Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование химерных генов на основе генов гордеина Bi и легумина B4 и экспрессия гена гордеина Bi в гетерологичных системах

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструирование химерных генов на основе генов гордеина Bi и легумина B4 и экспрессия гена гордеина Bi в гетерологичных системах"

схэ сУ)

5 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

^ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА 1о

На правах рукописи V' - -------- - -.. УДГС: 577.214.622:582.542.1

Оганесян Наталья Николаевна

Конструирование химерных генов на основе генов гордеипа В1 и легумина В4 и экспрессия гена гордеина В1 в гетерологичных системах.

м

«=С С5

£-0 С£_

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.15 - Генетика

-Москва.1996„

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и генетической инженерии растений Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Е.В.Ананьев

Официальные оппоненты:доктор биологических наук А.А.Колесников кандидат биологических наук Д.Б.Дорохов

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.01 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 117809, Москва, В-333, ул.Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Защита диссертации состоится

час. на

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Белки семян культурных растений, используемые в пищу человеком и животными непосредственно, а также после технологическом обработки, составляют от 10% (злаки) до 40% (масличные культуры) сухого веса, причем около половины общего белка приходится на долю запасных белков. В большинстве случаев запасные белки имеют несбалансированный аминокислотный согтап. Пролимины, запасные белки злаков, бедны незаменимой аминокислотой - лизином. Введение дополнительных кодонов лизина в индивидуальные гены проламшгов привело бы к синтезу белков, обогащенных лизином и улучшило бы кормовое и питательное качество зерна. Например, на сегодняшний день клонированы семь генов запасных белков ячменя, гордеинов. Метод о.шгонуклеотиднаправлепного мутагенеза позволяет производить точечные нуклеотидные замены и вводить добавочные кодопы лизина ь кодирующую последовательность гена. Так как изменение гена in vi tro может сказаться на уровне экспрессии, биологических и химических свойствах кодируемого белка, система быстрой гетерологичиой экспрессии генов гордеинов может выявить специфику синтеза модифицированного белка.

Разработка современных методов трансформации и регенерации растений злаков и бобовых позволят осуществлять перенос генетических конструкций в геном растения и целенаправленно изменять свойства растений уже в ближайшем будущем. Однако успешное манипулирование составом и композицией запасных белков невозможно без глубокого понимания механизмов регуляции генной экспрессии и клеточной биологии белка. Одним из способов решения этой задачи является изучение экспрессии химерных генов. Использование химерных генов, созданных на основе генов гордеина и легумина, позволит более детально изучать особенности процессов синтеза и запасания проламинов и глобулинов.

Цель работы.

1. Создание векторов для экспрессии гена гордеина В1 в Escherichia coli и клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803.

2. Изучение экспрессии гена гордеина В1 в бактериальных клетках.

3. Создание химерных генов на основе генов запасных белкой ячменя Hordeum vulgare L. и бобов Vicia faba L. - гордеина B1 и легумина В4.

4. Создание конструкций для изучения экспрессии химерных генов в растениях.

Научная ' новизна и практическая значимость работы.

Сконструированы векторы для экспрессии гена гордеина В1 в клетках бактерий под контролем /ас-промотора. Показан синтез гордеина в Escherichia coli и клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803. С помощью олигонуклеотиднаправлепиого мутагенеза сконструированы химерные гены на основе генов гордеина В1 и легумина В4. Показана интеграция в геном табака химерного гена с кодирующей областью гена гордеина под контролем регуляторных последовательностей гена легумина.

Представленные в работе данные могут быть использованы для решения задачи улучшения питательной ценности запасных белков ячменя путем целенаправленного изменения их аминокислотного состава, а также путем экспрессии в трансгенных растениях ячменя генов запасных белков других растений с достаточным количеством лизина. Запасные белки ячменя Я. vulgare L. и бобов Vicia faba L. различаются по аминокислотному составу, в частности, гордеин В заметно богаче серу содержащими аминокислотами, легумин - лизином. Поэтому экспрессия химерных конструкций, состоящих из участков этих генов, в злаках и бобовых может повлиять па состав запасных белков семян.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 123 страницах, содержит 18 рисунков и одну таблицу.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990; на Юбилейном симпозиуме "Genetic Research

and Education: current trends and the next fifty years", New Delhy, 1991; на IT Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений, Пупшпо, 1993 л на проблемном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов", ИОГеи РАН, Москва, 1996.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Экспрессия гена В1 гордеина л E.coii и клетках цианобакгерии Syrtrchocystis sp. PCCGS03.

