Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ проявления гена fused (Fu) у химерных мышей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ проявления гена fused (Fu) у химерных мышей"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ

е=Х О

СП

ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

ио

со

На правах рукописи УДК 575.224

РЕДИНА Ольга Евгеньевна

АНАЛИЗ ПРОЯВЛЕНИЯ ГЕНА fused (Fu) У ХИМЕРНЫХ МЫШЕИ

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН В.И.Евсиков

Институт систематики и экологии животных СО РАН, г.Новосибирск

кандидат биологических наук, И.А. Серова

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учревдение: Институт общей генетики

им. Н: И. Вавилова РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится 1995 года на

и^ГТчЛ-г^С'С^х/ заседании диссертационного совета по защите дассертаций на соискание ученой степени доктора наук Д -002.11.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан " ¿Х^у^^с^-У 1995 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Настоящая работа явилась логическим продолжением ранее проведенных работ по изучению мутации fused (Fu). Было показано, что мутантный ген Ри обладает неполной пенетрантностыо, варьирующей экспрессивностью (Reed, 1937). Пенетрантность гена Fu зависит от генетического фона и от направления скрещивания (частота проявления гена Ри материнского происхождения, как правило, ниже частоты проявления гена Ри отцовского происхождения). Было показано, что линия мышей C57BL/6 имеет доминантный ген-супрессор, который оказывает сильное действие на проявление гена Ри после оплодотворения (Рувинский, Агульнин, 1990).

В настоящей работе выбор метода получения химерных мышей позволял изучать закономерности формирования фенотипа особи при взаимодействий мутантного гена Fu и гена-супрессора из линии мышей C57BL/6 после 8-клеточной стадии развития.

Химерных животных получают в результате агрегации двух синхронно развивающихся эмбрионов разного генотипа. Для получения большого количества синхронно развивающихся зародышей часто используются экзогенные гонадотропные гормоны. Индуцированная овуляция ооцитов происходит через 2,5 суток после первой инъекции. Из ранее проводимых исследований известно, что инъекция гидрокортизона самцам, несущим мутацию Ри, за 2-3 дня до оплодотворения приводила к достоверному снижению пенетрантности гена Ри в потомстве (Беляев и др., 1983).

Цели и задачи исследования.

Главная цель работы состояла в проведении анализа фенотипического проявления доминантной мутации fused (Fu), при взаимодействии с геном-супрессором данной мутации, которое осуществлялось после оплодотворения. Такая возможность могла быть реализована с помощью химерных животных. Для получения химерных животных была использована суперовуляторная обработка самок. В контрольном скрещивании было обнаружено достоверное снижение пенетрантности мутации fused после введения гонадотропных гормонов. Поэтому был проведен дополнительный анализ по выяснению возможных

механизмов влияния суперовуляции на раннее развитие эмбрионов.

Таким образом, при выполнении данной работы перед нами стояли следующие конкретные задачи:

1) Получить химерных мышей, несущих мутацию fused (Fu) в одном компоненте и ген-супрессор данной мутации из линии C57BL/6 в другом компоненте.

2) Проанализировать характер фенотипического проявления мутации fused под действием гена-сулрессора, резко сникающего пенетрантность гена fusel (Fu) при гибридизации.

3) Определить возможные причины изменения пенетрантности мутации fused под действием экзогенных гормонов, используемых для вызывания индуцированной овуляции.

Научная новизна и практическая ценность.

1) Получены химерные мыши, несуще мутацию fused (Fu) в одном компоненте и ген-супрессор данной мутации в другом компоненте.

2) Показано, что ген-супрессор не оказывает влияние на пенетрантность мутации fused у химерных мышей, или фенотипическое проявление мутации Fu определяется на очень ранних стадиях развития - до 8-клеточной стадии.

3) Показано, что присутствие клеток нормального генотипа C57BL/6 не оказывает влияние на экспрессивность мутации Fu.

4) Отмечено достоверное снижение пенетрантности мутации Fu под действием гонадотропных гормонов при индукции суперовуляции.

