Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические предикторы хронического лимфолейкоза

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические предикторы хронического лимфолейкоза"

На правах рукописи

КАРИМОВ Деннс Олегович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ПФЬВ 2015

005558765

Белгород - 2015

005558765

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежцени науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центр Российской академии наук

Научные руководители:

Викторова Татьяна Викторовна, доктор медицинских наук, профессор Бакиров Булат Ахатович, доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Петрин Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессо Государственное бюджетное образовательное учреждение высшег профессионального образования «Московский государственный медико стоматологический университет» Министерства здравоохранени Российской Федерации, заведующий лабораторией медицински, генетических технологий

Асанов Алий Юрьевич, доктор медицинских наук, профессо Государственное бюджетное образовательное учреждение высшег профессионального образования «Первый Московский государственны медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерств здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедро медицинской генетики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится 201-^года в «_/2_» часо

на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степеш кандидата наук, на соискание ученой степени доктора нау Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственны! национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, Белгород, ул. Победы, 85

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВП «Белгородский государственный национальный исследовательски! университет» Минобрнауки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Автореферат разослан «¿^7» сС^^я^С 201^г.

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций.на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13, (> ,

доктор медицинских наук С.П. Пахомов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) -онкологическое заболевание лимфатической ткани, при котором опухолевые лимфоциты накапливаются в периферической крови, костном мозге и лимфатических узлах. Изучение ХЛЛ, занимающего одно из ведущих мест в структуре гематологической заболеваемости, представляет значительный научный и практический интерес. Анализ эпидемиологических данных о распространенности ХЛЛ среди населения России и за рубежом свидетельствует о явной тенденции заболевания к дальнейшему росту [Воробьев А.И., 1985, Бакиров А.Б., 2007, Бессмельцев С.С., 2013, На11ек М. е1а1.,2013].

Согласно литературным данным и результатам собственных наблюдений при первом обращении больного примерно в 40% случаев отсутствуют характерные для ХЛЛ клинические проявления, такие как анемия, тромбоцитопения, увеличение лимфоузлов и гепатоспленомегалия [Воробьев А.И., 2000]. Нередко диагноз ХЛЛ устанавливается уже на поздних стадиях, когда к течению основного заболевания присоединяются тяжелые инфекционные осложнения, сопутствующие заболевания, происходит прогрессирование опухоли и нарушается общее состояние больных. В связи с этим важной задачей практической медицины является поиск прогностических критериев, позволяющих оценить риск развития ХЛЛ и своевременно поставить правильный диагноз [Волкова М.А. 2010].

Важным фактором развития ХЛЛ является наследственная предрасположенность. В связи с этим в последние годы был проведен молекулярно-генетический анализ ряда генов-кандидатов, полиморфные варианты которых предположительно ассоциируют с риском развития этого заболевания [Виноградова Ю.Е., 2000, Калимуллина Д.Х., 2004]. Однако при ХЛЛ, как и в случае с другими многофакторными заболеваниями, влияние полиморфизма отдельного гена на функциональные свойства белка во многом зависит от свойств целой системы, в которой он функционирует [Бакиров Б.А., 2005]. Это, в свою очередь, в значительной мере обусловлено индивидуальными особенностями организма и условиями окружающей среды. Поэтому один и тот же набор генов-кандидатов может обладать различной функциональной значимостью не только в разных популяциях, но и у разных индивидов. В связи с этим выяснение функциональной значимости ряда генов-кандидатов, задействованных .в патогенезе ХЛЛ, выявление молекулярно-генетических предикторов заболевания является

актуальной научной задачей.

Цель: Поиск новых прогностических критериев оценки риска развития, тяжести течения и эффективности терапии хронического лимфолейкоза на основе анализа ассоциации полиморфных вариантов и уровня'экспрессии генов,' кодирующих компоненты цитокинЪвой системы, онкогены, факторы роста, супрессоры опухолей и микроРНК.

Задачи:

1) Дать клинико-гематологическую характеристику клинических форм хронического лимфолейкоза.

2) Изучить частоты аллелей и генотипов генов цитокиновой сети (TNFA (rs 1800629)), онкогенов (ВАХ (rs4645878), MDM2 (rs2279744)), гено факторов роста (VEGF (rs3025039) и генов супрессоров опухолей (ТР53 (rs 1042522, rs 1625895)) у больных хроническим лимфолейкозом.

3) Провести репликативные исследования полиморфных локусо rs735665, rsl949733 и rsl 1158493, выявленных в результате полногеномног анализа ассоциаций при хроническом лимфолейкозе.

4) Провести анализ ассоциации уровня экспрессии гено цитокиновой сети (TNFА), онкогенов (MDM2, ZAP-70), генов факторов рост (VEGF), генов супрессоров опухолей (ТР53) и микроРНК (miR-145) с риско развития хронического лимфолейкоза.

