Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования системы фруктозо-2,6-бифосфата в ткани печени крыс при стрептозотоциновом диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования системы фруктозо-2,6-бифосфата в ткани печени крыс при стрептозотоциновом диабете"

от РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ел

НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ химии ю На правах рукописи

УДК 516.3/9-008.64-092-074

МАРКОВА Марина Станиславовна

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ ФРУКТОЗО-2,6-БИСФОСФАТА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОМ ДИАБЕТЕ

(специальность 03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: член — корреспондент РАМН, профессор

КОРОВКИН Б.Ф.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук Доктор биологических наук

СЕВЕРИНА И.С. ВАСИЛЬЕВ А.В.

Ведущая организация:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится "¿6" __ 1996 года в

/ / ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Пошдинская, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ био — медицинской химии РАМН

Автореферат разослан Л^ " 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат бнологачесхих наук

Былинкияа В.С.

- з-

ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сахарный диабет — тяжелое хроническое заболевание, характеризующееся расстройством всех видов обмена веществ и, в первую очередь углеводного.

Принято считать, что одним из основных признаков сахарного диабета является гипергликемия, связанная, прежде всего,с нарушением утилизации глюкозы в ткани печени. Однако, несмотря на большое количество работ, посвященных данной проблеме, в последние десятилетие внимание ученых вновь сосредоточено на изучении процессов гликолиза и глюконеогенеза в ткани печени при стрептозотоциновом диабете ( модель ин — сулинозависимого типа диабета). И это связано с открытием в 1980—1981 годах нового соединения — фруктозо —2,6 — бисфосфата1 . Последний является самым мощным, из известных в настоящее время, активатором фосфофруктокиназы — 1 и ингибитором фруктозо— 1,6 — бисфосфатазы2. Синтез и деградация фруктозо — 2,6 — бисфосфата осуществляется бифункциональным ферментом — фосфофруктокнназой — 2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазой3 . Изучение регуляции системы фруктозо — 2,6 — бисфосфата в условиях стрептозотоцинового диабета может дать новое объяснение причинам нарушения обмена углеводов в ткани печени при сахарном диабете.

Б последнее десятилетие четко показано, большинство пероральных антидиабетических препаратов (производные сульфоиилмочевины, бигуаниды, недавно прошедший клинические испытания японский препарат "СБ — 045"--( + )—5 — [4 —

(б — гидроксн — 2,5,7,8—тетраметнлхроман — 2 —

1 Van Schfftingen et al. Biochem J. , 1080, v. 10?, p.897-901

2 Clans T.H. et aJ. Curr. Top. Regul., 1984, v.23.p.57-86

3 Rosseu G.G,, Hue L. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 1993,v.45,p.99— 127

илметокси)бензил] —2,4 — тиазолидондмон4 а, так же разрабатываемые новые антидиабетические препараты, в терапевтических дозах не оказывают влияния на секрецию инсулина р — клетками островков Лангерганса5 . Был сделан вывод, что многие из этих препаратов усиливают действие инсулина, воздействуя через его пострецепторный механизм6. Доказано также, что гипогликемический эффект ряда уже существующих и вновь разрабатываемых пероральных антидиабетических препаратов связан с их влиянием на систему фруктозо — 2,6 — бисфосфата в ткани печени7. В этой связи исследования состояния системы фруктозо — 2,6 — бисфосфата при экспериментальном стрепто — зотоциыовом диабете, а также молекулярных механизмов rano — гликемическош эффекта ванадата представляется весьма актуальными.

Цель и задачи исследования

В качестве модели диабета 1 — га типа использовался стрептозотоциновый диабет у крыс. Исследовалась ткань печени, а также гепатоциты, выделенные из ткани печени больных и здоровых животных. Основной целью работы явилось изучение особенностей функционирования системы фруктозо — 2,6 — бисфосфата в ткани печени при экспериментальном стрепто — зотоциновом диабете. Исходя из основной цели, бытии поставлены следующие задачи:

4 Mori K. et al. Metabolism - Clinical and Experimental, 1992, v.41, p.708-710.

Murano K. et al. Eur. J. Pharmacol., 1994, v.254, p.257-262.

5 Aoki M. et al. Diabetes, 1992, v.41, p.334-338.

6 Simonson IXC. et al. Diabetes, 1904, v.33, p.838-845.

Flaig W.E. et al. Diabetes, 1984, v.33, p.285-290. Murano K. et al. Eur. J. Pharmacol., "1994, v.254, p.257-262.

7 Matsuda M. et al. Diabetes Res. Clin.. Pract., 1986, v.2, p.347 - 403.

Gil J, et al. J. Biol. Chem., 1988, v.263, p.1868-1871.

1. Исследование киназнон активности бифункционального фермента (фосфофруктокиназы — 2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазы) и определение уровня фруктозо —2,6 — бисфосфзта в ткани печени в условиях стрептозотоцинового диабета.

2. Исследование активности печеночной фруктозо—1,6 —

бисфосфатазы.

3. Исследование механизма действия ванадата на уровень глюкозы в крови и систему фруктозо — 2,6 — бисфосфата при экспериментальном диабете.

