Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патогенетика хронического лимфолейкоза

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Патогенетика хронического лимфолейкоза"

005016831

ТИКУНОВА Татьяна Сергеевна

ПАТОГЕНЕТИКА ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА: ГЕНЫ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 пгш

Белгород - 2012

005016831

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ

Научный руководитель: Чурносов Михаил Иванович

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Иванов Владимир Петрович

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, зав. каф. биологии, медицинской генетики и экологии

Щипков Валерий Петрович

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», и. о. зав. каф. биологии и общей генетики

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ медицинской генетики» Сибирского отделения РАМН

Защита диссертации состоится <</^/>? 2012 года в »

часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автореферат разослан «¿¿^¿Р»

^¿¿с^ 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук ^ ' В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Хронический лимфолейкоз (XJIJ1) представляет собой доброкачественную опухоль, ее субстрат составляют преимущественно морфологически зрелые лимфоциты. Болезнь проявляется лимфатическим лейкоцитозом, диффузной лимфоцитарной пролиферацией в костном мозге, увеличением лимфатических узлов, селезенки и печени (Воробьев А.И., 2007). Хронический лимфолейкоз является самым частым видом лейкоза у взрослых. Наиболее распространен в странах Европы и Северной Америки. В этих странах на его долю приходится около 30% от всех лейкозов (Rai К. et al, 2000, Gatovsky D„ 2007, Волкова M.A., 2007), а ежегодная заболеваемость XJIJI составляет 3-3,5 на 100 000 населения, увеличиваясь до 20 на 100 000 для лиц старше 65 лет и до 50 на 100 000 после 70 лет (Leporriet М., 2001, Linet M.S. et al, 2002, Волкова M.A., 2007).

В настоящее время важное этиопатогенетическое значение при хроническом лимфолейкозе придается нарушениям в системе апоптоза и пролиферации (Kim Y. et al., 2010, Jung Y„ 2010, Chen J. et al., 2010). Одно из центральных звеньев в этих процессах занимают полифункциональные цитокины- факторы некроза опухолей и их рецепторы (Pfeifer D. et al, 2007, Mohr J., 2010, Helfrich H., 2010, Fuge M., 2010). Обладая множеством медико-биологических эффектов (цитотоксическое, индукция апоптоза, стимуляция пролиферации лимфоцитов, влияние на гемопоэз, провоспалительное действие и др. (Levy V. et al., 1999, Magliazza A. Etal,2001, Sturm J„ 2005, Jamroziak K. et al., 2006, 2009, Bogunia-Kubik K. et al., 2006, Nuckel H. et al., 2007, Dong H.J. et al., 2010)) эти цитокины влияют на развитие и прогрессирование хронического лимфолейкоза.

Согласно данным литературы (Rawstron A.C. et al., 2002, Capalbo S.,

2003, Воробьев А.И., 2007) значимую роль в формировании хронического лимфолейкоза играют генетические факторы. Как свидетельствуют результаты цитогенетических исследований, при В-ХЛЛ регистрируются определенные хромосомные аномалии, ассоциированные с особенностями течения и прогрессирования заболевания (Абраменко If.В., 2003, Домрачева Е.В. и др., 2005, Heinter D. et al., 2003, Crespo M. et al., 2003). С молекулярно-генетических позиций хронический лимфолейкоз изучен недостаточно. Подавляющее число работ по исследованию роли различных генов-кандидатов в формировании подверженности к хроническому лимфолейкозу проведено за рубежом (Levy V. et al., 1999, Magliazza A. et al., 2001, Hulkkonen J. et al., 2000, 2002, Sturm J.. 2005, Jamroziak K. et al., 2006, 2009, Bogunia-Kubik K. et al., 2006, Nuckel H. et al., 2007, Dong H.J. et al., 2010). В Российской Федерации лишь несколько работ посвящено молекулярно-генетическим аспектам хронического лимфолейкоза (Клинков А. А. и др.,

2004, Бакиров Б.А. и др., 2005, 2009, Гра О. А. и др.,2008, Овсепян В.А. и др., 2010), при чем основное внимание в этих исследованиях уделено генам системы детоксикации ксенобиотиков. Роль генетических вариантов

факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании и клиническом течение В-клеточного хронического лимфолейкоза среди населения России изучена крайне слабо.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 г.г. (государственный контракт № П384 «Разработка молекулярно-генетических основ мультифакториальной патологии человека (на модели генов цитокинов»)».