E.coii и ее плазмидные векторы наиболее широко используются в качестве гетерологичных систем экспрессии генов растений. Для цианобактерий также хорошо разработаны методы трансформации и клонирования чужеродных генов. Цианобактерии широко используются в исследованиях механизмов регуляции действия гена. Они являются перспектгтгой модельной системой экспрессии, поскольку по структуре клеточной оболчки и организации генома относятся к гр1гмогрит1сяъньгч бактериям, тогда как строение фогоеинтстичсского аппарата и способность к окситшому фотосинтезу приближают их к высшим растениям Коатому нами сконструированы экспресгиоиные векторы и показана экспрессия гена гордеина Bi под контролем бактериального /йе-промогора в клетках tischetichia coli и цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803.

1,1. Конструирование вектора для экспрессии гетта гордеина В1 в E.coii.

Б работе и качестве исходной иснолыювали tunvnm,iy pSPB12, к которой клонирован EcoRI фрагмент геномной ДНК ячменя II.vulgare L. сорта Донецкий 4, содержащий ген гордеина В1 (Чернышев и др., 1989).

Вектор для экспрессии гена гордеина в клетках E.coii получен на основе плазмиды pBSM13(-). Выбор этой плазмиды обусловлен тем, что в дальнейшем в бслоккодирующую область гена будут вноситься замены методом олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. Встраивание гена в pBSM13 под контроль /ас-промотора позволяет модифицировать, секвенировать и экспрессировать белоккодирующую область в одном и том

же векторе. В полилинкер плазмиды pBSM13 по Xbal-EcoRI сайтам встроили Xbal-EcoRI фрагмент плазмиды pSPB12 , содержащий 0.465 тпн

Рис.1. Плазмида pBSBi, сконструированная для изучения экспресии гена гордеина В1 иод контролем /ас-нромотора в клетках E.coli.

промоторной области, 0.879 тип белоккодирующей и 1.4 тпн 3'-фланкирующей области гена гордеина. Затем плазмиду обрабатывали рестрнктаэами Xbal и Iipal. Сайт Hpal расположен в гене гордеина в промоторной области на расстоянии 14 пя от АТГ-кодона. Xbal-конец достроили и плазмиду залигировали саму на себя. После лигирования сайт Xbal восстановился, что позволяет кодирующую область гена после модификации вырезать и встраивать в векторы для трансформации растений.

Таким образом была удалена промоторная область гена гордеина, а сам ген попал в рамку считывания гена lacZ. В полученной плазмиде pBSBl (рис.1) между белоккодирующей частью гена гордеина и lac- промотором

находится последовательность бактериального гена lacZ н фрагмент 5'-петраиглирусмой области гена гордеина,

M i M Г Т N S S S V P С 1) P L E АТС ЛСС ЛТО Л'Г'Г ЛС(г ЛЛТ TC(> АС.С ТСС СТА ССС GCG GAT ССТ СТА CAA nos Т M К Т F L I г Л J, I, Л !

«•Ч'.4^м...тсс.лсс^тс лаг, лес /пч: стс лте .тттс.сл стс стс ссс ait

А Л Т S Т 1 Л О О О P F Р О О Р CCGGC\ АСУ AGT ACO AIT GCG CAG CAA CAA CCA TIT CCA CAA САЛ ССС i P Q (> p О Г Y P O Q Г О P Y P АТС CCA CAA CAA CCA CAA CCA TAC CCA ÇA A _ CAA ССЛ CAA CCA _ ! ai

0 Q P Г Q P Q Q [' F P Q 0 P V P CAA CAA (ТС TTC . CAA CCG CAA CAA CC-Л TTT ССЛ CAA CAA ССС СТС CCA

У Q Р О P Y P Q Q P F P P Q Q P CAA CAA CCA CAA CCA TAC CCA CAA CAA ССС TTC CCA CCG CAA CAA ССЛ F P Q Q P P F W Q Q К P F P Q Q TYSLCCACAA СЛЛ CCA CCA TTT TGG CAA CAA AAA ССАТТТССАСАЛ CAA

P P G Q Q P / h S О О Q » с

ССАССЛГГТ GGG CT АС Л A САЛССАЛТТСТЛ ТС G CAO С* Л CA Л ССЛ ГОТ

Г 1' о • > Т ... АСА ¿'СА_.СДД_СЛ4 .ЛСА.i

Риг 2 Î Í у к )i ошдтя и аминокпед^ гпа.ч ¡юследовательцосд! xi,'i4í-¡;:¡o¡í> ihm ß-

1 ' ч Й1ДП.Ч.1 f 0|)ДР!П] lïi t !v KJICO I ü IHCl/i 'H. j í 'i'.' Ь ' <1 Д1 . Ii'lúl i 11 ' !SÍ

лпдчфтпгдга , ) íci;í;j ддд-' ■.>>/ .д.11 :jj.': i:; .шд ::-ч ítala.

Гранекртнптя такой конструкция привел«- к синтезу химерного -ß-галактозидаза-гордемн (пика. На рисунке 2 црздгглвлеи фрсм-монт нуклеошдной и аминокислотной последовательности химерною iciia, начиная с А'ГГ кодола гена lacZ.

После секвениропапня ила.шиды выяснилось, что в результате клонирования в кодирующей области гона трденна произошла деления 96 пуклеотндов. Деления не затронула рамку считывания гена.

1.2. Конструирование вектора для экспрессии гена гордеина в Synéchocystis sp. 6803.

Для введения гена гордеина в клетки цианобактерии ЗупескосузИз ¿■р.6803 использовали интегративный вектор р39Л-Кт. Эта часть работы выполнена в соавторстве с д.б.н И.В.Еланской (кафедра генетики МГУ). Плазмида р39А-Кт представляет собой вектор рВИ325 с ЕсоШ-ВатШ фрагментом хромосомной ДНК цианобактерии Synechocy.st.is хр. 6803 размером 3,1 тпн из илазмиды р39А (Шсстаков и др.,1989). Внутрь фрагмента цианобактериальпой ДНК но сайту НтсШ1 встроен фрагмент ДНК Тп5 размером 3,2 тпн, несущий гены устойчивости к канамипину, блсомицину и стрептомицину. Наличие фрагментов ДНК Бупескосу$№ $р.6803, фланкирующих участок ДНК Тп5 с генами устойчивости, обеспечивает при трансформации клеток цианобактерии встраивание тагов

Рис.3. Плазмида ЗШогШ, сконструированная для изучения экслресии геиа горлеина В1 под контролем ¿ас-промотора в клетках Synechocystis sp. 6803. Обозначения: Kmr, Blco', StpT - маркеры устойчивости к канамицину, блеомицику и стрептомицину из Тп5. Жирной линией обозначены фрагменты хромосомной ДНК Synechocystis sp. 6803, гошеой лшшей -ДНК pBR325.

устойчивости в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации (Williams and Szalay,1983).

Поскольку /йс-промотор функционирует п клетках цианобактертш, фрагмент пляямилы pBSBl размером 2 нш, нс-сущпй ген гордгшга под контролем /лоиромотора, вырезали по сайтам PvuII и клонировали по caihy Siual и rene ycTofrmRoc™ к блеомицину илазмвды рЗОД-Кш. Ген иеомпцннфогфотранефнразы использовали в качестве маркерной) гена. Полученной рекомбннантной плазмидой р31НогВ1 (рнс.З) граисформпрова чи клетки Synrrhonjsm л/j. GS03 п отбирали капамипипустойчивые клоны. Хромосомную ДНК этих клонов расщепляли но ВаюН! и анализировали блот-тибридюацпей по Cay зерну. В качестве зонда использовали меченный [P32¡ PvuII фрагмент плазмнды pBSBl, содержащий ген гордеина и lac-nvonmoo. В ДНК одного из двух клонов, 1 2 3 4

1 Í тгщ „.!.

íív

* ■»«««»> L r,

» «йДщ^. ~~ 1.5 тпн

Рис/). Радпоаигофаср блш-гпоридизашш ВатШ фрагмента |еномнон ДНК ргкпмбипаитпьтх глотов ЯупвсЫкч&Н ¡р.6803 с меченным № 1Ч-и 11 фрати-итом п.тазмпдм рШ;«!, содержащим геи гордеина В1

1,2 -ДНК канамицинустойчиьых клонов ¿'уп<>с1тсухИ.ч \рМК0'}, трансформированных плазмидой р31НогВ1;

3 - Д11К из клеток дикого типа 5упес1юсу$Ш 6803; Л- Рун11 фрагмент рВЗВ1.

длительное время растущих иа средс с 20 мг/мл канамицина, обнаружен фрагмент размером 1,4 тпн, соответствующий размеру BamHI фрагмента гена гордеина и дающий положительный гибридизадиошшй сигнал, что свидетельствует о встраивании гена гордеина в хромосому цианобактсрии (рис.4),

1.3. Экспрессия гена гордеина В1 в клетках E.coli и цианобактерии Synechocystis sp. 6803.

Выделение и электрофорез бактериальных белков проводили по Лэмли. Поскольку после окрашивания геля Кумасси в районе от 30 до 40 кДа, где должна находиться полоса В гордеина, выявляется масса полос прокариотических белков, для более четкой идентификации гордеинового белка использовали иммунологическую реакцию. После электроперецоса белков на нитроцеллюлозный фильтр, фильтр окрашивали антителами против фракции В гордеинов. В качестве положительного контроля использовали гордеиповую фракцию ячменя Донецкий 4, отрицательного -тотальный препарат белка из клеток E.coli, трансформированных вектором pBSM13. Среди белков трансформированных штаммов E.coli и Synechocystis sp.6803 обнаруживается полоса на уровне движения В1 гордеяна, которая связывается с гордеиновыми антителами (рис.5).

Таким образом, в бактериальных клетках показан синтез химерного белка Д-галактозидаза-гордеин. Трансляция в бактериальных клетках начинается с инициирующего кодона Дгалактозидазы. Синтезируемый белок на N-конце содержит 14 аминокислот /? галактозидазы, 4 аминокислоты, считываемые с фрагмента 5'-иетранслируемой области гена гордеина, и 19 аминокислот сигнального пептида гордеина. Так как в кодирующей области гена гордеина произошла не нарушающая рамку считывания делеция 96 нуклеотидов, синтезируемый химерный белок содержит укороченный на 32 аминокислоты гордеин и его общая длина составляет 280 аминокислот.

з 4 5 6

Piu > Нгпсрк-б.тот ;>:i:::tn : Ле-жов на кл'.ччж Ii.coli н Sipierhonptis ,v/>.Ш)3 с ¡юмочтт.то

:1|1'М11СЛ ГОрДСЧШОНСШ фрнКЦИИ ИЧМСЛЯ.

I Ilpciup-n белков Iкусток ¿'.cn/i, грлнсфордшров^ипых плазмидои pliSlit (беа индукции ШПТ); 2 - То :кс с индукциой ИШТ, - Тога'гыпы фршлшн юрдсл/юм шдооперма я ■ v i!,! 4 - !Ip^uap^j бгчкпн и,! клеток /:.rr;/i, трансформированных конipuj!o!iijii лдахмддои pBSMKi; 5 - Препарат ппi-oi* iüi клс-ivk Syiirrhocijslh трансформированных контрольной плазмидой р39Д-Кт; 6 - Препарат белков из клеток Sym'chiifijslitsjI eSfl'i. траисформнрои.шны?; i i^:ij.j■ Д1 р'ШТогН1

Поэтому элсктрофоретическая подвижность п ПААГ химерного гордеина не отличается от такоиой зрелого В1 гордеина из эндосперма ячменя (274 амтюкяслоты). Исходя из итого, молено говорить о способности модифицированного гена шрдеина к экспрессии в бактериальных системах.

Интересно отметить, что синтез гордеина, контролируемый tac-иромотором, наблюдается в клетках E.coli, трансформированных плаэмидой pBSBl, без добавления индуктора. Возможно, внесение

индуктора приводит к синтезу большего количества белка, что, в связи с его гидрофобностью, может быть токсично для клеток E.coli.

2. Конструирование легумин-гордеин химерных генов.

Без дальнейшего изучения регуляции процессов синтеза и запасания невозможна манипуляция количеством и составом запасных белков злаков и бобовых. Создание химерных генов на основе двух разных генов запасных белков, в которых кодирующая область гена подстроена под контроль чужеродных регуляторных последовательностей, может внести вклад в изучение особенностей механизмов регуляции процессинга и аггрегации запасных белков. В настоящей работе сконструированы четыре химерных гена на основе гена гордеина В1 (ячмень Н. vulgare L.) и гена лету мина В4 (Vicia faba L.).

2.1. Конструирование базовых плазмид pHLH1 и pLHLl.

В качестве исходных плазмид использовали плазмиды pSPB12 и pLJl. Плазмида pLJl представляет собой вектор pBSM13(+) со встроенным Belli фрагментом размером 4,7 тпн, содержащим кДНК копию гена легумина В4. Плазмида любезно предоставлена доктором Young R. (Институт генетики культурных растений, Германия).

Чтобы получить химерные гены, последовательность одного гена встраивали в последовательность другого. Xbal-EcoRI фрагмент длиной 2,8 тнп с геном гордеина из плазмиды pSPB12 встроили в полилинкер плазмиды pBSM13(-). Плазмида pHLHl получена путем вставки SphI фрагмента плазмиды pLJl, содержащим 152 пн промоторной области, 1450 нн кодирующей области и 144 пн З'-нетранслируемой области гена легумина, в достроенный Kpnl сайт кодирующей области гена гордеина. (рис.6). Таким же способом была получена и плазмида pLHLl: Bell фрагмент плазмиды pSPB12, содержащий 0.21 тпн промоторной, 0.879 тпн

[Kpnl, Split]

stop

[SphI, Kpnl]

poly A

T.eg-4B

Ж HÖR B1

Xbai ä ph

poly A

KcoKi

Рис.б. Плазмида рНЬН1 содержит БрЫ фрагмент с геном легумина В4, встроенный в Крп1 сайт кодирующей области гена гордеина В).

ВатШ/Вс11 Вс11/ВатН1

HÖR Iii

[ИатШ, I'.qlU]

Ыор l'ol-vA

Leg 4 it

% lUijlll, liiimHI]

pUIL 1

lO.Ofl k!i

P»c.7. Плазмида рЫПЛ содержит Bell фрагмент гена гордеина Iii, иенриешшй и кодирующую облапь lean легумина {И по BamHI сайту.

кодирующей и 1.325 тпн З'-фланкирующей области гена гордеина встроили в BamHI сайт кодирующей области гена легумина (рис.7).

2.2. Получение финальных конструкций.

Конструирование химерных генов требует точной подстановки кодирующей области гена под контроль чужеродных регуляторных последовательностей. В плазмидах рЬНЫ и рНШ1 кодирующая область встроенного гена отделена от регуляторных последовательностей другого гена протяженными участками ДНК. Для устранения нежелательных фрагментов ДНК, разделяющих регуляторные и кодирующую области, использовался метод олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. Были синтезированы олигопуклеотиды для специфических делеций и праймеры для сиквенирования полученных конструкций (таб.1).

Для плазмид серии НЬН синтезировали олигопуклеотиды, пришивающие стоп-кодон гена легумина к первому нуклсотидуЗ'-иетранслируемой области гена гордеила (ЫЬ2), последний нуклеотид 5'-нетранслируемой области гена гордеина к стартовому кодону гена легумина ШЬЗ) и последний нуклеотид последовательности, кодирующей сигнальный пептид гена гордеина, К первому нуклеотиду последовательности гена легумина, кодирующей зрелый белок (ЫЬ4).

Таблица 1. Олигопуклеотиды, синтезированные для мутагенеза и ссквенирования рекомбинаптных генов.

Наименование Нуклеотидная последовательность Координаты

ЫЬ2 5'-стсллтс/глл'пх;л(;ллл'гслссглто-3' 1760-1797

ЬШЗ 5'-ААСАССАЛТССАССАТОТССЛААССТТТТС-3' 316-345

ЫЬ4 5'-ЛЛСТАСОАТТОСОАСТАССТСТОАО-3' 374-398

ЫЬ5'-рг1тег З'-СОСЛТОТАОТАТАОАОАТС-З' 259-277

ЫЬЗ'-рптег 5'-ССОТСОСССТСТСЮТТСАССС-3' 1739-1759

1Ы2 5'-ООТСТСТАСТС.АТЛЛОЛ'!'СЛ'ГССТЛЛ(>и-3' 1111-1138

1ЫЗ З'-ЛСТАТСАСАО'ГСЛСАЛТОЛАОЛСС'П'СС-З' 214-241

1Ы4 З'-ССАСАТСТТТАОСАСАОСААСААССАТТТ-З' 281-309

1Ы5'-рс1тсг ' 5'-САССАСТТСЛССАСТТСАСТСАС-3' 172-194

1ЫЗ'-рг1тег З'-ССТОСОАОСССТТСОССССАС-З' 1086-1106

Для плазмид серии ЬНЬ были синтезированы олигопуклеотиды, продуцирующие подобные делении 01)12, 1ЫЗ, 1Ы4).

p polyA

LER ATO TOA LEG

В HORDEIIf GSIE

polyA

LEG ATC3 TGA t,EG

Ill1l||lt<lt>|lll"ll[

SPLEO

¿SSf 3 HOHDEIN GENE

polyA

5

P

НОИ ATG TGA H0R

LEG0MIN В GESE 3

polyA

ВЕйветшвивЕЙет ......................»"»Ksrasssi'siaa

IIOR ATG TGA K0R

•O

LEGUMIN В GENE 3'

3P HOK

Рис,8. Схема рскочомпаи шых icnon, иолучешнях ¡ra ornoije i'eiinn гордстптп R1 и /ктумигга B4: 1 - LHL3; 2 - LHL4; 3 - ULHJ; i - НI.II4. Послсдокате.шнопь гена легумшм обозначена пунктирной линией, гена гордеина - сплошной. Под номерами 2 и 4 приведены схемы генов с замененными последовательностями, кодирующими сигнальный пептид.

С помощью атого метода были получены две серии химерных генов: одна с peí уляториымп элементами гена гордеина и кодирующей областью гена легумина (HLH серия), вторая с кодирующей областью гена гордеина и регуляторными последовательностями гена легумина (LHL серия). С целью изучить функциональную специфичность сигнальных пептидов

обоих генов в этих сериях сделана и замена последовательностей, кодирующих сигнальный пептид (рис.8).

Полученные химерные конструкции встраивали в бинарные вектора pBIlOl и pGA471, имеющие RP-4 ori Т и способные реплицироваться как в Е. coli, так и в Agrobacterium. Провели генетическую трансформацию табака и получили канамищшустойчивые растения.

3. Анализ трансгенных растений табака.

Проводили анализ растений табака, трансформированных нлазмидами pLHL3BI и pBIHor, несущих белоккодирующую часть гена гордеина под контролем регулятортшх последовательностей гена легумина и ген гордеина под собственным иромотором, соответственно. Присутствие последовательностей ДНК, гомологичных последовательности гена гордеина в геноме канамицинустойчивых растений табака, определялось с помощью ПЦР геномной ДНК и блот-гибридизацией продуктов ПЦР но Саузерцу. Отрицательным контролем служил препарат ДНК, выделенный из ^трансформированных растений табака.

Анализ ДНК листьев табака, трансформированного геном гордеина под контролем собственного промотора, проводили, используя синтезированные праймеры Р38 и А8-18. Праймер Р38 синтезирован к участку 5'-иетраискрибирусмой области гена гордеина

(5' -CATGTAAAAGTGAATAAGGTGAGTC-3'), А8 18 комплементарен середине кодирующей области гена (5 '-GGTACAGTTGTCCTTGTG-3'). В процессе ПЦР ДНК гена гордеина должен амплифицироваться фрагмент размером 0.G тип. В электрофорезе продуктов ПЦР в семи образцах из шестнадцати препаратов ДНК трансформированных растений табака выявляются полосы олсидаемого размера (рис.ЭА). Амплификация фрагмента гена гордеина подтверждалась блот-гибридизацией но Саузерцу, где в качестве зонда использовали меченный [Р32]-олигонуклеотид, синтезированный к другому участку 5'-нетранскрибируемой области гена гордеина (5'-CAAACCAAGCAACACTCG-3') ( рис.ЭБ).

1 2 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 И 15 16 17 18 19 20

Рис 9. ПЦР-анадга ДПК капамишшупойчичмх растений табака, тряш-форшчюкаппыч илалмпдип рВШог. Размер ожидаемого иродуккч О G тгш. Л Электрофоне:) продуктов ПЦР.

1 - ДПК фат ">. IMI, 2-7, И) 1.4 ЛПК трапсформироиандых рапенпн niftara; 8 - ДНК ячменя; 9 - ДНК плазмиды рШНог; 19,20 - ДНК нетрансформированных pnriciinü табака. IS Радноаптограф 6 ют-гибридизации продуктов ПЦР по Саузерпу. Ii качестве зонда пгполъ.юпап меченный (Р»| олшоиуклготпд ( Г)' - С А Л Л С О А Л (тСЛ Л С Л СТС G -X >.

Анализ ДНК, выделенной из листьев табака, трансформированного (сном горденна под контролем регуляторных последовательностей гена. легумнна (плазмнда pLITL3Bi), проводили, нсильзуя нраймеры 2772 и GIJS2. Праймер 2772 синтезировали к 3 -концу кодирующей области гена горденна (5' GGGGCCCAGTTTGGTGTCAAGTG-3'). Праймер GUS2 комплементарен участку З'-конца кодирующей области гена GUS плазмиды pBIlOl (5'-TTGCCAGAGGTGCGGATTCA-3').

■12 3 4 5 6 7 «

Рис. 10. ПЦР-апализ ДНК канамицииустойчивых растений табака, трансформированных плазмидой рШШЬЗ. Размер ожидаемого продукта 1.5 тпн.

A. Электрофорез продуктом ПЦР.

111 - ДНК трансформированных растений табака; 12 - ДИК нлазмиды рВ1ЬНЬЗ, 13-14 -ДНК ^трансформированных растений табака; 15 - ДНК фага

B. Радиоавтограф блот-гибридизацик продуктов ПЦР по Саузерну. В качестве зонда кспользовап меченный (Р^-ВатШ-РзИ фрагмент гена гордеина размером 0.4 тпн.

Продукты ожидаемого размера (1,2 тпн) обнаружены в четырех образцах из десяти (рис. ЮЛ). Гибридизация продуктов ПЦР по Саузерну с использованием в качестве зонда меченного [Р32]-ВатН1-Р8(;1 фрагмента гена гордеина размером 0,4 тпн подтвердила присутствие гордеиновой

последовательности в геноме табака, трансформированного плазмидой PLHL3BI (рис. 10Б ).

Таким образом, получено одиннадцать независимо

трансформированных растений табака, семь из которых содержат и геноме ген гордеина В1 под контролем собственных регуляторных элементов и четыре - химерный геи, состоящий из белоккоднругощей части гена i'орденпа и ре1уляторпых последовательностей гена тегумина. Все растения фертпльпы ц от них получены семена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проделанной работы получены вектора для экспрессии гена гордеина В1 в бактериальных системах. Данные по экспрессии гена гордеина в клетках E.coli и цканобактершг Synechocystis sp. РСС6803 демонстрируют способность прокариотических систем к синтезу гордеина и могут быть использованы в олигонуклеотиднаправлепном мутагенезе генов горденнов. Гордс.'шьг бедны лштиоы и один т подходов К улучшению питательной ценности зерна связан с изменением in vitro нуклеотнднон последовательности кодирующей области генов и внесением добавочных колонов лизина. О л и гоиуклеотид направленный мутагенез позволяет нноешь подобного типа изменения в последовательность гена, а использование о/шонитевого фага pBSM13, в котором клонирован геи гордеина В1, даст возможность белоккодирующую часть гена клонировать, модггфи;(пронять, секвенировать и экспрсссировать и одном и том же век'юус. Влияние »носимых в последовательность шго изменений на синтез белка могут быть изучены экспрессией мутантного гена в клетках E.coli. Способность гордеина синтезироваться в Synechocystis sp. 6803 показывает, что клетки цианобпктернн являются подходящим объектом для клонирования генов запасных белков растений под контролем бактериальных нромогоров. Показано, что деления фрагмента кодирующей области гена, соответствующего пролннбогатому участку гордеина, пс влияет на синтез белка.

Чтобы успешно манипулировать количеством и составом запасных белков, необходимо изучить механизм регуляции синтеза белка, процессов, приводящих к формированию белковых тел. Важным методом решения этой проблемы является создание химерных геиов. Нами получены четыре химерных гена на основе двух генов запасных белков: гена гордеила В1 ячменя Н. vulgare L. и гена легумина В4 бобов Vicia {aba L. Используя метод олигонуклеотиднаправленного мутагенеза, кодирующую область гена гордсипа подстроили под контроль регуляторных последовательностей гена легумииа, а кодирующую область гена легумина-под контроль регуляторных областей гена гордсипа. В двух химерных гагах также произвели замену последовательности, кодирующей сигнальный пептид. Полученные конструкции встроили в вектора для опосредованной Agrobacterium tumefaciens трансформации растений. В качестве модельной системы экспрессии использовали табак. Проанализированы две независимо трансформированные линии табака. В геноме трансформантов показано присутствие гена гордеина и химерного гена с белоккодирующей последовательностью гена гордеина и 3'-, 5'-рсгуляторными последовательностями гена легумина.

Изучение в дальнейшем экспрессии полученных химерных генов в трансгенных растениях позволит получить новые данные о механизмах процессинга, транспорта и запасании проламинов и глобулинов. Поскольку механизм формирования белковых тел проламинами и глобулинами различен, изучение экспрессии химерных генов может выявить особенности сортинга запасных белков двудольных и однодольных растений. Экспрессия химерных конструкций в растениях позволит изучать специфичность регуляторных элементов и последовательностей, кодирующих сигнальный пептид, а также роль 5'-нетранслируемой области гена.

ВЫВОДЫ.

1. С использованием метода олигонуклсотидпапраиленного мутагенеза сконструированы четыре химерных гена на основе генов запасных белков ячменя llotdcum mdgarc L. и бобов Vicia fal>a L .-гордеина B1 и легумина Н4:

ген, который содержит белоккодирующую часть гена легумина и регуляториые последовательности гена гордеина;

ген, который содержит часть гена легумина, кодирующую зрелый белок, а регуляториые последовательности и последовательность, кодирующая сигнальный пептид, принадлежат гпту гордеина,

ген, который содержит белоккодирующую часть гена гордеина и регуляториые последовательности гена легумина;

ген, который содержит часть гена гордеина, кодирующую зрелый белок, а регуляториые последовательности и последовательность, кодирующая сигнальный пептид, принадлежат retry легумина.

2. Созданы векторм для экспрессии гена гордеина В1 и клетках E.coli и ииаиобкктерии Syncchocystis sp. PCC6S03.

3. Получены тращтенные растения табака, содержащие интегрированный к гпюм геи гордеина и химерный ген, содержащий белоккодирующую область гена гордеина и регуляториые последонателыюпп гена легумина.

3. Впервые показана экспрессия гена гордеина н Escherichia coli.

4. Впервые показана способность клеток цианобактерий к синтез)' запасных белков ржтешш.

Список работ, опубликованых по теме диссертации,

1. Чемерсскж H.I-I., Юнг Р., Мехедов С.Л., Ананьев Е.В. Получение рекомбинантных генов запасных белков из генов ячменя и бобов. Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". .Москва, 1990, с. 182.

2. S.Mekhedov, O.Sayanova, N.Ciiemeresjuk, D.Bclostotsky, R. Young, E. Ananiev. Genetic engineering approaches to improve nutrition quality of seed protein in barley. Abstracts of Golden Jubilee symposium on "Genetic

Research and Education: current trends and the next fifty years". New Delhy, 1991, v. Ill, p. 858.

3. Чемересюк H.H., Еланская И.В., Ананьев Е.В. Экспрессия гена В1 гордеина в гетерологичных системах. Тезисы II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений. Лущино, 1993, с. 96.

4. Чемересюк Н.Н., Еланская И.В. Клонирование и экспрессия гена В1 гордеина ячменя (Hordeum vulgare L) в клетках цианобактерии Symchocystis sp. РСС6803 и Escherichia coli. Генетика, 1994, т. 30, №9, с. 1143-1145.

Заказ № 01684. Тираж 70 экз. Бумага Купчих. Отпечатало ЗАО "Кардинал Глен" Тел: 270-8835, факс: 270-2283.