Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов перекисного окисления липидов в активности ферментов антиоксидантной защиты при сахарном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов перекисного окисления липидов в активности ферментов антиоксидантной защиты при сахарном диабете"

НАЦИОНАЛЬНА АКАДЕМЫ НАУК УКРАШИ В1ДД1ЛЕННЯ РЕГУЛЯТОРНИХ СИСТЕМ КЛГГИНИ ШСТИТУТУ БЮХШП1М. О.В. ПАЛЛАДША

пг* оп

? "

1-сЦ ОЛ1ЯРНИК ОЛЕНА ДМИТР1ВНА

УДК 577.158.1+661.729:616.379-008.64

ДОСЛЩЖЕННЯ ПРОЦЕС1В ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛППДГО ТА АКТИВНОСТ1ФЕРМЕНТГО АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ ПРИ ЦУКРОВОМУ Д1АБЕТТ.

03.00.04- бюнАИЯ

Автореферат дисертацн на здобуття наукового ступени кандидата б1олопчпих наук

Льв1в 1998

Дисертащею е рукопис.

Робота виконана на кафедр16ioxiMii бюлопчного факультету Лыивського державного ушверситету ш.1вана Франка

Науковий KepiBHHK- доктор бюлопчних наук, професор Великий Микола Миколайовнч Льв1вський державний уншерситет im. 1вана Франка завщувач кафедри бюх!мп

ОфщШш опоненти:

доктор бюлопчних наук, професор КаЛачнюк Григорш 1ванович

Львгвська акадешя ветеринарно! медицина ¡м.С.З.Гжицького,

професор кафедрй оргашчноУ та неоргашчно!' ximü

кандидат бюлопчних наук Апуховська Лариса 1ван1вна

1нститут 6ioxiMÜ ¡м.О.В. Палладша HAH Украши, провщний науковий сшвроб1тник

Провщна установа- Нацюнальний ушверситет iM. Тараса Шевченка (кафедра бюхшй)

Захист вщбудеться "^"^.р рсси iL* 1998 р. о _ годши на засщанш

спещал1зованоТ вчено1 ради К.35.238.01 у Вщдтенш регуляторних систем клшгаи 1нстнтуту бкшмп iM. О.В.Палладша HAH Украши (290005 JlbBiß, вул. Драгоманова, 14/16)

3 дисертащею можна ознайомитись у б1блютещ Вщдшенш регуляторних систем клГгини 1нституту 6ioxiMii iM. О.В.Палладша HAH Украши

Автореферат роз!йцаний "¿С11

Вчений секретар спещап1зовано1 вченоГ ради

п ИХ- 1998р.

¿.ГР

f —с. Федорович Д.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Аюуалыпсть теми.

1нсулшзалежний цукровий д'1абет (13ЦД) - с сндокринно- обмшним захворюванням, яке характеризуешься комплексом гормонально-метабол1чних порушень. 13ЦД е одним з найбшып поширених захворювань, частота якого неухильно зростае з кожним роком. В крашах бвропи, в т.ч. i на УкраТш частота захворюваносп на 13ЦД становить 45% вщ загальноТ кшькост1 населения (Панькив В.И., 1995). Ключовою причиною виникнення цього захворювання е ауто)мунш процеси, яю викликають деструкцию ß- юцтин пщшлунково\" залози (Rossini A.A., 1993; Skyler J.S., 1993). В ochobi розвитку патолопчних процес'т при 13 ЦЦ лежать викликаш дефщитом шсулшу змши субстратного та кофакторного забезпечення головних ланок метаболЬму, яю спричиняють розвиток тканей o'i rinoKcii та метабол1чного ацидозу.

Ршень вшьнорадикалышх процесш перекисного окисления лшщш (ПОЛ) е показником метабол1чноТ активност1 та ф^зюлопчного стану клшга i тканин (Губсышй Ю.И., 1995). Вш забезпечусться швидюспо утворення активних кисневих метаболтв та функцюнуванням складноУ тканшпю- специф1чно1 системи ПОЛ. Стацюнарне утворення прооксидантш у тканинах в норм! вр]вноважуеться к детоксикащего антиоксидантами, тому для шдтримання гомеостатичноУ р5вноваги необхадна безперервна регенерация антиокисдантних систем, як! формуються як ферментативними, так i неферментативними антиоксидантами (Ляйфер А.И., 1993). Ферментативна антиоксидантна система клшш включае ряд фермегтв серед яких юпочовими с супероксидцисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.11), каталаза (КФ 1.11.1.6.), глутатюнпероксидаза (ГПО, КФ 1.11.1.9), глутатюнредуктаза (КФ 1.6.4.2), глутатюнтрансферази (КФ 2.5.18) (Меньшикова Е.Б., 1993).

Сутгеве порушення постачання тканин киснем при цукровому д1абет1 спричиняе збшьшення швидкост! утворення активних кисневих метаболтв (АКМ), яи приймаготь участь в шццацн процессе ПОЛ у бюлопчних мембранах . 1нтенсиф1кац1я процесш вшьнорадикалыюго окисления та нагромадження продукта ПОЛ спричиняе порушення структури мембран, що посилюе деструкцию ß- юнтин (Lenschow D.J., 1995, Maiti R.K., 1997), а також зумовлюс розвиток ni3Hix ускладненнь диабету- анпопатш, ретинопатш, нефропатШ та нейропатШ (Аметов A.C., 1995) Серед велико!' кшькост! препаратов, яю застосовуються для профшактики цих ускладнень е шкотинамщ- попередник синтезу