Цель: Изучить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование и клиническое течение хронического лимфолейкоза.

Задачи:

1. Изучить распространенность полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли а (-308С/А ЮТа), лимфотоксина а (+250АЛЗ а), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36А/0 ТЫРЮ) и 2-го (+1663АЛЗ ЮТ!^) типов у больных ХЛЛ и в популяционной выборке.

2. Рассмотреть роль молекулярно-генетических маркеров и их комбинаций в формировании хронического лимфолейкоза.

3. Исследовать влияние генетических полиморфизмов на дебют хронического лимфолейкоза.

4. Проанализировать ассоциации генов-кандидатов с особенностями клинического течения хронического лимфолейкоза.

5. Оценить взаимосвязь генетических вариантов факторов некроза опухолей, и их рецепторов с гематологическим статусом больных хроническим лимфолейкозом.

Научная новизна. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов факторов некроза опухолей (-3080/А ТОТа, +250ААл На) и их рецепторов (+36А/С ЮТИЛ, +1663А/в ШРН2) с развитием хронического лимфолейкоза среди русского населения Центральной России. Установлены генетические факторы подверженности к хроническому лимфолейкозу. Выявлены молекулярно-генетические маркеры повышенного риска тяжелого клинического течения заболевания и развития осложнений в дебюте и течение ХЛЛ. Определены межгенные сочетания, ассоциированные с формированием ХЛЛ.

Научно-практическое значение. Установленные в исследовании молекулярно-генетические маркеры неблагоприятного клинического течения ХЛЛ могут быть использованы в работе гематологических стационаров для выявления среди больных группы риска тяжелого течения заболевания, развития осложнений. Полученные данные послужат основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития ХЛЛ. Результаты работы используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Аппобация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009), 63-й Итоговой научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (Ростов-на-Дону,

2009), II международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине», посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2009), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов» (Белгород, 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы полиморбидной патологии в клинике внутренних болезней (Белгород, 2010), IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010), V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва,

2010), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011).

Личный вклад автора. Автором лично определены цель и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведено клиническое обследование всех больных ХЛЛ. Автор лично принимал участие в выполнении молекулярно-генетических исследований, проводил обработку, анализ и обобщение полученных результатов, подготовку основных публикаций по выполненной работе, апробацию результатов исследования, написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетические полиморфизмы -ЗОБв/А ТЫ Ра, +250АЛЗ Ыа и +1663А/О ТОТ 112 определяют риск формирования хронического лимфолейкоза.

2. Молекулярно-генетические маркеры ассоциированы с клиническими особенностями дебюта хронического лимфолейкоза.

3. Клиническое течение заболевания связано с генами-кандидатами.

4. Гематологический статус больных зависит от носительства определенных генетических вариантов факторов некроза опухолей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 12 таблиц и 35 рисунков. Библиографический указатель содержит 206 наименований, из

которых 135 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика исследованных групп

Группу исследования составили 516 человек: 208 больных хроническим лимфолейкозом и 308 человек популяционного контроля.В нее включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имеющие родства между собой. Среди 208 больных ХЛЛ мужчин было 116 человек (55,77%), женщин - 92 (44,23%). В популяционной выборке (п=308) распределение по полу было аналогичным: мужчины - 160 человек (51,95%), женщины - 148 (48,05%) (р>0,05). Средний возраст больных составил 65,46±9,69 лет (варьировал от 34 до 88 лет), популяционной выборки -62,20±6,28 лет (варьировал от 18 до 79 лет) (р>0,05).

Клинико-лабораторное обследование больных проводилось на базе отделения гематологии Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Среди 208 больных детально изучены клинические особенности хронического лимфолейкоза в дебюте и течение заболевания, наличие септических, цитопенических и сочетанных осложнений, оценен гематологический статус и общая выживаемость пациентов.

Всем больным с ХЛЛ и индивидуумам популяционного контроля проводилось типирование четырех молекулярно-генетических маркеров: диаллельные локусы генов фактора некроза опухоли a (-308G/A TNFa), лимфотоксина a (+250A/G Lt a), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36A/G TNFR1), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+] 663A/G TNFR2). Генотапирование осуществлялось в лаборатории "Молекулярной генетики человека" медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Молекулярно-генетические методы

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. 3á6op венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1985) . Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе с флюоресцентной детекцией IQ5 (Bio-Rad) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол»

Генотипирование ДНК-маркеров осуществлялось методом дискриминации аллелей на основе Tag Man зондов с использованием программного обеспечения - Standart Edition Version 2,0 (Bio-Rad).

