Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия в гетерологичных системах генов химерных иммуноглобулинов и гена барстара

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия в гетерологичных системах генов химерных иммуноглобулинов и гена барстара"

Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

На правах рукописи

Родин Дмитрий Викторович

Экспрессия в гетерологичных системах генов химерных иммуноглобулинов и гена барстара

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

Доктор биологических наук, профессор

С.М.Десв

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ

Доктор биологических наук, профессор

ОЛ.Поляновский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор биологических наук, профессор

А.М.Сапожников Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Доктор биологических наук, профессор

Е.Е.Егоров

Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится . 2006 г. в ч на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991 Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан ¡ГО, '£.'{., ОС>,

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

.рицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы достигнуты значительные успехи в инженерии антител - области молекулярной биологии, имеющей целью создание неприродных антител с заданными функциями (Lobato M.N., 2004; Adrian Auf der Maur, 2004). Суть направления, называемого intrabody (intracellular antibody), состоит во введении в организм генетических конструкций, кодирующих in vivo антитела с запрограммированными антигенсвязывакяцими и/или эффекторными функциями. Такие антитела узнают белки патогена или регуляторные клеточные белки; поскольку антитела синтезируются непосредственно в организме, они могут оказаться весьма эффективными при лечении онкологических, инфекционных и других заболеваний. На этапе формирования такого подхода, в первых же практических работах возможность получения терапевтического эффекта бьша продемонстрирована в случаях СПИДа и других заболеваний (Chen S.Y., 1994).

Быстро развивающимся направлением современной фундаментальной и практической иммунологии является введение генов в клетки и ткани организма как в целях генной терапии, так и в целях ДНК-иммунизации. При этом принципиальное значение приобретает изучение условий и специфичности экспрессии генов в различном микроокружении: синтезируемые и секретируемые в ходе ДНК-иммунизации и генной терапии белки могут оказывать существенное воздействие на физиологические процессы. Важно, с одной стороны, искать оптимальные способы введения генов в клетки, а с другой - изучить закономерности экспрессии введенных генов в зависимости от типа ткани. В случаях рекомбинантных белков весьма важно также оценить иммунный ответ организма на ксепогенпые детерминанты синтезирующихся белков.

Ген барстара интересен как объект для трансфекции:

• белок барстар имеет небольшой размер (90 кДа), что минимизирует вероятность неправильного фолдинга белка;

• белок барстар связывается с рибонуклеазой барназой с высокой константой связывания, что позволяет использовать результаты даже поисковой работы для совершенствования использования модуля барназа-барстар; модуль

может использоваться как для селективного килинга клеток, то есть в терапевтических целях, так и для целей диагностики;

• белок имеет бациллярную природу и идентифицируется вне зависимости от окружения, так как константа связывания его с белками человеческой и мышиной систем мала;

• существуют апробированные методы идентификации белка.

Ген иммуноглобулина изотипа Е интересен как объект для трансфекции в силу ряда причин:

• моноклональные IgE уже использовались в мышиных моделях для терапии опухоли (Kershaw М.Н., 1998);

• сопоставление эффективности применения химерных IgE и IgG для случая иммуноглобулин-обусловленного киллинга клеток карциномы выявило более сильный и долгий эффект именно при применении IgE (Gould H.J., 1999; Sutton В.J., 1999);

• изучение роли IgE в антипаразитарных механизмах защиты организма (Vernersson М„ 2002) позволило разработать подходы к противоопухолевой терапии (Reali Е., 2001);

• высокоаффинное связывание IgE с рецепторами Тучных клеток в периферических тканях позволили выдвинуть (Gould H.J., 2003) предположение о возможности применения IgE в терапии опухолей периферических тканей и подтвердить обоснованность этого предположения.

Таким образом, последовательное изучение экспрессии барстара и IgE расширяет представление об экспрессии в гетерологичных эукариотических системах, дает возможность на относительно простом примере белка барстара отработать экспрессионную модель, а на примере химерного IgE - оценить возможности эукариотической модели и, в частности, проведения ДНК-иммунизации (ответ на ксеногенные детерминанты) и создать задел для дальнейших работ с химерным IgE в области терапии опухолей.

Цель и задачи работы

Целью работы явилось установление закономерностей экспрессии гетерологичных генов в различных клетках и тканях организма, а также разработка корректного количественного анализа уровня биосинтеза чужеродных иммуноглобулинов,

В работе были поставлены следующие задачи:

• создание генетической конструкции для экспрессии генов в гетерологичной системе;

• введение генов в различные клетки и ткани организма;

• количественная оценка эффективности баллистической трансфекции генов химерных антител в различных клетках и тканях организма;

• определение условий для корректной оценки уровня биосинтеза;

• количественная оценка уровня биосинтеза полученных de novo белков;

• оценка иммунного ответа организма на синтезированные чужеродные белки.

Научная новизна и практическая ценность работы

Ген барстара трансфицировали для определения возможности экспрессии и оптимизации анализа экспрессии - для случая экспрессии в эукариотах конструкций, способных специфически связывать рибонуклеазу барназу (барназа является составной частью целого ряда конструкций противоопухолевой направленности, и отработка модели экспрессии ее ингибитора позволяет существенно расширить арсенал подходов к противоопухолевой терапии).

Впервые использован метод баллистической трансфекции для введения генов полноразмерных химерных мышь/человек иммуноглобулинов и оценки уровня их биосинтеза. Результаты позволили выяснить закономерности экспрессии генов в гетерологичной системе, что важно для понимания процессов, лежащих в основе генотерапии и ДНК-иммунизации.

Ген иммуноглобулина Е трансфицировали для определения возможности экспрессии и оптимизации анализа экспрессии - для случая экспрессии в эукариотах конструкций, способных к участию в аллергических процессах и потенциально способных к участию в терапии опухолей ряда тканей.

В настоящей работе экспрессия генов иммуноглобулина Е и барстара оценивалась качественно и количественно in vilro и in vivo, причем в эксперименте in vivo анализировалась экспрессия в различных тканях животных. Также проведено исследование способности генов барстара экспрессироваться в клетках взрослого организма после трансфекции в эмбрион на стадии морулы.

Предложенный материал создает основу для дальнейшего исследования механизмов и закономерностей экспрессии генов.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были представлены на 39-й конференции МФТИ (Москва, 1996); 1-м Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996); 4-й конференции РААКИ (Москва, 1997); "Fourth John Humphrey Advanced Summer Program in Immunology" (Пущино, 1998); международной научной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2001); международной научной конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004), 7th International Engelhardt Conference on Molecular Biology (Суздаль, 2004).

