Экспрессия гена липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе

Бидерман, Белла Вениаминовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе"

□034588Э8

Бидерман Белла Вениаминовна

Экспрессия гена лнпопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008 \

003458898

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Судариков Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Хамаганова Екатерина Георгиевна

диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г.Москва, Новый Зыковский пр-д, д.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

кандидат биологических наук Лунин Владимир Глебович

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита состоится

2009г., в

часов на заседании

Автореферат разослан <

Ь* 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из наиболее распространенных лимфатических опухолей является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ). Существуют разные формы этого заболевания, различающиеся по клинической картине. В одних случаях болезнь быстро прогрессирует, а в других - годами не требует лечения. Общая выживаемость варьирует от нескольких месяцев до 20 лет и более.

В прогнозировании течения B-XJIJI могут иметь значение клинические, морфологические, цитогенетические, молекулярные и серологические параметры. Основным критерием, позволяющим прогнозировать течение В-ХЛЛ, является мутационный статус перестроенного гена иммуноглобулина в опухолевом клоне. Наличие мутаций (или, иными словами, высокая степень дифференцировки В-клетки) коррелирует с благоприятным прогнозом, отсутствие мутаций - с неблагоприятным. Однако, определение мутационного статуса трудо- и ресурсоемко и, по-видимому, не может быть использовано в качестве рутинного анализа. В то же время высокая распространенность В-ХЛЛ, а также появление новых возможностей лечения, требует ранней оценки прогноза заболевания с тем, чтобы как можно раньше начать лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания у каждого конкретного больного.

В последние годы зарубежные исследователи в экспериментах с микрочипами обнаружили несколько десятков генов, экспрессия которых существенно различается у больных различными типами В-клеточного хронического лимфолейкоза. Различия в экспрессии некоторых из этих генов (липопротеинлипазы (LPL), ZBTB20, ZAP-70 и др.) по результатам экспериментов с микрочипами довольно велики и относительно постоянны. Мы предположили, что эти гены могут использоваться в качестве альтернативных маркеров, заменяющих мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулина (IgVH). Экспрессионный анализ с помощью микрочипов решает проблему прогнозирования течения B-XJIJI. Однако этот анализ еще более трудоемок, дорог и не всегда надежен.

В то же время, мы считаем, что выборочная оценка уровня экспрессии наиболее значимых генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени при адекватных контролях представляет собой альтернативу этому важному методу и может стать фактором прогноза.

Цель исследования

Выяснить прогностическое значение уровня экспрессии, определенного с помощью ПЦР в реальном времени, генов, экспрессия которых различается при разных вариантах В-клеточного хронического лимфолейкоза.

Задачи исследования

1. Определение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов на ретроспективной выборке больных.

2. Определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 методом ПЦР в реальном времени у данной выборки больных, в разных субпопуляциях клеток крови больных и доноров.

3. Оценка корреляции уровня экспрессии вышеуказанных генов и мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов, а также других прогностических признаков B-XJIJI.

4. Определение прогностической значимости уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 при В-ХЛЛ.

Научная новизна работы

Проведено определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT10, SLAM, ADAM29 на большой коллекции образцов мононуклеаров периферической крови больных B-XJIJI и в отдельных субпопуляциях клеток крови. Проведен статистический анализ корреляции уровня экспрессии исследуемых генов с клиническими данными больных В-XJIJI. Установлена значительная корреляция относительной экспрессии генов LPL, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Показано, что увеличение уровня экспрессии LPL не связано со статусом активации клеток и не зависит от уровня экспрессии известных транскрипционных факторов. Предложен новый маркер прогноза при B-клеточном хроническом лимфолейкозе.

Значение для теории и практики

Измерение уровня экспрессии LPL методом ПЦР в реальном времени может предсказать прогноз на ранних стадиях B-XJIJI, что даст возможность своевременно назначить лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания у каждого конкретного больного. Кроме того, детальный анализ генов, экспрессия которых коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов, может открыть неизвестные пока аспекты патогенеза B-XJIJI.

Основные положения, выносимые на защиту

Липопротеинлипаза - эффективный маркер течения болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Измерение уровня экспрессии LPL методом ПЦР в реальном времени предсказывает прогноз на ранних стадиях В-ХЛЛ, и может быть использовано при выборе терапии, адаптированной к риску.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на III международной конференции, посвященной лечению лимфатических заболеваний (Палермо, 2006г.), на VI съезде гематологов и трансфузиологов республики Беларусь (Минск, 2007г.), на XII международном симпозиуме по XJIJI (Лондон, 2007), на XI Российском онкологическом конгрессе в рамках VI конкурса молодых ученых по онкологии (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, включая 4 статьи и 3 тезисов докладов, в т.ч. 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 90 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 12 рисунков и 6 таблиц. Список цитированной литературы включает 108 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав.лаб. - к.б.н. Судариков А.Б.). Исследования выполнялись при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№04-04-48154-офи_а, 06-04-49707-а).

Пациенты. Это исследование проводили на образцах, полученных от 157 пациентов с В-ХЛЛ и 10 доноров с их согласия. Материал больных был выбран из базы данных Гематологического Научного Центра на основании наличия клинических результатов. Для 8 пациентов не были доступны данные о стадии заболевания. Сведения о времени удвоения лимфоцитов были известны для 107 пациентов. Цитогенетические данные (стандартное карио-типирование и флуоресцентная гибридизация in situ) были доступны у 57 больных. Средний возраст пациентов с В-ХЛЛ 55 лет (разброс 28-83 лет), 107 из них мужчины, 50 - женщины. У большинства пациентов (N=121) были взяты мононуклеары периферической крови (МПК) и мгновенно заморожены для выделения мРНК. У 42 пациентов была проведена предварительная селекция С019-позитивных клеток перед выделением мРНК. У 18 пациентов была проведена селекция CD3+, CD38+, CD38- клеток. Большинство пациентов (N=135) не проходили курс лечения в момент взятия образца крови. Все 10 доноров крови, предоставившие контрольные образцы, были старше 50 лет.

Выделение, селекция и активация клеток. МПК выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque. Клетки мгновенно замораживали в жидком азоте и помещали на хранение при

температуре -70°С. Клетки, экспрессирующие молекулы CD 14 (моноциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цитотоксические клетки) и CD 19 (В-лимфоциты) были селектированы из свежих суспензий МПК иммуномагнитной сепарацией с использованием Dynabeads М-450 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки, экспрессирующие CD3, удаляли из МПК тем же методом с применением CD3 MicroBeads (Myltenyi Biotech). Оставшиеся клетки разделяли на популяции CD38+ и CD38- также методом иммуномагнитной сепарации с CD38 MicroBeads (Myltenyi Biotech). Чистота популяций была подтверждена с помощью проточной цитометрии и превышала 95%. Активированные клетки доноров, экспрессирующие CD 19, получали путем инкубации с митогеном Фитолакки МПК, свободных от CD4+ и С08+-клеток, в течение 4х дней.

Выделение РНК и обратная транскрипция. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Концентрацию определяли спектрофотометрически. Для обратной транскрипции использовали 2мкг РНК каждого образца. Одноцепочечную кДНК синтезировали с использованием случайных гексанукпеотидов в качестве затравки и обратной транскриптазы М-MLV (Promega).

ПЦР в реальном времени. Праймеры и пробы TaqMan для генов ТВР, ZAP70, ZBTB20, DMD, LPL, SLAM, ADAM29, SEPT10, IL-lb, PPAR-A, PPAR-G, PPAR-D, NFY-A были выбраны с использованием программы Primer3 (http://frodu.wi mit.edu/cui-bin/primer3/primer3 wwwxgi) ИЛИ с ПОМОЩЬЮ баз данных Quantitative PCR Primer Database (http://web.ncifcrf.gov/rtp/GEL/primer(lb/default.asp) и RealTime PCR Primer and Probe Database (littp://medgen.imcru hc/nprimerdb). Последовательности праймеров представлены в Таблице 1.

Количественные ПЦР-реакции в реальном времени для определения уровня экспрессии генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, LPL проводили на приборе ABI Prism 7000 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). Реакцию проводили в объеме 25 мкл и включала в себя 5 мкл 2,5-кратного разведения кДНК, 250нМ специфичных праймеров, 200нМ пробы и универсальную смесь для ПЦР Reality™ (Биочип-ИМБ, Россия). Условия реакции включали в себя первоначальную денатурацию (95°С, 10 мин) и последующие 40 циклов из 95°С 15сек, 60°С бОсек. Каждое измерение проводили в трех повторах. В качестве внутреннего контроля использовали ген TATA-box binding protein (ТВР). Число копий гена рассчитывалось из калибровочной кривой, построенной на основании ПЦР-реакций разведения плазмидной ДНК (от 30 до 300000 копий).

