Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Уровень транскрипции генов-онкомаркеров в клетках крови больных гемобластозом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Уровень транскрипции генов-онкомаркеров в клетках крови больных гемобластозом"

На правах рукописи

МАЛАХО СОФЬЯ ГАРИФОВНА

УРОВЕНЬ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ - ОНКОМАРКЕРОВ В КЛЕТКАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗОМ

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003171239

Москва-2008

003171239

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики Государственного Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель

Кандидат биологических наук А Б Полтараус

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, проф ПМ Рубцов

Доктор биологических наук Э А Брага

Ведущая организация

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН Защита состоится 2008 года в

// час на заседании

диссертационного совета Д 002 235 01 при Государственном Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, г Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан » с 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук

цын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

B-клеточный хронический чимфолейкоз (B-XJIJI) относится к наиболее распространенным лимфатическим опухотям человека Заболевание протекает вариабельно Продол житечьность жизни больных колеблется от нескольких месяцев до десятков лет (Montserrat et al, 1986) Использование клинических данных позволяет выявить неблагоприятный прогноз не более чем у 10% больных, в остальных случаях предсказать течение болезни невозможно Существует классифиция B-XJIJI как по клиническим стадиям, так и по генетическим характеристикам В качестве маркеров дтя генетического подразделения заболевания используется мутационный статус вариабельного региона тяжелой цепи генов иммуноглобулинов (IgVH) и некоторые хромосомные нарушения Эти маркеры позволяют выделять прогностически разные группы больных в пределах ранних стадий

Мутационный статус вариабельного региона генов иммуноглобулинов сравнительно недавно охарактеризован как маркер прогноза B-XJIJI (Staudt, 2003) Мутации вариабельного региона выявляются примерно в 40% случаев В-ХЛЛ Группа больных без мутаций (IgVmut-) характеризуется неблагоприятным прогнозом - большинство больных умирает в течение 12 лет При наличии мутаций (IgVmut+) вариабельного региона иммуноглобулинов прогноз в целом благоприятен Мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов служит маркером дочгосрочного прогноза, который не меняется со временем и не подвержен влиянию химиотерапии, но его определение мало приемлемо в практической медицине из-за дороговизны и трудоемкости В связи с этим актуален поиск других маркеров, пригодных в клинической практике

С помощью микрочипов установлено, что существуют гены, уровень транскрипции которых достоверно различается у вариантов В-ХЛЛ с разным мутационным статусом иммуноглобулинов (Klein et al, 2001, Rosenwald et al, 2001, Haslinger et al, 2004) Различия в уровне мРНК некоторых из этих генов (ZAP-70, DMD, ZBTB20 и др ) довольно велики, относительно постоянны и могут использоваться в качестве дополнительных маркеров мутационного статуса К генам, экспрессия которых достоверно различается при вариантах B-XJIJI с разным мутационным статусом, относят ZAP-70 (Wiestner et al, 2003) Разработаны тесты, позволяющие оценивать экспрессию ZAP-70 с помощью проточной цитофлуориметрии с моноклональным антителом Однако, иммуношстохимический анализ костного мозга с помощью антитела к ZAP-70 ненадежен, поскольку ZAP-70 сильно экспрессируется в Т-лимфоцитах, примесь которых в костном мозге у больных B-XJIJI может быть велика

Из-за дороговизны и трудоемкости существующих методов прогнозирования течения В-ХЛЛ лишь единичные клиники в мире выполняют определение мутационного статуса и экспрессионный анализ ZAP-70 для больных Использование ПЦР-РВ для диагностики В-ХЛЛ позволит дешево и надежно диагностировать вырианты заболевания Необходимо определение взаимосвязи между уровнем мРНК потенциальных онкомаркеров и мутационным статусом иммуноглобулина дтя тех генов, оценка транскрипции которых не требует предварительной селекции клеток

Цель и задачи исследования Цечью настоящей работы является определение уровня мРНК генов - потенциальных онкомаркеров в представительной группе больных B-XJIJI и доноров

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи

1 Создать высокочувствительную и надежную методику ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для точного количественного определения уровня мРНК генов

2 Определить уровень мРНК генов эндогенного контроля (GAPDH, ТВР, 18S гША, HPRT1) в норме и хроническом лимфолейкозе

3 Изучить и сравнить уровень мРНК генов - потенциальных онкомаркеров {ZAP-70, DMD, ZBTB20, LPL и MYCN) в норме и хроническом лимфолейкозе

4 Выбрать наиболее значимые генетические маркеры для разработки тест-системы прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза

Научная новизна работы Впервые проведено масштабное количественное определение уровня транскрипции генов LPL, ZBTB20, ZAP-70, MYCN и DMD на представительной коллекции образцов периферической крови больных В-ХЛЛ (134 образца) и в отдельных субпопуляциях клеток крови (всего 168 образцов) Полученные данные по содержанию мРНК изученных генов в образцах клеток крови явтяготея новыми, поскольку результаты опытов на микрочипах чаще дают качественную или полуколичественную характеристику и требуют дальнейшей валидации Проведен статистический анализ взаимосвязи уровня транскрипции пяти генов с клиническими данными больных B-XJIJI Установлено, что уровень мРНК генов липопротеинлипазы (LPL) и дистрофина (DMD) значительно лучше коррелирует с мутационным статусом генов иммуногтобулинов, чем экспрессия ZAP-70 (обязательный клинический тест)

Повышенный уровень мРНК генов липопротеинлипазы и дистрофина -показатель неблагоприятного прогноза B-XJIJI Уровень транскрипции гена LPL позволяет разделить больных B-XJIJI на три прогностически разные группы, в отличие от всех известных маркеров Впервые показано, что повышение уровня мРНК гена LPL в периферической крови больных B-XJIJI происходит за счет фракции моноцитов

Научно-практическая значимость работы Разработан новый способ прогнозирования течения B-XJIJI на основе комбинированного анализа уровней транскрипции генов LPL и DMD с помощью метода ПЦР-РВ Оценка прогноза базируется на определении количества копий кДНК двух генов - LPL и DMD, достоверно коррелирующих с мутационным статусом генов иммуноглобулинов и выживаемостью больных Этот способ может быть использован для создания тест-системы прогноза B-XJIJI, имеющей большое значение для онкогематологии Разработан оригинальный набор клонированных в плазмиду ДНК-стандартов онкомаркеров для ПЦР-РВ, перспективных дтя прогноза течения В-ХЛЛ Учитывая практическое значение предложенного варианта генодиагностики для установления верифицированного диагноза и лечения В-ХЛЛ, проведены испытания основного компонента ПЦР-тест-систем - универсального набора для проведения ПЦР-РВ «РиалитиТМ» Этот набор не уступает зарубежным аналогам, а по стоимости в 30-40 раз дешевле, что делает его доступным и востребованным в отечественной клинической медицине

На основе метода ПЦР-РВ разработан способ определения копийности маркера опухолей нейрогенного ряда - онкогена МУСМ в широком диапазоне значений Для определения копийности и уровня транскрипции гена МУСЫ, уровня транскрипции химерного гена РМЬ-ЯАЯа (маркера острого промиелоцитарного лейкоза - ОПЛ) разработаны праймеры и флуоресцентные зонды

Исследования выполнялись в 2004-2007 гг при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ N 06-04-49707-а, 04-04-48154-офи_а) и МН 1К15СА113331-01

Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены в виде стендовых сообщений на 2-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), доклада на VI Съезде гематоло1 ов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Минск, 2007)

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, включая 5 статей и 4 тезисов докладов

Место проведения работы Работа проводилась в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН (таборатория структурно-функциональной геномики, Центр коллективного пользования ИМБ «ГЕНОМ») .

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают/^рисунок и/^таблиц Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», включающая главы «Объекты и методы исстедования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит^, отечественных и-/^мрубежных; наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 168 больных В-ХЛЛ и 10 доноров Случаи В-ХЛЛ были отобраны из базы данных Гематологического научного центра РАМН (ГНЦ РАМН) исходя из наличия клинических данных Диагноз В-ХЛЛ устанавливался согласно стандартным морфологическим и иммунофенотипичсским критериям (СЬевоп й а1 1996) Средний возраст больных В-ХЛЛ составил 55 лет (разброс 28 -83 года), 116 из них бьпи мужского пола и 52 - женского Соотношение МЖ = 2 2 1 Это ретроспективная группа больных мононуклеарные клегки периферической крови (ПМК, ПК) замораживались в разные сроки, до 7 лет давности Средний срок наблюдения за больными составил 74 3 месяца (разброс от 17 до 264 мес) У части пациентов (К = 34) из отобранных мононуклеарных клеток проводили селекцию СБ 19+ клеток, из которых впоследствии выделяли препараты мРНК Средний срок наблюдения за больными этой группы составил 42 3 месяцев (разброс от 7 до 289 мес) Варианты В-ХЛЛ с «тлеющей» формой (М = 14) характеризовались стабильным уровнем лимфоцитов без каких-либо признаков прогрессии У большинства пациентов (N=117) забор крови осуществляли во время первичного обращения и они не проходили лечения Все 10 доноров были старше 50-ти лет

Мононуклеарные клетки периферической крови (ПМК, ПК) выделяли при помощи стандартной методики центрифугирования в градиенте Flcoll-Hypaque ("РЬагтасш-Вю1есЬ"', Англия) Клетки СО 14+, С04+, СБ8+ и СБ 19+ были отсортированы непосредственно из свежей суспензии ПМК при помощи иммуномапштной сепарации с БупаЬеасЬ М-450 ('ТтаНч^еп", США) Чистота

популяций клеток CD4+, CD8+, CD14+ и CD19+ превышала 95% Отдельные образцы нормальных CD 19+ лимфоцитов подвергали стимуляции митогеном Фитолакки с получением активированных CD 19+ клеток

Определение чувствительности набора реактивов для ПЦР-РВ «РиалитиТМ» проводили на примере выявления малых добавок и амплификации гена MYCN в образцах опухолей нейрогенного ряда Образцы медуллобластомы (п = 22) и центральной нейроцитомы (п = 22) были получены в НИИ Нейрохирургии имени академика Н Н Бурденко РАМН в период с ноября 2002г по декабрь 2005г Образцы каждой опухоли были взяты в момент первичной операции и охарактеризованы гистологически на наличие опухолевых клеток Средний возраст пациентов с медулаобластомой составил 7 5 лет (разброс 2-16 лет), 9 из них были мужского пола, 13 - женского Средний возраст пациентов с нейроцитомой составил 29 7 лет (разброс 16-59 лет), 3 из них были мужского пола, 19 - женского Дчя анализа использовали препараты мРНК и ДНК Отличительная особенность ПЦР-РВ с этими образцами - одновременное использование в каждом планшете систем детекции дчя контрольного и целевого генов, наличие во всех опытах контрольной ДНК или мРНК (кДНК) человека (Normal reference human DNA, "Perkm Elmer", США и Normal Human Bram Total RNA, "Clontech Laboratories", США соответственно), пять повторностей для всех точек Для всех пациентов с нейрогенными опухолями распотагали данными традиционного цитогенетического анализа и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) Образцы опухоли (срезы 5-цт) изучали с использованием коммерческого набора двухкрасочных флуорохром-меченых проб центромерной пробы 2pll-qll и локус-специфичной 2р22 (MYCN) пробы ("Vysis", США) Подробный протокол описан ранее (Korshunov et al 2005) Все образцы нейрогенных опухолей анализировали методом сравнительной геномной гибридизации на чипе (array-CGH) Примерно 100 нг ДНК (тест-ДНК) и нормальная референтная человеческая ДНК были мечены в реакции со случайными праймерами с Cy3-dCTP и Cy5-dCTP ("Perkm Elmer", США), соответственно Аликвоты ДНК гибридизовали на коммерческий GenoSensor Array 300 ("Vysis", США) содержащий геномные мишени, клонированные в библиотеках PI и ВАС Малые добавки и амплификацию ДНК-мишени определяли по соотношению зеленого/красного сигналов >1 2 и >2 0, соответственно Подробный протокол описан ранее (Korshunov et al 2006)

Микробиологические методы При работе с бактериальными культурами Е coli использовали TY-среду (бакто-триптон - 1%, дрожжевой экстракт - 0 5%, NaCl - 1%) и LB среду (бакто-триптон - 10%, дрожжевой экстракт - 5%, NaCl -10%) Для приготовления твердых (агаризированных) сред вносили 15-20% агар-агара) Перед использованием в среды добавляли необходимые антибиотики (ампициллин 100мкг/мл, тетрациклин 12мкг/мл) и изопропил ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG), X-gal

Молекулярно-биологические методы. Выделение препаратов геномной ДНК из свежезамороженных образцов ткани проводили набором DNeasy tissue kit ("Qiagen", Германия) Тотальную РНК выделяли из свежезамороженных образцов ткани и 106 - 107 клеток крови с помощью коммерческого набора RNeasy Mim Kit ("Qiagen", Германия) Экстракцию и очистку плазмидной ДНК из клеток Ecoli, полученных из 1мл культуральной среды проводили набором для выделения плазмидной ДНК ("Хеликон", Россия) Концентрацию нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически Качество РНК оценивали на приборе Agilent Bioanalyser ("Agilent Technologies", США) Пригодными к исследованию считали

образцы с соотношением 28S 18S = 15 1 Обратную транскрипцию проводите с использованием праймеров случайных 1ексамеров и обратной транскриптазы Superscript III Invivoscnbe ("Invitrogen", США)