5) Проведен первый этап анализа возможных причин снижения пенетрантности мутации Fu при использовании гонадотропных гормонов.

Основные результаты были получены автором самостоятельно. Получение химер проводилось совместно с А.И.Железовой и А.Н.Голубицей. Работа выполнена в лаборатории генетики животных (зав.лабораторией д.б.н. А.О.Рувинский) и в секторе генетики мейоза (зав.лабораторией д.б.н. П.М.Бородин) ЙЩГ СО РАН.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных журналах. Материалы

г

диссертации докладывались на 9-ом международном совещанзш по молекулярной генетике мыши, Эдинбург (Великобритания), 1994; на ежегодной конференции Отделения генетики Иельского Университета, Вудс Холл (США), 1994; на отчетной сессии ИЦиГ СО АН СССР, 1991; на межлабораторном семинаре по генетике животных в Институте Цитологии и Генетики СО РАН;

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 265 наименований. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, иллюстрирована II рисунками и содержит 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении формулируются предпосылки и основные задачи исследования. Обзор литературы посвящен вопросам, касающимся мутаций ' 17 хромосомы мыши, гормональных воздействий на формирование фенотипа животных, геномного импринтинга и исследований химерных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовали половозрелых мышей коллекционного фонда лаборатории экспериментальных животных ИЦИГ СО РАН: DD/Helcgn. (далее DD), белые (о,о); C57BL/6JYlcgn (далее вб), черные (a,a); TFN , гомозиготные по гену tufted (tf/tf), черные (а,а); мутация проявляется в виде характерного облысения в возрасте'4-6 недель; мыши из стока Rbl Fu tf/Rbl Fu tf -гомозиготные по Робертсоновской транслокации иы (Rb(8,l7)llem) и по генам Pu, tx, белые (с,о). В качестве самок-реципиентов использовали беспородных мышей.

Получение агрегационных химерных мышей проводилось по стандартной методике (Mintz, 1971). Для получения большого количества зародышей, находящихся на одной стадии развития, самкам вводили 5 i.u. ГСЖК (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл) и через 48 часов - 5 i.u. ЧХГ (человеческий хорионический гонадотропин).

Использовали скрещивания: I) ^ +/+- (DD) х ¿ri ны Fu tf/ Rb1 Fu tf; 2) Rb1 Fu tf / Rb1 Fu tf x dcf +/+ (DD); И

3) ^ Вб х ¿с/ Вб.

8-клеточные эмбрионы из скрещивания (I) или (2) агрегировали с эмбрионами из скрещивания (3). После культивирования в течение 24 часов образовавшиеся морулы и бластоцисты трансплантировали псевдобеременньм самкам-реципиентам. Эти самки спаривались с вазъэктомированными самцами на сутки позже, чем самки-доноры.

У химер визуально определяли фенотип Fused при рождении и процент химеризма по шкурке - на 7-10 день развития мышей. Двухцветные мыши считались истинными химерами, одноцветные -однокомпонентными. Препараты костного мозга самца JC39, представлявшего особый интерес, изготовляли по стандартной методике (Макаров, Сафронов, 1973), препараты окрашивали С-методом (Sumner, 1972). РоОертсоновская транслокация Rb(8.i7)llem (Rbi) использовалась как цитологический маркер клеток мугантного генотипа (йы Fu tf/+ + +).

Были проведены слэдущие контрольные скрещивания:

+/+(DD) х Rbi Fu tf / Rbi Fu tf - с естественной и индуцированной овуляцией; 2) ^ Rbi Fu tf / Rbi Fu tf z tf(f(DD).

Ксслбдование влияния гонадотропных гормонов на раннее развитие зародышей проводили на линии мышей DD/Helogn. ГСЖ вводили в установленные стадии астрального цикла самок: в проэструсе, эструсе, метэструсе, и диэструсе.

После введения ЧХГ самки ссаживались с самцами линии DD. Утром следующего дня самок без вагинальных пробок забивали методом смещения шейных позвонков. Самок с вагинальными пробками забивали на 3-ий день (день покрытия - 1-ый день). Яйцеводы промывали средой 199. Яйцеклетки освобождали от фолликулярных клеток с помощью гиалуронидазы. Ооциты классифицировались по наличию клеток кумулиса. Среди ооцитов, имевших клетки кумулюса, отдельно подсчитывали количество фрагментированных ооцитов, со сформированным полярным тельцем, с формирующимся полярным тельцем и ооциты без полярного тельца. Нормально развивающимися на 3-ий день считали зародыши, имеющие к этому времени 4 и более бластомеров. Контрольную группу животных составили самки со

спонтанной овуляцией.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью 1;-критерия Стыодента, однофакторного дисперсионного анализа и метода 4-х-польных таблиц (Лакин,1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипическая характеристика химерных мышей

С эмбрионами линии В6 было агрегировано 512 эмбрионов из скрещивания ^ +/> (вб) х осС ны Ри tf/RM Ри а и 324 эмбриона из скрещивания ^ ЙЬ1 ^ ^Г/ЯЫ Ри tf х +/+ (ВБ).

Было получено 28 особей: 20 двухкомпонентных химер, 5 однокомпонентных белых и I черная мышь от агрегации эмбрионов из скрещивания зд +/+- (БВ) х ¿с/ т>1 Ри tf/Rb1 Ри а с эмбрионами линии вб и 2 химеры с материнским происхождением гена Ри (Табл.1). У истинных химер представленность белого (и черного) компонента варьировала от I до 95%. Такая симметричность распределения химер по окраске указывает на то, что после попадания клеток обоих компонентов во внутреннюю клеточную массу, селективного преимущества какого-либо из компонентов не наблюдалось.

Все достигшие половой зрелости химеры скрещивались с линией мышей три. Количество потомков серой окраски, происходящих из клеток мутантного генотипа (319 особей), резко превосходило число черных потомков (34 особей). Причинами этого могли быть как влияния случайных факторов, так как не от всех химер получено достаточно многочисленное потомство, так и половой химеризм (хх/хт). Можно предполагать также некоторое селективное преимущество клеток мутантного компонента ' в гонадах химерных животных, так как у химер клетки разных генотипов могут обладать разной конкурентной способностью.

При скрещивании с мытами линии оты смешанных пометов обнаружено не было. Однако, у нас нет оснований отрицать принципиальную возможность появления смешанного потомства у химер, полученных в наших опытах, так как в скрещивании химер между собой (самки .141 с самцом КвЭ) был получен помет, состоящий из 5 серых и 2 черных мышей.

Таблица I. Фенотипическая характеристика химерных мышей и их потомков р. полученных при скрещивании с мшат, линии tfn

¿f

Rb1 Pu tf Rb1 Pu tf

) <—> б6

ЮЛ лмер особи окраска, % белого фенотип химер число потомков

черных серых (из белого компонента

1 2 3 4 5 6

27 100 Pu strong 0 6

tf 28 95 Pu mid стерильный

<f 24 90 N 0 103

<f 17 70 Pu strong 0 15

<f 16 50 Pu strong 4 0

tf 21 50 Fu mid стерильный

tf* 10 50 Pu mid

tf tt* tf%% 42 11 26 30 15 5 Pu mid N Pu mid стерильный I 3

tf 39 1 Pu raid 30

% 30 100 N 0 24

? 31 100 N 0 36

? 36 100 К 0 20

4% 37 100 Fu weak 0 28

12 95 Pu mid

* ? 13 90 К

? 23 90 N 0 35

¥ 41 60 Pu weak

? 25 50 N 0 70

29 50 Fu strong 0 27

¥ 14 50 Pu raid

22 10 Pu strong 0 19

¥ 15 10 N

16 5 N

¥ 40 0 N 38

Таблица I

продолжение

<¥? яя-йтг * " т №»<-> вб

1 2 3 4. 5 6

? 32 60 Fu strong 0 22

? 33 95 Fu weak 0 28

Примечание: »- животные не достигли репродуктивного возраста;

**- животные погибли в возрасте 2 дней, цвет не был определен;

Пенетрантность мутации Fu

Из 20 химер +/+ (DD) х i/c/ Rb1 Fu tf/Rb1 Fu tf )<—>Вб ген Fu проявился у 13 особей, т.е. пенетрантность гена Fu у химер составила 65%, что не отличалось достоверно от пенетрантности гена Fu в контрольной группе животных (53.5 %) (td= 1.1; р >0.05). Обе химерные самки Fu tf/RM Fu tf

z dc/ +/+ (DD)) <—> B6 имели фенотип Fu.

Нам не удалось обнаружить корреляцию между процентным содержанием клеток белого компонента (ны Fu tf / + + +) и пенетрантностыо гена Fu у химер. Фенотип fused был зарегистрирован у особей, состоящих преимущественно (на 90-99%) из клеток генотипа вб, т.е. не несущих мутацшо Fu. Наиболее информативным оказался анализ самой темной химеры -самца .¡§39. Химерный самец ,Ш9 имел хорошо выраженный фенотип fused и практически черную окраску (Рис.1). Лишь незначительная (~1%) доля его меланоцитов была непигментирована и происходила от белого компонента. Анализ костного мозга показал, что клетки с Rbi и без Rbi тлели Y-хромосому, следовательно, самец $39 имел набор половых хромосом ху/ху и клетки обоих компонентов должны были участвовать в размножении. От самца й39 было получено 30 потомков, все они тлели черную окраску. Это значит, что герминативный эпителий в гонадах самца ШЭ состоял преимущественно из клеток черного компонента. Анализ костного мозга показал, что только 5 из 294 метафазных пластинок имели

RM, которая являлась цитологическим маркером клеток белого компонента. Следовательно, костный мозг самца Я69 содержал 1.5-2% клеток генотипа Rbl Fu tf/+ .+

Данные по пенетрантности гена Ри у химер, а также тот факт, что проявление фенотипа fused не зависело от процентного содержания клеток мутантного генотипа позволяет предполагать отсутствие влияния гена-супрессора на проявление гена Ри у химерных особей.

Возникает вопрос о механизме формирования фенотипа fused у химер, тлеющих преимущественно черную окраску. При анализе химерного самца № 39 была получена хорошая корреляция процентных соотношений клеток мутантного и нормального генотипов в шкурке, костном мозге и герминативном эпителии гонад. Эти производные разных зародышевых листков имели не более 2% клеток мутантного генотипа. Следовательно, предположения о том, что могут существовать значительные отличия в представленности мутантного (Rbl Pu tf/+ + +) и нормального (+/+ вб) компонентов в разных тканях (МоЬагеп, 1975), или о том, что клетки разных генотипов в химере могут быть специфически распределены (Moore, Mintz, 1972) и

Рисунок I. Химерный самец Ji 39

хордомезодерма самца Ж39 могла, быть сформирована в основном из клеток белой компоненты, маловероятны.

Еще одним объяснением формирования фенотипа Fu у химер, составленных преимущественно из клеток нормального генотипа, может быть тот факт, что каждый позвонок мыши формируется из 4 клонов клеток (Moore, Mintz, ' 1972). Следовательно, изгибы хвоста у .химер могут быть результатом присутствия лишь нескольких мутантных клеток, давших начало мутантным клонам, сформировавшим позвонки аномальной морфологии. Однако, практически у всех химер с проявленным геном Fu хвост был не только изогнут, но и укорочен, т.е. при морфогенезе несколько хвостовых позвонков не сформировались. Следовательно, для объяснения формирования фенотипа Fu и в данном случае необходимо предположить заметное влияние гена Fu.

Таким образом, наиболее вероятной моделью взаимоотношений между клетками мутантного и нормального генотипа может быть следующая: либо фенотипическое проявление гена Fu должно быть определено до'8-клеточной стадии развития эмбрионов; либо влияние гена супрессора из линии C57BL/6 на проявление фенотипа Fu может осуществляться только на внутриклеточном уровне; ген Fu же на межклеточном уровне может оказывать воздействие на клетки нормального генотипа, изменяя их фенотип.

Проявление мутации Fu у химер, составленных преимущественно из клеток нормального генотипа подтверждает результаты других авторов, ранее изучавших мутации гена Fu (Greenspan, O'Brien, 1986; Рувинский и др.,1990), О ТОМ, ЧТО мутация гена Fu не связана с потерей или гипофункцией нормального аллеля.

Экспрессивность нутации fused (Fu).

Варьирующая экспрессивность является- характерной чертой в проявлении мутации Fu. Экспрессивность гена Fu у химер сильно варьировала. Она характеризовалась как "сильная" при значительном искривлении и укорочении хвоста более, чем наполовину (Рис. 2а), "средняя", когда хвост составлял от 1/2 до 2/3 нормальной длины и имел более двух мест искривления (Рис. 2Ь) и "слабая", когда хвост был искривлен всего в 1-2

Рисунок 2. Экспрессивность мутации Ри у химер: а - сильная; ъ - средняя; о - мутация Ри не проявлена;

местах и шел практически нормальную длину. Фенотип химер считали "нормальным", если они имели хвост нормальной формы и длины (Рис. 2а).

Мы не обнаружили корреляции между экспрессивностью гена Ри и процентным содержанием белого (или черного) компонента у химер (Табл. I). Следовательно, можно предполагать, что ген-супрессор из линии С57ВЬ/б не оказывал влияния на степень проявления мутации Ри.

Причины вариабельности проявления гена Ри исследовались разными авторами, но не были определены. В последние годы при изучении экспрессии трансгенных локусов были найдены отличия в метилировании ДНК в соседних соматических клетках (МсСотеап et а1., 1989), что привело к развитию теории, объясняющей существование явлений неполной пенетрантности и варьирующей экспрессивности (Зар1епза, 1989).

При проведении контрольных наблюдений, оказалось, что в потомстве самок с индуцированной овуляцией пенетрантность гена Ри была существенно ниже, -чем в потомстве самок без гормональной стимуляции (Табл.2).

В ранее проведенных работах по изучению влияния экзогенных гормонов (гидрокортизона) на проявление гена Ри было показано, что период за 2-3 дня до оплодотворения является наиболее чувствительным в ходе сперматогенеза к

Таблица 2 Влияние суперовуляции на пенетрантность гена Ри

Число ис- Генотип Фенотип Пенетрантность

следованных родителей потомков гена Ри

самок (%)

Ри Иогта!

I

23 ББ

№1_Ри«

ЁБПчГТг

120

44 73,1

»

2

16 ББ

после суперовуляции

НЫ Ри и йЬТТйГТг

100

87

53,5

* - пенетрантность гена Ри достоверно ниже в скрещивании с использованием гонадотропных гормонов (1;й = 4; р < 0.001).

действию инъецируемого гормона (Беляев и др., 1983). Введение ГСЖК в нашем эксперименте проводилось за 3,5 дня до овуляции. Данные о том, что при суперовуляции пенетрантность гена Fu оказалась достоверно сниженной, могут указывать на то, что у самок этот период также является чувствительным к влиянию экзогенных гормонов-на созревание гамет.

Результаты изучения влияния гонадотропных гормонов на раннее развитие^дмбрионов ыыши

Для определения причин снижения пенетрантности мутации fused под действием гонадотропных гормонов был проведен эксперимент по определению различий в раннем развитии эмбрионов, овулировавших под действием гонадотропных гормонов и при естественной овуляции.

Мышам линии DD/Heicgn вводили ГСЖК в разные фазы эстрального цикла: в проэструсе, эструсе, метэструсе и диэструсе. Во всех случаях был получен высокий суперовуляторный ответ без достоверных различий в общем числе овулировавших ооцитов и 3-дневных зародышей. Известно, что общее количество больших фолликулов (преантральные, антральнае и преовуляторные ) в яичнике примерно одинаково на всех стадиях эстрального цикла самок мышей. Эти фолликулы имеют полный набор рецепторов к фолликулостимулирующему гормону и при введении экзогенных препаратов, обладающих фолликулостимулирующей активностью, способны существенно ускорять свое развитие. Вероятно, это является причиной того, что обший суперовуляторный ответ на всех стадиях эстрального цикла был одинаков.

Анализ морфологии яйцеклеток

При введении ГСЖ на всех стадиях эстрального цикла были получены две группы ооцитов: без кумулюса и в кумулюсе. Ооциты без кумулюса, по-видимому овулировали значительно раньше, чем ооциты, имевшие клетки кумулюса. Вероятно, их овуляция происходила под действием ЛГ-активности вводимого ГСЖ. Группа ооцитов без кумулюса была представлена только фрагментирующимися ооцитами.

Ооциты, овулировавщие с клетками кумулюса имели разную морфологию: без полярного тельца, с формирующимся полярным

тельцем, со сформированным полярным тельцем и фрагментирувдиеся. В контрольной группе самок со спонтанной овуляцией практически все ооциты овулировали со сформированным полярным тельцем.

В нашем эксперименте наибольшее число ооцитов, овулировавших со сформированным полярным тельцем (т.е. синхронизированных с нормальной овуляцией) было получено при введении ГСЖК в эструсе (Табл. 3). Статистическая обработка полученных результатов показала наличие достоверной зависимости (Р < 0.05) между стадией астрального цикла самок при введении ГСЖК и числом ооцитов, овулировавших со сформированным полярным тельцем. Зависимости числа овулировавших ооцитов, отнесенных к другим морфологическим группам от стадии эстрального цикла самки при введении ГСЖК обнаружено не было.

Разная морфология ооцитов, имевших фолликулярные клетки, указывала на то, что под действием гонадотропных гормонов овулируют ооциты, находящиеся на разных стадиях развития (т.е. ооциты разного возраста). Известно, что возраст ооцитов оказывает существенное влияние на их способность к дальнейшему развитию. Таким образом, разные стадии развития суперовулированных ооцитов могут определять их способность к дальнейшему развитию.

Анализ развития 3-ех дневных зародышей показал, что высокий процент развивающихся зародышей был получен при обработке самок в проэструсе, эструсе и метэструсе. Введение ГСЖК самкам на стадии диэструса приводило к резкому увеличению числа аномально развивающихся эмбрионов (Табл.4).

Оценка достоверности различий между соотношениями Нормальные : Аномальные эмбрионы, полученными при введении ГСЖК в разные стадии эстрального цикла, была проведена методом четырехпольных таблиц. Полученные значения х2 на высоком уровне значимости (р < 0.001) подтвердили существование статистически достоверной разницы в парах проэструс-диэструс, эструс-диэструс и метэструс-диэструс. Дисперсионный анализ также подтвердил зависимость (Р < 0.05) появления аномальных эмбрионов от стадии эстрального цикла

Таблица 3. Морфология овулировавших ооцитов при введении ГСЖК взрослым самкам бв в разные стадии эстрального цикла

Стадии эстрального цикла

Число исследованных самок

Ч и с'л о ооцитов

без кумулюса (фрагментиро-ванные)

в

с е

куму

фрагмента- без полярного с формирую- со сформиро-рованные тельца щимся поляр- ванным полярным тельцем ным тельцем

Эструс

Метэструс

Диэструс

Проэструс

Контроль

10 11 15 9 10

2.9 + 1-5 3.5 +.1.0 2.4 + 0.8 5.3 + 1.4 О

4.0 + 0.6 7.0 + 1.5 7.4 ± 1.2 5.4 ± 1.3 О

8.8 + 3-5

8.9 + 1.4 9.3 + 1.3

13.9 + 4.4 0.8 + 0.4

18.7 + 5.4

13.9 + 2.5

14-2 + 2.0

13.3 + 0.5

0.1 + 0.09

19.7 + 6.2 8.2 + 2.0 8.2 ± 1.8

9.0 + 0.4 6.3 + 0.86

* - число ооцитов со сформированным полярным тельцем зависит от стадии эстрального цикла при введении ГСЖК (Р=3.3; РС0.05);

Таблица 4. Развитие 3-х дневных зародышей при введении взрослым самкам ББ в разные стадии астрального цикла

Стадии Число Эмбрионы с Эмбрионы с Доля

эстрально- исследован- нормальным аномальным, аномальных го цикла ных самок развитием развитием эмбрионов

Эструс Метэструс Диэструс Проэструс

11 б 10 12

35.7 + 8.5 32.6 + 3.9 23.0 + 2.2 32.5 + 3.6

14.3 + 2.2 11.0 + 1.0 21.0 + 2.8 13.2 + 2.3

0.2В ± 0.06 0.27 + 0.05 0.47 ± 0.05 0.28 + 0.06

* - число эмбрионов с аномальным развитием зависит от стадии эстрального цикла при введении ГОКК (F = 3.96; Р < о.05)

самок при введении ГСЖК.

Сравнение количества нормально развивающихся 3-ех дневных зародышей с количеством овулировавших ооцитов показало, что ооциты разной морфологии (со сфоргзфовакным полярным тельцем, с формирующимся полярным тельцем и без полярного тельца) могут успешно развиваться.

Полученные данные показывают, что дальнейшее изучегте влияния гонадотропинов на проявление мутации Ри следует проводить с учетом стадии эстрального цикла самок и с учетом морфологии овулирующих ооцитов.

ВЫВОДЫ

1) Впервые получены химерные мыши, несущие мутацию fused (Fu) в одном компоненте и ген-супрессор данной мутации в другом компоненте.

2) Показано, что ген-супрессор не может оказывать влияние на пенетрантность мутации fused ■ у химерных мышей, либо проявление мутации Fu определяется до 8-клеточной стадии развития эмбриона.

3) Показано, что присутствие клеток нормального генотипа C57BL/6 не оказывало влияния на экспрессивность мутации fused.

4) Впервые показано, что введение гонадотропных гормонов

самкам может оказывать влияние на фенотипическое проявление мутации fused (Fu).

5) Анализ раннего развития зародышей под действием гонадотропных гормонов позволил получить данные, необходимые для дальнейших экспериментов по установлению стадии развития ооцита, на которой ген Ри наиболее чувствителен к введению экзогенных гормонов.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации:

1. Редина О.Е., Амстиславский С.Я., Максимовский Л.Ф., Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Суперовуляция у двух видов лабораторных животных при введении им ГСЖК в разные фазы астрального цикла// Сиб.Биол.Журнал. 1992. №2. С.24-28.

2. Редина О.Е., Железова А.И., Голубица А.Н., Агульник А.И., Рувинский А.О. Анализ химерных мышей, несущих мутацию Fused //Генетика. 1993. Т.29. J§8. C.I320-I327.

3. Redina О.Е., Zhelesova A.I., Golubitsa A.N., Agulnik A.I., Ruvinsky A.O. Phenotypic expression of the fused ( Pu) gene in chimaeric mice//Genet.Res. 1994. Y.63. P.183-187.

4. Redina O.E., Zhelezova A.I., Golubitsa. A.N., Agulnik A.I., Ruvinsky A.O. Penetrance and expressivity of the fused gene in chimaeric mice// Ninth International Workshop "Molecular genetics in the mouse", Edinburgh, 1994. P.58.

5. Redina O.E., Amstislavsky S.Ya., Maksimovsky L.P. Induction of superovulation in DD mice at different stages of the oestrous cycle// J.Reprod.Pert. 1994. V.102. N 2. P.263-267.