5) Оценить связь полиморфизма генов-кандидатов эффективностью терапии больных хроническим лимфолейкозом.

Научная новизна. Впервые выявлены генетические маркерь полиморфных локусов генов TNFA (rsl800629), ВАХ (rs4645878), АСОХЗ (rsl949733), rs735665 ассоциированные с риском развития XJIJI.

Выявлена ассоциация полиморфных вариантов онкогена MDM2 развитием агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

Установлено, что маркерами ответа на проводимую терапию был полиморфные локусы генов VEGFA и TNFA.

Показано снижение экспрессии генов TNF A, MDM2, ZAP-70 больных с доброкачественной формой XJIJI, снижение экспрессии гено TNFA, ТР53, miR-145 у больных с агрессивной формой XJIJI.

Научно-практическая значимость. Результаты работы могут быт использованы для прогнозирования риска развития, тяжести течения и ответ на терапию у больных XJIJI.

Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе н биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курса последипломного образования врачей.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены обсуждены на II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическа диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, 2009), VI съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), I Российской научно-практической конференции с международным участие «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск 2011), VIII Российской конференции с международным участие; «Злокачественные лимфомы» (Москва, 2011), 77-ой Всероссийской научно практической конференции студентов и молодых ученых «Вопрось теоретической и практической медицины» (Уфа, 2012), ,Всероссийско молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессо жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новы

лекарственных препаратов» (Уфа, 2012), 78-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2013), Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Актуальные проблемы профилактической медицины, среды обитания и здоровья населения» (Уфа, 2013), X Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы» (Москва, 2013), межлабораторном семинаре и на ученом совете ИБГ УНЦ РАН (июнь, 2014).

Личный вклад автора. Соискателем лично сформированы исследуемые выборки, проведено анкетирование пациентов, собран анамнестический материал. Автор самостоятельно осуществил выделение ДНК, подбор праймеров и генотипирование молекулярно-генетических локусов, выполнил статистическую обработку данных, провел анализ генетических и клинических материалов, обобщил результаты исследования. По итогам выполненной работы автором подготовлены основные публикации, получено три патента на изобретение РФ, проведена апробация результатов исследования, написана и оформлена рукопись. Принял участие в выполнении двух грантов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатные работ, в том числе 8 - в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ. Получено 3 патента на изобретение.

Положения выносимы на защиту:

1) Прогностическими маркерами повышенного риска развития хронического лимфолейкоза являются полиморфные локусы генов TNFA и ВАХ.

2) Полиморфные локусы rsl949733 гена АСОХЗ и rs735665 выявленные , в результате полногеномного анализа ассоциаций, является маркером повышенного риска развития ХЛЛ

3) Установлена ассоциация полиморфного варианта онкогена MDM2 с развитием агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

4) Маркерами ответа на проводимую терапию были полиморфные локусы генов VEGFA и TNFA.

5) У больных с доброкачественной формой ХЛЛ снижена экспрессия генов TNFA, MDM2, ZAP-70, у больных с агрессивной формой ХЛЛ наблюдалось снижение экспрессии генов TNFA, ТР53, miR-145.

Объем н структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы, диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста и содержит,23 таблицы и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 158 наименования, из которых 78 иностранные.

Материалы и методы исследования

В работе использованы образцы ДНК 320 неродственных индивидов, проживающих на территории Республики Башкортостан. Группу исследования составили 124 больных с установленным диагнозом В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-XJIJI). Пациенты наблюдались в гематологическом отделении Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова (главный врач Нагаев Р.Я.)*.

Диагноз XJIJI устанавливался на основании комплекса обследований. В работе использовались данные клинического обследования, морфологического исследования крови и костного мозга, биохимического анализа крови (содержание общего белка, исследование белковых фракций с протеинограммой, билирубин, аланинаминотрансфераза,

аспартаттрансфераза), общего анализа мочи, иммунологического исследования, включая иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью моноклональных антител.

В зависимости от формы клинического течения ХШ1 исследуемые больные были разделены на две группы — с доброкачественной формо" (N=68) и агрессивной формой (N=56). Для формирования групп пациентов взяты критерии, предложенные Воробьевым А.И. (1985). Больные получали следующие программы лечения: 51 человек - FC, 45 - FCR. Программу FC выполняли по следующей схеме: циклофосфан вводился в дозе 250 мг/м2 в 1 2 и 3-й дни; флударабин — 40 мг/м2 в 1, 2 и 3-й дни. Пациентам проходившим лечение по схеме FCR, дополнительно к схеме FC добавляли ритуксимаб дозе 375 мг/м2 внутривенно в 1-й день каждого цикла или накануне. Курсь химиотерапии проводились каждые 28 дней. При развитии осложнений, таких как цитопения и другие, увеличивали промежутки времени межд курсами или отменяли лечение. Терапия CHOP проводилась по следующе" схеме: циклофосфамид г 750 мг/м2, доксорубицин - 50 мг/м2, винкристин 1,4 мг/м в 1-й день, преднизолон - 40 мг/м2 с 1 по 5 дни, схема R-CHOP заключалась в проведении стандартной CHOP с добавлением ритуксимаба дозе 375 мг/м2, в 1-й день.

