Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Морфология C-клеток щитовидной железы животных в различные периоды онтогенеза

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Морфология C-клеток щитовидной железы животных в различные периоды онтогенеза"

На правах рукописи сф

МУЖИКЯН АРМАН АРТУШОВИЧ

МОРФОЛОГИЯ С-КЛЕТОК ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЖИВОТНЫХ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ОНТОГЕНЕЗА

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и

морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

14 ОКТ 2015

Санкт-Петербург 2015

005563328

005563328

Работа выполнена на кафедре Биологии, экологии, гистологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Научный руководитель — Иванов Валентин Станиславович

кандидат ветеринарных наук (06.02.01), доцент, заведующий кафедрой биологии, экологии, гистологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Официальные оппоненты: Пилов Ауес Хусенович

доктор биологических наук (06.02.01), профессор, профессор кафедры ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный аграрный университет имени В.М. Кокова», почетный работник высшего профессионального образования РФ

Хасаев Арслан Насуевич

кандидат ветеринарных наук (06.02.01), заведующий кафедрой анатомии, гистологии и физиологии ФГБОУ ВПО «Дагестанский государственный аграрный университет имени М.М. Джамбулатова»

Ведущая организация - ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет»

Защита состоится 12 ноября 2015 г. В 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.01 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская д.5, тел/факс (812)388-36-31.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская д.5.

Автореферат и диссертация размещены на сайтах ВАК Минобразования и науки РФ: http://vak.ed.gov.ru «11» сентября 2015 г. и ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ»: http://spbgavm.ru «27» мая 2015 г.

Автореферат разослан «_££_» октября 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук, профессор Крячко О.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В отечественной и зарубежной литературе неуклонно возрастает количество работ, посвященных изучению анатомии, физиологии и биохимии щитовидной железы человека и животных в норме и патологии (Чекуров И.В., Абрамова Л Л., 2011, Калмина, O.A., 2009, Криштоп В. В., 2007, Brown R. S., Huang S., 2007, Liman I., 2008). Пристальное внимание исследователей к вопросам строения и функции щитовидной железы объясняется, прежде всего, особой ролью тиреоидных гормонов в поддержании основных метаболических процессов в организме, влиянием их на состояние центральной и периферической нервной системы (Chan S.Y., Andrews М.Н., 2005), костной ткани (Miura М., Tanaka К., 2002, Redfem В. G., Wise L.D., 2007), обмен витаминов и воды (Forhead A.J., Cutts S. et al., 2009), дифференцировку тканей организма в эмбриогенезе (Афанасьев Ю.И., Быков ВЛ. и др., 2001, Забродин В.А., 2005, Родионова Т.И., Самитин В.В., 2009, Piechotta М., 2007). Щитовидная железа в свою очередь в значительной степени подвержена воздействию факторов окружающей среды, в связи с чем, ее часто используют в качестве маркера экологического благополучия местности (Хмельницкий O.K., 2001, Толстенкова Е.С., 2010).

Морфология щитовидной железы хорошо изучена у плодов и взрослых животных, в том числе собак (Шурыгин С.Н., 2004, Evans Н. Е., Lahunta А., 2012), кошек (Глод Д.Ю., 2007), свиней (Федотов Д. Н., Бобрик В.М., 2011, Пилов А.Х., 2007), крупного и мелкого рогатого скота (Пилов А.Х., 2007), диких животных (Власова O.E., 2007), грызунов (Ермакова 0.в.,2006). В ряде работ были выявлены межвидовые и внутривидовые различия (Труш Н.В., 2004, Пилов А.Х., 2003). Большое внимание исследователей уделено пренатальному и постнатальному гистогенезу основной тиреоидной ткани (Fagman Н., Nilsson М., 2011). Наряду с этим, лишь в части работ уделяется внимание морфофункциональному состоянию парафолликулярных клеток (или С-клеток), вырабатывающих кальцитонин, серотонин и другие биогенные амины (Лычкова А.Э., 2013). Между тем, особенности строения и гистогенеза С-клеток щитовидной железы вызывают на сегодняшний день особый интерес.

Согласно литературным данным, С-клетки отличаются от тироцитов формой, величиной и расположением. Они крупнее тироцитов, форма клеток полигональная или веретенообразная, цитоплазма светлая, ядро округлое, светлое, в 1,5-2 раза крупнее, чем у фолликулярных клеток, с небольшим количеством гетерохроматина (Кубарко А. И., Yamashita S., 1998, Солянникова Д.Р., Брюхин Г.В., 2009). С-клетки играют ключевую роль в поддержании кальциевого гомеостаза (Данилов Р. К., Хмельницкая Н.М., 2011). Описано паракринное влияние гормонов С-клеток в отношении фолликулярных эпителиоцитов (Пальцев М. А., Кветной И. М., 2008, Смирнова Т.С., 2009). Парафолликулярные клетки являются частью APUD-системы, в связи с чем, могут становиться причиной медуллярного рака щитовидной железы (Грабовой А.Н., 2011, Бржезовский В. Ж.,

Любаев BJL, 2007). В то же время, остаются до конца неясными источники происхождения С-клеток и механизмы распределения С-клеточной популяции в тиреоидной ткани (Шлыков И.П., 2011, Brook С., Dattani М., 2012, Ozaki Т., Nagashima К., 2011). В связи с этим возрастает актуальность изучения вопросов возрастного гистогенеза как основной тиреоидной ткани, так и тесно связанной с ней системы специализированных С-клеток щитовидной железы животных с применением современных методов гистологической обработки материала и анализа данных.

