Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез ДНК и РНК в лимфоцитах крови крупного рогатого скота при спонтанном и экспериментальном лимфолейкозе

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Синтез ДНК и РНК в лимфоцитах крови крупного рогатого скота при спонтанном и экспериментальном лимфолейкозе"

1 и о

< 5,2

ВСЕРОССИЛСШ ОРДЕНА ЛШЖА НАУЧКО-ИССЩОВАТЕЛЬСНИЗ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я,Р,КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЖЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

ЗШРАЕЗА НАТАЛЬЯ ЗМДХШРОВНА

ста тез да и ?нк з лл.мо^тах кров;; крупного

РОГАТОГО СКОТА ПРК СПЖТАЬНСМ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ Л'.'йОЛЕ^КОЗЕ

G3.CC.C6 - вирусология

I6.CC.l2 - пaтoлoгия^ онкология и морфологи» животиых

А 3 7 0 ? С. 3 С Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата ¿иологиадских наук

^ * /

¿? '/С

Работа выполнена в Центральном отделе лейкозов, сравнительной й экспериментальной онкологии Всероссийского ордена Ленина №.учно-исследовательского института экспериментальной ветерина- , рии имени Я.Р.Коваленко.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных нйук( Ведущий

Официальные Ьппоненты:

1. Доктор биологических наук» профессор Н.И.Снежков (Тверской СХИ){

2. Кандидат биологически наук^ ст.научный сотрудник Г.А.Надто-чей (ВКЭВ).

Ведущая организация; Украинский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательски институт экспериментальной йе-теринарии,

* а?

Задита диссертации состоится в и V часов на заседаний СпбцйалйзйровЫного сойётй Д G2G.33.CI по защите диссертаций й'а. соискание ученой степени доктора наук при Всероссийской ьрДбйй. Ленина научно-исследоватеЯЬ-ском институте экспериментальной 8ё1"ерйнарии имени Я.Р.Коваленко по адресу; 209472, Москва, Куэьийнк.ч, ШЭВ-

С ¿'.иссвртацией мдано ознакомиться а научной библиотеке ВИЭВ.

научНьШ сотрудник М.И.ГуЛюкин

Ученый секретарь ОпециалиэкройаШогс совета, аандцда? биологических наук

Ф.Г.Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

Настоящая работа выполнена согласно Государственной научно-технической программа С.69.15 " Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике, лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека, сельскохозяйственных животных и птиц".

Акт1гальность_темы. Профилактика и ликвидация инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных является важным условием успешного развития животноводства страны. Среди вирусных болезней сельскохозяйственных ясивоткых, получивших в последние годи широкое распространение, лейкоз занимает одно из ведущих мест.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом (ВЛКРС), протекающая вначале бессимптомно, а затем проявляющаяся лимфоцитоэом или образованием опухолей в кроветворных и других органах и тканях.

Открытие возбудителя заболевания дало мощный толчок многочисленным исследованиям этого вида инфекционного неопластического заболевания.

Изучение патогенеза инфекционного процесса, индуцируемого вирусом лейкоза крупного рогатого скота, имеет важное теоретическое и практическое значение, "становится все более актуальным в связи с установлением структурного и иммунологического родства ВЛКРС с вирусом Т-клеточного лейкоза человека (Gallo R.C. et al., 1982; Oroazlaa S. et al., 1932; Weisa I.K. et al., 1934; Sagata H. et al., 19Э6).

Лимфолейкоз крупного рогатого скота в основном проявляется как хроническое ли^фопролиферативное заболевание В-лтлфоцитов (Николаева Н.З. и др., 1961; Тамоиюнас З.И., 1981,1987; Коуаша Н. et al., 1ЖЗ). По имению Л.Я.НпгаевоЛ и соавт.(1988), A.Burny (1988), экспрессия вируса лейкоза крупного рогатого скота в организме'яв-

ляется антигенным стимулом, запускающим пролиферацию В-лимфоцитов. В связи с этим изучение роли ВЛСРС в активации пролиферации клеток- лимфоидной 'популяции остается ватаейшим вопросам современной лейкоэологии.

В процессе неопластической трансформации клеток происходят существенные изменения в действии регуляторных механизмов клеточ-. , ной пролиферации.

Поэтому исследование особенностей пролиферации и дифференци-ровки кроветворных клеток, биосинтеза нуклеиновых кислот, изменений молекулярной структуры и функций мембран популяций лимфоцитов при гемобластозах особенно актуально (Когарко И.Н., 1990).

Несмотря на исключительно важное значение, многие вопросы проблемы изучения пролиферативны? процессов в клетках лимфоидной популяции в норме и при лейкозной патологии остаются .неразрешенными.

УбДь_и_задачи_исследования. Настоящее исследование было проведено с целью изучения особенностей синтеза нуклеиновых кислот при спонтанном и экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого ско- • та,как возмояшых маркеров лейкозной трансформации лимфоцитов крови.

В соответствии с выдвинутой целью были поставлены задачи:

1. Изучить уровень синтеза ЩШ и ШК лимфоцитами крови крупного рогатого скота в динамике развития спонтанного и экспериментального яимфолейкоза:

а) характеристика Синтеза ДЖ и ШК лимфоцитами крови инфицированных ВЛКРС и больных яимфолейкозом животных;

б) некоторые особенности синтеза ДНК и Н1К лимфоцитами крови животных, облученных различными дозами гамма-излучения (50-150200 Р) и зараженных вирусом лейкоза крупного рогатого скота..

2. Получить перевиваемую культуру клеток, продуцирулцую вирус лейкоза крупного рогатого скота.

3. Изучить влияние биологически активных веществ на пролпфв-ративную активность лимфоцитов крови.

Впервые изучено изменение синтеза ДНК, РНК и иммуноглобулинов класса 5 и Ив динамике развития лейкозного процесса.

Впервые получена культура клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота, хронически инфицированная ВЛКРС и продуцирующая вирус лейкоза.

Показан прогностический характер повышения уровня синтеза ДОК и РНК лимфоцитам-.! крови при инфицировании животных В1КРС и развитии за этим самого лейкозного процесса.

