Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей

Зайцева, Юлия Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей"

На правах рукописи

003452456

Зайцева Юлия Анатольевна

ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ЭНУКЛЕАЦИЯ ООЦИТОВ КРЫС. ПРОЦЕССЫ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК У РАННИХ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ КРЫС И МЫШЕЙ

03.00.25

Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

7 3 ноя 20.

Санкт-Петербург 2008

003452456

Работа выполнена в Центре молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка (Берлин) и в Институте цитологии Российской акдемии наук (Санкт-Петербург)

Научные руководители: кандидат биологических наук

Кривохарченко Александр Сергеевич

Центр молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка

(Берлин)

доктор биологических наук, профессор Парфёнов Владимир Николаевич Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук

Александрова Светлана Алексеевна Институт цитологии РАН

доктор медицинских наук, профессор Дыбан Павел Андреевич ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте

цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 с^сР.

e-mail: cellbio@mail cvtspb rssi ru сайт: http://www.cvtspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 2008 i

Ученый секретарь

диссертационного совета ¿>.

кандидат биологических наук ^^ТЧ^*^ Е.В.Каминская

^ )

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из форм полового размножения является партеногенез. У некоторых организмов естественный партеногенез — нормальный способ размножения в природе У других организмов партеногенез вызывается экспериментально действием разных факторов на неоплодотворённую яйцеклетку, причём факторы, активирующие ооцит, в основном видоспецифичны. Лучшим критерием успешной активации ооцитов является способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному и постимплантационному развитию Как известно, активация ооцита-реципиента является важнейшим этапом клонирования млекопитающих. Ко времени проведения данного исследования попытки получить предимплантационное развитие до стадии бластоцисты у активированных ооцитов крыс оказались неудачными, развитие партеногенетического эмбриона останавливалось на 4-клеточной стадии (Zernicka-Goetz, 1991). На данный момент зафиксирован единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003), повторить успех французских ученых пока никому не удалось

Другой важный этап процедуры клонирования — энуклеация ооцита-реципиента. Механическая энуклеация обычно сопряжена с высоким повреждающим воздействием. Альтернативой механической энуклеации может быть химическая энуклеация веществами, надежно блокирующими генетический материал клетки. Одним из них является этопозид -ингибитор ДНК-топоизомеразы 2, которая ответственна за скручивание и разделение цепей ДНК. Одной из задач работы было изучение возможности применения этопозида для химической энуклеациии ооцитов крыс

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии (Reik, Dean, 2001) Проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, низкая эффективность клонирования, сложности партеногенетического развития хорошо коррелируют с ненормальным рисунком метилирования генома. Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих могут служить маркером дефектного развития эмбриона. В настоящее время имеются работы по изучению динамики деметилирования генома мыши, однако приводимые в них данные сильно различаются (Mayer et al, 2000, Santos et al., 2002). Для крыс такие данные вообще отсутствуют. Вместе с тем, изучение процессов деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач биологии развития. Цель исследования. Цель работы заключалась в подборе оптимальных параметров активации ооцитов крыс (активирующие агенты, время воздействия) и получении жизнеспособных партеногенетических эмбрионов, в изучении возможности химической

энуклеации ооцитов крыс с последующей пересадкой в них ядер соматических клеток и в исследовании динамики деметилирования ДНК зигот (крыса, мышь), развивающихся in vivo и m vitro.

Конкретные задачи исследования

1. Изучить возможность партеногенетической активации ооцитов крысы различными агентами: этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом.

2. Выяснить зависимость эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3. Исследовать способность партеногенетически активированных ооцитов к развитию in vivo и in vitro.

4. Изучить возможность химической энуклеации ооцитов крыс с помощью этопозида. Сравнить эффективность клонирования при энуклеации химическим и механическим способами.

5. Исследовать динамику деметилирования ДНК у ранних крысиных эмбрионов in vivo и in vitro, сравнить её с динамикой деметилирования у ранних эмбрионов мышей.

6. Оценить уровень метилирования ДНК у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации существенно варьирует от животного к животному и зависит от времени между инъекцией хорионического гонадотропина человека и моментом извлечения ооцитов

2. Стронций (Sr2+) является более эффективным активатором партеногенеза по сравнению с электроимпульсом и этанолом Партеногенетические эмбрионы крысы способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

3. Этопозид не оказывает влияния на партеногенетическую активацию ооцитов крыс и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. Доля 2-клеточных эмбрионов после процедуры клонирования практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

4. Деметилирование ДНК у зигот крыс и мышей происходит с разной скоростью Эмбрионы обоих видов, культивируемые m vitro, демонстрируют более высокий уровень метилирования по сравнению с развивающимися in vivo. Партеногенетические и клонированные 2-клеточные эмбрионы крысы сохраняют высокий уровень метилирования. Научная новизна работы. Впервые получены партеногенетические бластоцисты крысы после активации ооцитов этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом, а также после спонтанной активации Воздействие стронция давало бОльшую долю активированных

ооцитов, активировались ооциты всех возрастов. Установлено, что активация ооцитов зависит от промежутка времени между процедурой суперовуляции и выделением ооцитов. Более старые ооциты крысы активировались успешнее, чем молодые. Впервые показано, что у ооцитов крыс аутбредной линии Wistar имеет место индивидуальная (от крысы к крысе) реакция на партеногенетическую активацию, не зависящая от активирующего агента. Установлено, что химическая энуклеация ооцитов крысы этопозидом может успешно использоваться при клонировании. Этопозид, являясь специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, не оказывал влияния на партеногенетическую активацию ооцитов и, тем не менее, необратимо блокировал их дальнейшее развитие.

Впервые исследована динамика деметилирования генома крысы на ранних этапах предимплантационного развития. Показано, что эмбрионы крыс и мышей, культивируемые со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии в системе in vitro имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы в системе in vivo. Впервые изучен уровень метилирования у партеногенетических эмбрионов крысы вплоть до 4-клеточной стадии развития, а также уровень метилирования у 2-клеточных клонированных эмбрионов. Обнаружен высокий уровень метилирования в обеих рассматриваемых группах по сравнению с нормальными эмбрионами.

Научно-практическое значение работы. Результаты тестирования различных активирующих агентов показали, что стронций является наиболее эффективным активационным агентом ооцитов крыс, что важно для технологии клонирования. При работе с аутбредной линией Wistar выявлено индивидуальное (от крысы к крысе) варьирование результатов, не зависящее от протокола эксперимента, что необходимо учитывать при проведении эмбриологических работ. Применение химической энуклеации вместо механической может существенно снизить трудоемкость процесса клонирования крыс и повысить его эффективность Разный уровень деметилирования мужского пронуклеуса зигот у крыс и мышей в системах in vivo и in vitro может служить индикатором качества используемых культивационных сред, в том числе используемых для манипуляций с эмбрионами человека в программах экстракорпорального оплодотворения. В целом полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии для совершенствовании технологии клонирования млекопитающих, а также при изучении процессов их раннего эмбриогенеза.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены в 3 печатных работах Материалы диссертации докладывались на международных конференциях: Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association (Rolduc, Niederlande 2002). — Proc of XVII Working Meeting "Genetic Resource Conservation" (Pushchino, November 19-21, 2003).

Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение,

заключение, выводы и список цитируемой литературы (110 ссылок). Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение н культивирование ооцитов и зигот у мышей и крыс

В работе использовали инбредных мышей (СВА х C57BL/6) и аутбредных крыс Wistar и SD Суперовуляцию вызывали введением гонадотропных препаратов. Для получения зигот самок подсаживали к самцам той же линии на 1 ч при работе с мышами и на 2 ч при работе с крысами. Это позволило определить время копуляции и проследить хронологию развития эмбрионов. Эмбрионы извлекали в предварительно подогретой среде М2 в разное время после копуляции для исследования в системе in vivo, либо через 2 ч после копуляции у мышей или 3 ч у крыс для исследований в системе in vitro. Кумулюсные клетки отмывали в среде М16, содержащей 0,1 % гиалуронидазы. Эмбрионы культивировали 10 ч в среде М16, а затем в среде mRlECM (Miyoshi et al, 1997) Партеногенетическая активация ооцитов крысы

Спонтанная активация Ооциты помещали в предварительно уравновешенную среду М16 В первой группе кумулюсные клетки отмывали немедленно, а во второй спустя 7 - 8 ч. Активация электроимпульсом Ооциты 1 - 2 мин уравновешивали в среде, содержащей манитол, затем помещали в камеру для слияния с аналогичной средой Клетки ориентировали переменным полем, активация индуцировалась при помощи частотного генератора.

Химическая активация. При активации стронцием ооциты инкубировали разное время (15 мин или 2 ч) в среде М16 без кальция и магния, содержащей 2 мМ стронция в инкубаторе при температуре 37 °С и атмосфере, содержащей 5 % углекислого газа При активации этиловым спиртом ооциты инкубировали в течение 7 мин в среде М16 с 8 % содержанием этилового спирта.

Диплоидизация. Ооциты культивировали 7-8 ч в присутствии цитохалазина Б Анализ. Эффективность партеногенетической активации анализировалась через 10 - 12 ч после воздействия активирующего агента. Ооциты оценивали на инвертивном микроскопе с оптикой Номарского. Ооциты с сформировавшимся видимым пронуклеусом считали активированными.

Статистика. Достоверность различия выборочных долей оценивали с помощью критерия х2-Для сравнения средних величин применялся t-критсрий Стьюдента (количественный анализ уровня флуоресценции). Достоверным считался уровень значимости р < 0.05. Клоннрование крысиных эмбрионов

Химическая энуклеация В качестве блокатора генетического материала был использован этопозид (Etoposide, Sigma, США) в концентрации 50 мкг на 1 мл в среде М16 Для растворения этопозида использовали диметилсульфоксид. Ооциты находились в растворе этопозида 1,5, 2,5 или 6 ч. Отмывание проводили в течение 5 мин в 1 М растворе сахарозы. Механическая энуклеация. При клонировании с использованием механической энуклеации удаление генетического материала производилось с использованием микропипетки. Для этого в область грушевидного выпячивания ооцита на стадии метафазы II вводилась пипетка, метафазная пластина удалялась вместе с частью цитоплазмы. Контролем качества служило окрашивание энуклеированных эмбрионов Хехстом 33342 и кратковременное (5 с) ультрафиолетовое облучение, что позволило отбраковывать ооциты содержащие собственный генетический материал.

Введение и активация генетического материала. Кумулюсную клетку вводили микропипеткой под блестящую оболочку энуклеированного ооцита Для слияния цитоплазматических мембран кумулюсной клетки и ооцита использовали камеру для слияния и импульсный генератор (Институт инструментов для биологии, Пущино, Россия). Активация генетического материала кумулюсной клетки производилась инкубацией в среде со стронцием в течение 15-20 мин. Иммунофлуоресцентный анализ метилирования

Оплодотворенные ооциты отмывали в фосфатном буфере (PBS), фиксировали в 3,7 % растворе формальдегида 10 мин, проницаемость клеточной мембраны повышали инкубацией с Triton Х-100 в течение 20 мин при комнатной температуре. Сайты неспецифического связывания антител блокировали обработкой клеток 10 % раствором козьей сыворотки. Для получения иммуннофлуоресцентного окрашивания эмбрионы инкубировали с моноклональными антителами против 5-MeCytosme (Eurogentec), разведенными 1.150, а также с 7 едУмл Dnasel (Promega) в 10 %-ном DNase буферном растворе при 37 °С в течение 60 мин. После трехкратной отмывки в фосфатном буферном растворе клетки инкубировали 60 мин с FITC-связанными вторыми антителами (Dianova) разведенными 1:300. Ядра клеток окрашивали ДНК-связывающим красителем DAPI (4', 6-диамидин-2-фенилиндол дигидрохлорид) Слайды заключали в среду Vectashield (Serva).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Партеногенетическое развитие эмбрионов крыс

Для оптимизации протокола клонирования у крыс тестировали различные методы партеногенетической активации, такие как электроимпульс, этиловый спирт, стронций, в зависимости от возраста ооцита. Максимально ранние ооциты удалось получить через 10-12 ч после инъекции хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Была замечена вариабельность эффективности активации в зависимости от индивидуальных особенностей конкретной крысы, поэтому животных разделяли на «активные» (эффективность активации более 40 % ) и «неактивные» (эффективность активации менее 20 %). Данные, полученные в работе, представлены с учётом этого фактора. Наблюдаемую вариабельность можно объяснить генетическими различиями в аутбредной линии Wistar, влиянием материнского генома на партеногенетическую активацию ооцитов крыс. Подобное влияние материнского генома на партеногенетическую активацию прослеживается и у мышей (Marcus 1990; Ry-bouchkin et al., 1996). Генетические различия сильнее проявляются при работе с ранними ооцитами крыс. Экспериментальные данные отражены на рис. 1.

о н 100 -

X =г 90

о о 30 ->

-0 £ 60-

X га 50-

о. 30 ■

0! ■'И -

t? su-

га rf и

о4-

"активные" животные

1 "неактивные" j животные

12-14 16-18 20-22 22-24 4. после иньекции ХГЧ

Рис. 1. Доля активированных этиловым спиртом ооцитов от всех ооцитов, полученных из животного, в зависимости от времени после инъекции хорионического гонадотропина человека.

Исходя из представленных результатов можно утверждать, что индивидуальные различия от крысы к крысе менее заметны и число «активных» животных возрастает с увеличением времени после инъекции ХГЧ.

Этиловый спирт - наиболее часто используемый активирующий агент для ооцитов млекопитающих. Как видно на рис. 1, использование этилового спирта для партеногенетической активации эффективно только для старых ооцитов крыс (22-24 ч после инъекции ХГЧ). Доля «активных животных», а также эффективность формирования пронуклеуса и дробления ооцитов крыс выше у данной возрастной группы (табл. I).

Табл. 1. Индицированная этиловым спиртом нартеногенетическая активация у крыс.

Время после Чпг то «Активные» Оошгты С Сф01>М1ф0В4ВШШ1СЯ Лробяшпесн

нньекцан ХГЧ, животных /«непктп&ные» пронл к ил сом. оошгты.

ч животные, %

12-14 б 0(0 о) ; . - « - / *

100(б б) 5 (6120) 100 (6 6)

16-18 6 33 (2 6)/ 50 <16 321*.' 87 (14-16)

66 (4■!) 5 (5 90) 0 (0 5")

20-22 6 0(0'б)/ - ! *

100 (б'б) 4 (4'13б) 0(0 4)

22-24 24 62 (15 241 ' 73 (255'34?)* - 94(107 113)/

37 (.9 24) П9-2о5) 47 (0.'19>

* Отсутствие «активных» животных Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р<0 05) а-б В скобках — абсолютные значения

Стимуляция электроимпульсом также эффективна для партеногенетической активации ооцитов крыс (табл. 2) У молодых ооцитов (12-14 ч после инъекции ХГЧ) доля ооцитов с сформировавшимся пронуклеусом и доля дробящихся ооцитов существенно выше по сравнению со стимуляцией этиловым спиртом той же возрастной группы.

Табл. 2. Электроактивация ооцитов крыс.

Время после инъекцпв ХГЧ, ч Чясло 4.ПВОТНЫХ «Активные» / «неаьтввные» животные, •Л Ооцпты с сформировавшимся пронук1е}соз|, «л Лроояшиеся оопиты. и

12-14 6 50 (3 'б) 50 (З'б) 44 (34'76)4' 20(16-70) 38(13 34) 31 (5'16}

16-18 7 71(5-71 -28 (2 7) 71 (97'13б)", 0 (0 57) 62(61-69) *

20-22 13 61 (8 1.П ' ЗБ (5 13) 77 (147'189)/ 4(0 131} 66 (85 128).' 100 (6 6)

* Отсутс типе активированных ооцитов В скобках — абсолютные значения Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р <0 05) а - б

В проведённых экспериментах партеногенетическую активацию очень эффективно вызывало культивирование крысиных ооцитов в среде, содержащей ионы стронция (2 мМ 8г 2+). Как видно на табл 3, кратковременное воздействие ионами стронция (15 мин) оказалось вполне достаточным для партеногенетической активации ооцитов крыс. Количество «активных»

животных в группе, соответствующей 16-18 ч после инъекции ХГЧ, было значительно ниже, чем у более старых ооцитов. Доля ооцитов с сформировавшимся пронуклеусом и доля дробящихся ооцитов была практически одинакова у всех возрастных групп

Табл. 3. Активация эмбрионов крысы 15-минутпой обработкой ионами стронция.

Время после нньекони ХГЧ, ч Числе Л.ПВОТНЫ1 «Активные* / ^неактивные» лнвотные, »0 Оышты с сформировавшимся п|>овукле)соч, о.» Дробящиеся ооциты. И

16-18 6 33(2,6)/ бб (4 6) 85 (41-48) ' 15(14 89) 92 (38'41)' 100(14'14)

20-22 5 80 (4/5) ' 20(1-5) 81(77/95)/ 0(0 11) 85 (бб'7Т) / *

22-24 5 100 (5'5)-0 <0 5) 84 (8Р'Ч05)/ 94 (84'89) /

Отсутствие активированных ооцитов # Отсутствие «неактивных» животных. В скобках — абсолютные значения

Повышение времени инкубации с 15 мин до 2 ч не приводило к существенным изменениям в эффективности формирования пронуклеуса и дробления, доля «активных» животных росла вместе с увеличением времени после инъекции ХГЧ (табл. 4).

Табл. 4. Активация крысиных эмбрионов 2-часовой обработкой стронцием.

Бречя г осле ккъехвви ХГЧ, ч Чнело лн&втных «Актив вые» 1 »-неактивные» лкввтяые. И Оовнти с сф орчкров а* шнм ея проязклегсоч, И Дробящиеся с-ош!ты. «4

12-14 53 35 £№53)/ 64 (34-'53) 89 (501/559)/ 8(85/971) 93 (266'284)/ 75 (64/68)

16-18 37 75 (28/37)/ 24 (9'37) 90 {858.947)/ 0(21.-226) 89(457/510)/ 85 (18.-21)

20-22 23 95 (22/23)' 4(1/23) 88(691,781)/ 5 (1/20) 87 (395 450)/ 0(01)

Крысиные ооциты подвержены спонтанной активации с формированием пронуклеуса и делением без какой-либо обработки и без применения гиалорунидазы (табл. 5). Способность к формированию пронуклеуса и эффективность активации зависит от возраста ооцита.

Спонтанная активация возможна у ооцитов начиная с 22-24-го ч после инекции ХГЧ и максимальна у очень старых ооцитов 25-27 ч. Тем не менее, остается неизвестным фактор, вызывающий спонтанную активацию. У мышей триггером является гиалуронидаза (Kaufman 1973; O'Neill and Kaufman 1998, Ilenery and Kaufman 1993) В проведенных экспериментах старые ооциты были изолированы без участия гиалуронидазы и, тем не менее, спонтанно активировались. Этот эффект может вызвать охлаждение ооцитов во время извлечения из яйцевода (Jiang et al., 2002).

Табл. 5. Спонтанная активация крысиных ооцитов.

Вр«чя после ХГЧ Число Оошггы с Дрсбяшсагя озшеты.

19ВЪ«КПШ^ Л ИВОТВЫХ »'Яеактсе&ные» сформировавшимся »-«

ч лияогяьзе, •* npcejK.iej toM^

12-14 27 0(0 27)' * / * ''

100(27*27) 2 (7.351) 14(17)

16-1S 12 010 12)" - *

100(12/12) S (1? 209} 52(9 17}

20-22 б 0 (0 б) - * , >

100(6,6) 1 (1,93} 100(1-1)

22-24 19 15 (3 19); 40(27,67)-' 77 <21'27;.'

84(16,19) 4 (16 394) S7 (14i6)

25-27 с гнзлу- 11 54(611). 56 (Ш'232). S7(41 47),

роншшей 45(5-11) 14 (37 252) 56(21 37)

25-27 без 9 33 (3?),' 65(112'! 70)/ 01 (22 24).

гпзлуронндззы 66(69} 10 (2S-277) 67 (10-28)

* Отсутствие активированных ооцитов

Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р <0 05)

Этиловый спирт, электроимпульс, стронций, активируют ооциты крыс, однако развитие эмбриона без диплоидизации останавливается на 2-клеточной стадии (Jiang et al., 2002). Проблема преодолевается использованием цитохалазина Б, который подавляет выделение второго полярного тельца, и в результате получается зигота с двумя пронуклеусами (Liu et al, 1998). Впервые, после партеногенетической активации и диплоидизации при помощи цитохалазина Б, были получены партеногенетические бластоцисты крысы (табл. 6). Не наблюдалось значительной разницы в дроблении и формировании бластоцист между экспериментальными и контрольной группами Доля

ооцитов, сформировавших бластоцисты, черезвычайно низка при активации стронцием 1214-часовых ооцитов по сравнению с контрольной группой

Табл. 6. Развитие in vitro партеногеиетическн активированных крысиных ооцитов.

Лктпяпфуювнхп факт«? Дрс5яашеся Доля ООЕШТО®.

В1Г1>*К1ЭЕШ ХГЧ, ООВ1ЕТ Ы. сформировавших

ч Ч &лястоспеты 'Л

Спонтанная активация 22-24 80(12 15) 13 (2Л5)

Эленцжиштулъс 16-18 £»5 (42.44) 13 (б'441

20-22 77 (21/27) 20 <S'27j

Этиловый спирт 22-24 S1 (26,32) 25 (S32)

Строншш 2 часа 12-14 93 (139149} 12<1БЛ49У

16-! S Pi (103/112) 17(20'Л2)

20-22 S3 (77т) 19(18-92)

Контроль * 92(156 169) 27 (47 169)е

(естественные зиготы)

* Естественное оплодотворение Различия достоверны (Р < 0.05). а-б

Изучение возможности применения этопозида для химической энуклеации ооцитов крыс на стадии метафазы II

Одним из важных этапов клонирования является энуклеация - удаление генетического материала ооцита В настоящее время для энуклеации ооцитов млекопитающих существуют два различных подхода: механический и химический Механический способ заключается в извлечении хромосом при помощи микропипетки Этот метод связан с высокой степенью травматичности, что снижает эффективность всей манипуляции. Химический способ привлекателен возможностью существенно упростить и ускорить процедуру энуклеации. На данный момент опубликованы данные, указывающие на возможность применения этопозида для химической энуклеации мышиных ооцитов на стадиях метафазы I (Ри1ка е! а1, 1993) и метафазы II (ЕЬЬеЖИ е1 а1., 1998).

Как видно на табл. 7, культивирование ооцитов крыс в среде, содержащей этопозид не оказывало влияния на способность ооцитов к активации стронцием В то же время этопозид достоверно снижал процент активированных ооцитов, достигших 2-клеточной стадии по сравнению с контролем (естественные зиготы) (Р < 0 05) Этопозид является специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, который ответственен за скручивание и разделение цепей ДНК. В наших опытах этопозид не оказывал влияния на

партеногенетическую активацию ооцитов и, в то же время, необратимо блокировал их дальнейшее развитие. Поэтому можно предположить, что химическая энуклеация ооцитов этопозндом может быть использована при клонировании крысы.

Табл. 7. Влияине этопозида на развитие крысиных эмбрионов.

1{|Н ми В(И 14ГИС1 НИ» МО(Ю1НЫ,М Чш 1» лишним* Чис ш (ШШИОП \К11111КР«1«»11ИМГ <Н>Ш1 1 Ы. )мб}1НОНМ ЦНЛШШИС 2 к И мрннХ! С1« %

1 5 1 ИХ ИХ (П1 14К1 (2<>'М1)

2 * 1 144 (120П4) 9 (МЛ 20)

! 4 <> и.з т (1-Г>.-1611 \ <6/1 П|

1 6 6 17 > 93 (1«! П2) (И'160)

* К'онгро'п. 6 6 17« чз 1167 178)__ м (140/107)

Были проведены сравнительные эксперименты по выяснению процента выживания эмбрионов крыс после процедуры клонирования как при помощи химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации (табл. 8). В качестве донора генетической информации использовали кумулюсные клетки.

Табл. 8. Сравнительная таблица выживания ооцитов и эмбрионов крыс на разных этапах клонирования при использовании химической или механической энуклеации.

Число ооцлтов крыс Ооакти выжившие ПОС16 воздействия >топ<Ш1за, Я» Ооцпты выжнвшае после >шклелциа а пньеквап М> "ПОСНОП клетка. и Ооиигы вылившие поете ЗЛбкТрОВМ- шльса, Оолиты выжившие после воздействия строшшя, «точные }Чб1ШОНЫ с ВШВМШ1А проэтктсачн. 2- к хшчны? змбрвсвы, «»

Кювировлвп* 142 54 45 45 28 16

при почошв мехд ни ческой (7* 142} (о4'142) (64 142) (40,142) (23 142)

)НЛК1«ЛЦШ1

Клонирование прп помошн 85 89 бй 49 49 43 16

хвмвческоп (76 5«> ('58'8>> {42 85» (42-85) (37 85) (14,85)

»в>к1е.1цнп

(этопоэод)

* Воздействие этопозндом не проводилось

Как видно на табл. 8, выживаемость эмбрионов крыс от этапа к этапу клонирования практически одинакова вне зависимости от способа энуклеации ооцитов. Доля 2-клеточных клонированных эмбрионов крысы составляет 16 % как при клонировании с применением химической энуклеации, так и при клонировании с применением механической энуклеации К сожалению, дальнейшая оценка выживаемости клонированных крысиных эмбрионов in vitro практически невозможна, поскольку развитие останавливается на 2-клеточной стадии вне зависимости от применяемого протокола клонирования (Jiang et al., 2002; Popova et al., 2006). Подобная особенность не встречается у клонированных эмбрионов других животных.

Динамика деметилироваиия у ранних крысиных и мышиных змбриоиов при развитии in vivo и in vitro

Для лучшего понимания процессов, происходящих в ранних предимплантационных эмбрионах, была исследована динамика деметилироваиия ДНК у эмбрионов крыс и мышей при помощи иммуноокрашивания с антителами против 5-МеС группы.

Впервые детальный анализ динамики деметилироваиия был проведён у эмбрионов крыс, развивающихся в системе in vivo При помощи окрашивания на 5-МеС группу были проанализированны 205 эмбрионов различных возрастов в системах in vivo и in vitro Доля эмбрионов с характерным рисунком метилирования (т. е наиболее часто встречающимся рисунком метилирования для данной временной точки) варьирует от 67 до 100 % (табл 9). Нехарактерный рисунок метилирования может служить индикатором ненормального развития эмбриона (Barton et al, 2001; Shi and Haaf, 2002).

Табл. 9. Доля эмбрионов крыс с характерным рисунком ДНК метилирования; развитие in vivo и in vitro

lipeun IIMIO к'от пиши, •i Р'НПНТНС >П >1*0 PaiBHMie in %itro

Число t4fi|moiion j >чбршшм с ' рис\икоч ДНК ¡ мсш.ифотмши, Чисто ччбриотш bifipmmw г (MicMitcoM ДНК чпилщтииннм, %

6 П(!-КЛСГ(.'ИНК) | 100 () 717) 20 (l-K,ÍL'T04Hb!C) 100 (20/20)

10 Л.Ч1-«лек»|чш:> | 78(18/231 14 (1«к «.»точные) Х5<12>14>

16 i 2N(l-K.4cu»Hi.rt> ¡67<19'28> 25 (l-k кмичт.0 76 0*25)

24 21 (2.рч1,п.»1ччг> | 71 (1<-211 20 (2"к;1<МОЧНМс) 80 {16-70 >

30 | 18(2-к1«очше) Í 77(14-18) 19 (2-клегочиыс) 78 05-19)

Чтобы выяснить временную хронологию деметилирования генома крысы, был использован метод датированной беременности для определения времени копуляции. Первый контакт ооцита и сперматозоида у крыс наблюдался через 4 ч после копуляции. Через 6 ч у зигот, развивавшихся в системах как in vivo так и in vitro, пронуклеусы при окрашивании на 5-МеС группу выглядели одинаково, причём мужской пронуклсус был более деконденсирован и выглядел крупнее чем женский пронуклеус крысы (рис. 2, А, - in vivo, С, - in vitro). Через 10 ч после копуляции мужской пронуклеус в системе in vivo частично метилирован в сравнении с сильно метилированным мужским пронуклеусом в системе in vitro (рис. 2, Е, - in vivo, G, - in vitro). Через 16 ч после копуляции у крысиной зиготы мужской пронуклеус в системе in vitro сохраняет высокий уровень метилирования по сравнению с практически полностью деметилированным мужским пронуклеусом в системе in vivo (рис. 2, I, - in vivo, К, - in vitro). Женский пронуклеус в обеих группах остаётся полностью метилированным.

А В С ш ф О

Е F в * . н

1 г J ' Ж к L %

М N О Р

Q R S т

Рис. 2. Деметилироваиие мужского пронуклеуса у ранних крысиных эмбрионов,

развивавшихся in vivo и in vitro.

Ядра эмбрионов окрашены FITC-связанными антителами против 5-МеС группы (зелёный цвет) (А. С, Е. G, I. К, М, О, Q, S) и контрастированы DAPI (голубой цвет) (В, D, F. Я, J, L, N, Р). Масштабная линейка 20 мкм. А. В, Е, F, I. J. М, N, Q. R: развитие in vivo. С, D. G, Н, К, L. О. P. S. Т: развитие in vitro.

Количественный анализ уровня флуоресценции показывает, что разница в метилировании мужского пронуклеуса зиготы крысы через 10, а также через 16 ч после копуляции в системах in vivo и in vitro достоверно различается (Р < 0.05), в то время как уровень ДНК-метилирования в женском пронуклеусе остаётся неизменным (рис. 3). Эмбрионы крысы, развивавшиеся до 2-клеточной стадии в разных условиях (24 или 30 ч после копуляции, in vivo и in vitro), показывают разный уровень метилирования - более высокий в системе in vitro (рис. 2, М, Q, О, S). Данный факт согласуется с исследованиями других авторов. Так, в работе Ши (Shi and llaaf, 2002) показано, что у эмбрионов мыши, культивитуемых в системе in vitro, ненормальное метилирование согласуется с качеством среды культивирования.

в! 1

Í .I 2 I_I 3

6 ч 10ч 16 ч

Рис. 3. Изменения уровня метилирования в мужском пронуклеусе у ранних эмбрионов крысы, развивавшихся in vivo и in vitro.

1 - мужской пронуклеус зиготы в системе in vivo

2 - мужской пронуклеус зиготы в системе in vitro

3 - женский пронуклеус эиготы в системе in vivo

4 - женский пронуклеус эиготы в системе in vitro

Уровень метилирования оценивался по интенсивности флуоресценции метки на 5-МеС, нормированной на размер ядра (формула /). Интенсивность флуоресценции мужского пронуклеуса через б ч после копуляции в системе in vitro была принята за 100%. На диаграмме представлены интенсивности флуоресценции в мужском (1, 2) и женском (3.4) пронуклеусе в разное время после копуляции в системах in vivo и in vitro.

Процессы деметилирования ДНК мыши были описаны в нескольких работах (Mayer et al., 2000; Santos et al., 2002; Beaujean et al., 2004c; Young and Beaujean, 2004). Однако время деметилирования мужского пронуклеуса мыши, указываемое разными авторами, различно. Данный факт можно объяснить тем, что использовались различные методы оплодотворения и отсчёта времени. Так, по данным Майер (Mayer et al., 2000), мужской пронуклеус мыши

сохраняет очень слабое метилирование через 8 ч после оплодотворения. К сожалению, авторы не описывают способ оплодотворения. В исследованиях, предпринятых Сантос (Santos et al., 2002), время деметилирования мужского пронуклеуса варьирует между 3 и 6 ч после микроинъекции спермы. Чтобы уточнить временную динамику деметилирования генома мыши, в диссертационной работе использовали метод датированной беременности для определения момента копуляции. 73 эмбриона мыши было проанализировано через разные промежутки времени после копуляции. Процент эмбрионов с характерным рисунком метилирования изменялся от 75 до 87 % (табл. 10). Первый контакт ооцита и сперматозоида мыши обнаруживался через 2 ч после копуляции. Как видно на рис. 4, А через 3 ч после копуляции можно наблюдать материнский и отцовский пронуклеусы идентично высокометилированные. У 1-клеточного эмбриона через 4 ч после копуляции отцовский пронуклеус существенно больше, чем материнский (рис. 3, С). Через 8 ч после копуляции отцовский пронуклеус окрашен менее интенсивно, чем женский и через 10 ч полностью деметилирован (рис. 3, Е, G). Проанализированы также эмбрионы, развивавшиеся в условиях in vivo и in vitro. Было найдено, что эмбрионы in vitro более метилированы, чем эмбрионы in vivo (рис. 3, I - in vitro, К - in vivo).

Табл. 10 Процент in vivo развившихся эмбрионов мыши с характерным рисунком ДНК метилирования

Время после копулЯИ»» ч Число 7Чб|)ИОН01) >м0рмоны е характерным рисунком метилирований ДНК,

з i 6 (1 -клеточные) 87(14/16)

4 20 Í)-клеточные) 85 (i7/20)

8 1? (1-клеточные) 76 0 3/17)

К) 20 (1-клеточные) 75 0 5/20}

Таким образом, у зигот как крыс, так и мышей происходит изменение рисунка метилирования ДНК, но с разной динамикой. Первое обнаружение мужского и женского пронуклеуса возможно через 3 ч после копуляции у мыши и через 6 ч у крысы. В 10 ч после копуляции мужской пронуклеус у мыши полностью деметилирован, а у крысы в то же время частично. Эти отличия можно объяснить видовой спецификой. Обнаружены различия в уровне метилирования ДНК у эмбрионов, развивающихся in vitro по сравнению с эмбрионами, развивающимися in vivo как у крыс, так и у мышей.

А Ф ♦ В Ш ¿;Ш..

С D

Е F É

G # н #

1 ш # 1||р: J

К L ^

Рис. 4. Деметилирование мужского пронуклеуса у ранних эмбрионов мыши.

Ядра эмбрионов окрашены FITC-связанными антителами против 5-МеС группы (зелёный цвет): (А, с; Е, G, /, К) и контрастированы DAPI (голубой цвет): (В, D, F, Н, J, L) развитие in vivo: А - J система in vitro: К, L Масштабная линейка 20 мкм.

Метилирование у партеногенетических и клонированных эмбрионов

Был исследован уровень метилирования у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы. У партеногенетических эмбрионов наблюдался высокий уровень метилирования ДНК как на 1-клеточной стадии, так и на 2- и 4-клеточной стадии по сравнению с контролем (естественное оплодотворение), динамика деметилирования отсутствует. Клонированные 2-клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

Ядра эмбрионов окрашены Р1ТС связанными антителами против 5-МеС группы (зелёный цвет) (А, С, Е. О, /. К) и контрастировав!ы ВАР/ (голубой цвет) (В. Д Р. Н, J. V). Масштабная линейка 20 мкм.

А-5 ч после активации ооцита. С - 1-клеточный

партеногенетический эмбрион через!О ч после активации ооцита. Е ¡-клеточный партеногенетический эмбрион через 16 ч после активации ооцита. С -2- клеточный партеногенетический эмбрион через 24 ч после активации ооцита. I -2- клеточный партеногенетический эмбрион через 30 ч после активации ооцита. К~4 клеточный партеногенетический эмбрион через 4Н ч после активации ооцита. Все

партеногенетические эмбрионы сильно метилированы.

Рис. 5. Метилирование у пар геногенеги чески х эмбрионов крысы.

о в

с ш. 0

Е , , * -* Л» «, * р. * * л ■»х-1

Рис. 6. Метилирование у клонированных эмбрионов крысы.

Ядра эмбрионов и кумулюсных клеток окрашены Р1ТС-связанными антителами против 5-МеС группы (зелёный цвет) (А. С, Е) и контрастированны йАР1 (голубой цвет) (В. Д Р). Масштабная линейка 20 мкм. А. В 1-клеточный клонированный эмбрион, 10 ч после активации ионами стронция. С, /) 2-клеточный клонированный эмбрион. 30 ч после активации ионами стронция Е, /*" кумулюсные клетки

Выводы

1. Партеногенетическую активацию ооцитов крыс удаётся получить при действии различных активационных агентов: стронция, электроимпульса, этилового спирта Воздействие ионов стронция (Sr2+) оказалось наиболее эффективным. Этот агент подходит для активации ооцитов крыс всех возрастов, дает бОльшую долю животных, ооциты которых активируются с высокой частотой (так называемые «активные» животные) и обеспечивает высокую эффективность активации Старые ооциты крыс (22-27 ч после инъекции хорионического гонадотропина человека — ХГЧ) склонны к спонтанной партеногенетической активации

2. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации зависит от времени между инъекцией ХГЧ и моментом извлечения ооцитов из животного; более старые ооциты активируются с большей частотой (у «активных» животных). Эффективность партеногенетической активации у «неактивных» крыс не изменяется с увеличением возраста ооцита.

3. У крыс после активации стронцием, электроимпульсом, этиловым спиртом, а также после спонтанной активации с последующей диплоидизацией при помощи цитохалазина Б ооциты способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

4. Этопозид не влияет на партеногенетическую активацию ооцитов крыс (формирование видимого пронуклеуса) и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие При пересадке в такие ооциты ядер кумулюсных клеток (клонирование) процент получающихся 2-клеточных эмбрионов практически одинаков как после химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

5. Эмбрионы, культивируемые in vitro со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии, имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы in vivo (то же наблюдается и у мышей).

7 У партеногенетических эмбрионов вплоть до 4-клеточной стадии наблюдается высокий уровень метилирования, деметилирование отсутствует Клонированные 2-клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

Список публикаций по теме диссертации

Knvokharchenko А , Popova Е, Zaitseva I, Vil'ianovich L, Ganten D, Bader M 2003 Development of parthenogenetic rat embryos. Biol. Reprod. 68:829-36

Zaitseva I, ZaitsevS, AlemnaN, Bader M, Knvokharchenko A 2007. Dynamics ofDNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed m vivo and in vitro. Mol. Reprod. Dev.74:1255-61.

Зайцева Ю A , Бадер M, Кривохарченко А С 2008 Получение двухклеточных реконструированных эмбрионов крысы после химической инактивации этопозидом хромосом ооцитов на стадии метафазы II. Онтогенез. 38: 340-344 Knvokharchenko A., Popova Е., Zaitsewa I., Vil'ianovich L , Ganten D , Bader M. 2002. Parthenogenetic activation of rat embryos Abstract Book, p 196. 6-7 18-th Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association, Rolduc, Niederlande.

Zaitseva I., Knvokharchenko A., Popova E., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Chemical enucleation of rat oocytes. Proceed of XVII Working Meeting "Genetic Resource Conservation", 19-21 November, Pushchino, Russia

Список цитируемой литературы

Barton S С, Arney К L , Shi II'., Niveleau A., Fúndele R., Suram M. A , HaafT 2001. Genome-wide methylation patterns in normal and uniparental early mouse embryos. Hum. Mol. Genet. 10: 2983-7. — Beaujean N, Taylor J E, McGarry M, Gardner J. 0., Wilmut /., Lot P, Ptak G, Galli С, Lazzan G, Bird A 2004c The effect of interspecific oocytes on demethylation of sperm DNA. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 101 7636-40. — BjerregaardВ, Wrenzycki С, StrejcekF, Laurmcik J, Holm P, Ochs R L, Rosenkranz С, Caliesen H, Rath D, Niemann H 2004. Expression of nu-cleolar-related proteins in porcine preimplantation embryos produced in vivo and in vitro. Biol. Reprod 70. 867-76 —ElsheikhA S, Takahashi Y, KatagiriS, Kanagawa H. 1998. Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn. J. Vet. Res. 45' 217-20 — Fulka J, Jr, Notarianm E, Passoni L, Moor R M 1993. Early changes in embryonic nuclei fused to chemically enucleated mouse oocytes Int. J. Dev. Biol 37.433-9. — Henery С С, Kaufman M H 1993 The incidence of aneuploidy after single pulse electroactivation of mouse oocytes. Mol. Reprod Dev. 34 299-307. — Jiang J Y, Mizuno S, Mizutani E, Sasada H, Sato E 2002. Parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro. Mol. Reprod. Dev. 61 • 120-5.

— Kaufman M H 1973. Parthenogenesis in the mouse. Nature. 242: 475-6. — Liu L, Trimarcht J R, Keefe D L 2002 Haploidy but not parthenogenetic activation leads to increased incidence of apoptosis in mouse embryos Biol. Reprod. 66: 204-10 — Marcus G J 1990. Activation of cumulus-free mouse oocytes. Mol Reprod. Dev. 26: 159-62 — Mayer W, Niveleau A , Walter J, Fundele R, HaafT 2000 Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature. 403: 501-2. — Miyo-shi К, Kono T, Niwa К 1997. Stage-dependent development of rat l-cell embryos in a chemically defined medium after fertilization in vivo and in vitro. Biol. Reprod. 56: 180-5. — Niemann H, Wrenzycki С 2000. Alterations of expression of developmental^ important genes in preimplantation bovme embryos by m vitro culture conditions: implications for subsequent development. Thenogenology. 53 21-34 — Niemann H, Wrenzycki С, Lucas-Hahn A , Brambrink T, Kues W A , Carnwath J W. 2002 Gene expression patterns in bovine m vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning. Stem. Cells. 4: 29-38

— O'Neill G Т., Kaufman M H 1988. Influence of postovulatory aging on chromosome segrega-

tion during the second meiotic division in mouse oocytes a parthenogenetic analysis. J Exp. Zool. 248: 125-31. — Popova E, Bader M, Krivokharchenko A 2006 Full-term development of rat after transfer of nuclei from two-cell stage embryos. Biol. Reprod. 75: 524-30 — Reik IV, Dean W 2001. DNA methylation and mammalian epigenetics. Electrophoresis 22: 2838-43. — Rybouchkin A., Dozortsev D, de Sutter P D, Dhont M 1996. Factors affecting the role of the spindle during early response of mouse oocytes to ethanol stimulation. J. Exp. Zool. 275' 469-75 — Santos F„ Hendrich B, Retk IV, Dean W. 2002 Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev. Biol 241: 172-82 — Shi W, HaafT. 2002. Aberrant methylation patterns at the two-cell stage as an indicator of early developmental failure. Mol. Reprod Dev. 63: 329-34. — Young L E, Beaujean N. 2004 DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing stories of the mouse and sheep. Anim. Reprod. Sci. 82-83: 61-78. — Zernicka-Goetz M 1991 Spontaneous and induced activation of rat oocytes. Mol. Reprod Dev. 28: 169-76. — Zhou Q, Renard J P, Le Friec G, Brochard V, Beaujean N., Cherifl K, Fratchard A , Cozzt, J 2003. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302: 1179.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 23.10 2008. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ л. 1,0 Уч.-изд л. 1,0. Тираж 100. Заказ 3608Ь.

Отпечатано с готового орш инал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцева, Юлия Анатольевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Научные аспекты клонирования млекопитающих.

1.1.1 История клонирования.

1.1.2 Особенности клонирования крысы.

1.2 Энуклеация.

1.3 Активация ооцита-реципиента.

1.4 Процессы метилирования и деметилирования во время раннего эмбриогенеза.

1.4.1 Геномный импринтинг.

1.4.2 Метилирование.

1.4.3 ДНК-метилирование во время раннего эмбриогенеза.

1.4.4 Ненормальныйный рисунок метилирования при клонировании. 25 1.5 Заключение.

2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.2 Метод суперовуляции.

2.3 Получение зигот у мышей и крыс.

2.4 Метод датированной беременности.

2.5 Культивирование эмбрионов крыс и мышей.

2.6 Партеногенетическая активация ооцитов крыс.

2.6.1 Спонтанная активация.

2.6.2 Активация электроимпульсом.

2.6.3 Химическая активация.

2.7 Анализ партеногенетической активации ооцитов крыс.

2.8 Диплоидизация.

2.9 Механическая энуклеация ооцитов крыс.

2.10 Химическая энуклеация ооцитов крыс.

2.11 Введение кумулюсной клетки под блестящую оболочку.!.

2.12 Слияние цитоплазм энуклеированного эмбриона и кумулюсной клетки.

2.13 Активация генетического материала реконструированного эмбриона.

2.14 Имуннофлуоресцентный анализ метилирования.

2.15 Численный анализ интенсивности флуоресценции.

2.16 Микроскопирование.

2.17 Статистический анализ.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Оптимизация активационных параметров.

3.1.1 Выяснение зависимости эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3.1.2 Химическая активация крысиных эмбрионов.

3.1.2.1 Активация ооцитов крыс этиловым спиртом.

3.1.2.2 Активация ооцитов крыс электроимпульсом.

3.1.2.3 Активация ооцитов крыс стронцием.

3.1.3 Спонтанная партеногенетическая активация.

3.1. 4 Развитие in vitro активированных ооцитов крысы.

3.2 Исследование возможности применения химической энуклеации при соматическом клонировании.

3.2.1 Влияние этопозида на развитие эмбрионов крыс.

3.2.2 Клонирование с применением механической и химической энуклеации

3.3 Исследование динамики деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов мышей и крыс.

3.3.1 Деметилирование мужского пронуклеуса мыши.

3.3.2 ДНК-метилирование в 2-клеточных эмбрионах мыши, развивавшихся в системах in vivo и in vitro.

3.3.3 Динамика деметилирования ДНК крысы в системах in vitro и in vivo.

3.3.4 Ненормальный рисунок метилирования в системе in vitro.

3.3.5 Сравнение динамики деметилирования у крысиных и мышиных предимплантационных эмбрионов, развивавшихся in vivo.

3.3.6 Уровень метилирования в эмбрионах, развивавшихся in vivo и in vitro.

3.3.7 Метилирование у партеногенетических и клонированых эмбрионов крысы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей"

Актуальность проблемы

Одной из форм полового размножения является партеногенез. У некоторых организмов естественный партеногенез — нормальный способ размножения в природе. У других организмов искусственный партеногенез вызывается экспериментально действием разных факторов на неоплодотворённую яйцеклетку, причём факторы, активирующие ооцит, в основном видоспецифичны. Лучшим критерием успешной активации ооцитов является способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному и постимплантационному развитию. Как известно, активация ооцита-реципиента является важнейшим этапом клонирования млекопитающих. Ко времени проведения данного исследования попытки получить предимплантационное развитие до стадии бластоцисты у активированных ооцитов крыс оказались неудачными, развитие партеногенетического эмбриона останавливалось на 4-клеточной стадии (Zernicka-Goetz, 1991). На данный момент зафиксирован единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003); повторить успех французских учёных пока никому не удалось.

Другой важный этап процедуры клонирования — энуклеация ооцита-реципиента. Механическая энуклеация обычно сопряжена с высоким повреждающим воздействием. Альтернативой механической энуклеации может быть химическая энуклеация веществами, надёжно блокирующими генетический материал клетки. Одним из них является этопозид - ингибитор ДНК-топоизомеразы 2, которая ответственна за скручивание и разделение цепей ДНК. Одной из задач работы было изучение возможности применения этопозида для химической энуклеациии ооцитов крыс.

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии (Reik, Dean, 2001). Проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, низкая эффективность клонирования, сложности партеногенетического развития хорошо коррелируют с ненормальным рисунком метилирования генома. Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих мокут служить маркёром дефектного развития эмбриона. В настоящее время имеются работы по изучению динамики деметилирования генома мыши, однако приводимые в них данные сильно различаются (Mayer et al., 2000; Santos et al., 2002). Для крыс такие данные вообще отсутствуют. Вместе с тем, изучение процессов деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач биологии развития.

Цель исследования

Цель работы заключалась в подборе оптимальных параметров активации ооцитов крыс (активирующие агенты, время воздействия) и получении жизнеспособных партеногенетических эмбрионов, в изучении возможности химической энуклеации ооцитов крыс с последующей пересадкой в них ядер соматических клеток и в исследовании динамики деметилирования ДНК зигот (крыса, мышь), развивающихся in vivo и in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации существенно варьирует от животного к животному и зависит от времени между инъекцией хорионического гонадотропина человека и моментом извлечения ооцитов.

2. Стронций (Si*+) является более эффективным активатором партеногенеза по сравнению с электроимпульсом и этанолом. Партеногенетические эмбрионы крысы способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

3. Этопозид не оказывает влияния на партеногенетическую активацию ооцитов крыс и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. Доля 2-клеточных эмбрионов после процедуры клонирования практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида так и после механической энуклеации.

4. Деметилирование ДНК у зигот крыс и мышей происходит с разной скоростью. Эмбрионы обоих видов, культивируемые in vitro демонстрируют более высокий уровень метилирования по сравнению с развивающимися in vivo.

Партеногенетические и клонированные 2-клеточные эмбрионы крысы сохраняют высокий уровень метилирования.

Конкретные задачи исследования

2. Выяснить зависимость эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3. Исследовать способность партеногенетически активированных ооцитов к развитию in vivo и in vitro.

6. Оценить уровень метилирования ДНК у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы.

Научная новизна работы

Впервые получены партеногенетические бластоцисты крысы после активации ооцитов этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом, а также после спонтанной активации. Воздействие стронция давало большую долю активированных ооцитов, активировались ооциты всех возрастов. Установлено, что активация ооцитов зависит от промежутка времени между процедурой суперовуляции и выделением ооцитов. Более старые ооциты крысы активировались успешнее, чем молодые. Впервые показано, что у ооцитов крыс аутбредной линии Wistar имеет место индивидуальная (от крысы к крысе) реакция на партеногенетическую активацию, не зависящая от активирующего агента. Установлено, что химическая энуклеация ооцитов крысы этопозидом может успешно использоваться при клонировании. Этопозид, являясь специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, не оказывал влияния на партеногенетическую активацию ооцитов и, тем не менее, необратимо блокировал их дальнейшее развитие.

Научно-практическое значение работы

Результаты тестирования различных активирующих агентов показали, что стронций является наиболее эффективным активационным агентом ооцитов крыс, что важно для технологии клонирования. При работе с аутбредной линией Wistar выявлено индивидуальное (от крысы к крысе) варьирование результатов, не зависящее от протокола эксперимента, что необходимо учитывать при проведении эмбриологических работ. Применение химической энуклеации вместо механической может существенно снизить трудоёмкость процесса клонирования крыс и повысить его эффективность. Разный уровень деметилирования мужского пронуклеуса зигот у крыс и мышей в системах in vivo и in vitro может служить индикатором качества используемых культивационных сред в том числе используемых для манипуляций с эмбрионами человека в программах экстракорпорального оплодотворения. В целом полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии для совершенствовании технологии клонирования млекопитающих, а также при изучении процессов их раннего эмбриогенеза.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Зайцева, Юлия Анатольевна

5. Выводы

1. Партеногенетическую активацию ооцитов крыс удаётся получить при действии различных активационных агентов: стронция, электроимпульса, этилового спирта. Воздействие ионов стронция (Sr2+) оказалось наиболее эффективным. Этот агент подходит для активации ооцитов крыс всех возрастов, даёт большую долю животных, ооциты которых активируются с высокой частотой (так называемые «активные» животные) и обеспечивает высокую эффективность активации. Старые ооциты крыс (22-27 ч после инъекции хорионического гонадотропина человека — ХГЧ) склонны к спонтанной партеногенетической активации.

4. Этопозид не влияет на партеногенетическую активацию ооцитов крыс (формирование видимого пронуклеуса) и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. При пересадке в такие ооциты ядер кумулюсных клеток (клонирование) процент получающихся 2-клеточных эмбрионов практически одинаков как после химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

6. Динамика деметилирования ДНК в нормальных зиготах крыс и мышей различна. Впервые мужской и женский пронуклеусы можно наблюдать у крыс через 6 ч после копуляции и через 3 ч у мышей. Через 10 часов после копуляции мужской пронуклеус у мыши полностью деметилирован, в то время как у крысы при аналогичных условиях -частично. Эти особенности можно объяснить видовыми различиями. 7. У партеногенетических эмбрионов вплоть до 4-клеточной стадии наблюдается высокий уровень метилирования, деметилирование отсутствует. Клонированные 2-клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

6. Список публикаций по теме диссертации

Krivokharchenko A., Popova Е., Zaitseva /., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Development of Parthenogenese rat embryos. Biol. Reprod. 68:829-36

Zaitseva /., ZaitsevS., Alenina N., Bader M., Krivokharchenko A. 2007. Dynamics of DNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro. Mol. Reprod. Dev.74:1255-61

Зайцева Ю.А., Бадер M., Кривохарченко A.C. 2008

Получение двухклеточных реконструированных эмбрионов крысы после химической инактивации этопозидом хромосом ооцитов на стадии метафазы II. Онтогенез. 38: 340-344

Krivokharchenko А., Popova Е., Zaitsewa I., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2002. Parthenogenetic activation of rat embryos Abstract Book, p. 196. 6-7 18-th Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association, Rolduc, Niederlande.

Zaitseva I., Krivokharchenko A., Popova E., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Chemical enucleation of rat oocytes. Proceed of XVII Working Meeting "Genetic Resource Conservation", 19-21 November, Pushchino, Russia.

4. Заключение

Подводя итог вышеизложенному, можно сказать, что в данной диссертационной работе была предпринята попытка оптимизации протокола клонирования крыс, которая включала в себя: а) выбор оптимальных активационных параметров

Активация ооцита-реципиента является важнейшим шагом клонированния. В представленном исследовании подробно рассматривались различные активирующие агенты, такие как этиловый спирт, стронций, электроимпульс, а также возможные факторы, влияющие на активацию ооцита (возраст ооцита, длительность обработки и т.д.). Воздействие стронция оказалось наиболее эффективным для активации ооцитов крыс всех возрастов. Изучалась также способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному развитию. Были получены партеногенетические бластоцисты после активации и последующей диплоидизации ооцитов крыс. б) применение химической энуклеации

Процедура клонирования представляет собой весьма трудоёмкую операцию, сопряжённую с высоким повреждающим воздействием при механической энуклеации ооцита-рецепиента. Альтернативой может служить химическая энуклеация при помощи веществ, надёжно блокирующих генетический материал ооцита. Одним из них является этопозид - ингибитор ДНК-топоизомеразы II, которая отвечает за скручивание и разделение цепей ДНК. Доля 2-клеточных клонированных эмбрионов крысы практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида так и после механической энуклеации. в) исследование динамики деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов мышей и крыс

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии. Низкая эффективность клонирования, проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, сложности партеногенетического развития, как правило, коррелируют с нарушением рисунка метилирования. В представленной работе было показано, что у зигот мышей и крыс в процессе развития происходит изменение рисунка метилирования ДНК с разной скоростью, что объясняется видовыми различиями. Выявлены отличия в уровне метилирования ДНК у эмбрионов мышей и крыс, развивающихся в разных системах: in vivo и in vitro. У партеногенетических, а также у клонированных эмбрионов, наблюдается высокий уровень метилирования, динамика деметилирования отсутствует. Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих могут служить маркёром дефектного развития эмбриона.

Крыса является незаменимой экспериментальной моделью в медицине и физиологии. На данный момент зафиксирован лишь единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003), поэтому для разработки технологии клонирования необходимы дальнейшие исследования.

Особенностью ооцитов крысы является их спонтанная активация, что усложняет процедуру клонирования. Активированная цитоплазма не поддерживает в достаточной степени процессы репрограмирования внесённого ядра, поэтому остаётся актуальным вопрос устранения этого фактора. В представленной работе, в экспериментах по клонированию крысы, использовали кумулюсные клетки в качестве доноров генетической информации. Было бы интересно исследовать способность к репрограммированию ядра других типов клеток, таких, как, например, эмбриональных стволовых клеток, полученных в лаборатории профессора Бадера. В этом случае требуется синхронизация цитоплазмы ооцита-реципиента крысы и донорского ядра.

Остаётся открытым вопрос о сравнении эффективности клонирования при использовании химической (этопозид) или механической энуклеации для получения клонированных эмбрионов более поздних стадий развития.

Процессы деметилирования мужского пронуклеуса крысы в системах in vivo и in vitro, а также уровень метилирования в 2-клеточных эмбрионах были детально изучены в представленном исследовании, однако уровень метилирования поздних предимплантационных эмбрионов крысы остаётся пока невыясненным. Технология клонирования уже внесла огромный вклад в понимание ранних процессов развития, взаимодействия родительских геномов, репрограммирования ядер и геномного импринтинга. Клонирование крысы - одна из актуальных проблем современной биологии, однако попытки создания клонов нельзя назвать успешными, т. к. большая часть реконструированных зародышей не развивается далее ранних эмбриональных стадий. Тем не менее, попытки создания технологии клонирования крысы продолжаются, и хочется надеяться, что полученные в данной работе результаты и планируемые нами дальнейшие исследования помогут в решении этой проблемы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцева, Юлия Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Гоголевский П. А., В.М.Здановский В. М., 1998. Клонирование. Проблемы репродукции 3.

2. Корочкин Л. И. 1999. Клонирование животных. Соросовский образовательный журнал 4, 10-16.

3. Шкуматов А. А. 2001. Клонирование: прошлое, настоящее. будущее? Проблемы репродукции №6

4. Aflalo Е. D., Sod-Moriah U. A., Potashnik G., Har-Vardi, I. 2005. Expression of plasminogen activators in preimplantation rat embryos developed in vivo and in vitro. Reprod Biol Endocrinol 3, 7.

5. Amano Т., Kato, Y., Tsunoda, Y. 2001. Full-term development of enucleated mouse oocytes fused with embryonic stem cells from different cell lines. Reproduction 121, 72933.

6. Baguisi A., Behboodi E., Melican D. Т., Pollock J. S., Destrempes M. M., Cammuso C., Williams J. L., Nims S. D., Porter C. A., Midura P. 1999. Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat Biotechnol 17, 456-61.

7. Barton S. С., Arney K. L., Shi W., Niveleau A., Fundele R., Surani M. A., Haaf T. 2001. Genome-wide methylation patterns in normal and uniparental early mouse embryos. Hum Mol Genet 10, 2983-7.

8. Barton T. S., Robaire В., Hales B. F. 2005. Epigenetic programming in the preimplantation rat embryo is disrupted by chronic paternal cyclophosphamide exposure. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7865-70.

9. Beaujean N., Hartshorne G., Cavilla J., Taylor J., Gardner J., Wilmut I., Meehan R., Young, L. 2004a. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics. Curr Biol 14, R266-7.

10. Beaujean N., Taylor J., Gardne, J., Wilmut I., Meehan R., Young, L. 2004b. Effect of limited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod 71,185-93.

11. Beaujean N., Taylor J. E., McGarry M., Gardner J. O., Wilmut I., Loi P., Ptak G., Galli C., Lazzari G., Bird A. 2004c. The effect of interspecific oocytes on demethylation of sperm DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7636-40.

12. Bestor T. H. 2000. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 9, 2395-402.

13. Bos-Mikich A., Whittingham D. G., Jones K. T. 1997. Meiotic and mitotic Ca2+ oscillations affect cell composition in resulting blastocysts. Dev Biol 182, 172-9.

14. Bos-Mikich A., Wood M. J., Candy C. J., Whittingham D. G. 1995. Cytogenetical analysis and developmental potential of vitrified mouse oocytes. Biol Reprod 53, 780-5.

15. Brandeis M., Kafri T., Ariel M., Chaillet J. R., McCarrey J., Razin A., Cedar H. 1993. The ontogeny of allele-specific methylation associated with imprinted genes in the mouse. Embo J 12, 3669-77.

16. Campbell K. H. 1999. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning 1, 3-15.

17. Campbell K. H., Loi P., Otaegui P. J., Wilmut I. 1996. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod 1, 40-6.

18. Cattanach B. M., Kirk, M. 1985. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice. Nature 315, 496-8.

19. Chan A. W., Dominko T., Luetjens C. M., Neuber E., Martinovich C., Hewitson L., Simerly C. R., Schatten G. P. 2000. Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science 287, 317-9.

20. Chen T., Zhang Y. L., Jiang Y., Liu S. Z, Schatten H., Chen D. Y., Sun Q. Y. 2004. The DNA methylation events in normal and cloned rabbit embryos. FEBS Lett 578, 69-72.

21. Dean W., Santos F., Stojkovic M., Zakhartchenko V., Walter J., Wolf E., Reik W. 2001. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 13734-8.

22. Elsheikh A. S., Takahashi Y., Hishinuma M., Kanagawa H. 1997. Developmental ability of mouse late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. J Vet Med Sci 59, 107-13.

23. Elsheikh A. S., Takahashi Y., Katagiri S., Kanagawa H. 1998. Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn J Vet Res 45, 217-20.

24. Feil R. 2001. Early-embryonic culture and manipulation could affect genomic imprinting. Trends Mol Med 7, 245-6.

25. Fulka H., Mrazek M., Tepla O., Fulka J., Jr. 2004. DNA methylation pattern in human zygotes and developing embryos. Reproduction 128, 703-8.

26. Fulka J., Jr., First N. L., Moor, R. M. 1996. Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor. Bioessays 18, 835-40.

27. Fulka J., Jr., Notarianni E., Passoni L., Moor R. M. 1993. Early changes in embryonic nuclei fused to chemically enucleated mouse oocytes. Int J Dev Biol 37, 433-9.

28. Grupen C. G., Verma P. J., Du Z. T., Mcllfatrick S. M., Ashman R. J., Nottle M. B. 1999. Activation of in vivo- and in vitro-derived porcine oocytes by using multiple electrical pulses. Reprod Fertil Dev 11, 457-62.

29. Gurdon J. B. 1968. Transplanted nuclei and cell differentiation. Sci Am 219, 24-35.

30. Gurdon J. B. 1986. Nuclear transplantation in eggs and oocytes. J Cell Sci Suppl 4, 287-318.

31. Gurdon J. B., Laskey, R. A. 1970. The transplantation of nuclei from single cultured cells into enucleate frogs' eggs. J Embryol Exp Morphol 24, 227-48.

32. Hajkova P., Erhardt S., Lane N., Haaf T., El-Maarri O., Reik W., Walter J., Surani, M. A. (2002). Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 117, 1523.

33. Hayes E., Galea S., Verkuylen A., Pera M., Morrison J., Lacham-Kaplan O., Trounson A. (2001). Nuclear transfer of adult and genetically modified fetal cells of the rat. Physiol Genomics 5,193-204.

34. Henery C. C., Kaufman M. H. 1992. Cleavage rate of haploid and diploid parthenogenetic mouse embryos during the preimplantation period. Mol Reprod Dev 31, 258-63.

35. Henery C. C., Kaufman M. H. 1993. The incidence of aneuploidy after single pulse electroactivation of mouse oocytes. Mol Reprod Dev 34, 299-307.

36. Hirabayashi M., Kato M., Takeuchi A., IshikawaA., Hochi S. 2003. Factors affecting premature chromosome condensation of cumulus cell nuclei injected into rat oocytes. J. Reprod. Dev. 49, 121-6.

37. Jiang J. V., Mizuno S., Mizutani E., Sasada H., Sato E. 2000. Parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro. Mol Reprod Dev 61, 120-5.

38. Kato Y., Rideout W. M., Hilton K, Barton S. C., Tsunoda Y., Surani M. A. 1999. Developmental potential of mouse primordial germ cells. Development 126,1823-32.

39. Kaufman M. H. 1973. Parthenogenesis in the mouse. Nature 242, 475-6.

40. Keefer, C. L, Schuetz A. W. 1982. Spontaneous activation of ovulated rat oocytes during in vitro culture. J Exp Zool 224, 371-7.

41. Kim J. M., Ogura A., Nagata M., Aoki F. 2002. Analysis of the mechanism for chromatin remodeling in embryos reconstructed by somatic nuclear transfer. Biol Reprod 67, 760-6.

42. Kishikawa H., Wakayama T., Yanagimachi Ft. 1999. Comparison of oocyte-activating agents for mouse cloning. Cloning 1,153-9.

43. Kline D., Kline J. T. 1992. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev Biol 149, 80-9.

44. Kono T., Jones K. T., Bos-Mikich A., Whittingham D. G., Carroll J. 1996. A cell cycle-associated change in Ca2+ releasing activity leads to the generation of Ca2+ transients in mouse embryos during the first mitotic division. J Cell Biol 132, 915-23.

45. Marcus G. J. 1990. Activation of cumulus-free mouse oocytes. Mol Reprod Dev 26, 159-62.

46. Marshall V. S., Wilton L. J., Moore H. D. 1998. Parthenogenetic activation of marmoset (Callithrix jacchus) oocytes and the development of marmoset parthenogenones in vitro and in vivo. Biol Reprod 59,1491-7.

47. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. 2000. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403, 501-2.

48. McGrath J., Solter D. 1984. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 37,179-83.

49. Meehan R. R. 2003. DNA methylation in animal development. Semin Cell Dev Biol 14, 53-65.

50. Miyoshi K., Kono T., Niwa, K. 1997. Stage-dependent development of rat 1 -cell embryos in a chemically defined medium after fertilization in vivo and in vitro. Biol Reprod 56, 180-5.

51. Niemann H., Wrenzycki C. 2000. Alterations of expression of developmental^ important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development. Theriogenology 53, 21-34.

52. Niemann H., Wrenzycki C., Lucas-Hahn A., Brambrink T., Kues, W. A., Carnwath J. W. 2002. Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning Stem Cells 4, 29-38.

53. O'Neill G. T., Kaufman M. H. 1988. Influence of postovulatory aging on chromosome segregation during the second meiotic division in mouse oocytes: a parthenogenetic analysis. J Exp Zool 248, 125-31.

54. O'Neill G. T., Rolfe L. R., Kaufman M. H. 1991. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Mol Reprod Dev 30, 214-9.

55. Onishi A., Iwamoto M., Akita T., Mikawa S., Takeda K, Awata T., Hanada H., Perry A. C. 2000. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289, 1188-90.

56. Oswald J., Engemann S., Lane N., Mayer W., Olek A., Fundele R., Dean W., Reik W., Walter J. 2000. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol 10, 475-8.

57. Otaegui P. J., O'Neill G T., Wilmut I. 1999. Parthenogenetic activation of mouse oocytes by exposure to strontium as a source of cytoplasts for nuclear transfer. Cloning 1, 111-7.

58. Ozil J. P., Huneau D. 2001. Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca2+ signal regime on development. Development 128, 917-28.

59. Patkin E. L, Suchkova I. O. 2006. Regulatory mechanisms of mammalian imprinting. Tsitologiia 48, 578-94.

60. Penkov L. I., Platonov E. S. 1992. The development of diploid parthenogenetic mouse embryos of the inbred C57BL and CBA strains. Ontogenez 23, 364-9.

61. Polejaeva I. A., Chen S. H., Vaught T. D., Page R. L., Mullins J., Ball S., Dai Y., Boone J., Walker S., Ayares D. L. 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407, 86-90.

62. Popova E., Bader M., Krivokharchenko A. 2006. Full-term development of rat after transfer of nuclei from two-cell stage embryos. Biol. Reprod. 75, 524-30.

63. Reik W., Santos F., Dean W. 2003. Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy. Theriogenology 59, 21-32.

64. Reik W., Walter J. 2001. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2, 21-32.

65. Rougier N., Bourc'his D., Gomes D. M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., Viegas-Pequignot E. 1998. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development. Genes Dev 12, 2108-13.

66. Russell D. F., Ibanez E., Albertini D. F., Overstrom E. W. 2005. Activated bovine cytoplasts prepared by demecolcine-induced enucleation support development of nuclear transfer embryos in vitro. Mol Reprod Dev 72,161-70.

67. Rybouchkin A., Dozortsev D., de Sutter P. D., Dhont, M. 1996. Factors affecting the role of the spindle during early response of mouse oocytes to ethanol stimulation. J Exp Zool 275, 469-75.

68. Santos F., Dean, W. 2004. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction 127, 643-51.

69. Santos F., Hendrich B., Reik W., Dean W. 2002. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev Biol 241, 172-82.

70. Savard C., Novak S., Saint-Cyr A., Moreau M., Pothier F., Sirard M. A. 2004. Comparison of bulk enucleation methods for porcine oocytes. Mol Reprod Dev 67, 70-6.

71. Shi W., Dirim F., Wolf E., Zakhartchenko V., Haaf T. 2004. Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos. Biol Reprod 71, 340-7.

72. Shi W., Haaf T. 2002. Aberrant methylation patterns at the two-cell stage as an indicator of early developmental failure. Mol Reprod Dev 63, 329-34.

73. Shi W., Zakhartchenko V., Wolf, E. 2003. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation 71, 91-113.

74. Solter D. 2000. Mammalian cloning: advances and limitations. Nat Rev Genet 1, 199-207.

75. Stice S. L., Strelchenko N. S., Keefer C. L., Matthews L. 1996. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer. Biol Reprod 54, 100-10.

76. Sturm K. S., Flannery M. L., Pedersen R. A. 1994. Abnormal development of embryonic and extraembryonic cell lineages in parthenogenetic mouse embryos. Dev Dyn 201, 11-28.

77. Surani M. A., Barton S. C. 1983. Development of gynogenetic eggs in the mouse: implications for parthenogenetic embryos. Science 222, 1034-6.

78. Tateno H., Kamiguchi Y. 1997. Parthenogenetic activation of Chinese hamster oocytes by chemical stimuli and its cytogenetic evaluation. Mol Reprod Dev 47, 72-8.

79. Tilghman S. M. 1999. The sins of the fathers and mothers: genomic imprinting in mammalian development. Cell 96, 185-93.

80. Tomioka I., Mizutani E., Yoshida T., Sugawara A., Inai K., Sasada H., Sato E. 2007. Spindle formation and microtubule organization during first division in reconstructed rat embryos produced by somatic cell nuclear transfer. J. Reprod. Dev. 53, 835-42.

81. Trembiay K. D., Saam J. R., Ingram R. S., Tilghman S. M., Bartolomei M. S. 1995. A paternal-specific methylation imprint marks the alleles of the mouse H19 gene. Nat Genet 9, 407-13.

82. Turker M. S. 1999. The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells. Semin Cancer Biol 9, 329-37.

83. Wakayama T., Perry A. C., Zuccotti M., Johnson K. R., Yanagimachi R. 1998. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-74.

84. Willadsen S. M. 1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320, 63-5.

85. Wilmut I., Schnieke A. E„ McWhir J., Kind A. J., Campbell K. H. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-3.

86. Yanagimachi R. 2002. Cloning: experience from the mouse and other animals. Mol Cell Endocrinol 187, 241-8.

87. Yin X. J., Kato Y., Tsunoda, Y. 2002a. Effect of enucleation procedures and maturation conditions on the development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells. Reproduction 124, 41-7.

88. Yin X. J., Tani T., Yonemura I., Kawakami M., Miyamoto K., Hasegawa R., Kato Y., Tsunoda Y. 2002b. Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes. Biol Reprod 67, 442-6.

89. Yoo J. G., Demers S. P., Lian L., Smith L. C. 2007. Developmental arrest and cytoskeletal anomalies of rat embryos reconstructed by somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells 9, 382-93.

90. Young L. E., Beaujean N. 2004. DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing stories of the mouse and sheep. Anim Reprod Sci 82-83, 61-78.

91. Zaitseva I., Zaitsev S., Alenina N., Bader M., Krivokharchenko, A. 2007. Dynamics of DNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev.

92. Zernicka-Goetz M. 1991. Spontaneous and induced activation of rat oocytes. Mol Reprod Dev 28, 169-76.

93. Zernicka-Goetz M., KubiakJ. Z., Antony C., Maro B. 1993. Cytoskeletal organization of rat oocytes during metaphase II arrest and following abortive activation: a study by confocal laser scanning microscopy. Mol Reprod Dev 35, 165-75.

94. Zhou Q., Renard J. P., Le Friec G., Brochard V., Beaujean N., Cherifi Y., Fraichard A., CozziJ. 2003. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302, 1179.

95. Zhu J., Telfer E. £., Fletcher J., Springbett A., Dobrinsky J. R., De Sousa P. A., Wilmut I. 2002. Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes. Biol Reprod 66, 635-41.

Информация о работе

Зайцева, Юлия Анатольевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы