язування БНЗ домену з цими білками у контролі поступово знижувався пропорційно час інкубації з тромбіном, а у тромбоцитах хворих на ІЗЦЦ динаміка зв'язуванії також мала фазний характер з максимумом на 1 хв стимуляції (рис.2.2.3б).

Виявлені зміни у взаємодії БНЗ-домену с-Бгс кінази з ефекторним білками можуть свідчити про порушення процесів полімеризації т реполімеризації актину у тромбоцитах людей із ІЗЦЦ, стимульованії тромбіном. Причиною цього може бути зростання внутрішньоклітинне концентрації іонів Са2+, які відіграють провідну роль у регуляції цьог процесу (ТясЬоере О., 1991).

Беручи до уваги, що З’-фосфоінозитиди ініціюють перехід О-актину Б форму, ми використали високоспецифічні антитіла до р85а - регуляторної

'бодишіці РІ З'-кінази для дослідження динаміки транслокації вказаного ггнального білка у цитоскелет методом імуноблотингу.

Нами показано, що рівень р85а у тритон Х-100 розчинній фракції юмбоцитів хворих на ІЗЦЦ протягом 4 хв стимуляції тромбіном, відрізнявся д аналогічних даних для контрольних клітин у кожній дослідній точці іис.2.2.4). Значне зменшення кількості р85а у детергент-розчинній. фракції юстерігалось на 1 і 4 хв стимуляції тромбіном у порівнянні з контролем.

1 2 3 4 5 6 7 8

ССЕ» сэ «сет ЄЕ5»

0 0.5 1 4 0 0.5 ! 4

Час інкубації з тгюмбіном. хв Рис.2.2.4. Імуноблотинг р85а у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та людей з ІЗЦЦ (треки 5-8), при стимуляції тромбіном (0,7 од/мл).

Посилення інтеграції сигнальних молекул - с-Бгс кінази та р85а у итоскелет тромбоцитів при ІЗЦЦ після активації тромбіном можна пояснити мінами у тригерних механізмах запуску процесу полімеризації актину і/чи юдифікацією сигнальних молекул глюкозою або активними кисневими .етаболітами (МаггаШі Ь. 1997). Беручи до уваги дані, що глікозилювання ілків-ферментів посилює процес їх окисної модифікації (ТакШ І., 1996), ми ропели дослідження активності ферментів антиоксидантного захисту та ггенсивності процесів ПОЛ у тромбоцитах людей з ІЗЦЦ та щурів з кспериментальним стрептозотоциновим діабетом.

3. Дослідження процесів перскисного окислення ліпідів та ктивності ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах при 131 ІД а експериментальному стрептозотоциновоиу діабеті.

Продемонстровано зростання вмісту продуктів ПОЛ - дієнових :он’югатів та ТБК-позитивних продуктів у тромбоцитах хворих на важку форму ЗЦД, ускладнену судинними ангіопатіями, та щурів з експериментальним трептозотоциновим діабетом (табл. 3.1). Отримані дані свідчать про нтенсифікацію перєкисних процесів у кров’яних пластинках при діабеті. Мдомо, що зростання інтенсивності ПОЛ у тромбоцитах є однією із основних іричин порушення структури плазматичної мембрани. Це відбувається, в першу іергу, за «рахунок зростання впорядкованості мембранних фосфоліпідів і ібагачення їх холестерином, що сприяє зменшенню плинності останньої і, як іаслідок, підвищує чутливість тромбоцитів до дії агоністів (Шаталина Л.В., 1993).

Таблиця 3.1. Вміст продуктів ПОЛ у тромбоцитах людей із ІЗЦД та щурів експериментальним стрептозотоциновим діабетом (М±ш, п = 8-15)

Показник Контроль ІЗЦЦ ІЗЦД+Нам

Люди

Дієнові кон’югати, нмоль на мг білка 1,80±0,08 5,11±0,09* 3,53±0,21**

ТБК-позитивні продукти, нмоль на мг білка 3,2810,18 6,57+0,62* 4,60 + 0,38**

Щурі

Дієнові кон’югати, нмоль на мг білка 2,10+0,09 6,00±0,23* 4,88+0,41**

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05 ** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

Причини активації процесів ПОЛ при діабеті можуть бути різними залежності від типу клітин. В інсуліннечутливих клітинах, зокрема тромбоцитах, це може бути пов’язано із модифікацією антиоксиданти: ферментів як активними метаболітами кисню, так і глюкозою, що призводить д інгібування активності останніх. Так, в еритроцитах здорових людей СО} присутня у неглікозильованій і глікозильованій формах у співвідношенні 4:1 При цукровому діабеті це співвідношення порушується за рахунок зростанн концентрації глікозильованої форми ферменту (Литвиненко Л.А., 1991 ] Отримані результати свідчать про зниження активності СОД та каталази ; тромбоцитах людей із ІЗЦД у важкій формі, ускладненій судинними