ПРё5£ИНв2£§й_Ц§Щость_рабогы. Обнаруженное увеличение клеток активно синтезирующих ДМ и РНК на раннем этапе экспериментального лю^юлейкоза - одно из доказательств нарушений пролиферативной активности лимфоцитов крови при лейкозной патологии, что является теоретической предпосылкой для дальнейшего изучения факторов, регулирующих синтез нуклеиновых кислот при лимфолейкозе крупного рогатого скота.

Радиометрический способ определения ДНК-и НЖ-синтезирупцих мононуклеарных клеток может быть использован в целях практической ветеринарии при оценке вероятности возникновения и дальнейшего развит!« ли?4>олейноэа крупного рогатого скота. Определение этого параметра совместно с гематологическими и серологическими исследованиями может улучшить достоверность диагноза и прогноза инфицированнос-ти крупного рогатого скота вирусом лейкоза.

По материалам проделанной работы разработаны и утверждены "Методические рекомендации но выявлению животных повьшенного риска заболевания (с использованием радиометрического метода)".

Научная новизна-и практическая значимость проведенной работы

отмечена положительным решением патентной экспертизы на авторскую заявку "Штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого- скота - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота".

Апробация_]эаботыЛ Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку на: Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и Продовольственная программа", .г.Киев, 26-28 сентября 1989 г.; конференции, посвященной 70-летию МВА, г.Москва, 24-26 ноября 1989 г.; Республиканской конференции "Теоретические и практические вопросы ветеринарии", г.Тарту,1990 г.; Всесоюзной научно-производственной конференции, г.Новосибирск, II—13 апреля 1990 г.; на заседании Ученого совета ВИЭВ, II декабря 1991 г.

П^бликауия_результатов_исследований. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

ьем_и_струкгура_£иссертауии. Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста, включает введение, . обзор литературы,собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предложения.список цитируемой литературы (385 источников).

Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 22 рисунками.

Основные_полджения_дассергауионноЯ_ра дит£: .

- результаты исследования синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови здоровых животных, свободных от ВЛНРС, в динамике развития спонтанного и экспериментального лимфолейноза крупного рогатого скота;

- возможность использования радиометрического метода для выявления животных повышенного риска заболевания;

- результаты исследования содержания иммуноглобулинов класса G и М в сыворотках крови в динамике развитая лейкозного процесса и возможность использования этих показателей в диагностических целях;

- получение перевиваемой культуры клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота, продуцирующей ВЛКРС;

- влияние биологически активных вецеств на пролиферативную активность лимфоцитов крови здоровых и больных лимфолейкозом животных.

СОГСТВШНЬ'Е нсслвдовшя

л!атериалы_11_кетоды. Исследования по теме диссертационной работы проводились с 1968 по 1991 г. в Центральном отделе лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии, а также в Вышневолоцком и Калужском отделах Е"ЭЗ.

Объектом исследования в работе служил крупный рогатый скот в возрасте от I дня до 8 лет.З опытах находились особи обоего пола.

Подопытные животные били объединены в следующие группы:

- клинически здоровые (контрольные) животные, отрицательные в гад (42 гол.);

- клинически здоровые, положительные в РИД (спонтанно инфицированные ВЛКГС ~ 16 гол.);

- животные,больные лимфолейкозом и инфицированные ВЛКРС(1С гол.);

- потомство больных лейкозом родителей ,10 гол.);

- животные,, экспериментально инфицированные ВЛКРС ;8 гол,,);

- облученные различными дозами общего гамма-излучения (50-150-2С0 Р) животные,,, экспериментально инфицированные ВЛКРС (5 гол«).

Материалом исследования служили лимфоциты и сыворотак крови этих животных, а такяе культура клеток легкого амбркона хоровн„ хронически инфицированная вирусом лейяоза крупного рогатого енота ;Л9К-Е113В-90), полученная нами из легкого плода хоров«, большой ХЛЛ и инфицированной ВЛКРС.

В качестве вируссодержадего материала для экспериментального воспроизведения лейкоза на телятах использовали леЯкояонцентрат от

больной и инфицированной ВЛКРС коровы в объеме 50 мл, содержащий 8 х 10® клеток. Для подтверждения наличия ВЛКРС в лейкоконцентрате была- поставлена "биопроба на овцах.

Контролем служили 5 телят, подобранные по принципу аналогов, из благополучного по лейкозу хозяйства, которым ввели лейкоконцент-рат от клинически здоровой и свободной от ВЛКРС коровы в такой .же дозе.

Гематологические, серологические и радиометрические исследования телят проводили до введения лейкоконцентрата и после через 3, 7, 14, 21, 28, 35 суток и далее ежемесячно в течение 1,5 лет.

Исследования всех животных проводились комплексным методом.

Материал, исследованный различными методами и подвергнутый анализу, представлен в таблице I.

Таблица I

______,_Мето,ды_____________________1____

Клинико-гематологический 1435

Серологический ' 1435

Радиометрический 1723

Цитоморфологический 1435

Авторадиографический 517

Патологоанатомический 33

Иммунологический 202

Культивирование клеток ■

Гематологические исследования проводили согласно "Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (1989).

Для выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза, применяли реакции иммунодиффузии (РИД) в геле агара согласно "Методическим рекомендациям по серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота", утвержденным ГУБ Госагрспро?/а СССР 30 ноября 1988 г.

Количественное определение иммуноглобулинов классов й и М проведено методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1965) в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ (зав.лаб. профессор Ю.Н.Федоров). •

Синтез нуклеиновых кислот под действием ВЛКРС в лимфоцитах крови определяли с помощью мечет« предшественников ДНК и РНК -3Н-тимидина и эН-уридина, а учет результатов проводили радиометрическим методом с использованием сцинтиляционного счетчика типа 1219 ЯАСОЕТА СЬКВ, ТОЛАС, Швеция), а морфологию этих клеток изучали методом авторадиографии.

Патологоанатомические и гистологические исследования проведены в ЦО лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВИЭВ совместно с н.с. А.В.Васиным.

Работу с культурой клеток проводили в лаборатории клеточной биотехнологии и экспериментальной технологии питательных сред, возглавляемой профессором Л.П.Дьяконовым, совместно с гс.в.н., с.н.с. Д.В.Лобунцовой.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТ*! ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Синтез ЛИК и РНК в лимфоцитах крови здорового крупного рогатого слота

Анализ современной литературы показывает, что в последние годы возросло внимание к изучению ДНК- и ГОК-сиитезируггцих клеток крови, тогда как специальные исследования этих клеток остаются пока единичными, а многие вопросы, касащиеся морфологии, природы, функции, уровня этих клеток в крови здоровых животных и при раз-л;гчных заболеваниях остается нерешенными.

При проведении параллельных исследований проб крови здоровых

животных авгорадиографическим и радиометрическим методами нами установлено, что в крови постоянно циркулируют лимфоциты, синтезирующие .ДНК и НЖ. '

Авторадиографическими исследованиями установлено, что количество ДНК-синтезяруюцих клеток составляет С,&±0,4% (из 1000 клеток данного ряда), а количество клеток, меченых по 3Н-уридину I,2+0,6С%.

Статистически достоверных отличий уровня синтеза ДНК и ШК в лимфоцитах крови здоровых и свободных от ВЖРС животных разных возрастных групп нами не установлено, что согласуется с данными по синтезу да, полученными другими авторами (Нагаева Л.И. и др., 1988; Смирнов П.Н. и др., 1989).

В среднем по группе здоровых животных синтез ДНК составил 746+32,7 расп/мин (максимально^ значение 1200 расп/мин), ГШ -1066+90,8 расп/мин (максимальное значение 2200 радп/мин).

На основании полученных данных при исследовании проб крови здоровых животных разных возрастных групп можно сделать заключение о том, что в крови постоянно циркулируют мононуклеарные клетки, синтезирующие ДНК и РНК,и количество их не зависит от возраста животных.

Показатели уровня синтеза нуклеиновых кислот лимфоцитами крови здоровых животных, определенные с помощью радиометрического метода, могут служить критериями относительной нормы, а превшапцие их показатели рассматриваться как характерные для животных с различной патологией или с повьиенНым риском заболевания.

2. Параллельные гематологические, серологические и радиометрические исследования' живйтннх, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота

С ВЖРС-инфекциой ассоциированы три патологических состояния: бессимптомная инфекция, гематологическая и опухолевая формы заболевания (Берни А.,1985; Бурба Л.Г., Шшиов В.П.,1986;Иишков В.П.,1988).

При проведении массовых серологических исследований на лейкоз

били выявлены положительные в РИД животные, не отличающиеся по гематологическим показателям от здоровых. Разница между гематологическими показателями этой группа и контрольными (таблица 2) незначительна и недостоверна (Р>0,05). Вместе с тем уровень синтеза нуклеиновых кислот в лимфоцитах, инфицированных ЗЛКРС животных с нормальными показателями крови оказался значительно вше контрольных показателей и соответствовал в среднем по группе для ДИК - 10242+2196 расп/мин, для РНК - 4025+718,1 расп/мин «'таблица 2).

На протяжении всех исследований показатели синтеза ДНК и РНК у них характеризовались значительным повышением относительно -контроля, что свидетельствовало о нарушении пролиферативных процессов в клетках лимфоидной популяции и возможности использования радиометрического метода для определения животных повьшенного риска заболевания.

Количество ДНК-синтезирущих клеток в крови животных данной группы 0,8+0,11%, ГОК-синтезирупцих клеток 1,6+0,21%.

Морфологически ДНК- и РНК-синтезируящие клетки не отличались от таковых у здоровых животных. В основном это были крупные клетки с баэофильной цитоплазмой и содержащие свыше 50 зерен восстановленного серебра.

3. Синтез ДНК и ИК в лимфоцитах крови животных, больных лимфолейкозом и генетически предрасположенных к гемо-бяастозам

На основании гематологических и серологических исследований была сформировано группа животных, бoльftыx лимфолейкозом. Все животные в группе коров, больных лимфолейкозом, были инфицированы. Титр антител к бр51 аятигену ВЛКРС у них не был одинаков. У одних животных антитела к «р5Г - антигену ВЖРС определялись в титрах 1:4-1:8, у других 1:32-1:64, а у № 6799 - 1:128, 1:256.

На протяжении всех исследований, проводимых в различные сезоны года, а также при различных физиологических состояниях животных

- 1С -

(период стельности 6-9 месяцев), ни разу не отмечали выпадения положительных результатов серологических реакций.

• Морфологическая картина крови коров исследуемой группы отлич£ лась разнообразием и зависела от степени развития патологического процесса.Количество лейкоцитов в среднем по группе составило 44,4н 7,59 тыс/мкл\с колебаниями от 26,4 до 84,8 тыс.в I мкл крови), относительное и абсолютное содержание лимфоцитов 88,3+3,56% и 40,0+ 7,74 тыс/мкл соответственно.

Уровень синтеза ДНК в среднем по группе составил 9757+1793,1 расп/мин, ГОК - 3579+452,5 расп/мин (таблица 2).

Таблица 2

Относительные показатели уровня синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови крупного рогатохо скота о различной патологией (А + 3 х)

Группа животных } !----------Синтез...

г ■ тыс/мкл 1гщ1г „„„„/,„„. ^

_____________!ДНК,расп/мин !НЖ,расп/мин,.

Больные эндометритами

(п=7) 6,3 + 0,84 1439 + 91,0 1728 + 252,8

Инфицированные ВЖРС

1п=18) 7,6 + 0,41 10242+2196,6 4025 + 718,1

Больные лимфолейкозсм

(п=10) 44,4 + 7,59 9757+1793,1 3579 + 452,5

Здоровые (контроль)

РВД - (п=42) 7,4+0,35 746+ 32,7 1С66 +90,8

Радиометрическими и гематологическими исследованиями, проводи шми ежеквартально в течение 2 лет, установлено, что уровень синте за нуклеиновых кислот в группе животных, больных лимфолейкозои, по ти всегда достоперно превышал контрольные показатели. При отем не происходило прогрессивного увеличения; синтеза дак и ПК (периода . подъема сменялись спадами), а ссвшение уровня синтеза нуклеиновых кислот пртдаеетЕОвало рецидивам заболевания.