Таблица 1. Праймеры и пробы, используемые для амплификации при ПЦР-РВ

Ген Праймер/ проба Последовательность

ТВР ТВР for 5'- GTTCTGGGAAAATGGTGTGC - 3'

ТВР rev 5'- CCAGGAAATAACTCTGGCTCA - 3'

ТВР probe 5'FAM- CAGTCCAGACTGGCAGCAAGAAAAT - TAMRA 3'

LPL LPL for 5' - GAGCCAAAGAACGAGCAAAA - 3'

LPL_rev 5 ' - CCACGGTGCCATGCAGAG - 3 '

LPL probe 5'FAM - CAGATGCCCTACAAAGTCAACCATTACCAA - TAMRA 3'

ZAP70 ZAP70 for 5' -CGCTGCACAAGTTCCTGGT - 3'

ZAP70 rev 5 ' - G ACACCTGGTGCAGCAGCT - 3 '

ZAP70 pr 5'FAM - CATTGCTCACAGGGATCTCCTCCCTCT - TAMRA 3 •

DMD DMD for 5 ' - TGGC АТС ATTTCCCTGTGTA - 3'

DMD rev 5 ' - AGGGCCGCTTCG ATCTCT - 3 '

DMD pr 5'FAM - GTTGGGTGAAGTTGCATCCT - TAMRA3'

ZBTB20 ZBTB20 for 5' - CGCCAAACAGAACTACGTCA - 3'

ZBTB20 rev 5 ' - TGAAGCGCTTGTTGCAG ATA - 3 '

ZBTB20 pr 5'FAM - CAAGCACATGGTGACACACA - TAMRA3'

IL-lb IL-lb for 5' - ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA - 3'

IL-lb rev 5' - GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT- 3'

IL-lb probe 5'FAM - CTCTGCCCTCTGGATGGCGG - TAMRA3'

ADAM29 ADAM29 for 5'- GCACTACACACTGACCAACT-3'

ADAM29 rev 5'- AG AAACACCCC AAGGCA ATG-3 '

ADAM29 pr 5'FAM - CCTGACTTCTGCTCTGGACCAGTGTTT - BHQ 3'

SEPT10 SEPT10 for 5'- GCGTTCTCTCTTTACCTACC -3'

SEPT 10 rev 5'- AGTGTCATCATCCGTTGGG -3'

SEPT10 pr 5'FAM -TACTTCATTTCACCGACAGGCCACTCT- BHQ 3'

SLAM SLAM for 5'- TTTCTCTCCCTGGCTTTTGG-3'

SLAM rev 5'- TCATCCTCCTTCCTGCTTTC-3 '

SLAM pr 5'FAM -TTGGGAAGCAAAGTGCTGCTGCCCCTG- BHQ 3'

NFY-A NFYA for 5' - AGTCTCGGCACCGTCATG - 3'

NFYA rev 5' - GCTTGGTTTGGATCCTGCAT - 3'

NFYA pr 5'FAM - TCGTCCACC7TCACCACGCTTCC - BHQ3'

PPAR-A PPAR-A for 5' - TGGCTGCTATCATTTGCTGTG - 3'

PPAR-A rev 5' - CATGTACAATACCCTCCTGCAT - 3'

PPAR-A jr 5'FAM - TCGTCCTGGCCTTCTAAACGTAGGAC - BHQ3 '

PPAR-G PPAR-G for 5' - ATGTCTCATAATGCCATCAGGTT - 3'

PPAR-G rev 5' - GATTCAGCTGGTCGATATCACT - 3'

PPAR-G pr 5'FAM - CCAACAGCTTCTCCTTCTCGGCCTG - BHQ3'

PPAR-D PPAR-D for 5' - GCCATCATTCTGTGTGGAGA - 3'

PPAR-D lev 5' - CAGGATGGTGTCCTGGATA - 3'

PPAR-D_pr 5'FAM - CCAGGCCTCATGAACGTTCCACG -BHQ3 '

Все результаты выражены в условных единицах, представляющих собой отношение среднего числа копий кДНК исследуемого гена к среднему числу копий гена ТВР (нормализованное число копий, НЧК).

Эксперименты по определению уровня экспрессии генов LPL, SLAM, ADAM29, SEPT 10, по исследованию профиля экспрессии генов в субпопуляциях клеток CD3+, CD38+ и CD38-, а также по изучению факторов транскрипции проводили на приборе АНК-32 (Синтол, Россия). Реакцию проводили в объеме 25 мкл, используя 3 мкл 5-кратного разведения кДНК, 200нМ специфичных праймеров, 200нМ пробы и универсальную смесь для ПЦР в реальном времени (Синтол, Россия). Условия реакции включали первоначальную денатурацию (95°С, 5 мин) и последующие 40 циклов из 95°С 15сек, 60°С 45сек. Каждое измерение проводили в трех повторах. Все гены-

мишени для каждого больного тестировали одновременно. В качестве эндогенного контроля также использовали ген ТВР. Все результаты выражены в условных единицах относительной экспрессии NE = 2 'а'ге?~ а>'"г^ где C/ ref -пороговый цикл амплификации КОНТРОЛЬНОГО Гена, Ct,tar ~ пороговый цикл амплификации исследуемого гена.

Анализ генов IgVH. Для определения клональной перестройки IgVH, кДНК, полученную из мононуклеаров (или С019+-клеток) пациентов амплифицировали в 6 отдельных реакциях с использованием праймеров, специфичных к VH-семействам, и консенсусного праймера JH (Campbell et а!., 1992). Если с этим набором клональность установить не удавалось, использовались праймеры, рекомендованные BIOMED-2 (van Dongen et al., 2003). Последовательности праймеров указаны в Таблице 2. ПЦР-реакцию проводили в программируемом термостате "Perkin Elmer" в объеме 25мкл, добавляя 3 мкл 5-кратного разведения кДНК, 5 пмоль каждого праймера и 2-кратную смесь для ПЦР, содержащую Taq-полимеразу (Promega). После первоначальной денатурации (5 мин при 95°С) цикл с условиями 95°С ЗОсек, 6(ГС ЗОсек, 72°С ЗОсек повторяли 35 раз, после чего выдерживали 10-минут при 72°С.

Таблица 2. Последовательности праймеров для определения мутационного статуса генов IgVH._

Источник праймep последовательность

{Campbell et al., 1992) VHl/7 5' - CTCACCATGGACTGGACCTGGAG - 3'

VH2 5' - ATGGACACACTTTGCT(A\C)CAC(G\A)CTC -3'

VH3 5' - CCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGG -3'

VH4 5' - ACATGAAACA(C\T)CTGTGGTTCTTCC -3'

VH5 5' - ATGGGGTCAACCGCCATCCT(C\T)G -3'

VH6 5' - ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTC -3'

JHcons 5' -CTTACCTGAGGAGACGGTGAC-3'

BIOMED-2 (van Dongen et al., 2003) VH1-FR1 5' - GGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAG - 3'

VH2-FR1 5' - GTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCC - 3'

VH3-FR1 5' - CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG - 3'

VH4-FR1 5' - CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG - 3'

VH5-FR1 5' - CGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGT- 3'

VH6-FR1 5' - TCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTG - 3'

JHcons 5' - CTTACCTGAGGAGACGGTGACC - 3'

Анализ результатов осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1мкг/мл) в TBE буфере (10х TBE: IM Tris, 0,83 М борная кислота, 10 mM EDTA) при напряженности электрического поля 10-15 В/см. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются как светящиеся полосы при возбуждении УФ-излучением с длиной волны 310 нм. Клональный продукт очищали электрофорезом в 2% агарозном геле и элюировали с помощью набора Diatom DNA Elution (Биоком, Россия). ПЦР-продукт секвенировали с праймера, специфичного семейству перестроенного VH-гена,

или с JHCo,ls с использованием набора Big Dye Terminator на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, Foster City, CA). Полученные последовательности сравнивали с имеющимися в базах данных IgBlast (http /Avww.iicbi.nlm.nih gov/ighlast) И 1MGT (http://imat eines fr/). Если последовательность клонального VH-гена совпадала с последовательностью одного из терминальных VH-генов на 98% и более, считали, что данный VH-ген соматической гипермутации не подвергался. При условии сходства последовательности клонального VH-гена менее 97,9%, считали, что клетка -предшественница клона B-XJIJI у данного больного подвергалась соматической гипермутации.

Статистический анализ. Связь между уровнями экспрессии генов ZAP70, ZBTB20, DMD, LPL, SLAM, ADAM29, SEPT10 и мутационным статусом IgVH описывали с помощью коэффициентов ранговой корреляции Спирмена (Гланц, 1999). Пороговые границы для дискриминации групп определяли с помощью индекса Юдена (Youden, 1950). Кривые выживаемости строили по методу Каплана-Мейер. Выживаемость определяли от даты первого анализа с установленным лимфоцитозом до смерти или до настоящего времени. Попарное сравнение групп проводили с использованием критерия %2 и точного теста Фишера. Статистическое сравнение уровней экспрессии генов в клетках различных популяций проводили при помощи непараметрического теста Манна-Уитни. Р-значения (Р<0,05) рассматривались как статистически значимые. Точные тесты Фишера, анализ выживаемости и корреляционный анализ проводился на программном обеспечении STATISTICA Version 6 (StatSoft, www statsoft.com ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика пациентов. В рамках данной работы мутационный статус был исследован у 157 пациентов с В-ХЛЛ. Распределение пациентов в зависимости от мутационного статуса представлено в таблице 3.

Средний возраст больных составлял 55 лет, разброс 28 - 83 года, из них 107 мужчин и 50 женщин. Распределение по стадиям во всей выборке приближается к генеральной совокупности. 27% больных имели стадию 0 (по Rai), 24% - стадию I, 35% - стадию II и 10% стадии III+IV (для 8 пациентов данные о стадиях болезни не были известны). Цитогенетические данные (стандартное кариотипирование и флуоресцентная гибридизация in situ) были доступны у 57 больных. 44% из них имели нормальный кариотип, 14% делецию 13q, 18% - делецию llq, 10% - трисомию 12 хромосомы. 14% больных имели комплексный кариотип и делецию 17р. Данные о времени удвоения лимфоцитов (ВУЛ) были доступны для 107 пациентов, для 51% из них ВУЛ было больше, чем 12 месяцев.