Статистические методы

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с ' использованием программы «ЗТАТКТЮА 6.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами (Животовский Л. А., 1983). Для оценки соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использовали критерий %2 (Вейр Б, 1995).

Ассоциации молекулярно-генетических маркеров с

предрасположенностью к хроническому лимфолейкозу, а также с качественными признаками, характеризующими особенности его дебюта, клинического течения, прогрессирования оценивали с помощью таблиц сопряженности 2x2 с расчетом критерия /2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (СЖ) с 95% доверительным интервалом (С1) (БсЫезвеипап I., 1982). Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ХЛЛ проведен с помощью программного обеспечения АР8атр1ег (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику (Рауогоу А. V., ег а1., 2005). Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводили с использованием поправки Бонферрони (Реброва О. Ю., 2006).

При изучении связей генетических полиморфизмов с патогенетически значимыми количественными признаками ХЛЛ в начале оценивали характер распределения исследуемых признаков с использованием критерия Шапиро-Уилка (Реброва О. Ю., 2006). Получено, что распределение всех исследуемых количественных признаков (гематологические и др. показатели) не соответствовало закону нормального распределения и поэтому для их описания применяли медиану (Ме) и интерквартильный размах ((}25-<375), а для сравнительного анализа - критерий Манна-Уитни (Реброва О. Ю., 2006).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование роли генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании хронического лимфолейкоза

Изучение частот генотипов исследуемых генетических маркеров показало, что для всех рассмотренных локусов, как среди больных ХЛЛ, так и в популяционной выборке, эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (р>0,05). Уровень аллельного разнообразия по изученным локусам варьировал от Но=0,25 (для локуса -3080/А ТЫГа) до Но=0,48 (для локуса +36АЛЗ ЮТШ) среди больных ХЛЛ, и от Но=0,18 (для локуса -308С/А ЮТа) до Но=0,53 (для локуса +36А/О таИИ) в популяционной выборке.

Установлено (табл.), что концентрация генетических вариантов +250 в и а, +1663С ЮТЯг и +1663СО ТЫП12 среди больных ХЛЛ в 1,2-1,4 раза

больше по сравнению с контрольной группой (с учетом поправки Бонферрони рсог=0,02-0,007), а частота генотипа +1663АА TNFR2- меньше, чем контроле (р=0,009, рсог=0,027).

С помощью биоинформатических подходов выявлены сочетания вариантов исследуемых генов факторов некроза опухолей и их рецепторов, ассоциированные с формированием хронического лимфолейкоза. Сочетание генотипа -308GG TNFa с аллелями +250А Lta и +1663А TNFR2 наблюдается у 32,04% больных XJIJI и у 52,13% индивидуумов популяционного контроля (OR=0,45, 95% CI 0,31-0,65, ргог=0,002). Протективным фактором развития хронического, лимфолейкоза является комбинация генетических вариантов -308GG TNFa и +1663А TNFR2, которая встречается у 34,47% больных и 53,11% популяционного контроля (OR= 0,47, 95% CI 0,33-0,69, pcor=0,007).

Полученные данные свидетельствуют о важной роли генетических полиморфизмов -308G/A фактора некроза опухоли a, +250A/G лимфотоксина a , +1663A/G рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа в формировании генетической предрасположенности к хроническому лимфолейкозу. Наличие генетических вариантов +250G Lt a, +1663G TNFR2, +1663GG TNFR2, контролирующих повышенную продукцию соответствующих цитокинов (Patuzzo С. et al., 2000) обуславливает высокий риск развития хронического лимфолейкоза (<Ж=1,38-1,83), тогда как генетические маркеры +1663АА TNFR2, сочетания -308GG TNFa, +250А Lta, +1663А TNFR2 и -308GG TNFa, +1663А TNFR2 являются протективными факторами по данной патологии (OR=0,45-0,50). Согласно литературным данным (Hulkkonen J., 2002, Кучер А. Н. и др., 2010) факторы некроза опухолей (фактор некроза опухоли а, лимфотоксин а), реализующие свои эффекты через специфические рецепторы (и в том числе рецепторы фактора некроза опухоли 2-го типа), обладают провоспалительным действием, участвуют в регуляции апоптоза, пролиферативных процессов в организме и могут играть важную роль в этиопатогенезе хронического лимфолейкоза (Demeter J. et al., 1997, Bogunia-Kubik К. et al., 2006, Бакиров Б. А. и др., 2005).

2. Молекулярно-генетические маркеры и гематологический статус

больных ХЛЛ

При изучении ассоциаций генетических полиморфизмов с гематологическими показателями больных ХЛЛ установлено, что пациенты с развившейся анемией в дебюте заболевания характеризуются максимальной концентрацией молекулярно-генетического маркера +250GG Lt а (28,58%), что статистически достоверно с высоким уровнем значимости (^2=10,40, р=0,002, pcor=0,006, OR=8,37, 95% CI 1,93-34,47) превышает показатель контрольной группы (4,57%). Следует отметить, что индивидуумы с генотипами +250GG Lt а и +250AG Lt а также отличаются высоким уровнем ретикулоцитов и лимфоцитов.

Таблица

Распределение полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и _их рецепторов у больных ХЛЛ и в популяционном контроле,%

2 о ^ Аллели, Больные ХЛЛ (п=208) Контрольная группа (п=308) СЖ (95% С1)

о <=; генотипы п % п %

+250 А 290 70,73 473 77,04 0,75 (0,53-0,96) 72=4,81; р=0,02

а Д +250 в 120 29,27 141 22,96 1,38 (1,03-1,86) /2=4,81; р=0,02

О о +250 АА 102 49,75 180 58,63 0,69 (0,48-1,01) /2=3,56; р=0,05

и-1 ¥ +250 Ав 86 41,96 113 36,80 1,19(0,81-1,73) »2=0,73; Р=0,39

+250 Ой 17 8,29 14 4,57 1,86(0,85-4,10) /2=2,25; р=0,13

-308 0 344 85,57 539 88,94 0,72 (0,49-1,07)

а -308 А 58 14,43 67 11,06 Х2=2,47; р=0,11

< -308 Ов 147 73,13 242 79,87 0,68 (0,44-1,06) /2=2,74; р=0.09

О оо о го -308 йА 50 24,85 55 18,15 1,52 (0,96-2,39) ■/2=3,26; р=0,07

-308 АА 4 2,02 6 1,98 0,67 (0,43-1,04) Х,2=3,05; р=0,08

+36 в 225 54,09 318 51,62 1,25 (0,97-1,61) /2=0,51;р=0,47

2 и. +36 А 191 45,91 298 48,38 0,90(0,70-1,17) /2=0,51; р=0,47

о ^ чо + +36 БС 62 29,81 76 24,68 1,29 (0,85-1,96) /2=1,41; р=0,23

+36 Ай 101 48,56 166 53,89 0,80 (0,56-1,16) /2=1,21 ;р=0,27

+36 АА 45 21,63 66 21,43 1,01 (0,64-1,58) /2=0,00; р=1,00

сч о£ и, О < +1663 О 279 67,72 341 55,74 1,67(1,28-2,19) /2=14,76; р=0,0007

+1663 А 133 32,28 269 44,26 0,59 (0,45-0,78) /2=14,76; р=0,0007

+1663 ее 98 47,57 101 33,12 1,83 (1,25-2,67) /2=10,21; р=0,002

т + +1663 Ав 83 40,29 138 45,24 0,81 (0,56-1,18) /2=1,03; р=0,30

+1663 АА 25 12,14 66 21,64 0,50 (0,29-0,84) /2=6,95; р=0,009

Получено, что у пациентов с 0-1 стадиями заболевания, имеющими генетические варианты +25000 Ы а и +250АО а, медиана содержания ретикулоцитов в дебюте ХЛЛ составила 7%о (нижний квартиль - 6%0, верхний квартиль - 8%о), тогда как среди индивидуумов с генотипом +250 АА Ы а этот показатель был ниже и равнялся 5%о (интерквартильный размах

- 2-6%о, р=0,02). Уровень лимфоцитоза у пациентов с генетическими вариантами +250 ОО 1Лх и +250 АО 1,1а (медиана - 75,50%, нижний квартиль

- 61,00%, верхний квартиль - 84,00%) выше, чем у пациентов с генотипом -250 АА Ы а (медиана -69,00%, интерквартильный размах - 45,00-80,00%, р=0,02).