В ходе работы были разработаны оригинальные праймеры и TaqMan-зонды дтя проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР (ПЦР-РВ) и реакции секвенирования Анализ специфичности выбранных олигонуклеотидов проводили в программе NCBI Blast, а тенденцию к образованшо петель и димеров и температуру отжига - с помощью программ Primer Express software v2 0, LaserGene 5 0 6 DNASTAR, Primer Designer, Oligoó О

ПЦР использовали для амплификации участков кДНК, проверки клонов на наличие гибридных плазмид ПЦР осуществляли по следующей программе 1 мин при 95°С, 1 мин при 55°С, 5 мин при 72°С (всего 25 циклов) В зависимости от размера и состава амплифицируемого участка ДНК, параметры могли незначительно меняться Продукты ПЦР разделяли путем электрофореза в агарозном геле и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свстс При получении однородного ампликона использовали очистку путем прямого переосаждения ДНК этанолом с ацетатом аммония

Для определения мутационного статуса генов вариабельного региона тяжелой цепи иммуноглобулинов использовали препараты кДНК ПЦР клонально перестроенных генов иммуноглобулинов проводили с праймерами, специфичными семи семействам V-генов, и гомологичными консервативным участкам Jh-сегментов (Campbell et al, 1992, van Dongen et al, 2003) Фрагменты ДНК выявляли в 2% агарозном геле Ампликоны, соответствующие клонально-перестроенным генам вариабельного региона подвергали электрофорезу в 6% полиакриламидном геле Вырезали участки геля и инкубировали в течение 12 часов в буфере ТЕ, pH 8 0 ПЦР-продукт выделяли осаждением в двух объемах этанола с раствором аммония ацетата в конечной концентрации IM Целостность и концентрацию ампликонов проверяли электрофоретически Сравнение полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей с терминальными V-генами проводили в программе IgV BLAST (http //www nkm hih gov/BLASTA и IMGT software (http //imgt eines fr 8104) Степень гомологии устанавливали по отношению к наиболее близкому терминальному VH-гену Прошедшую соматическую гипермутацию констатировали, если полученная последовательность более чем на 2% (гомология <98%) отличалась от наиболее близкого терминального VH-гена

Стандарты абсолютного количественного анализа методом ПЦР-РВ получали путем клонирования фрагментов генов-мишеней и контрольных генов в плазмидный вектор pGEM-T ("Promega Corporation", США) В качестве хозяина использовали штамм Е coli Z85, имеющий делецию (lac pro) и устойчивость к тетрациклину Трансформацию электрокомпетентных клеток плазмидной ДНК проводили с помощью электропоратора MicroPulser Electroporator ("Bio-Rad Laboratories", США) Скрининг клонов проводили, используя цветную реакцию 1ас-оперона на селективной твердой среде LB с антибиотиками и при помощи ПЦР с универсальными праймерами Т7 и SP6 с последующим секвенированием Рекомбинантные плазмиды посте выделения и очистки гидролизовали для получения линейной формы эндонуклеазами рестрикции Pstl, Ndel фирмы "СибЭнзим" (Россия) Плазмидную ДНК с точной последовательностью вставки использовали для серии десятикратных разведений (ДНК-стандарты) в диапазоне от 30 до 300000 копий в 5 мкл

Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v 3 1 ("Applied Biosystems", CIIIA) с последующим анализом продуктов реакции на автоматических секвенаторах ДНК ABI PRISM 3100-Avant и 3730 DNA Analyzer ("Applied Biosystems", CIIIA) Множественный анализ нуклеотидных последовательностей выполняли при помощи пакета программ LaserGene 5 0 6 DNASTAR

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) Фрагменты генов амплифицировали с препаратов кДНК при помощи оригинальных праймеров и флуоресцентных TaqMan-проб меченых FAM и TAMRA (табл 1) синтезированных фирмой "Синтол" (Россия) и набора реактивов для ПЦР-РВ «РиалитиТМ» (разработан в ходе выполнения работы) Реакцию проводили в амплификаторе ABI Prism 7000 Sequence Detection System ("Applied Biosystems", CIIIA) по стандартному протоколу Конечный объем реакционной смеси в каждой лунке составлял 25 мкл Определение количества копий мишени в образцах и эффективности амплификации проводили методом абсолютного количественного анализа, включающего построение стандартных калибровочных прямых для точек, соответствующих сериям 10-ти кратных разведений ДНК-стандарта (30 - 300000 копий в лунке) Измеряли и сравнивали данные в одном планшете с использованием одинаковых реактивов, ДНК- стандартов, на одном приборе Один планшет для каждого гена содержал 5 точек серийных разведений ДНК-стандарта, отрицательный контроль и измеряемые образцы, все в трех повторностях В некоторых случаях, дтя более точного эксперимента, в одном планшете измеряли содержание 1ена эндогенного контроля и целевого гена для серии образцов и нормы Интенсивность флуоресценции красителя-репортера FAM нормализовали относительно пассивного референтного красителя ROX Пороговый уровень (минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с данной парой праймеров реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы) выбирали с помощью управляющей программы ABI Prism 7000 SDS Software vi 0 Результаты ПЦР-РВ представлены в виде нормализованного числа копий (НЧК), т е отношения среднего числа копий гена-мишени к среднему числу копий гена эндогенного контроля

2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Выбор гена эндогенного контроля для ПЦР-РВ

В качестве генов-кандидатов для эндогенного контр о та тестировали GAPDH (кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу), ТВР (кодирует ТАТА-бокс связывающий белок), HPRT1 (ген гипоксантинфосфорибозилтрансферазы 1) и 18S rRNA Для этих генов выбрали наиболее часто используемые пары праймеров (Vandesompele et al 2002) Эксперимент проводился на 10-ти образцах РНК (кДНК) из ПМК Использовали ПЦР-РВ с красителем SybrGreen Для выбора лучшего контрольного гена высчитывали и сравнивали стабильность генной транскрипции для всех кандидатов, как было предложено ранее (Vandesompele et al 2002) Расчет производили при помощи программы geNorm (Microsoft Excel based software)

Подъем кривой амплификации для большинства тестируемых генов начинается с 25 - 28 цикла (Ct), в то время как для 18S rRNA - с 9 - 11 циклов По причине слишком высокой представленности рРНК невозможно корректно проводить с ним сравнение и требуется разведение ДНК Поэтому ген 18S rRNA был исключен из дальнейших исследованийТранскрипционная генная стабильность

Та С тица 1 Характеристика олигонуклеотидных систем для реакции амплификации

Ген/ мишень Олигонуклеотиды, 5'-3' нуклеотидная последовательность Длина амплнкона II п

Прямой праймер Обратный праймер TaqMan зонд

ZAP-70, кДНК СССТССАСААСТТССТООТ GACACCTGGTGCAGCAGCT CATTGCTCACAGGGATCTCCTCCCTCT 76

ZBTB20, кДНК ССССАААСАОААСТАССТСА TGAAGCGCTTGTTGCAGATA CAAGCACATGGTGACACACA 167

DMD, кДНК Твое АТС АТГ1СССТСТСТА AGGGCCGCTTCGATCTCT GTTGGGTGAAGTTGCATCCT 237

LPL, кДНК ОАОССААААОААОСАОСАААА CCACGGTGCCATACAGAGAA CAGATGCCCTACAAAGTCTTCCATTACCAA 150

ТВР1, кДНК ОТТСТСОСААААТССТСТСС GCTGGAAAACCCAACTTCTG CAGTCCAGACTGGCAGCAAGAAAAT 100

ТВР, ДНК 1ТАССТСОСТСТОАОТАТОА АТААС 112

ТВР* кДНК ОТТС ГС(30/\ЛАЛ100Т0ТСС CCAGGAAATAACTCTGGCTCA CAGTCCAGACTGGCAGCAAGAAAAT 226

MYCN, кДНК АОАООАСАСССТОАССОАТТС TCTTGGGACGCACAGTGATG СТТС rCCACAGTGACCACGTCGATTTCT 147

MYCN, ДНК ТСАТСОЛСССЛТЛЛЛЛЛТАОСЛОТС 258

PML-SARa, ЬсгЗ кДНК ТСТТССТССССААСАОСАА GCTTGTAGATGCGGGGTAGAG AGTGCCCAGCCCTCCCTCGC 127

1 2- два различных набора праймеров и зондов для одного гена

(размах вариации значений пороговых циклов) для GAPDH составила 6 55 Ct, для HPRT-4 9 Ct и для ТВР - 3 89 Ct

Таким образом, уровень мРНК гена ТВР обладает наименьшей вариацией и сопоставим с уровнем транскрипции генов-мишеней, т е это низкопредставленный ген с очень стабильным уровнем транскрипции в В-лимфоцитах Ген ТВР был выбран в качестве эндогенного контроля для нормализации уровня транскрипции генов - потенциальных онкомаркеров B-XJIJI

2.2 Разработка и тестирование набора реактивов для ПЦР-РВ на примере определения копийности гена MYCN

Проведена работа по созданию высокочувствительного набора реактивов для проведения ПЦР-РВ "РиалитиТМ" В состав этого набора входит 2 5-кратная смесь, состоящая из ПЦР-буфера (167 5 тМ Трис-HCl, рН 8 8, 42 5 mM (NH4)2S04, 0 025% Tween 20, 6 25 тМ MgCl2), 2 5-кратного стабилизатора-активатора, 0 5 тМ каждого dNTP (ИБХ СО РАН, Россия), 1 25 пикомоль/мкл 5-ROX (ЗАО "Синтол", Россия) и 0 03 ед. акт /мкл Taq-полимеразы (ООО НПФ "Гентех", Россия) Набор "РиалитиТМ" сравнивали с некоторыми коммерческими отечественными ("Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ" (ЗАО "Синтол", Россия) и зарубежными наборами (TaqMan PCR Core Reagent Kit фирмы "Applied Biosystems Inc ", США и JumpStart Tag Ready Mix for Quantitative PCR, "Sigma", США) Испытание всех наборов проводили на панелях контрольных плазмид (согласно протоколу, предложенному ранее (Gabert et al 2003) с добавлением в реакционную смесь "нагрузки" в виде геномной ДНК человека (5 нг/реакцию) Определение количества копий в образцах проводили методом абсолютного количественного анализа с построением калибровочной кривой За "неизвестные" образцы и ДНК-стандарты принимали серии 10-ти кратных разведений (30 - ЗОхЮ4 копий в реакции) плазмидной ДНК pGEM-T/PML-RARa (ЬсгЗ)

Основными параметрами для сравнения наборов были форма кинетической кривой, достоверность полученных результатов (коэффициент корреляции R2 и коэффициент вариации), эффективность амплификации и динамика реакции (угол наклона калибровочной кривой и ее расположение), величина нормированного сигнала относительно пассивного контроля ROX (ARn), чувствительность ((наименьшее количество копий гена-мишени, детектир>емое в реакции) и точность определения копийности "неизвестных" образцов Полученные результаты представлены в табл 2

Таблица 2 Сравнение основных параметров тестированных наборов для ПЦР-РВ

Набор, производитель ARn (FAM/Rox) 30-300000 копий PUL- RARa Наклон стандарта кривой Средняя эффективность амплификации, % Коэфф корреляции R2

РиалитиТМ, ИМБ 1 2(>l)-4 -3 53 95 0 999

Jump Start Taq Ready Mix for QPCR, Sigma 1(=1)- 2 8 -3 40 97 0 993

TaqMan PCR Core Reagent Kit, Applera 0 3(<1)-1 6 -3 51 95 0 996

Набор для ПЦР-РВ, Синтол 0 6(<l)-2 4 -3 40 97 0 995

Отечественные наборы по перечисленным выше параметрам не уступают наборам зарубежных фирм Коэффициент корреляции R2, отражающий достоверность полученных результатов при использовании всех изученных наборов для ПЦР-РВ, составляет не менее 0 993 Коэффициент вариации колеблется в пределах 3 3-43 5% Коэффициент корреляции при использовании универсального «TaqMan PCR Core Reagent Kit» составляет 0 996, коэффициент вариации - 6-28 8% Средняя эффективность амплификации в наших опытах - 95% при использовании как «РиалитиТМ», так и «TaqMan PCR Core Reagent Kit» При использовании «Набора для ПЦР-РВ» («Синтол», Россия) эффективность амплификации составляет 97%, коэффициент вариации находится в пределах 7 8-33% В модельных системах амплификации набор для ПЦР-РВ «РиалитиТМ» позволяет с высокой чувствительностью проводить определение числа копий рекомбинантных плазмид в присутствии геномной ДНК человека без снижения эффективности и чувствительности амплификации В лабораторных условиях набор «РиалитиТМ» хранился в течение года при -20°С и выдерживал 2 цикла замораживания -оттаивания без изменения своих свойств

2.2.1 Оценка чувствительности набора реактивов для ПЦР-РВ на примере определения копийности онкогена MYCN Высокая чувствительность набора «РиалитиТМ» была продемонстрирована при определении копийности гена MYCN - важного опухолевого опкомаркера Вариации копийности гена MYCN характерны для опухолей нейрогенного происхождения Поэтому оценивали чувствительность метода ПЦР-РВ с набором «РиалитиТМ» и оригинальными олигонуклеотидами (табл 1) на образцах медуллобластомы и нейроцитомы Всего значения копийности гена MYCN определены в 22-х образцах медуллобластомы и 22 образцах центральной нейроцитомы Для достоверности анализа использовали три метода FISH, array-CGH и количественная ПЦР-РВ Анализ образцов методами FISH, array-CGH проводился в НИИ Нейрохирургии им акад НН Бурденко РАМН Результаты ПЦР-РВ представ тены на рисунке 1