Для констатации факта прошедшей соматической гипермутации в клетках В-ХЛЛ использовали границу гомологии 98%. Если

последовательность клонального VH-гена на 98% и более совпадала с последовательностью одного из терминальных VH-генов, считали, что соматической гипермутации не было. Если сходство последовательности клонального VH-гена было менее 97,9%, считали, что клетка предшественница клона В-ХЛЛ у данного больного подвергалась соматической гипермутации. Граница в 98% гомологии установлена исходя из возможного аллельного полиморфизма терминальных VH-генов (Matsuda et ai, 1993). В группе больных с мутациями вариабельного региона средний уровень гомологии составил 94% (разброс 87% - 97,8%). 92 (58%) больных имели вариант без мутаций вариабельного региона, 65 (42%) - вариант с мутациями.

Наши результаты определения мутационного статуса отражают все общие закономерности, выявленные ранее. Так распределение больных в группах U-CLL и M-CLL было примерно равным. Имели место существенные демографические отличия. В группе U-CLL имелось явное преобладание мужчин. В целом, группа M-CLL характеризовалась более благоприятным течением В-ХЛЛ: в ней было меньше больных с развернутыми стадиями заболевания (И - IV) и больных, у которых ВУЛ составляло менее 12 месяцев, меньше больных с выраженной лимфаденопатией и спленомегалией. Также в этой группе достоверно больше больных с нормальным кариотипом и прогностически благоприятной делецией 13q. Как и ожидалось, мутационный статус достоверно дискриминировал прогностически разные группы больных В-ХЛЛ. Медиана выживаемости у больных с мутациями вариабельного региона составила 217 месяцев, у больных без мутаций - 76,8 месяца (Рисунок 7 А).

Группы также существенно различались по характеру использования VH, D и JH-генов. В группе U-CLL чаще всего использовались гены первого семейства и особенно часто VH1-69, тогда как в группе M-CLL такой зависимости не было (преобладали гены 3 семейства). Это также весьма характерно и, возможно, отражает признаки селекции антигеном.

Выбор контрольного гена. Для оценки экспрессии исследуемых генов необходимо было выбрать контрольный ген, сопоставимый по уровню транскрипции с мишенями, а также характеризующийся минимальным разбросом значений в клетках В-ХЛЛ. Был проведен анализ использовавшихся при В-ХЛЛ референтных генов в доступных базах данных и публикациях и выбрано несколько, включая GAPDH, ТВР, HPRT1, а также ген 18S рРНК. Эксперимент проводился на 10 неселектированных образцах РНК В-ХЛЛ,

Таблица 3. Распределение больных в зависимости от мутационного статуса генов

Варианты В-ХЛЛ

Без мутаций С мутациями Все больные

Число больных 92 65 157

Возраст 53.6 (28 - 83) 61.2 (22-78) 56 (22-83)

М/Ж 71:21 36:29 107:50

Стадии по Rai N % N % N %

0 9 10% 33 50% 42 27%

1 26 28% 11 17% 37 24%

2 43 47% 12 18% 55 35%

3+4 10 13% 5 8% 15 10%

Кариотип N % N % N %

нормальный 13 38% 12 54% 25 44%

dell3q 3 8% 5 23% 8 14%

delllq 8 23% 2 9% 10 18%

трисомия 12 5 14% 1 5% 6 10%

комплексЛ1е117р 6 17% 2 9% 8 14%

ВУЛ>12мес 18 из 58 (31%) 37 из 49 (76%) 55 из 107(51%)

Часто используемые N % N % N %

VH-гены

VH1-69 29 31,5% 1 1,5% 30 19%

VH1-2 6 6,5% 1 1,5% 7 4,5%

VH3-11 5 5% 1 1,5% 6 4%

VH3-33 5 5% 2 3% 7 4,5%

VH4-34 3 3% 9 14% 12 8%

VH3-48 1 1% 3 4,5% 4 2,5%

VH3-23 6 6,5% 5 8% 11 7%

VH3-21 3 3% 3 4,5% 6 4%

VH4-39 2 2% 4 6% 6 4%

Медиана 76,8 мес 217 мес 147 мес

выживаемости

Смерти от В-ХЛЛ 24 9 33

одновременно выделенных из мгновенно замороженных МПК. Для выбора наилучшего контрольного гена мы рассчитали и сравнили стабильность транскрипции каждого гена, как было предложено Vandesompele и соавт. (Vandesompele et al., 2002). Ген, кодирующий 18S рРНК, исключен в силу значительно большего уровня транскрипции по сравнению с исследуемыми генами. Стабильность транскрипции (в условных единицах) для гена GAPDH составила 6.55, 4.9 для HPRT и 3.9 для ТВР. Т.о., ТВР показал наименьшую вариабельность экспрессии, и его уровень транскрипции сравним с уровнем

транскрипции исследуемых генов. Поэтому ТВР был выбран в качестве эндогенного контроля.

Экспрессия ЬРЬ, ЭМБ, ЪА¥10 и гВТВ20 в неселектированных МПК В-ХЛЛ, СБ19-селектированных клетках В-ХЛЛ и нормальных субпопуляциях клеток крови. В данный эксперимент было включено 128 пациентов. Для 42 из них была проведена селекция по С019. 6 пациентов входили как в селектированную, так и в неселектированную группу.

Рисунок 1. Распределение значений относительной экспрессии генов 2ВТВ20, гАР70, и ЬРЬ (НЧК). Черным цветом выделены пациенты с немутированными ^УН, белым -с мутированными.

н—.«Л*......

V »». !»•

..... .;.... .

0,001 0,01

0,1

гВТВ20 СР19+

гвтвго мпк

гАР70 С019+

гАР70 мпк

РМР С019+

эмю мпк

1Р1 С019+

мпк

100

1000 НЧК

Рисунок 1 показывает распределение значений НЧК четырех исследуемых генов, амплифицированных в неселектированных МПК и СО 19-клетках во всех случаях В-ХЛЛ. Из рисунка видно, что значения экспрессии ЬРЬ отчетливо разделены как для СБ 19-селектированных, так и для неселектированных клеток, образуя два видимых кластера. Экспрессия БМО представлена с подобной, однако менее выраженной тенденцией. Распределение значений НЧК для 2ВТВ20 симметрично в обоих случаях, в то время как экспрессия ZAP70 несимметрична только для СБ 19+-селектированных клеток.

Значения НЧК этих же генов, амплифицированных в образцах нормальных субпопуляций клеток крови, представлены в Таблице 4. Все значения представлены их средними величинами с указанием разброса, кроме СБ8+ и С04+-клеток.

Таблица 4. Экспрессия LPL, DMD , ZAP-70, ZBTB20 в нормальных субпопуляциях клеток крови. (* - группа образцов из неселектированных МПК, ** - группа образцов из селектированных CD 19+-клеток, U-CLL - VH-немутированный подтип B-XJ1J1, M-CLL -УН-мутированный подтип B-XJIJ1)_

Число Гены

Образцы образцов LPL DMD ZBTB20 ZAP-70

CD4+ Pool, 1 0.002 0.003 5.9 5.9

CD8+ Pool, 1 0.005 0.001 2.5 7.2

CD 19+ 4 0.002 (0 -0.007) 0.042 (0.02 -0.08) 2.7 (1.7-3.8) 0.14 (0.07 -0.2)

CD 19+, активир. 4 0.01 (0-0.03) Нет данных Нет данных Нет данных

CD14+ 3 0.23 (0.13 -0.4) Нет данных Нет данных Нет данных

МПК 6 0.14 (0.03 -0.3) 0.15 (0.04 -0.28) 75.9 (48.6 -120) 65.7 (43.5 -82.9)

U-CLL* 48 2.7 (0.16 -16.6) 6.1 (0.3-33.5) 42 (4.4 -116.5) 32.3 (0.086 -37)

M-CLL* 46 0.44 (0 - 6.4) 1.5 (0.004 -15.9) 62 (3.3-368) 2.7 (0.11 -0.35)

U-CLL** 27 1.4 (0.07 -6.7) 2.3 (0.015 -5.5) 8.9 (2.4-2.3) 3 (0.74 - 6.9)

M-CLL** 13 0.26 (0-1.3) 2.3 (0.06 -16.2) 23.7 (9.2 -17.1) 0.87 (0.07 -3.9)

В нормальных В- и Т-клетках экспрессия ЬРЬ практически неопределима, в то время как в МПК она в 100 раз выше, что может объясняться существенной экспрессией в моноцитах (макрофагах). Экспрессия липопротеинлипазы в активированных В-клетках выше, чем в обычных, однако существенно ниже, чем в клетках В-ХЛЛ. Отсутствие экспрессии ЬРЬ в нормальных В-клетках говорит о том, что повышенный уровень экспрессии мРНК ЬРЬ в некоторых случаях В-ХЛЛ является специфической чертой клеток В-ХЛЛ, а не нормальных В-клеток.

Экспрессия гена ОКЮ в Т-клетках почти не определима, в то время как в В-клетках он экспрессируется хоть и на малом, но стабильном уровне. Среднее количество мРНК ЭМБ в УН-немутированных случаях В-ХЛЛ в 100 раз выше, чем в нормальных В-клетках. Уровень экспрессии БМБ в МПК и в С019+-клетках сравним, что означает преобладание сигнала от В-лимфоцитов в пуле МПК. Таким образом, БМЭ экспрессируется в нормальных В-лимфоцитах и его повышенная экспрессия встречается в некоторых случаях В-ХЛЛ.

Уровень экспрессии 2ВТВ20 относительно высок по сравнению с остальными генами в нормальных Т- и В-клетках и в клетках В-ХЛЛ. Различий в экспрессии этого гена в УН-мутированных и немутированных случаях В-ХЛЛ

обнаружено не было. Транскрипционный уровень ZAP70 примерно в 40 раз выше в Т-клетках, чем в нормальных B-клетках и сравним с клетками B-XJIJI.

