Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфа

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфа"



На правах рукописи

МОГИЛЕНКО Денис Александрович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА А-1 ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА

03.01.04 -Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 г.

2 1 ОКТ ?р.1П

004611258

Работа выполнена в Отделе биохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е1ладимир Николаевич Кокряков

доктор биологических наук, Ирина Владимировна Гужова

Ведущее научное учреждение:

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита состоится «28» октября 2010 года в 13— часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменнооетровский проспект, дом 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, улица Академика Павлова, дом 12.

Автореферат разослан «_» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В фундаментальных медико-биохимических исследованиях было установлено, что высокий уровень аполипопротеина A-I (АроА-I) в плазме крови коррелирует с низким риском развития атеросклероза и ишемической болезни сердца. АроА-I человека входит в состав липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), участвует в обратном транспорте холестерола из периферических тканей в печень, обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и, по-видимому, может выступать в роли сигнальной молекулы. Известно, что главными местами экспрессии гена ароА-I и синтеза белка АроА-I у человека являются гепатоциты печени и энтероциты тощей кишки. Экспрессия гена ароА-1 обнаружена также в плаценте, сердце, хрящевой ткани и в клетках желточного мешка зародышей млекопитающих. Вместе с тем, регуляция экспрессии гена ароА-I в клетках, отличных от энтероцитов и гепатоцитов, недостаточно охарактеризована.

В настоящее время все больше внимания вызывает представление об атеросклерозе как о процессе хронического воспаления (Hansson and Libby, 2006). Одним из ключевых факторов, участвующих в процессе воспаления при развитии атеросклеротических повреждений сосудов, является фактор некроза опухоли альфа (TNFa) (Canault et al., 2008). TNFa угнетает транскрипцию и снижают секрецию ароА-I в гепатоцитах человека (Song et al., 1998; Haas et al., 2003), а также приводит к уменьшению как содержания АроА-I в составе ЛПВП, так и уровня ЛПВП в плазме крови (Khovidhunkit et al., 2004; Esteve et al., 2005).Тем не менее, молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена ароА-I при действии провоспалительных цитокинов все еще недостаточно изучены. Интересным и важным является изучение регуляции экспрессии гена ароА-I при действии провоспалительных цитокинов, таких как TNFa, в гепатоцитах и клетках моноцитарно-макрофагальногоряда.

Цели работы. Целью диссертационной работы является изучение ткапеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-I человека при действии TNFa в клетках HepG2 и ТНР-1, а также выяснение роли сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2, NFkB и ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в этом процессе. Задачи исследования.

1. Изучить регуляцию экспрессии гена ароА-I в клетках гепатомы человека HepG2 при действии TNFa.

2. Исследовать возможность экспрессии гена ароА-I в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека ТНР-1 и её регуляции при действии TNFa.

3. Изучить роль сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2 и NFkB, а также ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в регуляции экспрессии гена ароА-I в клетках HepG2 и ТНР-1.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показано участие ядерного рецептора РРЛЯу в регуляции экспрессии гена ароА-1 в клетках гепатомы человека (Нер02). Установлена роль ядерных рецепторов НМЧа, РРАЯа, РРАЯу и ЬХЯв в ЮТа-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2.

Впервые показано, что ген ароА-1 экспрессируется в культивируемых человеческих клетках моноцитарно-макрофагального ряда - ТНР-1, в моноцитах и макрофагах, полученных из периферической крови человека, в перитониальных макрофагах мыши, причём экспрессия этого гена стимулируется при добавлении к клеткам провоспалительного цитокина ЮТа.

Показано участие сигнальных путей ЖК, р38, МЕК1/2, ОТкВ и ядерных рецепторов РРАЛа и ЬХЯг в ТЫРа-зависимой стимуляции экспрессии гена ароА-1 в. клетках ТНР-1.

Практическое значение результатов исследования. Полученные результаты расширяют наши представления о тканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-1, а также указывают на механизмы регуляции экспрессии этого гена при действии на клетки провоспалительного цитокина ЮТа. Предложена гипотеза о противовоспалительной роли эндогенно-синтезированного АроА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда.

Результаты, полученные в этой работе, дополняют представления о роли ЮТа и АроА-1 в развитии нарушений липидного обмена и могут быть использованы при разработке методов тканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-1 с целью терапии атеросклероза. Основные положения, выносимые на защиту:

• Показана роль сигнальных путей ЖК, р38, МЕК1/2 и ОТкВ в угнетении экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2 при действии ЮТа.

• Показана экспрессия гена ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда ТНР-1 и установлена ЮТа-зависимая активация транскрипции этого гена.

• Установлено, что сигнальные пути ЖК, р38, МЕК1/2 и ОТкВ принимают участие в активации экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1 при действии ЮТа.

• Выяснено участие ядерных рецепторов НОТ4а, РРАКа, РРАЯу и ЬХЛб в ТОТа-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках Нерв2, а также установлено, что РРАЯа и ЬХЛб участвуют в активации транскрипции гена ароА-1 в клетках ТНР-1 при действии Т№ а.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих

конференциях: 16-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 28 мая - 1 июня, 2007 г., Санкт-Петербург, Россия; 17-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 26 - 30 мая, 2008 г., Санкт-Петербург, Россия; ХП1 Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 8-11 июня 2009 г., Санкт-Петербург, Россия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», 13-18 апреля, 2009 г., Москва, Россия; 34th FEBS Congress, 4-9 июля, 2009 г., Prague, Czech Republic; International Conference "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", 9-10 November 2009, St. Petersburg, Russia. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ. Личный вклад автора в проведении исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы: по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Выделение РНК и клеточных белков, реакции обратной транскрипции и Real Time RT-PCR, иммунопреципитация хроматина, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, конструирование генетических конструкций, люциферазный тест и выделение ядерных белков выполнены соискателем. Культивирование клеточных линий HepG2 и ТНР-1 выполнено совместно с к.б.н. Э.Б. Диже и A.C. Трулевым. Эксперименты по проточной цитофлуорометрии выполнены совместно с к.б.н. И.В. Кудрявцевым. Задержка белков в геле выполнена совместно с к.б.н. C.B. Орловым.

Внедрение результатов работы. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процесс Отдела биохимии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Россия, 197376, ул. Ак. Павлова, 12), Кафедры эмбриологии и Кафедры цитологии и гистологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета (Россия, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9).

Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Вывсаы» и «Список цитируемой литературы)), включающий 271 наименование, и них 3 источника на русском языке и 268 наименований на английское языке. Диссертация изложена на 106 страницах. Результаты представлены в 1 таблице и иллюстрированы 24 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Ингибиторы МАР-киназ были получены из «Biomol» SB203580 (ингибитор р38 MAP); SP600125 (ингибитор JNK1/2/3); U0126 (ингибитор МЕК1/2) и ингибитор NF-кВ (QNZ). Ингибитор Src-киназы РР2 был получен из «Biomol». Синтетические диганды PPARa были получены из «Sigma»: WY-14643 (агонист) и МК886 (антагонист).

Синтетический агонист LXRs (Т0901317) был получен из «Biomol». Синтетический агонист PPARy (GW1929) и синтетический антагонист PPARy (GW9662) были получены из "Sigma". Рекомбинантный TNFa человека был получен из "Sigma". В данной работе использовались следующие антитела: мышиные моноклональные антитела против актина человека ("Abeam", ab3280), мышиные моноклональные антитела против АроА-1 человека ("AbD Serotec", 0650-0050), кроличьи поликлональные антитела против HNF4a человека ("Santa Cruz Biotechnology", sc-8987), кроличьи поликлональные антитела против PPARy человека ("Santa Cruz Biotechnology", sc-7196), кроличьи поликлональные антитела против LXRß человека ("Abeam", ab56237), мышиные моноклональные антитела против PPARa человека ("Abeam", ab2779) , козьи антитела против IgG мыши (FITC) ("Abeam", ab6669-l), козьи антитела против IgG мыши (HRP) н козьи антитела против IgG кролика (HRP) ("Sigma"). pCMVL представляет собой вектор экспрессии бактериального гена-репортера lacZ под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), и был получен ранее (Perevozchikov et al.., 1997). pCMVHNF4, вектор экспрессии транскрипционного фактора человека HNF4a, был любезно предоставлен Dr. Fukamizu (University of Tsukuba, Japan). pCMVHNF4D, вектор экспрессии доминантно-негативного мутанта транскрипционного фактора человека HNF4a, был любезно предоставлен Dr. Leff (Wayne State University School of Medicine, USA). pAPOA-I(-2498/+173)-Luc, pAPOA-I(-2498/+72)-Luc, pAPOA-I(-256/+173)-Luc и pAPOA-I(-256/+72)-Luc, плазмиды, содержащие ген-репортер люциферазы светлячка под контролем делеционных вариантов 5'-регуляторного участка гена ароА-1 человека (-2498...+173), (-2498...+72), (-256...+173) и (-256...+72) относительно точки инициации транскрипции (+1) соответственно, были сконструированы с использованием методов генетической инженерии и описаны ранее (Лапиков и др., 2008). Экспериментальная часть.