Величина индекса ггетки (ИЮ у лшвотньсх, больных линфолейкозсм составляла в среднем Г,44+0,72й. Корфологически Д!К- н ИЖ-еинтези рухчма клетки были 6 размером ядра 10-12 и 15-17 мкм и морфологией

среднего и больного лимфоцита.

При проведении серологических исследований сшзороток крови новорожденных телят >потомков больных лейкозом родителей - II голов) до приема ими первых порций молозива у 2 да 6774 , 7757) били вшт-леии антитела ж ВЛКРС. Наличие вируса у них было подтверждено биопробой на овцах.

При исследовании телят этой группы после исчезновения колост-ральных антител (в возрасте 5-6 месяцев) количество лейкоцитов в среднем составило 9,4+1,,46 тыс/мкл с колебаниями от 4,6 тыс/икл (.№ 3744) до 21,0 тыс/мкл (№ 3754). Кроме двух внутриутр'обношфици-рованных, все телята данной группы были серонегативными. Уровень синтеза нуклеиновых кислот в среднем по группе составил 29719+4265,2 расп/мин для ДНК и 8334+296,1 расп/мин для ШК, т.е. значительно превосходил контрольные показатели. Повыяенный уровень синтеза ДКК и НШ отмечали на протяжении всего периода наблюдения за этими животными (в течение 1С мес с интервалом 2-3 мес), в то время как гематологические показатели в среднем по группе не имели статистически достоверных отличий от контрольных или достигали верхних -границ нормы, установленной для животных этого возраста.

Появлению в крови антител к ВЛКРС предшествовало резкое увеличение уровня синтеза Д'К и ГОК лимфоцитами крови (за 2 мес), тогда как гематологические показатели у всех животных в этот период исследования не превышали уровня физиологической нормы. С выявлением в крови антител к ВЛКРС отмечали снижение синтеза ДНК у некоторых животных до уровня контрольных, а синтез ШК, наоборот, достоверно увеличивался.

После диагностического убоя у всех телят этой группы были обнаружены изменения, характерные для лейкоза. ПагоморфологическиЛ диагноз у животных Ш 7757, 3751 - слабодифференцироваяный лейкоз, у остальных - лимфоидный лейкоз (преимущественно лимфобластньгй рарияпО.

Таким образом, увеличение количества клеток,активно синтезирующих ДНК и РНК, свидетельствует об обострении болезни, когда отмечается резкое увеличение бластных клеточных форм с повышенной пролифера-тивной активностью,что может служить дополнительным диагностическим тестом; и .следовательно .повышенный уровень синтеза нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови телят, родившихся от больных лейкозом коров, является неблагоприятным прогностическим признаком развития лейкоз-ного процесса, а потомков больных лимфолейкозом родителей можно отмести в группу повышенного риска заболевания.

4. Результаты гематологических,серологических,иммунологических и радиометрических исследований крови телят,экспериментально инфицированных ВЛКРС

Познание отдельных сторон зтиопатогенеза лейкоза крупного рогатого скота не теряет актуальности в настоящее время. Эксперименталь- 1 ное воспроизведение различных форм гемобластозов с целью получения биологической модели болезни на животных гомологичных и гетерологич-ных видор позволяет более детально изучить этиологию, патогенез и разработать достоверные критерии определения начальной фазы лейкоз-ного процесса. Для решения этих проблем удобной моделыз является экспериментальный лейкоз телят, который удается воспроизвести путем введения лейкоконцентрата.полученного из крови животных, больных лимфолейгсозом.

В качестве экспериментальных хмвотних ш использовали телят черно-пестрой породы с гематологическими показателями,соответствующими физиологической норме,и свободных'от ВЛКРС. Опытные живбтние были разделены на 3 групгги: 1-я - 5 гол.в возрасте 5-6 нес; 2-я -3 гол.в возрасте 18 мое и 3-я - 5 гол. в возрасте 6-8 мес, ранее облученных различными дозпкп гемма-палучзиил (50-150-200 Р).

йссдоясешш'з сюгсес.г ДЩ к Г1Ш ь лгаг^цятис кроки тел;: г 1 труп- " ш показало, что у;,:с через 3 сут.пепле «ц'кцирег.яния ати показателя

были выше контрольных у всех животных и составили в среднем для Д!К 11113+1161.4 расп/мин (Р<0.001,Су=20,9£) в опытной-группе, 688+31.2 расп/мин - в контрольной; для РНК: 4304+316.4 расп/мин (Р< 0.001, Ог-и.^Х) - в опытной группе, 1275г42.9 расп/мин - в контрольной. Наряду с увеличением спонтанного синтеза нуклеиновых кислот также было отмечено повышение сывороточных иммуноглобулинов М-класса. Количество иммуноглобулинов С- и М-классов в сыворотках крови экспериментально инфицированных ВЛКРС телят определяли на протяжении 12 мес. параллельно с другими исследованиями. До заражения телят вируссодер-жащим материалом количество иммуноглобулинов М-класса в' среднем по группе составило 1.8+0.42 мг/кг, а С-класса 14.5+2.09 мг/мл. Через 3 сут после введения вируссодержащего материала содержание иммуноглобулинов М-класса равнялось в среднем по груше 2.7+0.47 мг/кг с колебаниями от 1.6 до 4.0 мг/кг, количество 1йС увеличилось незначительно и составило в среднем по группе 15.6+1.68 мг/мл с колебаниями от 12.0 до 21.2 мг/мл.

Уровень синтеза Д)К и РНК достиг 'тгка через 10 сут после заражения животных: включение 3Н-тимиднна в среднем в опытной группе составило 2733&+1812.2 расп/мин (Р<0.001), незначительно варьируя при этом среди отдельных особей '.коэффициент вариации составил 13,3%), включение 3Н-уридина было 9387+17Г7.3 расп/мин (Р<0.001,Су=36.6/5). В контрольной группе отмечали незначительное повышение синтеза ДНК на этот срок исследования,которое,тем не менее, не превышало предела данного показателя в группе здоровых животных. Экспериментальное инфицирование телят ВЛКРС в эти же сроки исследования (через 7 и 1С сут) характеризовалось увеличением количества 15Ы почти вдвое по сравнению с исходными данными, содержание же иммуноглобулинов в-класса повысилось незначительно, а у отдельных животных не изменилось или даже снизилось. В то же время в эти сроки исследования достоверных отличий в количестве лейкоцитов и лимфоцитов в опытной и

контрольной группах не было установлено.

Гематологические изменения были отмечены нами в опытной группе через 14 сут пойле инфицирования: количество лейкоцитов в среднем составило 19.2+1.14 тыс/мкл (до заражения - 9.0+1.18 тыс/мкл) с колебаниями у отдельных животных от 15.8 до 21.8 тыс/мкл. Одновременно у 3 из 5 животных были обнаружены антитела к ёр51-антигену ВЛКРС в титрах 1:2. У животного № 69С8,несмотря на высокий лейкоцитоз (21.8 тыс/мкл).экспериментально индуцированной инфекции ВЛКРС установить не удалось. Отрицательные результаты были также получены при серологическом исследовании сыворотки крови теленка № 6937 с лейкоцр тозом 15.8 тыс/мкл.

Через две недели после инфицирования животных ВЛКРС отмечали

снижение количества иммуноглобулинов И-класса и незначительно

«

а также уровня синтеза ДНК и РНК относительно предыдущего исследования. Новый подъем уровня 1аЦ в сыворотках крови экспериментальных животных отмечали через три недели после заражения. Количество иммуноглобулинов в -класса варьировало, снижаясь у одних животных, не изменяясь или повышаясь у других.

Ба 21 сут отмечали снижение количества лейкоцитов до 14.2+1.88 тыс/мкл, но вместе с тем наблюдали повьшенный уровень синтеза ДНК и Н1К, а титры антител к антигену гр51 ВЛКРС колебались от 1:2 до 1:16 Через 60 сут титр антител к ер51 антигену у трех животных составлял 1:32, у одного 1:61 и у теленка 69С8 1:16. В ото же время у 4 телят из 5 были обнаружены антитела к р24 -антигену ВЛКРС. Гематологические показатели характеризовались незначительным лейкоцитозом (18.5^2.94 тыс/мкл), а абсолютное число лимфоцитов составило 15.5+ 2.81 тис/икл, что свидетельствовало о начальной стадии лимролейкоэа. Одновременно с увеличением гематологических показателей нэЗлидаяи енгаенпе синтеза ДНК и РНК по сравнен;;» с предццуциии нсслед^пнняыл По исючгшы 3 П'.оле вездения Уп.руссодержа-дего ьатериола

у всех 5 телят были обнаружены антитела к р24 - антигену в РЦЦ. Титры антител к gp5I антигену у телят Р№ 6778, 6908 составляли 1:16, у теленка № 6984 - 1:32 и у животных № 6969 и № 6937 - 1:64.

Содержание igM оставалось повышенным на протяжении всего срока наблюдения,достигая максимальных значений через 3,7,9 мес.что совпадало с пиками лролиферативной активности лимфоцитов периферической крови.

Количество igG в среднем по группе оставалось повышенным по сравнению с исходными данными на протяжении всего срока наблюдения, но при этом у отдельных животных наблюдали значительное повышение содержания иммуноглобулинов G-класса, у других животных не обнаруживали изменений или этот показатель снижался относительно исходных данных.

Через 18 мес" после инфицирования было проведено комплексное обследование животных с последующим диагностическим убоем.

При диагностическом убое экспериментально инфицированных ВЛКРС яивотшх были обнаружены характерные для лимфолейкоза патологоанато-иические изменения. Последующими патоморфологичесцими исследованиями у всех телят' опытной группы был подтвержден диагноз - лимфоидный лейкоз.

Вгоруп экспериментальную группу составили три кивотных в возрасте 18 мес. У теленка № 6917 на 21 сут после введения вирусеодер-:кп!цего материала били выявлены антитела к е рбГ-ангигену в титрах Т:2 и лишь на 35 сут отмечали у всех животных инфекцию ВЛКРС. Тигры антител к {фГЛ-ангигену у животных 6990, 693-1 ;i 6917 составили 1:4, 1:8 и 1:15 соответственно.

7pc;VHb синтеза ДНК и ГНК в лимфоцитах кропи опытных телят на 7 сут после инфицирования ВЖРС достоверно отличался от контрольных лгамзиФлеЗ, тогда как общее количество лейкоцитов и абсолютное со-дерлг-нчс лимфоцитов в среднем по группе било достоверно низе алая о-

гичных данных контрольной группы. Относительное содержание лимфоцитов в опытной и контрольной группах не имело достоверных отличий. На 14 сут гематологические показатели стабилизировались: количество лейкоцитов достигло 9.I+C.59 тыс/мкл, абсолютное содержание лимфоцитов составило 7.3+0.53 тыс/мкл, и оставались примерно на таком же уровне в течение последующих исследований - до 3 мес после заражения. Затем наблюдали увеличение общего количества лейкоцитов, относительного и абсолютного содержания лимфоцитов.

На 7 сут после заражения ВЛКРС наблюдали также повышение содержания сывороточных иммуноглобулинов М-класса и незначительное увеличение igG. На протяжении всех последующих исследований содержание иммуноглобулинов а- и М-оассов било выше исходных значений.

Гематологические показатели животных Ш 6917, &99С через 140 сут после экспериментального инфицирования ВЛКРС свидетельствовали о начальных изменениях, характеризующих развитие лейкозного процесса. Животные этой группы были убиты по ходу эксперимента (№> 6934 через 4 мес, № 6917 через 9 мес, № 6990 через год после заражения ВЛКРС), и у них гистологическими исследованиями также подтвержден диагноз лимфолейкоэ.

Анализ результатов, полученных при исследовании телят 1-й и 2-й опытных, групп свидетельствует о том, что первоначально, несмотря на ранние сроки выявления инфекции ВЛКРС, происходит повышение уровня синтеза ДНК и FHK и иммуноглобулинов М-класса.

