Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липидный обмен при сахарном диабете и его осложнениях

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липидный обмен при сахарном диабете и его осложнениях"

На правах рукописи

НГУЕНЗАНЬ ХАНЬ

ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЯХ

( экспериментально - клиническое исследование )

03. 01.04 - биохимия 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ ^ 8 ОКТ 2015

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005563880

Москва -2015

005563880

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательно учреждении высшего профессионального образования «Российский национальны исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздра! России (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

1. Доктор медицинских наук, профессор, член корреспондент РАН Терентьев Александр Александрович

2. Доктор биологических наук, главный научный сотрудник НИЛ патологи сердечно - сосудистой системы РНИМУ Микаелян Нина Погосовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

1. Заведующая кафедрой биологической химии Московского государственно медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова, докт медицинских наук, профессор Вавилова Татьяна Павловна. Специальность 03.01.04 - биохимия.

2. Ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ болезне зависимости НИИ общей патологии и патофизиологии РАН, докто медицинских наук Давыдов Борис Васильевич.

Специальность 14.03.03 - патологическая физиология.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Первый Московский государственный медицинский университет имени И. Сеченова.

Защита состоится «'/■р »J/7g ¡с^^рЯу ЗО-У.С' г. в44- ООчасов па заседании

диссертационного совета Д 208.072.14 при ГБОУ ВПО «РНИМУ имени Н. Пирогова Минздрава России»(117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «РНИМ'! имени Н.И. Пирогова Минздрава России» и на сайте http://rsmu.ru

Автореферат разослан «-/-У » ОПЯ^Р^Ь 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость сахарным диабетом (СД) является одной из самых важнейших не только медицинских, но и социальных проблем. Это обусловлено широкой распространенностью заболевания, самой ранней из всех хронических заболеваний ннвалидизацией больных и высокой их смертностью (третье место после сердечно - сосудистой патологии и злокачественных новообразований), ранним выходом на инвалидность лиц молодого, трудоспособного возраста, а также большими экономическими затратами, связанными с заболеванием (М.И. Балаболкин, 2000; A.M. Мкртумян, 2008; И. Дедов, 2011; WHO, 1997). Широкое применение высококачественных препаратов инсулина и других сахароснижающих препаратов, существенно продлевающих жизнь больных, не обеспечивает полной компенсации нарушенного обмена веществ, и не предотвращает развитие многочисленных осложнений, среди которых основное место занимают поражения сердечно - сосудистой системы. Показано, что диабетические ангиопатпн во многом определяют клиническое течение заболевания, его прогноз, являются основной причиной инвалидизации и смертности в промышленно - развитых странах (М.И. Балаболкин, Е.М.Клебанова, 2000; R. Kocic, 2009; S. Choudhuri, 2013).

Многочисленные исследования в этой области свидетельствуют о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. Причем установлено, что в механизмах повышения окислительного стресса (ОС) при диабете участвует не только гипергликемия, но и гипоинсулинемпя. Так же доказано, что хроническая гнпергликемия через повышение скорости аутоокисления глюкозы увеличивает образование свободных радикалов, увеличивая процессы гликозилированпя, приводит к избыточному образованию окисленных белков, а повышенная активность полиолового пути обмена глюкозы способствует истощению запасов НАДФН. Гипоинсулинемпя активирует симпатическую нервную систему и опосредованное катехоламннамн

образование свободных радикалов, а через вызванное катехоламинами повышение уровня ненасыщенных жирных кислот дополнительно увеличивает образование свободных радикалов, н снижает уровень глутатиона (одного из важных водорастворимых антиоксидантов) (Д. Сепе11о, 2000; Еп£е1еп, 2000; А. Ма^Ьггак, 2001; К.В. Антонова, 2008; М.И. Балаболкин, 2000; Ф.А. Гершкорон, 2005). Таким образом, патофизиологические механизмы, определяющие взаимосвязь между дислипидемией и развитием диабетических ангиопатий, окончательно не ясны. Хроническая гипергликемия через повышения скорости аутоокислеиия глюкозы увеличивает образование свободных радикалов, усиливая процессы глнкозилнрования, повышает уровни насыщенных жирных кислот, эти вопросы не до конца изучены. Имеющиеся литературные данные, посвященные изучению состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) у больных с диабетом очень противоречивы и касаются лишь некоторых показателей системы «ПОЛ - АОС». Многие вопросы, связанные с особенностями нарушения липидного обмена, в том числе, обмена жирных кислот в эритроцитах, печени, сердечной мышце и коже у диабетических больных, остаются нерешёнными.

Целью исследования являлось исследование патогенетических механизмов нарушения липидного обмена при сахарном диабете и его осложнениях в эксперименте (на модели стрептозотоцинового диабета) и клинике (при ишемической болезни сердца и других диабетических ангиопатиях).

Задачи исследования:

1. Провести комплексное изучение углеводного и липидного статуса в эритроцитах, печени и коже у крыс на модели стрептозотоцинового диабета.

2. Изучить структурно - функциональные изменения в мембранах эритроцитов н гомогенатах сердечной мышцы, кожи и печени в разные сроки после введения стрептозотоцпна в эксперименте.

3. Выявить особенности нарушения липидного обмена у диабетических больных с ангиопатпями по спектру жирных кислот крови и но изменению активности липопероксидации и антнокислительной защиты клеток.

4. Выявить взаимосвязи между нарушением обмена углеводов, изменением соотношения ПОЛ - АОЗ и развитием дислипидемии у больных с ангиопатпями, а также у пациентов без нарушений углеводного обмена, входящих группу риска по сахарному диабету (н.п. при ожирении).

Научная новизна. Проведен анализ клинических, лабораторных и экспериментальных данных с целью выявления взаимосвязи развития диабетических осложнений от степени развития окислительного стресса, от дислипидемии и нарушения обмена жирных кислот.

Впервые проведено комплексное изучение углеводного и липидного статуса в эритроцитах, сердечной мышце, печени и коже у крыс на модели стрептозотоцинового диабета. Впервые проведено исследование параметров ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в эритроцитах, гомогенатах кожи, печени и сердечной мышцы при экспериментальном стрептозотоцнновом сахарном диабете и дана оценка роли жирных кислот в развитии перекисного окисления липидов.

Впервые показано, что по мере нарастания степени гипергликемии при стрептозотоцнновом диабете в эксперименте и снижения транспорта глюкозы в клетки, гиперлипосинтетическая направленность метаболизма липидов играет важную роль в патогенезе формирования диабетических осложнений.

Впервые проведено комплексное исследование процессов перекисного окисления липидов и антнокислительной системы у больных СД, включающих определение первичных и вторичных продуктов липиднои пероксидацин, изучение различных звеньев АОС, обладающих как внутриклеточной, так и внеклеточной направленностью действия. При этом обнаружено, что не только СД протекает с активацией процессов ПОЛ и нарушениями в системе антиоксидантной защиты, но отмечаются аналогичные нарушения и у пациентов с ожирением. Впервые проведено определение спектра жирных кислот у здоровых пациентов, пациентов с

ожирением, больных сахарным диабетом типа 1 и СД типа 2 и дана развернутая хроматограмма жирных кислот.

Впервые проведен анализ взаимосвязи нарушений спектра жирных кислот, процессов перекисного окисления лнпидов и утилизации глюкозы эритроцитами в зависимости от степени развития окислительного стресса у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов и у пациентов с ожирением, сопровождающимся пнсулинрезистентностью. Установлено, что нарушения в спектре жирных кислот может привести к увеличению концентрации метаболитов ПОЛ и снижению утилизации глюкозы тканями и эти нарушения особенно выражены при СД 1 типа с осложнениями.

Впервые установлено, что у больных женщин с ожирением сопровождающимся инсулинорезистснтностыо, а так же, как и при СД 2 отмечаются качественно однотипные нарушения липидного, липопротеидного и углеводного обменов (повышение уровня ОХ, ТГ, ЛПНП, холестерина ЛПОНП, постпрандиальной глюкозы и др.). Дислипидемия при ожирении и СД 2 имеет атерогенный характер. СД 2 обусловленный дисбалансом ПОЛ-АОА сопровождается более высокой концентрацией переокисленных липопродуктов, снижением параметров антиоксидантных систем и утилизации глюкозы клетками. Ожирение и СД 2 сопровождается модификацией состава свободных и зстерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности инсулин - зависимых транспортеров глюкозы.

Практическая значимость результатов исследования. Изучение механизмов развития дислипидемии, нарушения обмена жирных кислот и системы ПОЛ-АОЗ клеток крови при СД повышает возможности профилактики осложнений заболевания и позволяет предложить новый подход к коррекции нарушений липидного обмена у больных.

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В эксперименте в динамике показано, что метаболические нарушения, усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств эритроцптарных мембран и других тканей, а также нарушения в системе антиоксндантной защиты, происходят уже в дебюте стрептозотоцинового диабета и остаются таковыми на протяжении всего периода наблюдения.

2. При СД 2 типа наблюдается более выраженное нарушение в липндном спектре крови и обмене жирных кислот, увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания активности всех исследуемых ферментов (супероксидднсмутазы, каталазы, кроме глутатионпероксидазы) и в результате этого снижение утилизации глюкозы клетками, по сравнению с группой с ожирением и контролем. Развитие осложнений при СД 1 и СД 2 сопровождается более выраженным нарушением в обмене жирных кислот с повышением суммарного содержания НЖК, плазменного уровня МДА и снижением активности СОД, по сравнению с соответствующими показателями без осложнений.

3. Ожирение и СД 2 сопровождаются модификацией состава свободных и этерифицпрованных ЖК в эритроцитах и плазме крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности ннсулиновых рецепторов и других инсулин-зависимых транспортеров глюкозы. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о важной роли ЖК н их метаболитов в развитии окислительного стресса при ожирении, СД 1 типа и СД 2 типа, что необходимо учитывать при разработке и выборе соответствующих профилактических и терапевтических мероприятии, направленных на предотвращении или устранений выявленных нарушений.

Внедрение результатов исследования. Результаты проведённых исследований внедрены в лабораторную практику центральной научно-исследовательской лаборатории РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия

тканей», «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» студентам РНИМУ им. .И.Пирогова Минздрава.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК Мннобрнауки РФ («Российский медицинский журнал», «Биомедицинская химия», «Бюллетень экспериментальной медицины и биологии»). Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке».

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Молодая паука -XXI века». «Научная молодежь на пороге XXI века», Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных.

Апробация диссертации проведена на совместном заседании сотрудников кафедры биологической химии лечебного факультета и сотрудников научно-исследовательской лаборатории патологии сердечно - сосудистой системы ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Личный вклад автора в исследовании. Автором самостоятельно собрана информация обо всех вошедших в исследование пациентах. Автор самостоятельно провёл подробный анализ современной литературы и исследование лабораторных показателей крови у больных. При экспериментальном СД у крыс автор определял все параметры липпдного обмена и хроматограммы жирных кислот в различных тканях на газ - жидкостном хроматографе с масс спектрометрией. Представленные в диссертации результаты исследований, статистическая обработка и анализ полученных данных выполнены автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы 228 источников, в том числе 112 иностранных). Работа содержит 15 таблиц и проиллюстрирована 21 рисунками и хроматограммами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В соответствии с поставленной целью и задачами было обследовано 163 больных обоего пола в возрасте от 23 до 65 лет, страдающих сахарным диабетом. Все пациенты были разделены на 3 группы, согласно диагнозу.