Клеточные культуры и траисфекция. Клеточная линия гепатомы человека HepG2 была получена из Банка клеточных культур Института Цитологии Российской академии наук и культивировалась в среде DMEM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FCS) ("Биолот»), в атмосфере 5% СОг при 37*С. В экспериментах с TNFa клетки высевались в 24-луночные планшеты с плотностью 1х104 клеток на см2 и культивировались 24 ч в среде DMEM. После этого ростовую среду меняли, клетки переводили в DMEM без FCS и дополнительно инкубировали 24 ч. Ингибиторы сигнальных протеинкиназ и синтетические лиганды ядерных рецепторов добавляли за 1 ч до внесения TNFa в культуральную среду. Синтетические лиганды ядерных рецепторов добавляли к клеткам в следующих концентрациях: WY-14643 10 мкМ, МК886 10 мкМ, Т0901317 5 мкМ, GW1929 10 мкМ, GW1929 10 мкМ. Использовали следующие концентрации ингибиторов: SB203580 - 25 мкМ, SP600125 - 10 мкМ, U0126 - 10 мкМ, QNZ - 10 нМ, РР2 - 10 мкМ. Трансфекцию клеток генетическими конструкциями осуществляли методом кальций-фосфатной преципитации, как описано ранее (Graham, van der Eb, 1973). Во всех экспериментах использовали по 3 мкг плазмидной ДНК, 0.5 мкг плазмиды pCMVL (для контроля эффективности трансфекции) и 1 мкг ДНК спермы лосося (размер фрагментов ДНК 200-400 п.о.) на лунку 24-луночного планшета. Ингибиторы, синтетические лиганды и/или TNFa добавляли к клеткам через 24 ч после трансфекции и культивировали 24 ч. Клеточная линия моноцитарной лейкемии человека ТНР-1 была получена из Банка клеточных культур Института Цитологии Российской академии наук и культивировалась в среде RPMI-1640 с 10% FCS ("Биолот»), в атмосфере 5% СОг при 37°С. Дифферешдировку клеток ТНР-1 в макрофаги проводили, добавляя к клеткам форболовый эфир (phorbol 12-myristate 13-acetate - PMA) (50 нг/мл), как описано ранее (Tedia et al., 2004). Мононуклеары периферической крови человека получали,

используя метод разделения клеток в градиенте Percoll-Hypaque, как описано (Bennett and Breit, 1994).

Животные. Мыши С57В/6 были получены из питомнока "Рапполово" (Россия). Все эксперименты с животными были одобрены комитетом по этичному обращению с животными НИИ экспериментальной медицины РАМН и выполнялись в соответствии с требованиями, изложенными в "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". (1996) Institute of Laboratory Animal Research, Commission on Life Sciences, National Research Council. National Academy Press Washington, D.C. USA. Для получения перитониальных макрофагов использовали мышей возрастом 2 месяца и весом 16-20 г. Мышиные перитониальные макрофаги получали методом перитониального лаважа, переносили в 24-луночные планшеты (1*106 клеток на лунку) в RPM1 с 10% FCS и инкубировали в атмосфере 5% С02 при 37*С.

ß-галактозидазный и люциферазный тесты, ß-галактозидазный тест проводили стандартным способом, используя в качестве субстрата ферментативной реакции о-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид. Относительную активность ß-галактозидазы рассчитывали как отношение оптической плотности D420 за 1 ч на 1 мг тотального белка в клеточных лизатах.. Относительную активность люциферазы (RLU) измеряли на люминометре 20/20° ("Turner BioSystems"), используя Luciferase Assay System ("Promega") в соответствии с рекомендациями изготовителя. За единицу активности люциферазы (RLU) принимали свечение в течение 1 мин на 1 мг тотального белка в клеточных лизатах. Относительную активность люциферазы (RLA) выражали в процентах, принимая за 100% величину RLU в необработанных контрольных клетках. Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорд.

Обратная транскрипция. Тотальную РНК из культивируемых клеток выделяли с использованием RNA STAT-60 реагента ("Tel-Test") в соответствии с инструкциями изготовителя. После обработки ДНКазой I, свободной от РНКаз ("Roche Applied Science") (30 мин при 37°С, далее реакцию останавливали добавлением EDTA в конечной концентрации 2 мМ 15 мин при 70°С для инактивации ДНКазы), концентрация тотальной РНК и ее чистота определялись при помощи спектрофотометра Avaspec-2048 ("Avantes"). 2 мкг тотальной РНК использовали для проведения реакции обратной транскрипции, используя как праймер oligo-dT ("Invitrogen") и обратную транскриптазу M-MLV ("Promega"), для получения одноцепочечной кДНК (15 мин при 70°С с праймером dT16, 1 мин на льду, 60 мин при 42°С в реакционной смеси, содержащей 0.5 мМ дНТФ, 0.3 мМ MgC!2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT, и 8 единиц/мкл обратной транскриптазы, и затем 15 мин при 70°С для инактивации обратной транскригггазы).

Полимеразпая цепная реакция в реальном времени - Real Time PCR. Праймеры и зонды для PCR подбирали с использованием программы "РптегЗ" (Rozen, Skaletsky, 2000). Для Real Time PCR использовали следующие праймеры и зонды к указанным генам человека и мыши (все последовательности написаны в ориентации 5'-3'): Человек: GAPDH (AAGGGCATCCTGGGCTAC, . GTGGAGGAGTGGGTGTCG, CY5-TGAGCACCAGGTGGTCTCTGAC-RTQ2), ß-actin (AGCCTTCCTTCCTGGGC, CGGATGTCCACGTCACACT, Cy5-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGA-RTQ2), apoA-I (CCTTGGGAAAACAGCTAAACC, CAGCTTGCTGAAGGTGGAG, FAM-

AGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGT-BHQ1 ), LXRa (TCACCTTCCTCAAGGATTTCA, TCGAAGATGGGGTTGATGA, ROX-TAACCGGGAAGACTTTGCCAAAGCA-RTQ2), LXRß (CAGCAAGGACGACTTCCA, CCGCGAGAACTCGAAGAT, R6G-

AGGCCTGC AGGTGG AGTTC АТС AAC-RTQ1 ), PPARa (TCACAAGTGCCTTTCTGTCG, TCTTGGCATTCGTCCAAAA, ROX-GGATGTCACACAACGCGATTCG-RTQ2),

HNF4a (CGTGCTGCTCCTAGGCAA, GTCAAGGATGCGTATGGACAC, R6G-GAGCTGGCGGAGATGAGCCG-RTQ1), PPARy (TGACAGCGACTTGGCAAT,

TGGGCTTCACATTCAGCA, R6G-TATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGT-RTQ1), Мышь: ароА-I (TATGTGGATGCGGTCAAAGA, ACGGTTGAACCCAGAGTGTC, FAM-CCTCCTCCTTGGGCCAACAGCT-RTQ1), ß-actin (CTGGCACCACACCTTCTACA, CTTTTCACGGTTGGCCTTAG, ROX-GCACCCTGTGCTGCTCACCG). Все варианты использованных праймеров и зондов (кроме праймеров к ароА-I мыши и к ß-актину мыши) были подобраны таким образом, что они не были способны амплифицировать геномную ДНК (один из пары праймеров располагается на границе двух экзонов). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовались следующие варианты: а) без добавления в реакционную смесь обратной транскриптазы, б) без добавления матрицы для проверки загрязнения реакционной смеси молекулами ДНК. Для оптимизации мультиплексирования (анализа экспрессии четырех различных генов в одной пробирке) были подобраны условия, при которых происходило скорейшее нарастание амплификации продуктов PCR (значения Ct). Для проведения реакции RealTime-PCR использовали следующие значения: 95°С 300 с, затем 40 циклов при 95°С 25 с и 60°С 45 с в случае TaqMan и 95°С 300 с, затем 40 циклов при 95°С 30 с, 60°С 20 с и 72°С 30 с в случае SyberGreen. Использовали наборы для проведения TaqMan и Syber Green RealTime-PCR производства компании «Синтол» (каталожные номера R-412 и R-402). Реакционная смесь (25мкл) содержала 0.25 мМ дНТФ, 2.5 мМ MgC12, 0.05 единиц/мкл Taq - полимеразы («Синтол»), 0.25 pmol/мкл каждого из праймеров, 0.125 pmol/мкл зонда. Реакцию проводили с использованием амплификатора ANK32 производства компании «Синтол». Число циклов (значения Ct), необходимое для достижения порогового уровня флуоресценции, превышающего 10 стандартных отклонений от уровня фруктуаций фоновой флуоресценции, определяли при помощи программного обеспечения ANK32 («Синтол»), Относительные значения количеств кДНК (в процентах от контрольного образца) рассчитывали по формуле (2Ct K0"1pai,"Q о6г!Ие") х 100. Рассчитанные количества кДНК каждого из генов нормировали по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства», кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapdh) или бета-актин, и представляли как относительный уровень экспрессии гена, принимая за 100% уровень экспрессии в контрольных клетках.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP). Иммунопреципитацию хроматина проводили, как описано ранее (Martens et al., 2005). Фрагментацию хроматина проводили обработкой лизированных клеток HepG2 ультразвуком при 0°С, используя генератор ультразвука УЗДН-1 (4 раза по 20 с при силе тока 0.3А, частота звуковых колебаний 44 кГц), получая, в результате фрагменты хроматина длинной 200-300 п. о. Оценку количества фрагментов ДНК, соответствующих гепацитарному энхансеру гена ароА-I, в связанной с антителами и несвязанной фракциях хроматина проводили методом RealTime PCR с помощью праймеров и зонда, специфичных к данному участку гена ароА-I: HRE-c (5-hre-c: GCTTGCTGTTTGCCCACT, 3-hre-c: GGTCCTGGCAATGTGGAA, h-hre-c: FAM-CCCAGGGACAGAGCTGATCCTTG-BHQ1). В качестве отрицательного контроля использовали преципитацию неспецифическими IgG человека. Количества преципитированного хроматина, содержащие последовательность гепацитарного энхансера гена ароА-I нормировали по общему содержанию такой последовательности в образце хроматина

Иммуноферментный анализ (ELISA). Человеческий АроА-I в культуральных средах определяли методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител кролика против человеческого АроА-I и вторых антител козы против кроличьих IgG, сконъюгированных с пероксидазой хрена. Поликлональные кроличьи антитела против человеческого АроА-I были описаны ранее (McVicar et al., 1984), было установлено, что эти антитела не связывают белки FCS.

Вестерн-блоттинг. Клетки трижды отмывали PBS, затем лизировали в буфере RIPA-50 (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ EDTA, 0.1% S0S and 0.01% NaN3, 1 мМ

PMSF, pH 7.4). SDS-элетрофорез белков проводили в 7% или 12% полиакриламидном геле. Весгерн-блоттинг проводили, как описано (Kim et al., 2009), используя систему детекции Enhansed Chemoluminiscent (ECL).

