Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические эффекты полной и частичной инактивации функций соматического цитохрома C на модели генетически модифицированных мышей

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Биологические эффекты полной и частичной инактивации функций соматического цитохрома C на модели генетически модифицированных мышей"

005003645

На правах рукописи

МУФАЗАЛОВ ИЛЬГИЗ АЛЬБЕРТОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПОЛНОЙ И ЧАСТИЧНОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФУНКЦИЙ СОМАТИЧЕСКОГО ЦИТОХРОМА С НА МОДЕЛИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ

03.01.03 - молекулярная биология

2 4 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

005003645

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Недоспасов Сергей Артурович

Официальные доктор биологических наук,

оппоненты: профессор Гривенников Игорь Анатольевич

доктор биологических наук, Белявский Александр Вадимович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН),

Защита состоится /Л _ 2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « //>> ^4 2011 года

Ученый секретарь диссертационного советаи кандидат химических наук

рицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов функционирования белков на организменном уровне является одной из актуальных проблем современной биологии. Одним из главных участников программ регуляции жизнедеятельности и гибели клеток является цитохром С.

Обеспечение клеточного метаболизма во многом зависит от функции цитохрома С в дыхательной цепи митохондрий в качестве переносчика электронов с комплекса III на комплекс IV. С применением технологии направленного мутагенеза было показано, что мыши, лишенные соматического цитохрома С, могут доживать лишь до середины срока эмбрионального развития, в основном из-за утраты способности клеток к окислительному фосфорилированию [Li et al., 2000]. Развитие данной технологии в настоящее время позволяет создавать уникальные генетические системы, с помощью которых возможно изучать функции отдельных генов в живом организме на разных сроках развития и в отдельно взятом клеточном типе.

Помимо участия в процессе клеточного дыхания, цитохром С служит важным медиатором апоптотического каскада. Нарушения в механизмах апоптоза являются одной из причин устойчивости раковых клеток к способам цитотоксической противораковой терапии, поэтому детальное изучение всех этапов апоптотического процесса в клетках представляется весьма важным. Выход цитохрома С в цитоплазму и его взаимодействие с белком Apaf-1 инициирует сборку апоптосомы - белкового комплекса, который участвует в последующей активации специфических цистеиновых протеаз - каспаз, запускающих процесс программированной клеточной гибели. Поэтому экспериментальное изучение сборки и активации апоптосомы имеет важное фундаментальное и прикладное значение. В частности, вполне реальной становится терапия опухолей устойчивых к препаратам, действующим на этапах, предшествующих выходу цитохрома С из митохондрий и имеющих интактный постмитохондриальный каскад. В связи с этим уже исследуются миметики цитохрома С, способные индуцировать конформационные изменения в молекуле Apaf-1, необходимые для сборки апоптосомы и активации каспазы-9 [Schafer et al., 2006; Johnson et al., 2007].

Ранее при помощи бесклеточных систем и введения экзогенного цитохрома С в клетки было установлено, какие участки молекулы важны для его проапоптотической функции. Оказалось, что чрезвычайно важен остаток лизина в положении 72 [Yu et al., 2001]. Так, цитохром С, в котором этот остаток триметилирован, не способен запускать апоптотический каскад [Kluck et al., 2000], а эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) с заменой лизина в 72 положении на аланин (К72А) в молекуле цитохрома С существенно более устойчивы, чем

1

клетки дикого типа к таким видам стресса, как ультрафиолетовое излучение или обработка стауроспорином. При этом не было замечено влияния описываемой мутации на функцию клеточного дыхания. Часть гомозиготных мышей с заменой К72А проявляла явные фенотипические отклонения в строении головного мозга (гидроцефалия) и в структуре лимфоидных органов (лимфопения и спленомегалия) [Нао et al., 2005]. Однако внесенная мутация не привела к полной внутриутробной летальности, которую можно было бы ожидать, принимая во внимание важность апоптоза в эмбриогенезе и гомеостазе тканей. К сожалению, примененный исследователями подход не позволяет изучать экспрессию мутантной формы цитохрома С в отдельно взятых типах клеток и на различных стадиях онтогенеза. Впоследствии в дополнительных экспериментах с различными рекомбинантными мутантными формами цитохрома С было показано снижение апоптотической активности у мутанта с заменой лизина в 72 положении на триптофан (K72W) в 40 раз по сравнению с К72А [Sharonov et al., 2005] и в 500 раз по сравнению с цитохромом С дикого типа [Chertkova et al., 2008]. В связи с этим получение мышей и культур клеток с мутацией K72W, приводящей к инактивации проапоптотической функции и сохраняющей функцию дыхания, способно прояснить функции цитохрома С на организменном и клеточном уровнях.

Дели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование функции соматического цитохрома С мыши на организменном и клеточном уровнях. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить мышей с возможностью частичной (нарушена проапоптотическая активность) и полной (отсутствует зрелая форма) инактивацией функции соматического цитохрома С.

2. Выяснить эффекты полной инактивации функции соматического цитохрома С.

3. Исследовать эффекты частичной инактивации функции соматического цитохрома С у мышей, несущих мутацию K72W во всех клетках организма, а также на модели МЭФ.

Научная новизна работы. В данной работе с помощью технологии направленного мутагенеза впервые получены мыши, в которых возможно проводить полную или частичную инактивацию функций соматического цитохрома С. Созданная уникальная генепгческая система позволяет получать индуцибельную инактивацию функций цитохрома С как в отдельно взятом типе клеток, так и во всем организме мыши. Инактивация осуществляется в результате скрещивания мышей, несущих содержащую цитохром С конструкцию, с мышами, экспрессирующими гены Сге и Ир рекомбиназ под управлением тканеспецифических, индуцибельных или убиквитарных промоторов. Данные рекомбиназы способны узнавать экспериментально внесенные последовательности (LoxP и FRT сайты, соответственно) и

2

удалять участки ДНК заключенные между ними. В ходе работы получены мыши с потерей экспрессии соматического цитохрома С во всех клетках организма. Потеря произошла за счет внесения протяженного участка гена устойчивости к неомицину (neo кассета) в первый интрон гена цитохрома С. Показано, что такие гомозиготные мыши погибают в середине срока беременности, доживая лишь до возраста 9,5 дней внутриутробного развития. Использование систем тканеспецифической и/или индуцибельной экспрессии Сге рекомбиназы позволит в будущем получать мышей с полной инактивацией функции цитохрома С в отдельно взятом типе клеток, обходя проблему эмбриональной летальности.

Частичная инактивация функции цитохрома С, а именно нарушение его проапоптотической активности за счет наличия мутации K72W с сохранением функции окислительного фосфорилирования, была достигнута в результате последовательного удаления neo кассеты и участка цитохрома С дикого типа. Таким образом, в данной работе впервые были получены мыши с экспрессией K72W мутантной формы цитохрома С во всех клетках организма. Исследование проводили как на самих этих мышах, так и на культурах эмбриональных фибробластов. Вопреки ожиданиям, основанным на данных литературы, прогнозировавших абсолютную летальность мышей с инактивированной проапоптотической функцией цитохрома С в эмбриональном, либо в раннем постнатальном периоде, часть таких мышей оказалась жизнеспособной и не отличимой от мышей дикого типа, а другая часть проявляла явные аномалии в развитии, такие как макроцефалия и кахексия. При изучении свойств МЭФ впервые было показано, что наличие мутации K72W не влияет на экспрессию, локализацию и функцию клеточного дыхания цитохрома С в системе ex vivo. Также впервые было показано, что при действии индукторов апоптоза, активирующих митохондриальный апоптотический каскад, часть гомозиготных культур МЭФ показывает значительную устойчивость по сравнению с контрольными клетками. В то же время при активации внешнего апоптотического пути с помощью фактора некроза опухолей (ФИО) в комбинации с ингибитором синтеза белка эметином, клетки гибнут сходным образом вне зависимости от генотипа.

Научно-практическая ценность. Работа имеет теоретическое значение для понимания механизмов функционирования соматического цитохрома С в живой системе. Полученные результаты свидетельствуют об исключительной важности дыхательной функции цитохрома С для нормального протекания эмбриогенеза. Данные, полученные в ходе исследования цитохрома С с нарушенной проапоптотической активностью, говорят о необходимости внутреннего апоптотического пути для нормального развития и функционирования ЦНС. Показано, что замена лизина в 72 положении на триптофан существенно снижает проапоптотическую функцию цитохрома С и, возможно, эти данные в дальнейшем могут

3

быть использованы при разработке новых и/или корректировке существующих терапевтических схем лечения опухолей с интактным постмитохондриальным апоптотическим каскадом.

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном коллоквиуме Лаборатории молекулярной иммунологии и Группы онкоиммунологии при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Результаты работы были представлены на конференциях: «Keystone Symposia: Mitochondrial Dynamics and Physiology», Wistler, Canada (2009); IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, Россия (2009); Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии им. Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, Россия (2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (6 глав), раздела «Материалы и методы исследования» (14 глав), результатов и обсуждения (12 глав), заключения и выводов. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 26 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 194 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были получены и использованы генетически модифицированные мыши с полной или частичной инактивацией функции соматического цитохрома С, а также культуры эмбриональных фибробластов, несущих замену K72W или К72А. К моменту начала работы сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии ИМБ РАН с помощью стандартных биоинформатическнх и молекулярно-генетических методов был проведен дизайн, клонирование и наработка генно-инженерной конструкции, предназначенной для введения мутантного гена цитохрома С в эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши. Цикл работ, связанных с получением мышей с передачей генетически модифицированного локуса цитохрома С в клетки зародышевого пути, был осуществлен в Институте Рака (National Cancer Institute, Frederick, USA) и независимо сотрудниками Пущинского питомника лабораторных животных. Контроль прохождения всех биотехнологических этапов осуществлялся с помощью методов ПЦР и гибридизации по Саузерну, позволяющими детектировать различные конфигурации локуса цитохрома С. В некоторых случаях также применялось и прямое секвенирование кДНК, в межинститугском Центре коллективного пользования "ГЕНОМ" ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН. Животных содержали в виварии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, а также в Пущинском питомнике лабораторных животных. Для получения датированной беременности самок

4

ссаживали с самцом и утром проверяли наличие копулятивной пробки. Культуры МЭФ выделяли из индивидуальных эмбрионов на 13,5 день внутриутробного развития и культивировали в полной среде DMEM по стандартной методике.

Молекулярно-генетический анализ мутантных мышей и МЭФ, включающий в себя изучение профиля экспрессии цитохрома С, внутриклеточную локализацию и функцию клеточного дыхания был осуществлен с помощью методов ПЦР в реальном времени, иммуноцитохимии и методом полярографии, соответственно. Нейроанатомический анализ был осуществлен с помощью окрашивания серийных срезов головного мозга кризил-виолетом и люксолевым проточным синим, по стандартным гистологическим методикам. Для исследования проапоптогических свойств мутантной формы цитохрома С в культуральную среду с МЭФ различного генотипа добавляли индукторы апоптоза, такие как стауроспорин, эметин, актиномицин Д, ФНО и через 24 часа культуры анализировали с помощью теста МТТ, либо с помощью метода проточной цитофлуориметрии.

МЭФ с мутацией К72А [Нао et al., 2005] были любезно предоставлены А. Комаровым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение мышей с возможностью полной и частичной инактивации функции цитохрома С

Ген соматического цитохрома С состоит из трех экзонов, причем часть, кодирующая белок, расположена во втором и в начале третьего экзона. Для получения мутантной формы цитохрома С было заменено 4 нуклеотида в локусе между 71 и 73 кодоном (последовательность участка дикого типа: S'- ССС AAA AAG; последовательность участка после проведения процедуры мутагенеза: 5'- CCA TGG AAG). Таким образом, внесенная мутаиия полностью меняет 72 кодон, который теперь кодирует триптофан вместо лизина, а также затрагивает 71 кодон. Однако в последнем случае замена цитозина на аденин является синонимичной и не приводит к изменению аминокислотного состава в молекуле белка. Благодаря тому, что кодирующая часть цитохрома С является относительно короткой, оказалось возможным создать уникальную конструкцию вектора, несущего в своем составе не только описанную мутацию, но и участок цитохрома С дикого типа, обрамленного LoxP сайтами. Данный участок дикого типа встроен перед пео кассетой, расположенной в первом интроне и фланкированной FRT сайтами, и перед участком, несущим описанную замену, поэтому до рекомбинации по LoxP сайтам экспрессируется только природный вариант цитохрома С (Рис 1А).

В случае удаления участка дикого типа экспрессия в модифицированном локусе

5

оказывается нарушенной (за счет наличия протяженной последовательности neo кассеты), что приводит к полной инактивации функции цитохрома С. Этот процесс может происходить in vivo и достигается за счет скрещивания с мышами, несущими ген Сге рекомбиназы, под управлением убиквитарного промотора и тогда во всех клетках организма экспрессия цитохрома С оказывается нарушенной, что и было использовано в настоящей работе (Рис 1Б). В тоже время, использование мышей с экспрессией Сге рекомбиназы под контролем тканеспецифического и/или индуцибельного промотора дает возможность получения полной инактивации функций цитохрома С в отдельном типе клеток и на различных стадиях онтогенеза.

Поскольку геномный фрагмент с мутацией K72W находится после сигнала полиаденилирования гена дикого типа и не имеет собственного промотора, то переключение на мутантный фенотип с нарушенной проапоптотической активностью происходит только после перемещения мутантного гена под контроль природного промотора цитохрома С, осуществляемого за счет удаления neo кассеты и гена дикого типа. Этот процесс может происходить в живой мыши и достигается за счет последовательного скрещивания с трансгенными мышами, несущими гены Flp и Сге рекомбиназ (Рис 1В). В настоящей работе были использованы мыши с экспрессией рекомбиназ под управлением убиквитарных промоторов, что позволило активировать экспрессию мугантной формы цитохрома С с заменой K72W во всех клетках организма. Если же использовать тканеспецифические и/или индуцибельные промоторы, то открывается возможность изучения проапоптотической функции мутантного цитохрома С в отдельно взятом типе клеток мыши, которая в остальном абсолютно нормальна.

Электропорация мутагенезирующего конструкта была осуществлена в ЭСК мыши линии v6.4, представляющие собой гибридную линию на С57В1/6 и 129/SvJae генетической основе. После селекции было отобрано несколько клонов ЭСК и проведен Саузерн блот анализ, показавший гомологичность рекомбинации в двух клонах #6514 и 6570 (Рис 1Г). В ходе нескольких раундов инъекций в бластоцисты и трансплантации псевдобеременным самкам клеток клона #6514 было получено несколько мышей с высоким процентом химеризма (85-90%). Именно у этих мышей была детектирована передача мутации в клетки зародышевого пути. Данный факт был установлен с помощью ПЦР анализа потомков возвратного скрещивания, позволяющего детектировать наличие модифицированного cfKW аллеля и аллеля дикого типа - wt, и впоследствии был подтвержден методом гибридизации по Саузерну (Рис 1Д). С участием клеток клона #6570 были получены мыши с низким процентом химеризма и без передачи мутации в клетки зародышевого пути.

Frt сайт 1000 п.н.

У/-ih

пеог м

1 12 ä

neo M

-♦I г ■

-i/--ih

B

cfKW

V/T—//-1 I I?

Sc BP

-У/-//—

neo' M

2 2*9 i 2*+ 3

"" —//-#-Г-—1-Г*

PstI BstEII SacI

IX) Ш 1С Щ VO Ш

T

- 10,5 т.п.н.

- 9,9 т.п.*.

- 8,0 т.п.н.

Д BstEII

M 23 24 33 34

Г

BstEII + Sail 2 3 4 7

11,0 T.n.H. £ 10,S т.п.н. h 9.4Т.П.Н.

Проба a

Проба b Проба с

Проба Ь

Пробаb

Рисунок 1. Схема получении мышей е полной и частичной инактивацией функций гена соматического цитохрома С. (А) Получение генетически модифицированного аллеля (cfKW) достигается за счет гомологичной интеграции вектора в локус дикого типа (wt). Вектор имеет в своем составе фланкированную FRT сайтами PGK-Neo кассету, фланкированный LoxP сайтами участок цитохрома С дикого типа, участок с мутацией K72W, а так же ген тимндинкиназы (ТК) для проведения отрицательной селекции. (Б) Получение мышей с полной инактивацией функции цитохрома С достигается за счет рекомбинации по LoxP сайтам и удаления участка цитохрома С дикого типа. Генетически модифицированный аллель fKW несет в своем составе протяженный участок neo кассеты, что приводит к нарушению экспрессии. (В) Получение мышей с частичной инактивацией функции цитохрома С достигается за счет двух последовательных скрещиваний, с мышами несущими ген Ftp и Сге рекомбиназы. На первом этапе удаляется neo кассета, на втором -цитохром С дикого типа. С полученного KW локуса экспрессируется цитохром С с мутацией K.72W. (Г) Саузерн блот анализ ДНК клонов ЭСК. Показано присутствие модифицированного аллеля cfKW в двух клонах #6514 и 6570. Полосы, соответствующие cfKW локусу: Pst I - 8,0 т.п.н., BstE II - 14,1 т.п.н., Sac I - 14,7 т.п.н.. Полосы, соответствующие wt локусу: Pst I - 9,9 т.п.н., BstE Ii - 10,5 т.п.н.. (Д) Саузерн блот анализ ДНК потомков, полученных в результате возвратного скрещивания химер с мышами, экспрессирующими Flp рекомбиназу. Показано удаление neo кассеты и образование локуса cKW (полоса 12,2 т.п.н.) в образцах из мышей #24 и 34. Полоса 10,5 т.п.н. соответствует фрагменту из wt локуса. Полоса 14,1 т.п.н. свидетельствует о наличии локуса (cfKW) до рекомбинации. (Е) Саузерен блот анализ ДНК потомков скрещивания мышей несущих модифицированный локус cKW, с мышами, экспрессирующими Сге рекомбиназу. Показано удаление участка цитохрома С дикого типа в образце из мыши #7. Полоса 9,4 т.п.н.

соответствует фрагменту без neo кассеты и без участка цитохрома С дикого типа (KW аллель), полоса 10,5 т.п.н. соответствует фрагменту из wt локуса. В образце из мыши #2 присутствует полоса 11,0 т.п.н., что свидетельствует о наличии локуса (cKW) до рекомбинации.

Цифрами обозначены экзоны, кодирующая область цитохрома С показана черным цветом, мутация K72W отмечена буквой М (красный цвет), лпг - левое плечо гомологии, ппг - правое плечо гомологии, значимые для Саузерн блот анализа сайты рестрикции: В - BstE И, Р - Pst I, Sc - Sac I, S - Sal I, положение радиоактивно меченных проб показано как «а», «Ь» и «с», стрелками показаны положения праймеров для генотипирования с помощью ПЦР, М - маркер молекулярной массы ДНК.

2. Получение и анализ особенностей биологии развития мышей с полной инактивацией функций цитохрома С

Полученные в результате скрещивания химерных животных с мышами линии C57BI/6 гетерозиготные cfKW/wt мыши оказались способны достигать половозрелого состояния и давать плодовитое cfKW/cflíW гомозиготное потомство, неотличимое от мышей дикого типа. На следующем этапе cfKW/cfKW гомозиготных производителей скрестили с мышами, несущими ген Сге рекомбиназы под управлением CMV промотора. В результате рекомбинации по LoxP сайтам произошло вырезание участка цитохрома С дикого типа и в локусе, перед кодирующей частью цитохрома С с мутацией K72W, оказался протяженный участок neo кассеты и других адаптерных последовательностей (Рис 1Б). Таким образом были получены мыши с нарушенной экспрессией гена цитохрома С в гетерозиготной конфигурации íKW/wt (Рис 2А).

Данные гетерозиготные мыши суммарно прошли три этапа возвратного скрещивания с мышами линии С57В1/6 и оказались способны достигать полового созревания, участвовать в скрещиваниях и давать плодовитое потомство. Однако при анализе пометов не было зафиксировано ни одного случая рождения мыши с генотипом fKW/fKW (Таблица 1). Данное отклонение от нормального менделевского расщепления указывает на эмбриональную летальность гомозиготных мышей с нарушенной экспрессией гена. Действительно, согласно литературным данным, мыши, лишенные соматического цитохрома С (полная инактивация гена выполненная с другим дизайном вектора), доживают лишь до середины срока беременности [Li et al., 2000]. При генотипировании эмбрионов на 9,5 день внутриутробного развития (Рис 2Б) было показано присутствие fKW/fKW зародышей в ожидаемом соотношении с другими генотипами (Таблица 1), однако в сильно редуцированном состоянии (Рис 2В). В некоторых случаях атрофия достигала такой степени, что выделенных тканей эмбриона было недостаточно для проведения ПЦР, чем обусловлено наличие группы с неопределенным генотипом. Кроме того, при выделении редуцированных эмбрионов нельзя полностью исключить возможной контаминации тканями материнского

организма, чем может быть обусловлено попадание таких эмбрионов в группу с генотипом ЖЛУ/ш!. Однако не вызывает сомнения факт, что степень атрофии у всех гомозиготных эмбрионов была несовместима с дальнейшим продолжением онтогенеза. Объяснение данного феномена кроется в нарушенной экспрессии цитохрома С при наличии аплеля ЖЖ Синтезируемые транскрипты являются абберантными и не кодируют зрелой формы цитохрома С, что в свою очередь приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий и, как следствие, к гибели эмбрионов.

Возраст Количество (%) от общего числа потомков Всего

\vtZwt Ж\У Ш н/о

Внутриутробное развитие (Е9,5) 14+18 (22) 32+35(52) 11® (17) 4+2§ (9) 67

Новорожденные (Р1-Р10) 12(26) 34 (74) - - 46

Таблица 1. Генотипический анализ потомков гетерозиготного скрещивания ПСЧУ/иЧ мышей. Показано отсутствие Ж\\?/Ж\№ мышей с инактивированным геном цитохрома С среди новорожденных животных. Гомозиготные Ж^^/Ж^' мыши представлены в ожидаемом соотношении с другими генотипами на 9,5 день эмбрионального развития, однако они проявляют признаки атрофии (§). н/о - генотип не определен. Дни онтогенеза: Е - эмбриональный период, Р - постнатальный период.

Рисунок 2. Генотипированис и особенности биологии развития мышей с полной инактивацией функций цитохрома С. (А) ПЦР анализ потомков скрещивания сЖ\\'/сЖ'\У мышей с мышами экспрессирующими ген Сге рекомбиназы. Показано удаление участка цитохрома С дикого типа у мышей #2 и 5 и образование аллеля Ж\У. (Б) ПЦР анализ эмбрионов на стадии Е9,5, полученных в результате скрещивания гетерозиготных ЖЛУ/м мышей. Показано присутствие гомозиготного Ж\\7Ж\¥ эмбриона #6. (В) Фенотипическая характеристика эмбрионов на стадии Е9,5. Слева: существенное отставание в развитии эмбрионов Ж\У/ЖУ/. Справа: матка беременной гетерозиготной самки до выделения плодов.

Р - один из гомозиготных сЖ\\'/с1К\У производителей, М - маркер молекулярной массы ДНК, К - контроль показывающей отсутствие загрязнения ПЦР гетерогипической ДНК, (*) - гетеродуплексная ДНК.

3. Получение и характеристика мышей с частичной инактивацией функции цитохромаС

На первом этапе получения мышей с частичной инактивацией функции цитохрома С, экспрессирующих мутантную форму белка с нарушенной проапоптотической активностью, но с сохранением функции клеточного дыхания, cfKW/cfKW мыши были скрещены с мышами, несущими трансген Ир рекомбиназы под управлением промотора бета-актина. В результате было получено гетерозиготное cKW/wt потомство без neo кассеты. Такие мыши оказались способны достигать половозрелого состояния и давать плодовитое cKW/cKW гомозиготное потомство, неотличимое от мышей дикого типа. На втором этапе данных гомозиготных производителей скрестили с мышами, несущими ген Сге рекомбиназы под управлением CMV промотора, для удаления участка цитохрома С дикого типа. Таким образом были получены генетически модифицированные мыши, экспрессирующие ген цитохрома С с мутацией K72W во всех клетках организма в гетерозиготной конфигурации (KW/wt). Анализ пометов был проведен с помощью гибридизации по Саузерну (Рис 1Д,Е) и методом ПЦР. В результате прохождения всех биотехнологических циклов мыши, экспрессирующие K72W мутантную форму цитохрома С, имели смешанную С57В1/6 и 129/SvJae генетическую основу и суммарно прошли 4 этапа возвратного скрещивания с мышами линии С57В1/6.

После получения первых гомозиготных мугантных мышей был проверен профиль экспрессии гена цитохрома С, показавший сходный уровень экспрессии соматической изоформы и отсутствие транскриптов тестикулярной изоформы в образцах биопсии тканей хвоста из KW/KW, cKW/KW и мышей дикого типа. Так как наличие мутации K72W не удается обнаружить методом ПЦР, было проведено прямое секвенирование кДНК соматического цитохрома С из образца мыши с генотипом KW/KW, показавшее присутствие мутации в расчетном месте.

Некоторые KW/KW мыши оказались способны участвовать в скрещиваниях, однако в потомстве от скрещивания с KW/wt гетерозиготными мышами наблюдалось существенное отклонение от ожидаемого расщепления потомства (1:1) в пользу гегерозигот, что говорит о гибели большей части гомозиготных мышей (около 60%) в эмбриональный период. В дальнейшем, в ходе постнатального онтогенеза, погибает еще около 60% от родившихся KW/KW мышей, при этом 56% из них проявляют признаки кахексии и/или макроцефалии, а оставшаяся часть погибает без видимых фенотипических отклонений (Таблица 2). Замечено, что KW/KW мыши с аномалиями в развитии появлялись не только в потомстве от родителей, один из которых имеет гетерозиготный генотип, а второй - гомозиготный, но также и в других типах скрещиваний, в том числе и с участием обоих гомозиготных производителей.

10

При этом часть потомства с генотипом KW/KW внутри одного помета проявляла описанные выше аномалии в развитии, а другая часть выглядела внешне нормальной, достигала взрослого состояния и была фертильной. Проведя анализ потомства всех типов скрещиваний, удалось выделить периоды максимальной смертности гомозиготных мышей -они соответствовали нескольким первым дням после рождения и 3-6 неделе постнатального онтогенеза (Рис 3). При этом было установлено, что основная масса мышей начинала развивать видимые отклонения от нормы с третьей недели постнатального онтогенеза.

Возраст Количество (%) от общего числа потомков Всего

KW/wt KW/KW

Новорожденные (PI-PI4) 65 (70) 27+1* (30) 93

Ювенильные (Р15-Р50) 62+3* (74) 16+48+3*(26) 88

Взрослые (>Р50) 62 (83) 12+1*(17) 75

Таблица 2. Генотипический анализ потомков скрещивания KW/KW х KW/wt мышей. Показано существенное отклонение в количестве новорожденных мышей в пользу гетерозигот, вследствие эффекта эмбриональной летальности мутации K72W и гибели 57% гомозиготных мышей в период внутриутробного развития. В постнатальном онтогенезе 14% KW/KW мышей развивает признаки кахексии, 18% - макроцефалии, а 25% погибает без видимых аномалий. Таким образом, во взрослом состоянии популяция KW/KW мышей на 80% меньше, чем следовало бы ожидать, при одинаковой жизнеспособности особей различных генотипов. В то же время, 95% KW/wt мышей достигали взрослого состояния без отклонений в развитии. Мыши с признаками макроцефалии обозначены (§), мыши с признаками кахексии обозначены (*), Р - дни постнатального онтогенеза.

f

• .... ......

1 Ш.....~ N11 гт................-...............................п...................-..........

Постнатальный онтогенез, дни

Рисунок 3. Особенности постнатального онтогенеза KW/KW мышей. Бесцветные столбики соответствуют смертности мышей без видимых фенотипических отклонений; серые - соответствуют мышам проявляющим признаки кахексии и/или макроцефалии; столбики со штриховкой - соответствуют мышам с признаками кахексии и/или макроцефалии, забитыми в экспериментальных целях, а так же из гуманных соображений, -ввиду остроты аномалий. Верхняя граница столбика соответствует общему количеству погибших животных в указанный промежуток времени.

Мыши с признаками кахексии характеризовались существенно редуцированными размерами и массой тела, а мыши, проявляющие признаки макроцефалии, в дополнение,

имели увеличенный свод черепа, и по мере прогрессирования заболевания пропорция

11

размера головы к туловищу сильно возрастала (Рис 4А,Б). В большинстве случаев за несколько дней до смерти наблюдалась резкая потеря массы тела животных.

Рисунок 4. Фенотипическая характеристика гомозиготных мутантных мышей. Показаны проявления признаков макроцефалии и кахексии у части гомозиготных мышей. (А) Вверху показана мышь с признаками макроцефалии, внизу показана мышь из того же помета без видимых аномалий в развитии, возраст - 50 дней. (Б) Мышь с признаками кахексии (слеза) существенно отстает в развитии от мыши из общего помета без видимых отклонений (справа), возраст - 8 дней.

При вскрытии черепной коробки мышей с признаками макроцефалии обнаруживалось

спадание тканей мозга и обильное выделение жидкости (Рис 5), в некоторых случаях

наблюдалось присутствие гематом. Для оценки нейроанатомических особенностей таких

мышей были приготовлены серийные двадцатимикронные срезы головного мозга трех

животных. В исследуемую область попали все части головного мозга, начиная от

обонятельных луковиц и заканчивая мозжечком. В результате проведенного анализа с

помощью световой микроскопии было обнаружено аномальное увеличение латеральных

желудочков головного мозга (что является характерным признаком гидроцефалии),

некоторые из структур мозга (мозолистое тело, гиппокамп, стриатум, ядра миндалины и др.)

были сильно изменены в размерах и смещены относительно друг друга (Рис 6).

Рисунок 5. Макроанатомический анализ строения головного мозга гомозиготных мутантных мышей. Показано сильное увеличение размеров больших полушарий, спадающихся при вскрытии черепной коробки, у мышей с признаками макроцефалии. Слева: вид сверху на головной мозг KW/KW мыши с признаками макроцефалии, возраст - 36 дней. Справа: вид сверху на головной мозг KW/KW мыши без внешних фенотипических отклонений, возраст - 50 дней.

Степень изменений в архитектонике головного мозга оказалась индивидуальной для каждого животного, таким образом можно говорить о высокой вариабельности отклонений от нормы внутри этой группы. Примечательно, что в строении коры головного мозга значительных отклонений не наблюдалось. Слои коры были хорошо различимы и позволяли судить о расположении различных корковых зон, таких как цингулярная, моторная, соматосенсорная кора и др. Лишь иногда наблюдалось некоторое уменьшение толщины

В то же время, субпопуляция выживающих гомозиготных мышей была неотличима по внешним морфологическим параметрам от мышей дикого типа, а также характеризовалась сходной динамикой набора массы тела как самцов, так и самок в сравнении с гетерозиготными мь1шами. Более того, максимально зафиксированная продолжительность жизни таких животных составила 22 месяца. Проведенный гистологический анализ серийных срезов KW/KW мышей без фенотипических проявлений мутации не выявил аномалий ни в архитектонике головного мозга (Рис 7), ни в миелинизации нейронов (Рис 8).

Рисунок 6. Гистологический анализ строения головного мозга гомозиготной мыши с признаками макроцефалии. Показано аномальное увеличение желудочков мозга, что приводит к сильному смещению анатомических структур относительно друг друга. Слева: фронтальные срезы головного мозга KW/KW мыши на разных уровнях; возраст - 50 дней, окраска кризил-виолет. Справа: показаны уровни (Вг) фронтальных срезов наиболее близко соответствующие топологии экспериментальных срезов по Franklin и Paxinos, 1997.

мм

<ч ' )

♦

коры, видимо, за счет увеличения объема желудочков.

Вг 1,98

Вг 1,98 мм

Вг -2,46 мм

Рисунок 7. Гистологический анализ строения головного мозга гомозиготной мыши без видимых фенотипических отклонений. Показано присутствие и топология всех характерных структур головного мозга. Слева: фронтальные срезы головного мозга KW/KW мыши на разных уровнях, возраст 47 дней, окраска кризил-виолет. Справа: показаны соответствующие уровни (Вг) фронтальных срезов по Franklin и Paxinos, 1997.

Рисунок 8. Гистологический анализ миелинизации нейронов головного мозга. Показано наличие миелинизированных волокон в структурах головного мозга мутантных мышей на фронтальных срезах на уровне гиппокампа. Слева: гистологический срез головного мозга KW/KW мыши без признаков j мм макроцефалии, возраст 3 мес. Справа: гистологический срез головного мозга KW/wt мыши, возраст 10 мес. Окраска люксолевым прочным синим по Клюверу-Баррера. Миелин окрашен в бирюзово-синий цвет, нейроны в фиолетово-синий цвет.

Внутренний апоптотический каскад в значительной степени определяет цитоархитектонику головного мозга, что было показано при изучении мышей, лишенных таких ключевых компонентов митохондриальной ветви как: Apaf-1, каспаза-9, каспаза-3, а также мышей, экспрессирующих мутантную К72А форму цитохрома С, неспособную участвовать в формировании апоптосомы. Во всех случаях у части популяции генетически модифицированных мышей наблюдались аномалии в строении головного мозга, как в постнатальном онтогенезе, так и в эмбриональный период. В то же время, несмотря на отсутствие Apaf-1, часть мутантных мышей развивается нормально, что говорит о наличии компенсаторного Apaf-1 независимого пути, важного для формирования и функционирования всего организма и ЦНС в частности [Honarpour et al, 2000; Okamoto et al., 2006]. Также нельзя исключить возможного вклада других форм клеточной гибели, которые могут быть активированы в мутантных мышах с заблокированной митохондриальной ветвью апоптоза [Shiraishi et al., 2010]. Вместе приведенные факты могут стать объяснением наблюдаемого нами расщепления популяции KW/KW мышей на субпопуляцию с явными аномалиями в развитии и субпопуляцию без видимых феногипических отклонений.

В наших пилотных экспериментах по изучению нейрофизиологии было показано, что у всех KW/KW мутантных мышей имеется нормальная кожная и вибриссная чувствительность, они нормально слышат и видят. Локомоторная активность и чувство равновесия, координация передних и задних лап не отличается от мышей дикого типа. В то же время у мыши с макроцефалией наблюдались явные нарушения в моторике и координации движений: отчетливая недостаточность была выявлена в тестах на горизонтальном и вертикальном канатах и на наклонной плоскости.

Помимо отклонений в строении и функционировании нервной системы, мыши с признаками макроцефалии и/или кахексии характеризуются высокой вариабельностью в развитии лимфоидных органов, таких как тимус и селезенка. В то же время, мыши без

видимых фенотипических проявлений мутации не отличаются по развитию этих органов от мышей контрольной группы (Рис 9А,Б). Примечательно, что наличие мутации K72W не оказывает эффекта на инволюцию тимуса в обоих субпопуляциях KW/KW мышей в модели с умеренной сверхпродукцией трансгена ФНО/ЛТ человека. Ранее было показано, что повышенная продукция этих цитокинов приводит к преждевременной инволюции тимуса мышей с генетической основой С57В1/6 и не оказывает влияния на развитие вторичных лимфоидных органов [Liepinsh et al., 2009]. Таким образом, можно заключить, что мутация в гене соматического цитохрома С не затронула каскад трансдукции сигнала, опосредованного цитокинами ФИО и ЛТ, приводящего к ранней инволюции тимуса, а развитие лимфоидных органов, по крайней мере, тимуса и селезенки у KW/KW мышей, коррелирует с генерализованным фенотипическим проявлением мутации, также как строение головного мозга и уменьшение массы тела.

относительная масса селезенки

V- л л^

Рисунок 9. Макроанатомический анализ развития лимфоидных органов у KW/KW мышей. (А) Высокая вариабельность в развитии тимуса у мышей с признаками макроцефалии и/или кахексии (*), в то время как тимус у мышей без видимых аномалий не отличим от контрольной группы. Существенное уменьшение массы тимуса на 4-ой неделе постнатального онтогенеза у мышей, несущих трансген (Tg) локуса ФНО/ЛТ человека, не зависит от конфигурации локуса соматического цитохрома С. (Б) Отсутствие влияния мутации K72W и Tg на развитие селезенки у мышей без явных аномалий в развитии. Мыши с признаками макроцефалии и/или кахексии характеризуются большой вариабельностью в развитии органа. Данные представлены в виде относительной массы - отношение одного мг сырой массы органа на один г массы тела животного. Каждая группа содержала от двух до восьми животных. Цифрами указан возраст мышей (недели).

4. Свойства эмбриональных фибробластов мыши с частичной инактивацией функций цитохрома С

Для получения МЭФ, экспрессирующих соматический цитохром С с заменой K72W, а так же контрольных культур использовались скрещивания, в которых участвовали как гомозиготные, так и гетерозиготные производители. В результате таких скрещиваний были выделены первичные культуры эмбриональных фибробластов трех генотипов KW/KW,

15

K.W/wt и wt/wt. Все они не отличались значимо друг от друга по морфологии и скорости роста, и в дальнейшие исследования были отобраны по несколько культур из каждой группы.

В норме в соматических клетках ген тестикулярного цитохрома С не экспрессируется, однако описан случай, когда компенсаторная экспрессия этого гена в клетках CRL-2613, не имеющих соматической формы цитохрома С, приводила к восстановлению у клеток свойств дикого типа [Vempati et al., 2007]. Проведенные измерения уровня экспрессии с помощью метода ПЦР в реальном времени показали отсутствие экспрессии гена тестикулярной изоформы (Рис 10) и сходный уровень экспрессии соматической изоформы цитохрома С во всех культурах (данные не приведены). Выраженная в условных единицах концентрация транскриптов тестикулярной изоформы, оказалась исчезающе мала для всех протестированных культур по сравнению с положительным контролем. Эти результаты важны для интерпретации последующих экспериментов, выявивших различия в свойствах индивидуальных культур МЭФ с одним и тем же генотипом.

Рисунок 10. Анализ экспрессии тестикулярной

изоформы цитохрома С в культурах МЭФ с помощью метода ПЦР в реальном времени. Показано отсутствие экспрессии (экспрессия на уровне фона) тестикулярной изоформы во всех культурах МЭФ, вне зависимости от генотипа, в сравнении с клеточной линией CRL-2613. Экспрессия цитохрома С нормирована на экспрессию рибосомального фосфопротеина Р0 и выражена в условных единицах.

Следующим этапом анализа МЭФ стало определение внутриклеточной локализации цитохрома С с помощью метода иммуноцитохимии. Окрашивание клеток потенциалзависимым красителем Mitotreacker Red показало, что митохондрии в них имели нормальную форму и распределение (данные не приведены). Кроме того, с помощью антител было установлено, что цитохром С образует в клетках вытянутые тяжи, повторяющие форму митохондрий. Такой характер распределения цитохрома С наблюдали как в гомозиготных МЭФ с мутацией K72W, так и в клетках дикого типа (Рис 11).

Изучение функции дыхания МЭФ полярографическим методом показало, что все протестированные культуры, как мутантные так и контрольные, поглощали кислород из культуральной среды. После добавления разобщителя окислительного фосфорилирования FCCP наблюдалось увеличение скорости потребления кислорода, что указывает на

5000045000-

40000-1

KW/KW KW/wt wt/wt

нормальное сопряжение дыхания и синтеза АТФ. Аналогичные свойства были характерны не только для МЭФ с мутацией K72W, но и для МЭФ с мутацией К72А. В пользу сохранения функции дыхания говорит и тот факт, что для успешного культивирования мутантных МЭФ не требовалось каких-либо специальных ростовых добавок. Известно, что клетки, полностью лишенные цитохрома С, плохо растут и быстро закисляют среду из-за нарушенного аэробного дыхания и увеличенной активности гликолиза. Поэтому для успешного культивировании таких клеток необходимо добавлять в среду уридин и пируват [Li et al., 2000]. Таким образом, отсутствие эффектов мутации на экспрессию, локализацию и функцию клеточного дыхания указывают на полную пригодность нашей модели для изучения функции мутантной формы цитохрома С в условиях клеточного стресса, приводящего к активации апоптотической программы.

Рисунок 11. Определение локализации цитохрома С в МЭФ с помощью метода иммуноцитохимического анализа. Слева - окрашивание антителами к цитохрому С, зеленый фильтр; посередине -окрашивание ядер с помощью Hocchst 33342, синий фильтр; справа - наложение кадров. Фотографии получены с помощью флуоресцентного

микроскопа Axiovert ("Carl Zeiss")

Апоптоз может индуцироваться в ответ на внешние стимулы и опосредуется передачей сигнала через рецепторы смерти, либо в результате внутриклеточных повреждений. Способность МЭФ выживать при воздействии различных проапоптотических агентов оценивали с помощью цитотоксического теста МТТ и флуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре. Классическим агентом, стимулирующим внутренний апоптотический путь, является стауроспорин, ингибитор протеинкиназ [Tamaoki et al., 1986]. В тесте МТТ, в основе которого лежит способность живых клеток восстанавливать этот краситель до формазана, было показано, что МЭФ, несущие гомозиготную мутацию K72W в гене цитохрома С, более устойчивы к действию стауроспорина, чем клетки дикого типа и гетерозиготные культуры. Так, чувствительность клеток к стауроспорину в концентрации 2 мкМ за счет наличия мутации снижалась примерно в 2,5 раза (59% выживших KW/KW клеток против 23% клеток дикого типа). Кроме того, не было выявлено достоверных различий в устойчивости к стауроспорину между МЭФ с мутацией K72W и клетками с заменой К72А (Рис 12).

70л 60* 50-

S 405 ф 30-

100

Рисунок 12. Влияние стауроснорина на выживаемость МЭФ в цитотоксическом тесте.

Повышенная устойчивость

гомозиготных культур МЭФ KW/KW (ml) и КА/КА, к действию стауроспорина по сравнению с клетками дикого типа и гетерозиготными культурами.

KW/KW KW/wt wtftM КАЖА KA/wt wttwt

Стауроспорин, 2мкМ

Во всех культурах, проанализированных с помощью теста МТТ, наблюдалось появление активной формы каспазы-9 (данные не приведены), количество которой было заметно снижено в мугантных МЭФ. Эти данные показывают, что по крайней мере часть клеток в ответ на действие стауроспорина гибнет по каспазо-зависимому пути алолтоза.

Для исследования апоптотических изменений, связанных с перестройками в клеточной мембране, использовали метод проточной цитофлуориметрии, принцип которого заключается в способности возбуждать и детектировать флуоресценцию флуорофоров в отдельно взятой клетке. В качестве проапоптотического агента в дополнение к стауроспорину, был выбран антибиотик актиномшин Д, ингибируюший механизм репликации и транскрипции за счет образования комплекса с ДНК [Sobell, 1985]. Таким образом, клетки, подвергнутые действию этого агента, оказываются заблокированными в фазе GI клеточного цикла, что приводит к запуску программы апоптоза. Ранние апоптотические изменения характеризуются перемещением остатков фосфотидилсерина с внутренней стороны клеточной мембраны на внешнюю, что может быть детектировано с помощью аннексина V (Ann V). Для детекции поздних апоптотических изменений, когда целостность мембран нарушена и генетический материал клетки становится доступен для невитальных красителей, использовался раствор пропидий иодида (PI).

В ходе исследования было показано, что несколько гомозиготных K72W мугантных культур МЭФ существенно более устойчивы к действию стауроспорина (Рис 13А,Б) и актиномицина Д (Рис 14А,Б), чем клетки дикого типа и гетерозиготные культуры. Устойчивость гомозиготных культур варьирует в зависимости от концентрации проапоптотического агента и, подобно опытам с МТТ, может быть в 2,5 раза выше по сравнению с контрольными культурами. Для оценки устойчивости клеток к действию цитотоксического агента использовались суммарные значения ранних и поздних апоптотических событий, получаемые в результате сложения процента клеток, положительных по аннексину V (нижний правый квадрант) и процента клеток

положительных как по аннексину V, так и по пропидий иодиду (верхний правый квадрант) на точечных диаграммах детекции флуоресценции. Следует отметить, что использованный нами подход не позволяет четко разграничить клетки, умирающие некрозом или апоптозом. Так, клетки, которые мы относим к поздним апоптотическим, могут быть и некротическими. Внутренним контролем, показывающим, что по крайней мере часть клеточной популяции гибнет по апоптотическому пути, является наличие клеток, окрашенных только лишь Ann V, которые мы называем ранними апоптотическими. Одновременное наличие этих двух популяций может быть объяснено тем, что культуры клеток в наших опытах не являлись синхронными. В зависимости от фазы клеточного цикла, в котором находилась клетка на момент обработки проалоптотическим агентом, через 24 часа мы могли детектировать либо ранние, либо поздние апаптотические изменения. При увеличении времени инкубации с проапоптотическими агентами наблюдалось изменение соотношения количества клеток в пользу положительных одновременно и по аннексину V и по пропидий иодиду.

Стауроспорин

О 0,05 0,1 0,2

Стауроспорин, мкМ

Рисунок 13. Изучение влияния стауроспорина на клеточные культуры МЭФ с помощью флуоресцентного анализа. (А) Примеры точечных диаграмм детекции флуоресценции, соответствующие эмиссии аннексина V и пропидий иодида. Цифрами указан процент живых клеток, не связавшихся ни с Ann V, ни с Pi. (Б) График зависимости количества апоптотических клеток от концентрации стауроспорина для различных культур МЭФ. Значения для культур дикого типа являются средним арифметическим по двум культурам. Гетерозиготная культура и гомозиготные культуры МЭФ представлены индивидуально. Две KW/KW культуры (ml и т7) показывают существенную устойчивость к действию стауроспорина; одна (т41) неотличима от контрольных культур.

Актиномицин Д

о т *

с 1Г Ф

га о

О 50 100 200 500 1000

Актиномицин Д, нг/глп

Рисунок 14. Изучение влияния актиномицина Д на клеточные культуры МЭФ с помощью флуоресцентного анализа. (А) Примеры точечных диаграмм детекции флуоресценции, соответствующие эмиссии аннексина V и пропидий иодида. Цифрами указан процент живых клеток, не связавшихся ни с Ann V, ни с PI. (Б) График зависимости количества апоптотических клеток от концентрации актиномицина Д для различных культур МЭФ. Значения для гетерозиготных культур и культур дикого типа являются средним арифметическим по трем культурам каждого генотипа, гомозиготные культуры представлены индивидуально. Две KW/KW культуры (ml и ш7) показывают существенную устойчивость к действию актиномицина Д, одна (т44) неотличима от контрольных культур, оставшаяся (ш41) показывает промежуточную устойчивость.

Обращает на себя внимание факт, что устойчивость отдельных гомозиготных культур

МЭФ к действию проапоптотических агентов показывает существенную вариабельность. Так

можно выделить культуры с высокой степенью устойчивости - ml и т7 (опыты со

стауроспорином и актиномицином Д); с промежуточной устойчивостью - m41 (опыты с

актиномицином Д); и с отсутствием детектируемой разницы в сравнении с контрольными

культурами - m41 (опыты со стауроспорином) и т44 (опыты с актиномицином Д). При этом

не выявлено различий в устойчивости между пятью индивидуальными культурами дикого

типа и тремя гетерозиготными культурами, использованными в качестве контрольных.

Общим свойством для каждой группы культур МЭФ, как гомозиготных так и контрольных,

является отсутствие компенсаторной экспрессии тестикулярной изоформы цитохрома С и

отсутствие достоверных различий в уровнях экспрессии соматической изоформы, что могло

20

бы стать объяснением различной устойчивости индивидуальных гомозиготных культур. Таким образом, мы можем констатировать факт, что отдельные культуры МЭФ целиком, либо часть субпополяции клеток, подобно мышам, имеют адаптивные изменения, позволяющие восстановить недостаток в нарушенном апоптотическом каскаде передачи сигнала. Поскольку каждая культура МЭФ выделена из индивидуального эмбриона, мы можем провести аналогию с расщеплением фенотипа KW/KW мышей в постнатальном онтогенезе, часть которых погибает с признаками макроцефалии и/или кахексии, а у 43% родившихся мышей не было обнаружено отклонений в развитии.

Обнаруженная разница в устойчивости МЭФ к действию проапоптотических агентов оказалась существенно ниже, чем в опытах с рекомбинантными мутантными формами и формой цитохрома С дикого типа в бесклеточной системе, а также ниже, чем при введении экзогенного цитохрома С в клетки WEHI-3 [Abdullaev et al., 2002, Sharonov et al., 2005, Chertkova et al., 2008]. Сходная ситуация была ранее описана и для МЭФ с мутацией К72А в гомозиготном состоянии, где чувствительность к действию стауроспорина была снижена не более чем в 2 раза по сравнению с клетками дикого типа [Нао et al., 2005], хотя рекомбинатный цитохром С с данной мутацией не способен приводить к активации каспазу-9 в опытах in vitro [Yu et al., 2001]. Отсутствие существенной разницы между клетками с мутациями K72W и К72А, ожидавшейся на основании данных литературы [Sharonov et al., 2005, Chertkova et al., 2008], может быть в значительной степени обусловлено особенностями экспериментальных систем - WEHI-3 и МЭФ (в данной работе). Кроме того, нельзя полностью исключить возможность вклада постсинтетических модификаций цитохрома С во время его функционирования в живой клетке. Такие модификации трудно или невозможно воспроизвести даже в современных системах гетерологичной экспрессии. Например, показано, что часть пула молекул цитохрома С перед выходом из митохондрий в процессе апоптоза подвергается нитрозилированию [Schonhoff et al., 2003], а в последствии такой модифицированный белок может быть найден в ядре [Godoy et al., 2009].

Обнаруженные нами различия в устойчивости клеток к апоптотическим индукторам оказались меньшими, чем опубликованные ранее для клеток, лишенных Apaf-1 [Cecconi et al., 1998, Yoshida et al., 1998]. Возможное объяснение состоит в существовании "обходных" сигнальных путей, зависимых от Apaf-1, но не зависимых от цитохрома С. Известно, что цитохром С не единственная молекула, принимающая участие в активации апоптосомы и проведении митохондриального апоптотического каскада. Хотя по расщеплению прокаспазы-9 мы знаем, что при обработке стауроспорином часть клеток гибнет по каспазо-зависимому пути, нельзя исключить и возможность гибели части клеток популяции по другому пути. Также нельзя полностью исключить и возможность Apaf-1-независимого пути

21

активации каспаз, который в обычных условиях не проявляется, но при иншбировашш

активации Apaf-1 за счет мутаций в цитохроме С может играть более существенную роль.

Так, тимоциты мышей с гомозиготными мутациями К72А и K72W (данные не приведены)

развиваются нормально и сохраняют чувствительность ко многим проапоптотическим сигналам.

Второй возможный путь апоптоза активируется за счет взаимодействия лигандов, принадлежащих к суперсемейству фактора некроза опухоли, с рецепторами смерти на поверхности клеточной мембраны. Известно, что с внешним апоптотическим каскадом, в частности в ответ на ФНО, конкурирует путь активации NF-kB. Большинство клеток (в том числе МЭФ) защищено от апоптоза, вызываемого ФНО, по той причине, что гены нескольких белков-блокаторов апоптоза находятся под транскрипционным контролем NF-kB. Для того, чтобы сдвинуть тонкий баланс в сторону клеточной смерти в экспериментальной системе, необходимо добавлять питостатики, прямо или косвенно интерферирующие с системой NF-kB. Поэтому в нашей работе для активации внешнего апоптотического каскада использовался рекомбинантный ФНО в комбинации с эметином. Как и ожидалось, ФНО сам по себе в использованном диапазоне концентраций в тесте МТТ не оказал цитотоксического действия на МЭФ. В комбинации же с эметином (4 мкг/мл) индуцировал гибель клеток, однако эффект не зависел от наличия мутации K72W в цитохроме С (Рис 15). Сам эметин в этой концентрации не влияет на выживаемость клеток, однако в более высоких концентрациях, обладал цитотоксической активностью за счет ингибирования синтеза белка [Boon-Unge et al., 2007].

О KW/KW -£г KW/wt -ф- wt/wt

100- Ч

-1 '-'-1-Г , , - т-,—

0,005 0,01 0,02 0,04 0,08 0,16 0,31 0,63 1,25 2,5 ФНО, нг/мл (в присутствии эметина 4 мкг/мл)

Рисунок 15. Изучение влияния фактора некроза опухолей в присутствии цитостатика (эметина) на выживаемость МЭФ в цитотоксическом тесте.

Цитотоксическии эффект и отсутствие влияния мутации К72\У в гене цитохрома С на выживаемость МЭФ в сравнении с клетками дикого типа.

Ранее было показано, что МЭФ, лишенные соматического цитохрома С, более чувствительны к цитохром С-независимому апоптозу [Li et al., 2000]. Однако у легочных фибробластов, не экспрессирующих ни соматической, ни тестикулярной формы цитохрома С, чувствительность к ФНО оказалась пониженной [Vempati et al., 2007]. Проведенные нами опыты показали, что МЭФ вне зависимости от генотипа, реагировали на ФНО сходным образом. Таким образом, внесение мутации в цитохром С не нарушило алопготический каскад запускаемый фактором некроза опухоли в комбинации с эметином.

ВЫВОДЫ

1. С помощью технологии направленного мутагенеза получены мыши с возможностью кондиционной полной или частичной инактивации функций соматического цитохрома С. Полная инактивация функций соматического цитохрома С в гомозиготном состоянии приводит к эмбриональной летальности мышей в середине срока беременности.

2. Мутация K.72W, заметно снижающая проапототическую активность соматического цитохрома С, не затрагивает дыхательную функцию, а также не нарушает характер экспрессии данного белка и его внутриклеточную локализацию.

3. Гомозиготные KW/KW мутантные мыши характеризуются высокой эмбриональной (около 60%) и постнатальной (около 60%) летальностью, а также проявляют признаки кахексии и/или макроцефалии (около 32%). Мыши с макроцефалией имеют нарушения в нейроанатомии (гидроцефалия), нейрофизиологии (отклонения в моторике и координации движений) и в развитии лимфоидных органов (тимуса и селезенки).

4. Часть гомозиготных культур K.W/KW эмбриональных фибробластов мыши существенно более устойчива к действию проапоптотических индукторов (таких как стауроспорин, акгиномицин Д и эметин), активирующих митохондриальный алопготический каскад. При этом мутация не затронула внешний апоптотический путь в МЭФ, запускаемый фактором некроза опухолей в комбинации с эметином.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

!?!lik0,V' E S- !hil0V- I A- Mufazalov, V. Gogvadze, SA. Nedospasov and B. Zhivotovsky. Cytochrome c: the Achilles' heel in apoptosis. Cellular and Molecular Life Sciences. d печати.

L!rAMHM"'J А'^5РУГЛ0В' ПА- Ефимов' MC ДРУ«кая- Д-н- Пеньков, Д.В. Купраш, С.А. Недоспасов. Эффекты мутации в гене цитохрома С и блокаторов активных

1нп/гтКтТР0Д- -^Р««^ инволюцию тимуса в мышах, трансгенных по локусу чши/JU. госсиискии иммунологический журнал, 2011, 5(14), № 2, с. 112-120.

3) И.А^ Муфазалов, Д.Н. Пеньков, Б.В. Черняк, О.Ю. Плетюшкина, М.Ю. Высоких Р В Черткова, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, А.А. Круглов, Д.В. Купраш, В.П. Скулачев,'С.а' Недоспасов Эмбриональные фибробласты мыши с мутацией K72W в гене соматического цитохрома С: получение и характеристика. Молекулярная биология, 2009,43(4) с. 648-656.

i} . А"Р- А-А. Круглов, Н.Л. Большева, О.Ю. Юркевич, Д.Я. Липиньш, И.А.

Щфазалов, Д.В.Купраш, С.А. Недоспасов. Определение места и характера интета^ геномного фрагмента, содержащего локус фактора некроза опухолей человека, у трансгенных мышеи. Молекулярная биология, 2008,42(4), с. 629-638.

Тезисы коиференций

ги 1;АглМлиГ^а!,ОТ:,ДА- Kruglov' РА" Lemansky, D.V. Kuprash, M.Y. Vyssokikh, BV Chernyak, D.A Dolgikh, S.V. Zvorykina, K.V. Anokhin, L. Tessarollo, V.P. Skulachev and S a' Nedospasov. Мюе carrying K72W mutation in cytochrome c. Abstracts of The 13th STS MeetingSignal Transduction - Receptors, Mediators and Genes. Weimar, Germany, October 28-30, 2009,

bL^pr^0-' Д^раШ' Д Н' Пеньков' Б В- О.Ю. Плетюшкина, М.Ю.

Высоких, Р.В. Чернова, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, А.А. Круглов, C.B. Зворыкина,

К.И. Анохин, В.П. Скулачев, С.А. Недоспасов. Биологические эффекты мутации

приводящие к замене 72 лизина в молекуле соматического цитохрома С мыши'

Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и

бионанотехнологии им. Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, 28 сентября - 1 октября, 2009,

7) И.А. Муфазалов, Д.В. Купраш, Д.Н. Пеньков, Б.В. Черняк, О.Ю. Плетюшкина, М.Ю Высоких, Р.В^Черткова, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, А.А. Круглов, В.П. Скулачев С А Недоспасов. Влияние мутации K72W в гене соматического соматического цитохрома С на выживаемость эмбриональных фибробластов мыши. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня, 2009, с. 346.

v Ль' ^'0V\D:V- Kuprash' А А" Р- Lemansky, Yu.V. Shebzukhov, M.Y

DN S t t ^^^^I^™^ RV' Chertk0va' D A- * M.P. Kirpichnikov; D.N. Penkov L. Tessarollo, V.P. Skulachev and S.A. Nedospasov. Cells and mice carrying K72W

СГсаПп^

Подписано в печать 12.10.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1147 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Муфазалов, Ильгиз Альбертович

1 ОГЛАВЛЕНИЕ.

2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

3 ВВЕДЕНИЕ.

4ЮБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ^.8^

4111 Общая'характеристикащитохромагС.8^

4.2 Участие цитохрома С в анонтозе . 9>

4:211 Историявопроса^.

4.2.2 Мобилизация цитохрома С.:.16*

4.2.3 Транслокация.через внешнюю'мембрану.1'8>

4.2.5 Формированием функционирование апоптосомы.23*

4.3 Функции отдельных аминокислотных остатков в молекуле цитохрома С.

5'МАШЕРИАУ1БГ№.31!

5.1 Ферменты и. реактивы. 31!

5.2 Мыши и их генотипирование.

53 Радиоактивное мечение проб игСаузерн блот гибридизация;.

5.4 Выделение эмбрионов на разных сроках внутриутробного развития

5.5 Получение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши>

5.6 Измерение экспрессии генов соматической и тестикулярной изоформ цитохрома С.

5.7 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК.

5.8 Измерение скорости дыхани51 эмбриональных фибробластов мыши

5.9 I^нтотоксический тест.38;

5.10 Иммуноцигохимия.39т

5.11 Проточная цитофлуориметрия.

5.12 Гистологический анализ серийных срезов головного мозга.

5.13 Нейрофизиологические тесты.

5.14 Макроанатомический анализ развития некоторых лимфоидных органов.

6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

6.1 Получение мутагенезирующего конструкта для гомологичной рекомбинации.

6.2 Электропорация, отбор положительных клонов и инъекция в бластоцисты.

6.3 Получение мышей:с полной инактивацией функций цитохрома С . 50*

6.4!Особенности,биологии развития мышей с нарушенной экспрессией гена цитохромалС.

6.5 Получение мышей с частичной инактивациешфункции цитохрома*С

6.6 Особенности биологии мышей, экспрессирующих соматический^ цитохром С с заменой.лизина(В-72 положениинатриптофан.

6.6.1 Особенности биологии развития KW/KW мышей.

6.6.2 Особенности нейроанатомии KW/KW мышей.

6.6.3 Особенности нейрофизиологии KW/KW мышей.

6.6.4 Особенности развития некоторых лимфоидных органов KW/KW мышей.

6.7 Свойства эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ) с частичной инактивацией функций цитохрома С.

6.7.1 Получение МЭФ из KW/KW мышейанализ экспрессии и локализации цитохрома G.

6.7.2 Изучение функции дыхания МЭФ.

6.7.3 Изучение действия различных проапоптотических индукторов на культуры МЭФ.