Степень разработанности темы. Межвидовые и возрастные особенности морфологии С-клеток щитовидной железы животных на сегодняшний день остаются неизученными. Особый интерес представляет сравнительный анализ морфологии С-клеток, выяснение закономерностей развития С-клеточной популяции на разных этапах онтогенеза и влияние морфо-функционального состояния С-клеток на гистогенез тиреоидной ткани в целом. Данные о нормальном строении щитовидной железы и С-клеточного аппарата имеют высокое научно-практическое значение как для понимания вопросов становления и развития тиреоидной ткани, так и в диагностике патологических состояний щитовидной железы у домашних животных.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение особенностей гистологического строения щитовидной железы собак, кошек и свиней и определение возрастных изменений морфологии С-клеток в разные периоды онтогенеза.

Для достижения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:

- изучить межвидовые особенности строения щитовидной железы и морфологии С-клеток у собак, кошек, свиней различных возрастных групп.

- изучить изменения морфометрических показателей состояния тиреоидной ткани и С-клеточной популяции щитовидной железы собаки, кошки, свиньи на разных этапах онтогенеза.

- определить видовые особенности морфологии С-клеток щитовидной железы исследуемых животных.

иммуногистохимически изучить экспрессию кальцитонина,

нейронспецифической енолазы, синаптофизина в С-клетках щитовидной железы собаки, кошки, свиньи на разных этапах онтогенеза. Научная новизна. В ходе исследования проведено комплексное гистологическое исследование щитовидной железы собак, кошек и свиней на разных стадиях пренатального и постнатального онтогенеза. Получены новые данные о микроструктуре органа у изученных видов животных. Впервые проведен сравнительный межвидовой анализ экспрессии кальцитонина, нейронспецифической енолазы, синаптофизина в С-клетках щитовидной железы собаки, кошки, свиньи разных возрастных групп. Изучена пролиферативная активность ткани щитовидной железы у исследуемых животных. Определены изменения основных морфометрических показателей состояния тиреоидной ткани

и С-клеточной популяции щитовидной железы собаки, кошки, свиньи на разных этапах онтогенеза. Установлены межвидовые особенности строения щитовидной железы и морфологии С-клеток у собак, кошек, свиней различных возрастных групп.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа содержит решение актуальных проблем, связанных с вопросами становления и развития тиреоидной ткани и С-клеточной популяции щитовидной железы животных. Полученные данные позволяют объективно судить о морфологическом и функциональном состоянии С-клеток у собак, кошек и свиней на разных стадиях онтогенеза и могут быть использовании при диагностике заболеваний щитовидной железы, в исследованиях по моделированию эндокринных патологий, а также для сравнительного межвидового морфологического анализа С-клеток у разных видов животных.

Методология и методы исследований. Для изучения морфологии С-клеток щитовидной железы животных использовали комплекс гистологических, гистохимических, иммуногистохимических и морфометрических методов исследования: окрашивание микропрепаратов стандартными гистологическими красителями, постановка ШИК-реакции, импрегнация солями серебра с выявлением аргентофильных волокон, окраска по Ван-Гизону, выявление экспрессии маркера пролиферации клеток (РСЫА), иммуногистохимическое окрашивание С-клеток на кальцитонин, нейрон-специфическую енолазу, синаптофизин. Проведено морфометрическое исследование показателей состояния щитовидной железы и С-клеток у животных изученных возрастных групп, с применением методов описательной статистики.

Внедрение. Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе и учебном процессе при проведении лабораторных практикумов и чтении лекций по морфологии животных в следующих вузах и научно-исследовательских институтах России: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины, Вятская государственная сельскохозяйственная академия, Дагестанский государственный аграрный университет имени М.И. Джамбулатова, Национальный открытый институт г. Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации», ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на 65-й юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (С-Пб, 2011); Всероссийской студенческой научно-практической конференции с международным участием - Актуальные вопросы морфологии и репаративных гистогенезов - 2012 (Оренбург, 2012); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (С-ПБ, 2013); 67-й международной научной конференции

молодых ученых и студентов СПбГАВМ (С-Пб, 2013); Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Краснодар, 2013); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (С-ПБ, 2014); Объединенном XII конгрессе международной ассоциации морфологов и УНсъезде всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации (Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии №4, 2013 - 1, Ветеринарная патология №3-4 2014 - 1, Актуальные вопросы ветеринарной биологии №3 2015 - 1, Международный вестник ветеринарии №2 2015-1).

Личный вклад. Диссертация является результатом исследования автора в период с 2011-2014 гг. Автором самостоятельно поставлена цель и определены задачи исследований, план проводимых исследований по изучению морфологии С-клеток щитовидной железы животных в различные периоды онтогенеза, а также анализ и обобщение полученных результатов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация содержит 9 таблиц и 70 рисунков. Список литературы включает 246 наименований, из которых 92 русскоязычных и 154 иностранных работ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Морфогенез и видовые отличия в строении щитовидной железы у разных видов млекопитающих (собака, кошка, свинья).

2. Особенности развития и морфологии С-клеток у разных представителей млекопитающих.

3. Изменения экспрессии нейроспецифической енолазы, синаптофизина и кальцитонина на разных этапах пре- и постнатального онтогенеза млекопитающих.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материал и методы исследования

Объектами исследования служили ЩЖ клинически здоровых собак, кошек и свиней в разные периоды онтогенеза. У собак гистологическому и морфометрическому исследованию были подвергнуты ЩЖ плодов в возрасте 3035 дней (п=9), 40-45 дней (п=6), новорожденных щенков (п=5), собак в возрасте 46 месяцев (n=5), 1 года (п=5), 10-12 лет (п=7), 15 лет и старше (п=5). У кошек были исследованы ЩЖ плодов, изъятых на 40-45 дни гестации (п=5), новорожденных

котят (п=6), кошек в возрасте 4-6 месяцев (n=8), 1 года (п=5), 10-12 лет (п=6), 15 лет и старше (п=5).

Исследуемые животные не были разделены по породному и половому признакам. Возраст животных определялся со слов владельцев.