нкотинамцдоих коферменпв. Постульовано деюлька можливих MexaHÍ3MÍB захисно! дй нкотинамщу при дшбсп. Показано, що введеыыя нкотинамщу патентам з 13ЦЦ та щурам h експериментальним стрептозотоциновим д1абетом сприяе зниженню вм1сту антитш до ß-кгитин та гальмування аукнмунних npoueciB (Skyler J.S., 1993). NAD+ , джерелом бюсинтезу якого с шкотинамщ, безпосередньо л1м1туе процес ноль (ADP)- рибозилювання, яке е важливою ланкою ексцизшноТ репарацн одноланцюгових розрив!в ДНК (LeDoux S.P., 1988; Великий H.H., 1995), що вшшкають щд д!ею цитотоксичних агента (стрептозотоцин, алоксан). Безсумншшш фактом е стимулящя секрецц шсулшу ß- клпинами пад вшшвом нкотинамщу (НАм). Центральна роль в опосередкуванш впливу НАм на видшенпя шсулшу нал ежить цшапчнш ADP- рибоз1 (cADPR)- метаболиу NAD+, яка е вторшшим посередником внутршньоюитинного вившьнення Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму, i тим самим - глюкозошдуковано! секрецц шсулшу ß-клшгаами (Okamoto Н., 1993). Посилення бюсинтезу NAD+ при введент НАм активуе транспорт та метабол1зм глюкози в шсулшчутливих клшгаах. (Великий H.H., 1992; Ido Y., 1997).

Осюльки вшьнорадикальш процеси та реакца перекисного окисления tícho пов'язаш з окисно- вщновними продесами в клшшах, було актуальним з'ясувати вплив введения нкотинамщу на bmíct продутспв ПОЛ та активность фермента антиоксидантного захисту в еритроцитах та печшщ щурш b експериментальним стрептозотоциновим дкбетом.

Зв'язок робот з науковнми програмамы, планами, темами.

Дана робота е частиною фундаментальних дослщжень науково-дослщноУ лабораторц "РадащйиоТ та молекулярног бюлогп" JIbBiBCbKoro державного уншерситету ím. 1вана Франка за темами: "Д1агностика та розробка засобш корекцй метабол^чних порушень при цукровому fliaöeri" та "1нтегративна роль нкотинамщних коферментш в регуляцн клтшного метабол13му в норм! та при дй екстремальних факторш".

Дослщження ефективноеп нкотинамщу в терапн та профшактищ д1абету в групах ризику проводиться в рамках "€вропейсько1 програми дослщження вшшву нкотинамщу при Д1абет1" (European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial ) шд кер5вництвом Едвша Гейла (Великобританш). Дослщження проводяться згщно "Договору про cnienpamo м1ж органЬацкми, яи вивчають вплив нкотинамщу" (The Agreement of Collaboration among Nicotinamide Trial Organizers- ACANTO).

Мета та завдання роботи.

Метою дано! роботи було обгрунтувати участь нкотинамщних кофермештв в процесах перекисного окисления лшщш та функцюнуванш системи антиоксидантного захисту, а також охаракгеризувати особливосп шпбування колючового ферменту антиоксидантноТ системи-каталази специф!чним шпбпором 3- амшо- 1,2,4- триазолом при 13ЦД та експериментальному стрептозотоциновому fliaöeTi.

Вщповщно до поставлено}' мети виршувались наступш завдання:

1. Дослщити змши вмюту продуктов (ПОЛ) та активносп фермеипв антиоксидантного захисту в еритроцитах людей ¡з 13ЦЦ, а також в еритроцитах та печшщ iqypiB i3 стрептозотоциновим Д!'абетом.

2. Вивчити корегуючий вплив нкотинамщу на процеси ПОЛ та функцтнування системи иротиперекисного захисту в еритроцитах та печшщ щур iß ¡з стрептозотоциновим д1абетом.

3. Визначити особливосп шпбування каталази еритроцит1В i печшки щурш специф1чним шпбггором- 3-амшо-1,2,4- триазолом (AMT) при fliaöeri, а також вплив нкотанамщу на цей процес.

4. Дослщити вплив амшотриазол- та аскорбатшдуковапого шпбування каталази печшки i еритрощшв на штенсившсть процес5в ПОЛ в дослщах in vitro.

Наукова новизна одержаних результате.

У представленш робой вперше продемонстровано корегуючий вплив нкотанамщу, як попередника синтезу нкотинамщних коферментш на штенсившсть ПОЛ та функцюнування ферметтв системи антиоксидантного захисту при експериментальному

стрептозотоциновому fliaöeTi.

Вперше описан! особливосп проткання процесу АМТ-шдукованого шпбування каталази еритоципв людей i3 13ЦД, а також еритроциив та печшки щур5в ¡з експериментальним стрептозотоциновим д1абетом за умов in vitro. Виявлено посилення шпбування каталази печшки амшотриазолом, осюльки ефективна шпбуюча концентрация AMT в шкубащйному середовипц знижувалась вщ 20 мМ в контрол1 до 10 мМ при д5абе-п.

Ефекг шпбування каталази еритроципв AMT in vitro досягався внесениям в середовище шкубацп аскорбшово1 кислота. В еритроцитах людей ¡з 13ЦД та в еритроцитах nxypiß i3 стрептозотоциновим д1абетом спостерцалось збшыпення шпбування при д1гбет'1 в межах концентраци аскорбшовоУ кислота (АК) 25-100 мкМ. Введения нкотанамщу зменшуе

шпбування ферменту внаслщок активацц бюсинтезу NAD+ та нормалЬацп окисно- вщновних процес1в.

Вперше показано штенсифкащю процесш перекисного окислення лшццв за умов AMT- та аскорбатшдукованого шпбування каталази на piBHi утворення промЬкних продукпв ПОЛ- д1енових кон'югапв в клгпшах печшки та еритродитах контрольних щурш i шдвищення BMiciy як пром1жних продукпв, так i юнцевого продукту ПОЛ- малонового диальдепду (МДА) в тканинах тварин i3 стрептозотоциновим д1абетом.