Третья экспериментальная группа состояла из 6 животных. Телята этой группы были подвергнуты воздействию ионизирущего излучения на установке ГУЖ-24 (источник излучения 137 Cz) в дозах: 50 Р (мощность дозы 50 Р/ч) - 3154, 3155; 150 и 200 Р (мощность дозы ICO Р/ч) -№№ 3159, 3160 и 3164, 3165 соответственно. Клинические наблюдения за опытными животными и патслогоанатомические исследования павших гелят проводили по ходу опыта. Уже через двое суток после облучения

наблюдали уменьшение количества лейкоцитов и в первую очередь лимфоцитов. Более выраженная лейкопеническая реакция и лимфоцитопения отмечена в группе животных, облученных в дозах 150 и 200 Р (снижение количества лейкоцитов до 5.7+0.52 тыс/мкл и 4.5+0.73 тыс/мкл, лимфоцитов до 4.5+0.48 и 3.4+0.49 тыс/мкл соответственно), что характерно для начального периода острой лучевой болезни. В это время отмечено снижение уровня синтеза ДНК и ЖК, а также уменьшение количества иммуноглобулинов М-класса, в то время как содержание IgG в сыворотках крови опытных »квотных оставалось без изменений или незначительно (на 2-3$) повышалось. '

Через 18 сут после облучения общим гамма-излучением в дозе 150 Р I теленок пал (№ 3160) с характерными признаками острой лучевой болезни.

Через месяц после воздействия ионизирующей радиации уровень содержания лейкоцитов в крови стал повышаться и достиг в группе облученных в дозе 50 Р 6.3+4.67 тыс/мкл, что соответствует физиологической норме, характерной для животных данного вида, а через 2 мес нормализовались показатели крови и в группах, облученных в дозах 150 if 200 Р.

Через 150 сут после облучения синтез ДНК и ШК соответствовал уровни контрольных показателей с незначительными колебаниями у отдельных пшзотных. Гематологические показатели у 4 животных из 5 такие соответствовали физиологической норме для данной возрастной груп-III.!. На фоне этих показателей животные данной группы были инфицирова-ВЛКРС. ВирусеодортодиП катер-дел (лейкск01щснтрат от коровы, боль-л1";фолэ!!позом) бил получен от донора, которого использовали в I ~ Р. сорту, опита. Доза леЯкоконценграта и сроки исследования поело то ггчдеитп соответствовали предь-дущк! сериям опыта. При зар&хени'д •'.«•/•»«••шт rwowt-a ВЩСГС оогкпади тскг.е повшйшс синтеза ДГЛ я ЙШ услячпгот тсолтестпа ш.^уногдобулинов М-класса, то есть иаб.тгдгзя

изменения, аналогичные полученным при экспериментальном заражении ВЛКРС здоровых животных. Вместе с тем необходимо отметить, что уже через 7 сут после инфицирования было выявлено развитие инфекции ВЛКРС у всех 5 животных. Титры антител к ер51-антигену составили от 1:2 до 1:16, через три недели титры антител у животного !!' 3159 были 1:4, у телят № 3155 и 3164 равнялись 1:16, а у животных № 3155 и 3164 составляли 1:32 и 1:64 соответственно.

Гематологические изменения, характерные для начальной стадии лимфолейкоза, раньше были выявлены у животных, облученных в дозе 200 Р. Снижение синтеза нуклеиновых кислот до верхней границы контрольных показателей отмечено нами через 120 сут после заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота, количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание лимфоцитов в этот срок наблюдения соответственно составило 19.2+8.3С тыс/мкл, 89.7+3.93% и 17.6+8.31 тыс/мкл. Животные № 3154 на 24 сут, № 3155 через 3 мес были вынужденно убиты. Патологоанатомическими и гистологическими исследованиями у них установлен диагноз слабодифференцированный и лимфоидный лейкоз соответственно.

Все телята (I, 2 и 3 групп) по окончании эксперимента были убиты и подвергнуты пагологоанатомическоцу исследованию. На вскрытии и при патоморфологическом исследовании у телят обнаруживали однотипные изменения, которые по своему морфологическому проявлении отличались лишь по вовлечению в процесс различных органов и тканей и степени выраженности изменений в них.

При микроскопическом исследовании органов и тканей от подопытных животных мы наблюдали в большинстве случаев лимфоидный лейкоз • лшфоцигарный и лимфобласгный варианты) и слабодифференцированный лейкоз (в двух случаях).

Итак, на оснопании исследований, выполненных на телятах, экспериментально инфицироранннх ШРС, в динамике с использованием гема-

тологического, серологического, иммунологического и радиометрического методов мояшо сделать заключение, что наиболее ранним симптомом, позволяющим выявлять инфекцию ВЛКРС, было повышение уровня синтеза да и РНК лимфоцитами периферической крови, а также увеличение содержания иммуноглобулинов М-класса.

Применяемый нами метод экспериментального воспроизведения лимфо-лейкоэа на телятах позволил в 1С0Й случаев через 2-3 недели, а у облученных через одну неделю, воспроизвести инфекцию ВЛКРС и через 3-6 мес, а у облученных различными дозами общего гамма-излучения уже через месяц наблодать'развитие болезни с клиническими проявлениями.

Патоморфологкчески экспериментальные гемобласюзы у крупного рогатого скота проявлялись сходно (через 24-90 сут после заражения у облученных, через 4-18 мес у остальных опытных животных) и характеризовались пролиферативным разрастанием клеток лимфоидного ряда в ггроветворних и других органах и тканях (в лимфатических узлах, селезенке, печени, сердце, почках, легких).

5. Характеристика вируспродуциругацей культуры клеток,полученной из легкого эмбриона коровы, больной лимфолейкозом

Поставленная перед нами цель - получение перевиваемой линии клеток, хронически инфицированной отечественным птаммом ВЛКРС и продуцирующей вирус лейкоза крупного рогатого скота, обладающей способностью хорошо репродуцироваться на отечественных средах с коммерческой сывороткой крупного рогатого скота - достигнута благодаря полу-чештя перевиваемой шгеточнсП лнн.та легкого эийрнона ЗГГС (ЛЭК-ВИЭВ-90) - продуцента ВЛКРС, которая полет слуяить хорспой модольп для изучения биологических свойств вируса.