Различия между С019-селектированными и неселектированными группами пациентов достоверны для LPL (Р<0,031), DMD (Р<0,003), ZBTB20 (Р<2е-06) для немутированной группы пациентов, но не для случаев с мутациями. Для ZAP70 различия в экспрессии генов достоверны в обеих подгруппах В-ХЛЛ (Р<0,0002 для немутированой группы и Р<0,02 для мутированной).

Корреляция уровней экспрессии генов LPL, DMD, ZAP70 и ZBTB20 с мутационным статусом IgVH. Среди пациентов, включенных в это исследование, 74 (58%) имели IgVH-немутированный и 54 (42%) мутированный вариант В-ХЛЛ. Корреляции уровней экспрессии генов с наличием или отсутствием мутаций IgVH были рассчитаны отдельно для групп пациентов с С019-селектированными и неселектированными клетками. Для группы пациентов с неселектированными клетками (N=94) сильные корреляции были обнаружены для LPL (R=0.66, Р0.0001) и DMD (R=0.5, Р0.0001), но не для ZAP70 (R=0.06, NS). Для пациентов с селектированными CD 19+-клетками корреляция с мутационным статусом была обнаружена для LPL (R=0.5, Р<0.0001) и ZAP70 (R=0.45, Р=0.0004). Экспрессия дистрофина имеет ту же тенденцию, однако недостаточно значимую (R=0.26, NS). Корреляция, рассчитанная для ZBTB20, имеет обратный характер для обеих групп пациентов и не является значимой (R—0.06 и R=-0.25, NS).

Наши данные показывают, что анализ экспрессии генов ZAP-70 и ZBTB20 не позволяет использовать их в качестве альтернативных маркеров прогноза. Значимой корреляции ZBTB20 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов обнаружено не было ни в случае неселектированных МПК, ни для СБ19+-клеток. Корреляцию экспрессии ZAP70 с мутационным статусом удалось выявить только на препаратах клеток, селектированных антителами к CD 19. Это не совпадает с опубликованными данными по микрочипам. В частности, в исследовании группы Haslinger (Haslinger et al., 2004) эксперименты с микрочипами были поставлены на неселектированных клетках, и, тем не менее, корреляционная зависимость была обнаружена. Причина расхождения результатов не ясна. Мы полагаем, что отсутствие зависимости в нашем исследовании объясняется высоким уровнем экспрессии этих генов в других субпопуляциях клеток крови, в частности в Т-лимфоцитах и моноцитах. Этап селекции B-клеток вносит дополнительную сложность и повышает трудоемкость исследования. Поэтому эти гены не могут применяться для создания клинических тестов прогнозирования течения В-ХЛЛ.

Для определения наилучшей границы, позволяющей отличить мутированную и немутированную подгруппы В-ХЛЛ с помощью измерения экспрессии LPL и DMD, мы сложили CD 19-селектированные и

неселектированные случаи и рассчитали Индекс Юдена (чувствительность + специфичность -1). Пороговые границы были определены как 0.4 для LPL (Индекс Юдена = 0.74) и 1.0 для DMD (Индекс Юдена = 0.58). Согласованность уровня экспрессии LPL и мутационного статуса IgVH составила 88% с 6.7% ложноотрицательных и 19% ложноположительных результатов. Для DMD и мутационного статуса IgVH согласованность, процентное соотношение ложноотрицательных и ложноположительных результатов составили 80%, 12% и 29%, соответственно. Корреляция мутационного статуса IgVH с уровнем экспрессии генов LPL и DMD была определена как значимая согласно точному тесту Фишера (Р<0.0001 для обоих генов). Для липопротеинлипазы абсолютная разница значений между LPL-положительными и LPL-отрицательными случаями выше, чем для дистрофина.

Эти данные говорят о том, что использование гена LPL, как маркера прогноза, в рутинной клинической практике предпочтительнее. Однако эти наблюдения не мешают дальнейшим исследованиям DMD как прогностического маркера B-XJIJI, поскольку количественные измерения его экспрессии могут быть использованы в комбинации с измерениями других генов, включая ZAP70 и LPL.

Для 16 из 128 пациентов (12%) уровень экспрессии LPL не был согласован с мутационным статусом IgVH. Большинство этих пациентов (N=11, 69%) имели высокий уровень экспрессии LPL и при этом относились к подгруппе с мутированным B-XJIJI. Ни в одном из этих результатов это разногласие нельзя объяснить высокой экспрессией LPL в моноцитах. Течение болезни у пациентов с мутациями IgVH и высокой экспрессией LPL было разным.

Важно, что значения НЧК LPL и DMD у 8 из 16 пациентов, уровень экспрессии липопротеинлипазы которых не совпадал с мутационным статусом, не были согласованы. Это говорит о том, что уровень экспрессии этих генов может дать дополнительную информацию.

Корреляция уровня экспрессии LPL и DMD с выживаемостью и другими прогностическими факторами

Влияние мутационного статуса генов IgVH и уровня экспрессии LPL и DMD на выживаемость представлено на Рисунке 2. Наши наблюдения подтвердили, что мутационный статус имеет сильнейшее прогностическое значение при B-XJIJI. Медиана выживаемости для пациентов с немутированными IgVH и пациентов с мутациями составила 76.8 и 217 месяцев соответственно (Р=0.00002, Рисунок 2А). Для анализа выживаемости случаи были разделены на LPL-положительные и LPL-отрицательные согласно пороговой границе НЧК, равной 0.4. Медиана выживаемости для LPL-положительных пациентов составила 84.8 месяца, для LPL-отрицательных медиана выживаемости достигнута не была (75% выживших в течение 145 месяцев, Рисунок 2В). Различия между кривыми выживаемости статистически

значимы (Р=0.0001). Поскольку группа ЬРЬ-положительных пациентов включала в себя большее число больных с поздними стадиями развития В-ХЛЛ, было решено построить кривые выживаемости только для пациентов в стадии А. Медиана выживаемости для ЬРЬ-отрицательных пациентов в стадии А достигнута не была, средняя продолжительность жизни от начала лечения до настоящего момента составила 111.9 месяцев (ДИ 95% - 87-136.7 месяцев, разброс 10-269 месяцев). Медиана выживаемости для ЬРЬ-положительных пациентов в стадии А составила 87.5 месяцев. Различия в кривых выживаемости ЬРЬ-положительных и ЬРЬ-отрицательных пациентов в стадии А статистически достоверны (Р=0.000009, Рисунок 20). Важно, что прогноз для пациентов в стадии А с высоким уровнем экспрессии ЬРЬ оказался схож с прогнозом для пациентов в стадиях В и С (медиана для пациентов в стадиях В и С 85.6 месяцев). Таким образом, низкая экспрессия ЬРЬ определяет группу А больных с В-ХЛЛ с очень благоприятным прогнозом. Различий в выживаемости больных в стадиях В и С от уровня экспрессии ЬРЬ обнаружено не было (Р<0.8).

Рисунок 2. Анализ общей выживаемости (ОВ). (А). ОВ по отношению к мутационному статусу. (В). ОВ по отношению к экспрессии ЬРЬ. (С). ОВ по отношению к экспрессии 0\Ш. (О) ОВ у пациентов с низкой экспрессией ЬРЬ в зависимости от стадии В-ХЛЛ.

Влияние уровня экспрессии БМО на выживаемость также значимо (Р=0.00025). Медиана выживаемости для ЭМО-положительных пациентов (пороговая граница НЧК = 1) составила 90.1 месяцев, ЭМО-отрицательных она достигнута не была (75% выживших в течение 119.7 месяцев) (Рисунок 2С).

Уровень экспрессии ЬРЬ и ЭМЭ строго коррелирует со стадиями развития болезни и ВУЛ (Таблица 5). Цитогенетические данные были доступны для 57 пациентов. 25 пациентов имели нормальный кариотип, 8 имели единственную аномалию - делецию 1 Зя, 10 пациентов имели делецию 11 я, у 6 была трисомия 12 хромосомы, у 8 пациентов наблюдалась делеция 17р и комплексное нарушение кариотипа. Уровень экспрессии обоих генов не коррелирует с наличием хромосомных аберраций и их комбинаций.

Таблица 5. Корреляция уровня мРНК ЬРЬ и БМО с другими прогностическими маркерами

В-ХЛЛ.

LPL>0 ,4 LPL<0, 4 Р DMD>0, 4 DMD<0, 4 P

Мутационный статус

U-CLL (>98%) 72 5 <0.0001 67 10 <0.0001

M-CLL (<98%) 11 46 18 39

Цитогенетические группы

Нормальный KapnoTim+dell3q 19 13 0.17 16 16 0.16

Остальные аберрации 20 5 18 7

Врем» удвоения лимфоцитов

<12 мес 40 13 0.0008 37 16 0.029

>12 мес 23 32 26 29

Стадии Binet

А 28 33 0.007 27 34 0.007

В+С _50 15 49 16

Стадии Rai

0 11 26 <0.0001 (0 vs 1+2) 12 25 0.001 (0 vs 1+2)

1+2 60 16 56 20

3+4 7 6 0.74 (0-2 vs 3+4) 8 5 0.83 (0-2 vs 3+4)

Экспрессия SEPT10, ADAM29, SLAM, LPL в иеселектированных МПК B-XJIJI и корреляция ее с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов

В данный анализ был включен 81 пациент, большинство из которых входило и в группу первого исследования. Рисунок 3 показывает распределение значений относительной экспрессии четырех исследуемых генов, амплифицированных в иеселектированных МПК во всех случаях B-XJIJI. Как видно из рисунка, значения экспрессии всех четырех генов разделены (с разной степенью отчетливости) на два кластера. При этом для генов ADAM29 и SLAM наблюдается повышенная экспрессия в случае мутированного B-XJIJI, а для SEPT 10 и LPL- в случае немутированного.