Практичне значения одержаних результате.

Отримаш дат дозволяють обгрунтувати роль нкотинамщу та стану нкотинамщних коферметчв у вшьнорадикальпих процесах перекисного окислення лшщв. Осюльки введения НАм викликае зниження BMicry продукпв ПОЛ та нормал1защю функцюнування фермента системи антиоксидантного захисту, доцшьно рекомендувати застосування нкотинамщу з метою корекци метабол1чних порушень та попередження розвитку ускладень 13ЦЦ.

Результата дослщження шпбування катал ази AMT in vitro, а також впливу шпбування ключового ферменту антиоксидантного захисту на процеси ПОЛ доновнюють знания про мехашзм функцюнування ферменту в норм) та при цукровому д!абет1.

Отримаш результата складають теоретачну основу для науково-обгрунтованих розробок нових лнсарських препарат з включениям нкотинамщу для комплексно! терапп 13ЦД.

Особистий внесок здобувача

В npoueci виконання дисертацн автор особисто В1д1брала i критично нроаналЬувала весь обсяг вичизняшм та зарубежно!' лгсератури по reMi проведеного наукового дослщження. Дисертантом розроблено програму та метода вирннення поставлених завдань, штерпретовано отримаш результата. При виконанш експериментально! частини робота здобувачем особисто проведет визначення активное™ фермет'ш антиоксидантного захисту - супероксидцисмутази i каталази, вмкту продукпв перекисного окислення лнцщв. а також дослщжеш особливосп шпбування каталази 3- амшо- 1,2,4- триазолом та змш BMicry продукт is ПОЛ в клшшах за умов шпбуваання ферменту. Визначення активност! глутатюнпероксидази, глутатюнредукгази та вм1сту вщновленого глутатюну проведено спшьно ¡з ствробггниками лабораторн "Рад1ацшноТ та молекулярноТ бюлоги" бюлопчного факультету Льв1вського державного университету ¿м, 1вана Франка ям с сп!в авторами наукових

праць здобувача. Анал1з та обговорення результат дослщжень проведено спшьно з науковим кер1вником.

Апробащя результатов дисертащГ

Результата дисертаци були представлен! на 4- ш М!жнароднШ студентськш науковШ конференциям. Гданск, Польща, 1996); на конгресс "М1жнародш дш Д1абету" (м.Дншропетровськ, 1997); на 16-ому KOHrpeci МЬкнародноГ Федерацц Д!абету (м. Хельсиш, Фшляндм, 1997); на VII Украшському BioxÍMÍ4iioMy з'Тзд1 (м. КиУв, УкраТна, 1997).

Структура та обсяг робота

До складу дисертаци входить три роздши, вступ, висновки. Обсяг робота становить 133 сторшки, з них 5 выведено на таблиц! (ix шльюстъ-10) та 16 малюнюв; список використаних джерел mí стать 215 найменувань i розташований на 23 сторшках дисертаци.

ОСНОВНИЙ 3MICT РОБОТИ.

Материал» i методи дослщжень.

Об'ектом дослщжень були еритроцити людей, хворих на цукровий диабет у важюй форм1, ускладненш судинними ангюпапями, а також еритроцити та тканина печшки щурш-самцгв масою 120- 150 г.Експериментальний цукровий диабет моделтовали введениям стрептозотоцину ф1рми "Serva" з розрахунку 7 мг на 100 г маси внутрцпньочеревно. Розвиток дтбету контролювали за зросганням р1вня глюкози, який визначали глюкозооксидазним методом (Гулый М.Ф., 1965). Терапевтичний ефект нкотипамщу (препарат ф1рми "Sigma" дослщжували при його внутрнпньом'язевому введет» в доз! 200мг на 1 кг маси щоденно протягом 14 дп!в щурам з розвиненою гшерпнкем!ею.

Актившсть СОД визначали за допомогою реакцй" водювлення штратетразолш синього до н!троформазану (Чевари С., 1991), каталази- з використанням реакцн Н2Ог з мол1бдатом амонЬо (Королюк М.А., 1991). Для визначення актившсп ГПО та вмкту GSH застосовували метод, принцип якого базусться на реакцй сульфг!дрильних груп з реактивом Еллмана (Моин В.И., 1986). Актившсть глутат!онредуктази харакгеризували за зменшенням вмгсту одного Í3 субстрат1в ферменту-NADPH (Панченок Л.Ф., 1985). Bmíct д1енових кон'югат1в визначали за штенсившстю поглинання кон'югованих д1енових структур гщроперекиав лцвдш в обласп 232- 234 нм (Плацер М., модификация Гаврилова М.И., 1983) ревень МДА- за за штенсившстю забарвленпя

комплексу МДА з тюбарбпуровою кислотою (Тимирбулатов P.A., 1981). Концентрацию депдроаскорбшово1 кислоти визначали за допомогою реакцц з 2,4- динпрофеншгщразином, аскорбшово1 кислоти- при окисленш 2,6- дихлорфенолшшдофенолятом натрЬо до деддроаскорбату (Omaye S.T., 1979).

1нпбування каталази печшки 3- амшо- 1,2,4- триазолом in vitro проводили за методом (Margoleash Е., 1958).. 1кубацшне середовище готували на 15 мМ Na,К- фосфатному буфера рН=7,4. До складу середовища входили: гомогенат печшки ( з розрахунку 1 мг бшка па 1 мл шкубацшного середовища) та AMT у концентраци 10-50мМ. 1нкубацЬо проводили при 37° С протягом 45 хвилин. 1нпбуванпя катал ази еритроцитш проводили за методикою Ou Р. & Wolf S. (1994). До складу шкубацшного середовища, приготованого на Na,K-фocфaтнoмy буфера входили гемол1зат еритроцитш (з розрахунку 1 мг Hb па 1 мл шкубацшноТ сумшн), 50 мМ AMT, AK у кшцевш концентраци 25-250 мкМ. 1нкубацйо проводили при 37° С протягом 45 хвилин.