Иммуноцитохимия. Для иммуноцитохимического анализа экспрессии АроА-1 макрофаги ТНР-1 культивировали на пластиковых покровных стеклах (Tissue Culture Coverslips 13 mm, "Sarstedt"), а все манипуляции с моноцитами ТНР-1 проводили в суспензии. Клетки ТНР-1 фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS в течение 20 мин при +4°С, трижды отмывали PBS. Для детекции внутриклеточного АроА-1 клетки пермеабилизировали добавлением 0.1% TritonX-100, 1% BSA на PBS в течение 10 мин при +22°С; в случае определения АроА-1, связанного с наружной поверхностью клеточной мембраны, пермеабшшзацию не проводили. Далее препараты блокировали в течение 40 мин при +22°С в блокирующем буфере (1% BSA, 0.02% Tween-20, 1 мкг/мл неспецифических IgG человека на PBS). Клетки обрабатывали мышиными моноклональными антителами против АроА-1 человека в разведении 1:250 в 1% BSA, 0.02% Tween-20 на PBS при +37°С, 2 ч. После двукратной отмывки блокирующем буфером добавляли козьи поликлональные антитела меченые FITC против IgG мыши (Abeam, ab6669-l) в разведении 1:1000 в 1% BSA, 0.02% Tween-20 на PBS при +22°С 1 ч, трижды отмывали блокирующем буфером, один раз PBS и заключали в среду Vectashield (Vector Labs, USA), содержащую 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). В качестве контроля специфичности иммунного окрашивания использовали клетки, которые не обрабатывали антителами против АроА-1, но обрабатывали антителами, мечеными F1TC. Клетки анализировали методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при помощи Leika TCS SPE LCSM. Проточная цитофлуорометрия. Моноциты и макрофаги ТНР-1 культивировали в 24-луночных планшетах, как описано выше. Анализ клеток проводили при помощи проточного цитофлуориметра Epic Altra (Beckman Coulter, USA) и полученные результаты анализировали с использованием программного обеспечения Ехро32 (Beckman Coulter, USA).

Получение ядерных экстрактов, гель-ретардация и супер-шифт в геле. Ядерные экстракты из культивируемых клеток получали, как описано (Andrews and Faller, 1991). Концентрацию белка в ядерных экстрактах определяли по методу Бредфорд. В экспериментах по гель-ретардации использовали синтетические двуцепочечные олигонуклеотиды: HRE-A: 5'-CATGAACCCTTGACCCCTGCCCTG-3' и 3'-CTTGGGAACTGGGGACGGGACTGT-5'; HRE-C: 5'-

CTTGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3' и З'-CTCGACTAGGAACTTGAGAATTCTAG-5'. Олигонуклеотиды метили [a32P]dCTP или [oc32P]dGTP посредством ДНК-полимеразы фага Т4 (обменная реакция по З'-концу), или посредством фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (достройка выступающих 5'-концов), а также [у32Р]АТР посредством полинуклеотидкиназы фага Т4, согласно (Kadonaga et al., 1987). Ретардацию выполняли, как описано (Kadonaga et al., 1987). Для проведения экспериментов по супер-сдвигу в геле к белкам ядерных экстрактов перед добавлением меченых олигонуклеотидов добавляли указанные антитела (2 мкг в 10 мкл) и инкубировали 1 ч при 4°С. Пробы разделяли электрофорезом в 5% неденатурирующем полиакриламидном геле. Гель, приготовленный на трис-боратном буфере, фиксировали в 10% этаноле + 10% уксусной кислоте в течение 15 мин, высушивали и радиоавтографировали.

Статистический анализ. Результаты представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. Статистический анализ различий между сравниваемыми группами выполняли с использованием проверки по непарному /-критерию Стьюдента, либо по критерию Даннета в случаях множественного сравнения с контрольной группой. Все статистические анализы выполняли с использованием программы Statistica 5.0, "StatSoft, Inc., США".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. TNFa угнетает активность 5'-регуляторной области гена ароА-1 человека в клетках HepG2

Ранее было показано, что TNFa угнетает экспрессию гена ароА-I в клетках HepG2 (Song et al., 1998; Haas et al., 2003). Чтобы определить район, отвечающий за угнетающее действие TNFa на транскрипцию гена ароА-1 человека, мы использовали набор делеционных вариантов 5'-регуляторной области гена ароА-1 человека (Рис. 1). TNFa угнетает активность всех использованных нами генетических конструкций, в том числе, негативно регулирует активность плазмиды, содержащей 5'-регуляторную область гена ароА-1 человека с координатами -256...+72 п.о. относительно точки инициации транскрипции (pAPOA-I(-256/+72)-Luc), т. е. лишенной всех регуляторных участков, за исключением собственно промотора и гспацитарного энхансера (Рис. 1).

2. NFkB и МАР-кпназы участвуют в TNFa-зависимом угнетении транскрипции гепа ароА-1 и секреции белка АроА-1 в клетках HepG2 Известно, что в ходе воспаления TNFa активирует внутриклеточные сигнальные пути NFkB и МАР-киназ (Basak and Hoffmann, 2008; Moon et al., 2004), что приводит к изменению уровней экспрессии различных генов в гепатоцитах (Wullaert et al., 2006). Результаты Real Time RT-PCR показывают, что TNFa через 24 ч угнетает экспрессию гена ароА-1 в клетках HepG2 на 30 ±3.7% по сравнению с уровнем экспрессии этого гена в контрольных клетках (без добавления TNFa). Ингибирование NFkB, JNK и р38 приводит к отмене угнетающего эффекта TNFa на экспрессию гена ароА-1 в клетках HepG2 (Рис. 2). Ингибирование МЕК1/2 приводит к усилению экспрессии гена ароА-1, но не влияет на степень подавления транскрипции ароА-1 при действии TNFa (Рис. 2). Секреция АроА-1 клетками HepG2 через 24 ч после добавления TNFa достоверно уменьшается на 36.6 ±2.7% относительно уровня секреции этого белка контрольными клетками. Добавление ингибитора киназ МЕК1/2 приводит к увеличению секреции АроА-1, в то время как ингибиторы киназ JNK, р38 и фактора транскрипции NFkB в разной степени уменьшают секрецию этого белка клетками HepG2 (Рис. 2 б). Угнетение секреции АроА-1 клетками HepG2 при действии TNFa блокируется при добавлении ингибиторов JNK и р38, но не отменяется при добавлении ингибиторов МЕК1/2 и NF-кВ (Рис. 2 б).

-мет

-222 -110 -41 не

"LUC | pAPOA-4-2497/+t73)-Luc

g не luc |

pAPOA^-256/^173Ц.ЦС

pAPOA-i(-2497/+72)-Lue

cQEHMZSO

pAPOA-l(-25e(t72)-Luc

до

D-TNFil ш+tnfu

3

eoo aoo RLA, %

Рисунок 1. Влияние TNFa на 5' -регупяторную область гена ароА-\ человека (люциферазный тест): активности ллазмид, содержащих делеционные варианты 5'-регуляторной области гена ароА-l человека в клетках HepG2:

LUC - ген люциферазы светлячка, НЕ - гепацитарный энхансер гена ароА-l человека, черные прямоугольники - I экзон гена ароА-l человека, стрелка -каноническая точка инициации транскрипции (ТИТ) гена ароА-l человека; цифры указывают координаты относительно ТИТ гена ароА-l человека (+1). RLA -условные единицы активности люциферазы. Представлены результаты пяти независимых экспериментов как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

3. Ядерный рецептор HNF4a участвует в угнетении экспрессии гена ароА-I человека в клетках HepG2 при действии TNFa

5'-регуляторная область гена ароА-I человека содержит хорошо охарактеризованные сайты связывания для фактора транскрипции HNF4a (Harnish et al., 1994). Для определения роли HNF4a в подавлении экспрессии гена ароА-I при действии TNFa мы провели котрансфекцию клеток HepG2 генетической конструкцией, содержащей 5'-регуляторную область гена ароА-I человека, и векторами экспрессии гена HNF4a либо доминантно-негативной формы гена HNF4a. Добавление TNFa приводит к подавлению активности генетической конструкции, содержащей 5'-регуляторную область гена ароА-I человека, в 4.9 + 1.4 раза. Уровень подавления при действии TNFa не уменьшается в присутствии избытка HNF4a (в 6.2 ± 0.4 раза), и возрастает в присутствии избытка доминантно-негативной формы HNF4a (в 9.7 ± 0.3 раза).

Рисунок 2. Регуляция транскрипции эндогенного гена ароА-1 и секреции белка АроА-1 при действии TNFa в кпетках HepG2: роль протеинкиназных каскадов MAP и фактора транскрипции NFkB: а - Real Time RT-PCR: значения по оси Y обозначают относительный уровень транскрипции (100% в контрольных кпетках HepG2); 6 - анализ содержания белка ароА-1 в культуральной среде методом ELISA после добавления к клеткам HepG2 TNFa: Контроль - клетки HepG2 без добавления ингибиторов; значения по оси Y обозначают уровень белка ароА-1 (нг/мл) в культуральной среде, приведенные к 1 мг клеточного белка. Белые столбики - клетки без добавления TNFa, черные - клетки, к которым добавляли TNFa. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ различий между группами (с и без добавлением TNFa) выполняли с использованием проверки по непарному t-критерию Стьюдента (п=6, * р < 0.05, ** р < 0.01) и по критерию Даннета (n=6, # р < 0.05).

4. Ядерные рецепторы PPARa и LXRs участвуют в регуляции экспрессии гена ароА-1 человека и секреции АроА-1 в клетках HepG2 при действии TNFa

Известно, что в регуляции экспрессии гена ароА-1 человека в клетках печени важную роль играют ядерные рецепторы PPARa (Martin et al., 2001) и LXRs (Huuskonen et al., 2006), взаимодействующие с гепацитарным энхансером этого гена. Мы показали, что добавление к клеткам HepG2 синтетического агониста PPARa WY-14643 приводит к увеличению, а добавление антагониста PPARa МК886 или агониста LXRs Т0901317 - к уменьшению уровня экспрессии эндогенного гена ароА-1. Одновременно с этим, добавление к клеткам HepG2 МК886 и Т0901317 приводит к отмене угнетающего действия TNFa на экспрессию эндогенного гена ароА-1.