Для всех тестируемых генов обнаружена сильная корреляция относительной экспрессии с мутационным статусом генов IgVH: ADAM (R= -0,389, р=0,0004), SEPT (R=0,336, p=0,0022), SLAM (R= - 0,373, p=0,0006), LPL (0,607, p<0,0001). Пороговые границы для прогностически значимых подгрупп B-XJIJI были рассчитаны, как и ранее, с использованием индекса Юдена.

Рисунок 3. Распределение значений относительной экспресиии генов SLAM, SEPT10, ADAM29, LPL (Черными точками показаны пациенты с немутированными IgVH, белыми - с мутированными).

Относительная экспрессия

При использовании этих границ число правильно определенных случаев для SEPT 10 составило 71%, для SLAM - 74%, для ADAM29 - 77%, для LPL -85%. При анализе общей выживаемости в зависимости от экспрессии исследуемых генов с использованием данных пороговых границ были установлены статистически достоверные различия для ADAM29 (р=0,015), SLAM (0,0034) и LPL (р=0,0013). В многовариантом анализе при включении в модель всех генов, мутационный статус достоверно предсказывали только SLAM (р=0,05) и LPL (р=0,02). При сочетанной оценке экспрессии 3 генов

(LPL, SLAM и ADAM29) процент полного совпадения по 3 генам получен у 21 больного (26%), по 2 генам у 50 больных (62%). Отношение уровней экспрессии LPL к ADAM29 и к SLAM совпадает с мутационным статусом в 86% и 84% случаев, соответственно. В случае LPL/ADAM29 этот показатель выше, чем для каждого гена в отдельности, что совпадает с данными, полученными Oppezzo и соавт. (Oppezzo et al., 2005). Однако, возможно, для индивидуального прогностического значения предпочтительнее создание классификационного дерева, поскольку встречаются случаи, когда один из генов дает несовпадающий результат.

Экспрессия LPL, ZAP70 и IL-lb в CD3+, CD38+ и CD38- клетках.

Следует отметить, что ранее вообще не было известно, что липопротеинлипаза может экспрессироваться в В- и Т-лимфоцитах. Биологический смысл экспрессии LPL в клетках B-XJIJI без мутаций вариабельного региона не ясен. Наши данные говорят о том, что LPL практически не экспрессируется в нормальных В- и Т-лимфоцитах. Небольшой уровень экспрессии LPL был найден в С014+-клетках. Отсутствие экспрессии LPL в нормальных В-клетках говорит о том, что повышение уровня мРНК LPL - специфический признак В-XJUI. Это позволяет проводить оценку экспрессии LPL непосредственно на мононуклеарах периферической крови.

Неодинаковая экспрессия липопротеинлипазы в клетках B-XJIJI может объясняться разными факторами. Мы предположили, что повышенная экспрессия LPL у части пациентов объясняется тем, что клетки опухолевого клона прогностически неблагоприятного варианта B-XJIJI находятся в состоянии активации. Показано, что ген ZAP-70, повышение экспрессии которого обнаруживается при варианте B-XJIJI без мутаций вариабельного региона генов иммуноглобулинов, в норме экспрессируется при активации В-лимфоцитов (Cutrona et al., 2006). Для проверки этой гипотезы сравнили уровень мРНК LPL в отселектированных популяциях С038-позитивных и СБ38-негативных клеток B-XJIJI. CD38 традиционно считается маркером активации B-лимфоцитов. В качестве контрольного гена, хорошо коррелирующего с активированным состоянием лимфоцитов, был избран IL-lb.

У 9 из 18 пациентов, включенных в данный эксперимент, наблюдалась высокая экспрессия LPL, у 9 - низкая. Пороговая граница для прогностически значимых подгрупп B-XJIJI была рассчитана, как описано выше. Существенных различий в уровне экспрессии генов ZAP70 и II-lb в зависимости от мутационного статуса обнаружено не было.

Экспрессия LPL в СОЗ+-клетках практически неопределима. Уровень экспрессии ZAP70 в СОЗ+-клетках довольно высок и сравним с уровнем экспрессии этого гена в других клеточных субпопуляциях, как было показано в предыдущих экспериментах. II-lb экспрессируется в СОЗ+-клетках на малом, но стабильном уровне.

Рисунок 4. Относительная экспрессия ЬРЬ (А) и 1Ь-1Ь (В) в субпопуляциях клеток С038+ и С038-.

О. ^

о ф

о. с

о о

5000,0

500,0

50,0

5,0

0,5

0,05

5000,0

=1 500,0

о о ш о. с: о

о: го х м с; 0)

50,0

5,0

0,5

1_Р1_-

с038+ ср38- ср38+ ср38-

1_Р1.+

1_Р1_-

п Среднее значение

□ 25%-75% 31 М1п-Мах

Среднее ° значение

О 25%-75% Ш М1п-Мах

с038+ ср38- ср38+ с038-

Различий в уровне экспрессии ЬРЬ между субпопуляциями клеток СБ38+ и СЭ38- обнаружено не было как в группе с высоким уровнем экспрессии ЬРЬ, так и с низким. В то же время, уровень экспрессии ЬРЬ в СЭ38+-клетках значительно отличался у ЬРЬ-положительных и ЬРЬ-отрицательных пациентов (р<0.0002). Та же картина наблюдалась для подгруппы СЭ38- клеток (р<0.0002) (Рисунок 4, А).

Для гена 2АР70 не было обнаружено достоверных различий между субпопуляциями клеток СБ38+ и СБ38-. Уровень экспрессии 1Ь-1Ь напротив, был существенно выше в СЭ38+ клетках, чем в С038- в обеих ЬРЬ-определяемых подгруппах пациентов (р<0.001) (Рисунок 4, В).

Таким образом, наша гипотеза о том, что ЬРЬ экспрессируется в исключительно С038-позитивной части опухолевого клона не подтвердилась. Экспрессия данного гена характерна для всего опухолевого клона в целом.

Связь экспрессии ЬРЬ и факторов транскрипции. Далее было выдвинуто предположение о том, что, возможно, неодинаковая экспрессия липопротеинлипазы в клетках В-ХЛЛ отражает активность разных сигнальных путей, объясняемую онкогенным событием или действием внешних факторов.

Рисунок 5. Относительная экспрессия факторов транскрипции №У-А, РРАЯ-А, РРА11-В, РРАЯ-в у пациентов с разным уровнем экспрессии ЬРЬ. У пациентов 1-10 - низкая экспрессия ЬРЬ, у 11-20 - высокая.

100 1

о и и

Е" 1

£ 0,01 о о я

Ш NE M V A а NE PPAR-A ш NE PPAR-G ■ NE PPAR-B

1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Пациенты

К настоящему времени в промоторной области гена LPL идентифицировано более десятка разнообразных элементов, которые определяют базальную и лиганд-опосредованную транскрипцию гена LPL (Merkel et al., 2002). Для оценки базальной транскрипции исследовался уровень мРНК А-субъединицы ядерного фактора У (NFY-A), поскольку именно эта

единица является регуляторной и связывается с ДНК. Для оценки лиганд-опосредованной транскрипции LPL исследовали уровень мРНК 3 генов PPAR (рецепторы к белкам, активирующим пролиферацию пероксисом; peroxisome proliferator activated receptors), связывающихся с PPRE.

В исследование была включена выборка из 20 пациентов, у 10 наблюдалась высокая экспрессия LPL, у 10 - низкая. Никаких различий в уровне экспрессии транскрипционных факторов выявлено не было. Уровень экспрессии NFY-A был довольно высок и сопоставим с уровнем ТВР. Экспрессия 3 белков PPAR была значительно ниже, причем уровень PPAR-G, был ниже всего. Единственная закономерность состояла в том, что разброс значений всех транскрипционных факторов PPAR в группе больных с мутациями вариабельного региона и низкой экспрессией LPL был значительно меньше, чем в группе без мутаций и высокой экспрессией LPL. Так, стандартное отклонение в группе с низкой экспрессией LPL было в 1,8 меньше для гена PPAR-А, в 1,4 раза меньше для гена PPAR-B и в 2,5 раза ниже для гена PPAR-G. Достоверных различий между группами не было (Рис.5).

Таким образом, проведенный нами анализ известных транскрипционных факторов не позволил идентифицировать сигнальный путь, активация которого объясняла бы неодинаковую экспрессию LPL при вариантах В-ХЛЛ с разным прогнозом. По всей видимости, повышение уровня мРНК LPL - специфический признак В-ХЛЛ с неблагоприятным прогнозом - происходит по иному, неизвестному нам в настоящее время механизму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Причины экспрессии липопротеинлипазы в клетках В-ХЛЛ неясны, и возможная функция ее в лейкемических клетках в данный момент непонятна. К началу данного исследования были опубликованы только микрочиповые данные об экспрессии LPL в клетках В-ХЛЛ. Нами независимо установлена высокая диагностическая эффективность определения экспрессии липопротеинлипазы в клетках В-ХЛЛ. Эти данные подтверждаются зарубежными публикациями, появившимися во время выполнения данной работы (Heintel et а!., 2005; Oppezzo et al, 2005; van't Veer et al„ 2006). Так же в исследование были включен ряд других генов, данных об экспрессии которых в клетках В-ХЛЛ в литературе пока нет. Кроме того, впервые проведен детальный анализ уровня мРНК LPL в различных субпопуляциях клеток крови. Впервые проведено сравнение уровня мРНК LPL в активированных и неактивированных B-лимфоцитах периферической крови, исследован уровень экспрессии LPL в разных субпопуляциях опухолевого клона В-ХЛЛ и уровень экспрессии генов, связанных с транскрипцией LPL.