1-ую группу больных составили 55 человек, с диагнозом «сахарный диабет 2 тип, впервые выявленный». Средний возраст пациентов составил 52 года. Больные поступили в стационар в декомпенспрованном состоянии, течение заболевания было осложнено ИБС, другими ангиопатиями.

2-я группа включала в себя 40 человек в возрасте 23-35 лет с сахарным диабетом 1 типа. Все больные находились в фазе декомпенсации. Данную группу разделили на 2 подгруппы: с осложнениями и без осложнений.

3-я группа включала 38 пациентов с ожирением.

Группу контроля составили 30 человек без эндокринной патологии. Контрольная группа для сравнения с СД 1 типа состояла нз 15 человек того же возраста - призывников, для СД 2 типа - 15 человек 40-65 лет, средний возраст 52 года.

Степень компенсации СД оценивали по уровню гликемии натощак до и более 7,5 ммоль/л и концентрации гликированного гемоглобина (HbAlc). Декомпенсацию углеводного обмена у больных считали при показателе HbAlc более 6,5 %.

Материалом для исследования послужила кровь больных СД. У всех пациентов наряду с клиническим обследованием проводили определение концентрации глюкозы в плазме крови и уровень HbAlc. Об активности процессов ПОЛ в плазме крови и в мембране эритроцитов судили по содержанию первичных продуктов ПОЛ: ГП и ДК, определяемых методом Гаврилова (1983), и вторичного продукта - МДА, для определения концентрации которого использовали метод K.Yagi (1976). Состояние антиоксидантной защиты в плазме крови и в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию общего, восстановленного и окисленного глутатиона измеряемого циклическим методом М.Е. Андерсон (1985), а также по

активности ГПО, СОД, KT. Уровень общих антиоксидаптов исследовали в сыворотке крови больных на анализаторе. Исследование липидиого состава крови включало в себя определение концентрации общего ХС, ТГ, ЛПВП при помощи набора реактивов фирмы Аналитикон (Германия), ЛПНП и ЛПОНП по формуле У.Т.Фридевальда, а КА определяли по формуле А.М.Климова.

Материалом для исследования жирных кислот служили плазма и эритроциты крови, гомогенаты печени, мышц сердца и кожи. Экстракцию липидов из сыворотки крови проводили по методу J. Folch и соавт., после чего осуществляли гидролиз и метилирование жирных кислот методом Kenichi Ichihara и Yumeto Fukubayashi. Применяли метод газ - жидкостной хроматографии с масс спектрометрией (ГХ/МС) Trace GC Ultra ITQ 900 (Thermo Scientific, США, 2009). Прибор калибровали стандартными смесями метиловых эфиров ЖК фирмы «Sigma» (США). Обсчёт и идентификацию пиков проводили с помощью программно-аппаратного комплекса «Analytica for Windows» с использованием IBM Pentium IV 1800. Программное обеспечение для обработки данных: Xcalibur (Thermo); спектральные библиотеки: Mainlib; Microsoft Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований липидного и липопротеидного состава крови свидетельствуют, что у больных СД типа 1 отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями независимо от наличия осложнений (табл.1). Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД 1 у пациентов сопровождается существенными изменениями атерогепного характера. При этом у больных с СД с осложнениями имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов крови. КА повышался у этих больных в 2 раза (р<0,05), по сравнению с контролем на фоне увеличения концентраций ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП.

Повышение содержания общего ХС и ТГ в плазме крови сопровождалось снижением уровня холестерина ЛПВП.

Таблица 1.

Изменение некоторых показателен липидного к лпнопротендного состава плазмы крови у больных сахарным диабетом типа 1 с осложнениями н без осложнений (М ± БО)

Показатель Контрольная группа (п=15) Больные сахарным диабетом типа 1 без осложнений (п = 25) Больные сахарным диабетом типа 1 с осложнениями (П = 23)

ЛПВП, ммоль/л 7,55 ± 0,29 6,13 ±0.25 Р| < 0,05 5,72 ±0,32 р, > 0.05; р2 < 0.05

ЛПНП, ммоль/л 11,83 ±0,41 11,28 ±0,32 Р1 > 0,05 13,75 ±0,55 р, < 0,05; р2< 0.05

ЛПОНП, ммоль/л 1,38 ± 0,11 2,38 ±0,12 Р1> 0,05 3,33 ± 0,29 р,< 0,01; р2< 0.01

Общий холестерин, ммоль/л 4,39 ± 0,29 6,68 ± 0.24 Р1 < 0,05 8,37 ±0,26 Р1 < 0,001; р2< 0,01

Триглицериды, ммоль/л 1,72 ±0,11 2,36 ±0,09 Р1 < 0,05 2,44 ±0,13 р, < 0.001; р, < 0.0!

ХС/ФЛ 0,911 ±0,26 0,960 ±0,03 Р1 < 0,01 0,960 ±0,09 р,< 0.01; р2> 0.05

ХС ЛПВП, ммоль/л 1,49 ± 0,12 1,13 ±0.18 р, < 0.05 1,19 ± 0,18 р, < 0.05; р2> 0.05

ХС ЛПНП, ммоль/л 2,6± 0,2 3.38 ±0,18 Р1 < 0.05 3,38 ±0,06 р, < 0,05; р2> 0,05

Примечание: Р-достоверность по отношению к контрольной группы; р/ -

уровень значимости различий по сравнению со значениями в контрольной группе; р; -уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП - липопротеины низкой плотности, ЛПОНП -липопротеины очень низкой плотности, ЛПВП - липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности.

Изучение уровня липидной пероксидации у больных СД типа I показало увеличение содержания как первичных, так и вторичных метаболитов ПОЛ по сравнению с контрольной группой (табл.2). В обеих группах (как без осложнении, так и при их наличии) уровень эритроцитарного и плазменного МДА, а также

содержание ДК повышены в сравнении с контрольными величинами. Также показано достоверное повышение уровня плазменного МДА при развитии осложнений по сравнению с группой больных, не имеющих осложнений.

Таблица 2.

Содержание МДА и ДК в эритроцитах и плазме крови при СД I с осложнениями и без осложнений (М ± 80)

Показатели Здоровые лица СД I типа

без осложнений с осложнениями

МДА в эритроцитах, мкмоль/мл 0,53 ± 0,02 п = 28 0,92 ±0,01 р < 0,001 п = 25 0,95 ± 0,02 р < 0,001 п= 17

МДА в плазме, мкмоль/мл 0,75 ± 0,03 п = 28 1.16 ± 0.01 р< 0.001 п = 25 1,21 ±0,02 р < 0.001 р2< 0,05 п= 17

ДК в эритроцитах, ммоль/мл 0,57 ±0,03 п = 28 0,97 ±0,05 р < 0,001 п = 23 0,96 ± 0,07 р < 0,001 п= 18

Примечания: р• статистически достоверные различия с показателями здоровых па11иентов, р2- статистически достоверные различия с показателями больных не имекнцих осложнений СД типа 1.

Накопление продуктов пероксидации может вести к появлению в мембранах своеобразных пор за счёт увеличения содержания гидрофильно модифицированных углеводородных хвостов, а также к увеличению её жёсткости, за счёт снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, влиять на состояние ннсулиновых рецепторов, снизить их гормонсвязывающую активность и привести к снижению потребления глюкозы клетками.

Подтверждением этому являются полученные нами данные по определению утилизации глюкозы эритроцитами.

ЕЭ контроль без инс. и без инс. □ контроль с инс. о с инс.

Рис.1: Утилизация глюкозы эритроцитами in vitro у больных СД 1 типа

У больных с СД снижается как базальное, так и стимулируемое потребление глюкозы эритроцитами, особенно значительно при СД типа I осложнённого ангиопатиями.

Наряду с увеличением интенсивности СРО липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарной мембраны при СД типа 1 наблюдаются разнонаправленные изменения в системе антиоксидантной защиты.

У больных СД 1 типа активация процессов ПОЛ сопровождается достоверным снижением концентрации СОД и повышением активности КТ и ITIO по сравнению с контрольной группой, при этом достоверно снижается и активность ГбФДГ 1,75 раза (табл.3). Количество общих антиоксидантов повышено в 0,5 раза, по-видимому, за счет КТ и ГПО.

Таблица 3.

Активность ферментов антиоксидантнон защиты у больных с осложнениями СД 1и без осложнении СД (М ± вО)

Показатели Здоровые лица СД1

без осложнений с осложнениями

сод, Ед/гНЬ 1113,55 ±51,76 п = 20 955,69 ±55,94 0,1 > р > 0,05 п = 20 765,80 ± 130,87 р < 0,01 п = 8

КТ, Едх 104/гНЬ 8,71 ±0,18 п = 23 9,46 ±0,14 р < 0,01 п= 19 9,08 ± 0,32 р > 0,05 п= 10

ГПО, Ед/гНЬ 89,69 ±2,01 п = 10 56,60 ± 4,79 р < 0,001 п= 10 53,38 ±2,76 р < 0,001 п= 10

ГбФДГ, Ед/гНЬ 7,71 ±0,12 п= 14 4,40 ±0,18 р < 0,001 п= 14 4,49 ± 0,08 р < 0,001 п= 14

Примечания: р- статистически достоверные различия с показателями в контроле.

Исходя из того, что основным субстратом ПОЛ являются ПНЖК, можно ожидать увеличения жёсткости мембран, а, следовательно, нарушения проницаемости и функций данной- клетки. Увеличение жёсткости связано с изменением соотношения содержания ННЖК/НЖК в сторону увеличения насыщенности жирных кислот, так как прямые углеводородные цепн легче взаимодействуют между собой. Все эти изменения липндного состава являются результатом активации ПОЛ и служат причиной нарушения структуры и функций клеточных мембран. Особенно важно при СД усиление ПОЛ в р - клетках островков Лангерганса, поскольку они имеют слабую антиоксидантную защиту. В связи с этим возникает вопрос о возможной роли ПННЖК в антиоксидантной защиты клеток. Наши исследования показали, что у пациентов с СД I отмечались увеличение суммарного содержания насыщенных жирных кислот (НЖК) и уменьшение суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе; наиболее выраженные в группе больных с СД I с осложнениями (на 12,1 и10,1% соответственно) (табл.4 ).

Таблица 4.

Уровень жирных кислот в плазме крови у больных с СД I с осложнениями и без осложнении,по сравнению с их уровнем у контрольной группы (% от суммы жирных кислот, М ± 81))

Семейство ПНЖК Жирные кислоты Контрольная группа (п = 15) Сахарный диабет 1 с осложнениями (п = 20) Сахарный диабет 1 без осложнений ( п = 22)

ш 3-ПННЖК 20:5 (ЭПК) 22:6 (ДГК) 0,6 ±0,12 2,2 ± 0,8 0,3 ± 0,03 * 1,0 ±0,23 * 0,5 ±0,08* 1,2 ±0,2 *

(об-ПННЖК 18:2(линолевая кислота 20:3(дигомо -у линоленовая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) 24,0 ±3,5 0,3 ± 0,05 4,3 ± 1,9 39,3 ±5,4* 0,6 ± 0,2 * 5,7 ±2,1 * 36,0 ±7,9* 0,4 ±0,01 5,3 ± 1,8

ЕшЗ- ПННЖК 2,8 ±0,1 1,3 ±0,2 1.7 ± 0,1

Гшб- ПННЖК 28,6 ±3,1 45,6 ±4,2 41,7 ±6,3

шЗ-ПННЖК /со 6-ПННЖК, ед. 0,097 0,028 0,040

Б НЖК 31,87 ±3,01 38,60 ±2,90* 35,32 ±2,35 *

2) ННЖК 68,13 ±2,35 61,4 ±2,7* 64,68 ±3,21

НЖК/ ННЖК, ед 0,46 ± 0,05 0,63 ± 0,02 * 0,55 ±0,01*

Примечания: *- отличия достоверны по сравнению с контрольной группой (р< 0,05), Г- сумма.

В пуле НЖК максимальное повышение отдельных фракций отмечается у больных СД с осложнениями: миристиновой (С 14:0) кислоты - на 76%, пальмитиновой (С16:0) - на 35,8%, стеариновой (С18:0) - 24,8% по отношению к контрольной группе. У пациентов с осложнениями СД 1, в течение всего периода наблюдения отмечалось умеренное снижение суммы полиеновых жирных кислот (ПННЖК) на 9,3% по сравнению с её значениями в контроле. Анализ концентрации отдельных ПННЖК показал, что уровень а-линоленовой (С18:ЗсоЗ) кислоты снизился на 63,7% по сравнению с контролем, а также повысилось содержание

арахидоновой (С20:4ш6) кислоты на 32% по отношению к контролю. Таким образом, суммарный уровень а>6 — ПННЖК при СД1 был повышен, а уменьшение коэффициента о>3 — ПННЖК/ыб-ПННЖК (за счет низкой концентрации а-линоленовой кислоты на 17,3%, ЭПК - на 50% и ДГК на 52% от контрольных значений) отмечалось в течение всего периода наблюдения. Приведенные результаты свидетельствуют, что у пациентов с СД 1-го типа с осложнениями установлены более выраженные нарушения жирнокислотного состава крови за счет группы ЖК омега-3 и омега-6, сохранявшиеся в течение всего периода наблюдения. При этом отмечено увеличение коэффициента НЖК/ННЖК, максимально выраженные в начале исследования. Эти изменения связаны, по-видимому, с тем, что при липолизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов перекисного окисления липидов у больных при СД типа 1.

Таким образом, у больных СД типа 1 отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛГТНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями независимо от наличия осложнений. Эти изменения свидетельствуют о развитии дислипидемии атерогенного характера.

В группе больных с ожирением и СД типа 2 установлено, что при СД 2 происходят более значительные изменения в липидном составе крови по сравнению с группой больных с ожирением; повышение уровня общего ОХ, ТГ, ЛПНП и ЛПОНП, которые отрицательно коррелируют с показателями потребления глюкозы эритроцитами (г = -0,7). Гипертриглицеридемля сопряжена с повышением содержания ЛПОНП и увеличенному поступлению ЖК, по-видимому, вследствие отсутствия ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП. Также отмечалось снижение как базального, так и стимулируемого потребления глюкозы эритроцитами по сравнению с контролем (р < 0,05). При О отмечалось увеличение концентрации всех продуктов ПОЛ в плазме крови, которые имели наибольшие значения у больных с СД типа 2. При этом определяется

взаимосвязь между соотношением глюкоза/ инсулин натощак и систолическим АД (г =0,71; р<0,05).

Дислипидемия сопровождалось активацией свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) у больных с ожирением и СД 2, что привело к снижению утилизации глюкозы (УГ) в цитомембранах Эр (р<0,05). Это привело к значительному снижению активности ферментов - антиоксидантов, например, активность Сигп-СОО при СД 2 снижается в 1,83 раза (р<0,05), утилизация глюкозы эритроцитами - в 1,93 раза(р<0,01) (табл.5).

Таблица 5.

Изменение некоторых показателей антиоксндантной защиты и утилизации глюкозы эритроцитами у различных групп больных женщин (М ± 8Э)

Группа АОЗ, ммоль/л сигп-соо, ед/мг НЬ Катал аза, ед/мг НЬ Глутатион-пероксидаз, ед/мгНЬ Утилизация глюкозы Эр, мкмоль (2х109)кл/час

Контроль (п = 25) 56,7 ±2,3 1380 ±31 622 ±2,8 48,6 ± 0,6 1,68 ±0,05

Ожирение (п= 15) 41,7 ±2,4* 923 ± 29* 510 ± 4,3* 46,0 ±0,6 0,93 ±0,04*

СД2 (п= 25) 39,9 ±1,1* 752 ±23* 490 ±3,9* 40,3 ±0,57 0,87 ±0,03*

Примечание: *- достоверно по сравнению с контролем (р < 0,05).

Достоверное снижение инсулинсвязывающей активности (ИСА) и утилизации глюкозы (УГ) в этих группах свидетельствует также о наличии инсулннрезистентности (ИР). Резко выраженная гипергликемия, т.е. значительное снижение степени утилизации глюкозы, а также активности ферментов антиоксндантной защиты при высокой степени пероксидации липидов, отмечается особенно в группе больных с СД 2.

В пуле НЖК максимальное повышение отдельных фракций отмечается также у больных СД 2: миристиновой (С14:0) кислоты - на 76%, пальмитиновой (С16:0) -на 35,8%, стеариновой (С18:0) - 24,8% по отношению к контрольной группе. Анализ

концентрации отдельных ПННЖК показал, что уровень а-линоленовой (С18:3б)3) кислоты при СД 2 снижается на 63%, при О - напротив, повышается на 38% (р<0,05). При СД 2 по сравнению с контролем, повышается суммарное содержание £о6-ПННЖК более чем в 2 раза (табл.6).

Таблица 6.

Уровень жирных кислот в плазме крови у больных с ожирением и сахарным диабетом типа 2, по сравнению с их уровнем у контрольной группы (% от суммы жирных кислот, М ± БЭ)

Семейство ПНЖК Жирные кислоты Контрольная группа (п = 28) Ожирение (п= 15) Сахарный диабет 2типа (впервые выявленный) (п = 30)

ш 3-ПННЖК 20:5 (ЭПК) 22:6 (ДГК) 0,6 ±0,12 2,2 ±0,8 0,45 ± 0,07 2,18 ±0,09 0,36 ±0,03* 1,23 ±0,23 *

шб-ПННЖК 18:2(линолевая кислота 20:3(дигомо-у линоленовая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) 14,0 ±3,5 0,3 ± 0,05 8,3 ±1,9 11,98 ±0,28* 0,88 ±0,12 6,14 ±0,98 39,3 ±4,1 * 0,7 ± 0,2 * 5,01 ± 1,1 *

ХшЗ- ПННЖК 2,9 ±0,1 2,73 ±0,12 1,6 ±0,4*

Гш6- ПННЖК 23,6 ±3,1 19,5 ±3,4 48,6 ±3,2*

(УЗ-ПННЖК 1ш 6-ПННЖК, ед. 0,097 0,14 0,028

2НЖК 31,87 ±3,01 35,00 ± 2,05 38,60 ±2,20 *

1ННЖК 68,13 ±2,35 65, 00 ±3,21 61,2 ±2,3*

НЖК / ННЖК, ед 0,46 ± 0,05 0,54 ±0,01 0,63 ± 0,02 *

Примечание: *- отличия достоверны по сравнению с контрольной группой (р< О,05), Е- сумма.

Возрастание суммарного уровня шб —ПННЖК имеющее место при СД2, сопровождается уменьшением коэффициента шЗПННЖК/шб-ПННЖК, что было обусловлено низкой концентрацией а-линоленовой кислоты, а также ЭПК и ДГК (30% и 52% соответственно). Отмечались прямые корреляционные взаимосвязи

между активностью СОД и а-линоленовой кислотой (г = + 0,53; р < 0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (г = +0,47; р < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (г = + 0,67; р < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-З ПННЖК в крови больных с СД 2 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ (р < 0,05).

Суммарное соотношение омега-З/омега-6 (р < 0,05) снижалось за счет повышения суммарной активности СОД+КТ (г = -0,763; р < 0,05; п=19).

Также отмечено увеличение коэффициента НЖК/ННЖК. Эти изменения связаны, по-видимому, с тем, что при липолизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов перекисного окисления липидов у больных при О и СД типа 2. Следовательно, анализ полученных данных свидетельствует, что у больных СД 2 типа и у пациентов с О отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольной группой. Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД 2 у женщин, также, как и при О сопровождается дислипидемией атерогенного характера. При этом у больных с СД 2 типа имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов, в том числе жирнокислотного состава крови.

Исследование углеводного и липидного статуса в эритроцитах, сердечной мышце, печени и коже у крыс на модели стрептозотоцинового диабета показало, что уровень глюкозы в крови у крыс на третьи сутки после введения стрептозотоцина достоверно увеличился в 3,2 раза, а в моче - в 5,7 раз, по сравнению с контрольной группой животных. В течение последующих дней наблюдений количество глюкозы в крови крыс этой группы животных также оставалось стабильно высоким (рис.2).

20 15 10 5

гЬ -т.

п

□

г-

Контроль. Здня. 7 дней 1а дней. 21 дней. 28 дней 35 дней

После инъекции стрептозотоцина

Рис.2: Динамика концентрации глюкозы после введения стрептозотоцина крысам.

Параллельно к гипергликемии в зависимости от длительности времени после введения стрептозотоцина возрастала и концентрация МДА и других ТБК -активных продуктов, во всех изучаемых нами тканях, достигая высоких значении на 28 сутки после введения стрептозотоцина (рис.3, рис.4).

г-£п

Контроль. Здня. 7 дней 14 дней. 21 дней. 28 дней 35 дней

После инъекции стрептозотоцина

Рис.3: Концентрация МДА в эритроцитах крыс (мкмоль/литр, М ± вО)

Повышение активности ТБК - метаболитов было особенно значимым в гомогенатах кожи и печени на 28 сутки после введения стрептозотоцина (р< 0,05). Как видно из представленных рис.8, концентрация ТБК активных веществ в гомогенатах кожи и печени на 28 сутки введения стрептозотоцина возрастает более чем в 2 раза (до 0,254 ±0,012 при 0,123 ± 0,001 в контроле - в печени и до 0,141 ± 0,002 в коже по сравнению с контрольным уровнем 0,062 ± 0,003 нмоль/мг ткани ).

Контроль. Здня. 7дней 14дней. 21 дней. 28дней 35дней

После инъекции стрептозотошшя

Рис.4: Концентрация ТБК-ап. в ткани кожи, печени и сердечной мышцы (нмоль/мг ткани, М ±

Наряду с увеличением интенсивности СРО липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарной мембраны при стрептозотоциновом диабете наблюдается изменения в системе антиоксидантной защиты. Так, показано, что в крови у крыс имеет место повышение активности КТ(рис.5). Возрастание активности КТ в эритроцитах больных диабетом можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности СРО СД, в то время когда другие компоненты АОС оказываются значительно чувствительнее к усилению окислительных процессов в клетке, что проявляется снижением активности других ферментов - антиоксидантов (СОД, ГПО).

Н-| + гЬ и И

1+1

Контроль. Здня. 7дней 14 дней. 21 дней. 28 дней 35дней

После инъекции стрептозотоцння

Рис.5: Значение активности каталазы в крови у крыс (мкат/литр, М ± вБ)

Таблица 7.

Уровень жирных кислот в эритроцитах и гомогенатах печеночной ткани у крыс на 7-10 день после введения стрептозотоцина (% от суммы жирных кислот, М ± БО)

Жирные кислоты Эритроциты (контроль) (п = 10) Эритроциты (опыт) (п = 10) Гомогенаты печени (контроль) (п = 10) Гомогенаты печени (опыт) (п= 10)

20:5 (ЭПК) 22:6 (ДГК) 1,003 ±0,020 4,436 ±0,511 1,32 ±0,03 * 4,75 ±0,23 * 0,270 ± 0,047 4,84 ±0,83 0,532 ±0,44* 5,950 ±0,08*

18:2(линолевая кислота) 20:3(дигомо-у линолеповая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) 14,221 ±0,140 0,30 ± 0,02 13,746 ±0,479 13,81 ±0,49* 0,75 ±0,21 * 11,09 ±0,091* 20,46 ± 0,25 0,38 ±0,01 19,27 ± 1,08 21,26 ±0,27* 0,43 ± 0,09 17,51 ±0,96

1НЖК 43,116 ± 1,916 54,354 ± 0,70* 36,691 ±0,087 39,944 ± 0,548'

£ННЖК 56,884 ± 1,916 45,646 ±0,70' 63,309 ±0,087 60,056 ± 0,548*

НЖК/ ННЖК 0,759 ±0,059 1,191 ± 0,034' 0,580 ±0,002 0.665 ±0,015'

И 0)3 5,67 ±0,41 6,28 ±0,53 * 5,49 ± 0,95 6,91 ±0,05*

2 0)6 28,68 ±1,35 25,94 ± 0,79* 34,88 ±0,91 38,92 ± 0,66*

£ 0)7 1,69 ±0,05 1,23 ±0,08 * 1,85 ±0,01 0,81 ±0,06*

X 0)9 20,983 ±1,330 12,19 ±0,45 16,31 ±0,93 13,38 ±0,06

Примечание:*- отличия достоверны по сравнению с контрольной группой

(р< 0,05), I- сумма.

Как видно из табл.7, в пуле НЖК максимальное повышение уровня отдельных фракций в Эр отмечается,в опытной группе крыс, на 7-е сутки после введения стрептозотоцина: миристиновой (С14:0) кислоты - на 56%, пальмитиновой (С16:0) -на 45,8%), стеариновой (С18:0) - 24,8% по отношению к контрольной группе. Между тем, содержание мононенасыщенных жирных кислот (ЖК) пальмитоолейновой и миристоолейновой было достоверно низким.

Таким образом, при стрептозотоциновом сахарном диабете в эксперименте уже в ранние сроки развития патологии отмечаются значительные изменения в липидном и липопротеидном составе крови сопровождающиеся гипертриглицеридемией и гиперхолестеринемией, повышением уровней ЛПОНП и

ЛПНП со снижением концентрации ЛПВП и утилизации глюкозы эритроцитами. Повышение уровня насыщенной пальмитиновой жирной кислоты сопровождается снижением уровней МННЖК (за счет олейновой ЖК), что существенно отличается от соответствующего спектра у больных СД. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уже на ранних стадиях развития СД изменения в липидном составе и пуле жирных кислот изучаемых тканей (эритроцитов, гомогенатов печени,кожи и сердечной мышце) имеет атеросклеротическую направленность.

ВЫВОДЫ

1. Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом типа 2 по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом типа 1 и характеризуются значительным увеличением содержания в крови липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина. Выраженность указанных изменений при сахарном диабете зависит от длительности заболевания, наличия декомпенсации углеводного обмена и сосудистых осложнений.

2. СД у больных протекает с активацией процессов липидной пероксндации, проявляющейся увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ, изменениями структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран, а также нарушениями в системе антиоксидантной защиты, которые имеют разнонаправленные изменения. Содержание ДК и МДА в крови больных СД 2 увеличивается уже в ранние сроки заболевания. При увеличении срока заболевания наблюдается тенденция к повышению как эритроцитарного, так и плазменного уровня МДА, тогда как содержание ДК возрастает в более поздние сроки заболевания.

3. У больных с осложнениями СД 2 относительно пациентов без осложнений выявляется более выраженное повышение плазменного уровня МДА и снижение активности СОД.

4. Развитие декомпенсации у больных СД 2 типа сопровождается более выраженным увеличением содержания ДК, а также снижением степени утилизации глюкозы эритроцитами и активности ферментов тиосульфидного обмена, СОД, КТ и Г6ФДГ, по сравнению с соответствующими показателями в группе компенсированного диабета.

5. Изучение особенностей липидного и жирнокислотного метаболизма при стрептозотоциновом сахарном диабете у крыс показало, что уже в ранние сроки развития диабета отмечаются значительные изменения в липидном и липопротеидном составе крови, сопровождающиеся гипертриглицеридемией и гиперхолестеринемией, повышением уровней ЛПОНП и ЛПНП со снижением концентрации ЛПВП и утилизации глюкозы эритроцитами. Изменения в липидном составе и пуле жирных кислот эритроцитов и гомогенатов печени, кожи и сердечной мышце аналогичные и свидетельствуют о том, что во всех изучаемых тканях дислипидемия имеет атеросклеротическую направленность.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования могут иметь научно-практическое значение, так как выявленные изменения в липидном обмене и антиоксидантной защите в эритроцитах больных СД могут отражать метаболическую ситуацию во всем организме, что может быть использовано с целью своевременной диагностики и предупреждении диабетических осложнений.

Полученные результаты указывают на целесообразность добавления к традиционной инсулинотерапии антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов уже на ранней стадии заболевания с целью защиты клеток организма от токсического воздействия метаболитов липопероксидации и активных форм кислорода, а также для профилактики сосудистых осложнений сахарного диабета.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нгуен З.Х.. Взаимосвязь между процессом пероксидации липидов и антиоксидантной системы от жирнокислотного состава крови у больных сахарным диабетом I типа и его осложнениях/ Микаелян Н.П., Нгуен З.Х., Турина А.Е., Терентьев A.A., Микаелян К.А.// Российский медицинский журнал. 2014; №4: С. 3239.

2. Нгуен З.Х.. Метаболические нарушения в мембранах эритроцитов и гомогенатах печеночной ткани при сахарном диабете в эксперименте/ Микаелян Н.П., Нгуен З.Х., Терентьев A.A.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; №2: С.154-158.

3. Нгуен З.Х.. Нарушение обмена жирных кислот при ожирении и сахарном диабете 2 у женщин с инсулинрезистентностью/ Микаелян Н.П., Нгуен З.Х., Микаелян A.A.// Российский медицинский журнал. 2015; №6: (принята к печати).

4. Нгуен З.Х.. Особенности изменения состава жирных кислот крови при ожирении и сахарном диабете 2 типа у женщин репродуктивного возраста/ Микаелян Н.П., Терентьев A.A., Нгуен З.Х., Микаелян A.B., Новикова С.А.// Биомедицинская химия. 2015; Том 61(вып.6): С. 720-725.

5. Нгуен З.Х.. Клинико - патогенетическое значение взаимосвязи метаболических изменений, днслипидемии и утилизации глюкозы клетками при сахарном диабете, осложненном микро - и макроангиопатиями/ Нгуен З.Х., Прутяная B.C., Микаелян Н.П., Потемкин В.В., Михайлова С.Д.// Здоровье и образование в XXI веке. 2013. ISSN 2226 - 7425; Вып. № 1-4 (том 15): С. 48-50.

6. Нгуен З.Х.. Изменение обмена жирных кислот при ожирении и сахарном диабете 2 типа у женщин репродуктивного возраста/ Микаелян Н.П., Нгуен З.Х., Францева Е.Ю., Микаелян A.A.// XXII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»// Сборник материалов конгресса. 2015; Москва. С.153

7. Nguyen Danh Khanh. Using Sulfuric Acid to Produce Methyl Ester Derivatives of Fatty Acids for Gas Chromatography Mass Spectrometry Analysis/ Nguyen Danh Khanh, Nguyen Gia Binh // Journal of 108 - Clinical Medicine and Pharmacy; 2013; Vol.8 (№4): P. 98-102.

8. Нгуен 3.X.. Влияние липоевой кислоты на чувствительность клеток крови к инсулину при сахарном диабете типа 2 и его осложнениях/ Потемкин В.В., Микаелян Н.П., Францева Е.Ю., Нгуен З.Х.// Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2014; том 16(8): С.3-4 .

- Работа, опубликованная в журнале, включенном в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД Артериальное давление

АОС Антиоксидантная система

НЬА1с Гликированный гемоглобин

Г6ФДГ Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа

ГП Гидроперекиси

ГПО Глутатионпероксидаза

ДГК Докозагексаеновой кислоты

ДК Диеновые конъюгаты

ЖК Жирные кислоты

ИБС Ишемическая болезнь сердца

ИЗСД Инсулинзависимый сахарный диабет

ИНСД Инсулиннезависимый сахарный диабет

ИСА Инсулинсвязывающая активность

КА Коэффициент атерогенности

КТ Каталаза

ЛПВП Липопротеины высокой плотности

ЛПНП Липопротеины низкой плотности

ЛПОНП Липопротеины очень низкой плотности

МДА Малоновый диальдегид

НАДФ+ Никотинамиддинуклеозидфосфат

ННЖК Ненасыщенные жирные кислоты

НЖК Насыщенные жирные кислоты

ОС Окислительный стресс

ОХ Общий холестерин

ПНЖК Полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ Перекисное окисление липидов

СД Сахарный диабет

СЖК Свободные жирные кислоты

СОД Супероксиддисмутаза

СРО Свободно-радикальное окисление

ТГ Триацилглицериды

ХС Холестерин

ЭПК Эйкозапентаеновой кислоты

Подписано в печать: 07.10.15 Объем 1,0 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 141 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 +7(495)978-66-63, www.reglet.ru