Рис. 1. Частота аллеля -308 A TNF а среди больных ХЛЛ с тромбоцитопенией и в контрольной группе, %

Установлены значимые связи генетических полиморфизмов -308 О/А TNF а и +250 A/G Lta с развитием тромбоцитопении в течение заболевания. Частота аллеля +250 G Lta среди больных ХЛЛ с тромбоцитопенией является наибольшей и составляет 38,00%, тогда как в контрольной группе этот показатель равняется 22,96% (х2=4,92, р=0,03, OR=2,05, 95% CI 1,08-3,90). Высокая концентрация аллеля -308 A TNF a обнаружена у пациентов ХЛЛ с тромбоцитопенией (21,15%) в сравнении с данными популяционного контроля (11,06%, OR=2,16, р=0,05) (рис.1)

У пациентов с III—IV стадиями заболевания содержание зрелых лимфоцитов в миелограмме ассоциировано с генетическим полиморфизмом +1663 AJG TNFR2: у больных с генотипами +1663 GG и +1663 AG TNFR2 медиана уровня зрелых лимфоцитов составляет - 73,6% (интерквартильный

размах 64,75 - 83,00%) и в 1,6 раза превышает аналогичный показатель индивидуумов с генетическим вариантом +1663 АА Т№К2 (медиана -45,0%, интерквартильный размах - 30,0-62,0%, р=0,04) (рис. 2).

Таким образом, генетические варианты факторов некроза опухолей и их рецепторов ассоциированы с патогенетически значимыми гематологическими показателями больных ХЛЛ.

90

80

70

60

с 50 х

% 40

30

20

Median □ 25%-75% . X Min-Max

+1663 AATNFR2

+1663 GG и +1663 AG TNFR2

Рис. 2. Содержание зрелых лимфоцитов в миелограмме у больных ХЛЛ с III-IV стадиями заболевания в зависимости от генотипов локуса +1663 АЛЗ

ТЫРЯ2

3. Ассоциации генов-кандидатов с клиническими и клинике-лабораторными проявлениями хронического лимфолейкоза.

Важнейшей интегральной клинической характеристикой хронического лимфолейкоза, отражающей степень распространенности процесса, уровень лейкоцитоза, характер угнетения нормальных ростков кроветворения, является стадия заболевания (Руководство по гематологии, 2003). В исследуемой выборке (п=200), согласно классификации К. Rai (1975 г.) 0—1 стадии заболевания были зарегистрированы у 77 пациентов (38,5%), II стадия - у 94 пациентов (47%), III и IV стадии - у 29 пациентов (14,5%).

Установлено, что у пациентов с III и IV стадиями заболевания (рис. 3) концентрация молекулярно-генетического маркера +25000 лимфотоксина а составляет 18,19% и является наибольшей (в 2-4,75 раза) по сравнению как с контрольной группой (4,75%, х;2=7,67, р=0,01, рсог=0,03, ОК=4,62, 95% С1 1,45-14,38), так и с больными, имеющими другие стадии ХЛЛ (3,91% при II стадии и 9,31% при 0-1 стадиях,р=0,03-0,05). Также, среди больных с Ш-1У стадиями заболевания зарегистрирована и более высокая частота аллеля +250 О и а (33,33%), чем в контрольной группе (22,96%, -/2-3,38, р=0,05, 011=1,71, 95% С1 1,01-3,02).

Контрольная группа Пациенты с 0-1 Пациенты со II Пациенты с 1Н-1У

стадиями стадией стадиями

Рис. 3. Частота генотипа +250 ОО Ы а у больных ХЛЛ с различными стадиями заболевания и в контрольной группе, %

Выявлены особенности «генетической конституции» больных ХЛЛ с различными группами риска. Среди пациентов с низкой группой риска концентрация аллеля +36 в ТОТШ составляет 71,43% и в 1,4 раза превышает аналогичный показатель контрольной группы (51,62%, х2=18,78, р=0,0005, ОЯ=2,34, 95% С1 1,57-3,50). Наряду с этим распространенность генотипа +250 ОО 1л а у больных ХЛЛ с высокой группой риска (17,86%) в 3,9 раза больше частоты этого маркера в популяционном контроле (4,75%, х2=6,17, р=0,01, рСОг=0,03, 011=4,55, 95% С1 1,30-15,20).

Далее мы провели анализ ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с развитием осложнений в дебюте и течение хронического лимфолейкоза. Установлена значимая роль генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании осложнений ХЛЛ в дебюте заболевания. Среди больных ХЛЛ, имеющих цитопенические осложнения при манифестации заболевания, частота генотипа +250 ОО 1Л а составляет 21,88% и в 5 раз превышает аналогичный показатель в контрольной группе (4,57%, х2=12,12, р=0,001, рсог=0,003 , 011=5,36 95% С1

1,93-17,42) (рис. 4). Среди пациентов без осложнений в дебюте заболевания распространенность этого маркера равна 6,72% (х2=5,45, р=0,02, рсог=0,06). Индивидуумы, имеющие сочетанные осложнения при манифестации ХЛЛ, характеризуются наибольшей концентрацией аллеля +1663 О ТЫ РК2 (79,17%) в сравнении с контрольной группой (55,74%, х2=4,19, р=0,04, (Ж=3,0 95% С1 1,04-9,29).

Генетические варианты лимфотоксина связаны с развитием цитопенических осложнений и в течение хронического лимфолейкоза: частота аллеля +250в 1Л а среди больных с цитопеническими осложнениями (36,25%) в 1,6 раза превышает концентрацию этого маркера в контрольной группе (22,96%, 3(2=6,06, р=0,01, (Ж=1,91, 95% С1 1,13-3,21).

Важным клиническим признаком хронического лимфолейкоза является наличие симптомов интоксикации (В-симптомы) (Воробьев А. И., 2007): слабость, потливость, снижение массы тела. Выявлена высокая частота аллеля +1663 в ТКТРК2 у больных, имеющих снижение массы тела (81,25%), что превышает аналогичный показатель контрольной группы (55,74%, Х2=6,98, р=0,009, (Ж=3,42, 95% С1 1,32-9,40).

30 -1

Популяционный контроль Пациенты без осложнений Пациенты с

цитопеническими осложнениями

Рис. 4. Частота генотипа +250 СО а среди больных ХЛЛ с цитопеническими осложнениями в дебюте заболевания и в контрольной

группе, %

Одним из прогностически значимых клинико-лабораторных признаков ХЛЛ служит уровень лактатдегидрогеназы (Воробьев А. И., 2007). Получено, что у больных ХЛЛ со II стадией заболевания, имеющих генотипы +1663 СЮ ТНРК2 и +1663 АС ТЫ Р112 уровень лактатдегидрогеназы (медиана 208 ед/л, нижний квартиль - 203 ед/л, верхний квартиль - 282 ед/л) статистически достоверно (р=0,04) превышает аналогичный показатель индивидуумов с генотипом +1663 А А "ТОИ^ (медиана - 182 ед/л, интерквартильный размах

- 134-188 ед/л). Также выявлены, ассоциации генетического полиморфизма +36 A/G TNFR1 с уровнем лактатдегидрогеназы у больных с III-IV стадиями ХЛЛ: больные с генотипами +36 GG TNFR1 и +36 AG TNFR1 имеют значительно более высокий (в 1,76 раза) уровень лактатдегидрогеназы (медиана — 327 ед/л, нижний квартиль - 280 ед/л, верхний квартиль - 420 ед/л) по сравнению с индивидуумами с генетическим вариантом +36 АА TNFR1 (медиана - 186 ед/л, интерквартильный размах - 148-398 ед/л, р=0,04) (рис.5).

Итак, полученные результаты позволяют сделать вывод о важном клиническом значении генетических полиморфизмов +250 A/G лимфотоксина а, +36 A/G рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа, +1663 A/G рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа при хроническом лимфолейкозе. Следует отметить, что наши результаты соответствуют литературным данным, свидетельствующим о вовлеченности генетических вариантов лимфотоксина а в формирование XJDI (Бакиров Б. А. и др., 2005)

+36 GG и +36 AG TNFR1 +36 AATNFR1

Рис. 5. Уровень ЛДГ у больных ХЛЛ с III—IV стадиями заболевания в зависимости от генотипов локуса +36 A/G TNFR1 (в дебюте заболевания)

ВЫВОДЫ

1. Генетические полиморфизмы лимфотоксина а (+250А/0 Ы а), фактора некроза опухоли а (-3080/А ТОТа), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36А/0 ТЫРЯ!) и 2-го (+1663А/С ТМ^) типов ассоциированы с формированием хронического лимфолейкоза, клиническими особенностями в дебюте и течение заболевания, гематологическим статусом больных.

2. Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска возникновения хронического лимфолейкоза являются +25СЮ 1Ла (011=1,38, р=0,02), +16630 ТОТ!^ (ОЯ=1,67, р=0,0007) и +166300 ШРК2 (ОЯ=1,83, рсог=0,006), а протективным фактором развития заболевания служит -+ 1663АА ТОТК2 (0я=0,50, р=0,03). Сочетания генетических вариантов -30800 Тора, +250А 1ла, +1663А ЮТ112 (011-0,45, рсог=0,002) и -3080С ТЫРа, +1663А ТОРЯ2 (011=0,47, рсог=0,007) в популяционном контроле наблюдаются чаще, чем среди больных.

3. Концентрация генотипа +250 Ов лимфотоксина а среди больных с III и IV стадиями заболевания (18,19%) в 4 раза превышает показатели популяционного контроля (4,57%, р=0,03). Низкую группу риска при хроническом лимфолейкозе маркирует аллель +36й ТЫРЮ (011-2,34). высокая группа риска связана с генотипом +250 вО [Да (011=4,55).

4. В дебюте хронического лимфолейкоза фактором риска возникновения цитопенических осложнений является +250 ОО 1ла (ОЯ=5,86), формирование сочетанных осложнений ассоциировано с +1663 О таР112. Отношение шансов развития анемии при манифестации заболевания у индивидуумов с генотипом +250 00 ТЛгх составляет ОЯ=8,37 (рсог=0,006).

5. Генетические варианты -308А тара и +250 О 1Да маркируют развитие тромбоцитопении (ОЯ=2,16 и 011=2,05, соответственно), а полиморфный маркер +16630 ТЫР112 ассоциирован со снижением массы тела у больных в течение хронического лимфолейкоза (ОЯ=3,42). На Ш-1У стадиях заболевания уровень лактатдегидрогеназы связан с полиморфизмом +36А/0 ТЫРШ, а содержание зрелых лимфоцитов в миелограмме ассоциировано с генетическими вариантами локуса +1663А/О ТЫРК2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления индивидуумов повышенного риска развитая хронического лимфолейкоза следует проводить молекулярно-генетическое тестирование генов лимфотоксина а (+250АЮ 1Ла) и рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (+1663А/0 ТЫР112).

2. В гематологических стационарах при обследовании пациентов с хроническим лимфолейкозом в качестве маркера формирования III и IV стадий заболевания, возникновения цитопенических осложнений следует использовать генетический полиморфизм +250А/С 1Ла, а маркером развития симптомов интоксикации может являться +16630 ТОТЯ2. У больных хроническим лимфолейкозом рекомендуется использовать в качестве маркеров повышенного риска развития тромбоцитопении генетические

варианты -308А TNFa и +250G Lta.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

лдг - лактатдегидрогеназа

ПЦР - полимеразная цепная реакция ■

хлл - хронический лимфолейкоз

Lt - лимфотоксин

TNF - фактор некроза опухоли

TNFR1 - рецептор фактора некроза опухоли 1-го типа

TNFR2 - рецептор фактора некроза опухоли 2-го типа

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Популяционно-генетическая структура и анализ распространенности генов-кандидатов ряда мультифакториальных заболеваний среди населения / М.И. Чурносов, Е.В. Некипелова, Т.С. Тикунова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. — 2008. — № 6, вып. 6.-С. 34-39.

2. Особенности распространения полиморфизма гена фактора некроза опухоли a среди населения Белгородской области / Е.В. Калмыкова, Т.С. Тикунова, М.И. Чурносов // 63-я итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (MHO) : аннотации докл. и материалов дня науки / Ростов, гос. мед. ун-т. — Ростов н/Д, 2009.-С. 173.

3. Тикунова, Т.С. К вопросу о распределении частот аллелей и генотипов молекулярно-генетических маркеров факторов некроза опухоли среди населения / Т.С. Тикунова, Е.В. Калмыкова, М.И. Чурносов // Инновации в медицине : материалы второй междунар. дистанц. науч. конф., посвящ. 75-летию КГМУ / Курский гос. мед. ун-т, Цетр.-Чернозем. науч. центр Рос. акад. мед. наук, Общерос. обществ, орг. «Рос. союз молодых ученых». — Курск, 2009. - С. 188-190.

4. Тикунова, Т.С. Анализ алельного и генотипического разнообразия по локусу TNFa в группе больных хроническим лимфолейкозом / Т.С. Тикунова // Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине : сб. материалов X междунар. конгр., Москва, 9-12 дек. 2009 г. / РУДН. - М., 2009. - С. 946-947.

5. Тикунова, Т.С. Исследование генетического полиморфизма по локусу -250 G/A Lta среди больных хроническим лимфолейкозом / Т.С. Тикунова // Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов : материалы межрегион, науч.-практ. конф., Белгород, 17 дек. 2009 г. / Белгор. гос. ун-т [и др.]. - Белгород, 2009. - С. 58.

6. Молекул ярно-генетические маркеры цитокинов: популяционная распространенность и связь с мультифакториальной патологией / Е.В. Калмыкова, Т.С. Тнкунова, И.А. Юшина [и др.] // Вестник РУДН. Сер. Медицина. - 2009. - № 4. - С. 617-618.

7. Тикунова, Т.С. О распределении аллелей и генотипов локуса -308 G/A TNFa у больных хроническим лимфолейкозом / Т.С. Тикунова // Материалы IV международной научной конференции молодых ученых-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г. : в 3 т. / Кур. гос. мед. ун-т, Воронеж, гос. мед. акад., Центр.-Чернозем. науч. центр Рос. акад. мед. наук [и др.]. -Курск, 2010.-Т. 1.-С. 251-252.

8. Ассоциации полиморфизма -308 G/A TNFa с клиническими особенностями хронического лимфолейкоза / Т.С. Тикунова, С.С. Сиротина, O.A. Ефремова [и др.] // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г. -Ростов н/Д, 2010. - С. 178. - (Медицинская генетика. Прил. к журн.).

9. Материалы клинико-генетического исследования хронического лимфолейкоза / И.К. Аристова, Т.С. Тикунова, O.A. Ефремова [и др.] // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г. - Ростов н/Д, 2010. - С. 11. -(Медицинская генетика. Прил. к журн.).

Ю.Тикунова, Т.С. Оценка роли полиморфного локуса -36A/G TNFR1 в формировании хронического лимфолейкоза / Т.С. Тикунова II Актуальные вопросы полиморбидной патологии в клинике внутренних болезней : материалы междунар. науч-практ. конф., Белгород, 20 мая 2010 г. / БелГУ, Департамент здравоохранения и соц. защиты населения по Белгор. обл. ; под ред. O.A. Ефремовой. - Белгород, 2010. - С. 82-83.

11 .Тикунова, Т.С. Маркеры -1663G TNFR2 и -1663GG TNFR2 - факторы риска в развитии хронического лимфолейкоза / Т.С. Тикунова, М.И. Чурносов // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2010. - № 2. - С. 15. - (Геронтологические чтения-2010 : материалы третьей междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 11-12 нояб. 2010 г.).

12.Тикунова, Т.С. Генетический полиморфизм лимфотоксина (-250 G/A Lta) при хроническом лимфолейкозе / Т.С. Тикунова // Вестник новых медицинских технологий. - 2010. - Т. 17, № 2, прил. - С. 120-121. - (IX Всероссийская университетская научно-практической конференция молодых ученых по медицине : сб. материалов).

13.Тикунова, Т.С. Результаты генотипирования фактора некроза опухоли альфа и интерлейкина-1А у больных хроническим лимфолейкозом / Т.С. Тикунова, С.С. Сиротина // Вестник РГМУ. - 2010. - Спец. вып. № 2. - С. 561.

14.Тикунова, Т.С. Изучение молекулярно-генетического маркера +36A/G TNFR1 у больных хроническим лимфолейкозом / Т.С. Тикунова // Вестник РГМУ.-2011.-Спец. вып. № 1.-С. 72.

15.Тикунова, Т.С. Ассоциация полиморфного маркера +250 A/G Lta с группами риска хронического лимфолейкоза / Т.С. Тикунова // Медико-

биологические аспекты мультифакториальной патологии : II всерос. науч,-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 17-19 мая, 2011 г. : сб. материалов / КГМУ Минздравсопразвития России ; [отв. ред. В.П. Иванов].-Курск, 2011.-С. 106-107. 16.Тикунова, Т. С. Анализ вклада сочетаний генов факторов некроза опухоли "и их рецепторов в генетическую предрасположенность к хроническому лимфолейкозу. Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация.-2012.-№4(123), вып. 17.-С. 190-192.

Подписано в печать 19.04.2012 г. Формат издания 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Ризография. Уч.-изд. Л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 15687

Отпечатано в типографии «Принтмастер»,

308012, г. Белгород, ул. Костюкова, 16а