В ходе выполнения работы была создана оригинальная тест-система ПЦР-РВ, включающая олигонуклеотидные праймеры и зонды для генов MYCN (целевой) и ТВР (контроль геномной стабильности) и ДНК-стандарты Набор олигонуклеотидов отличается от известных коммерческих тем, что с его помощью можно определять как копийность гена в геноме, так и уровень его транскрипции Эффективность (Е) ПЦР-РВ с праймерами и зондами для контрольного гена ТВР (геномный вариант, среднее Е = 95%) сопоставима с эффективностью реакции амплификации онкомаркера MYCN (геномный вариант, среднее Е = 97%), что позволяет их корректно сравнивать

Уровни амплификации генов в медуллобластомах, полученные тремя методами, коррелируют друг с другом, например г = 0 92 (р<0 01) между данными ПЦР-РВ и агтау-CGH, и г = 1 (р<0 01) между array-CGH и FISH методами Значение нормализованного числа копий (НЧК) гена MYCN в контрольной геномной ДНК человека составило 0 5 Основываясь на распределении копийности MYCN в контрольной ДНК, установили рубежное значение НЧК равное 1 3 между образцами со сбалансированным геномом (НЧК<1 3) и образцами с дополнительными копиями гена MYCN (НЧК>1 3)(рис 2)

s

ä ю-

Y

центральная нейроцитома

медуллобластома

контрольная ДНК

Рис 1 Профиль копийности гена А4УС<\! в образцах ДНК медуллобластомы и нейроцитомы, полученный методом ПЦР-РВ

Белыми кружками обозначены опухолевые образцы, черными - образцы контрольной ДНК Пороговый уровень (НЧК =13) разделяет все образцы на две группы обладающие сбалансированным геномом (НЧК < 1 3) и содержащие добавки низкого уровня гена МУСЫ (НЧК > 1 3) Все образцы контрольной ДНК расположены ниже порогового уровня

Среди медуллобластом (рис 1) только восемь опухолей содержали добавочные копии гена MYCN (НЧК = 1 46 - 52 339), в то время как в четырнадцати образцах значения НЧК гена MYCN были в пределах нормы (0 27 - 1 14) Образцы с НЧК выше чем в контроле (6 78, 11 18 и 52 34) содержат амплификацию гена MYCN Два ложноположительных результата, полученные ПЦР-РВ, согласно методам FISH и array-CGH содержали малые добавки гена MYCN В одном образце медуллобластомы с достоверно высоким уровнем амплификации гена MYCN по данным FISH и array-CGH, методом ПЦР-РВ не показано увеличения копийности При дальнейшем анализе обнаружено, что только в этом образце присутствует добавка контрольного гена ТВР (добавлен регион 6q24-27), что ведет к неправильным результатам при расчете НЧК Хотя аберрации 6q редки в изучаемых опухолях, этот факт следует всегда иметь ввиду Решение этой проблемы возможно при использовании нескольких контрольных однокопийных генов, расположенных на разных хромосомах При этом эффективность амплификации для всех генов не должна сильно различаться

Методами FISH и array-CGH малые добавки гена в нейроцитоме с трудом фиксируются и могут быть представлены в формате "да/нет" Согласно данным ПЦР-РВ (рис 1) около половины образцов нейроцитомы (п = 12) содержат добавки низкого уровня (1 31 - 2 89-кратное увеличение гена) Эти результаты подтверждены методами FISH и array-CGH для десяти образцов Шесть образцов имели несколько большее значение копийности MYCN чем в контроле (НЧК = 1 07 - 1 28), а согласно FISH три, array-CGH - два из них содержат дополнительные копии MYCN В оставшихся четырех образцах нейроцитомы - сбалансированный геном (НЧК = 0 42 — О 92) согласно результатам ПЦР-РВ, хотя методами FISH и array-CGH в двух из них обнаруживались малые добавки гена MYCN

Полученные коэффициенты корреляции свидетельствуют о тесной связи между результатами, полученными тремя методами - ПЦР-РВ, FISH и array-CGH (суммарное г = 0 97/0 76/0 74, р<0 01 между FISH/array-CGH, array-CGH/ПЦР-РВ и

FISH/ПЦР-РВ соответственно) Подобные заключения были сделаны н другими исследователями (Dallas et al, 2005) Различия между методами можно объяснить сложностью детекции добавок низкого уровня на грани чувствительности приборов

С целью изучения зависимости уровня транскрипции MYCN от его амплификации в геноме, проанализировали ДНК и мРНК, выделенные из 12 образцов нейроцитом Методом ПЦР-РВ во всех образцах показано слабое увеличение копийности гена (малые добавки) в 13-2 9 раза по сравнению с контрольной ДНК человека Количество мРНК в этих образцах варьировало от нормального (НЧК = 0 39 и 0 96) до значительно превышающего норму в 10 образцах (НЧК = 1 41 - 24 2) и не коррелировало со степенью увеличения количества гена в геноме (г = -0 17, р < 0 01) Следовательно, в большинстве нейроцитом уровень транскрипции гена MYCN высокий, даже при малом увеличении копийности гена

Таким образом, методика ПЦР-РВ с оригинальными олигонуклеотидами, плазмидными стандартами и универсальным набором «РиалитиТМ» представляет собой высокоточную систему, пригодную для проведения широкомасштабного определения уровня транскрипции и амплификации потенциальных генов-онкомаркеров в широком диапазоне значений

2 3 Анализ мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов

В ходе работы, совместно с сотрудниками ГНЦ РАМН, определили нуклеотидную последовательность вариабельного региона генов иммуноглобулинов (IgVH) для 168 больных B-XJIJI При анализе последовательностей IgVH установтена разная степень гомологии терминальным VH-генам На основании этих данных все случаи В-ХЛЛ поделили на две группы первая - с уровнем гомологии <98% и вторая - с уровнем гомологии >98% В первую группу (табл 3) попали 71 из 134 стучаев (42 5%) В 97 случаях (57 5%) нуклеотидная последовательность вариабельного региона практически совпадала с терминальными VH-генами В группе без мутаций при анализе аминокислотной последовательности, предсказанной из нуклеотидной гомология всегда превышала 98%

Группа больных В-ХЛЛ, с высокой гомологией терминальным генам сокращенно обозначается IgVmut-, а группа с мутациями - IgVmut+ Уровень гомологии 98% взят с поправкой на аллельный полимфорфизм и возможные ошибки фермента Taq-потимеразы Аллельный полиморфизм терминальных VH-генов (известен практически для всех сегментов) существует, но он достаточно низок и не препятствует проведению прямого сравнения индивидуальных VH-генов непосредственно с терминальными (Fais et al, 1998)

Сравнение основных параметров в группах больных с разным мутационным статусом приведено в таблице 3 Разделения В-ХЛЛ по цитогенетическим аберрациям не выявлено, за исключением трисомии 12, которая чаще присутствует в случаях IgVmut- В группе больных без мутаций (IgVmut-) преобладают гены 1-го семейства, например, VH1-2 и VH1-69 В группе больных с мутациями (IgVmut+) преобладают гены 3-го и 4-го семейств, например, VH3-23, VH3-7 и VH4-34 (данные представлены в диссертации) Средняя выживаемость больных составила 62 9 месяца На основании полученных данных мутационного статуса и продолжительности жизни больных построены кривые выживаемости (рис 2) Мутационный статус достоверно (р<0 001) дискриминирует две прогностически разные группы ботьных Медиана выживаемости больных без мутаций вариабельного района - 81 6 месяцев, а больных с мутациями - 231 месяц (Р = 0 001)

Таблица 3 Демографическая и клиническая характеристики двух групп больных В-

XJIJI с разным мутационным статусом IgVH

Характеристика Варианты В-ХЛЛ Все

IgVmut- IgVmut+

Число больных (%) 97 (57 5%) 71 (42 5%) 168(100%)

Возраст, лет 54 7 (28 - 83) 55 5 (30 - 75) 55 (28-83)

Пол, М/Ж 77/20 38/33 115/53

Стадии В-ХЛЛ по Rai 0 13 (13%) 38 (53%) 51 (30%)

1 26 (27%) 11 (15%) 37 (22%)

2 48 (50%) 14 (20%) 62 (38%)

3+4 10(10%) 8 (12%) 18(10%)

Стадии В-ХЛЛ по Binet А 32 (33%) 49 (69%) 81 (48%)

В 55 (57%) 13 (19%) 68 (42%)

С 10(10%) 9 (12%) 19 (10%)

Нормальный кариотип 13 (38%) 12 (55%) 25 (45%)

dell3q 7 (20%) 4 (18%) 11(19%)

delllq 11 (32%) 3 (14%) 14 (25%)

трисомия 12 8 (24%) 1 (5%) 9 (16%)

Время удвоения лимфоцитов >12 мес 18 из 58 (31%) 37 из 49 (76%) 55 из 107 (51%)

Смерти от ХЛЛ, чел 24 9 33

месяцы

Рис 2 Кривые выживаемости больных В-ХЛЛ в зависимости от вариантов мутационного статуса вариабельного региона генов

иммуноглобулинов (р<0 001)_

В группах IgVmut- и IgVmut+ было примерно равное число больных В группе IgVmut- преобладали мужчины В целом, исследуемая выборка случаев B-XJIJI адекватно соответствует генеральной совокупности Мутационный статус вариабельного региона генов иммуноглобулинов достоверно дискриминирует две прогностически разные группы больных Использование мутационного статуса и выживаемости в качестве референтных маркеров сравнения статистически оправдано

2.4 Анализ уровня мРНК генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCNhLPL у больных B-XJ1JI

Для изучения транскрипционного профиля было отобрано 5 генов, перспективных для прогнозирования течения хронического лимфолейкоза ZBTB20, LPL, ZAP-70, DMD и MYCN В общедоступных базах данных и литературе не удалось найти последовательностей олигонуклеотидов для ПЦР-РВ к этим генам (кроме ZAP-70) Поэтому подбор праймеров и фтуоресцентных проб для этих генов оригинален Выбирали олигонуклеотиды по возможности к тем участкам генов, которые ранее использовались в качестве зондов в экспериментах с микрочипами (Klein et al ,2001, Rosenwald et al ,2001)

Уровень мРНК генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, LPL и MYCN определяли в ПМК и различных субпопуляциях клеток крови 168 больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом и у 10 здоровых доноров Для гена MYCN число исследованных бочьных составляло 60 человек

Распределение значений нормализованных чисел копий кДНК четырех изученных генов (кроме MYCN) в В-лимфоцитах и периферической крови (ПМК) больных с разным мутационным статусом иммуноглобулина представлено на рисунке 3 Распределение уровня транскрипции гена липопротеинлипазы (LPL) бимодально и образует 2 довольно четко разделенных кластера Часть точек смещена в сторону меньших значений НЧК, а вторая часть располагается в районе НЧК = 1 Такая бимодальность наблюдается как в селектированных по CD 19+, так и неселектированных образцах крови больных В-ХЛЛ Сходную, хотя и менее выраженную тенденцию наблюдали для распределения уровня мРНК гена DMD Уровень транскрипции гена ZBTB20 подчиняется нормальному распределению во всех типах образцов Характер распределения количества мРНК для ZAP-70 бимодален только в образцах CD 19+ клеток В-ХЛЛ

Таким образом, для двух групп бочьных В-ХЛЛ (с разным мутационным статусом) наблюдали различия уровня транскрипции генов LPL и DMD в клетках ПМК и В-лимфоцитах В этих группах больных уровень транскрипции гена ZAP-70 различался только в селектированных В-лимфоцитах

Результаты определения уровня транскрипции гена MYCN в отдельных субпопуляциях клеток крови и периферической крови больных В-ХЛЛ и доноров представлены на рисунке 4 Распределение уровня транскрипции MYCN в двух группах больных подчинялось нормальному Корреляции уровня мРНК гена MYCN с мутационным статусом не выявлено Однако в целом, в клетках периферической крови больных В-ХЛЛ среднее НЧК гена MYCN в 20 раз больше (0 117) чем в ПМК здоровых доноров (0 007) Причины повышенного содержания мРНК гена MYCN в клетках В-ХЛЛ не ясны Это может быть связано с активированным состоянием клеток В-ХЛЛ (Т-зависимая активация В-лимфоцитов) Для проверки этой гипотезы сравнили число копий кДНК гена MYCN в клетках CD 19+ и В-лимфоцитах, активированных митогеном Фитолакки Различий в уровне транскрипции MYCN в обычных и активированных В-лимфоцитах не выявлено Таким образом, высокое

15

содержание мРНК гена MYCN в клетках B-XJIJI скорее свидетельствует не об активации, а отражает какой то другой феномен Скорее всего это связано с тем, что белок гена MYCN как фактор транскрипции задействован в дифференциации тканей, а в случае активации В-лимфоцитов дифференциации не происходит

Результаты анализа уровня транскрипции пяти генов в нормальных субпопуляциях клеток крови показаны в таблице 4 Данные представлены в виде нормализованных чисел копий кДНК Уровень транскрипции гена LPL в нормальных В- и Т-лимфоцитах чрезвычайно мал, тогда как в мононуклеарах периферической крови он на два порядка выше - это объясняется относительно высоким (НЧК = О 229) уровнем транскрипции LPL в моноцитах (CD14+ клетки) По этой причине распределение данных на рисунке 3 уровня мРНК гена LPL в цельной фракции мононуклеарных клеток периферической крови больных B-XJ1J1 смещено вправо по сравнению с «чистой» популяцией клеток B-XJIJI - CD 19+ клетках

Обнаруженное значительное повышение уровня транскрипции гена липопротенинлипазы (LPL) специфично для клеток B-XJIJI и не характерно для В-лимфоцитов здоровых доноров (табл 4) Для выяснения причин данного явления, исследовали уровень транскрипции гена LPL в активированных В-лимфоцитах Установлено, что ген LPL в них практически не транскрибируется (НЧК = 0 006) Это свидетельствует о том, что повышение транскрипции гена LPL не связано с нормальным процессом активации В-лимфоцитов Вероятно, клетки B-XJIJI возникают из редких популяций лимфоцитов, активно транскрибирующих ген LPL

В Т-лимфоцитах мРНК гена DMD практически не выявляется (НЧК = 0 003) В В-лимфоцитах уровень его транскрипции хоть и незначительный (НЧК = 0 049), но стабильный (табл 4) Уровень мРНК гена DMD в ПМК и CD 19+ селектированных клетках различается, что позволяет сделать заключение о преимущественном происхождении ДМО-сигнала в ПМК не из В-лимфоцитов, а других популяций клеток, не вошедших в настоящее исследование В клетках B-XJIJI у части пациентов (вариант IgVmut-) уровень его транскрипции приблизительно в 2 5 раза выше, чем в нормальных В-лимфоцитах Это свидетельствует о том, что в клетках B-XJIJI наблюдается повышение изначально низкого уровня транскрипии DMD Стимуляция В-клеток митогеном приводит к небольшому повышению уровня транскрипции гена дистрофина (НЧК = 0 197), но он не достигает значений, наблюдаемых при B-XJIJI (среднее НЧК > 0 739)

Уровень транскрипции ZBTB20 в В- и Т-лимфоцитах, а также в клетках В-XJIJI высокий по сравнению с другими генами и не зависит от вариантов мутационного статуса генов иммуноглобулинов

Уровень транскрипции ZAP-70 в мононуклеарных клетках периферической крови и Т-лимфоцитах был относительно высок Сопоставим уровень транскрипции гена ZAP-70 в Т-лимфоцитах и клетках B-XJIJI Стимуляция В-лимфоцитов митогеном не приводит к существенному изменению уровня мРНК гена ZAP-70 Корреляция мутационного статуса IgVH с уровнем мРНК гена ZAP-70 была только в случае CD19+ селектированных В-лимфоцитов Что соответствует предыдущим наблюдениям (Rosenwald et al 2001) об относительно низкой надежности использования этого маркера и необходимости предварительной селекции В-лимфоцитов

В CD4+ (Т-хелперах), CD8+ (Т-киллерах) и активированных митогенами клетках CD 19+ мРНК гена MYCN не детектировалась методом ПЦР-РВ Уровень транскрипции гена MYCN в моноцитах (CD14+) и нормальных В-лимфоцитах (CD19+) был крайне низкий (НЧК = 0 006 и 0 020 соответственно)

Мононуклеары ZBTB20 -j CD19+ клетки Í | Мононуклеары ZAP 70 < CD19+ клетки Мононуклеары DMD < CD19+клетки г i Мононуклеары LPL < t

* i лай .

? ШЗ

i

*т t

* ♦ -сЗ- • ♦-.jy \ .J

< - - с 0

] CD19+ клетки 1 u.» .

0; jot од i 0.1 1 1 Нормализован 10 ■^e число 0 loro опий генов

Рис. 3. Уровень транскрипции (НЧК) генов LPL, DMD, ZBTB20 и ZAP-70 у больных В-ХЛЛ. Черными кружками обозначены случаи В -ХЛЛ без мутаций вариабельного региона. Белыми кружками обозначены больные с мутациями вариабельного региона генов иммуноглобулинов.

о Q с

8

Oo.li?

1Е-3 ~|-,-ф-,-ф-1-1-г-1-.-ф-i-i-.-1-■-1-г-

CD4+- CD8+ CD14+ CD19+ CD19+ CD19+ ПК ПК

активир В-ХЛЛ (норма) B-XJ1JI ОБРАЗЦЫ

Рис. 4. Уровни транскрипции гена МУСЫ в различных субпопуляциях клеток крови и периферических мононуклеарах крови больных В-ХЛЛ и доноров. Кружками обозначены данные для каждого образца, черными линиями -арифметическое среднее значение нормализованного числа копий (НЧК) в каждой группе.__|

Образец, источник п Гены, НЧК

LPL DMD ZBTB20 ZAP-70 MYCN

CD4+ 1 (пул) 0 002 0 003 5 906 0 064 0

CD8+ 1 (пул) 0 005 0 001 2 505 7 170 0

CD 19+ 4 0 003 (0-0 007) 0 049 (0 021 -0 084) 3 196 (1 731 -4 553) 0 138 (0 071-0 210) 0 020 ±0 006

CD 19+ активир 4 (пул) 0 006 (0 002 - 0 009) 0 197 (0 053 - 0 441) Нет данных 0 093 ±0 036 0

CD 14+ 3 0 229 (0 133-0 399) Нет данных Нет данных Нет данных 0 006 (0-0 014)

ПМК (норма) 10 0 138 (0 030-0 299) 0 153 (0 044 - 0 279) 75 899 (48 567-120 542) 65 687 (43 497 - 82 935) 0 071 (0 019-0 143)

A IgVmut- 72 2 919 (0 194-9 345) 9 094 (0 076 - 3 744) 57 104 (3 349- 150 216) 8 717 (0 109- 189 820) 0 392 (0 032 - 1 848)

А IgVmut+ 62 0 903 (0-9 681) 3 693 (0 - 35 805) 80 719 (0 657-562 135) 16 033 (0 153 - 392 667) 0 460 (0-2 253)

Б IgVmut- 25 1 430 (0-6 647) 0 739 (0 003-2 069) 5 146 (1 581-13 115) 3 231 (0 029-21 058) 0 013 (0 007-0 026)

Б IgVmut+ 9 0 260 (0-0 835) 0 961 (0-7 851) 9 365 (2 228-28 605) 4 535 (0 08-25 929) 0 010 (0-0 021)

ПМК - периферическая кровь Группа А - выборка больных (134 чел ) у которых ПЦР-РВ проводилась с использованием мРНК из периферической крови Группа Б - селектированные клетки СО 19+ (34 чел ) В скобках указаны минимальное и максимальное значения НЧК

Различия между селектированными клетками CD 19+ и ПМК внутри группы IgVmut- были значительны для уровней транскрипции генов LPL (Р < 0 031), DMD (Р

< 0 003) и ZBTB20 (Р < 0 001), но в случаях IgVmut+ такой разницы не наблюдали. Для гена ZAP-70 различия в уровне транскрипции значительны как для группы IgVmut-, так и для IgVmut+ (Р < 0 0002 и Р < 0 02 соответственно)

Таким образом, в результате исследования уровня транскрипции пяти генов ZBTB20, LPL, ZAP-70, DMD, MYCN установлено, что только уровень транскрипции двух из них - LPL и DMD - достоверно коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона IgVH Эта закономерность прослеживалась как в случае CD 19+ селектированных, так и в мононуклеарных клетках крови Посте определения уровней транскрипции генов в субпопуляциях клеток крови было обнаружено, что ген LPL относительно сильно транскрибируется в моноцитах В активированных В-лимфоцитах повышался только уровень мРНК 1сна DMD

2.5 Взаимосвязь уровня транскрипции генов LPL, DMD, ZBTB20, MYCN и ZAP-70

с мутационным статусом.

Среди больных, включенных в исследование, 97 (57 5%) имели вариант В-XJIJI без мутаций вариабельного региона генов иммуноглобулинов (IgVmut-) и 71 (42 5%) имели вариант B-XJIJI с мутациями (IgVmut+) Для этих групп больных была отдельно рассчитана корреляция уровня транскрипции исследованных генов с присутствием или отсутствием мутаций в IgVH

Анализ коэффициента корреляции по Спирмену позволил выявить следующие закономерности В выборке больных, у которых уровень транскрипции оценивали в мононуклеарных клетках периферической крови (п=134), наблюдали четкую корреляцию уровня транскрипции генов LPL (R = 0 66, Р < 0 0001) и DMD (R = 0 5, Р

< 0 0001) с мутационным статусом Уровень транскрипции генов ZAP-70 и ZBTB20 не имеет достоверной взаимосвязи с мутационным статусом (R = 0 06, Р = 0 59 и R = -0 06, Р = 0 6 соответственно) В группе больных, у которых проводили предварительную селекцию клеток CD19+ (п = 40), наблюдается достоверная взаимосвязь уровня транскрипции генов LPL (R = 0 5, Р < 0 001) и ZAP-70 (R = 0 45, Р - 0 004) с мутационным статусом Для уровня мРНК гена DMD выявлена только статистически недостоверная тенденция (R = 0 26, Р = 0 1) Корреляция уровня транскрипции гена MYCN с мутационным статусом отсутствов\ст (R = -0 1, Р = 0 01), также нет взаимосвязи с значимыми клиническими параметрами

Для определения порогового значения уровня транскрипции LPL и DMD дискриминирующего варианты IgVmut- и IgVmut+ использовали индекс Юдена Определили единые дискриминирующие пороги для всех 168-ми случаев Соответствующие значения составляют НЧК = 04 для транскрипции гена LPL (индекс Юдена = 0 74) и НЧК = 1 для гена DMD (индекс Юдена = 0 58) Результаты представлены в таблице 5 Соответствие вариантов мутационного статуса уровню транскрипции генов LPL и DMD достоверно, как показывает двусторонний тест Фишера (Р < 0 0001) и составляет 88% и 80% соответственно

При анализе ассоциации уровня транскрипции LPL с цитогенетическими данными, стадией заболевания и временем удвоения лимфоцитов показана достоверная взаимосвязь уровня транскрипции этого гена со временем удвоения лимфоцитов (табл 5) Уровень транскрипции генов LPL и DMD не коррелирует с цитогенетическими аберрациями

Таблица 5 Корреляция уровня транскрипции генов ЬРЬ и ОМО с прогностическими маркерами В-ХЛЛ

LPL>0 4( LPK0.4 DMD> 1 DMD< 1

N) (N) (N) (N)

Мутационный

статус IgVmut- 91 6 <0 0001 84 13 <0 0001

(>98%) IgVmut+ 14

(<98%) 57 22 49

Стадии по Binet

А 37 44 0 007 36 45 0 007

В+С 67 20 65 22

Стадии по Rai <0 000 0 01 (0Л

О 15 36 1 (0Я+П) 16 35 +11)

I+II 78 21 0 74 73 26 0 83 (0-

(0-11 / II/

III+IV 10 8 III+IV) 11 7 III+IV)

Цитогенетически

е аномалии

Аберрантный 20 5 Н/д 18 7 Н/д

кариотип (0 17) (0 16)

Нормальный

кариотип + dell3q 19 13 16 16

Наличие 11 q

делении Н/д Н/д

Да 11 3 (0 54) 10 4 (0 47)

Нет 28 15 24 9

Трисомия 12 Н/д Н/д

Да 8 1 7 2

31 18 (0 26) 21 (0 4)

Нет 27

Время удвоения

лимфоцитов

<12 месяцев 40 13 0 0008 37 16 0 029

>12 месяцев 23 32 26 29

Н/д - недостоверно

Таким образом, установленные пороговые значения НЧК дискриминируют группу больных В-ХЛЛ с коротким временем удвоения лимфоцитов, отрицательным мутационным статусом и более развернутыми стадиями заболевания от группы больных с благоприятными клиническими данными

2.6 Анализ «нетипичных» случаев В-ХЛЛ

В 16 случаях (9 5%) уровень транскрипции LPL не соответствует мутационному статусу У большинства этих больных (п = 11, 69%) высокий уровень мРНК гена LPL и вариант B-XJIJI без мутаций IgVH Ни в одном из случаев разногласие не может быть объяснено высоким содержанием LPL мРНК в моноцитах В клинической практике пороговое (дискриминирующее) значение данных ПЦР-РВ определить трудно Однако, как видно из распределения уровня транскрипции LPL (рис 3), можно выделить три зоны со значениями НЧК меньше О 1, в диапазоне 0 1 - 0 4 и больше 0 4 Среди больных с уровнем мРНК гена LPL менее чем 0 1 есть только случая из 34 (5%) В группе с НЧК гена LPL более 0 4 есть 12 значений из 105 (11 5%) Прогностика в группе с НЧК в диапазоне 0 1 - 0 4 не надежна В эту «серую» зону попали 29 больных (17%) Так как распределение транскрипции гена LPL является бимодальным, истинные «нетипичные» случаи -те, у которых значения уровня мРНК гена LPL ближе к средней внутри стандартной девиации После суммирования данных уровня транскрипции гена LPL в «нетипичных» случаях B-XJIJI оказалось, что эта группа больных старше и у них более часто наблюдается цитопения (сниженное число клеточных элементов крови) Также пациенты с высоким уровнем мРНК гена LPL характеризуются более развернутым течением заболевания и формой IgVmut+

Таким образом, на основании уровня транскрипции гена LPL возможно выделять три группы больных 1) группа с НЧК меньше 0 4 характеризуется благоприятным прогнозом течения заболевания, 2) группа с НЧК больше 0 4 характеризуется неблагоприятным прогнозом, 3) группа больных с «нетипичными» клиническими данными, сопровождающаяся очень высоким уровнем мРНК гена LPL, характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом

2.7 Взаимосвязь уровня транскрипции генов LPL и DMD с выживаемостью и другими прогностическими факторами

Для оценки степени корреляции выживаемости и уровня транскрипции генов использовали определенные в настоящей работе пороговые значения, дискриминирующие варианты с разным мутационным статусом Как показано выше (рис 2), мутационный статус IgVH генов - важный прогностический маркер В-ХЛЛ Медиана выживаемости больных с низким уровнем транскрипции гена LPL (НЧК <0 4) составила 84 8 месяцев (рис 5(А)), с высоким (НЧК > 04)- 226 месяцев (средняя выживаемость не была достигнута) Это различие достоверно (Р = 0 0001) При анализе выживаемости в пределах стадий заболевания установлено что прогностическое значение уровня мРНК гена LPL, сохраняется для стадии А Медиана выживаемости в зависимости от этого показателя составляет 93 6 (НЧК LPL < 0 4) и 252 (НЧК LPL >0 4) месяцев (Р = 0 001) Для сравнения, медианы выживаемости у больных в стадии А против стадий В+С составляют 183 и 87 5 месяцев, соответственно (Р = 0 006) Таким образом, низкий уровень транскрипции гена LPL идентифицирует группу больных В-ХЛЛ с очень благоприятным прогнозом Группа с высоким уровнем транскрипции LPL (НЧК >0 4) включает много больных с развернутыми клиническими стадиями заболевания, поэтому кривая выживаемости подразделена на две - со стадией А и В+С (рис 5В) Средняя выживаемость пациентов стадии А с низким уровнем мРНК гена LPL (НЧК < 0 4) не была достигнута Различия между выживаемостью больных стадии А с низким и высоким уровнем мРНК LPL статистически достоверны (Р = 0 0001, рис 5В) Важно, что выживаемость у больных в стадии А (87 5 месяцев) с высоким уровнем

МЕСЯЦЫ

О I , , I | , I I , I I . I I | I , I I 1 I I , , I . , I I

О 50 100 150 200 250 300 МЕСЯЦЫ

О , I . I I I I I I I I I . I I . ■ ■ I I I I I I I . I .

О 50 100 150 200 250 300 МЕСЯЦЫ

Рис 5 Общий анализ выживаемости (А) Общая выживаемость больных В-ХЛЛ с высоким (>0 4) и низким (<0 4) уровнем мРНК ЬРЬ, (Б) общая выживаемость пациентов с высоким (>1) и низким (<1) уровнем мРНК гена ОМО, (Б) общая выживаемость пациентов стадии А с высоким и низким уровнем мРНК гена ЬРЬ и 1 пациентов со стадиями В+С_________

транскрипции гена LPL примерно такая же, как у больных в стадиях В+С (87 месяцев) с разным уровнем мРНК этого гена Таким образом, низкий уровень транскрипции гена LPL идентифицирует благоприятную группу больных В-ХЛЛ с стадией А Не обнаружено различий выживаемости в зависимости от уровня мРНК гена LPL в группе пациентов с развернутыми стадиями В и С (Р < 0 8)

Выявлена достоверная (Р < 0 001) корреляция выживаемости больных и уровня транскрипции гена DMD Медианы выживаемости больных с уровнем мРНК гена DMD более 1 составляет 90 1 мес, а с уровнем мРНК менее 1 (рис 5Б) - «не достигнута» ("75% выживаемость - 119 7 месяцев), р = 0 003 Для различных пороговых значений транскрипции гена ZBTB20 не найдено отличий выживаемости При объединенном анализе уровня мРНК двух генов - LPL и DMD набчюдали статистически достоверную корреляцию транскрипции обоих маркеров с стадиями заболевания и временем удвоения лимфоцитов У 82 (49%) больных оба гена активно транскрибируются (НЧК DMD > 1, НЧК LPL > 0,4) У 40 человек (24%) -результаты не совпадают (разнонаправленные) и у 46 (27%) - уровень транскрипции двух генов низкий Медианы выживаемости для этих групп составляют, соответственно 83 6 мес , 145 мес и «не достигнута»

Таким образом, на стадии А пороговое значение НЧК достоверно различает группу больных (LPL < 0 4 и DMD < 1) с высокой выживаемостью и вариантом В-ХЛЛ с мутациями IgVH от группы пациентов (LPL > 0 4 и DMD > 1) с низкой выживаемостью и вариантом В-ХЛЛ без мутаций в IgVH Для группы пациентов на стадиях В и С пороговое значение уровня мРНК гена LPL не делит больных на подгруппы, что может объясняться недостаточностью выборки

Биологические причины высокого уровня транскрипции LPL в клетках В-ХЛЛ с отрицательным мутационным статусом неясны После того, как Chen и соавт (2002) показали, что клетки IgVHmut- более чувствительны к возбуждению их антигенных рецепторов, Oppezzo и соавт (2005) сделали предположение, что LPL играет роль в создании и/или стабилизации липидных рафтов, важном биологическом процессе активации В-лимфоцитов (Pierce, 2002) Установлена центральная роль липопротеинлипазы во всем липидном метаболизме и транспорте (Mead et al, 2002), а также идентифицированы другие, некаталитические функции фермента Нарушения его функции найдены в связи с различными патофизиологическими проблемами В норме липопротеинлипаза экспрессируется в жировых тканях, сердечной и скелетных мышцах, лактирующей молочной железе Небольшое количество фермента производят макрофаги, гормон-продуцирующие клетки в надпочечниках и яичниках, некоторые нервные клетки, селезенка, легкие и почки Многие исследователи потерпели неудачу в попытке обнаружить экспрессию LPL в нормальных отселектированных В- и Т-лимфоцитах (de Sanktis et al, 1994, Oppezzo et al, 2005) однако доказан факт экспрессии липопротеинлипазы в NK-хлетках При этом оказалось, что липопротеинлипаза увеличивает пролиферацию NK-клеток, но ингибирует их цитотоксичность (de Sanctis et al, 1996)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Созданный на первом этапе работы набор реактивов для ПЦР-РВ «РиалитиТМ» надежен и удобен для количественного определения генов -потенциальных онкомаркеров лейкозов Состав набора «РиалитиТМ» полностью представлен отечественными компонентами Его можно использовать в качестве доступной основы онкодиагностических наборов В ходе работы создан и апробирован новый высокоспецифичный набор олигонуклеотидов для измерения количества онкогена MYCN методом ПЦР-РВ Результаты определения копийности гена MYCN этим методом хорошо согласуются с данными, полученными классическими методами - FISH и array-CGH Показано, что методом ПЦР-РВ с использованием набора "РиалитиТМ" и выбранных олигонуклеотидов возможно определение уровней транскрипции и копийности гена MYCN в широком диапазоне значений, включая добавки низкого уровня Дополнительными преимуществами данного диагностикума являются малое время анализа, дешевизна и получение результата в виде точных числовых данных

Для точного определения уровня транскрипции генов - потенциальных онкомаркеров гемобластозов созданы плазмидные стандарты Они позволяют определять абсолютное количество копий целевых и контрольных фрагментов ДНК с высокой надежностью и корректно сравнивать результаты Уровень мРНК гена ТВР измеряли как контрольный, т к была продемонстрирована высокая стабильность уровня его транскрипции в клетках В-ХЛЛ по сравненшо с другими генами эндогенного контроля

Показано, что уровень транскрипции генов LPL и DMD достоверно коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона IgVH как селектированных клеток CD 19+, так и ПМК Связь мутационного статуса IgVH с транскрипционным профилем гена ZAP-70 выявлена только в случае CD19+ селектированных лимфоцитов Таким образом, уровень мРНК генов липопротеинлипазы и дистрофина может быть маркером прогноза на ранних стадиях B-клеточного хронического лимфолейкоза Выявленные «нетипичные» случаи В-ХЛЛ характеризовались высоким уровнем мРНК гена LPL и вариантом IgVmut+ с тяжелым течением заболевания Впервые создана фундаментальная основа диагностической системы, которая позволяет на основании пороговых значений уровня транскрипции липопротеинлипазы и дистрофина делать прогноз течения В-ХЛЛ

выводы

1 Создана высокочувствительная методика ПЦР-РВ с использованием оригинальных олигонуклеотидов, плазмидных стандартов и набора реактивов На примере известного онкомаркера - гена MYCN показана возможность точного измерения копий генов и уровня мРНК в нейрогенных опухолях и хроническом лимфолейкозе

2 Определена стабильность уровня транскрипции генов эндогенного контроля GAPDH, HPRT1, 18S rRNA и ТВР у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) Показано, что ген ТВР является наиболее надежным контролем для количественной оценки уровня мРНК генов-мишеней в клетках крови

3 Впервые на большой выборке бочьных В-ХЛЛ (168 человек) проведен анализ уровня мРНК пяти генов - потенциальных онкомаркеров Показана достоверная корреляция уровня мРНК генов липопротеинлипазы (LPL) и дистрофина (DMD) с мутационным статусом гена иммуноглобулина и выживаемостью бочьных На основании анализа отдельных субпопуляций клеток крови доказано, что повышение уровня мРНК гена LPL в периферической крови больных В-ХЛЛ происходит за счет фракции моноцитов

4 Показано, что уровень мРНК трех потенциальных онкомаркеров (ZAP-70, MYCN и ZBTB20) не может использоваться для прогноза В-ХЛЛ Корреляция уровня мРНК гена ZAP-70 с мутационным статусом гена иммуноглобулина выявлена только для фракции B-лимфоцитов Уровень транскрипции генов ZBTB20 и MYCN не различается у двух групп больных

5 На представительной выборке больных определены критерии - пороговые значения уровня транскрипции генов LPL (НЧК = 0 4) и DMD (НЧК = 1), на основании которых возможно создание тест-системы прогноза В-ХЛЛ

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1 Манзешок О Ю , Малахо С Г. Пехов В M, Косорукова И С , Полтараус А Б Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени Опыт использования в молекулярной онкодиагностике // Молекулярная биология 2006 40(2), С 349-356

2 Никитин Е А, Малахо СГ. Бидерман Б В , Полтараус А Б , Судариков А Б Молекулярно-биологические факторы прогноза при B-клеточном хроническом лимфолейкозе // Современная онкология 2006 8(1), С 30-33

3 Nikitin Е А, Malakho S G . Biderman В V, Baranova A V, Lorie Y Y, Shevelev A Y, Peklo MM, Vlasik TN, Moskalev EA, Zingerman В V, Vorob'ev IA, Poltaraus AB, Sudarikov AB, Vorobjev AI Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia // Leukemia and Lymphoma 2007 V 48(5), P 912-922

4 Малахо С Г, Никитин Е А, Наседкина Т В , Полтараус А Б Уровень транскрипции гена MYCN в клетках крови больных гемобластозами // Молекулярная биология 2008 42(2), С 378-382

5 Malakho S G, Korshunov A , Stroganova A M, Poltaraus А В Fast detection of MYCN copy number alterations m brain neuronal tumors by real-time PCR // Journal of Clinical Laboratory Analysis 2008 V 22(2), P 123-130

Тезисы

1 Малахо С Г. Манзенюк О Ю, Пехов В M, Полтараус А Б Сравнительная характеристика универсальных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени // II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва, Россия, 20-21 октября 2005 С 188

2 Пехов В M, Косорукова И С , Малахо С Г . Полтараус А Б Опыт использования метода количественной ПЦР для мониторинга минимальной остаточной болезни при остром лейкозе // II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва, Россия, 20-21 октября 2005 С 207

3 Бидерман Б В , Малахо С Г. Полтараус А Б , Никитин Е А, Судариков А Б Новые молекулярные маркеры для оценки прогноза при хроническом лимфолейкозе // VI Съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» Минск, 24-25 мая 2007 С 206

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к б н А Б Полтараусу, заведующему лаборатории акад Л Л Киселеву, к м н Е А Никитину (Гематологический научный центр РАМН) и д м н А Г Коршунову (НИИ Нейрохирургии имени академика НН Бурденко РАМН) за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов Автор приносит благодарность всем участникам работы, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку

Подписано в печать 29 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 362 Тираж 120 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малахо, Софья Гарифовна

Список сокращений

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 В-клеточный хронический лимфолейкоз

2.2 Организация и перестройка генов вариабельного региона 17 иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара.

2.3 Соматическая гипермутация

2.4 Изучение У-генов при лимфатических опухолях

2.5 Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом 30 лимфолейкозе

2.6 Особенности метода ПЦР в реальном времени

3 Экспериментальная часть 52 3.1 Объекты и методы исследования 52 3.1.1 Реактивы

ЗЛ2.Среды.