Изучит новизна и практическая значимость работы

В результате проделанной работы было четко показано, что основные изменения в системе фруктозо —2,6 — бисфосфата при стрептозотоциновом диабете происходят вследствие усиления процесса фосфорилирования фосфофруктокиназы —

2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазы с помощью цАМФ — зависимой протеинкиназы, что приводит к снижению его киназной активности и уменьшению содержания фруктозо— 2,6 —бисфосфата в ткани печени. Кроме того , при стрептозотоциновом диабете увеличивается активность печеночной фруктозо — 1,6 — бисфосфатазы и уменьшается ее чувствительность к ингиби — рующему действию фруктозо — 2,6 — бисфосфата, в результате чего снижается скорость гликолиза и усиливается глюконеогенез.

Ванадат препятствует фосфорилировакию бифункционального фермента, тем самым увеличивает его киназиую активность, а так же повышает содержание фосфофруктокиназы — 2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазы в ткани печени, в результате чего уровень фруктозо — 2,6 — бисфосфата возрастает, а уровень глюкозы в крови резко снижается, Ванадат также ингибирует активность фруктозо—1,6 —бисфосфатазы в результате чего усиливается скорость гликолиза и снижается глюконеогенез.

Полученные данные способствуют разработке новых антидиабетических препаратов, активную субстанцию которых составляют соединения, содержащие ванадий.

Материалы диссертационной работы были доложены на 4 —ом научном съезде специалистов по клинической лабораторной диагностике (Беларусь, 1992), на конференции "Актуальные проблемы эндокринологии" (С.-Петербург, 1993), на 15 Международном конгрессе по клинической химии (Австралия, Мельбурн, 1993), на 10-ом ШСС Европейском конгрессе по клинической химии (Франция, Ница, 1993) . Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинехой химии РАМН: энзимологии экстремальных состояний, медицинской биотехнологии, физиологически активных петидов и гуанилатциклазной системы, конструирования и синтеза минимальных функционально — активных белковых фрагментов, биохимии и патохимии углеводного обмена 25 июня 1996 года.

По теме диссертации имеется 10 публикаций.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц и 15 рисунков, и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты исследований и их обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список цитируемой литературы".

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на крысах — самцах линии \Vistar, массой 200 — 250 г. В опытах участвовали контрольные (здоровые) и диабетические крысы. Экспериментальный диабет вызывали единичной внутри брюшинной инъекцией стрелтозотоцина (60 мг/кг веса). За ходом развития диабета следили по появлению в моче глюкозы и кетоновых тел, по повышению уровня глюкозы в крови, по увеличению потребления воды и диуреза, по снижению

массы тела. Затем животных декантировали, собирали кровь и брали печень для дальнейших исследований. В сыворотке крови определял« содержание глюкозы.

Объектами исследования были гомогенаты печени крыс; взвесь гепатоцитов ( гепатоцнты выделяли с помощью двухступенчатой перфузии по Сеглену8); частично очищенные фракции, , содержащие фосфофруктокиназу— 2/фруктозо — 2,6 —

бисфосфатазу, выделенные из печени крыс по методу Colosia9, а также частично очищенные фракции , выделенные из печени крысы, содержащие фруктозо — 1,6 — бисфосфатазу, полученные по методу Week и Nimmo10.

Определение содержания фруктозо — 2,6 — бнсфосфата (ф — 2,6 —Р2) проводили по методу, предложенному Van Schaftingen11. Метод основан на способности фруктозо —2,6 —бисфосфата активировать пирофосфатзависимую фосфофруктокиназу (РРН — ФФК), выделенную из клубней картофеля. Определение содержания Ф —2,6 —Р2 осуществляли путем сравнения степени активации РРн — ФФК в присутствии известной концентрации Ф — 2,6~Р2 (строится калибровочная кривая) и Ф —2,6 —Р2, содержащемся в исследуемом образце (в данном случае в гепато — цитах или ткани печени). Непосредственно активность РРн — ФФК определяли спектрофотометрически (при 340 нм) по скорости окисления НАДН в системе, сопряженной с альдолазой, триозофосфатизмеразой и глицерол— 3 — фосфатдегидрогеназой.

РР-ФФК выделяли из клубней картофеля по методу, предложенному Van Schaftingen (1982).

Исследование киназной активности фосфофруктокиназы— 2/фруктозо -2,6 — бисфосфатазы проводили по методу Bartrons12.

8 Seglen P.O. In: Methods in Cell Biology, WewYork, London, Academic Press, J976,v. 13, p.30 - 03.

9 Colosia A.D. et al. J. Biol. Chcm., 1988, v.263, p. 18669- 18677.

10 Weelt D.W., Nimmo H.B. Biochem. J., 1984, v.222, p.125- 130.

" Van Schaftingen et al. EurJ. Biochem., 1982, v. 129, p.191 - 195.

i2 Bartrons R. et al. Biochem.J., 1983, v.214, p.829-837.

"Активную форму" фермента определяли при рН 6,6 и ненасыщающей концентрации субстрата (1мМ фруктозо — б — фосфата); определение "общей активности" фосфофруктокина— зы —2 (ФФК —2) проводили при рН 8,5 и насыщающей концентрации субстрата (5 мМ фруктозо —6 —фосфата). Для определения активности ФФК— 2 проводили преинкубацию фермента в присутствии фруктозо —6 —фосфата и АТФ с целью образования Ф — 2,6 — Р2 , последний определяли по методу, описанному выше.

