Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия генов химерных антител в эукариотических клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов химерных антител в эукариотических клетках"

г>-

т

2? >_и см

I

На правах рукописи

РАДЬКО БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ХИМЕРНЫХ АНТИТЕЛ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

03.00.03-Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетической иммунологии Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН, заведующий лабораторией профессор О.Л. Поляновский.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук С.М. Дсев

доктор биологических наук, профессор О.Л. Поляновский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А.Г. Габибов

доктор биологических наук, профессор Б.Б. Дзантиев

совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биологии гена РАН

Защита состоится

1997 г. в чао

часов на заседании диссертационного

Автореферат разослан '

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

стуалмюсть проблемы.

Прогресс в изучении генов иммуноглобулинов и регуляторных элементов, инимающих участие в их экспрессии, обусловил возможность конструирования спрессионных систем, позволяющих как исследовать отдельные элементы акционирования генов антител, так и проводить биосинтез полноразмерной 1лекулы антитела или же ее частей. Создание таких систем позволило энструировать in vitro неприродные антитела, имеющие как фундаментальное к и прикладное значение (Morrison, 1992; Norderhaug, 1997; Owens, 1994). Одной

интенсивно развивающихся областей молекулярной биологии является лучение, исследование экспрессии и свойств так называемых химерных антител, есть антител, вариабельная часть которых, как правило, имеет мышиное, а нстантная - человеческое происхождение. Совмещение в одной молекуле двух шх частей изначально было обусловлено потребностью в антителах для агностических и лечебных целей. Получение химерных антител позволяет лучше нять процессы экспрессии иммуноглобулиновых генов, а также структурно-нкциональные взаимодействия, существующие в молекуле антитела.

Химерные антитела получают в клетках эукариот, так как именно в сариотических клетках происходит гликозшшрование молекулы, корректное эрачивание (фолдинг) полипептидной цепи и образование дисульфидных свя-i, процессы, столь необходимые для сохранения и выполнения антигенсвязы-ощих и эффекторных функций антител. Прокариотические системы экспрессии обеспечивают такого посттрансляционногс процессинга молекулы.

В лимфоидных клетках имеется специальный аппарат транскрипции муноглобулиновых генов, включающий в себя транс-действующие белковые кторы, взаимодействующие с промоторами и энхансерами генов муноглобулинов, что представляет основу для экспрессии этих генов. В то же ;мя возрастающий интерес к получению рекомбинантных антител стимулирует иск новых систем экспрессии иммуноглобулиновых генов. Представляется гересным изучение экспрессии иммуноглобулиновых генов в лимфоидных и шмфоидных клетках под контролем вирусных промоторов: промотора РНК-иимеразы бактериофага Т7 и промотора цитомегаловируса человека (hCMV).

При экспрессии химерных (мышь/человек) антител внимание привлекают следующие вопросы. Во-первых, при конструировании плазмид необходимо учесть всю информацию по регуляторамм элементам иммуноглобулиновых генов, обеспечивающих их экспрессию в клетках лимфоидного и нелимфоидного ряда, а именно: наличие и функционирование промоторов и энхансеров генов, сайтов сплайсинга и сайтов полиаденилирования мРНК, а также лидерных пептидов, обеспечивающих транспорт синтезированных полипептидных цепей в вакуоли цитоплазматического ретикулюма клетки. Во-вторых, представляет интерес изучение и сравнение секреции химерных (мышь/человек) антител в лимфоидных и нелимфоидных клетках. В-третьих, актуально наличие функциональной активности химерных антител, определяемой взаимодействием константных доменов иммуноглобулинов человека с вариабельными доменами мышиных антител. В-четвертых, в случае бицистрошюй транскрипции тандема генов химерных антител с промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 встает вопрос о механизме трансляции транскрибированной РНК.

Задачи и цели исследования.

Целью данной работы являлось конструирование плазмид, несущи? рекомбинантные гены химерных (мышь/человек) антител против трансферринг свиньи под контролем промотора цитомегаловируса человека (ЬСМУ) ^ промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, экспрессия генов химерны; антител в лимфоидных (5Р2/0) и нелимфоидных (СНО) клетках, изучение секрецга химерных антител, продуцируемых клетками БР2/0 и СНО, а также анали: антигенсвязывающей активности полученных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Сконструированы плазмиды, несущие рекомбинантные гены химерны, (мышь/человек) антител против трансферрина свиньи под контролем промотор; цитомегаловируса человека (ЬСМУ) и промотора РНК-полимеразы бактериофаг Т7. Для экспрессии иммуноглобулиновых генов в эукариотических клетка промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 использован впервые. В результат трансфекции получены клоны клеток-продуцентов, стабильно интегрировавших

геном и экспрессирующих гены химерных антител на основе лимфоидных (SP2/0) и нелимфоидных (СНО) клеток.

Впервые получена полицистронная экспрессия тандема генов химерных антител под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, обеспечивающая сбалансированный синтез легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов. Предложена гипотеза, описывающая возможный механизм грансляции полицисгронной мРНК. Экспрессия под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7 может быть использована в других случаях, где требуется сбалансированный синтез двух полипептидных продуктов. Показано, что уровень секреции экспрессированных антител зависит от типа клеток.