Добавление синтетических лигандов РРАЯа (\VY-14643 или МК886) и ЬХЯв (Т0901317) в ростовую среду клеток НерС2 приводит к уменьшению секреции АроА-1, и отменяет дальнейшее подавление секреции АроА-1 при действии ТОТа. Действие синтетических лигандов РРА11а и ЬХЯв на ТОТа-зависимую регуляцию транскрипции гена ароА-1 подтверждено при трансфекции клеток НерС2 генетическими конструкциями, содержащими делеционные варианты 5'-регуляторной области гена ароА-1.

5. РРАИу подавляет экспрессию гена ароА-1 и секрецию белка АроА-1 в клетках НерС2 и принимает участие в Т1ЧРа-зависимой регуляции экспрессии этого гена

Приведенные на Рис. 6 результаты свидетельствуют о регуляции экспрессии гена ароА-1, а также секреции белка АроА-1 со стороны РРАЯу. Обработка клеток Нер02 агонистом РРАКу (GW1929) приводит к достоверному уменьшению экспрессии гена ароА-1, а также секреции белка АроА-1 в культуральную среду (Рис. 3).

200

<

О 100

о. го

S*£ X о.

z

50

TNF а - + - + - + -GW1929 --++-- + GW9662 ----+ + +■

150

с;

JE

im

<

° 50 <

TNF« GW1929 GW9662

+ - + - + --++-- +

" * 4* "f

Рисунок 3. Роль PPARy в регуляции экспрессии эндогенного гена г~ ^A-l и секреции белка АроА-1 при действии TNFa в клетках HepG2: а - Ret' Пте RT-PCR: значения по оси Y обозначают относительный уровень транскрип; м (100% в контрольных клетках HepG2); б - анализ содержания белка , \poA-l в культуральной среде методом ELISA. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ различий между группами (с и без добавлением TNF«) выполняли с использованием проверки по непарному f-критерию Стьюдента (п=12, * р < 0.05) и по критерию Даннета (отличие от контрольных клеток, к которым не добавляли синтетические лиганды, ингибиторы и TNFa) (n=12, # р < 0.05).

Обработка клеток HepG2 антагонистом PPARy (GW9662) не влияет на экспрессию гена apoA-I, а также содержание белка АроА-1 в культуралыюй среде. Добавление к клеткам HepG2 одновременно агониста и антагониста PPARy также не влияет на транскрипцию гена ароА-1 и содержание белка АроА-1 в культуралыюй среде. Эти результаты показывают специфический PPARy-зависимый характер действия GW1929 и GW9662 на экспрессию гена ароА-1 в клетках HepG2. Интересно, что агонист PPARy отменяет подавление экспрессии гена ароА-1 при действии TNFa, но не TNFa-зависимое угнетение секреции белка АроА-1 в клегках HepG2, в то время как антагонист PPARy не влияет на TNFa-зависимое подавление экспрессии гена и секреции белка АроА-1 (Рис. 3).

6. TNFa уменьшает количество PPARa и увеличивает количество LXRp, связанных с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в клетках HepG2 Добавление TNFa к клеткам HepG2 приводит к примерно двукратному уменьшению количества PPARa, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1. В то же время, количество LXRp, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1, возрастает в 3 раза после добавления TNFa к клеткам. Наши результаты говорят о том, что PPARy способен взаимодействовать с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в клетках HepG2. В то же время, обработка клеток HepG2 TNFa не приводит к изменению уровня PPARy, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1.

7. Эндогенный ген ароА-1 экспрессируется в моноцитах и макрофагах, полученных из мононукдеаров периферической крови человека, и в клетках моноцитарно-макрофагалыюй линии человека ТНР-1

Как показано на Рис. 4, мРНК ароА-1 обнаруживается в моноцитах и макрофагах, полученных из периферической крови человека, а также в моноцитах и макрофагах, полученных при дифференцировке клеток ТНР-1 под действием форболового эфира (РМА), в то время как в фибробластах кожи человека VH-10 экспрессия гена ароА-1 не обнаружена (не показано на рисунке). Уровень экспрессии гена ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда увеличивается при дифференцировке моноцитов, полученных из периферической крови человека, в макрофаги, а также при дифференцировке моноцитов ТНР-1 в макрофаги (Рис. 4 а). Относительное содержание мРНК ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда указано в Таблице 1. Результаты количественной Real Time RT-PCR показывают, что перитониальные макрофаги мыши тоже экспрессируют ген ароА-1, причем уровень мРНК этого гена составляет 0.0010±0.0003% от уровня мРНК ароА-1 в печени мыши. Рис. 5 показывает влияние TNFa на уровень экспрессии гена ароА-1 в моноцитах и макрофагах человека. Уровень активации экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1 зависит от

концентрации TNFa (Рис. 5 а). Временная динамика экспрессии гена ароА-I в ответ на обработку моноцитов ТНР-1 TNFa (10 нг/мл) показана на Рис. 5 б. Эндогенно синтезированный белок АроА-I обнаружен в клеточных лизатах моноцитарно-макрофагальной линии клеток человека ТНР-1, но не в лизатах фибробластов человека VH-10 (Рис. 6). Обработка клеток ТНР-1 TNFa (10 нг/мл, 24 ч) приводит к увеличению содержания белка ароА-I в моноцитах ТНР-1, но не влияет на его синтез в макрофагах ТНР-1 (Рис. 5 6).

Я б + TNF«

1000000

8

=г

СЗ 7 сз '

I 6

«3 5

J3

s 4

О

g 3 2

1

s g

I

■е-

Рисунок 4. Экспрессия эндогенного гена ароА-I в моноцитах и макрофагах человека: а - транскрипция гена ароА-I в клетках ТНР-1 и моноцитах периферической крови человека, Real Time RT-PCR: значения по оси Y указывают относительный уровень мРНК apciA-l (100% в моноцитах ТНР-1); 3 сут. и 7 сут. -макрофаги ТНР-1 через 3 и 7 суток с начала дифференцировки, соответственно; МПК моноциты и макрофаги - моноциты и макрофаги, полученные из мононуклеаров перефирической крови человека; б - уровень акт'-.ации транскрипции гена ароА-I при действии TNFa (10 нг/мл), где 1 сост' етствует уровню транскрипции гена ароА-I без добавления TNFa. Р зультаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ различий между группами выполняли с использованием проверки по критерию Даннета (п-6, #р < 0.05; ##р < 0.01).

Анализ содержания белка ароА-I в кулиуральной среде методом иммуно-блоттинга демонстрирует крайне низкий уровень его секреции моноцитами ТНР-1 и практически полное отсутствие секреции белка АроА-I макрофагами ТНР-1 (Рис. 6). В то же время, обработка клеток ТНР-1 TNFa (10 нг/мл, 24 ч)

приводит к значительному увеличению секреции белка АроА-1 (Рис. 6). Непрямая иммунофлуоресциентная конфокальная микроскопия показывает, что белок АроА-1 локализуется на клеточной мембране и в виде внутриклеточных включений в макрофагах ТНР-1. Распределение макрофагов ТНР-1 по содержанию белка АроА-1 показывает наличие двух популяций клеток через 3 суток с начала дифференцировки: содержащих и не содержащих АроА-1 (Рис. 6). Обработка хлегок ТНР-1 ЮТа (10 нг/мл, 24 ч) приводит к увеличению содержания внутриклеточного белка АроА-1 в моноцитах ТНР-1, но не в макрофагах ТНР-1 (Рис. 6).

3 зов»

„ 2500

04

V 2000

<

О

а.

(О 1500

^

X

Л 1000 500

о

Рисунок 5. Экспрессия эндогенного гена apoA-l в моноцитах и макрофагах человека при действии TNFa: а - влияние различных концентраций TNFa на уровень транскрипции гена ароА-l в моноцитах ТНР-1 через 24 ч после добавления TNFa; б - к моноцитам ТНР-1 был добавлен TNFa (10 нг/мл) или равный объем культуральной среды с BSA (10 нг/мл), после чего клетки инкубировали указанное время и измеряли уровень мРНК ароА-l. Real Time RT-PCR: значения по оси Y указывают относительный уровень мРНК apoA-l (100% в моноцитах ТНР-1 ). Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ различий между группами выполняли с использованием проверки по критерию Даннета (п=6, #р < 0.05; ##р < 0.01).

Известно, что АроА-1 взаимодействует с АТФ-зависимым кассетным транспортером АВСА1 на внешних мембранах макрофагов, осуществляя механизм обратного транспорта холестерола из этих клеток (Oram, 2003), а также запускает внутриклеточный сигнапинг, влияющий, в том числе, на воспалительные функции макрофагов (Seeiharam et al., 2006; Nofer et al., 2006; Diederich et al., 2001; Murphy et al., 2008; Rye and Barter, 2008). Возможно, что эндогенно синтезированный белок АроА-1, локализованный

5 10 40

TNFa, нг/мл

<

о a

го ^

г

cl

800 700 600 500 400 300 200 100 О

0 1 2 3 6 10 24 48

Время после добавления TNFa, ч

на плазматической мембране макрофагов, может взаимодействовать с АВСА1 на поверхности этих клеток. Эндогенно синтезированный белок АроА-1, секреция которого моноцитами-макрофагами стимулируется ЮТа, может выступать в роли своеобразного «буфера», препятствующего развитию субпорогового восп&тения на ранних стадиях воспалительного процесса, и может играть защитную роль на начальных стадиях развития атеросклеротических повреждений сосудов.

Таблица 1. Относительное содержание мРНК ароА-1 в клетках НерС2, клетках ТНР-1 и моноцитах/макрофагах, полученных из мононуклеаров периферической крови человека!.