Результата та ix обговорення.

1. Процеси перекисного окисления лшщ1в та стан системи антиоксндангного захиспгу при ОЦД та експериментальыому стрептозотоциновому Д1абет1.

Продемонстровано зростання вм!сту пром1жних продукт ПОЛ -д1енових KOH'roraTiB та кшцевого продукту ПОЛ - МДА в еритроцитах та печшц! щур!в ¡з експериментальним стрептозотоциновим д1абетом, що е наслщком збшьшення BMicry активних метаболrm кисшо за умов ¡нтенсифкацц окисних процес^в в цих кгптинах при fliaöeri (табл. 1.1). В еритроцитах людей з 13ЦД також спостериалось збшьшення BMicry д1енових кон'югат1в та МДА. Вплив продукпв ПОЛ може проявлятись у пщвищенш частота конформацшних змш макромолекул та ураженн5 мембранних структур. Вщомо, що icnye позитивна кореляцк М1ж актив!стю ПОЛ та ступеней важкосп д1абе-гичних ангюпатш (Сальникова Л.А., 1990; Ляпков Б.Г., 1995)..

Виявлеш при flia6eri змши BMicry продукгш ПОЛ пов'язан1 i3 модифкацкю антиоксидантних ферментш як активним киснем, так i глюкозою (табл. 1.2, 1.3). Вадомо, що вщ BMicry глюкози в Kpoei залежить ршень неферментутивного глкозилювання бшив, яке призводить до змш ix структурно - функцюнальних властивостей i розвитку ускладнень д1абету. Показано, що Си, Zn-СОД еритроцитш та кринггалика ока людини пцщаеться неферментутивному глкозилювапню по л13инових залишках - Lis-122 та Lis-128 (Taylor, 1988), що посилюе окисну

модифнсаццо та викликае двохстадшну фрагментаццо бшка- ферменту (БаЬ Э.С., 1990).

Таблиця 1.1

Вмнгг продуктов ПОЛ в тканинах щур!в !з стрептозотициновим Д1абетом

(М ± т, п = 8-10)

Показник Контроль Д1абет Ддабет+НАм

Еритроцити

Д1епов1 кон"югати, нмоль/мл еритроциттв 1.0 + 0.13 3.3 +0.14* 1.5Ю.09**

Малоновий диальдегщ мкмоль/мл еритроципв 50.0 ± 1.4 119.0 ±4.9* 48 ± 2.6**

Печшка

Д1снов1 кон"югати нмоль/мг бшка 51.8±3.2 91 + 1.2* 69.5 ± 3.0**

Малоновий диальдепд мкмоль/мг бшка 127 + 5.4 306 ± 17.6 133 ±7.6**

* РЬниця в1рогщна у пор1внянш з контролем, р<0.05 ** РЬниця в1рогадна у поршнянш з диабетом, р<0.05

Таблиця 1.2

Акгившсть ферменпв антиоксидантного захисту та вмют вБН в еритроцитах нэднв 1з стрептозотоциновим диабетом (М ± ш, п= 10-12)

Показник Контроль Д1абет Дгабет+ НАм

Акт-сть СОД, ум.од. / мл 2.3 ± 0.03 1.5 ±0.04* 1.5 ±0.02

Акт-сть каталази мкмоль/хв/мг НЬ 2.4 ±0.17 686.3 ±31.5 2.2 ± 0.08 2.6 ± 0.94

Акг-сть ГПО, мкмоль СЭН/хв/мг НЬ 478.8 ±43.1* 877.6 ± 28.9**

Акт-сть ГР, нмоль МАЭРН/хв/мг НЬ 3.97 ± 0.23 4.47 ± 0.33* 3.5 ± 0.27**

Вмгст СБН, нг/мг НЬ 4.7 ±0.10 1.5 ±0.08* 4.8 ±0.1**

Для клотн печшки характерною е значна ¡нтенсивнкть протжання процес!в окисления, в тому чишп 1 ПОЛ. Вщповщно, в клпинах печшки спостерц-ався бшып високий, в пор^внянш з еритроцитами, вм1ст д!енових

кон'югатш та МДА. Осккьки печшка належить до шсулшчутливих тканин, за умов цукрового диабету знижусться швидисть фосфорилювання глюкози в глюкозо- 6 фосфат, i, як наслщок, зростае штенсившсть лшол1зу

Таблиця 1.3

Актившсть фермента антиоксидантного захисту та вмнгг GSH в печшщ щур1в ¡3 стрептозотициновим диабетом (М ± m, п = 10-12)

Показник Контроль Д1абвт Д1абет + Нам

Акт-сть СОД, ум.од. / мг бшка 0.53 ± 0.054 0.11 ±0.01* 0.2 ± 0.028

Акт-сть каталази мкмоль/хв/мг бшка 2.9 ±0.1 4.6 ±0.15* 4.2 ± 0.2

Акт-сть ГПО, мкмоль GSH/хв/мг бшка 242.4 ± 9.5 358.7 ±10.8* 260.0 ± 12.0**

Акт-сть ГР, нмоль NADPH/хв/мг бшка 21.32 ±1.94 26.3 ± 1.63 31.2 ±1.5

Вмют GSH, мг/г бшка 3.0 ± 0.23 1.3 ±0.09* 2.41 ±0.12"

* Р1зниця BipoiioHa у паршнянн1 з контролем, р<0.05 ** Р1зниця в1ропдна у пор1внянш з д1абетом, р<0.05

(Тепперман Дж., 1989), а отжс i BMicr вшьних ненасичених жирних кислот, яю здатш окислюватись шляхом пероксидацц (Кучеренко Н.Е., 1985).