Культура получена методой трипсиинзации тканей легкого плода больней лт;фюлег?козогс коровы, что служит косвенне» доказательством трянсплпцентариой передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Исходные клетки культуры ЛЭК-ВИЭВ-90 выращивали на среда Игла

с 10$ сыворотки крови телят,, свободной от антител к ВЛКРС, полученной в отделе клеточной биотехнологии и технологии питательных сред ВИЭВ, добавляя в среду антибиотики: пенициллин (ICO Ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл).

Полученная линия обладает следующими свойствами. Культура клеток легко пассировалась, хорошо восстанавливалась из замороженного состояния Íкриогенизация культуры ЛЭК-ВИЭВ-90 в жидком азоте была проведена на 12, 18, 43 пассажах, размораживание культуры и рекультивирование проводили через 2 недели и 3 мес хранения в жидком азоте при -Т96°С,при этом монослой формировался через 48-72 ч, культура морфологически не отличалась от исходной и сохраняла свои физиологические признаки).

В процессе культивирования линии ЛЭК-ВИЭВ-9С на уровне 20-43 пассажа морфология и лролиферагивные потенции клеток были стабильными. Клетки ЛЭК-ВИЗВ-9С растут на поверхности в виде однослойной культуры. Морфологически культура представлена полигональными клетками с преобладанием фибробластоподобных отростчатых клеток вытянутой формы. Большинство клеток имели овальное, расположенное эксцентрично ядро, в котором различали от 2 до 5 ядрышек овальной формы. Цитоплазма клеток была слабо эозинофильна и имела нежно-зернистув структуру. В популяции преобладают клетки с диплоидным набором хромосом. В течение наблюдения в монослое выявлялись иногда многоядерные клетки (симпласты).

Оптимальная плотность посева составляет 2-3 х 10^ клеток/мл. Монослой формируется на 3-4 сут. С поверхности стекла клетки снимаются смесью растворов версена 'с трипсином 9:1 бесцентрифужным методом, индекс пересева составляет 1:5.

Клеточная линия ЛЭК-ВИЗВ-9С апробирована нами с положительным результатом в лабораторных условиях в ВИЭВ: слитую на б день куль-туральнуо жидкость сконцентрировали в 10 раз. Специфичность и актив-

ность полученного концентрата проверялась в реакции иммунной диффузионной преципитации в агаровом геле (РИД) с использованием тест-системы для идентификации антигенов ВЛКРС (сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену (gp5I ВЛКРС, сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к про-теидному антигену р24 ВЛКРС, коммерческий антиген ВЛКРС, содержащий gp5I и р24).

Полученный в ходе испытаний концентрат обладал специфичностью, активность его. в РИД соответствовала активности коммерческого антигена.

6. Влияние биологически активных веществ (БАВ) на пролифе-ративную активность лимфоцитов периферической крови здоровых и больных лимфолейкозом животных

Изучение влияния биологически активных веществ (БАВ) на синтез ДНК в лимфоцитах периферической крови проводилось.нами в опытах как in vivo, так и ia vltro.

Для анализа пролиферации под действием БАВ in vivo были сформированы группы животных по принципу аналогов (по три особи в каждой группе), клинически здоровых, свободных от ВЛКРС, и больных лимфолейкозом в начальной и развернутой стадиях лейкозного процесса,которым вводили биологически активные вещества. Контрольной группе ввели физиологический раствор. Радиометрические исследования проводили через 3, 7 и 14 сут после первого введения иммуностимуляторов.

Введение Т- и В-активина, левамизола, ГМДД здоровым яивоткш вызвало временное повышение уровня синтеза нуклеиновых кислот: FHK через 3 сут после инъекции, а ДНК через 7 сут и снижение обоих показателей через 14 сут. В то же врем следует отметить, что введение больным лимфолейкозом гсийотньм левамизола и ГВДП оказало более значительный стим^лируиций эффект на синтез ДНК и ГШ по сравнении со здоровыми животными, rfpn этоц введение левамизола вызвало п более длительный стимулирущиП эффект на синтез нуклеиновых кислот (пока-

затели синтеза ДНК и ШК у этих животных перед введением БАБ были близки к контрольным).

Кроме того,введение левамизола и ГГ*ЩП вызвало повышение титров антител к ВЛКРС, что может быть использовано в практических целях при получении контрольных сывороток от больных лимфолейкозом животных (специфических преципитирующих - СПС), применяемых в наборе дал серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

В опытах ia vitro к суспензиям лимфоцитов (.1 х IC^1 клеток/мл), выделенных от здоровых и больных лимфолейкозом животных, сгруппированных по составу крови, добавляли иммуностимуляторы и инкубировали пробы с 3Н-гимидином в течение 1,2,3,4,6,12,24,36 ч. Контролем служили пробы от тех же животных без добавления биологически активных соединений. Кроме того,нами предпринята попытка изучить действие сыворотки, полученной от больных лимфолейкозом коров (СЛЛК), на синтез ДНК мононуклеарами периферической крови здоровых животных.

Морфологические и биохимические характеристики при ответе лимфоцитов на воздействие митогенами in vitro очень похожи на реакцию лимфоцитов in vivo на антиген.

В опытах in vitro Т-активин, ФГА, ¿(^-интерферон (реаферон), инсулин, сыворотка крови от больных лимфолейкозом коров (также как и при введении ее животным) в испытанных концентрациях обладали стимулирующим влиянием на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови здоровых животных, инфицированных ВЛКРС с нормальными показателями крови, а также больных лимфолейкозом животных, находящихся в начальной стадии лейкозного процесса.

Влияние ЕАВ на пролиферативный ответ лимфоцитов крови больных лимфолейкозом животных было различным: от стимуляции до ингибиции в зависимости от времени инкубации с ними и стадии болезни. Как правило, стимулкрупциЛ эффект биологически активных веществ наблюдали у животных о низким уровнем синтеза Д!К. Ya над взгляд представляют

интерес данные, полученные при исследовании пролиферативной активности лимфоцитов крови больных лимфолейкозом животных,находящихся в развернутой стадии лейкозного процесса, под влиянием ЕАВ.

Таким образом, вышеперечисленные биологические активные вещества в опытах in vivo и in vitro в испытанных концентрациях и проведенные сроки наблюдения обладали неадекватным действием на проли-феративную функцию лимфоцитов периферической крови здоровых и больных лимфолейкозом животных с различным гематологическим статусом.

Под действием Т-активина, 8-активша, ФГА, инсулина, левамизо-ла, ГМДП, СЛЛК отмечена индукция синтеза нуклеиновых кислот.

Интерферон, простатландин, фолликулостимулин обладали антипро-лиферативным действием по отношению к лимфоцитам крови животных, больных лимфолейкозом.

ЗАКЛШЕНИЕ

Таким образом, на основании прижизненного определения уровня синтеза ДНК, FHK и IgH можно сделать заключение о том, что эти показатели обладают большой биологической информативностью и дают возможность, особенно в комплексе с другими исследованиями (гематологическими, серологически™),выявлять животных, инфицированных ВЛКРС, а также больных лимфолейкозом и судить не только о стадиях развития болезни, но и о его прогнозе.

ВЫВОДЫ

Г. В периферической кропи здорового крупного рогатого скота разных возрастных груш не установлено статистически достоверных отличий показателей синтеза ДИК и ГШ.В среднем по группе здоровых животных синтез ДШ составляет 746+32,7 pacn/wnH,FHK - IC66+S0.8 расп/мин.

2. По данным радиометрических исследований крови животных,инфицированных ВЛКРС с гематологическими показателями,характерными для клинически здоровых животных (бессимптомная стадия),обнаруживали повышенный уровень синтеза ДНК и FHK,что является прогностическим тестом для выявления животных с повышенны!« риском заболевания лейкозом.

3. Уровень синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови животных,больных лимфолейкозом,достоверно превышает во много раз контрольные показатели и может служить диагностическим тестом для выявления больных животных.

4. Разработанный метод экспериментального воспроизведения лш-фолейкоза на телятах позволяет через 2-3 недели в I0C5 случаях воспроизвести инфекцию вируса лейкоза и через З-б мес наблюдать клинические проявления болезни.

5. Через 3 сут после введения вируссодержацего материала теля-тал( отмечали повышенный уровень синтеза ДШ и PiiK лимфоцитами крот, что являлось наиболее ранним симптомом инфекции BJIKPC по сравнению

с гематологическими и серологическими методами.

6. Определение иммуноглобулинов о- и М-классов в сыворотках крови телят,экспериментально инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, может быть использовано совместно с другими показателями в качестве теста для выявления инфицированных животных.

7. Впервые проведено экспериментальное заражение вирусом лейкоза крупного рогатого скота телят, облученных различными дозами гамма-излучения (50,150 и 2СО Р) и установлено,что антитела к антигену gp-5I были выявлены через 7 сут после инфицирования, уровень синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови, а' также иммуноглобулина М-класса было выше по сравнению с контролем.

Клинико-гематологические и патоморфологические изменения,характерные для лимфолейкоэа у животных„облученных в дозах 150 и 2С0 Р, проявлялись интенсивнее и в более ранние сроки, чем при облучении в дозе 5С Р.

8„ Пятоморфологически экспериментальные гекобластозы крупного рогатого скота проявлялись сходно и характеризовались пролифератиэ-нчм оаэраятпнием клеток лимфоидного ряда в кроветворных и других органах и тканях р лиг^Ьятических узлах, селезенке, печени, сердце, пгчках и легких).

9. Биологически активные вещества оказывают различное действие на синтез ДНК и БНК в лимфоцитах крови. Индукция синтеза нуклеиновых кислот отмечена под действием Т- и В-активина, ФГА, инсулина, лева-мизола, ГВДП ¿'Н-ацетилглюкозаминил-Н'-ацетилмуремил-Ь-аланин-1>-изоглутамин) и сыворотки больных лимфолейкозом коров.

Интерферон, простагландин, фолликулостимулин обладают антипро-лиферативним действием по отношению к лимфоцитам крови животных, больных лимфолейкозом.

10. Получена перевиваемая культура клеток легкого эмбриона коровы, продуцирующая'вирус лейкоза крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. На основе использования радиометрического метода по определению уровня синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови крупного рогатого скота разработаны методические рекомендации по выявлению животных повышенного риска заболевания.

Методические рекомендации одобрены комиссией ОНКВет "Лейкозы,сравнительная и экспериментальная онкология животных"при ВАСХНИЛ 9 июня 1989 г.

П. На авторскую заявку № 4884320/13-113069 "Штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота* получено положительное решение ГоскомизобретениП СССР от 5 июня 1991 г.

Ш. Определение содержания 1еИ в сыворотках крови животных может быть использовано в качестве дополнительного диагностического теста для выявления ВЖРС-инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ I, Экспериментальное воспроизведение лейкоза на телятах / Н.И.Гуяв-кин, А.В.Васин, Л.А.Иванова, Н.В.Замараева // Бюллетень ВИЭВ, вып.67. - М., 1988.' - С.13-16.

2. Гулюкин М.И., Заыараева H.B. Синтез ДЩ в лимфоцитах крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота/ Тезисы докл.Всес.симпоз."Биохимия сельскохозяйственных животных и Продовольственная программа". - Киев, 1989. - С.33.

3. Гулюкин М.И., Васин A.B., Замараева Н.В. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1990. - JP I. - С.27-31.

4. Гулюкин U.U., Замараева Н.В., Уварова Н.В. Применение метода авторадиографии в биологических исследованиях // Теоретические и практические вопросы ветеринарии (Материалы'конференции). -Тарту, 1990. - С.84-94,

5. Замараева Н.В. Синтез нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови телят, генетически предрасположенных к гемобластозам // Тезисы докл."Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота" Всес.научно-произв.конф. - Новосибирск, 1990. -

С.60.

6. Синтез нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови облученных телят / Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Востряков А.П., Карташов П.А., Овдиенко Н.П., Кассич В.Ю. // Актуальные проблемы ветеринарной

и зоотехнической науки в интенсификации животноводства (Материалы. конференции). - М., 1990. - С.162-163.

7. Замараева Н.В. Синтез нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови телят, экспериментально инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) // Бюллетень ВИЭБ (в печати).'