Таблиця 3.2. Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантноп захисту у тромбоцитах людей хворих на ІЗЦД (М±ш, п = 8-18)

Показник Контроль ІЗЦД ІЗЦД+НАм

Супероксйддисмутаза, ум. од. за хв на мг білка 1,74+0,12 1,10+0,09* 1,45 ±0,10**

Каталаза, мкмоль Н202 за хв на мг білка , 3,60+0,09 3,10+0,08* 3,13 + 0,09

Г лутатіонпероксидаза, нмоль ОБН за хв на мг білка 688,52+10,81 518,16+15,01* 570,14+ 12,06**

Глутатіонредуктаза, нмоль ИАБРН за хв на мг білка 98,65+6,71 151,73+5,82* 110,51 ±6,73**

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05

** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

пгіопатіямн та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом габл. 3.2, 3.3). За цих же умов ми спостерігали зниження активності ГПО, яка ікислгоє глутатіон, відновлюючи гідроперекиси ліпідів та інших органічних полук. Ці дані можна пояснити алостеричним інгібуванням ИАВРН, ниженням концентрації відновленого глутатіону та глікозилюванням ферменту

'аблиця 3.3. Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантного ахисту у тромбоцитах щурів з експериментальним стрептозотоциновим цабетом (М±ш, п = 8-Ю)

Показник Контроль ІЗЦД ІЗЦД+НАм

^упероксиддисмутаза, ум. д. на мг білка 1,85±0,03 !,12±0,09* 1,74+0,04**

.аталаза, мкмоль І202 за хв на мг білка 3,80±0,Ю 2,70±0,09* 2,90±0,05

'лутатіонпероксидаза, імоль вБН за хв на мг ілка 580,20±23,50 406,14±15,10* 487,15+17,15**

! - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05 '* - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

! тромбоцитах при даній патології (МаггапН Ь., 1997). Функціонування ГПО існо спряжене з функціонуванням глутатіонредуктази, яка регенерує вБІІ з .7880 форми, що накопичується при активації тромбоцитів. Зростання іктивності ГР у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, спричинене збільшенням вмісту

та ИАОРН при діабеті (Великий М.М., 1995). Накопичення продуктів ТОЛ при ІЗЦД та експериментальному стрептозотоциновому діабеті, що Збувається на фоні зниження активності ферментів антиоксидантного захисту 5 інсуліннечутливих тканинах, зокрема в тромбоцитах, є одним з провідних факторів, які впливають на активацію останніх, таким чином прискорюючи розвиток судинних ангіопатій, характерних для даної патології. Це відбувається внаслідок порушення стуктури плазматичної мембрани та активації біосинтезу громбоксану В2 (Шаталина Л.В. 1993; \Vinocour Р.Ю. 1994).

4. Дослідження впливу нікотинаміду на агрегацію тромбоцитів, зміст продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту іри діабеті. У хворих після курсу терапії нікотинамідом спостерігали термалізацію процесу агрегації тромбоцитів, під дією тромбіну. Зокрема шижувалися ступінь агрегації на 20%, та швидкість агрегації у першій фазі процесу на 16% у порівнянні з даними, отриманими при тестуванні діабетичних громбоцит]в (рис. 1.1, табл. 1.1). Однак, введення нікотинаміду суттєво не зпливало на агрегацію кров’яних пластинок у другій фазі процесу, а, отже, на метаболізм арахідонової кислоти та секрецію тромбоцитарних гранул.

Ці дані частково можуть пояснюватись гіполіпідемічним та

антиоксидантним ефектом нікотинаміду, бо вже після двотижневого курсу йоі введення, відбувається зниження рівня агерогенних ліпопротеїні триацилгліцериш'в і холестерину плазми крові (ІсІо У., 1997).

У наших експериментах введення нікотинаміду спричиняло зменшені вмісту діенових кон’гагатів та ТБК-позитивних продуктів на 31% і ЗО? відповідно у тромбоцитах хворих ІЗЦЦ. У щурів із експериментальнії стрептозотоциновнм діабетом вміст дієнових кон’югатів знижувався на 19% (таб 3.1). Отримані дані свідчать про сповільнення вільнорадикальних процесів кров’яних пластинках за цих умов.

Введення нікотинаміду викликає в тромбоцитах людей та щурів достовірі зростання активності важливого ферменту антиоксидантного захисту - СОД (таб.

3.2, 3.3), що може бути пов’язане із зниженням ступеня модифікації фермент глюкозою та вільними радикалами кисню (ТакШ І., 1996). Особливо це стосуєтг.с молодих тромбоцитів, частка яких при цукровому діабеті зростає (Грабарчук 0.1 1998). Активність каталази за цих умов зростає не суттєво.

Нікотинамід, як попередник біосинтезу нікотинамідних коферментів, фактором, що селективно впливає на систему піридинових нуклеотиді: викликаючи, значне, в 4-5 разів, підвищення рівня їх окислених форм і в значи меншій мірі відновлених (Великий М.М. і ін., 1992), знімаючи таким чішо алостеричне інгібування ГПО ИАБРН. Поряд з цим, нікотинамід волод; гіпоглікемічним ефектом, що призводить до сповільнення процесі неферментативного глікозилювання та окисної модифікації білків (Великий Н.Н. др., 1995). За цих умов активність ГІІО у тромбоцитах людей та іцурів зростала н 10% та 19% (рис. 3,2, 3.3). Одночасно спостерігалась нормалізація активності ГР кров’яних пластинках людей при цій патології (рис. 3.2).

Отже, отримані результати свідчать, що введення нікотинаміду сприж нормалізації процесу тромбін-індукованої агрегації, активності ферментії антиоксидантного захисту, сприяє зниженню інтенсивності ПОЛ у тромбоцита; при ІЗЦЦ.

ВИСНОВКИ

1. Підвищена чутливість тромбоцитів до дії тромбіну при ІЗЦЦ зумовлені активацією процесів фосфорилювання, інтенсифікацією процесів ПОЛ т; зниженням активності основних ферментів антиоксидантного захисту.

2. У тромбоцитах людей при ІЗЦЦ зростає рівень фосфорилювання ж залишках тирозину ряду специфічних білків, які приймають участь з передачі внутрішньоклітинного сигналу. Отримані результати свідчать пре активацію тирозинових протеїнкіназ у кров’яних пластинках за цих умов.

3. Стимуляція тромбоцитів тромбіном супроводжується активацією транслокацією протеїнкінази с-Бгс у цитоскелетну фракцію. При ІЗЦД ) тромбоцитах людей включення с-Эгс кінази у детергент-нерозчинну фракцію відбувається інтенсивніше, а динаміка процесу має чітко виражений фазниґ

характер. Показано, що основна роль у інтеграції протеїнкінази c-Src у цитоскелет належить БИЗ-домену молекули ферменту, що специфічно зв’язується з білками з мол. масою 70 та 125 кДа.

. Посилення зв’язування регуляторної субодиниці р85а з цитоскелетом у стимульованих тромбіном кров’яних пластинок вказує на активацію РІ 3’-кінази при ІЗЦД.

. Тромбоцити хворих на ІЗЦД та щурів із' експериментальним стрептозотоциновим діабетом характеризуються посиленням процесів ПОЛ (зростання вмісту дієнових кон’югатів та ТБК-позитивних продуктів), зниженням активності основних ферментів антиоксидантного захисту (СОД, ГПО та каталази).

і. Введення нікотинаміду людям, хворим на ІЗЦД та щурам з стрептозотоциновим діабетом викликає зниження ступеня та швидкості агрегації тромбоцитів, гальмування процесів ПОЛ (зниження вмісту дієнових кон’югатів і ТБК-позитивних продуктів) та зростання активності ферментів антиоксидантного захисту, при ІЗЦД.

Список опублікованих праць здобувача.

• Махневич Т.Р.. Дробот Л.Б., Великий М.М., Сергієнко О.О., Токарева Л.В., Урбанович А.М. Агрегаційна та антиоксидантна активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Експериментальна і клінічна біохімія та фізіологія. - 1998. - № 3-4. - С. 85-89.

!. Махневич Т.Р.. Дробот Л.Б., Урбанович А.М., Кривко Ю.А., Сергієнко О.О., Великий М.М.. Вплив нікотинаміду на агрегаційну та антиоксидантну активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Ендокринол. - 2000. - 5, №1. - С. 40-46.

5. Великий М.М., Бурда В.А., Сергієнко О.О., Оліярник О.Д., Махневич Т.Р.. Козицький З.Я. Вплив нікотинаміду на стан киснево-транспортної системи периферичної крові при цукровому діабеті // Ліки. - 1997. - №5. - С.17-23

І. Оліярник О.Д., Великий М.М., Махневич Т.Р. Особливості гальмування активності каталази 3-аміно-1,2,4-триазолом в еритроцитах і печінці щурів зі стрептозотоциновим діабетом // Укр. біохім. жури. - 1999. - 71, № 1. - С. 7782.

5. Makhnevvch Т.. Drobot L., Serhiyenko A., Koval’chuk R., Fedyk M., Veliky M. Increased platelet agregation and pp60c SRC phosphorylation in diabetes mellitus // Diabetologia Polska. - Wroclaw (Poland). - 1999. - vol.6 supl. 1. - P.l 10.

5. Makhnevvch T.. Veliky M., Drobot L. Increased platelet agregation and protein phosphorylation in diabetes mellitus II Г* International Conference on Signal transduction. - Dubrovnic (Croatia). - 1998. - P. 101-102.

7. Velikiy/М., Oliyamyk O., Makhnevvch T. Nicotinamide prevents the oxidative stress in streptozotocin induced diabetic rats II 2-Pamas Conference. - Gdansk (Poland). - 1998.-P. 45-46.

8. Великий Н.Н., Бурда В.А., Махневич Т.Р. Олиярник Е.Д. Антиоксидаитны свойства никотинамида при диабете // Труды V Междунар. конференції “Биоантиоксидант”. - Москва (Россия). - 1998. - С. 34.

9. Махневич Т.Р- Гамазіна Н.В., Великий М.М. Застосування нікотшіаміду корекції метаболічних порушень при експериментальному цукровому діабет // Збірник статей міжнародної науково-практичної конференції “Сучаси проблеми біології ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва”. - Львів (Україна). - 1997. - С. 12.

10.Fedyk M.Y., Oliyamyk O.D., Makhnevvch T.R. Effect of nicotinamide oi hemoglobine glicosylation and antioxidant defensive enzymes in erythrocytes о streptozotocine diabetic rats // Fourth international student’s scientific conference

- Gdansk (Poland). - 1996. - P. 5.

Махневич Т.Р. Біохімічні механізми підвищеної чутливості тромбоцитів ді дії тромбіну при інсулінзалежному цукровому діабеті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук з; спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАІ України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено дослідженню біохімічних механізмів активаці тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті (ІЗЦЦ), що є однією і: причин розвитку діабетичних ангіопатій. В роботі використано ряд сучасній методів біохімії і молекулярної клітинної біології для з’ясування причіп підвищеної чутливості тромбоцитів до дії природного агоністу - тромбіну прі ІЗЦЦ.

Виявлено інтенсифікацію процесів фосфорилювання сигнальних білків зміни у функціонуванні протеїнкінази c-Src, регуляторної субодиниці РІ З’ кінази, після стимуляції тромбоцитів тромбіном при ІЗЦЦ у людей, що свідчиті про активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які регулююті адгезивні властивості та агрегацію кров'яних пластинок. Продемонстроване зростання інтенсивності процесів ІІОЛ у тромбоцитах, ізольованих із кров щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом та хворих на ІЗЦЦ що відбувається на фоні зниження активності ферментів антиоксидантногс захисту. Введення нікотинаміду сприяло зниженню ступеня і швидкост тромбін-індукованої агрегації, інтенсивності процесів ПОЛ та нормалізаці' активності ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦВ та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Результаті: роботи дозволяють зробити висновок про доцільність використанні; нікотинаміду в комплексній терапії з метою попередження розвитку судинних ускладнень при цукровому діабеті.

Ключові слова: агрегація тромбоцитів, c-Src кіназа, РІ З’-кіназа, тромбін перекисне окислення ліпідів, система антиоксидантного захисту, нікотинамід.

Гахиевич Т.Р. Биохимические механизмы повышенной чувствительности ромбоцитов к действию тромбина при инсулинзависимом сахарном иабете. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук л специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. О.В.Палладина АН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению биохимических механизмов тшации тромбоцитов при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИЗСД), го является одной из причин развития диабетических ангиопатий. В работе спользован ряд современных методов биохимии и молекулярной клеточной иологии для выяснения причин повышенной чувствительности тромбоцитов к ействию естественного агониста - тромбина при ИЗСД.

Обнаружена интенсификация процессов фосфорилирования белков, зменения в функционировании протеинкиназы c-Src, регуляторной убъединицы PI 3’-киназы, после стимуляции тромбоцитов тромбином при [ЗСД у людей, что свидетельствует об активации внутриклеточных сигнальных утей, регулирующих адгезивные свойства и агрегацию тромбоцитов. Продемонстрировано увеличение интенсивности процессов ПОЛ в ромбоцнтах, выделенных из крови крыс с экспериментальным грептозотоциновым диабетом, а также больных с ИЗСД, которое происходит а фоне уменьшения активности ферментов антиоксидантной защиты. Введение икотинамида приводило к уменьшению степени и скорости тромбин-ндуцированной агрегации, интенсивности ПОЛ и нормализации активности ерментоп антиоксидантной защиты в тромбоцитах больных ИЗСД и крыс с кспериментальным стрептозотоциновым диабетом. Результаты диссертации озволяют сделать вывод о целесообразности использования никотинамида в омплексной терапии сахарного диабета с целью предупреждения развития псудистых осложнений.

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, c-Src киназа, PI 3’-киназа, ромбин, перекисное окисление липидов, система антиоксидантной защиты, икотинамид.

fakhnevych T.R. The biochemical mechanisms of increased platelet sensitivity wards thrombin under insulin dependent diabetes mellitus. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by specialty

3.00.04 - biochemistry. - A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National .cademy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the investigation of the biochemical mechanisms of icreased platelet sensitivity towards thrombin which appears to be one of the nportant/causes of vascular complications development in the patients suffering rom insulin dependent diabetes mellitus (IDDM). We have undertaken a complex pproach in order to clarify the mechanisms of increased platelet sensitivity towards ;s natural agonist thrombin as well as investigation of nicotinamide influence on

platelet aggregation in IDDM patients and rats with experimental streptozotocir induced diabetes mellitus.

Using laser aggregometer we have demonstrated that thrombin stimulate diabetic platelets aggregate with higher velocity and stage than control one. It i known that protein phosphorylation processes play an important role in th mechanisms of platelet activation. We have shown an increased level of protei phosphorylation on tyrosine residues in the resting IDDM platelets. Especially thi can be referred to proteins with molecular weight 125 and 95 kDa. Stimulation wit thrombin triggered protein phosphorylation of numerous proteins in both control an IDDM platelets. Although in the last case the level of phosphorylation on tyrosin was higher. We suggest that there may be activation of protein kinases in IDD1\ platelets.

Both protein kinase c-Src (one of the best represented phosphotyrosine kinas in platelets) and phosphtidilinosit 3-kinase (PI3’K) translocate to the cytoskeleto when platelets become activated. We have observed that in IDDM platelet translocation of c-Src kinase and regulatory subunit of P13’K - p85a occur extensively than in the control experiments. It was demonstrated that SH3-domain o c-Src kinase plays the main role in the process of translocation and specificall; interacts with 70 and 125 kDa proteins. Although these interactions are significantl impaired in diabetic platelets. Obtained results indicate that such alterations in th mechanisms of c-Src and PI3’K activation can fully contribute to the increase* platelet sensitivity towards thrombin in the IDDM platelets.

We consider that the intensification of the lipidperoxidation processes in th platelets isolated from people suffering from IDDM and rats with experimenta streptozotocine induced diabetes mellitus is one of the major causes that effect platelet membrane fluidity, agonist receptor affinity and may modulate platcle hypersensitivity towards agonists. Increased content of diene conjugates am thiobarbituric acid (TBA) reactive substrates in the diabetic platelets may occu partly due to the decrease of the antioxidant enzymes activities. Decrease in th activity of superoxide dissmutase (SOD), glutathione peroxidase (Gpx) and katalas may occur as a result of their modification by the oxygen radicals or / and glucose Low antioxidant enzyme activity may intensify structure damages of the cell protein and lipids by reactive oxygen metabolites.

Nicotinamide treatment was performed during 14 days by intramuscl injection with dose of 200 mg per kg of rats weigh with experimental streptozotocim induced diabetes mellitus and 1 ml of 5 % solutions of nicotinamide twice a day fo patients with IDDM.

Nicotinamide therapy had positive effects on the process of IDDM platcle aggregation. We have observed the decrease of velocity and stage of diabetic platele aggregation. Along with the improvement of curve aggregation parameters we havi demonstrated a considerable decrease in the content of lipidperoxidation products -diene conjugates and TBA - positive reagents as well as normalization of the activit; of main antioxidant enzymes - SOD and Gpx in both platelets of IDDM patients am

ats with experimental streptozotocin-induced diabetes mellitus. Making conclusions iased on the obtained results we can suggest application of the nicotinamide reatment in the complex therapy of the diabetes mellitus with the goal to prevent levelopment of vascular complications.

Cey words: platelet aggregation, c-Src kinase, PI3’-kinase, thrombin,

ipidperoxidation, antioxidant defense systems.