Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция транскрипции гена фактора некроза опухолей человека в моноцитах и макрофагах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции гена фактора некроза опухолей человека в моноцитах и макрофагах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю-А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.21

УДАЛОВА Ирина Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА В МОНОЦИТАХ И МАКРОФАГАХ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

. О*

Работа выполнена в группе 'Молекулярная биология иитокиноп* Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарлта Российской Академии Наук (г. Москва), в американском отлелении совместной российско-американской лаборатории 'Молекулярная биология иитокиноп" (Национальный Раковый Институт США, г. Фредерик, шт. Мериленд) и в лаборатории химии генов Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. ММ. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова Российской Академии Наук (г. Москва).

Научный руководитель:

доктор биологических наук СЛ. Нелоспасов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор П.М. Рубцов

кандидат биологических наук Е.И. Фролова

Ведущая организация:

Институт биологии гена Российской Академии Наук

на заседании специализированного совета Л 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ Овчинникова РАН по адресу: 117871. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. МЛ!. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН.

Зашита диссертации состоится

1995 г. в

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ВА. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цнтокинами называются белки, обладающие регуляторными функциями, которые проявляются в их ауто-, пара- и эндокринном действиях путем взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Результатом подобных взаимодействий являются активация, дифферениировка или уничтожение клеток-мишеней. Фактор некроза опухолей (ФНО) - цитокин, продуцируемый, в основном, макрофагами, хотя известны и другие типы клеток, способных к его экспрессии (см. обзоры Beutler & Cerami, 1989; Fiers, 1991; Beutler & Grau, 1993; Beyaert & Fiers, 1993). Первоначальный интерес к ФНО был обусловлен проявляемым им антиопухолевым действием In vitro и In vivo. После клонирования гена ФНО и очистки кодируемого им рекомбинштиого белка стало понятно, что биологическое действие ФНО распространяется и на нормальные клетки. Изучение токсического действия бактериальных эндотоксинов на клетки привело к пониманию роли ФНО в возникновении токсического шока и сепсиса. Применение ФНО в терапии рака ограничено, прежде всего, возникающей при высоких дозах ФНО системной токсичностью. Значительный уровень циркулирующего ФНО наблюдался также у больные церебральной малярией, причем терапия с использованием антител X ФНО способствовала уменьшению церебральных осложнений. Кроме того, ФНО играет роль в патофизиологических событиях, наблюдающихся при ряде аутоиммунных заболеваний (например, развитие ревматоидного артрита). С другой стороны, неоднократно было показано, что ФНО в соответствующих небольших дозах является важным медиатором защитной реакции организма при различных инфекциях. Таким образом, ФНО может проявлять как защитные, так и вредные эффекты в зависимости от продуцируемого количества и периода времени, в течение которого эта продукция поддерживалась. Поэтому для применения ФНО в медицине необходимо понимание молекулярных механизмов биосинтеза ФНО и процессов, регулируемых его белковым продуктом.

Экспрессия гена ФНО регулируется на всех уровнях передачи информации: на уровне транскрипции, процессинга и времени жизни мРНК, трансляции и посттрансляционно. Ранее было показано, что обработка макрофагов различными активаторами приводит к быстрой активации транскрипции гена ФНО. Однако попытки функционально охарактеризовать регуляторные элементы предпромоторной области гена ФНО приводили к неоднозначным результатам. Более того, существовали прямые противоречия между результатами исследований промоторов генов ФНО кыш и человека, обладающих высокой гомологией.

Цель и задачи работы

Цель данного исследования состояла в изучении индукции транскрипции гена ФНО человека в моноцитах и макрофагах различными активаторами и в определении роли отдельных регуляторкых элементов предпромоторной области гена ФИО человека в регуляции его транскрипции. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние различных активаторов на уровень экспрессии гена ФНО человека в системе костно-мозговых макрофагов мыши и зрелых моноцитов человека.

2. Определить участки предпромоторной области гена ФНО человека, необходимые для обеспечения индуцированной транскрипции гена при действии различных активаторов, и функционально охарактеризовать регуляторные элементы, расположенные в этих участках.

3. Определить белковый состав комплексов, связывающихся с регуляторными элементами из предпромоторной области гена ФНО в ядерных экстрактах из моноцитов и макрофагов.

4. Охарактеризовать биохимические компоненты путей передачи внутриклеточных сигналов, приводящих к активации гена ФНО в моноцитах и макрофагах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Систематически исследовано влияние различных активаторов на уровень экспрессии гена ФНО человека в моноцитах (линия клеток Mono Mac б) и макрофагах (линия клеток ANA-1). Получен набор уникальных гашо-инжеиерных конструкций (5'-делеционные и сайт-специфические мутанты предпромоторной области гена ФНО человека), позволивший выявить участки промотора гена ФНО, необходимые для его индуцированной транскрипции. Функционально охарактеризованы регуляторные элементы, расположенные в этих участках, и определен белковый состав комплексов, связывающихся с этими регуляторными элементами. Показана основная роль белков семейства NF-kB/RcI в индуцированной липополисахаридом (LPS) транскрипции гена ФНО человека, чем снято противоречие между результатами предшествующих исследований промоторов генов ФНО мыши и человека. Изучена активация гена ФНО в моноцитах и макрофагах форболовыми эфирами (РМЛ), показано участие протеинкиназы С в одном из механизмов передачи внутриклеточных сигналов, приводящих к индуцированной транскрипции гена ФНО.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: симпозиум Транскрипция: факторы, регуляция и дифференцировка* (Кистоун, США, январь 1993), 9 Международный симпозиум по онкогенам (Фредерик, США, июнь 1993), 58 Симпозиум по количественной биологии (Кола Спринт Харбор, США, июнь 1993), конференция Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарлт» РАН с участием International Advisory Board (Москва, декабрь 1993), 5 Международный конгресс по ФНО (Монтерей, США, июнь 1994).