прогнозом среди больных со стадией А. Привлекательная сторона LPL как прогностического маркера состоит в возможности определения количества мРНК LPL в неселектированных МПК. Все эти данные говорят о том, что LPL надежный прогностический маркер. Количественный ПЦР-РВ может быть использован для определения экспрессии LPL в клинической практике, и уровень экспрессии LPL может применяться для установления долговременного прогноза у пациентов с B-XJIJI.

ВЫВОДЫ

1. Измерение уровня экспрессии гена липопротеинлипазы позволяет предсказать прогноз на ранних стадиях B-клеточного хронического лимфолейкоза, что может быть использовано при выборе терапии, т.к. низкий уровень экспрессии данного гена определяет группу пациентов с очень благоприятным прогнозом.

2. Уровень экспрессии генов LPL, DMD, ADAM29, SLAM, SEPT10 достоверно коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов в мононуклеарах периферической крови у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом.

3. Корреляция экспрессии гена ZAP70 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов наблюдается только в клетках, экспрессирующих молекулы CD 19. Уровень транскрипции гена ZBTB20 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов не коррелирует.

4. Экспрессия липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при B-клеточном хроническом лимфолейкозе не связана со статусом активации клеток, не зависит от уровня экспрессии известных транскрипционных факторов, и, по-видимому, отражает другой, неизвестный в настоящее время феномен.

Список публикаций по теме диссертации Статьи

1. Никитин ЕА, Малахо СГ, Бидерман БВ. Полтараус АБ, Судариков АБ. Молекулярно-биологические факторы прогноза при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Современная онкология. 2006; 8(1)

2. Nikitin ЕА, Malakho SG, Biderman BV. Baranova AV, Lorie YY, Shevelev AY, Peklo MM, Vlasik TN, Moskalev EA, Zingerman BV, Vorob'ev IA, Poltaraus AB, Sudarikov AB, Vorobjev AI. Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 2007; 48(5):912-22.

3. Никитин ЕА, Стадник ЕА, Лорие ЮЮ, Бидерман БВ. Салогуб ГН, Цыба НН, Пустовая ЕИ, Колошейнова ТИ, Колосова ЛЮ, Сафонова ТИ, Зарицкий ЮА, Ковалева ЛГ, Судариков АБ. Прогностическое значение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов у больных, получавших комбинированную терапию флударабином и циклофосфаном. Тер. Арх. 2007; 79(7):66-70.

4. Бидерман БВ. Никитин ЕА, Судариков АБ. Экспрессия липопротеинлипазы -эффективный предиктор прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза. Гематология и трансфузиология. 2008; 53(5):67-71

Тезисы

1. Biderman BY. Nikitin ЕА, Lorie UU, Byalik ТА, Zingerman BV, Sudarikov AB. Prognostic significance of mRNA expression markers in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Ill international conference on innovative treatment of lymphoid malignancies. 2006; Abstract N42

2. Бидерман БВ. Малахо СГ, Полтораус АБ, Никитин ЕА, Судариков АБ. Новые молекулярные маркеры для оценки прогноза при хроническом лимфолейкозе. VI съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь. 2007; 206-7

3. Biderman BV. Nikitin ЕА, Grecov ЕМ, Vorobjev IA, Sudarikov AB. High expression levels of LPL are unlikely to be related to an activated state of B-CLL cells. XII International Workshop on CLL. 2007; Abstract 2.35

Благодарности

За помощь и поддержку в проведении работы выражаю искреннюю благодарность научному руководителю Сударикову А.Б., с.н.с. Никитину Е.А. и всем остальным сотрудникам лаборатории молекулярной гематологии, а также сотруднику лаборатории функциональной морфологии гемобластозов Грецову Е.М., зав. отд. компьютеризации Зингерману Б.В., и сотрудникам ЦКП «Геном» (ИМБ РАН, руководитель - Полтараус А.Б.).

Заказ № 153/12/08 Подписано в печать 19.12.2008 Тираж 90 экз Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бидерман, Белла Вениаминовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. В-клеточный хронический лимфолейкоз. Факторы прогноза. ^ *

1.1.1. Доброкачественная форма ХЛЛ.

1.1.2. Пол и возраст.

1.1.3. Время удвоения лимфоцитов.

1.1.4. Морфология клеток.

1.1.5 Тип инфильтрации костного мозга.

1.1.6. Иммунологические факторы прогноза.

1.1.7. |32-микроглобулин.

1.1.8. Цитокины.

1.1.9. Цитогенетические и молекулярно-биологические 22 маркеры, как факторы прогноза.

1.2. Мутационный статус генов вариабельного региона 24 иммуноглобулинов.

1.2.1. Организация и перестройка генов вариабельного региона 24 иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара.

1.2.2. Соматическая гипермутация.

1.2.3. Изучение У-генов при лимфатических опухолях.

1.3. Изучение профиля экспрессии генов при В-клеточном 37 хроническом лимфолейкозе.

1.3.1. Исследования экспрессионного профиля с помощью 37 микрочипов.

1.3.2. ПЦР в реальном времени.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Пациенты.

2.2. Выделение, селекция и активация клеток.

2.3. Выделение РНК и обратная транскрипция.

2.4. ПЦР в реальном времени.

2.5. Анализ генов IgVH.

2.6. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характеристика пациентов.

3.2. Выбор контрольного гена.

3.3. Экспрессия LPL, DMD, ZAP70 и ZBTB20 в неселектирован- 53 ных МПК В-ХЛЛ, С019-селектированных клетках В-ХЛЛ и нормальных субпопуляциях клеток крови.

3.4. Корреляция уровней экспрессии генов LPL, DMD, ZAP70 и 55 ZBTB20 с мутационным статусом IgVH.

3.5. Корреляция уровня экспрессии LPL и DMD с выживаемостью 57 и другими прогностическими факторами.

3.6. Экспрессия SEPT 10, ADAM29, SLAM, LPL в неселекти- 59 рованных МПК В-ХЛЛ и корреляция ее с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов.

3.7. Экспрессия LPL, ZAP70 и IL-lb в CD3+, CD38+ и CD38- 61 клетках.

3.8. Связь экспрессии LPL и факторов транскрипции.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Мутационный статус генов IgVH и другие факторы прогноза 64 В-ХЛЛ.

4.2. Сравнение прогностической значимости мутационного 67 статуса генов IgVH и экспрессионного профиля исследованных генов.

4.3. Липопротеинлипаза. Ее функции и причины экспрессии в норме и в клетках В-ХЛЛ.:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия гена липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе"

Одной из наиболее распространенных лимфатических опухолей является В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-XJIJ1). Существуют разные формы этого заболевания, различающиеся по клинической картине. В одних случаях болезнь быстро прогрессирует, а в других — годами не требует лечения. Общая выживаемость варьирует от нескольких месяцев до 20 лет и более.

В прогнозировании течения B-XJIJ1 могут иметь значение клинические, морфологические, цитогенетические, молекулярные и серологические параметры. Основным критерием, позволяющим прогнозировать течение В-XJ1JI, является мутационный статус перестроенного гена иммуноглобулина в опухолевом клоне. Наличие мутаций (или, иными словами, высокая степень дифференцировки В-клетки) коррелирует с благоприятным прогнозом, отсутствие мутаций - с неблагоприятным. Однако, определение мутационного статуса трудо- и ресурсоемко и, по-видимому, не может быть использовано в качестве рутинного анализа. В то же время высокая распространенность B-XJIJT, а также появление новых возможностей лечения, требует ранней оценки прогноза заболевания с тем, чтобы как можно раньше начать лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания у каждого конкретного больного.

Альтернативным способом оценки прогноза B-XJTJI может быть анализ уровня мРНК генов, экспрессирующихся по-разному при вариантах B-XJIJ1 с различным мутационным статусом. В последние годы в экспериментах с микрочипами было найдено несколько десятков генов, экспрессия которых существенно различается у больных различными типами В-клеточного хронического лимфолейкоза. Различия в экспрессии некоторых из этих генов (LPL, ZBTB20, ZAP-70 и др.) по результатам экспериментов с микрочипами довольно велики и относительно постоянны. Мы предположили, что эти гены могут использоваться в качестве альтернативных маркеров, заменяющих мутационный статус. Сам по себе экспрессионный анализ с помощью микрочипов вполне решает проблему прогнозирования течения В-XJTJI. Однако этот анализ еще более трудоемок, дорог и не всегда надежен.

В то же время, мы считаем, что выборочная оценка уровня экспрессии наиболее значимых генов методом ПЦР в реальном времени при адекватных контролях представляет собой разумную альтернативу этому важному методу и может стать мощным оружием диагноза и прогноза. Кроме того, детальный анализ этих генов может открыть неизвестные пока аспекты патогенеза B-XJIJI.

В данной работе нами изучен характер экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 методом ПЦР в реальном времени у больных различными типами B-XJIJI и здоровых доноров в различных субпопуляциях клеток крови. Выявлена достоверная корреляция уровня экспрессии генов LPL, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. В исследовании продемонстрировано, что оценка уровня экспресии LPL методом ПЦР в реальном времени может быть новым надежным прогностическим маркером при В-ХЛЛ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выяснить прогностическое значение уровня экспрессии, определенного с помощью ПЦР в реальном времени, генов, экспрессия которых различается при разных вариантах B-клеточного хронического лимфолейкоза.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 методом ПЦР-РВ у данной выборки больных, в разных субпопуляциях клеток крови больных и доноров.