Зростання BMicTy АКМ в клгашах печшки внаслщок штенсифпсаци лшол1зу та ПОЛ, супроводжуеться суттевим зниженням активносп СОД (табл. 1.1, 1.3).Одночасно спостер1гастъся зростання активности каталази, що, очевидно, слад розглядати як компенсаторну реакцно на посилене утворення АКМ, зокрема Н202 .

Рузультати дослщження глутатюн - глутатюнредуктазноТ системи представлен! в таблицях 1.2, 1.3. При стрептозотоциновому д!абет1 BMicr вадновленого глутатюну знижувався як в еритроцитах, так i в печшщ. Причина зменшення концентрадц GSH пов'язана не тгпьки з посиленням його використання та недостатшм вщновленням, тобто 13 змшою активносп глутатюнпероксидази та глутатюнредуктази. але i з порушенням сиитезу та обмшу глутатюну (Murakami К., 1989). В еритроцитах та печшщ щургв i3 стрептозотоциновим д1абетом спостер1галось зростання активност1 глутатюнредуктази, спричинене збшыпенням вмюту вщновленого нисотинамщаденшдинуклеотидфосфату при fliaGeri власне i може бути причиною достов1рного пщвищення активност! ГР в еритроцитах. Функцюнування ГР спряжене з

функцюнуванням ГПО, яка окислюе глутатюн, вщновлюючи гидроперекиси лшццв та шших орган¡чних сполук. Актившсть ГПО при flia6eTÍ знижуеться внаслщок алостеричного шпбування ферменту NADPH (Великий М.М., 1995). ; ¡

Накопичеиня продуктов ПОЛ супроводжуеться поругаейням ф^зико-xímÍ4hhx властивоетей та проникносп бюлопчних мембран, шакгавацкю мембранозв'язаних фермента (Владимиров Ю.А., 1972). Там змши спричипяють розвитох nÍ3Hix ускладень Д1абету, переважно д5абетичних ангюпатш (Сальникова Л.А., 1990; Ляпков Б.Г., 1995). Тому нормал1зацк процесш ПОЛ та функцюнування системи антиоксвдантного захисту за допомогою лкарських препарата е важливим питаниям Д1абетолоп1.

2. Корегуючий вплив шкотпнамщу на bmíct продукпв ПОЛ та астивтсть ферменпн антиоксвдантного захисту при стрсптозотоциновому дшбетк

3 метою оцшки ступеня компенсаци анти оксида! mío i! системи при дшбетт тваринам Í3 стрептозотоциновим д1абетом вводили нЬкотинамщ в доз1 200мг на 1 кг маси. щоденно протягом 14 дшв. Результата дослщжень свщчать про гальмування вшьнорадикальних процесш в тканинах дибетичних щурш пщ д1'ею НАм. Bmíct продукт1в ПОЛ -дкнових кон"югатш та МДА теля введения ИАм значно знижувався в як в еритроцитах, так i в печшщ (табл.1.1). В ochobí протиперекисноТ дц НАм, можливо, лежить його здатшсть гальмувати процеси лшолЬу в клтгаах, понижуючи актившсть монооксигеназноТ системи мкросом шляхом взаемодп з цитохромом Р- 450 (Ido Y., 1997). Г5полшщем1чний ефект н коти нам щу теля двотижневого курсу введения виявляеться в пониженш р5вия атерогенних лшопротеМв, триацилглщеридш i холестерину плазми кров! (Абрамова Ж.И., 1985).

Введения нкотипамщу виюшкае в еритроцитах достов!рне зростання активносп важливого фермену аптиоксидантного захисту -каталази (табл. 1.2) в той час як активнкть СОД залишаегься пониженою, очевидно внаслщок пошкодження велико!' частей молекул ферменту в результат окисно! модифкаци полшептидного лаицюга мш Рго62- His63 пщ впливом АКМ (Takata J, 1996). В печшщ щурш теля введения НАм вщбувасться часткова нормашзацк активност1 СОД, в той час як актившсть каталази залишаегься пщвшценою (табл. 1.3). Bmíct вщновленого глутатюну i глутатюнредуктазна актившсть в еритроцитах щур1в гисля введения НАм наближались до норми (табл. 1.2). Спостеркався дещо пщвищений pÍBenb активносп ГПО. Це пояснюегься там, що при введенш НАм зростае епшвщношення NADP+/NADPH i,

вщповщно знижуеться алостеричне шпбування ГПО за участю NADPH (Кулинский В.И., 1993).

В печшщ щур!в шсля введения НАм спостериаеться нормал1за1щ aicraBHocrri СОД та ГПО, в той час як актившсть каталази залишаеться пщвшценою (табл. 1.3). Bmict GSH досягае значения , характерного для гепатоцит1в контрольних щур1в, а актившсть ГР збшыиуеться. В клпинах печшки ршень GSH також шдвшцувався, що зумовлено не тшьки зростанням активност! ГР, але й з можливим посиленням синтезу глутатюну (Сорока В.Р., 1989).