Анализ полиморфных локусов генов TNFA, MDM2, ВАХ, VEG проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) ПДРФ-анализа.

Синтез первой цепи кДНК проводился с помощью реакции обратно" транскрипции. Анализ уровня экспрессии генов TNF A, MDM2, VEGF, ZAP 70, GAPDH проводили-методом мультиплексной ПЦР с- детекцией реальном времени. Все результаты были выражены в условных единицах представляющих собой отношение среднего числа копий кДН] исследуемого гена к среднему числу копий гена домашнего хозяйств (нормализованное число копий).

< < t t

*Выражаю искреннюю признательность коллективу гематологического отделения клинико-диагностической лаборатории, отделению функциональной диагностики i ультразвуковой диагностики за помощь в формировании групп и обследовании больных.

Для изучения представленности транскриптов miR-145 были использованы образцы тотальной РНК, выделенные из лейкоцитов периферической венозной крови. Анализ представленности транскриптов miR-145 проводили методом ГТЦР с детекцией в реальном времени.

Статистические методы Математическую обработку результатов исследования проводили на ЮМ Pentium III с использованием статистических программ STATISTICA v.6.0, а также в программах Microsoft Excel и Microsoft Access. Частоты генотипов и аллелей, а также стандартную ошибку и доверительный интервал выражали в процентах (%). Ассоциацию аллелей генотипов и гаплотипов с развитием заболевания выявляли, сравнивая выборки больных ХЛЛ и здоровых индивидов по частоте одного признака с использованием критерия %. Статистически значимыми считали различия при р<0.05. Оценка функции выживания вычислялась по общепринятой формуле Каплан-Майер.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Клинико-гематологическая характеристика больных хроническим

лимфолейкозом

Комплексное клиническое и гематологическое обследование проведено 124 больным B-клеточным вариантом хронического лимфолейкоза (B-XJIJI) из которых для 68 пациентов установлена доброкачественная форма ХЛЛ, 56 - агрессивная форма заболевания.

Больные с доброкачественной формой заболевания характеризовались медленным нарастанием количества лейкоцитов, лимфоцитов и незначительным увеличением лимфоузлов. У больных с агрессивной формой заболевания значительно чаще встречались спленомегалия (75,00%, против 42,65%), гепатомегалия (50,00%, против 35,29%), увеличение абдоминальных лимфоузлов (25,00%, .против 16,18%) и периферических лимфоузлов (87,50%, против 55,88%). _

Показатели костномозгового кроветворения у больных ХЛЛ характеризовались повышенным содержанием зрелых лимфоцитов. Для больных с доброкачественной формой течения ХЛЛ было характерно медленное нарастание лейкоцитоза, очаговый тип роста в костном мозге, незначительное увеличение периферических лимфоузлов и селезенки. У больных с агрессивной формой ХЛЛ напротив наблюдалось прогрессирующее развитие заболевания и небольшие сроки выживаемости.

У-всех больных ХЛЛ на всех стадиях заболевания отмечается резкое повышение содержания В-клегок (CD22+ и HLA-DR+). Высокое относительное и абсолютное содержание HLA-DR+-iaieTOK у больных ХЛЛ являлось подтверждением B-клеточного фенотипа лейкозных клеток.

2. Анализ полиморфных локусов генов цитокиновой сети, онкогенов генов факторов роста, генов детоксикации, генов супрессоров опухолей у больных ХЛЛ

Для выявления генетических маркеров риска развития, вариантов клинического течения и исходов ХЛЛ проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов цитокиновой сети (ТТЧРА (гэ 1800629)), онкогенов (ВАХ (ге4645878), МОМ2 (ге2279744)), генов факторов роста (\ZEGF (гб3025039) и генов супрессоров опухолей (р53 (ге 1042522, ге1625895)).

При сравнении общей выборки больных ХЛЛ и группы контроля выявлены достоверные различия по частотам генотипов полиморфного локуса -3080>А гена ТЫ ГЛ.

В группе больных ХЛЛ достоверно чаще встречался генотип Св по сравнению с группой контроля (80,65% и 64,80%, соответственно; 50; р=0,005). Напротив, генотип ОА достоверно чаще встречался в группе здоровых индивидов (32,65%), тогда как его частота в группе больных ХЛЛ составила 18,55% ( %2=6,94; р=0,009). По частотам генотипа АА достоверных различий не обнаружено. Частота аллеля в полиморфного локуса -3080>А гена ТЫРА в группе больных ХЛЛ оказалась достоверно выше, чем в группе контроля (89,92% и 81,12%, соответственно; х2=8,33; р=0,005). Существенные различия также наблюдались по частоте аллеля А: в контрольной группе - 18,88%, в группе больных ХЛЛ - 10,88% (^2=8,33; р=0,005).

Таким образом, в результате исследования полиморфного локуса -308в>А гена ТЫЕА было показано, что маркерами риска развития ХЛЛ в общей группе больных являются генотип Св ((Ж=2,26; 95% С1 1,33-3,86) и аллель в (011=2,08; 95% С1 1,28-3,37). Напротив, маркерами устойчивости являются генотип СА (СЖ=0,47; 95% С1 0,27-0,81) и аллель А (СЖ=0,48; 95% С10,30-0,78).

Представляло интерес исследование взаимосвязи частот генотипов изучаемого полиморфного локуса и выживаемости больных ХЛЛ. При анализе кривых выживаемости по методу Каплан-Майер в зависимости от генотипа полиморфного локуса -3080>А гена ТИРА обнаружены достоверные различия при попарном сравнении генотипа Св и ОА (р=0,020). Так, у лиц с генотипом вв выживаемость в среднем составила 60 месяцев, тогда как у больных с генотипом ОА выживаемость превышала 270 месяцев, что говоритх) неблагоприятном прогнозе течения-ХЛЛ у лиц с генотипом вС (рис.1)

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 ' 0,2 0,1 0,0 -0,1

_ GA — GG

о 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 Время (мес.)

312 336

Рис.1, кривые выживаемости больных ХЛЛ в зависимости от генотипов полиморфного локуса -308G>A гена TNFA.

При изучении результатов проводимого лечения было показано, что клиническая стабилизация заболевания после проведенного лечения статистически достоверно ассоциирована с полиморфным вариантом GA

локуса -308G>A гена TNFA.

Исходя из полученных нами результатов, можно сделать предположение о том что экспрессия гена TNFA в присутствии аллеля G снижена так как предположительно недостаток этого цитокина способствует пролиферации лимфоцитов при ХЛЛ, в результате чего эти клетки накапливаются в костном

М°ЗГБыл проведен анализ распределения генотипов и аллелей полиморфного локуса Arg72Pro и 13494A>G гена Р53. Статистически значимых различии в пясппеделении по группам найдено не было.

Р СравнительныГ анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 не выявил статистически достоверных различий между группой больных ХЛЛ и здоровыми индивидами. Статистический анализ выживаемости по методу Каплан-Меиер показал достоверные различия при попарном сравнении генотипов GG и TT (р=0 01 В). Таким образом, генотип GG полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 является прогностически неблагоприятным маркером течения ХЛЛ.

(Рис. 2).-

О 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

- «3

- ТТ

- ТО

Время (мес.)

Рис. 2. Зависимость показателей беспрогрессивной выживаемости у больных ХЛЛ от вариантов полиморфного локуса 309Т>0 гена МОМ2.

Проведя статистический анализ связи полиморфного локуса 309Т>0 гена 1УГОМ2 с учетом клинического течения ХЛЛ, было показано, что генотип СО связан с агрессивным течением заболевания (х2=4,87; р=0,028; (Ж=3,27; 95% С1 1,224-8,724), тогда как генотип ТО ассоциирован с более доброкачественным течением ХЛЛ (СЖ=0,36).

Сравнение общей выборки больных ХЛЛ и здоровых индивидов выявило статистически достоверные различия в распределении частот генотипов. При анализе полиморфного локуса -2480>А гена ВАХ с одной стороны, гомозиготный генотип Ов достоверно чаще встречался в группе больных ХЛЛ (63,71%), тогда как в группе здоровых индивидов частота его составила 46,30% (%2=6,40; р=0,012). Данный генотип является фактором предрасположенности к развитию заболевания (СЖ=2,04; 95%С1 1,20-3,45). Также показано, что аллель О чаще встречался в группе больных ХЛЛ -75,00%, против 65,28 в группе контроля (х2=4,79; р=0,029). Показатель отношения шансов для аллеля О составил 1,60 (95% С1 1,07-2,39). На основе проведенного исследования можно предположить^ что аллель А полиморфного локуса -2480А гена ВАХ приводит к снижению экспрессии этого гена, что способствует противоапоптотическому действию ВСЬ-2, в результате чего нарушается клеточный контроль за пролиферацией лимфоцитов.

При- сравнении общей выборки больных ХЛЛ с группой здоровых достоверных различий в распределении ' частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 936С>Т гена УЕСТ-' обнаружено не было. Редкий генотип ТТ выявлен только у 1-го больного ХЛЛ (0,81%), тогда как в группе

обнаружена ассоциация r. prR Так у больных с отрицательным

^чмнт-епяпией ПО схемам l_nUr И юл, j Г

химиотерапией чи гнпр и FCR чаще встречался генотип СС

ответом на терапию по схемам CHOP и чаще во р

fo2=4,61; р=0,032; Х2=15,71; р=0,001).