Оценку степени фосфорилирования ФФК —2/ФБФазы —2 осуществляли путем сравнения соотношения активностей ФФК — 2, измеренных при рН 6,6 и при рН 8,5. Метод основан на изменении кинетических свойств фермента при изменении рН среды13.

Активность фруктозо — 1,6 —бисфосфатазы (ФБФазы) исследовали по методу, предложенному Nimmo и Timpton14. Определение активности ФБФазы проводили спектрофотомет— рически (при 340 нм) по скорости восстановления НАДФ+ в системе, сопряженной с фосфогексоизомеразой и глкжозо— 6 — фосфатдегидрогеназо й.

Изучение влияния ваиадата (Na3V04) на систему фруктозо — 2,6—бисфосфата проводилось нами на суспении гепатоцитов, выделенных из печени диабетических крыс, а также в опытах с пероральным введением ортованадата натрия диабетическим крысам. Ванадат вводили в дозе 0,3 мг на 1 мл питьевой воды. За сутки потребление ванадата крысами составляло 18 ± 2 мг/кг веса.

Содержание белка определяли по методу Bradford13.

13 Van Schafliiigen Е. eL al. Biochem. Biophys. Res. Commun., J981, v.103, p.362-368.

14 Nimmo H.G., Timpton К.Г. Methods in Enzymoiogy, i982, v.SO, p.330-334.

15 Bradford MM. Anal. Biochem., 1976, v.72, p.248-254.

Полученные результаты были обработаны статистически с использованием Т— критерия Стыодеита. Экспериментальные данные представлены к виде средних величин с указанием их среднеквадратичной ошибки (М ± т).

Основные результаты псследохшггая и их обсуждение 1. Изменение содержания лактата и уровня фруктозо-2,6-бисфосфата при стрептазотоциновом диабете.

Как уже отмечалось, что при сахарном диабете происходят весьма существенные изменения в функционировании и регуляции углеводного обмена. Одним из наиболее изученных аспектов метаболизма углеводов при сахарном диабете являются реакции гликолиза и глюконеогенеза. Конечным продуктом гликолиза является лактат. Определение содержания лактата в гептоцитах, полученных от диабетических животных показало, что оно в 4,5 раза снижено по сравнению с количеством лактата, определяемым в печени здоровых крыс (см. табл.1).

Таблица 1

Содержание лактата в среде инкубации суспензии генатоцнтоз здоровых (контроль) н диабетические крыс

Условия опыта Лактат (мкмоль/мг белка)

Здоровые животные (контроль) 0,138 ±0,010 (4)

Стрептозотоциновый диабет 0,053 ± 0,006 * (9)

Примечание. В скобках число определений, * - р < 0,001

Как известно, ключевым ферментом , регулирующим поток углеводов по пути гликолиза , является фосфофруктокиназа — 1 . Основным аллостеротеским активатором ФФК — 1 служит фруктозо - 2,6 — бисфосфат . Определение ф —2,6 —Р2 в печени стрептозотоциновых крыс показало, что его содержание при диабете значительно снижено по сравнению с контрольными (здоровыми) животными (см. рис. 1 ) и составляет 5,2 ± 0,2 имоль/г ткани в контроле и 0,9 ± 0,02 нмоль/г ткани при диабете.

Таким образом, снижение уровня Ф —2,6 —Р2 при диабете коррелируем с изменением содержания лактата в генатоцшах, полученных от диабетических крыс, что, скорее всего, говорит о низкой скорости гликолиза в печени диабетических крыс.

к д

Рис.1 Содержание Ф-2,6~Р2 в гепатоцнтах здоровых (контроль-К) и больных диабетом (Д) крыс.

Примечание: различия достоверны по сравнению с контрольными животными (* р<0,01 ); в каждой группе было по 8 крыс.

Данный факт может обьясняться несколькими причинами, главной из которых, по —видимому, является изменение киназной активности бифункционального фермента — фосфофрукто — киназы — 2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазы (ФФК — 2/ФБФазы — 2).

2.Измвнение киназной активности фосфофруктокинаэы-2/фруктозо-2,6-бисфосфатазы при стрептозотоциноеом диабете.

Определение активности ФФК —2, в частичноочищеиной фракции, выделенной из печени крыс, показало, что она снижена в печени диабетических крыс по сравнению с. контрольными животными (см . таблицу 2 ).

Таблица 2.