Окисно- вщповний стан нкотинамщних коферменпв, як спшвщношення NAD+/NADH i NADP7NADPH, а також глутатюн-глутатюнредуктаза утворюють едину редокс- систему, яка забезпечуе скоординовашсть функцюнувашга дегщрогеназ, редуктаз i иероксидаз в р1зпих метабол1чних шляхах i е визначальною в регуляци окисно-вщновних npoueciß. Глутатюн- глутатюнредукгазна система кр1м того зумовлюе щцтримання високого ступеня вщновленост! бшюв. Нжотинамщ, як иоиередник бюсинтезу шкотинамщних коферментш викликае значне, в 4-5 разш, пщвищення pißun ix окислених форм i в значно меншш Mipi- вщновлених (Великий H.H., 1995). Це викликае зростання сшввщношення NADVNADH та NADP+/NADPH, i, як наслщок, зумовлюе змши активност! ключових окисно- вщновпих ферментш та швидккпъ протжання основних метабол1чних процесш

Таким чином, введения нкотинамщу - попередника синтезу нкотинамщних кофермента при цукровому fliaöeri посилюе вщиовш процеси, знижуе штенсившсть процес1в ПОЛ та нормашуе актившсть фермента антиоксидантного захисту.

ЗЛнпбування каталази 3- амию- 1,2,4- триазолом.

Осюльки каталаза е основним ферментом, який розкладае Н2О2 i орган1чн1 перекиси в печшщ та, за екстремальних умов, в еритродитах, а змша и активносп при д1абет1 вщграе сутгеву роль в регуляцй' ПОЛ, були проведен! дослщженыя особливостей шпбування ферменту при данж патологи.

При вивченш залежност шпбування каталази печшки вщ концентрацп AMT виявлено посилення шпбування каталази печшки амшотриазолом, оскшьки ефективна ¡нпбуюча концентрац1я AMT в шкубацшному середовиии знижувалась вщ 20 мМ в контроле до 10 мМ при д1абеп (рис.3.1). Вщомо, що при д1абсп в юптинах печшки ictotho зростае bmIct Н2О2 (Margoleash Е., 1958). Вщповщно, збшьшуеться частка молекул каталази, hki знаходяться в комплекс! з перекисом водню, i

зростае ймсшршсть зв'язування ферменту з ¡нпбгёором. Шсля введения НЛм bmíct АКМ в гепатоцитах знижуеться (Ido Y., 1997). Тому процес шпбування каталази AMT був менш ефективним .

Копцентращя AMT, мМ

Рис. 3.1 1нпбування каталази печшки щур1в при зростаючш концентраци АМТ, час шкубацй 45 хвилин

Контроль (■), Д1абет (ж ), Диабет + нкотинамщ(*)

В еритроцитах не виявлено шпбування каталази амшотриазолом в межах концентраци 10—50 мМ. 1нпбуючнй ефект проявляеться лише в присутносп аскорбшовоТ кислота. На рис.3.2А представлено залежшсгь шпбування каталази еритроцита людей ¡з 13ЦД вщ концентраци АК в шкубацШному середовищь Спостер!галось збшьшенпя шпбування при д!абет! в межах концентраци АК 25-100 мкМ. Залежшсть шпбування каталази 50 мМ АМТ в!д концентраци аскорбшово! кислоти в шкубацШному середовинц представлена на рис. 3.2Б. У контрольних тварин ступшь шпбування пропорцшно зростае у межах концентраци аскорбату 25- 250 мкМ. В еритроцитах щур^в 13 стрептозотоциновим диабетом шпбування було бшьш вираженим в пор^внянш з контролем, особливо при низьких концентрац1ях аскорбшово!' кислоти 25- 100 мкМ (зростання складало в середньому 70%). При високгй концентраш"! АК

Концевтраци А.К, ккМ КщтрдаД^мМ

А Б

Рис.3.2 Вплив нкотинамщу на ¡нпбування каталази еритроцшчв людей (А) та еритроцит^в щурш (Б) 50 мМ AMT, час шкубацй 45 хвилин.

Контроль (■), Дшбет ( ж ), Дтбет + нкотинамщ(* )

(250 мкМ) ступшь ¡нпбування в контрол1 i при дтбет! був практично однаковим.

1снуе експериментальне пщгвердження, що система АК-ДГАК е своерщним 'човником', який здшснюе транспорт вцщовних етвалентаз через мембрану еритроцита. У ф1зюлопчних умовах взаемоперетворення в Ц1Й систем1 зеунуте в бк утворення АК. Тому в норм1 в плазмi та еритроцитах ДГАК знаходиться в слщових кшькостях. в той час як у хворих на цукровий диабет вщзначаегься значне пвдвищення р5вня ДГАК в плазм! та еритроцитах на фош зниження BMicTy АК (Науменко, 1985). В дослщженнях in vitro показано, що швидюсть вщновлення ДГАК в еритроцитах знижена внасщок зменшення вмшту GSH.

Зростання ¡нпбування катал ази в еритроцитах щур iß ¡з стрептозотоциновим д!абетом може бути спричинене змши окисно-вщновного стану системи аскорбат- дегщроаскорбат. внаслщок штенсифкацй' окисления АК згщно ршнянь.

АК^ ДГАК+2Н++2е" (3.1)

02-+0г+21Г ^ Н202-Ю2 (3.2)

Утвореш при окисленш АК протони е субстратом реакцп дисмутацп супероксидрадикалу за участю СОД з утворенням Н202 (Поберезкина Н.Б., 1989).