В работе экспрессированы химерные (мышь/человек) антитела изотопа Е. Известно, что антитела IgE играют исключительно важную роль в иммунологических реакциях организма. Полученные химерные антитела изотипа Е могут представлять потенциальную ценность при изучении процессов аллергии.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на:

11-ой конференции Европейской Федерации иммунологических обществ, Хельсинки, Финляндия, 1991);

8-ом Международном Конгрессе иммунологов (Будапешт, Венгрия, 1992); Российско-американской конференции "Catalytic antibodies and antibody ¡ngineering" (Москва, 1993);

на ежегодной Итоговой конференции Института молекулярной биологии ш.В.А.Энгельгардта РАН (в рамках этой конференции на конкурсе научных работ Института среди фундаментальных работ -1 место) (15-16 февраля 1994 г.);

12-ой Европейской конференции по иммунологии (Барселона, Испания,

1994);

Российско-германской конференции по молекулярной биологии (Кельн, РРГ, 1995).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка сокращений и ¡писка литературы. Она изложена на 121 странице, содержит 14 рисунков и фотографий, 7 таблиц и 267 библиографических источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Ранее в лаборатории молекулярно-генетической иммунологии были клонированы экспрессирующиеся в мышиной гибридоме PTF.02 вариабельные гены антител против трансферрина свиньи (Аджалов, 1987; Urakov, 1989). Вариабельные гены легкой и тяжелой цепи (каждый) имеют по два экзона, кодирующих лидерный пептид и вариабельный домен легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов, соответственно. Перед обоими генами в промоторной зоне были найдены ТАТА-боксы, а также октануклеотидные последовательности, придающие тканеспецифичный характер экспрессии иммуноглобулиновых генов. В генах легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов сохранены нативные сайты сплайсинга РНК, способствующие нормальному прохождению процессинга РНК. Клоны, содержащие константные гены легких (k-типа) (Hieter, 1980) и тяжелых (с-типа) (Flanagan, 1982) цепей, получены из генома человека.

На основе этих структурных элементов в настоящей работе были сконструированы экспрессионные плазмиды, в которых рекомбииантные гены иммуноглобулинов находятся под контролем гетерологичных промоторов.

Создание рекомбинантных плазмид. содержащих гены химерных антител. Конструирование плазмид. содержащих иммуноглобулиновые гены под контролем промотора цитомегаловируса человека (hCMV).

При конструировании плазмид, содержащих гены иммуноглобулинов под контролем цитомегаловирусного промотора было предусмотрено создание таких генетических конструкций, которые бы позволяли оптимальным образом провести отбор клеток-продуцентов после трансфекции. Именно по этой причине ген устойчивости к пуромицину был клонирован в плазмиду, имеющую ген легкой цепи иммуноглобулинов. Это было сделано для того, чтобы отбор клеток-продуцентов с помощью имеющегося иммуноферментного набора по определению тяжелой цепи s-типа иммуноглобулинов человека вести среди клеток, которые выжили в пуромицин-содержащей среде и несут в своем геноме встроенный ген легкой цепи иммуноглобулинов к-типа.

УЬ Се

\к Ск

Рис.1. Структура сконструированных в работе плазмвд. Плазмиды несут рекомбинантные иммуноглобулиновые гены под контролем промотора цитомегаловируса человека (СМУ) и промотора бактериофага Т7 (Т7). Ук, VII-вариабельные гены антител мыши, Ск и Се- константные гены антител человека.

На основе плазмиды pUC.pur была получена плазмида pUC.pur.CMV.VkCk (рис.1). Плазмида pUC.pur получена генно-инженерными манипуляциями из плазмиды pPACl (Laccale, 1989) и несет в себе ген N-ацетилтрансферазы из Streptomyces alboniger, придающей клеткам млекопитающих при трансфекции устойчивость к пуромицину. На основе плазмиды pUC19 была создана плазмида pUC.CMV.VhCe, в которой вариабельный ген тяжелой цепи иммуноглобулинов мыши сочленен с константным геном тяжелой цепи е-типа иммуноглобулинов человека (рис.1). На рис.2 приведена нуклеотидная последовательность области энхансера/промотора цитомегаловируса человека (hCMV) и У-конца Vh-гена тяжелой цепи иммуноглобулинов из плазмиды pUC.CMV.VhCe.

При клонировании описанных выше плазмид использовались клетки E.coli штамма JM103. Правильность клонирования проверялась секвенированием полученных плазмид со стороны промотора цитомегаловируса человека (hCMV).

Конструирование плазмиды. содержащей тандем иммуноглобудиновых генов под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7.

На основе плазмиды pGEMl была сконструирована плазмида рЮ.бек, несущая тандем рекомбинантных иммуноглобудиновых генов под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (рис.1). В этой плазмиде вариабельные гены легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов мыши сочленены с константными генами легкой (k-типа) и тяжелой (е-типа) цепей иммуноглобулинов человека. На рис.3 приведена нуклеотидная последовательность области промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 и 5-конца Vh-гена тяжелой цепи иммуноглобулинов из плазмиды рЮ.бек. При клонировании плазмиды рЮ.бек использовали клетки E.coli штамма DH5a.

Трансакция лимфоидных (SP2/0') и нелимфоидных (СНО*) клеток. Отбор клонов-продуцентов.

Плазмиды выделяли в количестве 0,5-2 мг и очищали ультрацентрифугированием в градиенте концентрации хлористого цезия.

, p(JC19 Eco RI _> энхансер

ATGACCATGA ТТАСЙААТТБ GCfcTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGA

CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT ATTACCATGG TGATG

CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTC

энхансер _

CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTTTGTTTTJG GCACCAAAAT CAACG

GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCATTGACGC AATGGGCGGT AGGCG _+1 .-► +23 Vh-ген

TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAA

i ■ i ► 1 v i i

;C^.GAGC TCjGGTACCCjC TAGATGTGTT TCCTG

SacX

TGATTTCTAA AGTCTTATTG CTCTCTTATT GGAGACTCAC ACTATAGGAA GCCAG

AGACCATGAT GGTCTTACTT TAATAACCAA GGGCATTCAT TATTTACCTT CCCAA

* окта

ATTATGAAGG CTGGGCTGTC CTGCATGCAA ATGCTTCTAA CTCTAAGTTA AATCC

CCTCT TGGGGTGTGA AAGCTCACAT CTCTCTCATT AGAGGTTGAT CTTTGAGGAA

Met lys Val leu leu Ser leu Tyr Leu Leu AACAGGGTGT TGCCTAAAGG ATG AAA GTG TTG AGT CTG TTG TAC CTG TTG Thr Ala He Pro Gly *

АСА GCC ATT CCT GGT GAGTGTTGAT ATTTCATACA TGTACCATGA GGGTTTTTCA

lie Leu Ser Thr

AAACGTGTGA TTGACCAAAA TGGCCCTTCT TTTCTGAAGG T АТС CTG TCT ACT

Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ser

GTA CAG CTT CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTC GTG AAA CCT TCT CAG TCT

Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Phe Ser He Thr Ser Gly Tyr

CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GAC TTC TCC АТС ACC AGT GGT TAT

Tyr Trp His Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met

TAC TGG CAC TGG АТС CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG

Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

GGC TAC ATA AGT TAC GAC GGT AGT AAT GGA TAC AAC CCC TCT CTC AAA

Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu

AAT CGA АТС TCC АТС ACT CGT GAC АСА TCT AAG AAC CAG TTT TTC CTG

Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr

AAG TTG AAT TCT GTG ACT ACT GAG GAC АСА GCC АСА TAT TAC TGT АСА

Рис.2. Структура области энхансер а/промотора цитомегаловируса человека (hCMV) и У-конец Vh-гена тяжелой цепи из плазмиды pUC.CMV.VhCc. Границы энхансера и начало Vh-гена указаны стрелками. Выделен предполагаемый ТАТА-бокс. Сайт начала транскрипции в геноме цитомегаловируса человека имеет позицию (+23), если первому нуклеотиду после ТАТА-бокса (нуклеотид G) присвоить номер (+1). Показана 5/-нетранслируемая область Vh-гена, а также экзон 1 (аминокислоты) и начало экзона 2 (аминокислоты). Указаны ATG-сайты в 5'-нетранслируемой области Vh-гена. Сайты рестрикции EcoRI и SacI - из полилинкера плазмиды pUC19.

Для трансфекции использовались мышиные миеломные клетки SP2/0 и клетки яичника хомячка СНО. Плазмидой рЮ.бек с тандемом генов под контролем промотора Т7 РНК-полимеразы трансфицировали клетки SP2/0(T7) и СНО 185, содержащие в своем геноме модифицированный ген РНК-полимеразы фага Т7 (Lieber, 1989) и стабильно экспрессирующие эту полимеразу. Модификация заключается в замене N-концевой части синтетической нуклеотидной последовательностью, кодирующей 124-133 аминокислоты большого Т-антигена вируса SV40. Эта последовательность является сигналом для ядерной локализации белка и позволяет модифицированной полимеразе эффективно проникать из цитоплазмы в ядро и обеспечивать там транскрипцию под контролем Т7 промотора.

Плазмидами pTJC.CMV.VhCE и pUC.pur.CMV.VkCk трансфицировали обычные клетки СНО. Для трансфекции клеток линий СНО и СНО 185 применяли кальций-фосфатный метод.

Плазмиду рЮ.бек трансфицировали совместно с плазмидой pSV2neo, несущей ген устойчивости к генетицину (G418), то есть проводили котрансфекцшо. Соотношение ДНК рЮ.бек к pSV2neo было 50:1. Для трансфекции клеток CHOI 85 во флаконе объемом 50 мл (конфлюэнтность 3040%) брали около 6 мкг ДНК плазмиды рЮ.бек. В случае плазмид с цитомегаловирусным промотором котрансфекция проводилась плазмидами pUC.CMV.VhCe и pUC.pur.CMV.VkCk в эквимолярной концентрации. Количество ДНК обеих плазмид для клеток, растущих во флаконе объемом 50 мл (конфлюэнтность 30-40%) также было около 6 мкг.

При трансфекции плазмидой рЮ.бек клеток CHOI 85 с одной чашки Петри получалось 20-40 клонов, что ниже ожидаемого количества (примерно 50) для линеаризованной ДНК. Так как данная ДНК для трансфекции бралась в суперспирализованном состоянии (из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции в незначащих областях), полученные результаты можно считать достаточно хорошими. При трансфекции плазмидами pUC.CMV.VhCs и pUC.pur.CMV.VkCk, которая проводилась в чашках Петри, образовывалось немного более клонов (около 40), а всего было получено примерно по 80 клонов в каждом случае (под CMV- и Т7-промоторами).

Т7-промотор TGTAATACGACT

_к Vh-ген

С TAGATGTGTT TCCTG

Сайт инициации транскрипции CACTATÄGGG CGAATTCGAG CTÇGGTACCC GGGGATCC

1 1 EcoRI Kpnl 1 BamHÎ

TGATTTCTAA AGTCTTATTG CTCTCTTATT GGAGACTCAC ACTATAGGAA GCCAG

AGACCATGAT GGTCTTACTT TAATAACCAA GGGCATTCAT TATTTACCTT CCCAA

окта

ATTATGAAGG CTGGGCTGTC CTGCATGCAA ATGCTTCTAA CTCTAAGTTA AATCC

CCTCT TGGGGTGTGA AAGCTCACAT CTCTCTCATT AGAGGTTGAT CTTTGAGGAA

Met lys Val leu leu Ser leu Туг Leu Leu AACAGGGTGT TGCCTAAAGG ATG AAA GTG TTG AGT CTG TTG TAC CTG TTG Thr Ala Ile Pro Gly *

ACA GCC ATT CCT GGT GAGTGTTGAT ATTTCATACA TGTACCATGA GGGTTTTTCA

Ile Leu Ser Thr

AAACGTGTGA TTGACCAAAA TGGCCCTTCT TTTCTGAAGG T АТС CTG TCT ACT Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ser GTA CAG CTT CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTC GTG AAA CCT TCT CAG TCT Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Phe Ser Ile Thr Ser Gly Туг CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GAC TTC ТСС АТС ACC AGT GGT TAT Tyr Trp His Trp Ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met TAC TGG CAC TGG АТС CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys GGC TAC ATA AGT TAC GAC GGT AGT AAT GGA TAC AAC CCC TCT CTC AAA Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu AAT CGA АТС ТСС АТС ACT CGT GAC АСА TCT AAG AAC CAG TTT TTC CTG Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr AAG TTG AAT TCT GTG ACT ACT GAG GAC АСА GCC АСА TAT TAC TGT АСА

Рис.3. Структура области промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 и У-конец Vh-гена тяжелой цепи из плазмиды pIG.éek. Стрелками указаны Т7-промотор и сайт инициации транскрипции. Показана 5'-нетранслируемая область Vh-гена, а также экзон 1 (аминокислоты) и начало экзона 2 (аминокислоты). Начало Vh-гена указано стрелкой. Подчеркнуты ATG-сайты в 5-нетранслируемой области Vh-гена. Сайты рестрикции Eco RI, Kpn I и BamHI - из полилинкера плазмиды pGEMl. Стрелкой указана последовательность консервативного октануклеотида.

В качестве контроля ставили трансфекцию клеток СНО плазмидой рСМУ.Ьас2. Проводили окрашивание клеток с помощью через 48 часов

(временная экспрессия). Интересно, что процент клеток, вовлеченных во временную экспрессию, был не менее 40%. Это является очень хорошим результатом, судя по описанию в литературе эффективности трансфекции, достигнутой с помощью этого метода.

Трансфекцию клеток 5Р2/0(Т7) проводили методом электропорации. Концентрация плазмидной ДНК при электропорации была 50 мкг/мл. Напряжение при электропорации - 400-450\\ продолжительность импульса -100 микросекунд, зазор между электродами в ячейке для электропорации - 4мм. Отбор клонов среди трансфицированных клеток БР2/0(Т7) вели путем рассева клеток на 96-луночных планшетах, с добавлением кондиционированной среды. Получено 30 клонов, экспрессирующих антитела.

Для полученных клонов как клеток 8Р2/0, так и СНО характерен различный уровень экспрессии для различных клонов. Это в полной мере согласуется с наблюдениями, полученными другими авторами (Ысиша^ег, 1990). В различных клонах клеток трансфицированная ДНК встраивается в различные места в хромосомы из-за случайного распределения сайтов интеграции. При экспрессии встроенных фрагментов ДНК сказывается так называемый "эффект положения". Кроме того, известно, что при трансфекции кальций-фосфатным способом в геном в одно место обычно встраивается несколько копий одного гена (6-12 копий). Копийность встроенного фрагмента ДНК, несомненно, также может влиять на уровень экспрессии трансфицированных генов. Кроме того, факт различного уровня экспрессии химерных антител, по крайней мере, для клеток СНО, можно объяснить допущением, что различные клоны несут в себе какую-то часть клеток, не экспрессирующих трансфицированные гены. Это тем более возможно, что были получены результаты, подтверждающие эту точку зрения (см.рис. 7). Для клеток БР2/0 такое объяснение маловероятно. Клоны трансфицированных клеток БР2/0 являются моноклонами, так как отдельные клоны на 96-луночных планшетах выросли с частотой 1 клон на несколько лунок и трудно предположить смешение клонов. Хотя формирование клона из единственной клетки-предшественницы не исключает возникновения в процессе деления части потомства, не экспрессирующего трансфицированные гены.

ГибридизационныЙ (Ро1- и МоПЬет-аталто-) мРНК. синтезируемой

трансфинированными клетками.

ОоЬанализ РНК, выделенной из трансфицированных клеток, однозначно указывает на транскрипцию генов антител в этих клетках (рис. 4).

При КогШет-анализе мРНК, выделенной из клеток СН0185 и 5Р2/0(Т7), трансфицированных плазмидой рЮ.бек, обнаружена протяженная мРНК (8,5-9,0 т.п.н.) (не приведено) и не наблюдалось дискретных полос РНК, соответствующих по подвижности отдельным мРНК легких или тяжелых.цепей иммуноглобулинов. Размеры транскрипта превышают размеры тандема (8,1 т.п.н.) и свидетельствуют об эффективности транскрипции протяженного участка ДНК под контролем Т7 РНК-полимеразы. Нативныс иммуноглобулиновые промоторы были сохранены как у У-гена тяжелой цепи, так и у У-гена легкой цепи. Однако, дистальные энхансеры, локализованные на значительном расстоянии от З'-конца генов, были удалены. Поэтому, при экспрессии плазмиды рЮ.бек в клетках БР2/0 с иммуноглобулинового промотора нельзя получить высокий уровень экспрессии химерных антител. В нелимфоидных клетках (СНО) промоторы иммуноглобулиновых генов, как было показано ранее, не функционируют

Рис. 4. Гибридизационный анализ мРНК, синтезируемой трансфицированными клетками 8Р2/0(Т7); А-гибридизация с 32Р-меченным фрагментом Се-гена человека; Б-гибридизация с 32Р-меченным фрагментом Ск-гена человека. Различные клеточные линии обозначены арабскими цифрами. Количество РНК в пробах составляло (в нг): 200 (1), 100 (II) и 20(111). В качестве контроля (К) использованы нетрансфицированные клетки 5Р2/0(Т7).

вследствие отсутствия специфических факторов транскрипции семейства Oct-2. Однако, нельзя исключать участие природных регуляторных элементов в экспрессии иммуноглобулиновых генов, по крайней мере, в лимфоидных клетках SP2/0. В нелимфоидных клетках промоторы и энхансеры иммуноглобулиновых генов неэффективны (Baneiji, 1983). Следует добавить, что промотор Т7 РНК-полимеразы функционирует как промотор РНК-полимеразы II в клетках млекопитающих (Sandig, 1993). Вместе с тем, в трансфицированных плазмидой рЮ.бек линиях как SP2/0(T7), так и СН0185-клеток не обнаруживаются дискретные транскрипты, соответствующие мРНК легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Отсюда следует, что в том и другом случае в трансфицированных клетках транскрипция контролируется, в основном, Т7 РНК-полимеразой.

Известно, что наличие консервативного октануклеотида с У-конца от промотора Т7 РНК-полимеразы стимулирует последний в клетках SP2/0 примерно в 4 раза (Sandig, 1993). Трудно сказать, какой вклад вносит эта последовательность в экспрессируемой в клетках SP2/0 конструкции, так как октануклеотид расположен с З'-конца от промотора фага Т7.

Ранее было показано (Elroy-Stein, 1989), что транскрипты РНК-полимеразы фага Т7 практически некэпированы и, следовательно, их трансляция осуществляется посредством кэп-независимого механизма, отличного от сканирующей модели (Kozak, 1989). Сканирующая модель подразумевает связывание рибосомы и соответствующих факторов с кэпированным З'-концом мРНК и дальнейшее ее продвижение вплоть до инициирующего AUG-кодона. Сканирующая модель исключает внутреннюю инициацию трансляции, то есть связывание рибосомы с участками внутри 5/-нетранслируемой области. Однако, как показали дальнейшие исследования, сканирующая модель не является универсальной. Например, трансляция РНК полиовирусов осуществляется в соответствии с моделью внутренней инициации трансляции (Pelletier, 1988; Jang, 1989). С высокой достоверностью также установлено (Futerrer, 1990), что такой механизм реализуется при экспрессии некоторых эукариотических генов.

Радиоиммунный анализ полипептидных цепей иммуноглобулинов, синтезируемых трансфицированными клетками.

Клетки SP2/0(T7) и CHOI85, траисфицированныс плазмидой рЮ.бек, были наращены, разрушены ультразвуком. Клеточные белки были подвергнуты разделению с помощью электрофореза с SDS по Laemmly (Laemmly, 1970). Разделенные таким образом белки были перенесены на нитроцеллголозный фильтр, инкубированы с кроличьими антителами против иммуноглобулинов человека. После этого фильтр инкубировали с раствором белка А, меченным изотопом 1251. После экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой видно, что трансфицированные клоны клеток SP2/0 и СНО синтезируют как тяжелые (е-типа), так и легкие (k-типа) цепи иммуноглобулинов (рис.5).

SP2/0

СНО

-72,5 кДа

, t •©• -52,5 кДа

-22,5 кДа

Рис. 5. Радиоиммуный анализ (Western blot) полипептидных цепей иммуноглобулинов, синтезируемых трансфицированными клетками: 1,4-нетрансфицированные; 2,3-трансфицированные SP2/0(T7) и СН0185-клетки, соответственно. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в стандартных условиях. Справа приведены размеры маркерных белков в кДа.

Размеры тяжелых (72,5 кДа) и соответственно легких (22,5 кДа) цепей совпадают в тех и других клетках. Вместе с тем тяжелая цепь иммуноглобулинов исходной гибридомы РТР.02 имеет заметно меньшие параметры (52,5 кДа), что и следовало ожидать, так как она относится к классу С1 (содержат 3 константных домена, а не 4, как иммуноглобулины класса Е). Из полученного снимка можно сделать вывод о примерно равном уровне экспрессии трансфицированных генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов.

Эффективность синтеза иммуноглобулинов находится на сопоставимом уровне в трансфицированных лимфоидных и нелимфоидных клетках, что свидетельствует в пользу реализации одних и тех же механизмов экспрессии трансфицированных иммуноглобулиновых генов в тех и других клетках. Это включает транскрипцию РНК-полимеразой фага Т7 тандема генов тяжелой и легкой цепей и трансляцию тандемной мРНК посредством механизма внутренней инициации, что представляется наиболее вероятным, по крайней мере, для нелимфоидных клеток.

Система экспрессии под контролем промотора фага Т7 позволяет синхронизировать синтез белков, кодируемых тандемом генов. Это особенно важно в случае генов иммуноглобулинов, легкая и тяжелая цепи которых должны быть представлены в клетке в равных количествах для формирования молекулы антитела.

Накопление продуктов экспрессии внутри трансфицированных клеток и в культуральной среде.

Клетки клонов-продуцентов 8Р2/0 и СНО были наращены до монослоя. Культуральную среду над монослоем, формировавшуюся в течение 24 часов, собирали и в ней с помощью иммуноферментного анализа определяли количество экспрессируемых антител. Клетки были собраны, разрушены ультразвуком во льду или методом быстрого замораживания-оттаивания в жидком азоте. Следует упомянуть, что циклы замораживания-оттаивания, как выяснилось в ходе эксперимента, не влияют на антигенные свойства константных районов химерных антител. С помощью иммуноферментного анализа было показано, что, по крайней мере, несколько клонов, полученных котрансфекцией двух различных плазмид (pUC.CMV.VhCE и pUC.pur.CMV.VkCk), наряду с тяжелой цепью антител экспрессируют и легкую к-цепь. Количество экспрессируемых внутри

клеток антител определялось с помощью иммупоферментного метода. Результаты исследования (трансфекция клеток плазмидой рЮ.бек) приведены на рис. 6. На нем видно, что только клоны SP2/0 способны к эффективной секреции антител. Из приведенного результата следует, что нелимфоидные (CHOI 85) клетки синтезируют химерные антитела, по в отличие от лимфоидных клеток не могут осуществлять их активную секрецию. Этот факт может объяснять пониженную продуктивность антител клетками CHOI85 по сравнению с клетками SP2/0(T7). Следует отметить, что различные клоны, как SP2/0(T7), так и CHOI85 продуцируют химерные антитела с различной интенсивностью. Приведенные на рис. 6 уровни экспрессии химерных антител представляют

нг/мл

А

Рис 6. Накопление продуктов экспрессии внутри трансфицированных клеток (А) и з культуралыюй среде (Б). Идентификация с помощью иммуноферментных тестов < е-цепям иммуноглобулинов человека (закрашено) и к полноразмерным 1яЕ геловека (не закрашено). В эксперименте использованы нелимфоидные клетки Ш0185 и лимфоидные клетки 8Р2/0(Т7). Трансфекция клеток плазмидой рЮ.бек.

усредненные данные (от 10 до 25 нг/мл/10й клеток). В то же время были получены отдельные клоны SP2/0(T7), экспрессирутощие иммуноглобулины до 150 нг/ми. Продукция химерных антител клетками СНО в случае трансфекции плазмидами под контролем промотора цитомегаловируса человека представлена в таблице 1.

Таблица 1. Величины экспрессии химерных антител клонами СНО (в нг/мл на 106 клеток). Котрансфекция плазмидами pUC.CMV.VhCe и pUC.pur.CMV.VkCk.

Название клона С4 С9 Fl D5 D8 D3

Выход антител 0,5 нг/мл 0,7 нг/мл 2 нг/мл 4 нг/мл 6,5 нг/мл 15 нг/мл

Секреция IgE в этом случае достигала 60% от количества антител внутри клеток (на 10s разрушенных клеток в объеме 1 мл).

Уровень экспрессии генов иммуноглобулинов под контролем промотора Т7 РНК-полимеразы и промотора цитомегаловируса человека сопоставим с уровнем экспрессии других генов с этими промоторами. Так, ген гормона роста человека (hGH) экспрессировался в клетках SP2/0(T7) под контролем промотора фага Т7 и под контролем цитомегаловирусного промотора в диапазоне от нескольких нг до 10-30 мкг на I05 клеток в объеме 1 мл в день (Sandig, 1993).

Уровень экспрессии, полученный в данной работе, также сравним с уровнями экспрессии генов рекомбинантных антител, полученных под контролем других промоторов без амплификации генов. Так, синтез антител в клетках SP2/0 под контролем промотора SV40 достиг 38 нг/мл (Liu, 1987). Хотя экспрессия может быть эффективнее. Например, в лимфоидных клетках Ag8.653 под контролем иммуноглобулиновых промоторов и энхансера она составляет 300 нг/мл (Walls, 1993), в клетках СНО под контролем промотора ß-актина человека - 500 нг/мл (Page, 1991).

Незначительная секреция химерных антител клеткам СНО находится в противоречии с наблюдениями, полученными ранее другими авторами. Показано, что гуманизированные антитела секретируются с равной интенсивностью из клеток СНО и миеломных клеток мыши NS0 (Peakman, 1994). При экспрессии в клетках СНО рекомбинантного антитела против антигена CDw52 лимфоцитов человека (Page, 1991) антитела быстро секретируется из клеток в культуральную среду.

Вероятно, структура иммуноглобулинов может оказывать влияние па эффективность секреции в клетках разных типов. Известно, что последовательности FRl-района легких цепей (Horwitz, 1994), а также CDR2-района тяжелых цепей (Chen, 1994) иммуноглобулинов сказываются на их способности к секреции.

Флуоресцентная микроскопия клеток СНО. продуцирующих химерные антитела.

Клетки клона D7 линии СНО, трансфицированные плазмидами pUC.CMV.VhCs и pUC.pur.CMV.VkCk, продуцирующие е- и k-цепи (по результатам проведения иммуноферментного анализа) были наращены в чашке Петри на предметном стекле. Клетки фиксировали в метаноле. Предметное стекло

Рис. 7. Флуоресцентная микроскопия клеток СНО, продуцирующих химерные антитела. Клетки были обработаны мышиными антителами против е-цепи иммуноглобулина Е человека, затем кроличьими антимышиными антителами, конъюгированными с Р1ТС. Цитоплазма клеток-продуцентов окрашена в желто-зеленый цвет (Р1ТС), ядра всех клеток, в том числе не продуцирующих антитела, окрашены в красный цвет (йодистый пропидий).

с клетками высушивали, инкубировали в растворе 4xSSC с мышиными антителами против константных доменов IgE человека. Затем пробы обрабатывали кроличьими антимышиными антителами, коньюгированными с FITC. При помощи флуоресцентной микроскопии показано, что клетки СНО эффективно экспрессируют Cs-домены химерных антител. Флуоресцирующие препараты были сфотографированы на цветную пленку "Kodak". На рис. 7 видно, что не все клетки окрашены. Это объясняется, по-видимому, тем, что клетки клона не представляют из себя однородную массу в смысле экспрессии химерных антител. Для объяснения этого можно привести следующее предположение. В клеточном пуле с определенной долей вероятности происходит либо потеря трансфицированных генов, либо способности экспрессировать эти гены.

Определение антигенсвязывающей активности химерных антител.

Для определения функциональной активности химерных антител использовались лизаты клеток СНО и супернатанты клеток SP2/0, исходя из известных уровней секреции химерных антител этими клетками. Связывание антител проводили с антигеном - трансферрином свиньи. Антиген пм мобилизовали на нитроцеллкшозном фильтре и связанные с антигеном антитела, выделенные из клеточных экстрактов, идентифицировали с помощью радиоиммунного анализа (рис. 8). Таким образом, установлено, что трансфицированные клетки обоих типов (SP2/0(T7) и СНО 185) синтезируют функционально активные антитела.

Следует отметить, что на аффинности получаемых химерных антител сильно сказывается совместимость константного и вариабельного доменов этих антител. Известно, что домен CHI константной части оказывает влияние на проявление идиотопов вариабельного домена (Rinfret, 1990). Предполагается, что взаимодействия между расположенными рядом V и С доменами Fab-фрагмента могут модулировать трехмерную структуру V-домена, что может отражаться на антигенсвязывающих свойствах молекулы антитела. В некоторых работах, связанных со сменой изотипа антител, наблюдается отсутствие антигенсвязывающей активности антител или же ее снижение. Так, авторами работы (Zebedee, 1994) высказывается предположение, что отмеченное значительное падение аффинности полученных химерных (мышь/человек) антител против

Cryptococcus neoformans произошло вследствие смены изотипа (IgM на JgGl). В то же время известны случаи замен изотипов, при которых связывание антител с антигеном остается на прежнем уровне. Так, в работе (Nakamura, 1994) при замене изотипа мыши (IgM) на изотип человека (IgGI) специфичность антитела и их аффинность к ганглиозиду изменены не были.

Наличие антигенсвязывагощей активности химерных антител говорит о совместимости константного и вариабельного доменов исходных антител.

SP2/0 СНО

Рис. 8. Связывание антигена (трансферрина свиньи) с химерными антителами из лизатов трансфицированных клонов клеток 5Р2/0(Т7) и СН0185 (1-4). К-нехрансфицированные клетки. Антиген (трансферрин свиньи) был иммобилизован на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтры были инкубированы с клеточными лизатами. Комплексы антиген-антитело были детектированы кроличьими антителами против ^Е человека и белком А, меченным 1251.

Заключение.

В настоящей работе получены гены химерных (мышь/человек) иммуноглобулинов и осуществлена их экспрессия в двух гетерологичных системах:

под контролем промотора цитомегаловируса человека (ЬСМУ) и промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7. При этом химерные антитела были получены как в клетках лимфоидного ряда (БР2/0), так и в нелимфоидных клетках (СНО). Экспрессия тандема генов, ответственных за синтез полипептидов, составляющих антитела, под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 представляется особенно интересной, поскольку позволяет провести синтез легкой и тяжелой цепей иммуноглобулиноз, используя одну транскрипционную единицу.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлена экспрессия тандема химерных иммуноглобулиновых генов под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 в лимфоидных клетках SP2/0(T7) и нелимфоидных клетках СНО 18 5.

2. Показано, что промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 обеспечивает тканенезависимую экспрессию иммуноглобулиновых генов как в лимфоидных (SP2/0(T7)), так и в нелимфоидных (СНО 185) клетках.

3. Под контролем промотора цитомегаловируса человека (hCMV) в нелимфоидных клетках СНО осуществлена раздельная экспрессия рекомбинантных генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов.

4. Показано, что в случае экспрессии исследованных трансф_ицированных генов иммуноглобулинов под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 эффективная секреция химерных антител происходит лишь в лимфоидных (SP2/0(T7)) клетках. В нелимфодных (СН0185) клетках она незначительна. Сходные результаты получены при использовании цитомегаловирусного промотора в клетках СНО.

5. Получены химерные антитела с изменением изотипа: от IgGl мыши к IgE человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Деев С.М., Либер А., Радько Б.В., Поляновский О.Л. Синтез рекомбинантных антител (мышь/человек) в лимфоидных и нелимфоидных клетках. - Доклада.! Академии Наук СССР, 1991, т.} 18, N6, стр. 1500-1503.

2. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Poianovsky O.L. Production of recombinant antibodies in lymphoid and nonlymphoid cells. - FEBS Letters, 1993, v.330, N2, p.l 11113.

3. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Poianovsky O.L. Expression of immunoglobulin genes tandem in eukaryotic cells under the control of T7 bacteriophage RNA polymerase. - Applied Biochemistry and Biotechnology, 1994, v.47, N2/3, p.I43-155.

4. Деев C.M., Либер А., Радько Б.В., Поляновский О.Л. Экспрессия иммуноглобулиновых "химерных" генов (мышь/человек) в лимфоидных и нелимфоидных клетках. - Молекулярная биология, 1994, т.28, N2, стр.429-436.

5. Deyev S.M., Radko B.V., Lieber A., Poianovsky O.L. Tandem of recombinant immunoglobulin genes under the control of T7 RNA polymerase promoter./l 1th Meeting European Federation of Immunological Sociétés, 9-12, June 1991, Helsinki, Finland.

6. Deyev S.M., Radko B.V., Lieber A., Poianovsky O.L. Expression of chimeric mouse/human antibodies under the control of T7 RNA polymerase promoter in lymphoid and nonlymphoid cells. /8th International Congress of Immunology. 23-28, August 1992, Budapest, Hungary.

7. Deyev S.M., Shiyanov P.A., Bespalov I.A., Radko B.V. and Poianovsky O.L. Genetically engineering antibodies. Expression in eukaryotic and prokaiyotic cells/ Russian-American Conference "Catalytic antibodies and antibody engineering", 6-11, июнь 1993, Москва, Россия.

8. Deyev S.M., Shiyanov P.A., Bespalov I.A., Radko B.V., Poianovsky O.L.. Expression of chimeric and single-chain antibodies in lymphoid and nonlymphoid cells/12th European Immunology Meeting, 14-17, June 1994, Barcelona, Spain.

9. Deyev S.M., Shiyanov P.A., Radko B.V., Yazynin S.A. and Poianovsky O.L. Expression of recombinant antibodies in heterologeous systems./Russian-German Meeting, 23-30, June 1995, Cologne, Germany.