Активность ФФК-2 в тк;шп печени Kpi.EC с норме к при сгрентозотошшоком диабете

Активность ФФК-2 пмоль/мин на мг белка

Группы животных "Активная форма" рН 6.6 "Общая активность" рИ 8,5 Отношение активностей рНб,в/рН а,5

контроль 2,6 + 0,02 5,5 ± 0,05 0,47 ± 0,03

диабет 0,7« + 0,01 * 3,25 + 0,01 * 0,24 +0,05 *

р < 0,01 п=3 р < 0,05 п=8 р < 0,01 п=3

Напомним, что, регуляция активности бифункционального фермента в печени осуществляется путем коиалентной модификации ФФК —2 /ФБФазы —2 с помощью цАМФ — зависимой протеинкнназы16. Известно, что инкубация бифункционального фермента в присутствии каталитической субъедишщы цАМФ — зависимо!! протеинкнназы приводот к снижению его киназной активности и увеличению бисфосфатазной активности17. О степени фосфорилпрования бифункционального фермента принято судить, сравнивая соотношения киназной активности бифункционального фермента, измеренной при рН 6,6 и ненасыщающей концентрации Ф —б —Р (1 мМ) (определение так называемой'активной формы" фермента (нефосфорилированной) и измеренной при рН 8,5 и насыщающей концентрации ф —6 —Ф (5 мМ) (определение "общей активности" ФФК —2)18. Метод основан на изменении кинетических свойств фермента при изменении рН среды . Ранее Van Schaftmgen н соавт. было по —

|в Pi Ik is S.J. et. al. Adv. in Second Messenger and Phosphoprotein Resaerch, 1ЭД8, v.22, p. 175- 191.

17 Olau.s Т.Н. et al. Curr. Top. Cell. Kegul. ,1984, v.23, p.57-86.

,ri Bartrons R. et al. Biochem. J., 1083, v. 214, p.829-837.

кззчно19, что иефосфорилнропанная форма фермента имеет пик киназной активности при рН 6,6, который исчезает при фос ~ форилировашш фермента. Активность ФФК — 2, определяемая при рН 8,5, изменяется при этом незначительно.

Как видно пз представленной выше таблицы, кпназная активность бифункционального фермента, измеренная при рН 6,6 снижается в 3,3 раза; активность, измеренная при рН 8,5, в 1,7 раза , а соотношение активностей почти в два раза. Из приведенных данных можно сделать следующие выводы: кину зная активность бифункционального фермента снижается вследствие увеличения фосфорилирования ФФК — 2/ФБФазы — 2 с помощью цАМФ — зависимой протеннкиназьт, что приводит к уменьшению уровня Ф —2,6 —Р2 при диабете. Кроме того , снижение киназной активности б и ф ун к ц и о налъ н о го фермента при рН 8,5 может быть обусловлено уменьшением общего количества фермента при стрептозотоциновом диабете, что, вероятно связано с изменением экспресии гена ФФК —2/фБФазы —2. Имеются сведения, что индукция гена бифункционального фермента усиливается в присутствии инсулина , т. е. увеличивается содержание мРНК ФФК —2/ФБФазы —2м и снижается в присутствии цАМФ (РШ-ая БЛ. е1 а!., 1988). Таким образом, снижение уровня ф —2,6 —Р2 при стрептозотоциновом диабете может также объясняться снижением уровня мРНК бифункционального фермента.

Как известно, при стрептозотоциновом диабеге наблюдается изменение соотношения гормонов: инсулин/глюкагон. Уровень инсулина оказывается значительно понижен, так как стрепто — зотоцин повреждает (3 — клетки островкового аппарата, секре — тирующие инсулин21. В то лее время уровень глюкагона значительно возрастает, что приводит к увеличению содержания цАМФ в ткани печени и активации цАМФ — зависимой про —

19 Van Schaffinrien Е. et al Biochem. Biophys. Res. Commun,, 1981, v.101, p. 1078- 1084.'

20 Miralpeix M. Diabetologia, 1992, v.35, p.24.3 --24G.

7) Srivgstsva L.Ivi. Trencis in Pharmacologica) Science, 1982, v.3, p.376 — 373.

теинкиназы. Это в свою очередь вызывает фосфорилирование отдельных белков , в том числе и ФФК--2/ФБФазы — 2, что в конечном результате приводит к снижению уровня Ф —2,6 —Р2 и падению скорости гликолиза.

По —видимому, существуют и другие механизмы, ведущие к уменьшению содержания Ф —2,6 —Р2 в гепятоцитах при стреп — тозотоциновом диабете. Так показано, что при экспериментальном стрептозотоциновом диабете в ткани печени имеет место резкое снижение активности глкжокиназы, несмотря на высокое содержание в сыворотке крови глюкозы — субстрата данного фермента22. Снижение активности глкжокиназы приводит к падению скорости фосфорнлировання глюкозы, э затем к снижению содержания Ф —6 —Ф — субстрата бифункционального фермента (Gil J. et al., 1983 ), а следовательно к торможение гликолиза и усиление глюконеогенеза.

3. Изменение активности фруктозо-1,6-бисфосфатазы

при экспериментальном диабете .

Уменьшение содержания Ф —2,6 —Р2 в гепатоцнтах диабетических крыс сопровождается активацией ФБФазы — ключевого фермента глюконеогенеза. Нами показано, что общая активность ФБФазы, выделенной из' печени крысы увеличивается с 9,75 ± 0,35 ед/г в контроле до 15,45 ± 0,20 ед/г ткани при диабете, а удельная активность с 0,09 ± 0,01 ед/мг белка в контроле до 0,14 ± 0,015 ед/мг белка при диабете (рис.2, 3 ) Увеличение активности ФБФазы в печени крысы ш vivo связано со снятием ингибирутощего эффекта Ф —2,6 —Р2 — аллостерического ингибитора ФБФазы, концентрация которого снижена при диабете. Увеличение общей и удельной активности ФБФазы при стрептозотоциновом диабете можно объяснить стимуляцией индукции гона ФБФазы в присутствии повышенного уровня цАМФ23.

22 Gil G. J. Biol. Chem. 1988, v.263, p.lG68- 1871.

23 El —Magbrabi M.R. .1. Biol. Chem, 1991, v.266, p.2115-2120.

В присутствии, ф —?,6 —Р2 кривая зависимости активности ферменте от концентрации субстрата меняется с гиперболической на сигмонднуго, при этом исчезает иигибнровзние фермента высокими концентрациями субстрата (рис.4).

■О X

Ь С5

О и

0

X и.

а —.

£ ©

3

1 «

£ ®

э е

ю ш

о л

К Д

Рис.2 Общая активность ФБФазы

в печени контрольных я диабетических: крыс , п = 5, р < 0,01

М Я.

Е с

« о

о ю

о ^

Ё ч:

га в>

К

X

.а

с

® _

« е

0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 О

•

¡¡Й!

щ

М

¡В

И , <

К

А

Рис.З Удельная актисиость ФСФгзы, выделенной из печень: контрольных (здоровых) и больных диаОоток крыс; п = С, р < 0,01

Величина [й]05 для кривойингибирования ФБФазы в присутствие ф —2,6 —Р2 равна )2 мкМ, тогда как. К^ для фругстозо — 1,6 — бисфосфага в отсутствии ингибитора равна 6 мкМ, что свидетельствует об уменьшении сродства фермента к субстрату в присутствии ингибитора (см. рис..4).

-1-1-!-}-!-1-!-1-1-8-(-(-1-1

10 20 30 40 50 60 70 83 90 100 ПО 120 130 НО 150

фрукта™-1, (г-бисфосфат, л«<М

-безФ-2,б-Р2

&—с4.'хкМФ-2,6-Р2

Рис.4 Кривые пависиностп активности ФБФазы от концентрации Ф-1,6-Рг ^дя определения коэффициента Хилла был построен график

зависимости 1д

Ут - V

от ]д[5]:

0,4

0,2

>

> 0

'¿3 (

га -0,2

-0,4

Ж

А.

1,1 1,2

6 + 1д [0-1,6-Р2]

О

3

Рис. 5. График Хилла для фруктозо-1,6-бисфосфатазы

Рассчитешпыи из ото го графика коэффициент Хилла равен '¿,2, что свидетельствует о полояиггельной кооперативное™ при связывании ф — 2,6— Р2 с фруктозо1,6 — бисфосфатазой, а так лее показывает, что число центров связывания Ф —2,6—Р2 в молекуле фермента больше двух.

4. Изменение чувствительности фруктозо-1,6-6исфосфатазы к ингибирующему действию Ф-2,6-Р^ при стрептозотоциновом диабете.

Было установлено, что в ткани печени у крыс после введения стрептозотоцина величина [1]05 (т.е. концентрация ф — 2,6 —Р2, при которой наблюдается 50% ингибирования активности фермента) увеличивается почти в 3 раза с 2-х до 6 мкМ Ф — 2,6 —Р2 (см. рис.6 ).

сз

С! О

Я

а

и и

о о

Я Б!

К «5

Г\ Я

О

100 & 90 НО 70 60 50 40 30 20 10

X

2

4

Фрухтазо-2, 6-бисфм.фат, лв<М

0

о

—О—Дб1а6ст ■—Д—кшпршо* —

Рис. 6 Ингибирование фруктозо-2,6_бисфосфатом активности ФБФазы из здоровых и больных диабетом крыс.

Причиной изменения чувствительности ФБФазы к действию ф —2,6—Р? при диабете может быть модификация

...

молекулы фермента в результате ограниченного протеолнза или фосфорнлирования. Известно, что ограниченный протеолиз ФБФазы, осуществляемый специфической нротсазой, приводит к повышению активности фермента, измеренной при щелочном рН. Иными словами, о протеолитнческой модификации фермента можно судить по отношению активностей ФБФазы при рН 7,4 и рН 9,4. Обычно (т.е. без участия ограниченного протеолнза) это отношение равно 4,0 — 5,5 . Оказалось, что у стрептозотоци — новых крыс (диабет), как и у контрольных (здоровых) крыс, отношение активности ФБФазы при рН 7,4 к активности, измеренной при рН 9,4 равно 4,3 ± 0,2. Полученные результаты говорят о том, что вряд ли протеолитическая модификация имеет место при стрептозотоциновом диабете. Скорее всего изменение чувствительности ФБФазы к действию Ф —2,6 —Р2 при диабете связано с фосфатной модификацией фермента. Можно предположить, что, существует взаимосвязь между степенью фос — форилирования ФБФазы и чувствительностью фермента к ин — гибирующему действию Ф — 2,6 — Р2. Напомним, что в печени крысы ФБФаза является субстратом для цАМФ — зависимой протеинкнназы24.

5. Влияние ванадата (NasVO*) на систему фруктозо-2,6-бисфосфата

в печени диабетических (стрептозотоциновых) крыс

Изучение влияния ванадата (Na3V04) проводилось нами на суспензии гепатоцитов, выделенных из печени контрольных и диабетических крыс, а так же в опытах in vivo с пероральным введенном ортованадата натрия.

Сначала нами был изучен эффект различных концентраций ванадата на уровень Ф —2,6—Р2 в гепатоцитах, выделенных из печени диабетических крыс (рис.7 ). Гепатоциты преинкуби — ровалпсь при 37° С в присутствии 10 мМ глюкозы. После пре — инкубации к пробам добавляли ортованэдат (Na3V04) в раз —

24 Ekdahl K.N., Ekman Р. Biochem. Biophys. Acta, 1987, v.929, p.31S-326.

- т

личных концентрациях ¡0,5; 1, 2 и 5 мМ) и продолжали инкубацию еще 20 мин.

Как видно из данного рисунка, увеличение концентрации добавленного ванадата приводит к увеличению содержания ф — 2,6 —Р2 в гепатоцитах диабетических крыс более чем в 3 раза, при концентрации ванадата 1 мМ.

а ж <з и

£ $

■о К

3,5

2 5

1,5

0,5

О -ь

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 4,5 5 Ваиадат натрии (мМ)

Рис. 7 Влияние ванадата на содержание Ф-2,6~Р2 в гепато-цитах, выделенных из печени диабетических крыс

Отмечено также, что в присутствии добавленного ванадата продукция лактата гепатоцитами увеличивается ( рис.8). За двадцать минут инкубации в гепатоцитах, полученных из печени диабетических животных и инкубируемых е присутствии ванадата продукция лактата увеличивалась в 1,7 раза по сравнению с гепатоцитами, инкубируемыми в отсутствие ванадата.

0,12

с:

I 0,02---

т <1

О --!-1

О 10 20

ере.т 1вщ€чщ<и (мл)

Рис.8 Эффект ванадата на продукцию лактата а суспензии гепатоцитов, выделенных из печени диабетических крыс

Ранее, группой испанских исследователей было показано25, что под влиянием экзогенного глюкагона и цАМФ содержание Ф — 2,6 — Р-2 в инкубируемой суспензии гепатоцитов заметно уменьшается. Одновременное же добавление к инкубационной среде глюкагона , цАМФ и ванадата снижает эффекты глюкагона и цАМФ, т.е. содержание Ф —2,6 —Р2 в присутствии ванадата практически нормализуется.

Этот эффект отмечали и мы в своих экспериментах (рис.9). Как видно из рисунка, уровень Ф —2,6 —Р2 заметно повышается в геяатоцитах, выделенных из печени диабетических крыс и преинхубированных в присутствии Ю мМ глюкагона и 2 мМ ванадата.

25 ЯосМдиег —СИ ХЕ. е1 а1. ПтЬеЮ.«, 1991, </.40, р. 1355- 1359.

о

&

- « у §

3

«Ч

4

©

2Г5 2 1,5 I

0,5 0

2 4 6 8 время инкубации (мин)

410

ч 12

—&г-10мМ глюкагои

-10 мМ глюкагон и 2 мМ ванадат

Рис. § Влияние вавадата на уровень Ф-2,6~Рг в гепатоцнтах, получеп-ных от диабетических крыс.

Нами также исследовалось влияние перорального введения ортованадата натрия на уровень глюкозы в крови и содержание Ф — 2,6 ~Р2 в ткани печени у контрольных и больных диабетом крыс. Отмечено, что под влиянием ванадата содержание Ф —2,6 — Р2 в ткани печени больных диабетом крыс возрастало, а уровень глюкозы в крови на 5 —6 —е сутки эксперимента снижался ( см. таблицу 3)

Таблица 3

Влияние ванадата на уровень глюкозы в крози и содержание Ф-2,б-Рг в ткани печени контрольных ( здоровых) и больных диабетом крыс

Группа животных Уровень глюкозы в крови, ммоль/л Содержание ф—2,6-Р2, нм оль/г ткапн

контроль 6,5 ± 0,4 5,2 + 0,2

контроль + ванадат 6,2 1 0,3 5,5 ± 0,4

диабет 23,4 ± 1,2 • 0,9 ± 0,02 «

диабет + ванадат 15,3 ± 1,3 »• 4,2 ± 0,2 *•

Примечание. В каждой группе било по 5 крыс. * — Р < 0,05 по сравнению с группой контроль, ** — р < 0,05 по сравнению с группой диабет.

Кроме того, нами была исследована активность фосфо — фруктокиназы — 2, частично очищенного препарата бифункционального фермента, выделенного из ткани печени крыс, получавших ванадат (см. таблицу 4 ) .

Таблица 4

Влияние калэдата на кзшаз.чую активность фосфо^зруктокгшаэы-2/фруктозо-2,б-б!гсфосфатазы

Группы животных "Активная форма" рН 8,5 пмоль/мпи па мг белка "Общая активность" рН 8,5 нмоль/миэ на мг белка Отношения активностей рН 8,6/рН 8,5

Диабет 0,78 ± 0,01 3,25 ± 0,15 0,24 ± 0,01

Диабет + ванадат 2,0 ± 0,15 • 4,3 1 0,02 • 0,42 ± 0,03 *

а =6, р < 0,01 D-S, р < 0,05 п=8, р < 0,01

При даче диабетическим крысам ванадата имеет место повышение активности ФФК —2, особенно измеренной при рН б,б (в 2,6 раза), при рН 8,5 — в 1,5 раза. Соотношение активностей при рНб,б и рН 8,5 увеличивается в 1,8 раза.

Нами также исследовалось влияние ванадата па активность ФБФазы, выделенной из печени диабетических крыс. Оказалось, что в присутствии 300 мкМ ванадата активность ФБФазы снижается на 25%, а в присутствии 1,5 мМ ванадата на 75% (опыты проведены in vitro) (рис.10).

100 it

0

—-'-tl—■

100 200 300 1500

Ванадат, мкМ

Рис. 10 Влияние ванадага на активность ФБФазы, выделенном из печени диабетических крыс

Итак, ванадат увеличивает уровень Ф—2,6—Р2 в гепато — цитах, полученных от диабетических крыс ( см. рис.6) и в печени стрептозотоциновых крыс, которым давали per. os. ванадат с питьевой водой (см. табл.3).

Кроме того, ванадат увеличивает продукцию лактата в гепатоцитах, полученных от диабетических крыс (см. рис. 8) и снижает уровень глюкозы в крови почти в 3 раза (см. табл.3). Все это говорит о стимуляции ванадатом процессов гликолиза в печени диабетических крыс.

Увеличение уровня Ф — 2,6 — Р2 сопровождается повышением киназной активности бифункционального фермента (см.табл.4). Соотношение для киназной активности, измеренной при рН6,6 и рН 8,5 увеличивается почти в 2 раза, что свидетельствует о снижении степени фосфорилирования бифункционального фермента. Это подтверждается также следующими данными. Как видно из рис.9, ванадат повышает уровень Ф —2,6 —Р2 в печени диабетических крыс, противодействуя эффекту глюкагона. Как было показано, соединения ванадия способны понижать основной уровень активности аденилатциклдзы, повышенный при диабете26 , а также активность цАМФ — зависимой протеин — киназы27 . Все это приводит к снижению процессов фосфорн —

26 Anandrivastava MB. et al. Mol. CelL. Biochem., 1995, v. 153, p. 113- 119

27 Brown R.W., Dong G.W. Mol. Cell. Biochem., 1995, v.153, p.131 - 137

лирования бифункционального фермента и увеличению его киназной активности. Повышение уровня Ф —2,6 —Р2 в печени стимулирует активность фосфофруктохиназы, для которой Ф —2,6 —Р^ является основным аллостерическим активатором.

Нами также установлено, что ванадат способен ингиби — ровать активность фруктозо—1,6 —бисфосфатазы (см. рис. 10). В условиях стрептозотоцинового диабета это ингибирование может приводить к снижению процессов глюконеогепеза. Данное действие ванадата будет усиливаться в результате увеличения уровня Ф —2,6—Р2 , так как известно, что Ф — 2,6 — Р2 является сильным аллостерическим ингибитором ФБФазы.

Есть попытки использовать ванадат в качестве терапевтического препарата для лечения диабета как 1-го так и 2 — го типа (т.е. инсулин— зависимого и инсулин — независимого)28 . Было показано, что метаванадат снижал уровень глюкозы в крови в обоих группах пациентов (Со1сШпе Р.В. е1 а1., 1995).

Однако в последнее время показано29, что использовать ванадат в качестве активной субстанции препарата, обладающего гипогликемическим эффектом, практически нельзя. Во-первых, ванадат плохо всасывается в кишечнике; во —вторых, он токсичен в дозах, достаточных для замены инсулина.

Соединения четырехвалентного ванадия, а именно производные ванадила в виде комплексов с органическими лигандами на порядок менее токсичны, чем ванадат и обладают выраженным гипогликемическим эффектом.

Сегодня известны ванадильные комллексы с мальтолом, цистеином, N — пирролидиндикарбоновой кислотой и другие, обладающие инсулиноподобным эффектом. Есть основания считать, что эти соединения могут служит ь активной субстанцией пероральных антидиабетических препаратов, пригодных для лечения как инсулин —зависимого, так и инсулин —независимого типов диабета.

28 СокШие А.В. сЧ -Л. 3. СПп. Епс1осгуяо1. апс1 Ме1дЬо1., 1995, \'.80, р.0311 — ЗЗУО.

^ Ашзкта А., У1ск)гоуа Ь, Со1иЬе</ М, СоюйеЬкку У., Оо1до</ V., Когоукт В,Р. Эсапг!. .1. От. 1аЬ. 8ирр1„ 1995, ¥.55,' р.223

Выводы

1. При стрептозотоциновом диабете у крыс уровень фруктозо — 2,6 — бисфосфата в ткани печени снижен в 4 —5 раз.

2. Показано, что при экспериментальном диабете у крыс содержание лактата в печени диабетических крыс снижается ( по сравнению с контрольными животными) в 4 раза (с 0,138 ± 0,01 до 0,053 ± 0,006 мкмоль/мг белка).

3. Установлено, что у диабетических крыс имеет место снижение киназной активности бифункционального фермента печени (фосфофруктокиназы — 2/фруктозо — 2,6 — бисфосфатазы) (с 2,6 ± 0,02 до 0,78 + 0,01 и моль/мин на мг белка при рН 6,6). Снижение соотношения активностей ФФК—2, измеренных при рН 6,6 и рН 8,5 связано с увеличением степени цАМФ — зависимого фосфо — рилирования бифункционального фермента.

4. При диабете в ткани печени возрастает общая и удельная активность фруктозо—1,6 —бисфосфатазы ( в 1,6 раза). При этом изменяется чувствительность фермента к аллостерическому ингибитору — Ф —2,6 —Р2 (величина [1]05 увеличивается в 3 раза).

5. В опытах с пероральным введением диабетическим крысам с питьевой водой ортованадата натрия (Na3V04 ) , последний снижает уровень глюкозы в крови (с 23,4 ± 1,2 до 15,3 ± 1,3 ммоль/л )и повышает содержание Ф —2,6—Р2 в ткани печени (с 0,9 ± 0,02 до 4,2 ± 0,2 нмоль/г ткани). При этом киназная активность ФФК —2/ФБФазы —2, измеренная при рН 6,6 увеличивается с 0,78 ± 0,01 до 2,0 ± 0,15 пмоль/мин на мг белка, а соотношение активностей ФФК —2, измеренных при двух рН увеличивается в 1,8 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что ванадат препятствует фосфорилированию фермента с помощью цАМФ — зависимой протеинкиназы.

6. Добавление ванадата к суспензии гепатоцитов, выделенных из печени диабетических крыс (опыты in vitro) и инкубируемых в присутствии глюкагона, приводит к увеличению уровня Ф—2,6 —Р2 .

7. Ванадат является ингибитором фруктозо — 1,6 — бисфосфатазы, что снижает скорость глюконеогенеза в печени диабетических крыс.

Списои опубликованных работ по темэ диссертации

1. Беляева Н.Ф., Голубев М.А., Маркова М.С., Стволинская Н,С., Коровкин Б.Ф. Система фруктозо — 2,6 — бисфосфата и ее роль в метаболизме клетки в норме и при патологии, 4 —й научн,съезд специалистов по клин. лаб. диагностике респ. Беларусь, 'Гез.докл., Гродно, 1992, стр.208 - 209.

2. Голубев М.А., Маркова М.С. Использование пирофосфатза— висимой фосфофруктокиназы для определения концентрации фруктозо —2,6 —бисфосфата в биологическом материале. Клиническая лабораторная диагностика. 1993, N 1, стр.27 —29.

3. Голубев М.А., Маркова М.С., Стволинская Н.С. Содержание фруктозо —2,6 —бисфосфата и активность фруктоза — 1,6 — бисфосфатазы в суспензии гепатоцитов при стрептозотоциновом диабете. Клиническая лабораторная диагностика, 1993, N 6, стр.13—15.

4. Markova М., Golubev М., Yushkina М., Korovkin В., The activity of phosphofructokinase —2 in the liver of diabetic rats . Abstract books. The Clinical Biochemist — Reviews 1993, p.244 XV International Congress of Clinical Chemistry. Annual Conference, Australian Association of Clinical Biochemists 6th Asian — Pacific congress of Clinical Chemistry, 14—19 November, 1993, Melburn, Australia.

5. Korovkin В., Golubev M., Belyaeva N., Markova M., Stvolinskaya N., Positive effect of vanadate on carbohidrate metabolism in hepatocytes from diabetic rats. Abstract book. Annales de Biologie Clinique, v.51. N 3-4-5, 1993 , p.416, Evrolab 93., 10th IFCC European Congress of Clinical Chemistry. Nice, France.

6. Коровкин Б.Ф., Голубев M.A., Беляева II.Ф., Маркова М.С., Стволинская Н.С. Система фруктозо — 2,6 — бисфосфата и сахарный диабет. Тезисы докладов конференции: "Актуальные вопросы эндокринологии", Военно — медицинская Академия, С.Петербург, 1993, стр.91 —92.

7. Korovkin B.F..GoIubev M.A., Stvolinskaya N.S., Markova M.S., Belyaeva N.F., Balabolkin M.L, and Korovkin B.F. The streptozatocm diabetes, fructose--2,6 —bisphosphate system and vanadate. In: Pathobiochemical aspekts of extreme states , Ed. by Korovkin B.F., Mir Publisher, Moscow, 1994, p.68 —77.

8. Коровкин Б.Ф., Беляева Н.Ф., Голубев M.A., Викторова Л.Н. , Городецкий В.К., Маркова М.С., Саяпин A.B., Стволинская Н.С. Система фруктозо — 2,6 — бисфосфата и сахарный диабет. Клиническая лабораторная диагностика. 1994, 2, стр.21—23.

9. Маркова М.С., Голубев М.А., Городецкий В.К., Беляева Н.Ф., Викторова Л.Н., Коровкин Б.Ф. Некоторые особенности функционирования системы фруктозо — 2,6 — бисфосфата в ткани печени при экспериментальном стрептозотоциновом диабете. "Вопросы медицинской химии", 1996, № 3, с.223 — 227.

10. Беляева Н.Ф., Голубев М.А., Маркова М.С., Кольченко O.A., Ламзина H.H., Городецкий В.К., Викторова Л.Н., Балаболкин М.И., Коровкин Б.Ф. Определение фруктозо — 2,6 — бисфосфата в лимфоцитах крови человека — потенциальный клинико — лабораторный тест в диабетологии. "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины", 1996, т.122, № 9, с.341—344.