Отже, для ¡нпбування катал ази AMT за участю АК принциновс значения мае вихщний стан системи ДГАК-АК в клггинах. 3 метою

оцшки ступеня окисленост! АК ми провели дослцркення вмюту окислено! та обновлено! форм вгсамшу С в еритроцитах людей i3 13ЦД та еритроцитах щур lb ¡з стрептозотоциновим д1абетом. Показано, що при Д1абет1 зменшуеться концентрацш АК i одночасно зростае концентрацш ДГАК (табл.3.1, 3.2). В еритроцитах при Д1абет1 зменшуеться bmict вцщовленого глутатюну, якш використовуеться в реакцн вщновлення ДГАК. Сшввщнощення концентрацШ [ДГАК]/[АК] ¡стотно збшыпувалоеь при стрептозотоциновому д1абеп, що свщчить про перевагу процеав окисления АК над процесами вщновлення, що корелюе ¡з змшами NAD+ i NAD?1' залежних окисно- вадновних процессе за умов дано! патологи. Значне зростання концентрацшного сп1ввщношення [ДГАК]/[АК] в еритроцитах щур1в ¡з стрептозотоциновим Д1абетом пояснюсться вщсутшстю шсулшово! та супровщпо! терапп. Оскшыш ДГАК мае д1абетогенну дно (Patterson J.W., 1949), пщвищення п BMicry ускладтое проткання диабету (Науменко М.Я., 1985). Введения НАм сприяло корекцн окисно- виновного стану системи АК- ДГАК в еритроцитах щурш ¡з стрептозотоциновим д1абетом (табл.3.1, 3.2).

Таблиця .3.1

Вмют АК та ДГАК в еритроцитах людей b 13ЦД (М ± m, п = 9-10)

Показник Контроль Д1абет

АК, нмоль/мл еритроцтв 43 ±4.1 19 ± 1.5*

ДГАК,нмоль/мл еритроципа 11 ± 1.6 16 ± 1.5*

ШГАКШАК] 0,26 0,84

Таблиця 3.2

BmIct АК та ДГАК в еритроцитах щур1в а стрептозотоциновим диабетом _(Mini, п = 9-10)_

Показник Контроль Д'|абет Дабет + НАм

АК, нмоль/мл еритроцитю 31 ±1.1 11.0 ±0.8* 27± 2.1**

ДГАК, нмоль/мл еритроцит1в 8.0 ±0.7 19 ± 1.2* 12 ±1.2**

ШГАЩ1АК1. 0,26 1,7 0,44

Таким чином, при стрепотозотоциновому Д1'абет! спостер5гаеться посилення шпбування каталази печшки та еритрощгпв шд впливом 3-амшо- 1,2,4- триазолу та аскорбшово! кислота. Введения нкотинамшу

сприяе зниженню шпбування ферменту внаслщок активаци бюсинтезу NAD+Ta нормашзацй' окисно- вщновних процеав

висновки.

1 Одержан! результата доповнюють i розширюють уявлсння про мехашзми функщонування ферментутивно1 системи антиоксидантного захисту при цукровому Äiaöeri та роль нжотинамщу, як попередника синтезу нжотинамщних кофермента, в корекцц метабол1чних порушень за умов дано'1 патологи.

2.При 13ЦД у людей та експериментальному стрептозотодииовому fliaöeri у щур ¡в в еритроцитах та клшшах печшки спостерн-аеться зростання BMicry д!енових кон'югата та малонового диальдегщу, що супроводжуеться зниженням активности фермента антиоксидантного захисту- супероксиддисмутази та еритроцитарно! глутатюппероксидази, а також зростання активносп глутатюнредуктази.

3. Введения шкотинамщу виклшсае зниження BMicry продуктib перекисного окисления лшдав та нормшйзацио активное^ фермента антиоксидантного захисту при експериментальному стрептозотоциновому fliaöeTi.

4. При стрептозотоциновому дтбеп спостерггали збшьшення аскорбатшдукованого шпбування каталази печшки специфшним шпбл-ором 3- амшо- 1,2,4 триазолом, про що свщчить зменшення ефективно!' шпбуючоГ концентрацп амшотриазолу вщ 20 мМ в контрол! до 10 мМ при fliaöeTi.

5. Ефект шпбування каталази еритроцита AMT in vitro досягався внесениям в середовище шкубацн аскорбшовоТ кислота. В еритроцитах людей и 13ЦД та в еритроцитах щурш i3 стрептозотоциновим д1абетом спостеркалось збшьшення шпбування при fliaöeri в межах концентрацп АК 25-100 мкМ. Показано, що введения нжотинамщу веде до зменшення шпбування ферменту внаслщок активаци" бюсинтезу NAD та зниження сшввщиошення концентрацш [ДГАК]/[АК].

6. Пщ впливом AMT шдукованого шпбування каталази в клтшах печшки та аскорбатшдукованого шпбування в еритроцитах вщбувалась штенсифкац1я ПОЛ на piBHi утворення промисних продукта ПОЛ-flieHOBHx кон'югата у контрольних iuypiB i пщвищення вмюту як пром!жних продукта, так i кшцевого продукту ПОЛ- МДА в тканинах тварин ¡з стрептозотоциновим д1абетом.

Список онубл1Коианих праць здобувача.

1. Великий М.М. Бурда В.A., Bipoirr Н.В., Ол!ярник О.Д., Великий О.М. Вплив нжотинамщу на актившсть фермента антиоксидантного

захисту при експериментальному стрептозотоциновому Д1абеп.// Укр. 6iox. журнал,-1996.- т.68, №2 -С.109-114.

2. Федик М.Я., Великий М.М., Забабурша М.Л., Олшрник О.Д. Динамка бюсинтезу нкотинамцдаих кофермент1в з шкотинамщу та нкотиновоТ кислоти в тканинах щур1в.//Укр. 6iox. журнал.- 1996.-Т.68, №2.-С. 29-33.

3. Великий М.М., Бурда В.А., Серпенко О.О., Олшрник О.Д., Махневич Т.Р., Козицький 3-Я. Вплив нкотинамщу на стан киснево-транспортноТ системи периферично! Kponi при цукровому Д1абетй// Лки,-1997.- №5,- С. 7-23.

4. Олшрник О.Д., Великий М.М., .чл.-кор. НАН Украши Донченко Г.В., Вигнан Т.Л., Гамазша Н.В. 1ппбування каталази ериоцитш 3- амшо-1,2,4- триазолом при цукровому д'тбетг.// Допов¡Д1 НАН УкраГни.- 1998.-№2.- С. 183-186.