4. Определение прогностической значимости уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 при В-ХЛЛ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Проведено определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 на большой коллекции образцов мононуклеаров периферической крови больных В-ХЛЛ и в отдельных субпопуляциях клеток крови. Проведен статистический анализ корреляции уровня экспрессии исследуемых генов с клиническими данными больных В-ХЛЛ. Установлена значительная корреляция относительной экспрессии генов LPL, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Показано, что увеличение уровня экспрессии LPL не связано со статусом активации клеток и не зависит от уровня экспрессии известных транскрипционных факторов. Предложен новый маркер прогноза при B-клеточном хроническом лимфолейкозе.

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ

Измерение уровня экспрессии LPL методом ПЦР в реальном времени может предсказать прогноз на ранних стадиях В-ХЛЛ, что даст возможность своевременно назначить лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания, у каждого конкретного больного. Кроме того, детальный анализ генов, экспрессия которых коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов, может открыть неизвестные пока аспекты патогенеза В-ХЛЛ.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликованы 7 работ, в т.ч. 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации доложены на III международной конференции, посвященной лечению лимфатических заболеваний (Палермо, 2006г.), на VI съезде гематологов и трансфузиологов республики Беларусь (Минск, 2007г.), на XII международном симпозиуме по ХЛЛ (Лондон, 2007), на XI Российском онкологическом конгрессе в рамках VI конкурса молодых ученых по онкологии (Москва, 2007).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бидерман, Белла Вениаминовна

ВЫВОДЫ

2. Уровень экспрессии генов LPL, DMD, ADAM29, SLAM, SEPT 10 достоверно коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов в мононуклеарах периферической крови у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом.

3. Корреляция экспрессии гена ZAP70 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов наблюдается только в клетках, экспрессирующих молекулы CD19. Уровень транскрипции гена ZBTB20 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов не коррелирует.

4. Экспрессия липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе не связана со статусом активации клеток, не зависит от уровня экспрессии известных транскрипционных факторов, и, по-видимому, отражает другой, неизвестный в настоящее время феномен.

Благодарности

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав.лаб. - к.б.н. Судариков А.Б.). За помощь и поддержку в проведении работы выражаю искреннюю благодарность научному руководителю Сударикову А.Б., с.н.с. Никитину Е.А. и всем остальным сотрудникам лаборатории молекулярной гематологии, а также сотруднику лаборатории функциональной морфологии гемобластозов Грецову Е.М., зав. отд. компьютеризации Зингерману Б.В., и сотрудникам ЦКП «Геном» (ИМБ РАН, руководитель - Полтараус А.Б.).

Список публикаций по теме диссертации

1. Никитин ЕА, Малахо СГ, Бидерман БВ, Полтараус АБ, Судариков АБ. Молекулярно-биологические факторы прогноза при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Современная онкология. 2006; 8(1)

2. Biderman BV, Nikitin ЕА, Lorie UU, Byalik ТА, Zingerman BV, Sudarikov AB. Prognostic significance of mRNA expression markers in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Ill international conference on innovative treatment of lymphoid malignancies. 2006; Abstract N42

3. Nikitin EA, Malakho SG, Biderman BV, Baranova AV, Lorie YY, Shevelev AY, Peklo MM, Vlasik TN, Moskalev EA, Zingerman BV, Vorob'ev IA, Poltaraus AB, Sudarikov AB, Vorobjev AI. Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 2007; 48(5):912-22.

4. Бидерман БВ, Малахо СГ, Полтораус АБ, Никитин ЕА, Судариков АБ. Новые молекулярные маркеры для оценки прогноза при хроническом лимфолейкозе. VI съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь. 2007; 206-7

5. Biderman BV, Nikitin ЕА, Grecov ЕМ, Vorobjev IA, Sudarikov AB. High expression levels of LPL are unlikely to be related to an activated state of B-CLL cells. XII International Workshop on CLL. 2007; Abstract 2.35

6. Никитин ЕА, Стадник ЕА, Лорие ЮЮ, Бидерман БВ, Салогуб ГН, Цыба НН, Пустовая ЕИ, Колошейнова ТИ, Колосова ЛЮ, Сафонова ТИ, Зарицкий ЮА, Ковалева ЛГ, Судариков АБ. Прогностическое значение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов у больных, получавших комбинированную терапию флударабином и циклофосфаном. Тер. Арх. 2007; 79(7):66-70.

7. Бидерман БВ, Никитин ЕА, Судариков АБ. Экспрессия липопротеинлипазы - эффективный предиктор прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза. Гематология и трансфузиология. 2008; 53(5):67-71

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Причины экспрессии липопротеинлипазы в клетках B-XJIJT неясны, и возможная функция ее в лейкемических клетках в данный момент непонятна. К началу данного исследования были опубликованы только микрочиповые данные об экспрессии LPL в клетках В-ХЛЛ. Нами независимо установлена высокая диагностическая эффективность определения экспрессии липопротеинлипазы в клетках В-ХЛЛ. Эти данные подтверждаются зарубежными публикациями, появившимися во время выполнения данной работы (Heintel et al., 2005; Oppezzo et al, 2005; van Y Veer et al., 2006). Так же в исследование были включен ряд других генов, данных об экспрессии которых в клетках В-ХЛЛ в литературе пока нет. Кроме того, впервые проведен детальный анализ уровня мРНК LPL в различных субпопуляциях клеток крови. Впервые проведено сравнение уровня мРНК LPL в активированных и неактивированных В-лимфоцитах периферической крови, исследован уровень экспрессии LPL в разных субпопуляциях опухолевого клона B-XJIJ1 и уровень экспрессии генов, связанных с транскрипцией LPL.

В этом исследовании мы показали, что уровень экспрессии генов LPL, DMD, ADAM29, SLAM, SEPT10 хорошо коррелирует с мутационным статусом IgVH, и предсказывает выживаемость для всей группы пациентов. Уровень экспрессии LPL определяет подгруппу пациентов с очень благоприятным прогнозом среди больных со стадией А. Привлекательная сторона LPL как прогностического маркера состоит в возможности определения количества мРНК LPL в неселектированных МПК. Все эти данные говорят о том, что LPL надежный прогностический маркер. Количественный ПЦР-РВ может быть использован для определения экспрессии LPL в клинической практике, и уровень экспрессии LPL может применяться для установления долговременного прогноза у пациентов с В-ХЛЛ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бидерман, Белла Вениаминовна, Москва

1. Adami F, Guarini A, Pini М, Siviero F, Sancetta R, et al. Serum levels of tumour necrosis factor-alpha in patients with B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Cancer. 1994; 30A(9): 1259-63

2. Binet JL, Lepoprier M, Dighiero G, Charron D, D'Athis P, et al. A clinical staging system for chronic lymphocytic leukemia: prognostic significance. Cancer. 1977; 40(2):855-64.

3. Boggs D., Sofferman A., Wintrobe M., Cartwright G. Factors influencing the duration of survival of patients with chronic lymphocytic leukemia. American J of Med. 1966; 40: 243-254

4. Campbell MJ, Zelenetz AD, Levy S, Levy R, Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region repertoire. Mol Immunol. 1992; 29:193-203.

5. Catovsky D, Richards S, Matutes E, Oscier D, Dyer MJ, et al. Assessment of fludarabine plus cyclophosphamide for patients with chronic lymphocytic leukaemia (the LRF CLL4 Trial): a randomised controlled trial. Lancet. 2007; 21 ;370(9583):230-9.

6. Cheson BD, Bennett JM, Grever M, et al. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood. 1996; 87(12): 4990-4997

7. Cook GP, Tomlison IM. The human immunoglobulin VH repertoire. Immunol Today. 1995; 16:237-42. Review

8. Cordone I, Masi S, Mauro FR, Soddu S, Morsilli O, et al. p53 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a marker of disease progression and poor prognosis. Blood. 1998; 91(11):4342-9.

9. Cordone I, Matutes E, Catovsky D. Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and T cells in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity. Leukemia. 1992; 6(9):902-6.

10. Crespo M, Bosch F, Villamor N, Bellosillo B, Colomer D, et al. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2003; 348(18): 1764-75.

11. Criel A, Wlodarska I, Meeus P, Stul M, Louwagie A, et al. Trisomy 12 is uncommon in typical chronic lymphocytic leukaemias. Br J Haematol. 1994; 87(3):523-8.

12. Damle RN, Temburni S, Calissano C, Yancopoulos S, Banapour T, et al. CD38 expression labels an activated subset within chronic lymphocytic leukemia clones enriched in proliferating B cells. Blood. 2007; 110(9):3352-9

13. Davis Z, Orchard J, Corcoran M, Oscier D. Divergence from the germ-line sequence in unmutated chronic lymphocytic leukemia is due to somatic mutation rather than polymorphisms. Blood. 2003; 102:3075.

14. De Rossi G, Mandelli F, Covelli A, Luciani M, Martelli M, et al. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) in younger adults: a retrospective study of 133 cases. Hematol Oncol. 1989; 7(2): 127-37.

15. Di Giovanni S, Valentini G, Carducci P, Giallonardo P. Beta-2-microglobulin is a reliable tumor marker in chronic lymphocytic leukemia. Acta Haematol. 1989; 81(4):181-5.

16. Dohner H, Stilgenbauer S, James MR, Benner A, Weilguni T, et al. llq deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemiacharacterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood.1997; 89(7):2516-22.