Публикация ■ ■

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 105 страницах и включает 32 рисунка и 4 таблицы. Список цитированной литературы включает 145 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Материалы, используемые в работе

В данной работе использованы генетические конструкции, несущие гены полноразмерного иммуноглобулина Е и конструкция pPSneo-Bs, созданная на базе вектора pPSneo. В экспериментах in vivo использованы мышиные модели. В экспериментах in vilro использованы методы иммуноферметного анализа, стандартные

подходы ведения клеток. Применялись методы баллистической трансфекции и введения генетических конструкций в клетки эмбриона мышей.

Разработка универсального метода доставки генетического материала в организм

Для введения генов представлялось целесообразным использование метода баллистической трансфекции, состоящего в обстреле траисфицируемых клеток и тканей микрочастицами тяжелых металлов (вольфрам, золото), несущими на своей поверхности вводимую генетическую конструкцию. Метод баллистической трансфекции выбран в силу того, что он: успешно применяется во многих работах (Zelenin, 1999); универсален, то есть одинаково эффективно обеспечивает проникновение генетического материала в различные виды клеток; не является технологически сложным (естественным затруднением, ограничивающим развитие ДНК-иммунизации и генной терапии, является, в частности, сложность введения генетических конструкций в живые клетки).

Наиболее значимы для эффективной иммунизации при баллистической трансфекции следующие факторы: внутриклеточная активность антигена, эффективность его экспрессии и токсичность; генотип и возраст животного-реципиента; количество трансфицируемой ДНК. Каждый параметр может иметь определяющее значение.

Путь механического переноса ДНК через плазматическую мембрану выгодно отличается от других: меньше зависит от характеристик клетки-мишени, является более быстрым и простым. В зоне трансфекции ДНК инъецируется во все клетки без селекции. Кроме того, метод баллистической трансфекции уже апробирован на тканях млекопитающих, проведен анализ подбора баллистических параметров и декларирована возможность использования метода для клинического применения. Метод баллистической трансфекции также использовался для введения ДНК в покоящиеся опухолевые клетки (Mahvi D.M., 1997; Mahvi D.M., 1996).

Создание генетической конструкции и анализ экспрессии гена барстара в фибробластах человека и в эмбрионе мыши

Созданы и охарактеризованы более простые генетические конструкции, необходимые для исследования in vivo экспрессии генов барстара.

В целях изучения возможности идентификации экспрессии генов барстара в клетках с помощью иммуноферментного анализа, была проведена серия экспериментов по детектированию барстара в иммуноферментном анализе (Рис.1).

; о,7

! 0,65

i 0,6

! 0,65

без плазмиды плазмнда pPS плазмида barstar ,

pPS-barstar (4,6 мкг/лунку)

Рис. 1. Результаты экспериментов по детектированию в иммуноферментном анализе барстара, полученного в результате экспрессии генов плазмиды pPSneo-Bs. Положительным контролем являлся раствор барстара известной концентрации, отрицательным — лизат клеток без плазмиды и лизат клеток, в которых экснрессировали генетическую конструкцию.

Идентификация барстара в иммунохимическом тесте

Следует упомянуть, что, по нашим данным, барстар - слабоиммуногенный белок, и получение к нему антисыворотки с высоким титром является нетривиальной задачей.

Однако существует другая возможность идентификации барстара, основанная на его природе. Как мы упоминали выше, барстар является ингибитором рибонуклеазы барназы и связывается с ней с чрезвычайно высокой константой (~10'|4М). По силе связывания это намного превосходит взаимодействие антиген-антитело и дает возможность применить современную методологию «микрочипов», в которой и было использовано уникально высокое сродство барназы и ее антагониста.

Качественный анализ экспрессии рекомбинантного барстара. Анализ проводился in vitro на клетках 293 человека, трансформированных pPSneo-Bs, и in vivo в мышиной модели. Анализ базировался на способности барназы и барстара образовывать устойчивый комплекс. Клетки 293 обрабатывали FITS-меченными молекулами барназы. В эксперименте in vitro наблюдалась существенная разница

между светимостью трансформированных и контрольных клеток, трансформированных рРЭ-З-пео (Рис.2). Эти различия свидетельствуют об экспрессии генов барстара нашего вектора в эукариотических клетках, что впоследствии подтверждено экспериментами с микрочипами.

Рис.2. Визуальная идентификация синтезированного клетками in vitro барстара с помощью FITS-меченой барназы.

Оценка экспрессии барстара клетками взрослого организма В эксперименте in vivo проведена баллистическая трансфекция генов барстара в клетки эмбриона мыши на стадии морулы, после чего оценили возможность экспрессии белка клетками взрослого организма.

Рис.3. Механическая трансфекция клетки; введение ДНК в удерживаемую клетку с помощью микропипетки.

После механической трансфекции группы из 6 эмбрионов мышей (Рис.3) ПЦР-анализ указал на наличие гена барстара у двух трансфициуованных мышей.

Оценка экспрессии барстара с помощью микрочипов1.

Взаимодействие барназа-барстар на микрочипе использовали для количественного анализа экспрессии рекомбинантного барстара в эукариотических клетках. Клетки 293 лизировали и наносили на микрочип. Зависимость интенсивности флуоресценции от гелевых элементов с иммобилизованной барпазой после взаимодействия с лизатами клеток, содержащими известное количество барстара, была аналогична калибровочной кривой. Флуоресцентный сигнал, полученный после взаимодействия микрочипа с анализируемым лизатом, разбавленным в 20 раз, соответствовал концентрации барстара 9±1 мкг/мл, т.е. исходный лизат содержал 180±20 мкг рекомбинантного барстара в 1 мл.

После взаимодействия иммобилизованной на микрочипе барназы с барстаром, меченным Texas Red, наблюдали флуоресцентные сигналы от ячеек с иммобилизованной барназой. Интенсивность флуоресценции пропорциональна как концентрации иммобилизованной на микрочипе барназы, так и концентрации

1 Автор приносит благодарность сотрудникам ИМБ РАН Е.И.Дементьевой, А.Ю.Рубиной, А.А.Стомахину, С.М.Иванову за проведение работы с микрочипами.

меченного барстара, нанесенного на микрочип. Кривую зависимости интенсвности флуоресценции от концентрации барстара (рис.4) использовали в качестве калибровочной. Наименьшая определяемая концентрация барстара составила 1нг/мл.

А

■ Флуоресценция

О 5 10 15 20

[Барстар], мкг/мл

Рис. 4. Зависимости интенсивности флуоресценции ячеек микрочипа: А -калибровочная кривая, Е - зависимость флуоресценции ячеек, содержащих иммобилизованную барназу (0,2 мг/мл), от концентрации меченого барстара

Вывод формулы для количественной оценки экспрессии генов после баллистической трансфекции in vivo

Сначала была проведена серия экспериментов для определения характеристик используемой иммунохимической тест-системы.

Анализ количественных соотношений IgE и конъюгата показал наибольшую эффективность методики при добавлении порядка 101 1011 молекул иммуноглобулина и 10"-Ю'2 меченых антител. Однако при таком соотношении участвующих в реакциях

молекул возникает неоднозначность трактовки результатов. Дело в том, что в случае экспрессии и сборки молекулы иммуноглобулина в сыворотке крове разумно ожидать появление не только самих новосинтезированных молекул, но и антител к их константной части (домены иммуноглобулинов человека). Тогда добавление сыворотки на первом этапе теста (до первой отмывки) позволяет оценить количество IgE. Подчеркнем, что попытка прямо оценить количество появившихся антител к IgE не может быть столь же успешной: находящийся в крови IgE может закрепиться на находящихся на пластике антителах и образовать таким образом участки связывания для конъюгата и немечеиных атител к IgE. Имеют место противоположные по своему характеру эффекты: наличие IgE увеличивает результирующее оптическое поглощение смеси, тогда как антитела к IgE в реакции конкурентного связывания его уменьшают. Если:

[IgE], - количество IgE в сыворотке (в молях); [IgE] - количество "стандарта" IgE (в молях); [IgG] - количество меченых антител (в молях); к - коэффициент поглощения 1 моля конъюгата;

z - количество антител, синтезируемых организмом мыши при появлении I моля чужеродных молекул IgE заданной специфичности,

то (z [IgE]*) - число синтезированных организмом антител к ксеногенным детерминантам гетерогенного IgE, а

(z [IgE]x / ([IgG] + z [IgE]x)) - доля немеченых вторичных антител, (z [IgE], ([IgE]x + [IgE]) / ([IgG] + z[IgE]x)), следовательно, учитывает конкуренцию вторичных меченых антител и антител к IgE, появившихся в крови, за сайты связывания на IgE.

Таким образом, оптическое поглощение всей лунки ¡К (min {[IgE];[IgG]} + [IgE], - z [IgE], ([IgE],+ [IgE]) / ([IgG] +z[IgE]0), Поскольку в нашем случае [IgE]<[IgG], то 4=k ([IgE] + [IgE], - z [IgE], ([IgE], + [IgE]) / ([IgG] + z [IgE],)). Отсюда [IgE],=[IgG] (k[IgE] - 4) / (z 4 - k [IgG]).

Изначально k и z неизвестны, и их лучше для каждой тест-системы определять отдельно.

Для определения коэффициента к достаточно знать соотношение между оптическим поглощением и количеством светящихся молекул в контрольной лунке (в нее не добавлялась сыворотка крови). Первый показатель получаем напрямую с помощью спектрофотометра, второй представляет собой наименьшее из двух значений: числа молекул ^Е и конъюгата в контрольной лунке.

Параметр г определяется в дополнительном эксперименте: мыши внутрибрюшинно вводили 10 МЕ2 человеческого ^Е, а затем сопоставляли характеристики сыворотки ее крови и сыворотки крови шггактной мыши. Несмотря на то, что сопоставление дает ориентировочную оценку, которая достаточно точно отражает истинное соотношение. С одной стороны, антитела в мыши вырабатываются на детерминанты не только константной части иммуноглобулина, но и вариабельной. С другой - вариабельные участки химерного иммуноглобулина мышиные и не могут иметь большого количества иммуногенных детерминант.

В результате для каждой лунки можно написать одно уравнение с одним неизвестным - количеством синтезированного в мыши ^Е, содержащего константную часть человеческого иммуноглобулина.

Генетические конструкции. Получение плазмиды рР5-3-пео.

Плазмида рРЭ-З-псо получена путем введения вставки в полилинкерный

участок плазмиды рРЭб4 (Рис.5).

2 МЕ — международная единица, МЕ-2,4 нг

Рис.5. Плтмида рР564, использованная для создания генетической конструкции с геном барстара

ЕаЖ1

рЫЖ

—«О

•ееоо-ё-

-1300-

20.

Ват Н]

ш

Рза гаЛ

сы

^ БдЙ ЗЬ)

<г Т ,г ^-^--

-200- Ф

-920-

ЕСС'1

I

-2500-

_Ш0_

Рис.6. Вставка, встроенная в плазмиду рРБб4, по сайту ЕсоШ для получения рР$-3-пео

Плазмида рРЭ-З-ЬБ получена путем введения гена барстара в ДНК ректровирусного вектора рРЭ-З-пео по НтЛП-участку полилинкера (Рис.6). Экспрессия гена барстара находилась под контролем энхансерно-промоторных элементов 5'-длинного концевого повтора (ЬТЛ) этого вектора.

Генетические конструкции. Полноразмерное антитело.

В качестве модельных генетических конструкций были выбраны две плазмиды, несущие геномные гены легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов под контролем эукариотического промотора цитомегаловируса человека, что должно обеспечивать универсальную эффективную экспрессию указанных генов без их встраивания в геном в любых тканях. Использованные химерные мыщь/человек-копструкции содержали вариабельные участки мышиного происхождения (из гибридомы РТР.02), а константные - человеческого (Рис.7).

А- рСМУ Ц-2 УБЛ! Сем ро!уА

~~~^ ьН_' —- - Г" -

В. рСМУ ь УЛч Ск ро1уА

Г*"" !___^шт

I г... ^А

Рис. 7. Схема генов иммуноглобулинов.

А. Схема гена тяжелой цепи химерного /¿»/Г под контролем цитомегаловирусного промотора (рСМУ) из плазмиды pUC.CMV.VhCe. Ген включает лидерный пептид (Ь), кодируемый двумя экзонами (11-2); вариабельный ген (Ун), состоящий из генных сегментов VII, й и М; константный ген Се, состоящий из четырех

экзонов. С У-конца от константного гена располагается поли-А последовательность (polyA).

В. Схема гена легкой цепи химерного IgE под контролем цитомегаловирусного промотора (pCMV) из плазмиды pUC.CMV.VkCk. Ген включает лидерный пептид (L); вариабельный ген (Vk), состоящий из генных сегментов Vk и Jk; константный ген Ск. С У-конца от константного гена располагается поли-А последовательность (polyA).

В целях оценки уровня экспрессии полноразмерных антител использовали плазмиды, в которых гены химерных мышь/человек. антител представлены таким образом, что константная часть мышиных антител заменена соответствующей константной областью антител человека. Поскольку большая часть антигенных детерминант молекулы иммуноглобулина находится в константных доменах и с ними же связаны основные эффекторные функции (взаимодействие с Fc-рецепторами, системой комплемента и др.), использование химерных иммуноглобулинов мышь/человек должно обусловить практически нормальное их взаимодействие с иммунной системой человека при сохранении специфичности и сродства мышиных моноклональных антител.

Сравнительный анализ экспрессии иммуноглобулинов в различных тканях

Отработаны биологические модели для исследования экспрессии введенных генов и иммунного ответа организма на синтезируемые белки. Так, проведена баллистическая трансфекция т vivo в различные ткани организма мыши, после чего в крови мыши было зафиксировано наличие химерных антител. Было показано, что после трансфекции хрящевой ткани мышей химерных антител синтезируется во много раз меньше, чем после трансфекции печени, селезенки и подушек лап мышей. Несмотря на то что, как показано в случае трансфекции в клетки яичника хомячка СНО (Радько, 1993), данная конструкция приводит к экспрессии в основном несекретируемых химерных антител, тем не менее, при трансфекции в организм мыши химерные антитела были идентифицированы. В целом можно сделать вывод, что данная генно-инженерная конструкция под контролем промотора цитомегаловируса

человека (hCMV) дает in vitro и in vivo сопоставимый уровень экспрессии химерных антител.

"Выстрел" золотыми и вольфрамовыми микрочастицами, несущими гены тяжелых и легких цепей IgE, производился по различным тканям: селезенке (иммунокомпетентный орган), печени (через печень проходит большой объем крови), подушкам лап (не столь хорошо снабжаются кровью) и хрящевым тканям ушей (как в любой хрящевой ткани, движение молекул осуществляется за счет миграции). Хотя было показано, что для появления гуморального иммунного ответа достаточно использовать 40 нг/"выстрел", мы двукратно превысили это значение для увеличения вероятности успешного прохождения всей последовательности процессов от трансфекции до сборки молекулы иммуноглобулина.

Количество синтезированного IgE, константные домены которого -человеческие, а вариабельные - мышиные, оценивалось в иммунохимическом тесте.

В силу того, что погрешность эксперимента существенна, графики зависимости количества синтезированных антител к IgE от времени (рис.8,9) не всегда показательны. Поэтому при анализе мы сочли более удобным в иллюстративном плане представление количества антител к IgE от времени нарастающим итогом (рис.10,11).

Для каждой группы мышей на оси ординат на графике и на столбцах гистограммы отложена сумма всех измерений концентрации антител, или, другими словами, величина, пропорциональная суммарному количеству белка, синтезированного в ходе иммунного ответа. Координата плато для каждой группы животных пропорциональна силе всего иммунного ответа.

ME/мл

Рис.10. Зависимость от времени суммарного значения количества антител к ígE. Суммарное значение количества антител представлено как величина, пропорциональная количеству иммуноглобулинов, синтезированных в ответ на появление в организме мыши химерных за все время опыта. Для каждой группы мышей ордината соответствует сумме измерений, проведенных во все предшествующие дни эксперимента

45 г 4035 -3025 -2015 -105 -0L

Интс тральное значение количества IgE и антител к IgE

он IgE, МЁ/мл ез Антитела к IgE, к МЕ/мл

JL—ПЯ23

Печень Селезенка Подушки Хрящевая

лап ткань

Puc.ll. Зависимость от времени суммарных значений количества химерного и антител к чему

Было показано, что концентрация трансгенного иммуноглобулина в крови растет в первые же дни после трансфекции и поддерживается в идентифицируемых количествах около трех недель. При трансфекции всех тканей, за исключением хрящевой, средняя концентрация ^Е первые 3 недели составляла около 8 МЕ/мл (для хрящевой ткани - около 1 МЕ/мл). Как известно из литературы, использование универсального промотора СМУ-человека дает по сравнению с другими промоторами заниженную оценку эффективности экспрессии введенных генов, следовательно, в случаях других промоторов логично ожидать более высокую эффективность экспрессии.

Концентрация антител, синтезированных иммунной системой мыши в ответ на появление ксеногенных детерминант, для всех групп мышей была одинакова - на уровне 20 МЕ/мл. Следовательно, несмотря на различия в количестве иммуногенного белка, поступающего в организм из трансфицированных тканей (в случае печени, селезенки, подушек лап - 8 МЕ/мл, для хрящевой ткани - 1 МЕ/мл) достигается одинаковый уровень иммунного ответа.

Повторная баллистическая трансфекция была произведена через 3,5 месяца после первой, для стимулирования наибольшего возможного вторичного ответа и явного сопоставления первичного и вторичного иммунного ответа (рис. 10).

Сравнительный анализ экспрессии иммуноглобулинов в культуре клеток и в тканях

В наших экспериментах по проведению баллистической трансфекции показано: экспрессия химерного ^Е не является тканеспецифической (кроме хрящевой ткани, где сравнительно затруднено движение молекул); ксеногенный ответ на появление химерных антител не является дозозависимым; после повторной трансфекции не удалось обнаружить ни химерные ^Е, ни антитела к ним (известно, что вторичный ответ на чужеродные детерминанты сильнее первичного и быстрее достигает максимума; следовательно, после повторной трансфекции синтезируемые химерные могли быть почти сразу инактивированы в результате вторичного ответа, тем временем антитела к "человеческим" детерминантам могли бьггь инактивированы мышиными антителами, поскольку человеческие и мышиные 1£Е иногда имеют перекрестное распознавание детерминант).

Возможно, из-за того, что вторичный иммунный ответ сильнее первичного и проявляется быстрее, концентрация химерных иммуноглобулинов не достигала значимых величин. Отсутствие же антител к человеческому ^Е могло явиться следствием его перекрестной реакции с мышиными иммуноглобулинами. Кроме того, нельзя исключать из рассмотрения вторичный Т-клеточный ответ, способный существенно снизить значения обоих измерявшихся параметров.

Контроль эукариотического промотора позволяет предполагать, что экспрессия генов может происходить без их встраивания в геном. Поскольку эффективность генной терапии определяется также характеристиками экспрессии плазмидных векторов, в некоторых работах указывается на увеличение эффекта за счет эписомальной экспрессии. Применение в будущих экспериментах иных эукариотических промоторов вместо СМУ-промотора позволит увеличить эффективность иммунизации, так как при баллистическом введении ДНК встраивается в клетки случайно, а вектор сможет экспрессироваться с высокой эффективностью эписомально, без встраивания в геном.

Созданы генетические конструкции для исследования экспрессии гена барстара в эукариотических системах; показано, что указанные конструкции эффективно экспрессируются в различных эукариотических системах.

Выведена формула подсчета количества экспрессированного in vivo химерного белка в присутствии антител к видоспецифичным детерминантам.

При введении генов методом баллистической трансфекции определены условия экспрессии генов химерного IgE в различных тканях и органах мышей in vivo — с точки зрения иммунного ответа на ксеногенные детерминанты экспрессируюшихся генов и возможности проведения ДНК-иммунизации.

На примере экспрессии генов химерного IgE, трансфицированных в различные ткани и органы мышей (введение методом баллистической трансфекции), оценены возможности ДНК-иммунизации, а также установлено, что иммунный ответ на ксеногенные детерминанты не зависит ни от типа ткани, в которой экспрессировался чужеродный ген, ни от его количества.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. D.V. Rodin, B.V. Rad'ko, V.A. Kolesnikov, O.L. Polanovsky, S.M. Deyev. Expression of the chimeric IgE gene in cell culture and in various mouse tissues. Biochemie. 2004, Vol. 86, №12, pp. 939-943.

2. D.V. Rodin, V.A. Kolesnikov, I,A. Zelenina, A.V. Zelenin, S.M. Deyev. The quantitative characteristics of efficiency of ballistic transfection of chimeric antibody genes. Immunoll Lett. 2000, Vol. 74, pp. 197-200.

3. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Стомахин A.A., Иванов С.М., Крейндлин Е.Ю., Иванов Д.С., Родин Д.В., Дсев С.М., Прасолов B.C., Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы: анализ экспрессии рекомбинантного барстара. Докл РАН. 2003, Том 6, №3, стр.161-167.

4. Родин Д.В., Колесников В.А., Сердаок О.В., Зеленина И.А., Зеленин А.В., Деев С.М. Синтез химерного IgE in vivo после баллистической трансфекции иммуноглобулиновых генов в различных тканях мыши. Мол Биол. 2000, Том 34, №1, стр. 18-23.

5. Родин Д.В., Колесников В.А., Зеленина И.А., Зеленин А.В., Деев С.М. Экспрессия генов иммуноглобулинов in vivo как результат баллистической трансфекции. Мед иммунол. 2001, Том 3, №2, стр.129-130.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 06.10.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родин, Дмитрий Викторович

Список обозначений и сокращений з

Введение

Обзор литературы

1 Иммуноглобулин Е как возможный агент противоопухолевого иммунитета

1 Сведения о функциях иммуноглобулина Е

2 Инициация синтеза иммуноглобулина Е

3 Регуляторные функции иммуноглобулина Е

4 Иммуноглобулин Е и аллергическая реакция как факторы развития и ингибирования роста опухолей

5 Количественные оценки концентрации иммуноглобулинов в терапии

2. Генотерапия

1. Общее описание типов генотерапии

2 Основные направления клинического применения генотерапии

3 Химерные антитела как эффекторный белок терапии

4 Факторы, обеспечивающие эффективность генотерапии

2 4 1 Доставка генетического материала

2 4 2 Экспрессия генов

3. Эксперессия генов барстара и химерного иммуноглобулина 38 Резюме обзора литературы

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

1. Создание генетической конструкции и анализ экспрессии гена барстара в фибробластах человека и в эмбрионе мыши

2. Баллистическая трансфекция

3. Экспрессия генов химерного ^Е в различных тканях и органах мышей, иммунный ответ на ксеногенные детерминанты

4. Вывод формулы подсчета количества экспрессированного химерного белка

5. Количественный анализ экспрессии химерного ^Е и иммунного ответа на ксеногенные детерминанты выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия в гетерологичных системах генов химерных иммуноглобулинов и гена барстара"

В последние десяилетия одним из наиболее востребованных подходов в биологических и биомедицинских исследованиях стало создание генетических конструкций для экспрессии целевых белков непосредственно в жиом организме. В соответствии с конечными практическими приложениями этой методологии сформировались два основных направления - генотерапия и ДНК-иммунизация. Одним из наиболее востребованных направлений применения генотерапии является подход с применением интрател, который состоит во введении в организм генетических конструкций, кодирующих антитела с запрограммированными антигенсвязывающими и/или эффекторными функциями.

В связи с этим необходимо, с одной стороны, искать оптимальные способы введения в клетки чужеродных генов, а с другой - изучить закономерности экспрессии введенных генов в зависимости от типа ткани. Весьма важно также оценить иммунный ответ организма на ксеногенные детерминанты синтезирующихся рекомбинантных белков.

В настоящей работе исследовали генетические конструкции для экспрессии простых однодоменных и сложных мультидоменных белковых молекул. Последовательно рассмотрены генетические конструкции, необходимые для исследования in vivo экспрессии гена барстара; возможности качественной и количественной оценки экспрессии этого гена в человеческих фибробластах; экспрессия гена барстара клетками взрослого организма после трансфекции в клетки эмбриона на стадии морулы; возможность экспрессии генов химерных антител мышь-человек при введении генов in vitro и в клетки различных органов и частей тела мышей in vivo.

Были сконструированы плазмиды, несущие ген барстара под контролем эукариотических регуляторных элементов для его экспрессии в эукариотах.

На первом этапе исследования работа являлась поисковой. Было необходимо определить принципиальную возможность исследования экспрессии гена барстара в эукариотических системах. Работа выступала предтечей работ по созданию химерных полноразмерных иммуноглобулинов.

При работе с химерными мышь-человек иммуноглобулинами класса Е основной задачей было апробирование подхода к экспрессии генов иммуноглобулинов in vitro и in vivo. Конкретно - анализ экспрессии под гетерологичным промотором и оценка уровня биосинтеза целевого белка.

При использовании генов химерного мышь/человек IgE был оценен уровень биосинтеза целевого белка in vivo в различных тканях мыши: селезенке (иммунокомпетентный орган), печени (через печень проходит большой объем крови), подушках лап (не столь хорошо снабжаются кровью) и хрящевой ткани ушей (в любой хрящевой ткани движение молекул осуществляется исключительно за счет диффузии). Также была дана количественная оценка иммунного ответа организма на чужеродные антигенные детерминанты синтезированных антител. Получение таких данных было важно с точки зрения так называемой ДНК-иммунизации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Родин, Дмитрий Викторович

выводы

1. Созданы генетические конструкции для исследования экспрессии гена барстара в эукариотических системах; показано, что указанные конструкции эффективно экспрессируются в различных эукариотических системах.

2. Выведена формула подсчета количества экспрессированного in vivo химерного белка в присутствии антител к видоспецифичным детерминантам.

3. При введении генов методом баллистической трансфекции определены условия экспрессии генов химерного IgE в различных тканях и органах мышей in vivo - с точки зрения иммунного ответа на ксеногенные детерминанты экспрессирующихся генов и возможности проведения ДНК-иммунизации.

4. На примере экспрессии генов химерного IgE, трансфицированных в различные ткани и органы мышей (введение методом баллистической трансфекции), оценены возможности ДНК-иммунизации, а также установлено, что иммунный ответ на ксеногенные детерминанты не зависит ни от типа ткани, в которой экспрессировался чужеродный ген, ни от его количества.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родин, Дмитрий Викторович, Москва

1. Биологический энциклопедический словарь Под ред МС Гилярова М: «Советская Экциклопедия», 1989

2. Sutton В.J., Gould H.J. The human IgE network, Nature, 1999, V.366, p.421-428

3. Vernersson M. The rise and fall of IgE, Uppsala University, 2002

4. Chang T.W. Developing antibodies for targeting immunoglobulin and membrane-bound immunoglobulin E, Allergy Asthma Proc, 2006, V.27, #2 (Suppl 1): 7-14

5. Blank U., Jouvin M.H., Guerin-Marchand C., Kinet J.P. The high-affinity IgE receptor: lessons from structural analysis, Med Sci, 2003, V.19, #1, p. 63-9

6. Roitt I., Essential Immunology, 6th edition, 1997

7. Mills PK, Beeson WL, Fraser GE, Philips RL Allergy and cancer: organ site-specific results from Adventist health study Am. J. Epidemiol. 1992 136: 287-295

8. Szczeklik A, Jawien J, Stadler BM, Radwan J, Piwowarska W, Dziatkowiak A Possible relationship between IL-6 and response of IgE to surgical trauma Ann. NY Acad. Sci. 1995 762:477-479

9. Szczeklik A., Jawien J. IgE in acute phase response to surgical stress, Clin Exp Allergy, 1996, V.26, p.303-307lO.Szczeklik A., Jawien J. Possible role of IgE in acute-phase response, Allergy, 1997, V.52, p.l 149-1150

10. Kapmen G.T., Poulsen L.K., Nielsen H.J., Schulze S., Petersen L.J. IgE levels in surgery: effect of ranitidine and prednisolone, Allergy, 1999, V.54, p.l 71-176

11. Navarro-Zorraquino M., Lozano R., Deus J., Pastor C., Larrad L., Tejero E., Roman J., Palacios M.J., Torcal J., Salinas J.C. Determination of the IgE postoperative variation as a measure of surgical injury, World J Surg, 2001, V.25, p.585-591

12. Smith J.K., Krishnaswamy G.H., Dykes R., Reynolds S., Berk S.L. Clinical manifestations of IgE hypogammaglobulinemia, Ann Allergy Asthma Immunol, 1997, V.78, p.313-318

13. Schoettler J.J., Schleissner L.A., Heiner D.C. Familial IgE deficiency associated with sinopulmonary disease, Chest, 1989, V.96, p.516-521

14. Levy D.A., Chen J. Healthy IgE-deficient person, N Engl J Med, 1970, V.283, p.541

15. Wesrman S., Gustavsson S., Heyman B. Early explanation of secondary B cells after primary immunization with antigen complexed with IgE, Scand J Immunol, 1997, V.46, p. 10-15

16. Heyman B. Regulation of antibody responses via antibodies, complement, and Fc receptors, Annu Rev Immunol, 2000, V.18, p.709-737

17. Gould H., Br Med Bui, 2000, V.56, p.908-924

18. Nowak-Wegrzyn A., Sampson H.A. Food allergy therapy, Immunol Allergy Clin North Am, 2004, V.24, #4, p.705-725

19. Oettgen H.S., Geha R.S. IgE regulation and roles in asthma pathogenesis, J Allergy Clin Immunol, 2001, V.107, #3, p.429-441

20. Yamaguchi M., Sayama K., Yano K., Lantz C., Noben-Trauth N. et al J Immunol, 1999, V.162, #9, p.5455-5465

21. Mills P.K., Beeson W.L., Fraser G.E., Phillips R.L. Allergy and cancer: organ site-specific results from the Adventist Health Study, Am J Epidemiol, 1992, V.136, #3, p.287-295

22. Gould H.J., Sutton B.J., Beavil A.J., Beavil R.L., McCloskey N., Coker H.A., Fear D., Smurthwaite L. The biology of IGE and the basis of allergic disease, Annu Rev Im, 2003, V.21, p.579-628

23. Fisherman E.W. Does the allergic diathesis influence malignancy?, J Allergy, 1960, V.31, p.74-78

24. Mackay W.D. The incidence of allergic disorder and cancer, Br J Cancer, 1966, V.20, p.434-437

25. Ure D.M.J. Negative association between allergy and cancer, Scot Med J, 1969, V.14, p.51-54

26. McK.ee W.D., Arnold C.A., Perlman M.D. A double-blind study of the comparative incidence of malignancy and allergy, J Allergy, 1967, V.39, p.294-301

27. Meers P.D., Allergy and Cancer, Lancet, 1973, V.l, p.884-885

28. Vena J.E., Bona J.R., Byers T.E., Middleton E. Jr, Swanson M.K., Graham S. Allergy-related diseases and cancer: an inverse association, Am J Epidemiol, 1985, V.122, #1, p.66-74

29. Wang H., Rothenbacher D., Low M., Stegmaier C., Brenner H., Diepgen T.L. Atopic diseases, immunoglobulin E and risk of cancer of the prostate, breast, lung and colorectum, Int J Cancer, 2006, V.l 19, #3, p.695-701

30. Gould H.J., Mackay G.A., Karagiannis S.N., O'Toole C.M., Marsh P.J., Daniel B.E., Coney L.R., Zurawski V.R. Jr., Joseph M., Capron M., Gilbert

31. M., Murphy G.F., Korngold R. Comparison of IgE and IgG antibody-dependent cytotoxicity in vitro and in a SCID mouse xenograft model of ovarian carcinoma, Eur J Immunol, 1999, V.29, #11, p.3527-3537

32. Nagy E., Berczi I., Sehon A.H. Growth inhibition of murine mammary carcinoma by monoclonal IgE antibodies specific for the mammary tumor virus, Cancer Immunol Immunother, 1991, V.34, p.63-69

33. MacGlashan D.W.Jr,, Mckenzie-White J., Chichester K., Bochner B.S., Davis F.M., Schroeder J.T., Lichtenstein L.M. In vitro regulation of FcsRIa expression on human basophils by IgE antibody, Blood, 1988, V.91, p. 16331634

34. Gould H.J., Mackay G.A. et a! Eur J Imm, 1999, V.29, p.3527-3537

35. Баранов B.C. «Соросовский образовательный журнал», 1999, №3, с. 1-640.3еленин А.В., Кайгородов В.А., Прасолов B.C. Генотерапия сегодня изавтра, Мол биол, 1998, Т.32, №2, с.219-228

36. Culver K.W. Gene therapy: a handbook for physicians, 1994

37. Molecular and Cell Biology of Human Gene Therapeutics, 1995

38. Gura T. Science, 1995, V.270, p.575-577

39. Siatskas C., Chan J., Field J., Murphy K., Nasa Z., Toh B.H., Alderuccio F. Gene therapy strategies towards immune tolerance to treat the autoimmune diseases, Curr Gene Ther, 2006, V.6, #1, p.45-58

40. Dzau V.J. Predicting the future of human gene therapy for cardiovascular diseases: what will the management of coronary artery disease be like in 2005 and 2010?, Am J Cardiol, 2003, V.92, p.32-35

41. LÍ S., Tokuyama T., Yamamoto J., Koide M., Yokota N., Namba H. Potent bystander effect in suicide gene therapy using neural stem cells transduced with herpes simplex virus thymidine kinase gene, Oncology, 2005, V.69, #6, p.503-508

42. Muller F.J., Snyder E.Y., Loring J.F. Gene therapy: can neural stem cells deliver?, Nat Rev Neurosci, 2006, V.7, #1, p.75-84

43. Yates F., Daley G.Q. Progress and prospects: gene transfer into embryonic stem cells, Gene Ther, 2006, V.13, #20, p.1431-1439

44. Kay M.A., Liu D., Hoogerbrugge P.M. Gene therapy, Proc Natl Acad Sci USA, 1997, V.94, #24, p.12744-12746

45. Roberts J.P. Transcription controls segmentation clock gene, Scientist, 2002, V.16, #20, p.45

46. Smith K.T., Shepherd A.J., Boyd J.E., Lees J.M., Gene Delivery Systems for Use in Gene Therapy: An Overview of Quality Assurance and Safety Issues, Gene Therapy, 1996, V.3, p. 190-200

47. Expert Reviews in Molecular Medicine, 1999, Cambridge University Press

48. Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S., de Saint Basile G, et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-Xl disease, Blood, 2000, V.96, p.590

49. Rosen F.S. Successful Gene Therapy for Severe Combined Immunodeficiency The New England Journal of Medicine, 2002, V.346, #16, p.1241-1243

50. Wade N, Patient Dies While Undergoing Gene Therapy, The New York Times, 1999, September 29

51. Koehler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, V.256, p.493-497

52. Jones P.T., Deat P.H., Foote J. Neuberger M.S., Winter G. Nature, 1986, V.321, p.522-525 b

53. Gura S. Therapeutic antibodies: Magic bullets hit the target, Nature, 2002, V.417, p.584 586

54. Wolff J. A., Malone R. W., Williams P., Chong W., AcSadi G., Jani A., Felgner P. L. Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in Vivo, Science, 1990, V.247, #4949, p.1465-1468

55. Schreurs M.W., de Boer A.J., Figdor C.G., Adema G.J., Genetic vaccination against the melanocyte lineage-specific antigen gplOO induces cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor protection, Cancer Res, 1998, V.58, #12, p.2509-2514

56. Taubes G. Science 1997 05 Dec V.278, 1711-1714

57. Donnelly J.J., Friedman A., Martinez D., Montgomery D.L., Shiver J.W., Motzel S.L., Ulmer J.B., Liu M.A. Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine: enhanced protection against antigenic drift in influenza virus, Nat Med, 1995, V.l, #6, p.583-587

58. Johnston S.A., Barry M.A. Vaccine, 1997, V.15, #8, p.808-809

59. Schuler K., Lu C., Chang H.D., Croft M., Zanetti M., Gerloni M.

60. Circumvention of MHC class II restriction by genetic immunization, Vaccine, 2001, V.20, #3-4, p.630-634

61. Фаворова O.O. Соросовский образовательный журнал, 1997, №2, с.21-27

62. Culver K.W. Gene therapy: a handbook for physicians, NY:May Ann Liebert Inc Publ, 1994, p.l 17

63. Marr R.A., Hitt M., Muller W.J., Gauldie J., Graham F.L. Int J Oncol, 1998, V.12, #3, p.509-515

64. Лещинская И.Б. Соросовский образовательный журнал, 1996, №1, с.32-39

65. Weisz В., David A.L., Gregory L.G., Perocheau D., Ruthe A., Waddington S.N., Themis M., Cook Т., Coutelle C., Rodeck C.H., Peebles D.M. Targeting the respiratory muscles of fetal sheep for prenatal gene therapy for

66. Duchenne muscular dystrophy, Am J Obstet Gynecol, 2005, V.193, #3, p.l 105-1109

67. Chuah M.K., Collen D., VandenDriessche T. Clinical gene transfer studies for hemophilia A, Semin Thromb Hemost, 2004, V.30, #2, p.249-256

68. Densmore C.L. Advances in noninvasive pulmonary gene therapy, Curr Drug Deliv, 2006, V.3, #1, p.55-63

69. Koehler D.R., Martin В., Corey M., Palmer D., Ng P., Tanswell A.K., Hu J. Readministration of helper-dependent adenovirus to mouse lung, Gene Ther, 2006, Jan 26 Epub ahead of print.

70. Malik P., Arumugam P.I. Gene Therapy for {beta}-Thalassemia, Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 2005, p.45-50

71. Bank A., Dorazio R., Leboulch P. A Phase I/II Clinical Trial of {beta}-Globin Gene Therapy for {beta}-Thalassemia, Ann NY Acad Sci, 2005, V.1054, p.308-316

72. Агол В.И. Соросовский образовательный журнал, 1997, №4, с. 11-16

73. Агол В.И. Соросовский образовательный журнал 1997, №9, с.27-31

74. Tang D., DeVit М., Johnston S.A. Nature, 1992, V.356, p. 152-154

75. Pertmer T.M., Eisenbraun M.D., McCabe D., Prayaga S.K., Fuller D.H., Haynes J.R. Vaccine, 1995, V.13, p.1427-1430

76. Barry M.A., Johnston S.A. Vaccine, 1997, V.15, p.788-791

77. Yang N-S., Sun W.H., McCabe D. Mol Med Today, 1996, V., p.476-481

78. Biewenga J.E., Destree O.H., Schrama L.H. J Neurosci Methods, 1997, V.71, p.67-75

79. Mahvi D.M., Sondel P.M., Yang N.S., Albertini M.R., Schiller J.H., Hank J., Heiner J., Gan J., Swain W., Logrono R. Hum Gene Ther, 1997, V.8, p.875-891

80. Mahvi D.M., Burkholder J.K., Turner J., Culp J., Malter J.S., Sondel P.M., Yang N.S. Hum Gene Ther, 1996, V.7, p. 1535-1543

81. Chen S.Y., Bagley J., Marasco W.A. Hum Gene Ther, 1994, V.5, p.595-601

82. Колесников B.A., Зеенина И.А., Семенова M.JI., Шафей Р., Зеленин А.В. Журн биол разв, 1995, Т.6, с.467-480

83. Xiong S., Gerloni M., Zanetti M. Proc Natl Acad Sei USA, 1997, V.94, p.6352-6357

84. Zelenin A.V., Kolesnikov V.A., Tarasenko O.A., Shafei R.A., Zelenina I.A., Mikhailov V.V. et al. FEBS Letters, 1997, V.414, p.319-322

85. Conry R.M., LoBuglio A.F., Kantor J., Schlom J., Loechel F., Moore S.E., Sumerel L.A., Barlow D.L., Abrams S., Curiel D.T. Cancer Res, 1994, V.54,p.l 164-1168

86. Davis H.L., Whalen R.G., Demeneix B.A. Hum Gene Ther, 1993, V.4, p.151-159

87. Raz E., Carson D.A., Parker S.E., Parr T.B., Abai A.M., Aichinger G., Gromkowski S.H., Singh M., Lew D., Yankauckas M.A., Baird S.M., Rhodes G.H. Proc Natl Acad Sei USA, 1994, V.91, p.9519-9523

88. Wang B., Ugen K., Srikantan V., Agadjanyan M., Dang K., Refaeli Y., Sato A., Boyer J., Williams W., Weiner D. Proc Natl Acad Sei USA, 1993, V.90,p.4156-4160

89. Huygen K., Content J., Denis O., Montgomery D.L., Yawman A.M., Deck R.R., DeWitt C.M., Orme I.M., Baldwin S., D'Souza C., Drowart A.,1.zes E., Vandenbussche P., Van Vooren J-P., Liu M.A., Ulmer J.B. Nat Med, 1996, V.2, p.893-898

90. Tascon R.E., Colston M.J., Ragno S., Stavropoulos E., Gregory D. Nat Med, 1996, V.2, p.888-892

91. Sedegah M., Hedstrom R., Hobart P., Hoffman S.L, Proc Natl Acad Sci USA, 1994, V.91, p.9866-9870

92. Doolan D.L., Sedegah M., Hedstrom R.C., Hobart P., Charoenvit Y., Hoffman S.L. J Exp Med, 1996, V.183, p. 1739-1746

93. Xu D., Liew F.Y. Protection against leishmaniasis by injection of DNA encoding a major surface glycoprotein, gp63, of L. major, Immunology, 1995, V.84, #2, p.173-176

94. Cooper M.J., Lippa M., Payne J.M., Hatzivassiliou G., Reifenberg E., Fayazi B., Perales J.C., Morrison L.J., Templeton D., Piekarz R.L., Tan J. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, V.94, p.6450-6455

95. Shiraishi M, Kusano T, Hara J, Hiroyasu S, Shao-ping M, Makino Y, Muto Y Adenovirus-mediated gene transfer using in-situ perfusion of the liver graft, Transpl Int, 1997, V.10, #3, p.202-206

96. Newton D.L., Ryback S.M. Antibody targeted therapeutics for lymphoma: new focus on the CD22 antigen and RNA, Expert Opin Biol Ther, 2001, V. 1, #6, p.995-1003

97. Glinka E.M., Edelweiss E.F., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. Gene 2005, in press

98. SchreiberG., Buckle A.M., FershtA.R. Structure, 1994, V.2, #10, p.945-951

99. Deyev S.M., Yazynin S.A., Kuznetsov D.A., Jukovich M., Hartley R.W. Ribonuclease-charged vector for facile direct cloning with positive selection, Mol Gen Genet, 1998, V.259, #4, p.379-382

100. Jucovic M., Hartley R.W. Protein-protein interaction: a genetic selection for compensating mutations at the barnase-barstar interface, Proc Natl Acad Sci USA, 1996, V.93, #6, p.2343-2347

101. Jucovic M., Hartley R.W. In vivo system for the detection of low level activity barnase mutants, Protein Eng, 1995, V.8, #5, p.497-499

102. Kershaw M.H. et al Oncol Res, 1998, V.10, #3, 133-142

103. Gould H.J., Mackay G.A. et al Eur J 1mm, 1999, V.29, p.3527-3537

104. Sutton B.J., Gould HJ. The human IgE network, Nature, 1999, V.366, p.421-428

105. Reali E. et al Cancer Res, 2001, V.61, #14, p.5517-5522

106. Gould H.J. et al Annu Rev Im, 2003, V.21, p. 579-628

107. Kamiya T., Sugio S., Yamanouchi K., Kagitani Y. Secretion of active Fc fragments of immunoglobulin E directed by the yeast invertase signal sequence in mammalian cells, J Exp Med, 1996, V.180, #4, p.297-308

108. Nechansky A., Ruf C., Pursch E., Wasserbauer E., Stampfli M.R., Pachlopnik J.M., Stadler B.M., Kricek F. Interaction of human IgE with Fc epsilon RI alpha exposes hidden epitopes on IgE, Int Arch Allergy Immunol, 1999, V.120, #4, p.295-302

109. Радько Б.В. Автореферат диссертации на соискание научной степени канд. биол. наук. М.: ИМБ, 1998

110. Прасолов B.C., Чумаков П.М. Мол биол, 1988, Т.22, с. 1678-1687

111. Zelenin A.V., Alimov A.A., Titomirov A.V., Kazansky A.V., Gorodetsky S.I., Kolenikov V.A. FEBS Lett, 1991, V.280, p.94-96

112. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова M.JI., Шафей Р., Зеленин А.В. Онтогенез, 1995, Т.26, с.467-480

113. Кэтти Д., Райкундалия Ч. Антитела. Методы. Под ред. Д.Кэтти. М: Мир 1991 с 73

114. Barsky V., Perov A., Tokalov S., et al J Biomol Screen, 2002, V,7, p.247-257

115. Barry M.A., Johnston S.A. Biological features of genetic immunization, Vaccine, 1997, V.15, #8, p.788-791

116. Yang N-S., Sun W.H., McCabe D. Mol Med Today, 1996, p.476-481

117. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Polanovsky O.L. Appl Biochem Biotechnol, 1994, V.47, #2-3, p.143-155

118. Biewenga J.E., Destree O.H., Schrama L.H. J Neurosci Methods, 1997, V.71, p.67-75

119. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Шафей Р., Зеленин А.В. Онтогенез, 1995, Т.6, с.467-480

120. Sundaram P., Xiao W., Brandsma K.L. Nucl Acids Research, 1996, V.24, p.1375-1377

121. Yang N-S., Sun W.H., McCabe D. Mol Med Today, 1996, V. p.476-481

122. Mahvi D.M., Sondel P.M., Yang N.S., Albertini M.R., Schiller J.H., Hank J., Heiner J., Gan J., Swain W., Logrono R. Hum Gene Ther, 1997, V.8, p.875-891

123. Pertmer T.M., Eisenbraun M.D., McCabe D., Prayaga S.K., Fuller D.H., Haynes J.R. Vaccine, 1995, V.13, p.l427-1430