5. Fedyk M.Y., Oliyarnyk O.D., Mahnevych T.R. Effect of nicotinamide on hemoglobine glycosylation and antioxidant defensive enzymes in erythrocytes of streptozotozin diabetes rats.// Abstr. 4th International Student Scientific conference.-Gdansk. (Poland).- 1996.- E5.

6. Олшрник О.Д., Чикеречко M.M., Гамазша H.B., Великий М.М. Вплив нкотинамщу на перекисне окисления лшдав при стрептозотоциновому д1абе-п у щур1в.// MaTepiaira конгресу "МЬкпародш дш д1абету".- Дншропетровськ (УкраТна).- 1997.-С21-22.

7. Olijarnyk O.D., Gamasina N.V., Veliky М.М. Catalase inactivation in the presence of 3-amino- 1,2,4- triazole: Effect of diabetes and nicotinamide.// Abstr. 16th Internatiolal Diabetes Federation Congress.- Helsinki (Finland).-

1997.- N1475.

8. Олшрник О.Д., Вигнан Т.Л., Гамазша H.B., Великий М.М. [нпбування каталази еритрощшв та печшки 3- aMiHO- 1,2,4- триазолом.// MaTepiaira VII УкраТнського 6ioxiMi4Horo зТзду.- Киш.- 1997.-Ч.1.- С.67.

АНОТАЦШ

Ол1ярник О.Д. Дослщження npoqecie перекисного окисления лтщ1в та aKTHBHocTi ферментов антиоксидаптного захисту при цукровому д!абсть- Рукопис.

Дисертацш на здобуття наукового ступеня кандиата бкшпчних наук за спещальшстю 03.00.04- бюхшш.- Вщдшення регуляторних систем клшши 1нституту 6ioxiMu НАН Украши ¡м. О.В. Палладша, Льв1в,

1998.

Дисертаццо присвячено проблем! пошуку шляхт фармаколопчно! корекци метабол ¡чн их порушень та ускладнень шсулшзалежного

\

I

цукрового диабету. Дослщження проводились на експериментальнш модел! д1абету- стрептозотоциновому дщбет! у щур ib. В дисертацн вперше продемонстровано зниження штенсивноси процесса перекисного окисления лшадш та нормашзащя активности ферментш антиоксидантного захисту внасладок введения попередника синтезу нйсотинамщшх кофермешчв - нкотинамщу в доз! 200 мг на 1 кг маси тварини на протяз1 14 дшв. Показано збшьшення аскорбатшдукованого шпбування ключового фермешу антиоксидантного захисту- каталази специф!чням шпбгёором 3- амшо- 1,2,4 триазолом (AMT) в еритроцитах а також AMT - залежного шпбування катал ази печшки mypiB. Введения ншотинамщу сприяе зниженню шпбування ферменту. Результата дисертаци дозволяють вважати доцшьним рекомендувати застосування нисотинамщу з метою зменшення вм1сту продукт1в ПОЛ в комплекснШ терапн ускладень 13ЦЦ.

Ключов1 слова: перекисне окисления лшщш, система антиоксидантного захисту, нкотинамщ, катал аза, 3- амшо- 1,2,4-триазол.

АННОТАЦИЯ

Олнярник Б.Д. Исследование процессов перекисного окисления липидов и активности ферментов антиоксидантной защиты при сахарном диабете.- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04- биохимия.- Отделение регуляторных систем клетки Института биохимии HAH Украины им. A.B. Палладина, Львов, 1998.

Диссертация присвящена проблеме поиска путей фармакологической коррекции метаболических нарушений и осложнений инсулинзависимого сахарного диабета. Исследования проводились на экспериментальной модели диабета стрептозотоциновом диабете у крыс. В диссертации впервые продемонстрироовано снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и нормализация активности ферментов антиоксидантной защиты вследствие введения предшественника синтеза никотинамидных коферментов - никотинамида в дозе 200 мг на 1 кг масы животного впродолжение 14 дней. Показано увеличение аскорбатиндуцированного ингибирования ключевого ферменту антиоксидантной защиты- каталазы специфическим ингибитором 3- амино- 1,2,4 триазолом (AMT) эритроцитов, а также AMT - зависимого ингибирования каталазы печени крыс. Введение кикотинамнда способствует снижению

ингибирования ферменту. Результаты диссертации позволяют считать целесообразным рекомендовать использование ншсопшамида с целью уменьшения содержания продуктов ПОЛ в комплексной терапии осложнений ИЗСД

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, система антиоксидантной защиты, никотин амид, каталаза, 3- амино- 1,2,4-триазол.

SUMMARY

Oliyarnyk O.D. Research of lipid repoxidation and activity of antioxidant enzymes by Diabetes mellitus.- Manuscript

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.04- biochemistry.- Division of regulatory cell systems A.V.Palladifi Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 1998.

The thesis is devoted search ways of pharmacological correction metabolic damages and complications of insulin dependent Diabetes mellitus. The research was done on experimental model of Diabetes mellitus-streptozotocine diabetes by rats. In thesis was firstly demonstrated decrease of lipid peroxidation and correction antioxidant enzymes after nicotinamide injections in dose 200 mg to 1 kg weight of animals through 14 days. It was demonstrated increase ascorbic acid induced catalase inhibition by 3- amino-1,2,4- triazole (AMT) in erythrocytes and AMT induced catalase inhibition in the rat liver. Nicotinamide injections promoted decrease inhibition of enzyme. Results may be recommended for decrease of concentration of lipid peroxidation products in complex therapeutic of diabetes complications.

Key words: lipid peroxidation, antioxidant enzymes, nicotinamide, catalase, 3- amino- 1,2,4- triazole.