Также были изучены ЩЖ свиней породы Ландрас следующих возрастных групп: новорожденных поросят (п=10), поросят в возрасте 4-5 дней (п=7), 8-10 дней (п=5), 30-35 дней (п=5), свиней в возрасте 1,5-2 года (п=5). Материал отбирался на свинокомплексе «Рюрик-Агро» (Ленинградская область, Тосненский район, деревня Нурма) от животных, подвергнутых выбраковке по причине травматизма. Возраст исследованных животных определялся согласно инвентарным книгам учета ветеринарных врачей хозяйства.

Исследование включало проведение гистологического анализа, постановку гистохимических и иммуногистохимических реакций, морфометрию и статистическую обработку полученных данных.

Для изучения общего строения железы, а также проведения морфометрии, материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина, по общепринятой методике заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином. С целью выявления коллагеновых волокон и оценки соединительнотканной стромы органа, парафиновые срезы окрашивали по Ван-Гизону, для оценки площади стромального компонента проводили импрегнацию ткани ЩЖ солями серебра, с выявлением коллагеновых и ретикулярных волокон. С целью обнаружения мукополисахаридов в коллоиде железы проводили ШИК-реакцию с применением Шифф-йодной кислоты по Мак-Манусу.

Для проведения иммуногистохимических (ИГХ) реакций материал фиксировали в спирт-формалине с цинком (Коржевский Д.Э., 2014). Парафолликулярные клетки выявляли иммунопероксидазным методом с помощью ИГХ-реакции на кальцитонин (CAL), нейрон-специфическую енолазу (NSE), синаптофизин (SYN). Пролиферативную активность железы изучали с помощью экспрессии PCNA, для выявления которой использовали моноклональные мышиные антитела (клон PC 10; Dako, Дания). В качестве вторичных реагентов применялись EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания). Для постановки ИГХ-реакции на кальцитонин, NSE, синаптофизин использовали поликлональные кроличьи антитела (Dako, Дания). В качестве вторичных реагентов для реакции на синаптофизин применяли реактивы из набора Polymer HRP Detection Kit Spring Bio (Genex, США). Для кальцитонина и NSE применяли EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Rabbit (Dako, Дания).

ИГХ-реакции проводили согласно следующему протоколу.

Стекла со срезами прогревали в термостате при температуре 56°С в течение 30 мин, затем депарафинировали (в двух порциях ксилола) и подвергали регидратация в спиртах нисходящей концентрации с доведением до воды.

Далее проводили блокирование эндогенной пероксидазы в 3% водном растворе перекиси водорода в течение 5 мин, после чего промывали в дистиллированной воде в течение 3 мин.

Затем осуществляли восстановление активности антигенов путем кипячения в TBS (pH 6,0) на водяной бане: срезы прогревали во влажной камере с буфером до выравнивания температуры буфера и воды и далее в течение 30 мин; остужали в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего промывали в дистиллированной воде в течение 1-2 мин и в двух сменах отмывочного буфера TBS по 5 мин. Далее проводили инкубацию с первичными антителами в рабочей концентрации во влажной камере в течение ЗО-бОмин. Срезы промывали в двух сменах TBS по 5 мин, после чего инкубировали с EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Rabbit в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее срезы промывали в двух сменах TBS по 5 мин. Затем ставили реакцию с DAB (в течение 3-5 мин при комнатной температуре), для чего готовили рабочий раствор путем добавления к 1 л буфера 1 капли концентрированного хромогена согласно инструкции. Далее смывали хромоген дистиллированной водой и промывали в дистиллированной воде в течение 3 мин.

При необходимости проводили докраску гематоксилином Джилла, толлуидиновым синим, астровым синим и другими красителями, после чего срезы по общепринятой методике обезвоживали и заключали под покровное стекло.

Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss (Германия) при увеличении 25, 50, 100, 200, 400 и 1000. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры Axio Scope Al (Германия). Морфометрические измерения проводили полуавтоматически и вручную с помощью программного обеспечения AxioVision Reí. 4.8. и редактора изображений PhotoM 1.21. Площади структур определяли при помощи бинаризации изображений (Абламейко C.B., Недзьведь A.M., 2005) с дальнейшей обработкой в редакторе PhotoM 1.21.

Морфометрическое исследование состояния ЩЖ включало определение следующих показателей: средний диаметр фолликула, высота фолликулярного эпителия, диаметр ядра тироцитов. На основании полученных данных были определены: просвет-эпителиальный индекс (ПЭИ), показатель накопления коллоида (ПНК), ядерный индекс (ЯИ), фолликулярный индекс (ФИ) (Автандилов Г.Г., 1990). Измерена площадь стромального компонента железы, определены индекс накопления ШИК-положительного коллоида (Ipas) и пролиферативная активность железы (Ipsna)- Для изучения С-клеточного аппарата считали абсолютное и среднее количество С-клеток на условную единицу площади при увеличении 200 - 78485.34 мкм2 (324.0x242.0 мкм), среднюю площадь иммунореактивных. клеток (мкм2) с экспрессией кальцитонина (определяли площадь одной С-клетки), среднюю площадь иммунореактивной ткани (мкм2) с экспрессией кальцитонина (SCal+) и нейронспецифической 6НОЛЗЗЫ (Snse+) в поле

зрения, средний диаметр кариона (СДК) и индекс функциональной активности С-клеток (ИФА).

Исследуемые показатели определяли следующим образом:

1. Просвет-эпителиальный индекс (ПЭИ) — отношение внутреннего

диаметра фолликула к высоте тиреоидного эпителия:

ПЭИ = —, где d — внутренний диаметр фолликула, h — высота тиреоидного эпителия.

2. Показатель накопления коллоида (ПНК) — отношение внутреннего

диаметра фолликула к удвоенной толщине его стенки:

ПНК = ——, где d — внутренний диаметр фолликула, h — высота

(2xh)

тиреоидного эпителия.

3. Ядерный индекс (ЯИ) — определение объемов ядер тироцитов,

который вычислялся по формуле:

ЯИ = * , где d2,—диаметр ядра.

oxaze

4. Фолликулярный индекс (ФИ) — усредненный диаметр фолликула:

ФИ = ii2L5£ где ^ — внутренний диаметр фолликула, п —

количество морфометрических замеров диаметра фолликулов.

5. Индекс PCNA (Ipcna) - рассчитывали по формуле

IPCNA (%) = (NPCNA+/№0 • 100, где Npcna+ — количество меченых ядер, N, — общее число ядер в поле зрения.

6. Ipas определяли по формуле

NPAS + (%) = (NPAS + /ДОф) • 100, где NPAs+ - количество фолликулов с ШИК+ веществом, N,^ — общее число фолликулов в поле зрения.

7. Средний диаметр кариона (СДК) парафолликулярных клеток:

СДК = л/аТЪ, где а - наибольший диаметр ядер парафолликулярных клеток, b - наименьший диаметр ядер (Хесин Я. Е., 1967);

8. Индекс функциональной активности (ИФА):

ИФА = , где Nc - общее количество С-клеток с поле зрения (Волков

В.П., 2014);

Полученные данные были подвергнуты статистическому анализу. Для всех данных применена описательная статистика: данные проверены на соответствие нормальному закону распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением п представлены в итоговых таблицах. Межгрупповые различия анализировали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки (таблицы 1, 4, 7). Различия определены при уровне значимости р<0,05. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 (StatSoft, Россия).

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Особенности гистологического строения щитовидной железы и морфология С-клеток у собаки в онтогенезе

Проведенное нами гистохимическое исследование на мукополисахариды (ШИК-реакция), а также экспрессия клетками щитовидной железы (ЩЖ) собаки ряда белков (в т.ч. CAL) подтвердили, что железа является функционально активной уже у 30-35 дневных плодов. К моменту рождения она полностью сформирована. В гистогенезе ЩЖ собаки отмечаются равномерные изменения основных показателей, характеризующих эндокринную активность тиреоидной ткани. Происходит увеличение высоты тиреоидного эпителия, ПЭИ, ПНК, ФИ. Увеличивается диаметр ядра тироцитов. Возрастает доля фолликулов с ШИК-положительным коллоидом в просвете. У старых животных паренхима железы была представлена растянутыми фолликулами, выстланными нередко уплощенными эпителиоцитами, с уменьшенными гиперхромными ядрами. IPAs у старых животных оказался ниже, чем у собак в возрасте от 4-6 месяцев до года. Интересно отметить, что пролиферативная активность железы после рождения заметно снижается, а доля соединительнотканной стромы существенно возрастает.

На всех этапах онтогенеза в ЩЖ собак иммуногистохимически выявлялись интерфолликулярные клетки (или С-клетки), претерпевающие в разные периоды жизни ряд морфологических изменений. У 30-35 дневных плодов интерфолликулярные клетки располагались как отдельно, так и группами по 4-8 клеток. В центральных участках железы плотность расположения С-клеток оказалась наиболее высокой. Интерфоликулярные клетки отличались сравнительно небольшими размерами: площадь CAL+ клеток составляла 44,1±0,6 мкм2, диаметр ядра варьировал среднем от 5,5 до 6-6,5 мкм. При этом у многих плодов данной возрастной группы С-клетки проявляли слабую реакцию на CAL и NSE, но хорошо окрашивались на SYN. По-нашему мнению, это связано с высокой степенью дегрануляции С-клеток и выполнением ими паракринной функции в отношении фолликулярного эпителия, а также недостаточным накоплением гормонов в секреторных гранулах.

У 40-45 дневных плодов статистически значимо увеличивались размеры парафолликулярных клеток, возрастали площадь CAL+ материала в пересчете на одну клетку и СДК парафолликулярных клеток. Экспрессия CAL и NSE также возрастали. Однако, ввиду развития паренхимы железы и рассредоточения С-клеток, количество и площадь их в поле зрения оказывалась ниже, чем в предыдущей группе. С этим же связано снижение показателя ИФА С-клеток. Схожая тенденция сохранялась и у новорожденных животных, однако различия между указанными группами недостоверны. Количество С-клеток, с концентрацией гранул на сосудистом полюсе у новорожденных щенков оказывалась заметно ниже, чем у плодов.

Наибольшие размеры интерфолликулярные клетки имели у взрослых собак. В возрасте 4-6 месяцев площадь одной С-клетки достигала 77,5±2,1 мкм2, а СДК

составлял 6,3±0,2 мкм. Данные показатели были статистически значимо выше, чем у новорожденных собак. Ядра клеток увеличены в размере, светлые, округлой или овальной формы. Часть ядер с неровными контурами, вытянутые, в некоторых случаях с формированием выпячиваний и углублений на кариолемме. При этом клетки представлялись функционально активными и в высокой степени экспрессировали CAL и NSE.

По мере взросления собак (1 год, а позднее и 10-12 лет), размеры ядер С-клеток возрастали, а площадь их статистически значимо снижалась по сравнению с показателями собак в возрасте 4-6 месяцев, что указывает на увеличение с возрастом ядерно-цитоплазматического соотношения интерфолликулярных клеток. Изменения микроструктуры С-клеток сопровождалось повышением ИФА, достигающего наибольших значений у старых животных. У собак в возрасте 15 лет и старше отмечалось статистически значимое снижение СДК и площади парафолликулярных клеток по сравнению с собаками в возрасте 1 года. В то же время определялось статистически значимое увеличение количества С-клеток и CAL+ материала в поле зрения по сравнению с молодыми животными, что могло быть обусловлено возрастной гиперплазией интерфолликулярного аппарата.

Наряду с уже описанными интерфолликулярными клетками, в ЩЖ плодов собак и реже у взрослых животных выявлялись группы клеток, представленные CAL- и NSE-положительными клетками, связанными с другими эпителиальными структурами. Похожие структуры описаны в литературе как остатки ультимобранхиальных телец или С-клеточные комплексы (Leblanc В., et al., 1990). Они встречались в основном вблизи паращитовидных желез, Были отделены от паренхимы ЩЖ тонкими прослойками соединительной ткани. С-клеточные комплексы были представлены как типичными С-клетками, так и слабо дифференцированными клетками, формирующими к 40-45 дням жизни плода небольшие фолликулоподобные структуры в составе комплексов. Среди прочих в С-клеточных комплексах встречались группы тесно связанных фолликулов, образованных призматической формы слега вытянутыми NSE-положительными клетками с овальными удлиненными ядрами и слабогранулированной цитоплазмой, не дающими положительную реакцию на CAL. С-клетки в указанных комплексах имели строение, сходное с диффузно рассредоточенными в паренхиме железы интерфолликулярными клетками, были объединены в большие группы из 20-40 клеток и редко располагались одиночно.

Таблица 1.

Морфометрические показатели С-клеток щитовидной железы собак разных _возрастных групп. Данные представлены как М ± ш_

Кол-во С-кл. в поле зрения, ув.200 БсаН материала в поле зрения, мкм2 ув.200 материала в поле зрения, мкм2 ув.200 S одной С-кл, с положительной реакцией на Cal, мкм2 сдк, мкм ИФА С-клеток

1 Плоды 3035 дн. (п=9) 138,0±2,9* 6092±168 3256±404*' 44,1±0,6* 5,1± 0,1* 35,0± 0,9

2 Плоды 4045 дн. (п=6) 121,8±2,3 6046±183 4724±570 49,6±1,0 5,3± 0,1 32,4± 0,7

3 Новорожд. щенки (п=5) 119,6±7,2* 6057±387 6735±630 50,9±1,9* 5,6± 0,1* ЗЗД± 2,0

4 Собаки 46 мес. (п=5) 53,1±4,2* 4109±335* 4749±855 77,5±2,1** 6,3± 0,2* 16,9± 1,6*

5 Собаки 1 год (п=5) 52,9±2,7 3719±200* 5957±403 70,4±1,4 6,4± 0,1 17,0± 1,0*

6 Собаки 10-12 лет (п=7) 56,8±1,9* 3435±117* 5532±202 60,6±1,3*' 6,5± 0,1* 18,5± 0,6*

7 Собаки 15 лет (п=5) 87,5±4,6** 4993±293* 6241±362 57,1±1,5* 5,9± 0,1* 26,0± 1,4*'

Примечание - *-р<0,05, статистически значимое отличие от новорожденных щенков (3 группа), тест Тыоки

•-р<0,05, статистически значимое отличие от собак в возрасте 1 года (5 группа), тест

Тыоки

2.2.2. Особенности гистологического строения щитовидной железы и морфология С-клеток у кошки в онтогенезе

Проведенный гистологический и морфометрический анализ структуры ЩЖ кошек различных возрастных групп показал наличие существенных отличий и ряда возрастных изменений в строении и функциональном состоянии органа. У 40-45 дневных плодов основная часть тиреоидной ткани представлена эпителиальными тяжами, образованными тироцитами кубической формы, с небольшими светлыми округлыми ядрами. У новорожденных кошек паренхима железы образована многочисленными тиреоидными фолликулами, содержащими коллоид, показывающий часто ШИК-положительное окрашивание. Возрастает площадь стромы железы, а пролиферативная активность по сравнению с 40-45 дневными плодами снижается. В ЩЖ 4-6 месячных кошек выявляется ряд особенностей, связанных со значительным увеличением среднего диаметра фолликулов, высоты тиреоидного эпителия, среднего диаметра ядра тироцитов.

Причем в строении ядер тироцитов отмечается значительная полиморфность. Возрастают показатели ПЭИ, ПНК и IPAs и резко снижается площадь стромы органа, что связано с увеличением размеров фолликулов железы, появлением крупных фолликулов, занимающих часто большую часть поля зрения. В возрасте 1 года в строении ЩЖ кошек отмечаются те же изменения, что и у 4-6 месячных животных. Основные показатели состояния ЩЖ не претерпевают существенных изменений, однако возрастает площадь стромы органа, главным образом за счет утолщения межфолликулярной соединительной ткани. У 10-12 летних животных отмечается резкое снижение высоты фолликулярного эпителия. Уменьшается диаметр ядра тироцитов. Возрастают ПЭИ и ПНК, а пролиферативная активность железы оказывается ниже, чем у кошек в возрасте 1 года. В строении ЩЖ кошек в возрасте 15 лет и старше проявляются различные изменения, характеризующиеся как тенденцией к увеличению диаметра фолликулов, снижению высоты фолликулярного эпителия и диаметра ядра у одних животных, так и появлению многочисленных новообразованных малоактивных фолликулов вследствие гиперплазии тиреоидной ткани в ответ на развивающуюся гипофункцию органа у старых животных. При этом у старых кошек отмечается снижение IPAS и IPCna и увеличение площади стромы железы.

Материал, полученный от исследуемых животных, подвергался ИГХ-окрашиванию на CAL, NSE, SYN, показавшему наличие в разной степени функционально активных С-клеток в ЩЖ кошек всех изученных возрастных групп.

У 40-45 дневных плодов С-клетки имели интерфолликулярное расположение, встречались в основном группами по 4-8 клеток, преимущественно в центральных участках железы. Клетки вытянутой или полигональной формы, со сравнительно крупными округлыми ядрами. СДК С-клеток в данной возрастной группе составил 4,4±0,1 мкм. Обнаруженные клетки показывали слабую экспрессию CAL, однако хорошо окрашивались на SYN и NSE: площадь CAL+ материала в поле зрения составила 1099±74 мкм2, тогда как площадь NNE+ материала была значительно больше и составляла 3157±478 мкм2.

У новорожденных животных отмечалось статистически значимое снижение количества С-клеток в поле зрения до 41,1±3,6, в основном ввиду диффузного рассредоточения их в ткани железы. В то же время выявлялись обширные периферические участки, лишенные CAL+ клеток, содержащие, однако, большое количество клеток, в высокой степени экспрессирующих NSE и SYN. Данное обстоятельство могло говорить как о слабой гормонопродуцирующей функции С-клеток у 40-45 дневных плодов кошки и новорожденных животных, так и о гиперфункции парафолликулярных клеток, активно высвобождающих накапливающиеся в гранулах вещества. Однако, учитывая высокую степень экспрессии С-клетками SYN, являющегося компонентом мембраны гормонсодержащих везикул, можно предположить слабую дегрануляцию парафолликулярных клеток, и, следовательно, незначительное выделение

накапливаемых в этих везикулах веществ в межклеточные пространства и кровеносное русло.

С-клетки ЩЖ 4-6 месячных кошек отличались как большими размерами, так и более высокой экспрессией CAL, чем у новорожденных животных. Количество С-клеток в поле зрения было существенно ниже, что связано с резким увеличением площади фолликулов, занимающих большую часть исследуемых полей зрения. Несмотря на это, площадь CAL+ материала оказалась статистически значимо больше, чем у новорожденных животных. Возрастал показатель СДК для ядер С-клеток, составивший у животных данной группы 5,8±0,1 мкм. Интересно отметить, что в ЩЖ 4-6 месячных кошек отмечалась высокая экспрессия NSE как парафолликулярными клетками, так фолликулярными тироцитами. Так, площадь NSE+ материала в тиреоидной ткани составила 23321±1169 мкм2.

У кошек в возрасте 1 года определялось снижение количества С-клеток в поле зрения, по сравнению с 4-6 месячными животными. Отмечалось незначительное увеличение площади CAL+ материала в пересчете на одну С-клетку на фоне общего снижения площади CAL+ материала в поле зрения. Количество клеток, экспрессирующих NSE, также снижалось. Показатель ИФА С-клеток был ниже, чем у 4-6 месячных кошек, а СДК существенно не менялся.

Схожие тенденции в отношении С-клеточной популяции выявлялись и в ЩЖ 10-12 летних кошек. У животных данной возрастной группы отмечалось снижение показателя ИФА и количества С-клеток в поле зрения, однако возрастали СДК и площадь CAL+ материала в пересчете на одну С-клетку. У 3 из 6 исследованных кошек были выявлены участки железы, образованные NSE+ структурами, как небольшие, так и представляющие собой обширные поля клеток и фолликулоподобных структур, не дающих позитивное окрашивание на CAL. Указанные фолликулоподобные структуры не были ограничены друг от друга соединительной тканью, тесно связаны между собой, и не взаимодействовали с сосудистым компонентом стромы. В части из них отмечалось наличие небольшого количества гомогенного вещества, не дающего ШИК-положительное окрашивание. Некоторые из структур формировали кисты, диаметром от 50 до 300 мкм.

В возрасте 15 лет и старше у кошек отмечалась умеренно выраженная гиперплазия С-клеток, проявляющаяся в увеличении количества С-клеток и площади CAL+ материала в поле зрения. Отмечалось статистически значимое снижение количества клеток, экспрессирующих NSE. Уменьшался СДК С-клеток, а ИФА возрастал по сравнению с 10-12 летними животными. Отмечалось увеличение площади С-клеток. В части из них содержались многочисленные крупные NSE+ гранулы диаметром от 1 до 3 мкм. Сами парафолликулярные клетки окружали фолликулы по периферии, а также формировали С-клеточные фолликулы, содержащие слабо окрашивающееся гомогенное вещество.

Таблица 2.

Морфометрические показатели С-клеток щитовидной железы кошек разных _возрастных групп. Данные представлены как М ± т __

Кол-во С-кл. в поле зрения, ув.200 материала в поле зрения, мкм2 ув.200 Snse+ материала в поле зрения, мкм2 ув.200 S одной С-кл, с положительно й реакцией на Cal, мкм2 еда; ИФА С-клет ок

1 Плоды 40-45 дн. (п=5) 57,2±3,2** 1099±74 3157±478* 19,4±1,0* 4,4± 0,1* 12,6± 0,8*

2 Новорожд. (п=6) 41,1±3,6* 788±68,7 5055±485* 19,3±0,5* 4,6± 0,1* 9,5± 0,9

3 Кошки 4-6 мес. (п=8) 27,6±2,4* 1325±116* 23321±1169*' 48,6±1,5* 5,8± 0,1* 8,0± 0,7

4 Кошки 1 год (п=5) 23,3±2,3* 1180±113 18186±1701* 51,4±1,8* 5,8± 0,1* 6,8± 0,7

5 Кошки 10-12 лет (п=6) 21,2±2,2* 1152±114 16247±1559* 56,5±4,6* 5,9± 0,1* 6,4± 0,7

6 Кошки 15 лет (п=5) 30,7±3,8 1729±163** 9190±1166* 59,7±4,4* 5,0± 0,1* 7,5± 0,8*

Примечание - *-р<0,05, статистически значимое отличие от новорожденных котят (2 группа), тест Тьюки

*-р<0,05, статистически значимое отличие от кошек в возрасте 1 года (4 группа), тест

Тьюки

2.23. Особенности гистологического строения щитовидной железы и морфология С-клеток у свиньи в онтогенезе

Проведенный гистологический и морфометрический анализ ЩЖ свиней изученных возрастных групп показал некоторые особенности гистогенеза тиреоидной ткани на ранних этапах постнатального онтогенеза. Отмечено, что ЩЖ новорожденных поросят является полностью сформированным и функционально активным органом, образованным многочисленными коллоидсодержащими фолликулами и хорошо развитой стромой. У 4-5 дневных поросят изменения в строении ЩЖ характеризуются увеличением среднего диаметра фолликулов, большая часть которых содержит ШИК-положительное вещество. К 8-10 дню жизни возрастает васкуляризация железы, увеличивается средний диаметр фолликулов и высота тиреоидного эпителия, резко возрастает пролиферативная активность железы. 1рст у 8-10 дневных поросят составил 12,1±0,7 %, причем наиболее часто экспрессия РСИА определялась в центральных участках железы и гораздо реже на периферии. 1рдз также увеличивался по сравнению с 4-5 дневными поросятами. Полученные данные могут свидетельствовать о наступлении одного из критических периодов в гистогенезе ЩЖ свиней на 8-10 дни жизни, характеризующегося возрастанием пролиферативной и функциональной активности органа. У 30-35 дневных поросят отмечалось увеличение среднего диаметра фолликулов и высоты фолликулярного

эпителия, в то время как Ipas и Ipcna были ниже, чем у 8-10 дневных животных. ЩЖ свиней в возрасте 1,-2 года, как и животных других возрастных групп, имела классическое строение, была образована крупными тиреоидными фолликулами, выстланными кубическим и реже уплощенным эпителием. Отмечено увеличение среднего диаметра фолликулов, ПЭИ, ПНК и Ipas У взрослых свинеи по сравнению с 30-35 дневными поросятами и статистически значимое снижение пролиферативной активности железы. Диаметр ядра тироцитов и площадь стромального компонента железы существенных отличий в исследованных возрастных группах не имели.

ИГХ окрашивание на CAL, NSE, SYN показало наличие функционально активных парафолликулярных С-клегок в ЩЖ свиней всех исследованных возрастных групп. С-клетки ЩЖ новорожденных поросят характеризовались небольшими размерами, отростчатой или веретеновидной формой с зернистой цитоплазмой и центрально расположенными светлыми округлыми ядрами. С-клетки располагались как одиночно, так и группами по 3-5 клеток, в составе фолликулрного эпителия и в межфолликулярных пространствах. Интересно отметить, что среди CAL+ С-клеток встречались особые клетки с темными гиперхромными ядрами, диаметр которых не превышал 3-4 мкм. В цитоплазме таких клеток определялось большое количество CAL+ гранул, но также встречались клетки с высокой степенью дегрануляции. Указанные клетки в ЩЖ новорожденных поросят составляли порядка 10-15 %, также показывали положительное окрашивание на NSE и SYN, что позволяет отнести их к С-клеточной популяции. При дополнительном ИГХ окрашивании на виментин, указанные парафолликулярные клетки, в отличие от других клеток ткани ЩЖ, давали положительную реакцию.

У 4-5 дневных поросят отмечалось статистически значимое увеличение ИФА С-клеток, по сравнению с новорожденными животными. Увеличивалась площадь CAL+ материала в ткани железы, возрастал СДК парафолликулярных клеток. С-клетки, содержащие гиперхромные ядра, в данной возрастной группе встречались реже, чем у новорожденных поросят. К 8-10 дню жизни происходило снижение количества С-клеток в поле рения, снижалась площадь CAL+ материала в ткани ЩЖ главным образом за счет высокой степени дегрануляции С-клеток. В пользу последнего говорит увеличение площади NSE+ материала, по сравнению с 4-5 дневными поросятами.

У 30-35 дневных поросят отмечалось увеличение количества С-клеток в поле рения, снижалась площадь CAL+ материала в ткани ЩЖ и увеличение числа клеток, экспрессирующих NSE. Выявлялось резкое снижение показателей ИФА и СДК С-клеток, причем значительно возрастало количество парафолликулярных клеток с темными гиперхромными ядрами в разной стадии накопления и выделения синтезированных продуктов. В ЩЖ свиней в возрасте 1,5-2 года отмечалась слабо выраженная гиперплазия С-клеток, носящая в основном очаговый характер. Участки с большим количеством кальцитониноцитов

встречались в основном в центральной зоне. С-клетки располагались одиночно и группами, окружали фолликулы по периферии, однако не формировали самостоятельных фолликулов или фолликулоподобных структур. Обращало на себя внимание резкое снижение СДК парафолликулярных клеток, причем количество С-клеток, содержащих гиперхромные ядра, достигало половины из всех, дающих положительное окрашивание на CAL. ИФА С-клеток, также был ниже, чем в других возрастных группах.

Таблица 3.

Морфометрнческне показатели С-клеток щитовидной железы свиней разных _возрастных групп. Данные представлены как М ± ш__

Кол-во С- Scal+ Snse+ S одной С-кл, с ИФА

кл. в поле материала в материала в положительной СДК С-

зрения, ув.200 поле зрения, мкм2 ув.200 поле зрения, мкм2 ув.200 реакцией на Cal, мкм2 клето к

1 Новорожд. (п=10) 52,3±2,2 1524,5±61,6 555,6±57,6 29,4±0,6 5,1± 0,1 13,4± 0,6

2 4-5 дн. (п=7) 53,7±1,8 1705±45* 544,6± 33,7* 32,1±0,7* 6,6± 0,2* 17,6± 0,6*

3 8-10 да. (п=5) 48,4±1,9 1359±47 899±128* 28,3±0,8 6,3± 0,2* 15,4± 1,0

4 30-35 дн. (п=5) 37,3±1,1** 1099±52* 913,5±114,2* 29,6±1,3 5,2± 0,1* 9,7± 0,3*'

5 Свиньи 1,5-2 года (п=5) 35Д±2,9*' 1147,1±75,7* 1002±81* 33,4±1,3** 4,3± 0,1*' 7,6± 0,7*'

Примечание - *-р<0,05, статистически значимое отличие от новорожденных поросят (2 группа), тест Тьюки

*-р<0,05, статистически значимое отличие от свиней в возрасте 1,5-2 года (5 группа), тест

Тьюки

Выводы

1. У собаки в щитовидной железе:

отмечаются возрастные изменения основных показателей, характеризующих эндокринную активность тиреоидной ткани, возрастают просвет-эпителиальный индекс, показатель накопления коллоида, фолликулярный индекс. Увеличивается диаметр ядра тироцитов, пролиферативная активность железы после рождения снижается, возрастает доля фолликулов, содержащих ШИК-положительное вещество;

- равномерно увеличивается средний диаметр кариона и площадь С-клеток, возрастает экспрессия кальцитонина, нейронспецифической енолазы и синаптофизина, увеличивается индекс функциональной активности С-клеток, имеющий наибольшие значения у плодов, новорожденных щенков и старых собак;

- отмечается тенденция к снижению с возрастом количества С-клеток с концентрацией секреторных гранул на сосудистом полюсе, а также наибольшая

плотность расположения С-клеток в участках железы с высокой экспрессией РСЫА;

- обнаружены С-клеточные комплексы у плодов и взрослых животных.

2. У кошек в щитовидной железе:

отмечаются возрастные изменения основных показателей, характеризующих эндокринную активность тиреоидной ткани, возрастают просвет-эпителиальный индекс, показатель накопления коллоида, фолликулярный индекс. Увеличивается диаметр ядра тироцитов, пролиферативная активность железы после рождения снижается, возрастает доля фолликулов, содержащих ШИК-положительное вещество;

- равномерно увеличивается средний диаметр кариона и площадь С-клеток, индекс функциональной активности С-клеток с возрастом снижается, имеет наибольшие значения у плодов, новорожденных котят и старых кошек;

- основные показатели, характеризующие эндокринную активность тиреоидной ткани, возрастают после рождения и увеличиваются периоду старости;

- к 40-45 дням гестации отмечается низкая гормонопродуцирующая активность С-клеток, на фоне достаточно высокой экспрессии нейронспецифической енолазы и синаптофизина, сохраняющейся во всех возрастных группах.

- отмечено формирование узловых образований из С-клеток у старых животных и возрастная гиперплазия С-клеточной популяции, наиболее ярко проявляющаяся у кошек в возрасте 15 лет и старше;

- установлена высокая экспрессия нейронспецифической енолазы основной тиреоидной тканью щитовидной железы кошек во всех исследованных возрастных группах.

3. У свиней в щитовидной железе:

- к 8-10 дню жизни возрастает васкуляризация органа, увеличивается средний диаметр фолликулов и высота тиреоидного эпителия, резко возрастает пролиферативная активность железы, что свидетельствует о наступлении одного из критических периодов в гистогенезе щитовидной железы свиней на данном сроке; отмечается высокая степень дегрануляции С-клеток, указывающая на рост их функциональной активности;

- экспрессия РСЫА в тиреоидной ткани определяется чаще в центральных участках железы и гораздо реже на периферии;

- на всех изученных сроках обнаруживались многочисленные С-клетки с пикнотичными гиперхромными ядрами, вне зависимости от степени накопления гранул или дегрануляции, показывающими положительное окрашивание на кальцитонин, нейронспецифическую енолазу, синаптофизин и виментин, что позволяет предположить наличие в щитовидной железе свиней особой популяции С-клеток или особого пути развития типичной С-клеточной популяции.

5. Практические рекомендации

1. Результаты исследований в значительной мере уточняют и дополняют имеющиеся знания об онтогенезе щитовидной железы у млекопитающих разных видов (собака, кошка, свинья).

2. Установленные закономерности формирования и возрастных изменений щитовидной железы в целом, и С-клеток в частности, позволяют составить более полное представление о потенциальных возможностях эндокринной системы организма. Кроме того, последовательность возрастных изменений цито архитектоники щитовидной железы, а также гистохимических особенностей ее клеток позволит клиницистам глубже понять суть происходящих патологических процессов и на этой основе разработать наиболее оптимальные методы лечения и профилактики.

3. Результаты исследований о данных структурах могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и клинических кафедрах, а также их можно рекомендовать в учебные руководства по возрастной морфологии, эндокринологии и в специальную литературу для ветеринарных врачей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в рецензируемых научных журналах согласно перечню ВАК Российской Федерации

1. Корчагина, И.Г. Анализ морфологических структур щитовидной железы при гипотиреозе собак / ИГ. Корчагина, АЛ. Мужикян, ВВ. Анников // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. — 2013. - № 4. - С. 47-50.

2. Мужикян, АЛ. Иммуногистохимическое исследование и морфология С-клеток щитовидной железы свиней / АЛ. Мужикян // Ветеринарная патология. - 2014. - №3-

4.-С. 54-61.

3. Мужикян, АЛ. Иммуноги сто химические маркеры С-клеток щитовидной железы животных/ АЛ. Мужикян // Международный вестник ветеринарии. - 2015. -№3-4. -С. 65-71

4. Мужикян, АЛ. Особенности гистологического строения щитовидной железы собаки и морфология С-клеток на разных стадиях онтогенеза / АЛ. Мужикян, B.C. Иванов // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2015. - №3. — С. 52-57

Основные публикации в журналах, сборниках и материалах конференций

5. Иванов, B.C. Синаптофизин как маркер С-клеток щитовидной железы собаки / B.C. Иванов, АЛ. Мужикян // Морфология. - 2014. - N° 3. - С. 80.

6. Мужикян, АЛ. Гистологическая характеристика щитовидной железы кролика / АЛ. Мужикян // Материалы 65-й юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ. - СПб., 2011. - С. 58-59.

7. Мужикян, АЛ. Цито архитектоника щитовидной железы зародыша кролика на 23 день беременности / АЛ. Мужикян // Актуальные вопросы морфологии и репаративных гистогенезов - 2012: Материалы всероссийской студенческой научно-практической конференции с международным участием. - Оренбург, 2012. - С. 32-34.

Формат. Бумага офсетная ГОСТ Р ИНФО 9001-2001 (ИФО 9001:2000) Гарнитура Миньон. Печать офсетная. Усл. Печ.л. 1,25. Уч.-изд. Л 8.5

Тираж 100 экз. Заказ № 98 Подписано в печать 11.09.2015 Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии «Периферия»