Публикация

По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем я структура работы

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает в себя 160 источника, работа проиллюстрирована 19 рисунками и 3 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование влиянии различных активаторов на уровень

экспрессии тепа ФНО в мопопитах и макрофагах Аля проведения исследований по регуляции транскрипции гена ФНО человека в моноцитах/макрофагах были выбраны две молельные линии клеток: иммортализовакные макрофаги мыши линии ANA-1, полученные из костного мозга мыши в результате трансформации ретровирусом (Сох et.al., 1989), и моноциты человека линии Mono Mac 6, полученные из периферической крови пациента с монобластической лейкемией и проявляющие феиотипичесхие и функциональные свойства зрелых моноцитов (Ziegler-Heitbroclc et.al., 1988).

Для проверки влияния различных активаторов на уровень экспрессии гена ФНО в этих клетках применяли метод Northern-гибридизации. В качестве активаторов использовались LPS, PMA и рекомбинантный ФНО человека (hTNF).

—mTNF

Рис. 1. Анализ экспрессии мРНК ФНО методам Northern-гибридизаигш в клетках линий ANA-1 (А) и Mono Mac 6 (В).

—hTNF

В

Суммарную клеточную РНК (15 мхг) фракционировали в 2.42 ¡нарезном геле с формальдегидам и переносили на нейлоновую мембрану НуЬоп<1 N. В качестве гибридизационньа проб использовали фрагменты 4 экзона генов ФНО мыши и человека.

Обработка клеток LPS и hTNF приводила к 30- и 10-кратаому усилению сигнала (Рис. 1). При обработке РМЛ усиление сигнала было выше для клеток линии Mono Mac 6, чем для ANA-1 (соотвествснно, в 10 и в 4 раза). Кроме того, комбинированная обработка клеток Mono Mac 6 LP? и PMA приводила к дополнительному повышению уровня экспрессии гена. Аля всех использованных активаторов уровень мРНК был выше через 2 часа после активации, чем через 24 часа, что свидетельствовало о кратковременном характере экспрессии гена ФНО.

На основании полученных данных, был сделан вывод о существовании регулируемой транскрипции гена ФНО человека в исследуемых линиях клеток и/или стабилизации мРНК при обработке клеток активаторами. Ранее для линии АМ-1 существование регулируемой транскрипции было показано непосредственным анализом скорости транскрипции в изолированных ядрах клеток.

2. Аелецноннын анализ промотора гена ФНО человека Промотор гена ФНО человека имеет сложную модульную структуру, в нем расположены пять потенциальных сайтов связывания Г^-кВ/Яе!, в том числе и консервативные 0сВ1, кВ2, кВ2а и СК-1), а также сайты связывания белков других семейств транскрипционных факторов (ЕСЯ-1, ЛП^-НЛ, ЕТС и др.) (Рис. 2).

кВ2

-670 ТСССССТСАСААТСАААСААСААССССТСССССАСТССССТСТСТСААТТ

к В 2а

-620 ССССССССТСАПТСАСТСССССССССТСТСССАСССТТСТСССТССТАС

-570 ССССАСССАСССТТТССТСАССССТСААОССТСССАССААССССССАССТ

-520 ССТТСТССССОСАСАССССАААСАСАССССТСАССАСТСААСАСАССТТТ

ЫГ-11.6-11ке

-470 ТСССТССААССССС11ЧЧСТСТСССТСААСССАСТСАССТГГСТСААССС

-420 ССТСССАСТТСТАСТТСТАТС11111ССТССАТССТСТСТССААСТТАСА

-370 АССАААСАСАССАСАСАССТССТССССААААСАААТССАСССААТАССТГ а '-308'

-320 ТТСАСССССАТС«ССАСССССТТСАСССТССАСССТССТАСАСАСАААТС

ТЯБ а *-238'

-270 АСТСАОТСССССАСААСАССССССТСОСААТС£САССАОССАССАТОССС

СК-1 ОТ-11.6

-220 АСТСТСАОССОТЛТССТТСЛТССТТСТОТСТССССЛЛСТТГССЛЛАТССС

еся-1

-170 ССССССССССАТОСАСААСАААСССАСАСАСААССТССАССССССАСТАС

ОТ-И.6-111се АТТ/ Егв-1 СПЕВ (сВЗ'

-120 СССТТССТССАСАТСЛССГСАТСССТТТСТССАССААССААСТТТТСССС

Эр1 ТАТА-Ьох

-70 ТССТТСААТСАТТСТТТССССССССТССТСТССССССАСССАСАТАТААА

САР-.Ие (4-1)«

-20 ОССАОТТСТТСССАСАСССАСССАССАСАСССТСССТСАССААССАСАСС

Рис. 2. Последовательность нукяеотидов проксимальной части проииагора гена ФНО человека. Обозначены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов и природные мутации. Сайт кВ1 (ССССАССССС, -873 пн) не показан.

Чтобы исследовать роль отдельных сайтов связывания транскрипционных факторов в регуляции транскрипции гена ФНО человека, был приготовлен набор конструкций, содержащих фрагменты убывающей длины прсдпромоторной области гена ФНО человека, присоединенные к гену-репортеру (бактериальной хлорамфеникол-аиетилтрансферазы - CAT) (Рис. ЗА и ЗВ) в плазмидном векторе pSVOcat (FYomega). Способность таких конструкций (pSVOcat/TNFprom.) активировать экспрессию гена-репортера проверяли после трансфекции в клетки ANA-1 и

Mono Mac 6.

EcoRI(2120)

LT-a TNF

BarnHI(2851) , AAAA

EcoRI(4253) HindllI(0/4505)

Hindm [+130J

B.

c.

-1142

•90S

"S

g

+88-С

= S Щ Ц Ц. 5? ^ î? 8 S ?

Рисунок 3.

A. Схематическая карта модифицированной плахииды pSVOcat, содержащей полный промотор гена ФНО человека (конструкция '-1173').

B. Схема Б'-делеицоммьа мутантов промотора хна ФНО человека.

C. Анализ активности CAT в клетках линии ANA-1, трансфеинрованных плазмидами серии pSVOcat/TNFprom, и индуцированных LPS (черные столбики), РМА (штрихованные столбики) или неиндуимрованньа (открытые столбики), проводили по стандартному протоколу с использованием в качестве субстрата

С-хлорамфеникала. Количественную обработку результатов САТ-смошзв проводили на двумерной анализаторе радиоактивного излучения Ambis.

Результаты измерений активности CAT в клетках мышиных макрофагов линии ÀNA-1 приведены на рис. ЗС.

Конструкция '-Ц73', содержащая полный промотор, была функционально активной, т.е. при индукции LPS и РМЛ уровень экспрессии гена-репортера повышался в 50-100 и S-10 раз, соответственно. Последовательное удаление нуклеотндов с 5'-ко«ца прсдпромоторной области приводило к снижению, а затем -к полной отмене индуцированной экспрессии гена-репортера. Из рис. ЗС очевидно наличие двух "ступеней* (слагаемых) активации транскрипции по мере увеличения прсдпромоторной области гена: первой (низкой) - приблизительно совпадающей по уровню активации для LPS и РМЛ, и, вероятно, опосредованной регуляторнымн элементами, расположенными между -109 и -284 пн промотора; И* второй (высокой) - появляющейся только при активации LPS, обусловленной дополнительными регуляторными элементами в области между -442 и -656 пн промотора. Исследование экспрессии гена-репортера в полученных конструкциях при индукции рекомбинантным ФНО человека показало наличие двух 'ступеней' индукции, как и в случае LPS.

Результаты измерения активности гена-репортера при трансфекции набора делеционных конструкций в клетки Mono Mac 6 при активации LPS не противоречили результатам, полученным ранее для клеточной линии ANA-1.

3. Сайт-специфический му-гагевез промотора гена ФНО человека

Второй систематический подход к определению роли отдельных регуляторных элементов из предпромоторной области гена ФНО человека в LPS- и РМА-индуцированной активации транскрипции состоял во введении сайт-специфических мутаций в потенциальные участки связывания транскрипционных факторов в составе конструкции '-U73'.

При выборе мутаций мы стремились полностью устранить возможность взаимодействия транс-активирукнцих факторов с узнаваемыми ими нуклеотидными сайтами связывания. С этой целью в каждом сайте связывния для мутаций выбирались лишь те нуклеотнды, которые на основании опубликованных ранее работ являлись существенными для формирования ЛНК-белковых комплексов. По сравнению с методом 5'-концевых делений настоящий подход должен был позволить нам удалить отдельные регуляторные элементы, принимающие участие в активации транскрипции гена ФНО человека в произвольном порядке, а не последовательно. На рис. 4 показаны использованные в данной работе мутантные конструкции. Эти конструкции функционально анализировали в опытах по измерению активности CAT после трансфекции клеток ANA-I (Рис. 5).

wild type (-1173) NT-tB ft /> tlà CI-1 tr -fr-

-И-

NF-IL6 mat

-0-M-

Jcfl/Z rout

-JH-

kBfZa mill

CK-1 mut

-!-

EGR-1 mut

w-

■ILS EGR-1 ТЛ

слт.>

ТД

■ a

СТТТССЛЛЛ

-МО-Ф-+Сслт > СТСЛЛТТССС

и

сссестстсс

и

сссстлт сст

-Otf-0-H СЛТ CGCCCCCGC

-«ИЙ-СёлйО

1гВ#3' rout

-1-M-

kB#2, кВ#2а, СК-1 mut

-(h—-»-ЖЬ»-К_!=дО>

ta

GGGTTTCTCC

Рисунок 4. Cmu конструкций, содержащих саОт-спеицфические мутанты участков связывании транскрипционных факторов в промоторе гена ФИО человека.

Оказалось, что ряд. регуляторных элементов - кВ сайты кВ2 и кВ2а, сайт СК-1, сайт EGR-1 и NF-JL6 - были необходимы для полной индукшш транскрипции гена-репортера при активации LPS, так как мутации в любом из этих сайтов с точностью до ошибок измерений приводили к уменьшению активности CAT. Наибольший эффект в случае активации LPS наблюдался при устранении сайтов кВ2а и СК-1 (понижение активности в 8 раз по сравнению с контролем - конструкцией, содержавшей неизмененный полный промотор (wt)). Мутация в сайте кВ2 в 3 раза снижала активность контрольной конструкции, EGR-1 и NF-IL6 - примерно на 157.. Мутация сайта кВЗ' не приводила к снижению функциональной активности конструкции.

При активации транскрипции РМЛ мутация лишь в одном регуляторном элементе, сайте EGR-1, приводила х значительному (до 10 раз) палению уровня транскрипции (Рис. S). Изменение остальных слитон не приводило к уменьшению РМЛ-нилуцированной экспрессии гена-репортера.

£ ~ э э — Е > Рис. 5. Анализ экспрессии

гена- репортера CAT под контролем

i ! i * i V

" Е « ос r-^ э m (3 ^

CJ <л ï ш О мутантньа промоторов гена ФНО

человека в клетках линии ANA-I _ if) активированных LPS или PMA;

О.

I п/а - неактивированные клетки.

>1

Приведены автографы

хромагографического разделения _ —" < 14

С-хлорамфеникала и его

П ацетильного производного.

%

ГО

•s»

с

1вЭ4ВЯ7вВ

Полученные данные показали, что несколько исследуемы* регуляторных элементов предпромоторной области гена ФНО человека участвуют в активации транскрипции, опосредуя действие LPS либо РМА на макрофаги. В то же время мутации в сайтах EGR-1 и NF-IL6 лишь слабо влияли на LPS-индуцмруемость промотора. Это лает основание предполагать, что главную роль в

LPS-индуцируемой активации транскрипции гена ФНО человека в макрофагах играют белки семейства NF-KB/Rel. Для проверки этого предположения мы получили и исследовали конструкцию, содержащую мутации в сайтах связывания кВ2, кВ2а и СК-1 одновременно (Sum). Хотя эффект действия LPS как активатора транскрипции гена ФНО человека при введении мутаций в три сайта связывания (падение активности конструкции в 8-10 раз) лишь незначительно отличался от эффекта устранения одиночных сайтов кВ2а и СК-1, тем не менее мы интерпретируем полученные данные как подтверждение основной роли белков семейства NF-icB/Rel в LPS-индуцируемой активации транскрипции гена ФНО человека в макрофагах. С другой стороны, PMA-индуцируемая активация транскрипции гена ФНО человека в ' клеточной системе ANA-1 является NF-KB/Rel-независимой и, по всей видимости, в основном определяется действием транскрипционного фактора EGR-1.

Результаты сайт-специфического мутагенеза промотора гена ФНО человека хорошо согласуются с данными, полученными при функциональном изучении набора 5*-концевых делециониых мутантов промотора. Наибольшее паление инлуцируемости промотора гена ФНО под действием LPS коррелирует с утратой участка связывания в районе расположения сайтов кВ2 и кВ2а. Тандем этих сайтов относится к наиболее консервативным участкам предпромоторных областей всех известных к настоящему времени нуклеотидных последовательностей генов ФНО. Кроме того, они находятся на расстоянии 3 витков спирали друг от друга, что может обеспечивать кооперативы ость связывания белковых комплексов, находящихся на одной стороне ДНК, если они сходны по структуре и взаимодействуют с гомологичными последовательностями нуклеотидов. Поэтому устранение с помощью мутагенеза как одного, так и другого сайта связывания привадит к значительному снижению уровня LPS-инлуцированиой транскрипции гена ФНО в макрофагах.

Второй спад в LPS-зависимой активации промотора гена ФНО, приводящий к полной потере инлуцируемост транскрипции, имеет место в районе расположения сайтов связывания нескольких транскрипционных факторов. Среди них сайт СК-1 (GGGGTATCCT, -213 пи) имеет крайне низкое сродство ко всем кВ-комплексам, тогда как сайты NF-IL6 (СТТТССААА, -183 пн, обратная ориентация) и EGR-1 (CGCCCCCGC, -170 пн) способны связывать соответствующие транскрипционные факторы других семейств. Поэтому значительная потеря инлуцируемости гена под действием LPS в случае мутации лишь в сайте СК-1 является несколько неожиданной. Для подтверждения отсутствия каких-либо артефактов в конструкции, содержащей мутантный сайт СК-1, был проведен обратный мутагенез, восстанавливающий исходный сайт СК-1. Функциональное исследование полученной конструкции (СК-1 rev) показало, что по способности к LPS-индуцированной транскрипции она не отличалась от конструкции с исходным промотором (Рис. 5). Остается неясным, является ли сайт СК-1 дополнительным 'слабым* кВ-подобным сайтом или он связывает дополнительный белковый фактор.

4. Определение белкового состава NF-кВ комплексов, образованных на

синтетических кВ-сайтах из предпромоторной области гена ФНО человека

Район предпромоторной области гена ФНО, необходимый для максимальной

индукции промотора (-656 --442 пн), содержит два неканонических участка

узнавания NF-кВ: сайт (CBZ (GTGAATTCCС. -627 пн) и сайт кВ2а (GGGCCTGTCC, -598 пн). Ядерные белки, способные связываться с этими сайтами, выявляли по способности образовывать In vitro комплексы с олигонуклеотидными дуплексами соответствующего состава:

кВ2 5' AGCTGGGTCTGTGAATTCCCGGGGGT 3'

3' CCCAGACACTTAAGGGCCCCCATCGA 5'

кВ2а

5'

3'

ACCTTCCCCGGCCGCTGCCCAGGCTT

AGGGGCCCCCGACCCGTCCGAATCGA

Перед инкубацией с ядерными белками олигонуклеотилные дуплексы

радиоактивно метили застраиванием 3'-концов при помощи фрагмента Клснова

32

ДНК-полимеразы I в присутствии 1а Р) дНТР. Олнгонуклеотнл-белковые комплексы анализировали электрофорезом в полиакриламнлном геле (Рис. 6).

А

В

-кВ-сМа #2--кв-»н* »г»-

* s г/S S г/

kB-«K* #2 kB-alta #2a

л г э л в в т

Рис. 6. Анализ образования /LHK-белковых комплексов на синтетических сайтах связывания кВ2 и кВ2а в с помощью электрофореза в 5% ПААГ. Использовали ядерные экстракты клеток линий ANA-1 (Л) Il Mono Mac 6 (В), обработанных LPS, PMA или hTNF. Цифрами 1. 2, 3 обозначены NF-icB/Rel-специфичсские комплексы.

Было установлено, что образование индуцированных комплексов происходило в случае обоих сайтов лишь при активации LPS и hTNF, но не РМА.

Для определения белкового состава комплексов, обозначенных соответственно 1, 2 и 3 (см. рис. 6), были использованы моноспеиифические 'анти сыворотки к трем членам семейства NF-icB/Rel: р50, р65 и c-Rel. На рис. 7 показаны нуклеопротеиновые гели, которые демонстрируют изменения в картине распределения образовании ДНК-белковых комплексов при применениии специфических антисывороток.

Рис. 7. Анализ белков ядерных экстракте из LPS активированных клеток линий ANA-I (A) u Mono Mac 6 (В), образующих комплексы на сайтах связывания >сВ2 и кВ2а, электрофорезом в 5% ПЛАТ с помощью моноспецифичеашх антител. Цифрами I, 2, 3 обозначены NF-«cB/Rel - специфические комплексы.

Комплекс 1 исчезал лишь при примеисиии анти-р50; комплекс 2 - анти-pSO (полиостью), анти-р65 и анти-c-ReI (частично); а комплекс 3- апти-р65 (полностью) и анти-c-Rel (частично). Во всех случаях наблюдалось появление дополнительных полос, соответствующих сложным комплексам ДНК-белок-антитело с меньшей элехтрофоретической подвижностью.

Кроме того, для дополнительной характеристики белковых комплексов использовали альтернативный подход - метод Уф пришивки. Он заключался в фиксации (при облучении УФ-светом) термодинамически нестабильных АНК-белковых комплексов посредством образования ковалентных связей между молекулами белка и радиоактивно меченной ДНК и последующем разделении меченных таким образом белковых компонентов электрофорезом в SDS-ПААГ (Рис. 8). Поскольку

чувствительность этого метода не позволяла применять его к низкоафинным сайтам сявзывания (каковыми являются сайты к£52 и кВ2л из прелпромоторной области гена ФНО), то он был отработан на кВ-сайте кВ4, расположенном за З'-нетранслируемой областью гена ФНО. Комплексы, образованные на этом сайте связывания, по своей электрофоретической подвижности аналогичны комплексам, образованным на сайтах кВ2 и кВ2а (Рис. 8А).

Рис. S. Определение состава белковых комплексов, образованных на

сайте связывания кВ4, при полону/ метода 'УФ пришивки".

Л. Разделение ДНК-белковых комплексов, образующихся на синтетическом сайте

связывания кВ4 modified, электрофорезом в 5% ПЛАТ.

Цифрами I, II, III обозначены №-кВ/Яе:\-спешфическис комплексы.

B. Определение молекулярной массы белков, входящих в комплексы I, II и III (АЪлектрофорезом в 107. SDS-ПААГ.

C. Разделение коваленгтно-связанных нуклеопрогеидов электрофорезом в 107. SDS-ПААГ после иммунопреинпитаими с антителами против индивидуальных белков семейства NF-KB/ReL

В и С. Слева приведены положения маркерных белков соответствующих молекулярных масс, справа обозначены положения белков семейства NF-KB/ReL

С этой ислью в качестве синтетического сайта связывания кВ4 использовали синтетический дуплекс, состоящий из модифицированных олнгонуклеотидов, у которых в последовательности сайта дезокситимнлин был заменен на бромдезоксиуриднн, что, как показали контрольные эксперименты, не влияло на эффективность образования белковых комплексов, но способствовало увеличению эффективности сшивки (Рис. 8).

* •

кВ4 modified 5' AGCTGGGCATGGGA ATUUCCCACTCA 3'

3' СС CGTA С С CUUA A A GGGTGAGTTCGA 5'

• •

При разделении белковых компонентов комплеков I, II и III после облучения УФ на денатурирующем полиакриламилном геле наблюдали появление полос, соответствующих молекулярным массам в 50, 65 и 68 кДа (за вычетом молекулярной массы прикрепленного олигонуклеотидного дуплекса). При этом комплекс I состоял преимущественно из белков с молекулярной массой 50 кДа, комплекс II - 50 кДа, 65 кДа и незначительного количества белка 68 кДа, а комплекс III - 65 кДа и 68 кЛа. Никакие другие значимые по интенсивности сигнала полосы не наблюдались. С помощью иммуннопреципитации с антителами к соответствующим белковым факторам было подтверждено, что входящие в комплексы белки являются членами семейства NF-tcB/Rel. Мы считаем, что этот вывод справедлив и для кВ-сайтов кВ2 и кВ2а.

Таким образом, мы показали, что в условиях нашей экспериментальной системы на синтетических кВ энхансерах из предпромоторной области гена ФИО и области, расположенной за ним, образуются специфические комплексы NF-icB/Rel, не содержащие дополнительных белковых компонентов, контактирующих с ЛНК. Полученные результаты приводят к заключению, что функциональные свойства данных энхансеров должны определяться количеством в ядрах клеток соответствующих транскрипционных факторов семейства NF-icB/Rel.

5. Изучение влияния различных индукторов иа накопление белков семейства NF-icB/Rel в ядрах клеток

Роль -транскрипционных факторов NF-«cB/Rel была дополнительно исследована анализом количества белков семейства в ядрах клеток линий ANA-1 и Mono Мае 6 при активации их различными индукторами. На рис. 9А показан пример Вестерн-анализа ядерных экстрактов стимулированных клеток Mono Mac 6 с использованием антител к р50, р65 и c-Rel. Полученные результаты свидетельствуют о том, что транслокация данных транскрипционных факторов в ядро происходит лишь при стимуляции макрофагов LPS или hTNF, но не РМА. Аналогичные результаты были получены и для клеток линии ANA-1 (Рис 9В).

в

çN

ч5 3

X X <,

ч? <Г <Г

р«5

12 3 4

«- р65

р50

1 2 3 4 5 6 7

pSO

2 3 4

Рис. 9. Изменение количества белков семейства NF-icB/Rel в ядрах клеток линий Mono Mac 6 (А) и ANA-1 (В) при обработке их LPS, PMA и hTNF. Стрелки указывают на положение белков семейства NF-icB/ReJ.

Полученные нами экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что LPS и hTNF индуцируют появление в ядра! моноцитарных/ макрофзгальных клеток мыши и человека белков, способных образовывать следующие комплексы с сайтами NF-icB, расположенными в районе, критическом для активации транскрипции ген» ФНО человека: 1 - р50/р50; 2 - р50/р65, pSO/c-Rel и 3 - p65/p6S, p65/c-Rel.

Наконец, нами была сделана попытка имитировать действие LPS при совместной трансфскции клеток ANA-1 плазмидой pSVOcat/TNF prom., содержащей полный промотор гена ФНО человека (конструкция '-1173*) с плазмидой Rc/CMV-p65, кодирующей белок р65 - один из членов семейства NF-icB/Rel, содержащий трансактивирующий домен. Было обнаружено, что активность гена-репортера была на порядок выше, чем в контрольном опыте без р65. В то же время для конструкции '-442*, ие содержавшей «сВ-сайты kBZ и >сВ2а, разница между контролем и опытом не наблюдалась. Таким образом, было получено дополнительное подтверждение участия NF-icB/Rel в активации транскрипции гена ФНО человека под действием LPS.

Наши данные в совокупности свидетельствуют о важной роли белков семейства NF-icB/Rel в транскрипционной регуляции гена ФНО человека в активированных LPS моноцитах и макрофагах. Интересно, что ауторегуляция промотора гена ФНО человека его собственным белковым продуктом в клетках ANA-1 и Mono Mac 6 также опосредована NF-кВ (см. рис. 6, 7, 9).

6. Изучение роли транскрипционного фактора EGR-1 в LPS- и РМА-инлуцнровапнон активации транскрипции гена ФНО человека

6а. Увеличение количества EGR-1 в ядрах клеток ANA-1 и Mono Mac 6

при индукции LPS и РМА Результаты функциональных исследований мутантов предпромоторной области гена ФНО человека показали, что замена трех нуклеотилов в сайте связывания транскрипционного фактора EGR-1 приводит к снижению в 10 раз PMA-индуцированного уровня активации транскрипции гена ФНО человека (Рис. 5). Аля того чтобы проверить эффект стимуляции клеток на накопление в ядре белка EGR-1, мы приготовили ядерные экстракты из активированных LPS, РМА и hTNF клеток ANA-1 и Mono Mac 6 и проанализировали их при помощи иммуноблоттинга (Рис. 10). В ядрах неактивированных клеток наблюдали лишь незначительное количество белка EGR-1, которое значительно возрастало после обработки клеток LPS или РМА. Обработка клеток hTNF не привадила к видимому влиянию на синтез фактора EGR-1.

В

Vs <r ■<?■

«р <г

<у >У «

<-4 С г i

-Egr-1

—Egr-1 .

12 3 4

5 6 7 8 9

Рис. 10. Изменение количества транскрипционного фактора EGR-1 в ядрах клеток линий ANA-1 (А) и Mono Mac 6 (В) при обработке их LPS, РМА и hTNF. Стрелки указывают на положение белка EGR-L

66. Взаимодействие транскрипционного фактора EGR-1 с сайтом связывания из

прелпромоторпой области гена ФИО человека Аля дальнейшего исследования регуляторной роли фактора EGR-1 в LPS- и РМА-индуиированиой активации транскрипции гена ФНО человека мы проверили, отражает ли повышение уровня ядерного EGR-1 при активациях также и изменение его АНК-связывакшшх свойств. Для этого ядерные экстракты клеток ANA-1 и Mono Mac 6, активированных LPS и PMA, инкубировали с меченым олигонуклеотидным дуплексом, содержащим сайт связывания EGR-1 (CGCCCCCGC, -170 пн1 из предпромоторной области гена ФНО человека:

EGR-1 5' AGCTAAATCCCCCCCCCCGCGATGGA " 3'

3' TTTAGGGGCGGGGGCGCTACCTTCGA 5'

Образование ДНК-белковых комплексов исследовали на нуклеопротеиновом геле (Рис. И).

Рис. 11. Электрофорез a 5Jm ПЛАТ комплексов белков из ядерных экстрактов ■ LPS- и РМА-активированных клеток jaowa ANA-1 (А) и Mono Mac 6 (В,С) с сшяттичесаш сайтом связывания фактора транскрипции EGR-1. Стрелками обозначено положение EGR-1-специфического ЛНК-белкового комплекса.

В соответствии с результатами других групп (Meichle et. al., 1994) мы наблюдали образование лишь одного идуцируемого комплекса (Рис. 11). Моноспецифические антитела к ECR-1 сдвигали индуцированный комплекс, образуя комплекс ДНК-белок-антитело с более медленной электрофоретической подвижностью (Рис. ILA, 11С). Тем самым мы показали, что индуцированный на сайте связывания EGR-1 комплекс действительно является EGR-1-специфическим.

6в. Участие протсинкиназы С в индукции EGR-1

При исследовании ДНК-белковых комплексов, формируемых на сайте связывания EGR-1 из предпромоторной области гена ФНО человека в ядерных экстрактах клеток ANA-1 и Mono Мае 6, мы заметили, что комплекс EGR-1 был индуцирован при активации РМА немного сильнее, чем при LPS. PMA известен как наиболее мощный активатор протсинкиназы С (РКС). Точные механизмы внутриклеточной передачи сигналов при воздействии LPS до сих пор остаются недостаточно изученными, хотя в некоторых работах было продемонстрировано участие в них различных киназ. Мы решили проверить, принимает ли участие РКС в синтезе транскрипционного фактора EGR-1 в ядрах клеток ANA-1 и Mono Mac 6 при активации LPS. С этой целью клетки ANA-1 и Mono Mac 6 преинкубировали с ингибитором РКС - стауроспорином, а затем активировали LPS. В качестве контрольных использовали активированные LPS клетки, необработанные стауроспорином. Ядерные экстракты анализировали при помощи иммуноблоттинга (Рис. 12).

А

В

1

э л

7 В В -ID

Рис. 12. Определение влияния ингибитора протеинжиназы С на присутствие

фактора транехрипщш EGR-1 в ядрах клеток линий ANA-1 (А) и

Mono Mac 6 (В), обработанных LPS.

СтрелаI указывают на положение белка EGR-L

Ku вилно из рис. 12, стауроспорин полностью ингибировал эффект LPS в индукции белка EGR-1 в ядрах клеток. Хотя данные о частично РКС-зависимой индукции мРНК EGR-1 в активированных LPS перитониальных макрофагах были получены в работе Coleman и др. (Coleman et. al., 1992), остается неясным, на каких уровнях регуляции продукции белка EGR-1 принимает участие РКС. Полученные нами результаты в совокупности с ранее опубликованными данными свидетельствуют в пользу использования РКС-зависимого пути внутриклеточной передачи сигналов для индукции транскрипционного фактора EGR-1 в активированных LPS моноцитах и макрофагах.

Таким образом, в линиях клеток ANA-1 и Mono Mac 6 ниндукцин LPS или PMA приводят к быстрому синтезу транскрипционного фактора EGR-1, который локализуется в ядре и образует комплекс с ДНК на сайте связывания в прелпромоторной области гена ФНО человека. Согласно результатам наших функциональных исследований 5'-делеционных мутантов промотора гена ФНО человека в клетках линии ANA-1, удаление области, содержащей сайт связывания EGR-1, приводило к уменьшению или даже полной потери действия РМА на уровень транскрипции гена ФНО (Рис. 3). Более того, изменение сайт-специфическим мутагенезом сайта связывания EGR-1 в составе полного промотора гена ФНО приводило к падению в 10 раз уровня активации транскрипции при индукции РМА (Рис. 5). Все это дает основание полагать, что именно сайт связывания EGR-1 является функционально важным регуляторным элементом для активации гена ФНО человека в моноцитах и макрофагах при индукции РМА.

7. Заключение

ФНО - важный компонент неспецифических защитных реакций организма; уровень его продукции зависит от природы активирующего воздействия и контролиреутся на всех уровнях биосинтеза. На уровне транскрипции этот контроль возможен за счет дифференциального взаимодействия различных транскрипционных факторов с регуляторными элементами из прелпромоторной области гена. Промотор гена ФНО имеет сложную модульную структуру с регуляторными элементами, расположенными вплоть до -900 пн от точки начала транскрипции.

Полученные результаты в совокупности позволяют предложить общую схему регуляции транскрипции гена ФНО человека в моноцитах и макрофагах. Возможны два различных случая активации экспрессии гена ФНО: случай максимальной активации, возникающий, например, при непосредственном контакте макрофагов с бактериальным эндотоксином, и случай частичной активации, имеющий место при вторичной индукции макрофагов продуцированными ранее системными цитокинами или другими активирующими молекулами. В активации транскрипции гена ФНО участвуют

разные транскрипционные факторы, сайты связывания которых расположены в предпромоторвой области гена. Их можно разделить на два класса: факторы семейства NF-xB/Ríl и все остальные факторы.

Максимальная активация является NF-KB/Rel-зависимой, она определяется взаимодействием белков этого семейства с тремя кВ-подобными сайтами связывания, расположенными как вблизи ТАТА-бокса (ZOO пи), так и на значительном расстоянии от него (600-650 пн). Не исключено, что при подобном взаимодействии происходят конформационные изменения в пространственной организации промотора гена, результатом которых могут быть дополнительные белок-белковые взаимодействия, приводящие к транс-активации комплекса РНК-полимеразы II и началу быстрого синтеза мРНК. Кроме того, с точки зрения представления о пороговом эффекте транскрипции, присутствие трех гомологичных регуляторных элементов в промоторе может приводить к повышению уровня транскрипции в несколько десятков раз по сравнению с одиночным регуляторным элементом.

В частичной активации белки семейства NF-kB/RsI могут не принимать участия. Она обусловлена взаимодействием разных (в зависимости от примененного стимула) транскрипционных факторов с регуляторными элементами промотора, расположенными недалеко от ТАТА-бокса (150-200 пн). Эти элементы одиночны для всей предпромоторной области гена, что делает невозможным возникновение эффекта кооперативное™ взаимодействия и, по-видимому, приводит к не столь сильной транс-активации комплекса РНК-полммеразы II.

выводы

1. Впервые систематически проведены делеционный и мутационный анализ промотора гена ФНО человека. Получена уникальная коллекция генно-инженерных конструкций для проведения функциональных исследований по регуляции транскрипции гена ФНО человека.

2. Исследовано влияние различных активаторов (липополисахарил (LPS), форболовые эфиры (PUA), и рекомбинантный ФНО человека (hTNF)) на уровень экспрессии гена ФНО человека в линии клеток костно-мозговых макрофагов мыши ANA-1 и линии клеток моноцитов человека Mono Mac 6. Показано, что LPS и hTNF являются сильными активаторами транскрипции гена ФНО в моноцитах и макрофагах, в то время как РМА оказывает более слабое активирующее действие.

3. Обнаружены две 'ступени* активации транскрипции гена ФНО человека в моноцитах и макрофагах: низкая, совпадающая для всех трех индукторов, и высокая, имеющая место только при активациях LPS и hTNF. Предложена схема дифференциального ответа макрофагов на различные чужеродные раздражители.

4. Показана важная роль транскрипционных факторов семейства NF-icB/Rel в LPS н hTNF-регулируемой активации промотора гена ФНО человека. Тем самым снято противоречие между результатами исследований промоторов генов ФНО мыши и человека.

5. В промоторе гена ФНО человека функционально охарактеризован регуляторный элемент (сайт связывания транскрипционного фактора EGR-1), необходимый для активации гена в моноцитах и макрофагах форболовыми эфирами. Показано участии протеинкиназы С в индукции транскрипции и синтеза мРНК ФНО человека.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Удалова, И .А, Турецкая, Р.Л, Купраш, ДВ. и СА. Нелоспасов. 1995.

Две ступени активации транскрипции гена ФНО человека в макрофагах. Роль белков семейства NF-icB/Rel при действии липополисахарида. ДАН РАН. 1995. т. 342, № 3. 27-32.

2. Kuprash, D.V., Udalova, I.Л., Turetskaya. R.L., Rice, N.R., and S.A. Nedospasov. 1995. Conserved кВ element located downstream of the Tumor Necrosis Factor a gene: distinct NF-icB binding pattern and enhancer activity in LPS activated murine macrophages. Oncogene. 1995. Vol.10, 2890-2897.

3. Udalova, I.A., Kuprash, D.V., Rice, N.R., Reeves. R., and S.A. Nedospasov. DNA-protein interactions at kappa-B enhancers Involving NF-kB/Rei family and HMG-I(Y). Abstracts of 9thAnnual Meeting on Oncogenes (Frederick, MD, USA, June, 1993), p. 420.

4. Udalova, I.A., Kuprash, D.V., Turetskaya, R.L., Rice, N.R. and S.A. Nedospasov. Analysis of regulatory elements of human TNF gene in ANA-1 cells. In: The 5th International TNF Congress (USA. May 30 - June 3, 1994). European Cytokine Network. (Volume 5. Number 2. March-April 1994) p. 158.