3.1.3 Характеристика больных

3.1.4 Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМК) 55 и селекция клеток СБ 14+, СБ4+, СБ8+ и СБ 19+

3.1.5 Получение препаратов ДНК, РНК и кДНК

3.1.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.1.7 Подготовка стандартов для абсолютного количественного анализа

3.1.7.1 Клонирование в плазмиде

3.1.7.2 Отбор рекомбинантных ДНК 57 "ЗШ.Ре^шщш ДНК.58"

3.1.8 Секвенирование ДНК

3.1.9 Создание олигонуклеотидных систем для детекции методом ПЦР- 5 8 • РВ

3.1.10 Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени 59 (ПЦР-РВ)

3.1.11 Определение мутационного статуса генов иммуноглобулинов

3.1.11.1 Амплификация клонально-перестроенных генов вариабельного 63 региона иммуноглобулинов

3.1.11.2 Очистка ампликонов и определение их нуклеотидной 64 последовательности

3.1.12 Компьютерные программы

3.1.13 Статистический анализ

3.2 Результаты исследований и их обсуждение 68,

3.2.1 Предыстория работы

3.2.2 Разработка и тестирование набора реактивов для ПЦР-РВ

3.2.3 Анализ мутационного статуса вариабельного региона генов 82 иммуноглобулинов

3.2.4 Выбор референтного гена и генов, перспективных онкомаркеров В- 86 ХЛЛ

3.2!5 Оценка уровня транскрипции г"енов 24Р-70, ¿ВТВ20~ЪШ), МУСЫ. и ЬРЬ

3.2:6.АнадйТуровня^ тёиаъ^Р-70, ¿ВТВ20, ВАЮ, МУСЫ.91" и ЬРЬ в различных субпопуляциях клеток крови

3.2.7 Взаимосвязь уровня транскрипции генов ¿АР-70, ¿ВТВ20, ЪШ), 95 МУСЫ к ЬРЬ с мутационным статусом

3.2.8 Анализ «нетипичных» случаев В-ХЛЛ

3.2.9 Взаимосвязь уровня транскрипции генов ЬРЬ и ЪМЛ с 99 выживаемостью и другими прогностическими факторами

3.2.10 Обсуждение результатов 102 Заключение 117 Выводы 119 Список литературы

Список сокращений dNTP дезоксинуклеотидтрифосфат

LB среда Luria-Bertani

YT среда из триптона и дрожжевого экстракта

ТЕ трис-ЭДТА буфер

TBE трис-борат-ЭДТА буфер

IPTG изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

X-Gal 5-бром-4-хлор-3-индоксизил-Р-Б-галактозид

SDS додецилсульфат Na

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

БСА бычий сывороточный альбумин

B-XJIJI B-клеточный хронический лимфолейкоз i

OMJI острый миелоидный лейкоз

ОПЛ острый промиелоцитарный лейкоз

НЧК нормализованное число копий

FISH флуоресцентная in situ гибридизация (fluorescence in situ hybridization) array-CGH сравнительная геномная гибридизация на чипе (array comparative genomic hybridization)

ПМК/ГПС Периферические мононуклеарные клетки крови / периферическая кровь кДНК Комплементарная ДНК

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК Рибонуклеиновая кислота

МФ Мутационный фактор

ОПЛ Острый промиелоцитарный лейкоз в-хлл B-клеточный хронический лимфолейкоз хлл Хронический лимфолейкоз

ГЦ Терминальный центр зт Злокачественная трансформация

Введение Диссертация по биологии, на тему "Уровень транскрипции генов-онкомаркеров в клетках крови больных гемобластозом"

Лимфатические опухоли входят в группу самых распространенных опухолей у человека, а у детей занимают второе место по частоте. По данным статистических исследований в США, в последние десятилетия частота гемобластозов ежегодно возрастает на 4%. Причины этого роста не известны и одним из важных направлений современной науки стало изучение биологии лимфатических опухолей и улучшение их диагностики.

Одной из наиболее распространенных лимфатических опухолей является В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-XJIJI). Это заболевание характеризуется гетерогенностью течения. Продолжительность жизни больных колеблется от нескольких месяцев до десятков лет. Исследования последних лет позволили выявить несколько маркеров прогноза B-XJIJI. В частности, было показано, что прогноз заболевания зависит от уровня созревания клетки-предшественницы B-XJIJI, который определяется по состоянию вариабельного региона генов иммуноглобулинов. Исследование мутационного статуса генов иммуноглобулинов - дорогой и трудоемкий метод, мало приемлемый в практической медицине. В связи с этим необходимы другие маркеры, пригодные к использованною в клинической практике.

Альтернативным способом оценки прогноза B-XJTJI может быть анализ различий уровня транскрипции генов в вариантах В-ХЛЛ, отличающихся по мутационному статусу генов иммуноглобулинов. Так, было показано, что экспрессия ZAP-70 коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Благодаря наличию антител к ZAP-70 довольно быстро были разработаны тесты, позволяющие оценивать экспрессию ZAP-70 с помошыо проточной цитофлуориметрии. Однако, иммуногистохимическое исследование костного мозга антителом к ZAP-70 не надежно, поскольку этот ген сильно экспрессируется в Т-клетках, примесь которых у больных B-XJIJI может быть велика. По этой же причине пе падежна оценка уровня мРНК ZAP-70 методами полимеразной пепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ

ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ): такая оценка требует предварительной селекции В-лимфоцитов.

В последние годы в результате экспериментов с микрочипами составлен список генов, уровень транскрипции которых существенно различается в подгруппах больных В-ХЛЛ. Показано, что различия в уровне мРНК 1 некоторых из этих генов (DMD, ZBTB20, ZAP-70 и др.) довольно велики и относительно постоянны. Мы предположили, что эти гены могут использоваться в качестве дополнительных маркеров мутационного статуса иммуноглобулинов. Сам по себе анализ с помощью микрочипов вполне решает проблему прогнозирования течения В-ХЛЛ. Однако он еще более трудоемок, чем исследование мутационного статуса, дорог и не всегда надежен. Выборочная оценка наиболее значимых генов методом ПЦР в реальном времени при адекватных контролях представляет собой разумную альтернативу этому важному методу и может стать мощным оружием диагноза и прогноза.

Делью настоящей работы является определение уровня мРНК генов — потенциальных онкомаркеров в представительной группе больных В-ХЛЛ и доноров.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Создать высокочувствительную и надежную методику ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для точного количественного определения уровня мРНК генов.

2. Определить уровень мРНК генов эндогенного контроля (GAPDH, ТВР, 18S rRNA, HPRT1) в норме и хроническом лимфолейкозе.

3. Изучить и сравнить уровень мРНК генов - потенциальных онкомаркеров СZAP-70, DMD, ZBTB20, LPL и MYCN) в норме и хроническом лимфолейкозе.

4. Выбрать наиболее значимые генетические маркеры для разработки тест-системы прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза.

2 Обзор литературы

Неходжкинские лимфомы подразделяются на две главные категории: В-клеточные лимфомы, которые развиваются из аномальных В-лимфоцитов и Т-клеточные лимфомы, которые развиваются из аномальных Т-лимфоцитов. Частота неходжкинских лимфом за последние 20 лет удвоилось. Клинические проявления лимфом разнообразны, поскольку они могут расти практически в любом органе. Течение неходжкинских лимфом также бывает разным. Некоторые развиваются длительно, годами и десятилетиями, и даже не требуют лечения. Другие характеризуются более агрессивным течением. По клиническому течению неходжкинские лимфомы подразделяются на три категории: высоко-агрессивные, агрессивные и вялотекущие. Со временем, лимфомы могут приобретать более агрессивное течение. Это называется* трансформацией. В таком случае клетки иначе выглядят под микроскопом и заболевание хуже поддается лечению.

Клетки агрессивных лимфом делятся очень быстро. Лимфоузлы и органы, в которых растут агрессивные лимфомы быстро увеличиваются в размерах, симптомы болезни появляются относительно рано. Некоторые агрессивные лимфомы характеризуются особенно быстрым ростом - по дням и неделям. К ним относятся лимфома Беркитта, Т- и В-лимфобластные лимфомы. Они встречаются преимущественно у детей и молодых людей. У пожилых людей агрессивные лимфомы протекают медленнее. Пик заболеваемости приходится на 50 лет. Как и при болезни Ходжкина, мужчины заболевают чаще женщин.

Клетки вялотекущих лимфом делятся очень медленно. Основная причина их накопления состоит в том, что лимфоциты, выполнившие свою задачу по уничтожению возбудителя, не могут умереть. Вялотекущие лимфомы характеризуются длительным спокойным течением, но существенно менее чувствительны к химиотерапии. Заболевают, в основном, пожилые люди, чаще мужчины. Лимфоузлы и органы увеличиваются очень медленно, симптомы болезни появляются нескоро, иногда через несколько лет от начала болезни. Многие пациенты с вялотекущими лимфомами вообще не требуют лечения до тех пор, пока болезнь не вызывает проблем.

В дебюте далеко не всегда можно прогнозировать течение болезни. Слишком раннее начало лечения,- приводит к тому, что неоправданно накапливается токсичность химиотерапии, а это крайне нежелательно. У пациентов с лимфомами часто применяется лечебная тактика, которая называется «выжидательное наблюдение». Такой тактики придерживаются у больных с вялотекущими лимфомами и хроническим лимфолейкозом в случаях, когда болезнь не вызывает никаких симптомов и не ухудшает качество жизни. Такое состояние может длиться годами, иногда десятилетиями. Выжидательное наблюдение предполагает, что пациент регулярно проходит обследование. Это продолжается до тех пор, пока не появится серьезных проблем, связанных с болезнью. Если появляются признаки, свидетельствующие о прогрессии болезни, эту тактику прерывают и назначается какой-то вариант лечения.

Точная дифференциальная диагностика лимфом имеет принципиальное значение. Во-первых, потому, что опухоли, даже очень похожие клинически и; гистологически, могут радикально различаться по прогнозу. Во-вторых, если раньше выбор вариантов лечения, имевшийся в распоряжении докторов, был относительно не велик, то сегодня арсенал способов воздействия значительно расширен. Очень часто требуется дополнительное исследование — иммуногистохимия. При этом тонкий срез обрабатывают мечеными антителами против определенных молекул (CD). CD — кластеры дифференциации (cluster of differentiation) — это маркеры, которые имеются на? поверхности клеток, в том числе лимфоцитов. Определенная комбинация этих маркеров говорит о типе клеток, из которых возникла лимфома и позволяет поставить точный диагноз. Так, В-лимфоциты имеют на своей поверхности CD 19, CD20, CD22 и другие маркеры, а Т-лимфоциты CD3, CD4, CD8, CD5.

Соответственно, лимфомы, возникающие из них также несут эти маркеры. Анализ СО на клетках называется иммунофенотипирование, а анализ СО в ткани называется иммуногистохимия. Некоторые СО являются мишенями для< терапевтических антител. Так, С020 - мишень для антитела ритуксимаб (Мабтера), а СЭ52 - мишень для антитела СатраЙ1-1Н (алемтузумаб).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Малахо, Софья Гарифовна

Выводы

1. Создана высокочувствительная методика ПЦР-РВ с использованием оригинальных олигонуклеотидов, плазмидных стандартов и набора реактивов. На примере известного онкомаркера - гена MYCN показана возможность точного измерения копий генов и уровня мРНК в нейрогенных опухолях и хроническом лимфолейкозе.

2. Определена стабильность уровня транскрипции генов эндогенного контроля: GAPDH, HPRT1, 18S rRNA и ТВР у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ). Показано, что ген ТВР является наиболее надежным контролем для количественной оценки уровня мРНК генов-мишеней в клетках крови.

3. Впервые на большой выборке больных В-ХЛЛ (168 человек) проведен анализ уровня мРНК пяти генов - потенциальных онкомаркеров. Показана достоверная корреляция уровня мРНК генов липопротеинлипазы (ЬРЬ) и дистрофина (.DMD) с мутационным статусом гена иммуноглобулина и выживаемостью больных. На основании анализа отдельных субпопуляций клеток крови доказано, что повышение уровня мРНК гена ЬРЬ в периферической крови больных В-ХЛЛ происходит за счет фракции моноцитов.

4. Показано, что уровень мРНК трех потенциальных онкомаркеров (ZAP-70, MYCN и ZBTB20) не может использоваться для прогноза В-ХЛЛ. Корреляция уровня мРНК гена ZAP-70 с мутационным статусом гена иммуноглобулина выявлена только для фракции В-лимфоцитов. Уровень транскрипции генов ZBTB20 и MYCN по. различается у двух групп больных.

5. На представительной выборке больных определены критерии — пороговые значения уровня транскрипции генов ЬРЬ (НЧК = 0.4) и DMD (НЧК = 1), на основании которых возможно создание тест-системы прогноза В-ХЛЛ.

120

Заключение

Созданный на первом этапе работы набор реактивов для ПЦР-РВ «РиалитиТМ» надежен и удобен для количественного определения генов — потенциальных онкомаркеров лейкозов. Состав набора «РиалитиТМ» представлен полностью отечественными компонентами. Его можно использовать в качестве дешевой основы онкодиагностических наборов. В ходе работы создана и апробирована новая высокоспецифичная система олигонуклеотидов для измерения количества гена MYCN методом ПЦР-РВ. Результаты определения копийности гена MYCN методом ПЦР-РВ хорошо согласуются с данными, полученными классическими методами — FISH? и array-GGH. Таким образом, методом ПЦР-РВ с использованием набора "РиалитиТМ" и выбранных олигонуклеотидов возможно определение < уровней транскрипции и копийности онкогена MYCN в широком диапазоне* ч значений, включая добавки низкого уровня. Дополнительным

• преимуществом данного диагностикума является получение1 результата в 1 виде точных числовых данных, малое время анализа и низкая стоимость.

Для точного определения уровня транскрипции генов — потенциальных онкомаркеров гемобластозов созданы плазмидные стандарты. Они позволяют определять абсолютное количество копий целевых и контрольных фрагментов ДНК с высокой надежностью и корректно сравнивать результаты. Уровень мРНК гена ТВР измеряли как контрольный, так как была продемонстрирована высокая стабильность уровня его транскрипции в клетках B-XJIJI по сравнению с другими генами эндогенного контроля.

Проведено масштабное исследование уровня транскрипции пяти генов: ZAP-70, ZBTB20, MYCN, LPL и DMD на представительной коллекции образцов крови больных В-ХЛЛ (168 образцов). Полученные данные являются новыми, поскольку результаты опытов на микрочипах далеко не всегда подтверждаются для каждого конкретного гена. Ранее было показано, что мутационный статус коррелирует с экспрессией белка ZAP-70. В настоящее время ZAP-70 считается наиболее важным маркером прогноза В-XJIJL Оценка ZAP-70 является обязательным тестом в клинических испытаниях B-XJIJI. В наших исследованиях связь мутационного статуса IgVH с транскрипционным профилем гена ZAP-70 выявлена только в случае CD 19+ селектированных лимфоцитов. Показано, что уровень мРНК генов LPL и DMD достоверно коррелирует с мутационным статусом вариабельного региона IgVH как селектированных клеток CD 19+, так и периферической крови. Уровень мРНК генов липопротеинлипазы и дистрофина может быть маркером прогноза на ранних стадиях В-клеточного хронического лимфолейкоза. Выявленные «нетипичные» случаи B-XJIJI характеризовались высоким уровнем мРНК гена LPL и вариантом IgVmut+ с тяжелым течением заболевания. Таким образом, создана фундаментальная основа диагностической системы, которая позволяет на основании нормализованного отношения числа копий кДНК генов LPL и DMD к числу копий кДНК контрольного гена ТВР делать прогноз течения B-XJIJI.

119 4

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малахо, Софья Гарифовна, Москва

1. Schroeder H.WJr., Dighiero G. The pathogenesis of chronic lymphocyticleukemia: analysis of the antibody repertoire. Immunology Today. 1994. 15. P. 288-294.

2. Freedman A.S., Freeman G., Whitman J., Segil J., Daley J., Levine H., Nadler

3. M. Expression and regulation of CD5 on in vitro activated human B cells. Eur J Immunol. 1989. 19(5). P. 849-855.

4. Rai K.R., Sawitsky A., Cronkite E.P., Chanana A.D., Levy R.N., Pasternack B.S.

5. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1975. 46. P. 219234.

6. Binet J.L., Auquier A., Dighiero G., Chastang C., Piguet H., Goasguen J.,

7. Richter M.N. Generalized reticular cell sarcoma of lymph nodes associated withlymphatic leukemia. Am J Pathol. 1928. 6. P. 285-299.

8. Chemotherapeutic options in chronic lymphocytic leukemia: a meta-analysis ofthe randomized trials. CLL Trialists' Collaborative Group. J Natl Cancer Inst. 1999. 91(10). P. 861-868.

9. Dighiero G., Binet J.L. When and how to treat Chronic Lymphocytic Leukemia.

10. New England Journal4of Medicine. 2000. 343(24). P. 1799-1801.

11. Montillo M., Hamblin T., Hallek M., Montserrat E., Morra E. Chroniclymphocytic leukemia: novel prognostic factors and their relevance for risk-adapted therapeutic strategies. Haematologica. 2005. 90(3). P. 391-399.

12. Bosch F., Montserrat E. Refining prognostic factors in chronic lymphocyticleukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2002. 6(4). P. 335-349; discussion 449450.

13. Montserrat E., Sanchez-Bisono J., Vinolasi N., Rozman C. Lymphocytedoubling time in chronic lymphocytic leukemia: Analysis of its prognostic significance. Br J Haematol. 1986. 62.,P. 567-575.

14. Fais F., Ghiotto F., Hashimoto S., Sellars B., Valetto A., Allen S.L., Schulman

15. Dohner H., Stilgenbauer S., James M.R., Benner A., Weilguni T., Bentz M.,

16. Fischer K., Hunstein W., Lichter P. 1 lq deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal' involvement and inferior prognosis. Blood. 1997. 89. P. 2516-2522.

17. Cook G.P., Tomlinson I.M. The human immunoglobulin V(H) repertoire.1.munology Today, 1995. 16. P. 237-242.

18. Cook G.P., Tomlinson I.M., Walter G., Riethman H., Carter N.P., Buluwela L.,

19. Winter G., Rabbitts T.H. A map of the human- immunoglobulin VH locus completed by analysis of the telomeric region of chromosome 14q. 1994. Nat Genet. 7. P. 162-168.T

20. Walter M.A., Surti U., Hofker M.H., Cox D.W. The physical organization ofthe human immunoglobulin heavy chain gene complex. EMBO J. 1990. 9. P. 3303-3313.

21. MacLennan I. Immunology. The centre of hypermutation. Nature. 1991.354(6352). P. 352-353.

22. MacLennan I.C.M. Germinal centers. Annu Rev Immunol. 1994. 12. P. 117139.

23. Storb U. Molecular mechanism of somatic hypermutation of immunoglobulingenes. CurrOpin Immunol. 1996. 8. P. 206-214.

24. Storb U., Peters A., Klotz E., Kim N., Shen H.M., Kage K., Rogerson В.,

25. Martin Т.Е. Somatic hypermutation of immunoglobulin genes is linked to transcription. Curr Top. Microbiol Immunol. 1998. 229. P. 11-19.

26. Storb U., Klotz E.L., Hackett Jr.J., Kage K., Bozek G., Martin Т.Е. A

27. Hypermutable Insert in an Immunoglobulin Transgene Contains Hotspots of Somatic Mutation and Sequences Predicting Highly Stable Structures in the RNA Transcript. J Exp Med. 1998. 188(17). P. 689-698.

28. Kuppers R., Klein U., Hansmann M.L., Rajewsky K. Cellular origin of human

29. B-cell lymphomas. N Engl J Med. 1999. 341(20). P. 1520-1529.

30. Никитин E.A., Пивник A.B., Судариков А.Б., Валова Г.М., Габеева Н.Г.,

31. Самойлова Р.С., Иванов Д.В., Меликян А.Л., Ковалева Л.Г. Сравнение форм хронического лимфолейкоза в зависимости от мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Тер архив. 2000. 72(7). С. 52-56.

32. Matsuda F., Ishii К., Bourvagnet P., Kuma Ki., Hayashida H., Miyata Т., Honjo

33. T. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med. 1998. 188(11). P. 2151-2162.

34. Hamblin T.J., Davis Z., Oscier D.G., Stevenson F.K. Unmutatedimmunoglobulin VH genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999. 94. P. 1848-55.

35. Damle R.N., Wasil T., Fais F., Ghiotto F., Valetto A., Allen S.L., Buchbinder

36. Maloum K., Pritsch O., Magnac C., Vuillier F., Davi F., Troussard X., Mauro

37. F.F., Benichou J., Merle-Beral H., Dighiero G. Expression of unmutated VH genes is a detrimental prognostic factor in Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood. 2000. 96. P. 377-379.

38. Nikitin E.A., Lorie Iu.Iu., Melikian A.L., Samoilova R.S., Bulycheva T.I.,

39. Obukhova T.N., Kaplanskaia I.B., Doronin V.A., Kolosova L.Iu., Goriacheva S.R. Factors of an unfavorable prognosis in patients with B-cell chronic lymphoid leukemia: a retrospective analysis of 206 cases. Ter Arkh. 2003. 75(7). P. 38-47.

40. Nikitin E., Stadnik E., Bialik T., Baryah E., Sudarikov A., Volkova M.

41. Prognostic significance of VH mutational status in early stages of CLL. Leuk Lymphoma. 2003. 44(2). P. 37-38.

42. Plate J.M.D., Petersen K.S., Buckingham L., Shahidi H., Schofield C.M. Geneexpression in chronic lymphocytic leukemia B cells and changes during induction of apoptosis: Exp Hematol. 2000. 28. P. 1214 1224.

43. Gunz F.W., Fitzgerald P.H., Adams A. An abnormal chromosome in chroniclymphocytic leukaemia. Brit Med J. 1962. 2. P. 1097-1099.

44. Caspersson T., Zech L., Johansson C. Differential binding of alkylatingfluorochromes in human chromosomes. Exp Cell Res. 1970. 60. 315-319.

45. Tsujimoto Y., Yunis J., Onorato-Showe L., Erikson J., Nowell P.C., Croce

46. C.M. Molecular cloning of the chromosomal breakpoint of B-cell lymphomas and leukemias with the t(ll;14) chromosome translocation. Science. 1984. 224. P. 1403-1406.

47. Tsujimoto Y., Jaffe E., Cossman J., Gorham J., Nowell P.C., Croce C.M.

48. Clustering of breakpoints on chromosome 11 in human B-cell neoplasms with the t(l 1;14) chromosome translocation. Nature. 1985. 315: P. 340-343.

49. Dohner H., Stilgenbauer S., Benner A., et al. Genomic aberrations and survivalin chronic lymphocytic leukemia. New Eng. J Med. 2000. 343. P. 1910c.1916. .

50. Calin G.A., Trapasso F., Shimizu M., Dumitru C.D., Yendamuri S., Godwin

51. Conley C.L., Misiti J., Laster A J. Genetic factors predisposing to chroniclymphocytic leukemia and to autoimmune disease. Medicine. 1980. 59. P. 323-334.

52. Goldin L.R., Pfeiffer R.M., Li X., Hemminki K. Familial risk oflymphoproliferative tumors in families of patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the Swedish Family-Cancer Database. Blood. 2004. 104. P. 1850-1854.

53. Staudt L.M. Molecular diagnosis of the hematologic cancers. New Eng J Med.2003. 348. P. 1777-1785.

54. Calin G.A., Sevignani C., Dumitru C.D., Hyslop T., Noch E., Yendamuri S.,

55. Shimizu M., Rattan S., Bullrich F., Negrini M., Croce C.M. HumanmicroRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Nat Acad Sci. 2004. 101. P. 2999-3004.

56. Calin G.A., Dumitru C.D., Shimizu M., Bichi R., Zupo S., Noch E., Aldler H.,

57. Rattan S., Keating M., Rai K., Rassenti L., Kipps T., Negrini M., Bullrich F., Croce C.M. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Nat Acad Sci. 2002. 99. P. 15524-15529.

58. Cimmino A., Calin G.A., Fabbri M:, Iorio M:V., Ferracin M., Shimizu M:,

59. Wojcik S.E., Aqeilan R.I., Zupo S., Dono M., Rassenti L., Alder H., Volinia S., Liu G., Kipps T.J;, Negrini M., Croce C.M. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Nat Acad Sci. 2005. 102. P. 1394413949.

60. Stratowa C., Loffler G., Lichter P., Stilgenbauer S., Haberl P., Schweifer N.,

61. Dohner H., Wilgenbus K.K. CDNA microarray gene expression analysis of B-cell' chronic lymphocytic leukemia proposes potential new prognostic markers involved in lymphocyte trafficking. Int J Cancer. 2001. 91(4). P. 474-480.

62. Klein U., Tu Y., Stolovitzky G.A., Mattioli M., Cattoretti G., Husson H>,

63. Freedman A., Inghirami G., Cro L., Baldini L., Neri A., Califano A., Dalla-Favera R. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med. 2001. 194. P. 1625-1638.

64. Wiestner A., Rosenwald A., Barry T.S., Wright G., Davis R.E., Henrickson

65. Crespo M., Bosch F., Villamor N., Bellosillo B., Colomer D., Rozman M.,

66. Marce S., Lopez-Guillermo A., Campo E., Montserrat E. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulinvariable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 2003: 348. P. 1764-1775.

67. Rosenwald A., Staudt L.M. Clinical translation of gene expression profiling inlymphomas and leukemias. Semin Oncol: 2002. 29(3). P. 258-263:

68. Plate J.M.D., Petersen K.S., Buckingham L., Shahidi H., Schofield C.M, Gene.expression in chronic lymphocytic leukemia B cells and changes during induction of apoptosis. Exp Hematol. 2000. 28. P. 1214 1224.

69. Rassenti L.Z., Huynh L., Toy T.L., Chen L., Keating MJ., Gribben J.G.,

70. Shin L.Y., Kuo M.Ch., Liang D.Ch., Huang C.F., Lin T.L., Wu J.H., Wang

71. Walker G.T., Little M.C., Nadeau J.G., Shank D.D. Isothermal in vitroamplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89(1). P. 392-396.

72. Chantratita W., Pongtanapisit W., Piroj W., Srichunrasmi C., Seesuai S.

73. Romano J.W., Williams K.G., Shurtliff R.N., Ginocchio C., Kaplan M. NASBAtechnology: Isothermal RNA* amplification in qualitative and quantitative diagnostics. Immunol Invest. 1997. 26(1-2). P. 15-28.

74. Heid C.A., Stevens J., Livak K. J., Williams P.M. Real time quantitative PCR.

75. Genome Res. 1996. 6(10). P. 986-994.

76. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specificpolymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Acad Sci. 1991. 88. P. 7276-7280.

77. Манзенюк О.Ю., Москалец O.B. Бурдакова Ю.А., Сучков G.B.

78. Молекулярное типирование в клинической диагностике. Биопрепараты. 2002.3. С. 16-18.

79. Gabert J., Beillard Е., van der Velden V.H., Bi W., Grimwade D., Pallisgaard

80. N., Barbany G., Cazzaniga G., Cayuela J.M., Cavé H., Pane F., Aerts J.L., De Micheli D., Thirion X., Pradel V., González M., Viehmann S., Malee M.,

81. Szabo A., Pérou C.M.j.Karaca M., Perreard L., Quackenbush J.F., Bernard P.S.

82. Statistical modeling for selecting housekeeper, genes. Genome Biol. 2004. 5(8). R59.

83. Lossos I.S., Czerwinski D.K., Wechser M.A., Levy R. Optimization ofquantitative real-time RT-PCR parameters for the study of lymphoid: malignancies. Leukemia. 2003. 17. P; 789-795.

84. Zhang X., Ding L., Sandford A. Selection of reference genes for geneexpression studies in human neutrophils by real-time PCR. BMC Molecular Biology. 2005. 6:4.

85. Cheson B.D., Bennett J.M., Grever M., Kay N., Keating M.J., O'Brien S., Rai

86. K.R. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for . diagnosis and treatment. Blood. 1996. 87. P. 4990-4997.

87. Korshunov A., Sycheva R., Gorelyshev S., Golanov A. Clinical utility offluorescence in situ hybridization (FISH) in nonbrainstem glioblastomas of childhood. Mod Pathol. 2005. 18. P. 1258-1263.

88. Korshunov A., Sycheva» R., Golanov A. Genetically distinct and- clinicallyrelevant subtypes of glioblastoma defined, by array-based comparative genomic hybridization (array-CGH). Acta Neuropathol. 2006. 111. P. 465474.i

89. MicroPulser Electroporation Apparatus Operating Instructions and Applications

90. Guide. Bio-Rad Laboratories.

91. Primer Express User Bulletin (P/N 4317594). Applied Biosystems.

92. Creating Standard,Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for

93. Use in Quantitative PCR. 2003. Applied Biosystems.

94. Гланц С. Медико-биологическая статистика. 1999. М.: Практика.

95. Azeri B., Xing W., Sorge J.A., Hogrefe H.H. Amplification efficiency ofthermostable DNA polymerases. Analyt. Biochem. 2003. 321. P. 226-235.

96. Wolf P., Grage H., Hagberg O., Radstromom P. Impact of DNA polymerasesand the buffer systems on quantitative real time PGR. J of Clin. Microbiol. 2004. 42(1). P. 408-411.

97. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A.,

98. Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002. 3(7). P. 0034.1-0034.11.

99. Tajiri T., Tanaka S., Shono K., Kinoshita Y., Fujii Y., Suita S., Ihara K., Hara

100. T. Quick quantitative analysis of gene dosages associated with prognosis in neuroblastoma. Cancer Lett. 2001. 166(1). P. 89-94.

101. Spitz R., Hero B., Skowron M., Ernestus K., Berthold F. MYCN-status inneuroblastoma: characteristics of tumours showing amplification, gain, and non-amplification. Eur J Cancer. 2004. 40(18). P. 2753-2759.

102. Chen Q-R., Bilke S., Wei J.S., Whiteford C.C., Cenacchi N., Krasnoselsky

103. A.L., Greer B.T., Son C-G., Westermann F., Berthold F., Schwab M., Catchpoole D., Khan J. cDNA array-CGH profiling identifies genomic alterations specific to stage and MYCN-amplification in neuroblastoma. BMC Genomics. 2004. 5:70.'

104. Pinkel D., Segraves R., Sudar D„ Clark S., Poole I., Kowbel D., Collins C.,

105. Kuo W.L., Chen C., Zhai Y., Dairkee S.Hi, Ljung B.M., Gray J.W., Albertson D.G. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat Genet. 1998. 20(2). P. 207-211.

106. Tajiri T., Tanaka S., Shono K., Kinoshita Y., Fujii Y., Suita S., Ihara K., Hara

107. T. Quick quantitative analysis of gene dosages associated with prognosis in neuroblastoma. Cancer Lett. 2001. 166(1). P. 89-94.

108. Raggi C.C., Bagnoni M.L., Tonini G.T., Maggi M., Vona G., Pinzani P.,

109. Mazzocco K., De Bernardi B., Pazzagli M., Orlando C. Real -Time Quantitative PCR for the Measurement of MYCN Amplification in Human Neuroblastoma with the TaqMan Detection System. Clin Chem. 1999. 45(11). P. 1918-1924.

110. De Preter K., Speleman F., Combaret V., Lunec J., Laureys G., Eussen B.H.,

111. Francotte N., Board J., Pearson A.D., De Paepe A., Van Roy N., Vandesompele J. Quantification of MYCN, DDX1, and NAG gene copy number in neuroblastoma using a real-time quantitative PCR assay. Mod Pathol. 2002. 15(2). P. 159- 166.

112. Gallego S., Reventos J., Detoledo J.S., Munell F. Differential polymerase chainreaction with serial dilutions for quantification of MYCN gene amplification in neuroblastoma. Anticancer Res. 1998. 18(2A). P. 1211-1215.

113. Boensch M., Oberthuer A., Fischer M., Skowron M., Oestreich J., Berthold F.,

114. Spitz R. Quantitative real-time PCR for quick simultaneous determination of therapy-stratifying markers MYCN amplification, deletion lp and llq. DiagnMol Pathol. 2005. 14(3). P. 177-82.

115. Fruhwald M.C., O'Dorisio M.S., Rush L.J., Reiter J.L., Smiraglia D.J., Wenger

116. G., Costello J.F., White P.S., Krahe R., Brodeur G.M., Plass C. Gene amplification in PNETs/medulloblastomas: mapping of a novel amplified gene within the MYCN amplicon. J Med Genet. 2000. 37(7). P. 501-509.

117. Bayani J., Zielenska M., Marrano P., Kwan Ng.Y., Taylor M.D., Jay V., Rutka

118. J.T., Squire J.A. Molecular cytogenetic analysis of medulloblastomas and supratentorial primitive neuroectodermal tumours by using conventional banding, comparative genomic hybridization, and spectral karyotyping. J Neurosurg. 2000. 93(3). P. 437-448.

119. Schwab M., Corvi R., Amler L. N-MYC Oncogene amplification: aconsequence of genomic instability in human neuroblastoma. The Neuroscientist. 1995. 1(5). P. 277-285.

120. Knoepfler P.S., Cheng P.F., Eisenman R.N. N-MYC is essential duringneurogenesis for the rapid expansion of progenitor cell populations and the inhibition of neuronal differentiation. Genes Dev. 2002. 16. P. 2699-2712.

121. Kleihues P., Cavenee W.K. Tumors of the Nervous System. Pathology and

122. Genetics: World Health Organization International Classification of Tumours. Lyon, France: WHO/IARC, 2000.

123. Jay V., Edwards V., Hoving E., Rutka J., Becker L., Zielenska M., Teshima I.

124. Central neurocytoma: morphological, flow cytometric, polymerase chain reaction, fluorescence in situ hybridization, and karyotypic analyses. J Neurosurg. 1999. 90(2). P. 348-354.

125. Tong C.Y., Ng H.K., Pang J.C., Hu J., Hui A.B., Poon W.S. Centralneurocytomas are genetically distinct from oligodendrogliomas and ' neuroblastomas. Histopathology. 2000. 37(2). P. 160-165.

126. Korshunov A., Sycheva R., Golanov A. Recurrent cytogenetic aberrations, incentral neurocytomas and their biological relevance. Acta NeuropathoU 2007. 113(3). P. 303-12.

127. Corvi R., Savelyeva L., Schwab M. Duplication of N-MYC at its resident site2p24 may be a mechanism of activation in human neuroblastoma cells. Cancer Res. 1995. 55. P. 3471-3474.

128. Tanaka S., Tajiri T., Noguchi S., Shono K., Ihara K., Hara T., Suita S. Clinical

129. Significance of a Highly Sensitive Analysis for Gene Dosage and the Expression Level of MYCN in Neuroblastoma. J Pediatr Surg. 2004. 39(1). P. 63-68.

130. Dallas P.B., Gottardo N.G., Firth MJ., Beesley A.H., Hoffinann К., Тепу P.A.,

131. Freitas J.R., Boag J.M., Cummings A.J., Kees U.R. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR how well do they correlate? BMC Genomics. 2005. 6:59.

132. Anderson J., Gibson S., Williamson D., Rampling D., Austin C., Shipley J.,

133. Sebire N., Brock P. Rapid and accurate determination of MYCN copy number and lp deletion in neuroblastoma by quantitative PCR. Pediatr Blood Cancer. 2006. 46(7). P. 820-824.

134. Mehes G., Kovacs G., Kajtar В., Lacza A., Varnai A., Losonczy H., Pajor L.

135. Karyotype complexity and VH gene status in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica. 2006. 91(10), P. 1430-1431.

136. Stilgenbauer S:, Sander S., Bullinger L., Benner A., Leupolt E., Winkler D.,

137. Krober A, Kienle D., Lichter P., Dohner H. Clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia: acquisition of high-risk genomic aberrations associated with unmutated VH, resistance to therapy, and short survival. Haematologica. 2007. 92(9). P. 1242-1245.

138. Francis S., Karanth M., Pratt G., Starczynski J., Hooper L., Fegan C., Pepper

139. C., Valcarcel D., Milligan D.W., Delgado J:.The effect of immunoglobulin VH gene mutation status and other prognostic factors on the incidence of major infections in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 2006. 107(5). P. 1023-1033.

140. Krober A., Benner A., Buhler A., Dohner H., Stilgenbauer S. Multivariatesurvival analysis of specific VH-genes in CLL: VH3-21 and VH3-23 are prognosic factors independently of the VH mutation status. Blood. 2002. 100.196a.

141. Tobin G., Thunberg U., Karlsson K., Murray F., Laurell A., Willander K.,

142. Thorselius M., Krober A., Murray F., Thunberg U.} Tobin G., Biihler A.,

143. Fait S., Merup M., Tobin G., Thunberg U., Gahrton G., Rosenquist R.,

144. Wennborg A. Distinctive gene expression pattern in VH3-21 utilizing B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2005. 106(2). P. 681-689.

145. Turgut B., Vural O., Pala F.S., Pamuk G.E., Tabakcioglu K., Demir M.,

146. Ongoren S., Soysal T., Algune§ C. 17p Deletion is associated with resistance of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells to in vitro fludarabine-induced apoptosis. Leuk Lymphoma. 2007. 48(2). P. 311-320.

147. Morabito F., Damle R.N., Deaglio S., Keating M., Ferrarini M., Chiorazzi N.

148. The CD38 ectoenzyme family: advances in basic science and clinical practice. Mol Med. 2006. 12(11-12). P. 342-344.

149. Crespo M., Bosch F., Villamor N., Bellosillo B., Colomer D., Rozman M.,

150. Marce S., Lopez-Guillermo A., Campo E., Montserrat E. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. New Eng J Med. 2003. 348. P. 1764-1775.

151. Haslinger C., Schweifer N., Stilgenbauer S., Dohner H., Lichter P., Kraut N.,

152. Stratowa C., Abseher R. Microarray Gene Expression Profiling of B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia Subgroups Defined by Genomic

153. Aberrations and VH Mutation Status. J Clin Oncol. 2004. 22(19). P. 39373949.

154. Byrd J.C., Stilgenbauer S., Flinn I.W. Chronic lymphocytic leukemia.

155. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2004. P. 163-183.

156. Zhang W., Mi J., Li N., Sui L., Wan T., Zhang J., Chen T., Cao X.1.entification and characterization of DPZF, a novel human BTB/POZ zinc finger protein sharing homology to BCL-6. Biochem Biophys Res Commun. 2001.282. P. 1067-1073.

157. Crespo M., Bosch F., Villamor N., Bellosillo B., Colomer D., Rozman M.,

158. Mareé S., López-Guillermo A., Campo E., Montserrat E. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2003. 348(18). P. 1764-1775.

159. Chelly J., Kaplan J.-C., Maire P., Gautron S., Kahn A. Transcription of thedystrophin gene in human'muscle and non-muscle tissues. Nature. 1988. 333. P. 858-860.

160. Chelly J., Concordet J.-P., Kaplan J.-C., Kahn A. Illegitimate transcription:transcription of any gene in any cell type. Proc Nat Acad Sei. 1989. 86. P. 2617-2621.

161. Sarkar G., Sommer S.S. Access to a messenger RNA sequence or its proteinproduct is not limited by tissue or species specificity. Science. 1989. 244. P. 331-334.

162. Heintel D., Kienle D., Shehata M., Kröber A., Kroemer E., Schwarzinger I.,

163. Oppezzo P., Vasconcelos Y., Settegrana C., Jeannel D., Vuillier F., Legarff

164. Chen L., Widhopf G., Huynh L., Rassenti L., Rai K.R., Weiss A., Kipps T.J.

165. Expression of ZAP-70 is associated with increased B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002. 100. P. 4609-4616.

166. Pierce S.K. Lipid rafts and B-cell activation. Nat Rev Immunol. 2002. 2(2). P.96.105.

167. Chan A.C., Iwashima M., Turck C.W., Weiss A. ZAP-70: a 70 kd proteintyrosine kinase that associates with the TCR zeta chain. Cell. 1992. 71. P. 649-662.

168. Sasahara Y., Rachid R., Byrne M.J., de la Fuente M.A., Abraham R.T.,

169. Ramesh N., Geha R.S. Mechanism of recruitment of WASP to the immunological synapse and of its activation folio wing. TCR ligation. Molec Cell. 2002. 10. P. 1269-1281.

170. Mead J.R., Irvine S.A., Ramji D.P. Lipoprotein lipase: structure, function,regulation, and role in disease. J Mol Med. 2002. 80(12). P. 753-769.