Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга в развитии партеногенетических клеточных клонов у химерных мышей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Исаев, Дмитрий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Партеногенез у млекопитающих и геномный импринтинг.

1.1. Партеногенез в различных группах животных и у млекопитающих.

1.2.Типы партеногенетических зародышей и пути партеногенетического развития яйцеклеток млекопитающих

1.3. Получение искусственных партеногенов млекопитающих

1.4. Развитие и причины гибели партеногенетических зародышей млекопитающих.

1.5. Геномный импринтинг.

2. Использование химерных мышей для изучения эффектов геномного импринтинга.

2.1. Химеры млекопитающих.

2.2. Партеногенетические химеры.

2.3. Андрогенетические химеры.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга в развитии партеногенетических клеточных клонов у химерных мышей"

Изучение механизмов генетического контроля онтогенеза млекопитающих является важнейшим направлением в экспериментальной эмбриологии и генетике развития. Данные фундаментальных исследований в этой области имеют в перспективе прикладное значение в медицинской генетике и животноводстве. Предупреждение наследственных болезней человека на основе генетического прогнозирования и их коррекция, получение трансгенных животных и воспроизведение уникальных особей путем клонирования, а в будущем, возможно, и полноценная регенерация утраченных или пораженных органов, - все это требует новых фундаментальных знаний о реализации генетической информации в развитии. Недавние успешные, но, в то же время, все еще уникальные эксперименты по клонированию (Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998) закономерно вызвали повышенный интерес к генетике развития млекопитающих.

Млекопитающие являются единственным классом позвоночных, где не наблюдается партеногенетического (т.е. протекающего без какого-либо участия мужского генома) развития. Для нормального развития млекопитающих требуется оба набора хромосом - материнский и отцовский. Механизм, регулирующий функциональные различия родительских геномов у плацентарных млекопитающих, был назван геномным импринтингом (Surani et al., 1984). Гены млекопитающих, которые наследуются от матери или отца в репрессированном состоянии, называют импринтированными. Импринтированные гены составляют примерно 0,1% генома млекопитающих, что ограничивает экспрессию примерно 100 генов на различных стадиях онтогенеза (Barlow, 1997).В отличие от большинства генов, экспрес-сирующихся в соматических диплоидных клетках биаллельно, экспрессия импринтированных генов проявляется моноаллельно: один из двух родительских аллелей (материнский или отцовский) находится в репрессиро6 ванном, или неактивном, состоянии. Многие данные показывают, что возникновение геномного импринтинга обусловлено специфическим метилированием цитозиновых оснований ДНК (Surani et al., 1990, 1993; Razin, Cedar, 1994; Feil, Khosla, 1999).

Возможность искусственной активации ооцитов млекопитающих к партеногенетическому развитию положила начало довольно многочисленным исследованиям с использованием экспериментально получаемых пар-теногенетических зародышей в качестве модельной системы для изучения эффектов геномного импринтинга в развитии млекопитающих. Первые эксперименты, по-видимому, были связаны с попыткой получения таким путем генетически идентичных особей. Исследования по искусственному партеногенезу у млекопитающих проводятся, начиная с 30-х годов (Pincus, Enzman, 1936), но только в начале 80-х годов были найдены эффективные методы активации (Дыбан, Хожай, 1980) и получения партеногенетиче-ских эмбрионов сомитных стадий (Kaufman, 1983). В настоящее время наиболее распространенным объектом в этих исследованиях являются различные лабораторные линии домовой мыши (Mus musculus) и их гибриды.

Несмотря на многие достоинства этой модельной системы, ранняя гибель партеногенетических зародышей (в большинстве случаев партеноге-нетические эмбрионы мышей гибнут вскоре после имплантации и начала органогенеза) накладывает определенные ограничения на ее использование. Вместе с тем, преодоление этих ограничений и получение более продвинутого развития партеногенетических зародышей является важнейшим подходом к изучению импринтированных генов, контролирующих определенные этапы развития и тканевой и органной дифференцировки. К методам, позволяющим получать более продвинутое развитие и повышающим процент сомитных стадий у партеногенетических эмбрионов относятся искусственная задержка имплантации (Kaufman et al., 1977), исполь7 зование деметилирующих агентов (Пенков, Платонов, 1992) и ростовых факторов (Пенков, Платонов, 1999), культивирование постимплантацион-ных эмбрионов in vitro со вскрытым желточным мешком (Penkov et al., 1995).

Для изучения потенций к развитию разных партеногенетических клеточных клонов используют химерных мышей. Химеры - организмы, состоящие из двух или более генотипически различных родительских компонентов, широко используются в генетике развития млекопитающих для определения места действия генов и их эффектов (McLaren, 1976; Конюхов и др., 1988). Химерных мышей, состоящих из партеногенетических и нормальных клеток, называют партеногенетическими химерами. Такие химеры способны развиваться до рождения и половой зрелости, причем партеногенетические клетки включаются практически во все ткани и органы, в том числе и гонады, продуцируя полноценные гаметы (Stevens et al., 1977; Surani et al., 1977; Stevens, 1978). Партеногенетические химеры мышей являются замечательной моделью для изучения эффектов геномного импринтинга не только в эмбриональном, но и в постнатальном развитии млекопитающих.

Большинство работ, связанных с использованием партеногенетических химер, приходится на конец 80-х - начало 90-х годов. На основании многочисленных экспериментальных данных было установлено, что различные этапы индивидуального развития млекопитающих требуют последовательной экспрессии генов, импринтированных по отцовской линии (такие импринты отсутствуют в геноме партеногенетических клеток). Тканевая специфичность экспрессии таких генов приводит к последовательной полной или частичной элиминации партеногенетических клеток в организме химер в процессе эмбрионального развития. 8

Несмотря на очевидную важность подобных исследований, партеноге-нетические химеры мышей в последнее время используются мало, вероятно, вследствие трудоемкости процедуры их получения, ограниченного количества клеточных маркеров и уникальности получаемого материала. Между тем, остаются невыясненными вопросы о механизме элиминации партеногенетических клеток, о пространственном распределении этих клеток в ткани, об аллельной специфичности генов, контролирующих наиболее поздние этапы тканевой дифференцировки в определенных структурах организма.

Обычно для изучения партеногенетического развития, в том числе и в экспериментах с получением химер, используют гибриды первого поколения от скрещивания мышей линий СВА и C57BL/6, поскольку диплоидные партеногенетические эмбрионы таких гибридов достаточно стабильно развиваются in vitro в доимплантационном периоде и достигают сомитных стадий после трансплантации в матку ложнобеременных самок (Kaufman et al., 1977). В то же время, использование эмбрионов мышей инбредных линий для получения партеногенетических химер в некоторых случаях является предпочтительным, так как генетическая среда может модулировать эффекты геномного импринтинга (Allen, Mooslehner, 1992; Latham, 1994; Chaillet et al., 1995; Пенков, Платонов, 1992; Penkov et al., 1996).

Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга в эмбриогенезе млекопитающих приводит к различиям в способности к развитию партеногенетических эмбрионов мышей различных лабораторных линий. Так, развитие диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей инбредных линий C57BL/6 и СВА значительно отличается: партеногенетические эмбрионы C57BL/6 в 95% случаев развиваются до стадии бластоцисты in vitro, но гибнут вскоре после имплантации в матку. В то же время партеногенетические зародыши СВА достигают стадии бластоцисты лишь в 23% случаев, но после трансплантации бластоцист в 9 матку 26% имплантировавшихся зародышей достигают сомитных стадий (Пенков, Платонов, 1992; Penkov et al., 1995, 1996). Поэтому можно ожидать, что потенции к развитию разных партеногенетических клеточных клонов этих двух инбредных линий мышей у химер могут существенно отличаться: элиминация партеногенетических клеток различного генотипа может происходить с разной интенсивностью в эмбриогенезе.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение различий в способности к развитию партеногенетических клеточных клонов линий мышей C57BL/6 и СВА в химерном организме. Исходя из намеченной цели, были поставлены следующие задачи:

1) Получение химер с использованием диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей линий C57BL/6 и СВА и нормальных эмбрионов линии BALB/c.

2) Изучение доимплантационного развития in vitro, постимплантаци-онного и постнатального развития полученных химер.

3) Анализ распределения партеногенетических клеточных клонов у полученных химер в структурах организма эктодермального, эндодер-мального и мезодермального происхождения.

10

Научная новизна

Впервые получены взрослые партеногенетические химеры с использованием двух инбредных линий мышей: С57ВЬ/6 в качестве партеногене-тического компонента и ВАЬВ/с в качестве нормального компонента химерного организма.

Впервые проведен анализ распределения партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове и партеногенетических клеточных клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаз полученных химер. Выполнен анализ распределения партеногенетических клеточных клонов в органах и тканях эктодермального, мезодермального и эндодермального происхождения.

Впервые показано, что эффекты геномного импринтинга проявляются неодинаково на клеточном уровне у партеногенетических эмбрионов мышей инбредных линий С57ВЬ/6 и СВА. Показано, что партеногенетические клеточные клоны СВА интенсивно элиминируются в раннем периоде эмбриогенеза, в то время как партеногенетические клеточные клоны С57ВЬ/6 элиминируются из тканей и органов химерных эмбрионов постепенно в течение всего эмбриогенеза, причем в основном погибают партеногенетические клетки эндодермального и мезодермального происхождения.

Практическая ценность

Партеногенетические химерные мыши, полученные с использованием контрастных по клеточным маркерам инбредных линий, могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения влияния геномного импринтинга на процессы пролиферации и дифференцировки клеточных клонов в развитии млекопитающих.

11

Апробация работы

Основные материалы работы изложены в докладе на конференции молодых ученых и аспирантов ИОГен РАН и кафедры генетики и селекции биологического факультета МГУ (17 декабря 1997 г.), представлены и опубликованы в виде тезисов на конгрессе In Vitro Biology (14 - 18 июня 1997 г., Вашингтон) и II съезде ВОГиС (1-5 февраля 2000 г., Санкт-Петербург), доложены на межлабораторном научном семинаре ИОГен РАН «Генетика животных» (28 ноября 2000 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 96 страницах и состоит из двух частей: обзора литературы и собственных исследований, включающих материал и методику, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Работа содержит 5 таблиц и 12 рисунков. Список литературы включает 136 наименований цитированных работ.

12

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Исаев, Дмитрий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Доимплантационное развитие in vitro партеногенетических химер С57BL/6(PG}<->BALB/с и CBA(PG)<->BALB/c протекает сходным образом, а их жизнеспособность достаточно высокая. Присутствие ПГКК СВА или C57BL/6 не влияет на жизнеспособность химерных эмбрионов в доимплантационном периоде развития. После трансплантации в матку ложнобеременных самок развитие партеногенетических химер С57BL/6(PG)<->B ALB/c и CBA(PG)oB ALB/c существенно различается: химеры C57BL/6(PG)<-»BALB/c способны развиваться до рождения и половой зрелости, а химеры CBA(PG)o-BALB/c погибают в раннем постим-лантационном периоде развития.

2. Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга приводит к существенным различиям в способности к развитию в составе химерного организма ПГКК мышей инбредных линий C57BL/6 и СВА. Элиминация ПГКК C57BL/6 происходит постепенно в течение всего эмбриогенеза, причем в основном погибают ПГКК эндодермального и мезодер-мального происхождения, поэтому у взрослых химер C57BL/6(PG)oBALB/c сохраняются ПГКК преимущественно эктодер-мального происхождения. ПГКК СВА эндодермального, мезодермального и эктодермального происхождения подвергаются интенсивной элиминации на ранних этапах эмбриогенеза, что является причиной гибели химерных зародышей CBA(PG)-<-»BALB/c с большим вкладом партеногенетиче-ского компонента, а у живых зародышей с изначально низким вкладом ПГКК СВА происходит их полная элиминация.

3. Отсутствие пигментации глаз у 14- и 18-суточных химерных эмбрионов C57BL/6(PG)-o-BALB/c может быть обусловлено запаздыванием диффе-ренцировки ПГКК и/или более поздней экспрессией в них ответственных за пигментацию генов.

78

4. Характерный паттерн пятнистости шерстного покрова партеногенетиче-ских химер С57ВЬ/6(РО)<->ВАЬВ/с обусловлен пониженной скоростью пролиферации и миграции ПГКМ и возможной клеточной гибелью. Сходство паттернов пятнистости шерстного покрова партеногенетических химер с фенотипическими проявлениями мутаций, нарушающих процессы пролиферации, миграции и дифференцировки меланобластов, указывает, что эти процессы находятся под контролем импринтированных генов.

5. Асимметрия в распределении ГТГКК эктодермального происхождения у взрослых химер С57ВЬ/6(РО)<-^ВАЬВ/с является, очевидно, результатом случайной клеточной гибели. Однако, высокая степень соответствия между долей вклада ПГКК в ретинальном пигментном эпителии правого или левого глаза и в шерстном покрове соответствующей половины тела химеры указывает на существование взаимосвязи между процессами, приводящими к такому распределению эктодермальных ПГКК.

3. Заключение

Клональный анализ формирующихся тканей партено- и андрогенети-ческих химерных мышей показал различную роль экспрессирующихся аллелей импринтированных локусов материнского и отцовского геномов в развитии как самого зародыша, так и его внезародышевых оболочек. Если экспрессия аллелей импринтированных локусов материнских хромосом играет важную роль в развитии тканей и органов самого зародыша, то экспрессия аллелей импринтированных локусов отцовских хромосом имеет большое значение для формирования внезародышевых оболочек. Развитие различных клеточных клонов, возникающих из трех зародышевых листков, также находится под дифференциальным контролем экспрессирующихся аллелей импринтированных локусов материнских или отцовских хромосом. Если для развития клеточных клонов - производных мезодермы и эндодермы большое влияние оказывает экспрессия аллелей импринтированных локусов отцовских хромосом, то развитие клеточных клонов -производных эктодермы больше зависит от экспрессии аллелей других импринтированных локусов материнских хромосом (Конюхов, Исаев, 2000).

39

Для нормального развития млекопитающих требуется оба набора хромосом - материнский и отцовский. В результате дифференциальной экспрессии генов различных импринтированных локусов возникает соответствующий баланс генной активности, необходимый для нормального развития. Гибель диплоидных партеногенетических (гиногенетических) или андрогенетических зародышей млекопитающих обусловлена отсутствием экспрессии генов импринтированных локусов отцовского или материнского геномов, что приводит к возникновению дисбаланса генной активности и нарушению развития тканей и органов.

Генетическая среда может модулировать эффекты геномного имприн-тинга, что является причиной существования различий в способности к развитию диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей разных инбредных линий и их гибридов (Репкоу е! а1., 1996). Эти различия могут сохраняться и при дальнейшем развитии ПГКК различных генотипов в составе химерного организма, а их элиминация в течение эмбрионального развития может происходить с разной интенсивностью и тканевой специфичностью. Изучение партеногенетических химер, полученных с использованием диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей инбредных линий, может пролить свет на особенности проявления эффектов геномного импринтинга в различной генетической среде.

40

ЧАСТЬ II СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 1. Животные

В работе были использованы контрастные по пигментации и изофер-ментам глюкозофосфатизомеразы (далее - ГФИ) инбредные линии мышей C57BL/6fC/Ç Gpi-lbb), СВА(С/С, Gpi-lbb) и BALB/cfc/c, Gpi-Г'), а также гибридные самки (C57BL/6 х BALB/c)Fl и (СВА х BALB/c)Fl в качестве реципиентов для трансплантации эмбрионов в матку.

Большинство приведенных в данном разделе методик обращения и работы с лабораторными животными и их эмбрионами подробно описаны в учебных и методических руководствах (Hogan et al, 1986; Monk, 1987).

1.1. Анестезия, умерщвление

Все операции (вазэктомия, трансплантация эмбрионов в матку) проводились под авертиновым наркозом (Avertin), представляющим собой раствор трибромоэтанола (5 весовых частей) в третичном амиловом спирте (6 объемных частей). Приготовленный на водяной бане 2%-ный раствор авертина в физиологическом растворе инъецировали внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл на каждые 5 г веса животного.

Для получения ооцитов или выделения эмбрионов животных забивали путем смещения шейных позвонков.

1.2. Вазэктомия

Для получения у самок ложной беременности использовали вазэкто-мированных самцов, которым в возрасте 6-8 недель удаляли короткий (до 5 мм) отрезок семяпроводов (vas defferens). По прошествии нескольких недель после операции производили контрольные спаривания с самками с

РОСС rl'-'rC К А я целью подтверждения стерильности и нормальной половой активности самцов.

1.3. Суперовуляция, датировка беременности

Для получения оплодотворенных ооцитов BALB/c и неоплодотворен-ных ооцитов C57BL/6 и СВА посредством гормональной суперовуляции использовали самок в возрасте 6-8 недель. Для суперовуляции использовали препараты «Folligon» (фолликулостимулирующий гормон) и «Chorulon» (хорионический гонадотропин) (Intervet, Holland). Оба гормона вводили внутрибрюшинно: фолликулостимулирующий гормон из расчета 10 i.u. на мышь и, спустя 46 - 48 часов, хорионический гонадотропин в количестве 5 i.u.

Самок BALB/c подсаживали на ночь к самцам той же линии и утром следующего дня констатировали наличие вагинальной (копулятивной) пробки. Через 18-22 часа после инъекции второго гормона, хориониче-ского гонадотропина, самок забивали и выделяли ооциты.

Для получения ложной беременности самок (C57BL/6 х BALB/c)Fl и (СВА х BALB/c)Fl подсаживали на ночь к вазэктомированным самцам, на следующее утро проверяли наличие копулятивной пробки. День обнаружения копулятивной пробки считали первым днем беременности.

2. Получение партеногенетических химер 2.1. Инструменты для работы с эмбрионами

Техника изготовления стеклянных микрокапиллярных пипеток для манипуляций с ранними зародышами мыши подробно описана в методическом руководстве под редакцией М.Манк (Monk, 1987). Для работы с эмбрионами использовали капилляры с диаметром сопла 120 мкм, а после удаления zona, pellucida и для манипуляций с агрегированными морулами и химерными бластоцистами использовали капилляры с большим диамет

42 ром сопла (от 130 до 150 мкм) и оплавленными краями. Это позволяет избежать повреждения и прилипания лишенных блестящей оболочки эмбрионов к стенкам и краям капилляра.

2.2. Получение партеногенетических и нормальных воеьмиклеточных зародышей

Ооциты C57BL/6 и СВА активировали к партеногенетическому развитию 7% этанолом в течение 5 минут при температуре 27°С и диплоидизи-ровали при помощи цитохалазина-В в концентрации 5 мкг/мл среды в течение 6 часов при температуре 37°С (Balakier, Tarkowsky, 1976; Cuthbertson, 1983). Диплоидизированные ооциты C57BL/6 и СВА, а также зиготы BALB/c культивировали в герметично закрытых пузырьках с трех-газовой смесью (5% 02; 5% С02; 90% N2) в модифицированной среде Вит-тена (Whitten, 1971; Abramczuk et al., 1977) при температуре 37 С в течение 72 часов до стадии 8 бластомеров.

2.3. Агрегация эмбрионов и культивирование in vitro

Агрегацию партеногенетических и нормальных воеьмиклеточных эмбрионов в соотношении 1:1 производили по методу Минц (Mintz, 1971) в 0,01%) растворе фитогемагглютинина-Р (Mintz et al., 1973), предварительно удалив zonae pellucidae в 0,5% растворе проназы (1 i.u./мг) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко.

Агрегированные морулы CBA(PG)<->BALB/c и C57BL/6(PG)^BALB/c культивировали в течение 1,5 суток в каплях модифицированной среды Виттена под парафиновым маслом (Paraffin oil, «Fluka») в атмосфере трехгазовой смеси (5% 02; 5% С02; 90% N2) при 37°С, после чего химерные бластоцисты трансплантировали в матку ложнобеременных самок. Схема получения партеногенетических химер представлена на рисунке 2.

43

2.4. Трансплантация бластоцист

Химерные бластоцисты С57ВЬ/6(РО)<-^ВАЬВ/с трансплантировали в матку ложнобеременных самок (С57ВЬ/6 х ВАГВ/с)Р1, а химерные бластоцисты СВА(РО)^ВАЬВ/с в матку самок (СВА х ВАЬВ/с)Р1 на третьи сутки ложной беременности после спаривания с вазэктомированным самцом. Бластоцисты переносили только в левый рог матки в количестве 5-8 шт., правый рог матки при этом служил дополнительным контролем стерильности вазэктомированных самцов при выделении пренатальных эмбрионов. Схема операции представлена на рисунке 3.

3. Анализ распределения партеногенетических клеточных клонов

3.1. Анализ распределения партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове химер С57ВЬ/6(РС)^»ВА1ЛЗ/с

Степень химеризма по соотношению пигментированных и непигмен-тированных (белых) участков шерстного покрова определяли у трехмесячных мышей при помощи сетки с размером ячейки 4x4 мм. На рисованные контуры мыши со спинной и брюшной стороны наносили изображения пигментированных участков и определяли их площадь в условных единицах. Спинной и брюшной контуры были разделены на 4 сектора (всего - 8 секторов). Разделение на переднюю и заднюю половины производилось в зоне, расположенной между поясничным отделом и нижней границей ребер, а на правую и левую половины - по оси тела. Для выявления паттерна распределения партеногенетических клонов меланобластов (далее - ПГКМ) вместо контура использовали шаблон (рис. 4), на котором картировали пигментированные участки с учетом масштаба.

Рис. 2. Схема получения партеногенетических химерных мышей.

46

Как указывала Мак-Ларен (McLaren, 1976), число пигментированных участков шерстного покрова может не соответствовать числу пигментированных клонов меланоцитов у химер. Поэтому следует иметь в виду, что соотношение площадей пигментированных и непигментированных участков шерстного покрова у полученных нами партеногенетических химер лишь отражает соотношение партеногенетических и нормальных клонов меланобластов. В то же время, характер расположения пигментированных участков указывает на особенности процессов гибели, пролиферации и миграции ПГКМ.

3.2. Анализ распределения партеногенетических клеточных клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаза

Распределение ПГКК в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаз партеногенетических химер C57BL/6(PG)^>BALB/c изучали на серийных гистологических парафиновых срезах по методике, описанной в работах (Куприянов, Конюхов, 1984; Малинина, Марчук, 1991). Химерных животных забивали в возрасте 6 месяцев путем смещения шейных позвонков. Фиксацию глаз производили в жидкости Буэна. Хрусталик удаляли перед заключением глаза в парафин. Сагиттальные срезы через глаз толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Процент присутствия партеногенетических клонов в РПЭ и СО определяли путем расчета соотношения измеренных курвиметром длин пигментированных участков к общей длине соответствующей структуры на каждом пятом срезе. Для облегчения процедуры подсчета использовали гистологический проектор «Визапан» («Reichert», Австрия), измерения длин курвиметром осуществляли непосредственно на проекциях срезов. Вместе с тем, отмечали присутствие пигментированных участков по отношению к зрительному нерву, условно разделив глазную чашу на периферическую, среднюю и центральную области (рис.5).

47

Рис. 5. Схема центрального сагиттального среза глаза. I - периферическая область глазной чаши; II - средняя область; III - центральная область глазной чаши, прилежащая к зрительному нерву.

3.3. Электрофоретический анализ изоферментов глюкозофосфатизомеразы

Для электрофоретического анализа изоферментов ГФИ были выбраны следующие органы: головной мозг (правая и левая половины), почки (правая и левая) и печень, так как было интересно исследовать вклад ПГКК в органах эктодермального, мезодермального и эндодермального происхождения. Электрофоретический анализ проводили в 12% крахмальном геле (DeLorenzo, Ruddle, 1969), количественную оценку соотношения клеточных клонов производили по методу двойных разведений (Klebe, 1975).

Для электрофоретического анализа органов 14- и 18-суточных эмбрионов использовали ацетат-целлюлозные пластинки, поскольку этот подход позволяет работать с микрообъемами вносимых проб (Brown et al., 1990). После проведения фореза и окрашивания ацетат-целлюлозные пластинки фиксировали в 5% растворе уксусной кислоты и высушивали. Полученную таким образом электрофореграмму разрезали на полоски шириной 5мм и помещали в кварцевую кювету, заполненную минеральным маслом. Ска

48 нирование электрофореграмм проводили на денситометрической приставке спектрофотометра «Gilford» при длине волны 560 нм. На полученные денситограммы накладывали кальку и очерчивали контуры пиков оптической плотности. Полученные на кальке контуры пиков вырезали и взвешивали на торсионных весах. Расчет соотношения клонов производили по формуле: В р =-х 100%, где

F А + В процент присутствия ПГКК в исследуемом образце, вес вырезанного контура пика, соответствующего изоферменту GPI-1В (маркер партеногенетического компонента), вес контура пика изофермента GPI-1A (маркер BALB/c).

3.4. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных при помощи теста Уилкоксона и непараметрический корреляционный анализ Спирмена были выполнены с использованием компьютерной программы «STATISTICA for Windows 5.1» (StatSoft, Inc., 1996).

P " B

A

49

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Постнатальное развитие иартеногеиетических химер

Данные о получении партеногенетических химер С5 7ВЬ/6(РО)<->ВАЬВ/с и СВА(РО)оВАЬВ/с и их развитии от агрегации до рождения приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаев, Дмитрий Александрович, Москва

1. Астауров Б. Л. Искусственный партеногенез у тутового шелкопряда. М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1940. 240 с.

2. Астауров А. П., Демин Ю. С. Партеногенез у птиц // Онтогенез. 1972. Т. 3. №2. С. 123 143.

3. Баранов В. С. Хромосомный импринтинг и межхромосомные взаимодействия в раннем развитии млекопитающих // Успехи современной биологии. 1988. Т. 105. № 3. С. 393 405.

4. Белоусов Л. В. Основы общей эмбриологии. М.: Изд-во Моск. Ун-та. 1993. 304 с.

5. Дыбан А. П. Реализация генетической программы раннего развития млекопитающих: аллокация клеток, их взаимодействия и коммитиро-вание / Проблемы биологии развития: Механизмы детерминации.- М.: Наука. 1990. С. 42 65.

6. Дыбан А. П., Нониашвили Е. М. Партеногенез млекопитающих // Онтогенез. 1986. Т. 17. № 4. С. 368 388.

7. Дыбан А. П., Хожай Л. И. Партеногенетическое развитие овулировав-ших мышиных яйцеклеток под влиянием этилового спирта // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1980. Т. 139. С. 487 489.

8. Исаев Д. А., Платонов Е. С., Конюхов Б. В. Распределение партеноге-нетических клонов эпидермальных меланобластов у химерных мышей C57BL/6(PG)<-»BALB/c // Онтогенез. 1997. Т. 28. № 4. С. 306 313.80

9. Исаев Д. А., Миронова О. В., Платонов Е. С., Конюхов Б. В. Анализ партеногенетических клеточных клонов у химерных мышей C57BL/6(PG)<->BALB/c // Онтогенез. 1999. Т. 30. № 1. С. 64 70.

10. Киндяков Б. Н., Конюхов Б. В., Малинина Н. А. Изучение экспрессии мутантных генов у агрегационных химер мыши. 1. Ген white II Онтогенез. 1984. Т. 15. № 2. С. 153 162.

11. Конюхов Б. В. Межвидовые химеры млекопитающих // Онтогенез. 1985. Т. 16. №3. С. 242-246.

12. Конюхов Б. В. Клональный анализ онтогенеза млекопитающих // Успехи современной биологии. 1989. Т. 107. С. 274 288.

13. Конюхов Б. В., Куприянов С. Д., Исабеков Б. С. Использование химерных и трансгенных животных для изучения экспресии генов в онтогенезе / Успехи современной генетики. М.: Наука. 1988. С. 106 -142.

14. Конюхов Б. В., Малинина Н. А., Сажина М. В. Экспрессия мутантного гена mi у мыши: паттерн белой пятнистости // Генетика. 1996. Т. 32. №11. С. 1521-1527.

15. Конюхов Б. В., Исаев Д. А. Использование химерных мышей для изучения эффектов геномного импринтинга // Онтогенез. 2000. Т. 31. №5. С. 302 308.

16. Куприянов С. Д., Конюхов Б. В. Изучение экспрессии мутантных генов у агрегационных химер мыши. 2. Ген dominant cataract-Fr // Онтогенез. 1984. Т. 15. №4. С. 348 355.

17. Малинина Н. А., Марчук Е. Г. Анализ распределения клонов клеток в ретинальном пигментном эпителии у химерных мышей // Изв. АН СССР, Сер. биол. 1991. №2. С. 165 168.

18. Неганова И. Э., Секирина Г. Г. «Двухклеточный блок» и жизнеспособность зародышей мышей линии BALB/c при эксплантации на втором клеточном цикле дробления // Онтогенез. 1996. Т. 27. №5. С. 371-378.81

19. Пенков Л. И. Влияние деметилирования ДНК на экспрессию генов ло-куса Gpi-1 и развитие партеногенетических зародышей мышей / Дисс. канд. биол. наук. М. 1992. 128 с.

20. Пенков Л. П., Платонов Е. С. Изучение развития диплоидных партеногенетических зародышей мышей инбредных линий C57BL/6 и СВА // Онтогенез. 1992. Т. 23. №4. С. 364 369.

21. Пенков Л.И., Платонов Е.С. Влияние факторов роста фибробластов (ФРФ-2, ФРФ-4) на развитие партеногенетических эмбрионов мышей // Онтогенез. 1999. Т.30. №6. С. 448 452.

22. Секирина Г. Г., НегановаИ.Э. Преодоление «двухклеточного блока» зародышей мышей в агрегационных химерах // Онтогенез. 1996. Т. 27. №5. С. 361-370.

23. Хадорн Э., Венер Р. Общая зоология. Пер. с нем. М.: Мир. 1989. 528 с.

24. Abramczuk J., Solter D., Koprowski H. The beneficial effect of EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically defined medium // Develop. Biol. 1977. V. 61. P. 378-383.

25. Allen N. D., Norris M. L., Surani M. A. Epigenetic control of transgene expression and imprinting by genotype-specific modifiers // Cell. 1990. V. 61. P. 853 861.

26. Allen N. D., Mooslehner K. A. Imprinting, transgene methylation and genotype-specific modification // Semin. Dev. Biol. 1992. V. 3. P. 87 98.

27. Allen N. D., Barton S. C., Hilton K. et al. A functional analysis of imprinting in parthenogenetic embryonic stem cells // Development. 1994. V. 120. P. 1473 1482.

28. Allen N.D., Logan K., Lally G. et al. Distribution of parthenogenetic cells in the mouse brain and their influence on brain development and behavior // Proc. Natl. Acad. Sci. USA : Developmental Biology. 1995. V. 92. P. 10782 -10786.82

29. Austin C. R., Braden A. W. H. Induction andinhibition of the second polar division in the rat eggs and subsequent fertilisation // Aust. J. Biol. Sci. 1954. V. 7. P. 195-210.

30. Babinet C., Richoux V., Guenet J-L.,, Renard J-P. The DDK inbred strain as a model for the study of intersection between parental genomes and egg cytoplasm in mouse preimplantation development // Development Suppl. 1990. P. 81-88.

31. Balakier H., Tarkowsky A. K. Diploid parthenogenetic mouse embryos produced by heat shock and cytochalasin B // J. Embryol. exp. Morph. 1976. V. 35. P. 25-39.

32. Barlow D. P. Gametic imprinting in mammals // Science. 1995. V. 270. P. 1610- 1613.

33. Barlow D. P. Competition a common motif for the imprinting mechanism // The EMBO Journal. 1997. Y. 16. №52. P. 6899 - 6905.

34. Bartolomei M. S., Tilghman S. M. Parental imprinting of mouse chromosome 7 // Semin. Dev. Biol. 1992. V. 3. P. 107 117.

35. Barton S. C., Ferguson-Smith A. C., Fundele R., Surani M. A. Influence of paternaly imprinted genes on development // Development. 1991. V. 113. P. 679- 688.

36. Beatty R.A. Partenogenesis and polyploidy in mammalian development. London: Cambridge Univ. Press. 1957. 210 p.

37. Beechey C. V., Cattanach B. M. Genetic imprinting map // Mouse Genome. 1996. V. 94. P. 96-99.

38. Boediono A., Suzuki T., Li L. Y., Godke R. A. Offspring born from chimeras reconstructed from parthenogenetic and in vitro fertilized bovine embryos // Mol. Reprod. Dev. 1999. V. 53. P. 159 170.

39. Boue G. J.,Boue A. Chromosomal anomalies in early spontaneous abortions // Curr. Top. Pathol. 1976. Y. 62. P. 193 208.83

40. Braden A. W. H., Austin C. R. Reactions on unfertilized mouse eggs to some experimental stimuli //Exp. Cell. Res. 1954. V. 7. P. 277 280.

41. Brown N. A., McCarthy A., Wolpert L. The development of handed asymmetry in aggregation chimeras of situs inversus mutant and wild-type mouse embryo // Development. 1990. V. 110. P. 949 954.

42. Cattanach B. M. Parental origin effects in mice // J. Embryol. Exp. Morph. 1986. V. 97. P. 137 150.

43. Cattanach B. M., Kirk M. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice // Nature, Lond. 1985. V. 315. P. 496-498.

44. Cattanach B. M., Jones J. Genetic imprinting in the mouse: implications for gene regulation // J. Inherited Metab. Dis. 1994. V. 17. P. 403 420.

45. Cedar H. DNA metilation and gene activity // Cell. 1988. V. 53. P. 3 4.

46. Chaillet J. R., Bader D. S., Leder P. Regulation of genomic imprinting by gametic and embryonic processes // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1177 1187.

47. Clarke H. J., Varmuza S., Prideaux V. R. et al. The developmental potential of parthenogenetically derived cells in chimeric mouse embryos: implications for action of imprinted genes // Development. 1988. V. 104. P. 175 -182.

48. Cooper D. W. Directed genetic change model for X-chromosome inactivation in eutherian mammals // Nature. 1971. V. 230. P. 292 294.

49. Crouse H. W. The controlling element in sex chromosome behaviour in Sciara II Genetics. 1960. V. 45. P. 1429 1443.

50. Cuthbertson K. C. R. Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and benzil alcohol // J. Exp. Zool. 1983. V. 226. P. 311-314.

51. DeChiara T. M., Robertson E. J., Efstratiadis A. Parental imprintind of the insuline-like growth factor II gene // Cell. 1991. V. 64. P. 849 859.84

52. De-Groot N., Hockberg A. Gene imprinting during placental and embryonic development // Molecular reproduction and development. 1993. V. 36. P. 390-406.

53. DeLorenzo R. J., Ruddle F. H. Genetic control of two electrophoretic variants of glucose phosphate isomerase in the mouse (Mus musculus) II Bio-chem. Genet. 1969. V. 3. № 2. P. 151 162.

54. Eppig J. J. Development potential of LT/Sv parthenotes derived from oocytes matured in vivo and in vitro II Develop. Biol. 1978. V. 65. P. 244 249.

55. Feil R., Khosla S. Genomic imprinting in mammals: an interplay between chromatin and DNA methylation? // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 431 435.

56. Forejt J., Gregorova S. Genetic analysis of genomic imprinting: An im-printor-1 gene controls inactivation of the paternal copy of the mouse Tme locus 11 Cell. 1992, V. 70. P. 443 450.

57. Fundele R., Norris M.L., Barton S.C. et al. Systematic elimination of par-thenogenetic cells in mouse chimaeras // Development. 1989. V. 106. P. 20 35.

58. Fundele R.H., Norris M.L., Barton S.C. et al. Temporal and spatial selection against parthenogenetic cells during development of fetal chimeras // Development. 1990. V. 108. P. 203 211.

59. Fundele R., Howlett S. K., Kothary R. et al. Developmental potential of parthenogenetic cells: role of genotipe-specific modifiers // Development. 1991. V. 113. P. 941 -946.

60. Gardner R. L. Mouse chimaeras obtained by the injection of cells into the blastocyst // Nature. 1968. V. 220. P. 596 597.85

61. Gearhart J. D., Mintz B. Glucosephosphate isomerase subunit-reassociation tests for maternal-fetal and fetal-fetal cell fusion in the mouse placenta // Dev. Biol. 1972. V. 29. P. 55 64.

62. Graham G. F. The production of parthenogenetic mammalian embryos and their use in biological research // Biol. Rev. 1974. V. 49. P. 399 422.

63. Hogan B., Costantini F., Lacy E. Manipulating the mouse embryo: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 1986. 332 p.

64. Hoppe P. C., Ilmensee K. Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei into fertilized mouse eggs // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. № 6. P. 1912 1916.

65. John R. M., Surani M. A. Imprinted genes and regulation of gene expression by epigenetic inheritance // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. V. 8. P. 348 -353.

66. Kaufman M. H., Barton S. C., Surani M. A. H. Normal postimplantation development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage // Nature. 1977. V. 265. P. 53 55.

67. Kaufman M. H. Parthenogenesis: a system facilitating understanding of factor that influence early mammalian development / Progress in Anatomy. Eds. Harrison R.J., Holmes R.L. Cambridge Univ. Press. 1981. V. 1. P. 1 -34.

68. Kaufman M. H. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryos following activation by ethanol treatment // J. Embryol. Exp. Morphol. 1982. V. 71. P. 139 154.86

69. Kaufman M. H. Early mammalian development:parthenogenetic studies. Cambridge Univ. Press, Cambridge London. 1983. P. 1 - 259.

70. Kaufman M. H., Evans M. J., Robertson E. J., Bradly A. Influence of injected pluripotential (EK) cells on haploidand diploid parthenogenetic development//J. Embryol. Exp. Morphol. 1984. V. 80. P. 75 86.

71. Klebe R. J. A simple method for the quantitation of isozyme patterns // Biochem. Genet. 1975. V. 13. № 11/12. P. 805 812.

72. Konyukhov B. V., Kindyakov B. N., Malinina N. A. Effects of the white allele of the mi locus on coat pigmentation in chimeric mice // Genet. Res. 1994. V. 63. P. 175-181.

73. Lalande M. Parental imprinting and human disease // Annu. Rev. Genet. 1996. V. 30. P. 173 95.

74. Latham K. E. Strain-specific differences in mouse oocytes and their contributions to epigenetic inheritance // Development. 1994. V. 120. P. 3419 3426.

75. Latham K.E., Solter D. Effect of egg composition on the development capacity of androgenetic mouse embryos // Development. 1991. V. 113. P. 561 568.

76. Latham K. E., McGrath J., Solter D. Mechanistic and developmental aspects of genetic imprinting in mammals // Internat. Rev. Cytol. 1995. V. 160. P. 53-98.

77. Leighton P. A., Saam J. R., Ingram R. S., Tilghman S. M. Genomic imprinting in mice its function and mechanism // Biol. Reprod. 1996. V. 54. P. 273 - 278.

78. Lyon M. F. Chromosome condensation in relation to genetic activity // Organization and expression of chromosomes: Dahlem Conf. 1976. V. 4. P. 131 140.87

79. Lyon M. F., Glenister Ph. Factors affecting the observed resulting from adjacent-2 disjounction in mice, carrying a translocation // Genet. Res. 1977. V. 29. P. 83 92.

80. Mann J. R., Lovell-Badge R. H. Inviability of parthenogenones is determined by pronuclei, not egg cytoplasm // Nature. 1984. V. 310. P. 66- 67.

81. Mann J. R., Stewart C. L. Development to term of mouse androgenetic aggregation chimeras//Development. 1991. V. 113. P. 1325 1333.

82. Markert C. L. Genetic control of cell interactions in chimeras // Develop. Genet. 1984. V. 4. P. 267 279.

83. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in mouse embryos // J. Exp. Zool. 1983. V. 228. P. 355 362.

84. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes // Cell. 1984. V. 7. P. 179-183.

85. McLaren A. Mammalian chimaeras. L.: Cambridge Univ. Press. 1976. 154 p.

86. McLaren A. Germ cell and soma: A new look at an old problem. New Haven, L.: Yale Univ. Press. 1981. 140 p.

87. Mintz B. Experimental study of the developing mammalian egg: removal of the zonapellucidaH Science. 1962. V. 138. P. 594 595.

88. Mintz B. Allophenic mice of multi-embryo origin // Methods in mammalian embryology / Ed. Deniel J. C. SanFrancisco: Freeman. 1971. P. 186-214.

89. Mintz B., Baker W. W. Normal mammalian muscle differentiation and gene control of isocitrate dehydrogenase synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 592 598.

90. Mintz B., Gearhart J. D.,Guymont A. O. Phytohemagglutinin mediated blastomere aggregation and development of allophenic mice // Develop. Biol. 1973. V. 31. P. 195 -199.88

91. Monk M. Development in mammals. Amsterdam: North-Holland Publ. Co. 1978. 189 p.

92. Monk M. Mammalian development: A practical approach / IRL Press. 1987. 406 p.

93. Moore W.J., Mintz B. Clonal model of vertebral column and skull development derived from genetically mosaic skeletons in allophenic mice // Dev. Biol. 1972. V. 27. P. 55 70.

94. Morison I. M., Reeve A. E. A catalogue of imprinted genes and parent-of-origin effects in humans and animals // Hum. Mol. Genet. 1998. V. 7. P. 1599 1609.

95. Nagy A., Paldi A., Dezso L. et al. Prenatal fate of parthenogenetic cells in mouse aggregation chimaeras // Development. 1987. V. 101. 67 71.

96. Nagy A., Sass M., Markkula M. Systematic non-uniform distribution of parthenogenetic cells in adult mouse chimaeras // Development. 1989. V. 106. P. 321 324.

97. Nicholls R. D., Saitoh S., Horsthemke B. Imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes // Trends Genet. 1998. V. 14. P. 194 200.

98. Park J-I., Yoshida I., Tada T. et al. Differentiative potential of a mouse parthenogenetic embryonic stem cell line revealed by embryoid body formation in vitro // Jpn. J. Vet. Res. 1998. V. 46. P. 19 28.

99. Penkov L. I., Platonov E. S., New D. A. T. Prolonged development of normal and parthenogenetic postimplantation mouse embryos in vitro // Int. J. Dev. Biol. 1995. V. 39. P. 985 991.89

100. Penkov L. I., Platonov E. S., Mironova О. V. et al. Effect of 5-azacytidine on the development of parthenogenetic mouse embryos // Develop. Growth Differ. 1996. V. 38. P. 263 270.

101. Pincus G., Enzman E. V. The comparative behavior of mammalian eggs in vitro and in vivo. 2. The activation of the tubal eggs of the rabbit // J. Exp. Zool. 1936. V. 73. P. 195 208.

102. Razin A., Cedar H. DNA methylation and genomic imprinting // Cell. 1994. V. 77. P. 473 476.

103. Q1 .Reik W., Romer I., Barton S C. et al. Adult phenotypes in the mouse can be affected by epigenetic events in the early embryo // Development. V. 119. P. 933 -942.

104. Sapienza C., Peterson A. C., Rossant J. et al. Degree of methylation of transgenes is dependent on gamete of origin. // Nature. 1987. V. 328. P. 251 254.

105. Sanyal S., Zeilmaker G. H. Cell lineage in retinal development of mice studied in experimental chimaeras //Nature. 1977. V. 265 . P. 731 733.

106. Stevens L. C. Totipotent cells of parthenogenetic origin in a chimaeric mouse // Nature. 1978. V. 276. P. 266 267.

107. Stevens L. C., Varnum D. S. The development of teratomas from partenogeneticaly activated ovarian mouse eggs // Develop. Biol. 1974. V. 37. P. 369 380.

108. Stevens L. C., Varnum D. S., Eicher E. M. Viable chimaeras produced from normal and parthenogenetic mouse embryos // Nature. 1977. V. 269. P. 515 517.90

109. Strain L., Warner J. P., Johnston T. et al. A human parthenogenetic chi-maera//Nature. 1995. V. 11. P. 164 169.

110. Surani M. A. H., Barton S. C., Kaufman M. H. Development to term of chimaeras between diploid parthenogenetic and fertilised embryos // Nature. 1977. V. 270. P. 601 603.

111. Surani M. A., Barton S. C. Development of gynogenetic eggs in the mouse: implications for parthenogenetic embryos // Science. 1983. V. 222. P. 1034 1036.

112. Surani M. A. H., Barton S. C., Norris M. L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis // Nature. 1984. V. 308. P. 548 550.

113. Surani M. A. H., Barton S. C, Norris M. L. Nuclear transplantation in the mouse: heritable differences between parental genomes after activation of the embryonic genome // Cell. 1986. V. 45. P. 127 136.

114. Surani M. A. H., Allen N. I)., Barton S. C. et al. Developmental consequenses of imprinting of parental chromosomes by DNA metilation / Royal Society Meeting on DNA Metilation and Gene Regulation. 1989. P. 1 -46.

115. Surani M. A., Kothary R., Allen N. D. et al. Genome imprinting and development in the mouse // Development. 1990. V. 110 Suppl. P. 89 98.91

116. Surani M. A. H., Sasaki H., Ferguson-Smith A. G. et al. The inheritance of germline-specific epigenetic modifications during development // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1993. V. 339. P. 165 172.

117. Tarkowski A. K. Mouse chimaeras developed from fused eggs // Nature. 1961. V. 190. P. 857 860.

118. Tarkowski A. K., Wroblewska A., Nowicka J. Experimental parthenogesis in the mouse // Nature. 1970. V. 226. P. 162 165.127 .Tarkowski A. K. Recent studies on parthenogenesis in the mouse // J. Re-prod. Fert. Suppl. 1971. V. 14. P. 31 -39.

119. Thomson J. A., Solter D. The developmental fate of androgenetic, parthe-nogenetic, and gynogenetic cells in chimeric gastrulating mouse embryos // Genes & Development. 1988. V. 2. P. 1344 1351.

120. Tilghman S. M. The sins of the fathers and mothers: genomic imprinting in mammalian development // Cell. 1999. V. 96. P. 185 193.

121. Wakayama T., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K. R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei //Nature. 1998. V. 394. P. 369 -374.

122. West J.D. A theoretical approach to the relation between patch size and clone size in chimaeric tissue // J. Theor. Biol. 1975. V. 50. V. 153 160.

123. Whitten W. K. Nutrient requirements for the culture ofpreimplantation embryos in vitro II Adv. Biosci. 1971. V. 6. P. 129-141.92

124. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J., Kind A. J., Campbell K. H. S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. V. 385. P. 810-813.

125. Yoshida H., Kunisada T., Kusakabe M, Nishikawa S., Nishikawa S.-I. Distinct stages of melanocyte differentiation revealed by analysis of nonuniform pigmentation patterns // Development. 1996. V. 122. P. 1207-1214.95