Клетки Относительное содержание мРНК ароА-1, %

Нерэг 100 ±8

ТНР-1 моноциты 0.03 ± 0.01

ТНР-1 макрофаги 3 суток 0.17 ±0.01

ТНР-1 макрофаги 7 суток 1.28 ±0.12

МПК моноциты 0.26 ± 0.04 .

МПК макрофаги 3 суток 4.07 ± 0.99

МПК макрофаги 7 суток 18.4 ± 12.6

Содержание мРНК ароА-1 нормировано по уровню мРНК в АРОН, за 100% принято содержание мРНК ароА-1 в клетках НерС2. Макрофаги 3 сутки и 7 сутки - 3 и 7 суток с начала дифференцировки клеток ТНР-1 или моноцитов периферической крови в макрофаги, МПК - мононуклеары периферической крови человека. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего для 4 независимых экспериментов.

8. Роль ОТкВ, МАР-киназного сигнального каскада и ядерных рецепторов РРАНа и ЬХ!^ в ТХЕа-зависимон активации экспрессии гена ароА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-1

Ингибирование сигнальных путей ОТкВ, р38 или ЖК в моноцитах ТНР-1 приводит к увеличению уровня экспрессии гена ароА-1 приблизительно в 2 раза, в то время как ингибирование МЕК1/2 увеличивает экспрессию этого гена в 4 раза. Ингибирование ЖК или МЕК1/2 отменяет увеличение экспрессии гена ароА-1 в ответ на добавление к моноцитам ТНР-1 ЮТа, в то время как ингибирование ОТкВ или р38 практически не влияет на уровень ЮТа-зависимой активации экспрессии этого гена (Рис. 7). Дифференцировка клеток ТНР-1 в макрофаги приводит к отмене активации экспрессии гена ароА-1 при ингибировании сигнальных путей №кВ, р38, ЖК или МЕК1/2 (Рис. 7). Добавление ЮТа (10 нг/мл, 24 ч) к макрофагам ТНР-1 (3 суток с начала дифференцировки) приводит к активации экспрессии гена ароА-1 на 44.5 ± 9.6% по сравнению с контрольными клетками (Рис. 7).

Э TNFö

: apoA-l ■ актин

б

TNFa

: ароА-i

моноциты макрофаги VH-10 THP-1 THP-1

моноциты макрофаги VH-10 ТНР-1 тнр-1

В

»«• -AB&;apoA-l +2nd AB *■■» -TNFa -- +TNFa

Внутриклеточный

Мембранный

87% М=22.3 ■ 91%М=26.Э

ароА

ароА-1

Рисунок 6. Продукция, секреция и локализация эндогенно синтезированного белка ApoA-l в моноцитах и макрофагах ТНР-1: а - анализ содержания белка ApoA-l в клетках ТНР-1; б - анализ секреции белка ApoA-l в культуральную среду (эквивалент 250 мкп среды) клетками ТНР-1 за 24 ч в присутствии и без TNFa; в -анализ влияния TNFa (10 нг/мл, 24 ч) на содержание внутриклеточного и связанного с мембраной АпоА-l в моноцитах и макрофагах ТНР-1 методом проточной цитофлуорометрии. Указан процент клеток положительных по содержанию белка ApoA-l. М - арифметическая медиана распределения. Использовали монокпональные антитела против ApoA-l человека; было установлено, что эти антитела дают только две полосы при Вестерн-блоте, соответствующие по молекулярной массе про-белку и зрелому ApoA-l человека и не связывают в использованных концентрациях другие внутриклеточные белки или белки FCS. Эксперименты повторяли три раза, результат воспроизводился в каждом эксперименте. На рисунке представлены результаты одного эксперимента.

Рисунок 7. Регуляция экспрессии гена ароА-1 в моноцитах (а, в) и макрофагах через 3 суток с начала дифференцировки (б, д) ТНР-1 при действии TNFa:

роль МАР-киназных каскадов, фактора транскрипции NFkB и ядерных рецепторов PPARa и LXRs, Real Time RT-PCR; значения по оси Y соответствуют относительному уровню транскрипции гена apoA-l (100% в контрольных клетках); контроль - клетки ТНР-1 без добавления ингибиторов или синтетических лигандов; Заштрихованные столбики - клетки, к которым не добавляли TNFa, черные столбики - клетки, к которым добавляли TNFa. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего для 6 независимых экспериментов. Статистический анализ различий между группами сравнения (с или без TNFa) проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента (*р < 0.05, **р < 0.01, ***р < 0.001). Статистический анализ различий между уровнями транскрипции гена ароА-1 в контрольных клетках и клетках, к которым добавляли ингибиторы или синтетические лиганды, проводили с использованием критерия Даннета (#р < 0.05, ##р < 0.01).

Ингибирование сигнальных путей №'кВ, р38 или ЖК. в макрофагах ТНР-1 приводит к отмене ТОТа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 (Рис. 7). Добавление к клеткам синтетического антагониста РРЛРх/, (МК886) или агониста ЬХИз (Т0901317) приводит к увеличению экспрессии гена ароА-1 как в моноцитах, так и в макрофагах ТНР-1 (Рис. 7). В то же время, добавление агониста РРАНа (\\ПГ-14643) не влияет на уровень экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1, однако отменяет ЮТа-зависимую активацию экспрессии этого гена, как в моноцитах, так и в макрофагах (Рис. 7). Добавление к моноцитам или макрофагам ТНР-1 Т090131 также отменяет увеличение экспрессии гена ароА-1 в ответ на ТОТа (Рис. 7). Обработка клеток ТНР-1 МК886 приводит к уменьшению ТОТа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в несколько раз в моноцитах ТНР-1 (Рис. 7).

9. Влияние Т№а на связывание ядерных рецепторов РРАИа и ЬХЩ1 с гепацитарным энхансером гена ароА-1 человека в моноцитах и макрофагах ТНР-1

Иммунопреципитация хроматина моноцитов и макрофагов ТНР-1 с использованием антител к РРАЯа и ЬХРф показывает, что уровень РРАНа, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1, не изменяется при дифференцировке клеток ТНР-1 в макрофаги. В то же время, уровень ЬХЛР, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1 при дифференцировке клеток ТНР-1 в макрофаги, увеличивается приблизительно в 1.8 раза по сравнению с моноцитами ТНР-1. Добавление к клеткам ТОРа (10 нг/мл) не влияет на уровень РРАЛа, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в моноцитах ТНР-1, но уменьшает уровень РРАЯа, ассоциированного с гепацитарным энхансером в макрофагах ТНР-1, приблизительно в 2 раза через 24 ч. Уровень ЬХ11р, связанного с гепацитарным энхансером гена ароА-1, увеличивается примерно в 1.5 раза в моноцитах и уменьшается приблизительно в 1.3 раза в макрофагах через 24 после воздействия ТОТа на клетки ТНР-1.

Методами задержки ДНК-белковых комплексов в геле (ЕМ8А) и «суперсдвига» ДНК-белковых комплексов показано, что РРА11а связывается с сайтом НКЕ-А, а ЬХЯр взаимодействуете сайтом НЯЕ-С в составе гепацитарного энхансера гена ароА-1 в клетках ТНР-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что сигнальные пути ОТкВ, ЖК и р38, но не МЕК1/2 участвуют в механизме подавления экспрессии эндогенного гена ароА-1 в клетках Нерв2 при действии ЮТа. ЮТа-зависимое угнетение транскрипции гена ароА-1 опосредовано РРА11а и ЬХГф, в том числе за счет уменьшения уровня положительного (РРАЛа.) и увеличения уровня отрицательного (ЬХ1ф) регуляторов транскрипции гена ароА-1, связанных с

НКЕ гепацитарного энхансера гена ароА-1 в клетках Нер02. В данной впервые показано, что РРАЛу является отрицательным лиганд-зависимым регулятором транскрипции гена и секреции белка АроА-1 в клетках НерС2. Отмена ЮТа-зависимого подавления транскрипции гена ароА-1 при активации РРАЛу опосредована гепацитарным энхансером гена ароА-1. В нашей работе впервые показана транскрипция эндогенного гена ароА-1 и синтез белка АроА-1 клетками моноцитарно-макрофагального ряда. Представленные данные свидетельствуют о том, что обработка моноцитов и макрофагов ТНР-1 ТОТа приводит не только к увеличению транскрипции гена ароА-1, по также и к индукции секреции белка АроА-1. ЮТа-зависимая активация экспрессии гена ароА-1 контролируется сигнальными путями ЖК и МЕК1/2 в моноцитах. В то же время, в макрофагах ингибирование любого из ЖК, р38 или №кВ сигнальных путей ведет к ослаблению или отмене активации экспрессии гена ароА-1 в этих клетках. В моноцитах и макрофагах ТНР-1 ЬХЯа лиганд-зависимым образом активируют экспрессию гена ароА-1, в то время как РРАИа отрицательно регулирует транскрипцию гена ароА-1, и оба указанных ядерных рецептора связываются с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-1. ЬХЕз и РРАЯа участвуют в механизме активации экспрессии гена ароА-1, опосредованной ЮТа в клетках моноцитарно-макрофагального ряда.

ВЫВОДЫ

1. МАР-киназные каскады ЖК и р38, но не МЕК1/2 принимают участие в ЮТа-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2. Фактор транскрипции №кВ и ядерные рецепторы ЬХКб, РРАЯа и РРАЯу, но не НОТ4а повлечены в ЮТа-зависимое подавление экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2.

2. Впервые показано, что экспрессия гена ароА-1 происходит в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека на уровне образования мРНК и белка АроА-1.

3. Дифференцировка моноцитов в макрофаги сопровождается прогрессивным увеличением экспрессии гена АроА-1.

4. ТОТа значительно активирует экспрессию гена ароА-1 в кл' гках моноцитарно-макрофагального ряда.

5. МАР-киназные каскады ЖК и МЕК1/2, но не р38, а такж ядерные рецепторы ЬХЯз и РРАЯа, но не фактор транскрипцки ЫРкВ участвуют в ТОТа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в моноцитах ТНР-1.

6. МАР-киназные каскады Ж К, р38, а также ядерные рецепторы ЬХЛб и РРАЛа и фактор транскрипции NFкB участвуют в ЮТа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в макрофагах ТНР-1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Orlov S. V., Mogilenko Р. A.. Shawa V. S. Dizhe E. В., Ignatovich I. A., Perevozchikov A. P. (2010) Effect of TNFa on activities of different promoters of human Apolipoprotein A-I gene. Biochem Biopliys Res Commnn. V.398(2), P.224-230.

2. Mogilenko P. A.. Dizhe E. В., Shawa V. S., Lapikov I. A., Orlov S. V., Perevozchikov A. P. (2009) Role of the nuclear receptors HNFci, PPARa, and LXRs in the TNFa-mediated inhibition of human Apolipoprotein A-I gene expression in HepG2 cells. Biochemistry. V.48(50), Р.11950-И960.

3. Лапиков И. А., Могиленко Д. А.. Диже Э. Б., Игнатович И. А., Орлов С. В., Перевозчиков А. П. Apl-подобпые цис-элеменгы в 5'-регулторной области гена аполилопротеина A-I человека. (2008) Мол. Биол. Т.42, № 2, С. 295-305.

4. Акнфьев Б. Н., Диже Э. Б., Ефремов А. М., Могиленко Д. А.. Олейникова Г. Н., Лапиков И. А., Жданова О. Ю., Кидготко О. В., Орлов С. В., Перевозчиков А. П., Перенос гена аполилопротеина A-I человека мышам методом гидродинамических инъекций: факторы, влияющие на эффективность и продолжительность экспрессии гена в печени животного. (2004) Мол. Биол. Т.38, С.1076-1084.

5. Mogilenko Р. A.. Orlov S. V., Trulioff A. S., Nagumanov V. К., Perevozchikov А. Р. (2009) Evidence for expression of human apolipoprotein A-I gene in monocyte/macrophage cells. FEBS Journal, V. 276, Suppl.l, P.378.

6. Могиленко Д. А. Регуляция экспрессии гена аполипопротеина A-I человека в клетках моноцитарно-макрофагального ряда при действии фактора некроза опухоли альфа. (2009) Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009». 13-18 апргля, 2009 г., Москва, Россия, С.188-189.

7. Могиленко Д. А.. Орлов С. В., Трулев А. С., Кудрявцев И. В., Перевозчиков А. П. (2009) Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека в клетках ТНР-1. Медицинская иммунология, Т. 11, №4-5, С.325-326.

8. Mogilenko Р.. Orlov S., Trulioff A., Perevozchikov A. Expressoin and localization of apolipoprotein A-I in human macrophages and monocytes. (2009) Abstract book of International Conference "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", 9-10 November 2009, St. Petersburg, Russia, P.21-22.

9. Могиленко Д. А.. Орлов С. В., Диже Э. Б., Чернова А. А., Нагуманов В. К., Перевозчиков А. П. (2008) Дифференциальная регуляция экспрессии гена аполипопротеина A-I человека в гепатоцитах и макрофагах при действии TNFa. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье», Т.12, №2, С.26.

10. Могиленко Д. А.. Орлов С. В., Диже Э. Б., Виленская Е. Г., Перевозчиков А. П. Влияние TNFa на дифференциальную активность альтернативных промоторов гена аполипопротеина A-I человека. (2007) Русский :курнал «СПИД, рак общественное здоровье», Т.11, №1, С88-89.

Denis Mogilenko

Dissertation Thesis: "Regulation of Human Apolipoprotein A-I Gene Expression under the Impact of Tumor Necrosis Factor a".

Apolipoprotein A-I (ApoA-I) is the main structural and functional protein component of human high-density lipoproteins. The expression of the apolipoprotein A-I gene (apoA-I) in hepatocytes is repressed by proinflammatory cytokines such as IL-ip and TNFa. In this work, it has been demonstrated that treatment of human hepatoma HepG2 cells with chemical inhibitors for JNK, p38 protein kinases, and NFkB transcription factor abolishes the TNFa-mediated inhibition of human apoA-I gene expression in HepG2 cells. In addition, we have shown that TNFa decreases secretion of apoA-I protein by HepG2 cells, and this effect depends on INK and p38, but not on NFkB and MEK.1/2 signaling pathways. The inhibitory effect of TNFa has been found to be mediated by the hepatic enhancer of the apoA-I gene. The decrease in the level of human apoA-I gene expression under the impact of TNFa appears to be partly mediated by the inhibition PPARa gene expression. Treatment of HepG2 cells with PPARa antagonist (MK886) or LXRs agonist (T0901317) abolishes the TNFa-mediated downregulation of apoA-I gene expression. Treatment of HepG2 cells with PPARa and LXRs synthetic agonists also blocks the inhibition of apoA-I protein secretion in HepG2 cells under the impact of TNFa. A chromatin immnnoprecipitation assay demonstrates that TNFa leads to a 2-fold decrease in the level of PPARa binding with the apoA-I gene hepatic enhancer. At the same time, the level of LXRP binding with the apoA-I gene hepatic enhancer is increased 3-fold under the impact of TNFa. These results suggest that nuclear receptors PPARa, and LXRs are involved in the TNFa-mediated downregulation of human apoA-I gene expression and apoA-I protein secretion in HepG2 cells. We have shown that activation of nuclear receptor PPARy leads to inhibition of apoA-I gene expression and protein secretion in HepG2 cells. Treatment of HepG2 cells with PPARy agonist (GW1929) abolishes the TNFa-mediated decrease in the level of apoA-1 gene expression but does not block TNFa-mediated inhibition of ApoA-I protein secretion in HepG2 cells. We have shown for the first time the moderate expression of endogenous apoA-I gene in human peripheral blood mononuclear monocytes (PBM) and PBM-derived macrophages as well as in the human monocyte-macrophage cell line THP-1. The expression of apoA-I gene has been increasing in course of monocyte-macrophage cell differentiation. Endogenous ApoA-I is localized in intracellular vesicles and on outer side of plasma membrane of THP-1 cells. THP-1 macrophages are separated into two populations concerning the ApoA-I protein level - ApoA-I rich and ApoA-I poor cells. TNFa increases apoA-I gene expression and stimulates ApoA-I protein secretion in THP-1 cells. TNFa-mediated activation of apoA-I gene expression depends on JNK and MEK1/2 signaling pathways in THP-1 monocytes, whereas inhibition of NFkB, JNK, or p38 blocks TNFa-dependent activation of apoA-I gene expression in THP-1 macrophages. Treatment of THP-1 cells by synthetic ligands of PPARa and LXRs interferes with TNFa-mediated activation of apoA-I ger.c in THP-1 cells. At the same time, TNFa differently regulates the levels of PPARa and LXR(i binding with the apoA-I gene hepatic enhancer in THP-1 cells. Obtained results elucidate the tissue-specific mechanism of the .TNFa-mediated regulation of apoA-I gene expression in hepatocytes and monocyte-macrophage cells and suggest the possibility that macrophage endogenous synthesized ApoA-I may be involved in control of inflammation and atherosclerotic lesions formation.

Подписано в печать 14.09.2010 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 26

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Могиленко, Денис Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Функции липопротеинов высокой плотности человека.

2.2 Структура и функции аполипопротеина A-I человека.

2.3. Организация кластера генов аполипопротеинов человека apoA-1/apoC-III/apoA-IV/apoA-V.

2.4. Регуляция экспрессии гена ароА-1 человека.

2.5 Регуляция экспрессии ароА-1 при воспалении.

2.6. Ядерные рецепторы: структура и функции.

2.7. LXRs.

2.8. PPARs.

2.9. HNF4a.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Ингибиторы сигнальных киназ, синтетические лиганды ядерных рецепторов и рекомбинантные белки.

3.2. Антитела.

3.3. Генетические конструкции.

3.4. Клеточные культуры и трансфекция.

3.5 Животные.

3.6. ß-галактозидазный и люциферазный тесты.

3.7. Обратная транскрипция.

3.8. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - RealTime-PCR.

3.9. Иммунопреципитация хроматина (ChIP).

3.12. Иммуноферментный анализ (ELISA).

3.13. Вестерн-блоттинг.'.

3.14. Иммуноцитохимия.

3.15. Проточная цитофлуорометрия.

3.16. Получение ядерных экстрактов, гель-ретардация и супер-шифт в геле.

3.17. Статистический анализ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. TNFa угнетает активность 5'-регуляторной области гена ароА-1 человека в клетках HepG2.

4.2. NFkB и MAP -киназы участвуют в TNFa-зависимом угне гении экспрессии гена ароА-1 и секреции АроА-1 в клетках HepG2.

4.3. Ядерный рецептор НЫР4а участвует в угнетении экспрессии гена ароА-1 человека в клетках НерС2 при действии ТОТа.

4.4. Ядерные рецепторы РРАЯа и ЬХЯб участвуют в регуляции экспрессии гена ароА-1 человека и секреции АроА-1 в клетках Нерв2 при действии ТИРа.

4.5. РРАИу подавляет экспрессию гена ароА-1 и секрецию белка АроА-Г в клетках НерС2 и принимает участие в ТОТа- зависимой регуляции экспрессии этого гена.

4.6. РРАЯу подавляет транскрипцию гена ароА-1 через гепацитарный энхансер в клетках Нер02.

4.7. ТЫ Ра уменьшает количество РРАИсх и увеличивает количество ЬХЛр, связанных с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в клетках Нер02.

4.8. РРАЯу взаимодействует с гепацитарным энхансером гена ароА-1.

4.9. ТЫ Ра подавляет экспрессию генов ШЧР4а, РРАЯа, ЬХЯа и ЬХЯР в клетках Нерв

4.10. Влияние агониста и антагониста РРАЯу на взаимодействие РРАЯа и ЬХЯр с гепацитарным энхансером гена ароА-1.

4.11. РРАЯу регулирует экспрессию ЬШР4а, РРАЯа, LXR.cc и ЬХ11р в клетках Нер02.

4.12. Эндогенный ген ароА-1 экспрессируется в моноцитах и макрофагах, полученных из мононуклеаров периферической крови человека, и в клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека ТНР-1.

4.13. Экспрессия гена ароА-1, локализация и секреция белка АроА-1 в моноцитах и макрофагах ив клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека ТНР-1.

4.14. Роль ЫРкВ, МАР-киназного сигнального каскада и ядерных рецепторов РРАЯа и ЬХИэ в ТЫРа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-1.■.

4.15. Влияние ядерных рецепторов РРАЯа и ЬХ1^ на содержание белка АроА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-1.

4.16. Влияние ТЫРа на экспрессию генов РРАЯа, ЬХИа и ЬХЯр и на связывание ядерных рецепторов РРА11а и ЬХЯр с гепацитарным энхансером гена ароА-1 человека в моноцитах и макрофагах ТНР-1.

4.17. Взаимодействие РРА11а и ЬХЯР с НКЕ гепацитарного энхансера гена ароА-1 в макрофагах ТНР-1.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфа"

Актуальность проблемы. В фундаментальных медико-биохимических исследованиях было установлено, что высокий уровень аполипопротеина A-I (АроА-I) в плазме крови коррелирует с низким риском развития атеросклероза и ишемической болезни сердца. АроА-I человека входит в состав липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), участвует в обратном транспорте холестерола из периферических тканей в печень, обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и, по-видимому, может выступать в роли сигнальной молекулы. Известно, что главными местами экспрессии гена ароА-I и синтеза белка АроА-I у человека являются гепатоциты печени и энтероциты тощей кишки. Экспрессия гена ароА-I обнаружена также в плаценте, сердце, хрящевой ткани и в клетках желточного мешка зародышей млекопитающих. Вместе с тем, регуляция экспрессии гена ароА-I в клетках, отличных от энтероцитов и гепатоцитов, недостаточно охарактеризована.

В настоящее время все больше внимания вызывает представление об атеросклерозе как о процессе хронического воспаления (Hansson and Libby, 2006). Одним из ключевых факторов, участвующих в процессе воспаления при развитии атеросклеротических повреждений сосудов, является фактор некроза опухоли альфа (TNFa) (Canault et al., 2008). TNFa угнетает транскрипцию и снижают секрецию ароА-I в гепатоцитах человека (Song et al., 1998; Haas et al., 2003), а также приводит к уменьшению как содержания АроА-I в составе ЛПВП, так и уровня ЛПВП в плазме крови (Khovidhunkit et al., 2004; Esteve et al., 2005).Тем не менее, молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена ароА-I при действии провоспалительных цитокинов все еще недостаточно изучены. Интересным и важным является изучение регуляции экспрессии гена ароА-I при действии провоспалительных цитокинов, таких как TNFa, в гепатоцитах и клетках мопоцитарно-макрофагального ряда.

Цели работы. Целью диссертационной работы является изучение гканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-I человека при действии TNFa в клетках HepG2 и ТНР-1, а также выяснение роли сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2, NFkB и ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в этом процессе.

Задачи исследования.

1. Изучить регуляцию экспрессии гена ароА-I в клетках гепатомы человека HepG2 при действии TNFa.

2. Исследовать возможность экспрессии гена ароА-I в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека,ТНР-1 и её регуляции при действии TNFa.

3. Изучить роль сигнальных путей Ж, р38, МЕК1/2 и ОТкВ, а также ядерных рецепторов НЫР4а, РРАЫа, РРАЛу и ЬХЯ$ в регуляции экспрессии гена ароА-1 в клетках Нер02 и ТНР-1. Научная новизна полученных результатов. Впервые показано участие ядерного рецептора РРАЯу в регуляции экспрессии гена ароА-1 в клетках гепатомы человека (Нер02). Установлена роль ядерных рецепторов НЫР4а, РРАЯа, РРЛКу и ЬХЯя в ГЫРа-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках Нер02.

Впервые показано, что ген ароА-1 экспрессируется в культивируемых человеческих клетках моноцитарно-макрофагального ряда - ТНР-1, в моноцитах и макрофагах, полученных из периферической крови человека, в перитониальных макрофагах мыши, причём экспрессия этого гена стимулируется при добавлении к клеткам провоспалительного цитокина ТЫТа.

Показано участие сигнальных путей ЖК, р38, МЕК1/2, №кВ и ядерных рецепторов РРАЯа и ЬХИз в ШРа-зависимой стимуляции экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1. Практическое значение результатов исследования. Полученные результаты расширяют наши представления о тканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-1, а также указывают на механизмы регуляции экспрессии этого гена при действии на клетки провоспалительного цитокина ТЫРа. Предложена гипотеза о противовоспалительной роли эндогенно-синтезированного АроА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда. Результаты, полученные в этой работе, дополняют представления о роли ТЫРа и АроА-1 в развитии нарушений липидного обмена и могут быть использованы при разработке методов тканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-1 с целью терапии атеросклероза.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Показана роль сигнальных путей ЛЫК, р38, МЕК1/2 и ЫРкВ в угнетении экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2 при действии ТЫРа.

• Показана экспрессия гена ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда ТПР-1 и установлена ТЫРа-зависимая активация транскрипции этого гена.

• Установлено, что сигнальные пути ЖК, р38, МЕК1/2 и ЫРкВ принимают участие в активации экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1 при действии ТЫРа.

• Выяснено участие ядерных рецепторов НЫР4а, РРА11а, РРАЯу и ЬХЯэ в ТЫРа-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках Нер02, а также установлено, что РРАЯа и ЬХЯб участвуют в активации транскрипции гена ароА-1 в клетках ТНР-1 при действии ТЫРа.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих конференциях: 16-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 28 мая - 1 июня, 2007 г., Санкт-Петербург, Россия; 17-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 26 - 30 мая, 2008 г., Санкт-Петербург, Россия; XIII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 8-11 июня 2009 г., Санкт-Петербург, Россия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», 13-18 апреля, 2009 г., Москва, Россия; 34th FEBS Congress, 4-9 июля. 2009 г., Prague, Czech Republic; International Conference "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", 9-10 November 2009, St. Petersburg, Russia.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ.

Личный вклад автора в проведении исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Выделение РНК и клеточных белков, реакции обратной транскрипции и Real Time PCR, иммунопреципитация хроматина, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, конструирование генетических конструкций, люциферазный тест и выделение ядерных белков выполнены соискателем. Культивирование клеточных линий HepG2 и ТНР-1 выполнено совместно с к.б.н. Э.Б. Диже и A.C. Трулевым. Эксперименты по проточной цитофлуорометрии выполнены совместно с к.б.н. И.В. Кудрявцевым. Задержка белков в геле выполнена совместно с к.б.н. C.B. Орловым.

Внедрение результатов работы. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процесс Отдела биохимии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Россия, 197376, ул. Ак. Павлова, 12), Кафедры эмбриологии и Кафедры цитологии и гистологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9).

Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 271 наименование, из них 3 источника на русском языке и 268 наименований на английском языке. Диссертация изложена на 106 страницах. Результаты представлены в 1 таблице и иллюстрированы 24 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Могиленко, Денис Александрович

6. выводы

1. МАР-киназные каскады РЫК и р38, но не МЕК1/2 принимают участие в ТЫРос-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2. Фактор транскрипции №кВ и ядерные рецепторы ЬХЯэ, РРАЯа и РРАЯу, но не НЫБ4а вовлечены в ТЫРа-зависимое подавление экспрессии гена ароА-1 в клетках НерС2.

2. Впервые показано, что экспрессия гена ароА-1 происходит в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека на уровне образования мРНК и белка АроА-1.

3. Дифференцировка моноцитов в макрофаги сопровождается прогрессивным увеличением экспрессии гена АроА-1.

4. ТЫРа значительно активирует экспрессию гена ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда.

5. МАР-киназные каскады ЖК и МЕК1/2, но не р38, а также ядерные рецепторы ЬХЯэ и РРАЯа, но не фактор транскрипции №"кВ участвуют в Т№а-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в моноцитах ТНР-1.

6. МАР-киназные каскады ЛЫК, р38, а также ядерные рецепторы ЬХЯэ и РРАИа и фактор транскрипции №кВ участвуют в ТЫРа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в макрофагах ТНР-1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Могиленко, Денис Александрович, Санкт-Петербург

1. Игнатьева Е. В., Меркулова Т.И., Вишневский О.В., Кель А.Э. (1997) Регуляция транскрипции генов липидного метаболизма: описание в базе данных TRRD. Молекулярная биология 31: 684-700.

2. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. (1999) Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб: Питер Ком.

3. Климов А.Н., Коземякин Л.А., Плесков В.М., Андреева Л.И. (1987) Бюлл. эксп. биол. мед. Т. 103, С.550-552.

4. Ajees А.А., Anantharamaiah G.M., Mishra V. К., Hussain М.М., Murthy H.M.K. (2006) Crystal structure of human apolipoprotein A-I: insights into its protective effect against cardiovascular diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 2126-2131.

5. Andrews N.C. and Faller D.V. (1991) A rapid micropreparation technique for extraction of DNA binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acids Research. 9: 2499.

6. Attie A. D., Kastelein J. P., Hayden M. R. (2001) Pivotal role of ABCAl in reverse cholesterol transport influencing HDL levels and susceptibility to atherosclerosis. J. Lipid Res. 42: 1717-1726.

7. Baes M., Castelein H., Desmet L., Declercq P.E. (1995.) Antagonism of COUP-TF and PPAR alpha/RXR alpha on the activation of the malic enzyme gene promoter: modulation by 9-cis RA. Biochem Biophys Res Commun. 215: 338-345.

8. Banka C. L. (1996) High density lipoprotein and lipoprotein oxidation. Curr. Opin. Lipidol. 7: 139-142.

9. Barak Y., Nelson M.C., Ong E.S., Jones Y.Z., Ruiz-Lozano P., Chien K.R., Koder A., Evans R.M. (1999) PPARgamma is required for placental, cardiac, and adipose tissue development. Mol.Cell. 4: 585-595.

10. Barger P. M., Browning A. C., Garner A. N., Kelly D. P. (2001) p38 mitogen-activated protein kinase activates peroxisome proliferator-activated receptor alpha: a potential role in the cardiac metabolic stress response. J. Biol. Chem. 276: 44495-44501.

11. Baroukh N., Lopez C. E., Saleh M. C., Recalde D., Vergnes L., Ostos M. A., Fiette L. J., Fruchart C., Castro G., Zakin M. M., Ochoa A. (2004) Expression and secretion of human apolipoprotein A-I in the heart. FEBS Lett. 557: 39-44.

12. Barter P. J., Rye K. A. (1996) Molecular mechanisms of reverse cholesterol transport. Curr. Opin. Lipidol. 7: 82-87.

13. Barter, P.J., Nicholls, S., Rye, K.A., Anantharamaiah, G.M., Navab, M., Fogelman, A.M. (2004) Antiinflammatory properties of HDL. Circ. Res 95:764-772

14. Basak S., Hoffmann A. (2008) Crosstalk via the NF-kappaB signaling system. Cytokine Growth Factor Rev. 19: 187-197;

15. Karin M, Lin A. (2002) NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol. 3: 221-227.

16. Beers A., Haas M.M.J., Wong, N.C., Mooradian, A.D. (2006) Inhibition of apolipoprotein AI gene expression by tumor necrosis factor alpha: roles for MEK/ERK and JNK. signaling. Biochemistry. 45: 2408-2413.

17. Belandia B., Parker M.G. (2003) Nuclear receptors: a rendezvous for chromatin remodeling factors. Cell. 114: 277-280.

18. Bennett S., Breit S.N. (1994) Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56: 236-240.

19. Bogan A.A., Dallas-Yang Q., Ruse M.D., Maeda Y., Jiang G., Nepomuceno L., Scanlan T.S., Cohen F.E., Sladek F.M. (2000) Analysis of protein dimerization and ligand binding of orphan receptor HNF4alpha. J Mol Biol. 302: 831-851

20. Borthwick F., Taylor J. M., Bartholomew C., Graham A. (2009) Differential regulation of the STARD1 subfamily of START lipid trafficking proteins in human macrophages. FEBS Letters 583: 1147-1153

21. Braissant O., Foufelle F., Scotto C., Dau?a M., Wahli W. (1996) Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): tissue distribution of PPAR-alpha, -beta, and -gamma in the adult rat. Endocrinology. 137: 354-366.

22. Bresnihan, B., Gogarty, M., FitzGerald, O., Dayer, J-M., Burger, D. (2004) Apolipoprotein A-I infiltration in rheumatoid arthritis synovial tissue: a control mechanism of cytokine production? Arthritis Res Ther. 6:R563-R566.

23. Brouillette, C. G., Anantharamaiah, G. M. (1995) Structural models of human apolipoprotein A-I. Biochim. Biophys. Acta. 1256(2):103-129.

24. Brouillette, C. G., Anantharamaiah, G. M., Engler, J. A., Borhani, D. W. (2001) Structural models of human apolipoprotein A-I: a critical analysis and review. Biochim. Biophys. Acta 1531:4-46.

25. Brun R.P., Tontonoz P., Forman B.M., Ellis R., Chen J., Evans R.M., Spiegelman B.M. (1996) Differential activation of adipogenesis by multiple PPAR isoforms. Genes Dev. 10: 974-984.

26. Buono C., Li Y., Waldo S.W., Kruth H.S. (2007) Liver X receptors inhibit human monocyte-dcrived macrophage foam cell formation by inhibiting fluid-phase pinocytosis of LDL. J. Lipid Res. 48:2411-2418.

27. Burger, D., Dayer, J-M. (2001) High-density lipoprotein-associated apolipoprotein A-I: the missing link between infection and chronic inflammation? Autoimmunity Reviews. 1:111117.

28. Cabana V.G., Lukens J.R., Rice K.S., Hawkins T.J., Getz G.S. (1996) HDL content and ' composition in acute phase response in three species: triglyceride enrichment of HDL a factor in its decrease. J Lipid Res. 37:2662-2674.

29. Carninci P., Sandelin A., Lenhard B., Katayama S., Shimokawa K., Ponjavic J., Semple C. A., Taylor M. S., Engstrom P. G., Frith M. C. et al. (2006) Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat. Genet. 38: 626-635.

30. Castrillo A., Joseph, S.B., Marathe C., Mangelsdorf D.J., Tontonoz P. (2003) Liver X receptor-dependent repression of matrix metalloproteinase-9 expression in macrophages. J. Biol. Chem. 278: 10443-10449

31. Chambon P. (1996) A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEB J. 10: 940-954

32. Chan J., Nakabayashi H., Wong N. C. (1993) HNF-4 increases activity of the rat Apo A1 gene. Nucleic Acids Res. 21: 1205-1211.

33. Chinetti G., Lestavel S., Fruchart J.C., Clavey V., Staels B. (2003) Peroxisome proliferator-activated receptor alpha reduces cholesterol esterification in macrophages. CircRes. 92:212-217.

34. Chisaki I., Kobayashi M., Itagaki S., Hirano T., Iseki K. (2009) Liver X receptor regulates expression of MRP2 but not that of MDR1 and BCRP in the liver. Biochim Biophys Acta. 1788:2396-23403.

35. Cockerill G.W., Rye K.A., Gamble J.R., Vadas M.A., Barter, P. J. (1995) High-density lipoproteins inhibit cytokine-induced expression of endothelial cell adhesion molecules. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15: 1987-1994.

36. Cosma M.P. (2002) Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. Mol. Cell. 10: 227-236

37. Costet P., Luo Y., Wang N., Tall A.R. (2000) Sterol-dependent transactivation of the ABC1 promoter by the liver X receptor/retinoid X receptor. J. Biol. Chem. 275: 2824028245

38. Davignon J., Cohn J.S., Mabile L., Bernier L. (1999) Apolipoprotein E and atherosclerosis: insight from animal and human studies. Clin Chim Acta. 286: 115-143.

39. Davidson W. S., Thompson T. B. (2007) The structure of apolipoprotein A-I in high density lipoproteins. J Biol Chem. 282: 22249-22253.

40. Delerive P., Galardi C.M. Bisi J.E., Nicodeme E., Goodwin B. ( 2004) Identification of liver receptor homolog-1 as a novel regulator of apolipoprotein AI gene transcription. Mol Endocrinol. 18:2378-2387.

41. Delerive P., Gervois P., Fruchart J.C., Staels B. (2000) Induction of IkappaBalpha expression as a mechanism contributing to the anti-inflammatory activities of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha activators. J Biol Chem. 275: 36703-36707.

42. Diederich, W., Orso, E., Drobnik, W., Schmitz, G. (2001) Apolipoprotein AI and HDL3 inhibit spreading of primary human monocytes through a echanism that involves cholesterol depletion and regulation of CDC42. Atherosclerosis. 159: 313-324

43. Diradourian C., Le May C., Cauzac M., Girard J., Burnol A. F., Pegorier J. P. (2008) Involvement of ZIP/p62 in the regulation of PPARalpha transcriptional activity by p38-MAPK. Biochim. Biophys. Acta. 1781: 239-244.

44. Dreyer C, Krey G, Keller H, Givel F, Helftenbein G, Wahli W. (1992) Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell. 68: 879-87.

45. Duan H., Li Z., Mazzone T. (1995) Tumor necrosis factor-alpha modulates monocyte/macrophage apoprotein E gene expression. J Clin Invest. 96: 915-922

46. Edwards P.A., Kast H.R., Anisfeld A.M. (2002) BAREing it all: the adoption of LXR and FXR and their roles in lipid homeostasis. J. Lipid Res. 43: 2-12.

47. Eggerman T.L., Hoeg J.M., Meng M.S., Tombragel A., Bojanovski D., Brewer, H.B.J. (1991) Differential tissue-specific expression of human apoA-I and apoA- II. J. Lipid Res. 32: 821-828.

48. Esteve, E., Ricart, W., Fernandez-Real, J.M. (2005) Dyslipidemia and inflammation: an evolutionary conserved mechanism. Clin Nutr. 24:16-31.

49. Epand R.M., Stafford A., Leon B., Lock P. E., Tytler E. M., Segrest J. P., Anantharamaiah G. M. (1994) HDL and apolipoprotein A-I protect erythrocytes against the generation of procoagulant activity. Arterioscler. Thromb. 14: 1775-1783.

50. Ericsson C., Hamsten A., Nilsson J., Grip L., Svane B., de Faire U. (1996) Angiographic assessment of effects of bezafibrate on progression of coronary artery disease in young male postinfarction patients. Lancet 347: 849-853

51. Fidge N. H. (1999) High density lipoprotein receptors, binding proteins, and ligands. *J Lipid Res. 40:187-201.

52. Fonarow G. C., Watson K. E. (2004) High-density lipoprotein cholesterol as a therapeutic target to reduce cardiovascular events. Am. Heart J. 147: 939-941.

53. Forman B.M., Tontonoz P., Chen J., Brun R.P., Spiegelman B.M., Evans R.M. (1995) 15-Deoxy-delta 12, 14-prostaglandin J2 is a ligand for the adipocyte determination factor PPAR gamma. Cell. 83: 803-812.

54. Fraser J.D., Martinez V., Straney R., Briggs M.R. (1998) DNA binding and transcription activation specificity of hepatocyte nuclear factor 4. Nucleic Acids Res. 26: 2702-2707

55. Gao Z., He Q., Peng B., Chiao P.J., Ye J. (2006) Regulation of nuclear translocation of HDAC3 by IkappaBalpha is required for tumor necrosis factor inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor gamma function. J Biol Chem. 281: 4540-4547.