3 Реплнкатнвные исследования полиморфных ло^сов выявленных ПО результатам GWAS при ХЛЛ

В результате проведенного анализа по поиску ассоциащну-ежду генотипами и аллелями полиморфного локуса rs!949733 гена АСОХЗ были

найдены статистически значимые различия.

№ в группе больных ХЛЛ -ас,™ генотипа ДА с—а « «/ » ™

(OR 3,22, *>/» t. , , > контроля (83,06% против 64,14%,

ЛЛ. Р^.00О, P„S Г„™ ХЛИ при э„м бь,л

езрГ:х ХТ„еакп,.е„. Иеходя „з ,™го, не «о ««» Р-™™ Zumra в патогенезе ХЛЛ. Мы предполагаем, что опухоль в результате ГгГГлюГонного развития активирует этот эмбриональным ген для восполнения ^финдта питания и пополнения жирными кислотами По-—у, в п^угствии аллеля С —— -„т.

генотипам^Ьиа^лел^ локуса rs 1П 58493 гена «««

статистически значимые различия не обнаружены.

В результате проведенного анализа по «„^З^ы генотипами и аллелями полиморфного локуса rs735665 были найдены

статистически значимые различия. „ППпп ГПявнению с

Так генотип АА чаще встречался в группе больных ХЛЛ по сс группой контроля (11,29%, против 3%, соотв^стве.шо х^!, Р « Риск пазвития ХЛЛ при наличии данного генотипа был повыше в 4,1/раза (OR=4P?2 95% CI 1,54-11,02).- Аллель А .существенно чаще ■ встречался в (OK 4,1 А уд/ , сравнению с группой контроля - 18,50/»

^2= Н,4^ р^!о01^риск 'развития ХЛЛ при этом был повышен в 2 раза (QR=2,06; 95% CI 1,43-2,98).

4. Анализ уровня экспрессии генов цитокиновой сети (Т№А), онкогенов (\1DM2, ¿АР-70), генов факторов роста (УЕОР), генов супрессоров опухолей (р53)

Был проведен анализ профиля экспрессии генов цитокиновой сети (ТА'ЕЛ), онкогенов (МОМ2, 2АР-70), генов факторов роста (ЕЕСЕА), генов супрессоров опухолей (ТР53) у больных ХЛЛ с доброкачественным и агрессивным течением заболевания, до лечения.

Интерес представляет изучение уровня экспрессии гена ШГА, так как продукт этого гена напрямую отвечает за запуск апоптоза опухолевых клеток. Уровень экспрессии этого гена у больных ХЛЛ был статистически значимо ниже по сравнению с группой контроля (РЯ= -3,91, р=0,001). Так, в группе контроля экспрессия этого гена составила - 4,22%, а в группе больных ХЛЛ-1,08%. (рис.3).

Т^А

6,00%

с:

а

о. с

* 4,00% сс

^ 3,00%

8 2,00%

. 1,00%

0,00%

ЯТ^А

■I

Контрольная группа

Больные ХЛЛ

Рис. 3. Уровень экспрессии гена ТЪГЕА у больных ХЛЛ и в группе контроля.

Одним из высокоинформативных показателей, позволяющем судить о прогнозе течения ХЛЛ, является белок 2АР-70, экспрессия которого " коррелирует с мутационным статусом иммуноглобулинов на поверхности опухолевых лимфоцитов. Анализ уровня экспрессии гена гЛР-70 у больных ХЛЛ с учетом формы клинического течения заболевания показал статистически достоверные различия. Так в группе с доброкачественной формой ХЛЛ уровень экспрессии этого гена оказался существенно ниже по сравнению с группой контроля (5,32% и 0,41%, соответственно) (рис. 4).

о. о X

10,00% 8,00% 6,00% 4,00% 2,00% 0,00% -2,00% -4,00% -6,00% -8,00%

Контрольная группа

2АР70

гдр7о

Доброкач. форма ХЛЛ

Агрессивная форма ХЛЛ

Рис. 4. Уровень экспрессии гена 2АР-70 у больных ХЛЛ в зависимости от формы заболевания и в группе контроля.

Снижение уровня экспрессии гена 7АР-70, может объясняться тем, что в группе больных с доброкачественным течением заболевания мутационный статус поверхностных иммуноглобулинов был низким.

Супрессор опухолевого роста - белок р53 является фактором транскрипции. Этот белок имеет решающее значение для поддержания целостности генома, остановки клеточного цикла и апоптоза.

При анализе уровня экспрессии гена ТР53 наблюдалась тенденция к повышению уровня экспрессии в группе больных ХЛЛ (18,45%, против 11,44%, соответственно), но статистически значимого уровня эта тенденция не достигла, (рис. 5).

ТР53

35,00% 30,00%

а: и

« 25,00%

с

и

; 20,00% го

1

х

2 15,00%

1 10,00%

о.

о

5,00% 0,00%

®ТР53

Контрольная группа

Больные ХЛЛ

РИС.Туровень экспрессии гена ТР53 у больных ХЛЛ и в группе контроля.

Поскольку р53 является супрессором опухолей, то ^ном^ о, ожидать снижения но не повышения экспрессии этого гена у больных ХЛЛ.

X более Д-ального анализа экспрессии гена ТР53 в зависимости от Формы клинического течения ХЛЛ был проведен сравнительный анализ в подгруппах ^ агрессивной и доброкачественной формами заболевания (рис.

6),

ТР53

60,00%

50,00%

' 40,00%

30,00%

20,00%

10,00%

0,00%

:ТР53

Контрольная группа Доброкач. форма Агрессивная форма ХЛЛ

ХЛЛ

~1^^вшь^кспр^с1^гена ТР53 у больных ХЛЛ в зависимости <| формы заболевания и в группе контроля.

Как видно из полученных результатов, у больных с агрессивной формой заболевания наблюдается значительное снижение экспрессии практически в пять раз (FR= -5.28; р=0,001). Это согласуется с данными о патогенетической значимости гена ТР53 в развитии опухолей. Кроме того, пониженная экспрессия данного гена у больных с агрессивной формой XJIJI может объясняться тем, что в процессе развития опухоли нередко в гене ТР53 возникают мутации, нарушающие нормальную экспрессию этого гена [Groves MJet.al. 2012].

При сравнении больных с доброкачественной формой XJIJI с группой контроля, напротив, наблюдалась тенденция к повышению экспрессии гена ТР53. По всей видимости, повышенная экспрессия гена ТР53 может служить сдерживающим фактором развития ХЛЛ, так как подавляет опухолевый рост. Возможно, этим и объясняется выраженный фенотипический полиморфизм вариантов течения данного заболевания у разных пациентов.

В физиологических условиях деятельность и уровень экспрессии белка р53 находятся под жестким контролем, в основном, белка MDM2. Белок MDM2 является убиквитин-лигазой ЕЗ, которая связывает белок р53 для последующей его деградации в протеосомах. При сверхэкспрессии гена MDM2 работа белка р53 чрезмерно подавляется, что способствует накоплению мутантных клеток и, как следствие, запускаются процессы канцерогенеза.

С целью дальнейшего анализа данного механизма опухолевой супрессии был проанализирован уровень экспрессии гена MDM. Было обнаружено, что уровень экспрессии гена MDM2 имеет тенденцию к снижению в группе больных ХЛЛ по сравнению с группой контроля (рис. 7).

MDM2

30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% -5,00% -10,00% -15,00%

—

к ,, * штш

- Hf? НИ-

I MDM2

Контрольная группа

Больные ХЛЛ

Рис. 7. Уровень экспрессии гена МОМ2 у больных ХЛЛ и в группе контроля.

" Однако при анализе экспрессии гена МИМ2 в группах с разными клиническими формами ХЛЛ мы наблюдали противоположную картину (рис. 8).

МРМ2

160,00% 140,00% 120,00% 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00%

т

" ш

-------------------- 1 Т мМА

ШЙ1 __

1М0М2

Контрольная Доброкач. Агрессивная

группа форма ХЛЛ форма ХЛЛ

Р^П". Уровень экспрессии гена МИМ2 у больных ХЛЛ в зависимости от формы заболевания и в группе контроля.

Так вопреки ожиданию, в группе больных с агрессивной формой ХЛЛ наблюдалось тенденция к повышению экспрессии гена МОМ2, хотя уровень статистической значимости не был достигнут. В группе с доброкачественным течением ХЛЛ, напротив, уровень экспрессии гена МИМ2 был значительно ниже (РЯ= -6 73 р=0 001). Обращает на себя внимание разнонаправленность экспрессии генов мЬм2 и ТР53. Повышение у больных уровня экспрессии гена \iDM2, видимо, оказывает угнетающее влияние на экспрессию генг ТР53, что находит подтверждение при анализе корреляции этих двух генов

которая составила г=0,321 (р=0,01).

Для объяснения возможных причин выявленного нами повышенной уровня экспрессии гена МОМ2 был проведен анализ представленное^ транскриптов тЖ-145, для которых имеются сайты связывания с мРНК ген 1УГОМ2 и поэтому не исключается возможность регуляции уровня экспрессии данного гена посредством интерференции 1шЯ-145. К тому же, исследовани! А1зЬ™агуа в е1. а1. (2011) показали, что в промоторной области 1гнК-14Ь ест сайты связывания с белком р53 в связи с чем мутантные варианты белка Р5 значительно подавляют процессы транскрипции тП1-145, в отличие от р5 дикого типа, уровень представленности транскриптов гшЯ-145 при которо был выше. Таким образом, есть основания предполагать, что уровет экспрессии гшЯ-145 модулируется с помощью белка Р53 путе|

16

метилирования промоторной области miR-145. [Aishwarya G. et. al. 2011; Seong O. et. al. 2014]. К тому же Suzuki H.I. (2009) было показано, что белок р53, усиливает пост-транскрипционное созревание miR-145 в ответ на повреждение ДНК.

При сравнении количества транскриптов miR-145 у больных XJIJI и группы контроля статистически значимых различий найдено не было. Несмотря на это выявлена отчетливая тенденция к снижению уровня представленности транскриптов miR-145 в группе больных ХЛЛ (рис. 9).

miRNA-145

Рис. 9. Уровень представленности транскриптов гг^-145 у больных ХЛЛ и в группе контроля.

При анализе представленности транскриптов тЖ-145 у больных с разными формами клинического течения ХЛЛ, было показано, что в группе с агрессивной формой течения заболевания уровень представленности транскриптов т^-145 оказался значительно ниже и составил 0,06% по сравнению с группой контроля, в которой он оказался равным 1,60% (РК= -28,66, р=0,001) (рис. 10).

гт!МА-145

14,00% 12,00% 10,00% 8,00% 6,00% 4,00% 2,00% 0,00% -2,00%

группа

и

т

1

Контрольная .Добр окач. Агрессивная

I гтКЫА-145

форма ХЛЛ

форма ХЛЛ

Рис. 10. Уровень представленности транскриптов ш1Я-145 у больных ХЛЛ в зависимости от формы заболевания и в группе контроля.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено важное патогенетическое значение уровня экспрессии генов цитокиновой сети (ТОТА), онкогенов (МБМ2, гАР-70), генов супрессоров опухолей (ТР53) и гшК-145 в формировании ХЛЛ и различных клинических форм1 заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Маркерами повышенного риска развития хронического лимфолейкоза являются генотип СО (011=2,26; 95% С1 1,33-3,86) и аллель в (СЖ=2,08; 95% С1 1,28-3,37) полиморфного локуса-3080А гена ГА^Л, генотип (Зв (ОЯ=2,45; 95%С1 1,41-4,26) и аллель в (011=1,936; 95% С1 1,263-2,968)1 полиморфного локуса -248С>А гена ВАХ.

2. В результате репликативных исследований показано, что маркерами, повышенного риска развития ХЛЛ являются генотип СС (011=9,08; 95% С1 5,92-14,15) полиморфного локуса ге 1949733 гена АСОХЗ и генотип АА (011=4,25; 95% С1 1,61 -11,28) полиморфного локуса «735665.

3. Установлено, что генотип ОС полиморфного локуса 309ТМЗ гена МОМ21 является прогностическим маркером агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

4. Генотип СС полиморфного локуса 936С>Т гена фактора роста эндотели: сосудов -УЕСРА ассоциирован с лучшим ответом на проводимук терапию -по схемам РС и РСЯ. Генотип СО полиморфного локус, -308С>А гена ТЫНА и генотип СТ и аллель Т полиморфного локус;

9360Т гена VEGFA являлись факторами риска развития резистентности к проводимой терапии. 5. У больных с доброкачественной формой ХЛЛ снижена экспрессия генов TNFA (FR= -3,97; р=0,001), MDM2 (FR= -6,73; р=0,001), ZAP-70 (FR= -13,10; р=0,025). У больных с агрессивной формой ХЛЛ наблюдалось снижение экспрессии генов TNFA (FR= -3,52; р=0,001), ТР53 (FR= -5,28; р=0,001), miR-145 (FR=-28,66; р=0,001).

Практические рекомендации.

Для прогноза риска развития, тяжести течения и ответа на проводимую терапию при полиморфных локусов генов TNFA, ВАХ, VEGF, АСОХЗ.

Для прогноза повышенного риска развития хронического лимфолейкоза рекомендовано молекулярно-генетическое исследование полиморфного локуса -308G>A гена TNFA, полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ, полиморфного локуса rs 1949733 гена АСОХЗ полиморфного локуса rs735665.

Для прогноза клинической формы течения хронического лимфолейкоза рекомендовано молекулярно-генетическое исследование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2.

Для прогноза ответа на терапию хронического лимфолейкоза рекомендовано молекулярно-генетическое исследование полиморфного локуса 9360Т гена VEGFA.

Список сокращений

ПЦР полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

ПДРФ полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

п.н. пар нуклеотидов

РБ Республика Башкортостан

ХЛЛ хронический лимфолейкоз

ВАХ Вс1-2 ассоциированный X протеин

FR Fold regulation (кратность изменения нормализованной экспрессии)

MDM2 главный регулятор супрессора опухолей р53

OR отношение шансов

SNP single nucleotide polymorphism

TNFA фактор некроза опухолей а

VEGFA- фактор роста эндотелия сосудов "

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Полиморфизм генов факторов некроза опухолей (а и Р) у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Каримов Д.О., Бакиров Б.А., Хабибуллина , К.Р. Викторова ,Т.В. // Сборник, тезисов II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» 22-23 января 2009, г. Москва

2. TNF-alfa and MDM2 polymorphysm in pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia [Текст] / Bakirov В., Karimov D., Warshavsky A., Sgibneva A. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2009

3. Роль полиморфных вариантов генов фактора нероза опухолей (а и ß) у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Хабибуллина K.P., Данилко К.В., Измайлова С.М., Каримов Д.О. // «Вопросы теоретической и практической медицины» Материалы 74-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых.(Уфа, 12-13 апреля 2009 г.) Том 2, стр. 195-196

4. Полиморфизм гена НАД(Ф)Н-хинон оксидоредуктазы 1 у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Меринов С.С., Назарова Л.Ш., Тухватуллин A.B., Каримов Д.О. // «Вопросы теоретической и практической медицины» Материалы 75-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых.(Уфа, 12-13 апреля 2009 г.) Том1, стр. 236-237

5. Полиморфизм гена ингибитора апоптоза клеток В АХ у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Тухватуллин A.B., Назарова Л.Ш., Меринов C.G., Каримов Д.О. // «Вопросы теоретической и практической медицины» Материалы 75-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых.(Уфа, 12-13 апреля 2009 г.) Том 2, стр. 145-146

6. Полиморфизм генов главного регулятора супрессора опухоли р53 (MDM2) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Назарова Л.Ш., Тухватуллин A.B., Меринов С.С., Каримов Д.О. // «Вопросы теоретической и практической медицины» Материалы 75-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых.(Уфа, 12-13 апреля 2009 г.) Том2, стр. 48-49

7. Бакиров Б.А. Поиск генетических маркеров прогнозирования и развития хронического лимфолейкоза [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О., Викторова Т.В. // Креативная хирургия и онкология. 2010/№4 с.68-70.

8. Бакиров Б.А. Роль гена белка р53, онкогенов и генов цитокинов в процессах онкогенеза при хроническом лимфолейкозе [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О. // Медицинский вестник Башкортостана, 2010г., том 5, №3, с.114-119.

9. Полиморфизм гена основного фактора роста фибробластов у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О., Викторова Т.В., Бессмельцев С.С. // Фундаментальные исследования №7, 2011 с.15-17.

10. Бакиров Б.А. Полиморфизм генов регуляторов апоптоза и-факторов рост; у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О., Викторова Т.В. // Медицинская наука и образование Урала, №3, Тол 12, 2011, с.55-57.

11. Бакиров Б.А. Полиморфизм генов регуляторов апоптоза и факторов роста у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О., Викторова Т.В. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2011. Т. 7. №4. С. 827-831.

12. Бакиров Б.А. Полиморфизм генов генов фактора некроза опухолей а, главного регулятора-супрессора опухолей р53 и надф(н) хинон оксидоредуктазы у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Бакиров Б.А., Каримов Д.О., Викторова Т.В. // Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 4. С. 27-30.

13. Оценка риска развития хронического лимфолейкоза с помощью молекулярно-генетических маркеров [Текст] / Каримов Д.О., Байзигитов Д.Р., Мухаммадиева Г.Ф., Бакиров Б.А. // Санитарный врач. 2013. № 10. С. 66-68.

14. Полиморфизм генов регуляторов апоптоза и факторов роста у больных хроническим лимфолейкозом [Текст] / Каримов Д.О., Бакиров Б.А., Бакиров А.Б., Викторова Т.В. // Медицинская генетика. 2013. №11 С. 29-34

15. Постгеномные исследования хронического лимфолейкоза [Текст] / Каримов Д.О., Шамиева Л.В., Назарова Л.Ш., Данилко К.В. // Вестник Башкирского государственного медицинского университета, №1, 2013. С. 5761

16. Анализ ассоциации полиморфного локуса гэ735655с риском развития хронического лимфолейкоза [Текст] / Шамиева Л.В., Каримов Д.О., Назарова Л.Ш., Данилко К.В. // Вестник Башкирского государственного медицинского университета, №1, 2013. С.136-139.

Патенты РФ на изобретение:

1. Патент РФ №2490642 от 20.08.2013. «Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза».

2. Патент РФ №2495427 от 10.10.2013. «Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе».

3. Патент РФ №2496110 от 20.10.2013. «Способ прогнозирования «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза».

Работа выполнена при поддержке:

1. Грант по программе У.М.Н.И.К. фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (государственный контракт № 10261р/16827 от 28.04.2012)

2. Грант Республики Башкортостан молодым ученым и молодежным научным коллективам (договор №1034 от 12.02.2013)