17. Faguet GB.Chronic lymphocytic leukemia: an updated review. J Clin Oncol. 1994; 12: 1974-1990

18. Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, Sellars B, Valleto A, et al. Chronic lymphocytic leukemia B cells espress restricted sets of mutated and unmutated antigen receptors. J Clin Invest. 1998; 102:1515-25

19. Finn WG, Kay NE, Kroft SH, Church S, Peterson LC. Secondary abnormalities of chromosome 6q in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a sequential study of karyotypic instability in 51 patients. Am J Hematol. 1998; 59(3):223-9.

20. Foa R, Massaia M, Cardona S, Tos AG, Bianchi A, et al. Production of tumor necrosis factor-alpha by B-cell chronic lymphocytic leukemia cells: a possible regulatory role of TNF in the progression of the disease. Blood. 1990; 76(2):393-400.

21. Geisler CH, Hou-Jensen K, Jensen OM, Tinggaard-Pedersen N, Hansen MM,et al. The bone-marrow infiltration pattern in B-cell chronic lymphocytic leukemia is not an important prognostic factor. Danish CLL Study Group. Eur J Haematol. 1996; 57(4):292-300.

22. Hamblin T. Historical aspects of chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 2000; 111(4): 1023-34. Review.

23. Hansen M. Chronic lymphocytic leukemia: clinical study, based on 189 cases followed for a long time. Scandinavian J of Hematology. 1973; 18 (Suppl.):l -286

24. Heintel D, Kienle D, Shehata M, Krober A, Kroemer E, et al. High expression of lipoprotein lipase in poor risk B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2005; 19(7): 1216-23

25. Hummel M, Tamaru J, Kalvelage B, Stein H. Mantle cell (previously centrocytic) lymphomas express VH genes with no or very little somatic mutations like the physiologic cells of the follicle mantle. Blood. 1994; 84(2): 403-7

26. Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. Immunobiology. Garland Science. 2001.

27. Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M, Ross FM, Stockdill G, et al. Prognostic subgroups in B-cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med. 1990; 323(11):720-4.

28. Kallander CF, Simonsson B, Gronowitz JS, Nilsson K. Serum deoxythymidine kinase correlates with peripheral lymphocyte thymidine uptake in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Haematol. 1987; 38(4):331-7.

29. Kay NE, Burton J, Wagner D, Nelson DL. The malignant B cells from B-chronic lymphocytic leukemia patients release TAC-soluble interleukin-2 receptors. Blood. 1988; 72(2):447-50.

30. Keating M, Lerner S, Kantarjian H, et.al.: The serum beta-2-microglobulin level is more powerful than stage in predicting response and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1995; 86: 606a (abstr)

31. Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H, et al. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med. 2001; 194(11):1625-38

32. Lee JS, Dixon DO, Kantarjian HM, Keating MJ, Talpaz M. Prognosis of chronic lymphocytic leukemia: a multivariate regression analysis of 325 untreated patients. Blood. 1987; 69(3):929-36.

33. Lin K, Sherrington PD, Dennis M, Matrai Z, Cawley JC, Pettitt AR. Relationship between p53 dysfunction, CD38 expression, and IgV(H) mutation in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002; 100:1404 1409.

34. MacLennan I. Germinal centers. Annual Review Immunology. 1994; 12:11739. Review

35. MacLennan I. Immunology. The centre of hypermutation. Nature. 1991; 354(6352):352-3.

36. Mandelli F, De Rossi G, Mancini P, Alberti A, Cajozzo A, et al. Prognosis in chronic lymphocytic leukemia: a retrospective multicentric study from the GIMEMA group. J Clin Oncol. 1987; 5(3):398-406. .

37. Matsuda F, Ishii K, Bourvagnet P, Kuma Ki, Hayashida H, et al. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med. 1998; 188(11):2151-62.

38. Matsuda F, Shin EK, Nagaoka H, Matsumura R, Haino M, et al. Structure and physical map of 64 variable segments in the 300.8-megabase region of the human immunoglobulin heavy-chain locus. Nat Genet. 1993; 3:88 -94.

39. Mead JR, Irvine SA, Ramji DP. Lipoprotein lipase: structure, function, regulation, and role in disease. J Mol Med. 2002; 80:753-769

40. Melo JV, Catovsky D, Galton DA. Chronic lymphocytic leukemia and prolymphocyte leukemia: a clinicopathological reappraisal. Blood Cells. 1987; 12(2):339-53.

41. Molica S, Dattil A, Levato D: Clinical relevance of the intensity of CD20 antigen in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1996; 88: 239a, (abstr) (suppl).

42. Montserrat E, Sanchez-Bisono J, Vínolas N, Rozman C. Lymphocyte doubling time in chronic lymphocytic leukaemia: analysis of its prognostic significance. Br J Haematol. 1986; 62(3):567-75.

43. Oppezzo P, Vasconcelos Y, Settegrana C, Jeannel D, Vuillier F, et al. The LPL/ADAM29 expression ratio is a novel prognosis indicator in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2005; 106(2):650-657

44. Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z, Wiestner A, Rosenwald A et al. ZAP-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Lancet. 2004; 363(9403):105-11.

45. Pangalis GA, Reverter JC, Bousiotis VA, et.al. Chronic lymphocytic leukemia in younger adults: preliminary results of a study based on 454 patients. Leuk lymph. 1991(suppl); 175-178

46. Pangalis GA, Roussou PA, Kittas C, Kokkinou S, Fessas P. B-chronic lymphocytic leukemia. Prognostic implication of bone marrow histology in 120 patients experience from a single hematology unit. Cancer. 1987; 59(4):767-71.

47. Patalay M, Lofgren IE, Freake HC, Koo SI, Fernandez ML. The lowering of plasma lipids following a weight reduction program is related to increasedexpression of the LDL receptor and lipoprotein lipase. J Nutr. 2005; 135:735 -739.

48. Pines A, Ben-Bassat I, Modan M, Blumstein T, Ramot B. Survival and prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Haematol. 1987; 38(2): 123-30.

49. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Patemack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1975; 46:219-234

50. S7.Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, Chen L, Keating MJ et al. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression. N Engl J Med. 2004; 351(9):893-901

51. Rojas R, Roman J, Torres A, Ramirez R, Carracedo J, et al. Inhibition of apoptotic cell death in B-CLL by interferon gamma correlates with clinical stage. Leukemia. 1996; 10(11):1782-8.

52. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, et al. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med. 2001; 194(11): 1639-47.

53. Rozman C, Montserrat E, Rodriguez-Fernandez JM, Ayats R, Vallespi T, et al. Bone marrow histologic pattern—the best single prognostic parameter in chroniclymphocytic leukemia: a multivariate survival analysis of 329 cases. Blood. 1984; 64(3):642-8.

54. Sarfati M, Chevret S, Chastang C, Biron G, Stryckmans P, et al. Prognostic importance of serum soluble CD23 level in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1996; 88(11):4259-64.

55. Stf.Schoonjans K, Peinado-Onsurbe J, Lefebvrev AM, Heyman RA, Briggs M, et al. PPARalpha and PPARgamma activators direct a distinct tissue-specific transcriptional response via a PPRE in the lipoprotein lipase gene. EMBO 1996; 15: 5336-5348

56. Semenzato G, Foa R, Agostini C, Zambello R, Trentin L, et al. High serum levels of soluble interleukin 2 receptor in patients with B chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1987; 70(2):396-400.

57. S9.Storb U, Peters A, Klotz E, Kim N, Shen HM, et al. Somatic hypermutation of immunoglobulin genes is linked to transcription. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1998; 229: 11-19

58. PO.Storb U. Molecular mechanism of somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8: 206-214

59. The French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukaemia. Natural history of stage A chronic lymphocytic leukaemia untreated patients. Br J Haematol. 1990; 76(l):45-57.

60. Tobin G, Thunberg U, Laurell A, Karlsson K, Aleskog A, et al. Patients with chronic lymphocytic leukemia with mutated VH genes presenting with Binet stage B or C form a subgroup with a poor outcome. Haematologica. 2005; 90:465-469

61. PP. Walter MA, Surti U, Hofker MH, Cox DW. The physical organization of the human immunoglobulin heavy chain gene complex. EMBO 1990; 9: 3303— 3313

62. Youden WJ. Index for rating diagnostic tests. Cancer. 1950; 3:32-35

63. Воробьев АИ, Бриллиант МД, Тихонова ЛИ, Самойлова PC, Маргулис ЕИ. Зрелоклеточные лимфатические опухоли. Тер.Арх. 1986; 58(9):4-8.

64. Воробьев АИ, Бриллиант МД. Дифференцированная терапия хронического лимфолейкоза. Тер. Арх. 1983; 55(8):7-15.

65. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М. Практика; 1999.

66. Екимов АН, Шипулин ГА, Бочкарев ЕГ, Рюмин ДВ. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). 2002. www.PCR.ru/bibliogr/articles.

67. Кременецкая AM, Воробьев ИА, Сидорова ЮВ, Захарова АИ, Шкловский-Корди НЕ, Воробьев АИ. Морфология лимфоцитов. Тер.Архив. 1998; 70(7):37-9

68. Никитин ЕА, Лорие ЮЮ, Меликян АЛ, Самойлова PC, Булычева ТИ, и др. Факторы неблагоприятного прогноза у больных хроническим лимфолейкозом: ретроспективный анализ 206 случаев. Тер архив. 2003; 7: 38-47.

69. Яхнина ЕИ, Никитин ЕА, Асцатуров ИА, Варламова ЕИ, Кобзев ЮН, и др. Доброкачественная форма хронического лимфолейкоза. Тер. Арх. 1997; 69(7): 11-7.

Информация о работе

Бидерман, Белла Вениаминовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Экспрессия гена липопротеинлипазы в мононуклеарах периферической крови при В-клеточном хроническом лимфолейкозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы