Цитологические основы трансдифференцировки в тканях глаза позвоночных животных

Григорян, Элеонора Норайровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитологические основы трансдифференцировки в тканях глаза позвоночных животных
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Цитологические основы трансдифференцировки в тканях глаза позвоночных животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591. 169

ГРИГОРЯН Элеонора Норяйровна

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ТКАНЯХ ГЛАЗА ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.11 — эмбриология, гистология, циюлогия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

Работа выполнялась в лаборатории проблем регенерации Института биологии развития им П. К. Кольцова РАН (директор Института — академик РАН Н. Г. Хрущов, зав. лабораторией проблем регенерации — проф В И. Миташов) и в отделе экспериментальной морфологии Института зоологии Кельнского Университета, Германия (зав. отделом — проф. Ш Беркинг, зав. лабораторией — проф. Г Дж. Антон).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Я. Бродский доктор медицинских наук, профессор Л. Г. Бабаева доктор биологических наук, профессор Ю. С. Чепцов

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М В. Ломоносова

Защита состоится 1998 г. в 11 часов на заседании Диссертационного

совета Д002.85 01 при Институте биологии развития им.Н. К. Кольцова РАН по адресу: 117808, Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН

Автореферат разослан ::J"£>tZ7JгJ//Уl 1998 г. Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

Е В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение трансдифференцировки клеток (г е превращения клеток, уже экспрессировавших черты специфической дифференцировки, в другой клеточный тип, отличный от исходного набором новых фенотипнчески.х черт) является актуальным, как минимум, по двум причинам Эта проблема — одна из фундаментальных, во-первых, в области изучения клеточной дифференцировки, во-вторых — в исследованиях регенерации органов и тканей.

Именно пластичность клеточного фенотипа представляег один из механизмов (наряду с участием недифференцированных, либо стволовых клеток), обеспечивающих регенерацию многих органов и тканей у беспозвоночных и низших позвоночных животных С участием этого механизма возможно восстановление некоторых тканей и у высших позвоночных животных (см например: Стокум, Миташов, 1990, По.'пева. 1996; Okada, 1991; Chen et al. 1995; Eguchi, 1995, Schmid, Rebermiiller, 1995, Tsonis et al., 1995; Reh, Pittack, 1995, Rao, Reddy, 1995; Yuan et al., 1996).

Вопрос о пластичности клеточного типа является фундаментальной теоретической проблемой, так как в основе этого явления лежит нарушение стабильности клеточной дифференцировки (спецификации), клеточный рост, клеточная миграция и смена типов функциональной нагрузкн. Исследование изменений клеточной дифференцировки помогает ответить на основные вопросы биологии развития как возникают фенотипические различия и становятся стабильными клеточные линии многоклеточного организма, когда и при каких условиях происходит расхождение путей дифференцировки и т. д

Цель и задачи исследования. В большинстве изучаемых биологией развития систем анализируются механизмы последовательных изменений, происходящих в клетках на пути к их окончательной специализации. Направлением нашей работы было изучение цитологических основ смены клетками типа своей дифференцировки (трансдифференцировки) на примере клеток глаза взрослых низших позвоночных животных — тритонов Для исследования были выбраны три модели:

1) превращение пигментного эпителия сетчатки (ГГЗС) в клетки нейральной сетчатки.

2) превращение пигментного эпителия радужки (ПЭР) в клетки хрусталика,

3) превращение биполяроподобных клеток нейральнон сетчатки в фоторецепторы сетчатки.

Основной целью данного исследования явилось изучение:

1) трансднфференцировки клеток глаза низших позвоночных с точки зрения изменений общих и смены специфических внутриклеточных синтезов и

2) различных экзогенных и эндогенных механизмов регуляции превращения клеточной дифференцнровки.

Конкретными задачами исследования были следующие

— изучение соотношения пролиферации и специфического синтеза (синтез меланина) в пигментированных эпителиальных клетках глаза, претерпевающих конверсию фенотипа,

— исследование времени появления и локализации специфических макромолекул новых возникающих дифференцировок: Б-100 белка, белков нейрофила-ментов и кристаллинов при превращении ПЭС в нейральную сетчатку и ПЭР в хрусталик, соответственно;

— изучение активности синтезов РНК, общих и негистоновых ядерных белков в процессе трансднфференцировки клеток ПЭС и ПЭР,

— исследование экспресии специфических белков цитоскелета в процессе конверсии клеток ПЭС в нейральную сетчатку;

— изучение регулирующей роли адгезионного компонента внеклеточного матрикса, фибронектина на начальных этапах трансднфференцировки клеток ПЭС и ПЭР,

— исследование роли рост-стимулирующих и рост-ингибирующих факторов в прогрессе трансднфференцировки клеток ПЭР в хрусталик;

— изучение роли межтканевых взаимодействий при осуществлении финальных этапов трансднфференцировки клеток ПЭС;

— обнаружение и изучение процесса превращения дифференцированных клеток нейральной сетчатки (биполяроподобных клеток в фоторецепторы)

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна работы заключается в том, что впервые дана характеристика процесса трансдиффренци-

poBKti клеток глаза не только с точки зрения изменений их внешних морфологических признаков и пролиферативной активности, летально изученных ранее (Миташов, 1968, 1969, 1970, 1980, Миташов и др.. 1973; Sato, 1940; Reyer, 1954, 1977а; Hasegawa, 1958, Williams, 1964; Hendrikson, 1964, Eguchi, 1964, Karasaki, 1964; Stone, 1965, Yamada, 1967b; 1977; Dumont, Yamada, 1972), Keefe, 1973; Eisenberg-Zalik, Yamada, 1967, Yamada, Roesel, 1969,1971; Yamada et al., 1975), но описан широкий ряд внутриклеточных биосинтетических событий, сопровождающих процесс клеточной конверсии. Показано, что в клетках, меняющих тип своей дифференцнровки, происходит смена специфических синтезов, активация синтеза РНК, общих и негистоновых ядерных белков, смена специфических макромолекул цнтоскелета. Обнаружено, что исходный специфический синтез пигментных клеток глаза (синтез меланина) подавляется, а затем активируется синтез белков новой дифференцировки. Появляются S-100 белки и накапливаются белки нейрорецепторов в новой, возникшей из ПЭС, развивающейся клеточной популяции нейральной сетчатки; появляется полный спектр белков хрусталика (я, ft, у- кристаллины) при трансдифференцировке клеток ПЭР в хрусталик. Данные о связи трансдифференцировки клеток ПЭС с подавлением меланинового синтеза находят подтверждение в настоящее время в других лабораториях, использующих иные подходы и методы (Negishi et al., 1992; Fuji, Wakasugi, 1993). На основе собственных данных по меланиновому синтезу при сопоставлении с литературными данными по белкам премелансом и тирозиназе выдвинуто предположение о том, что подавление исходного синтеза в клетках происходит из-за нарушения не всех, а только отдельных звеньев процесса. Выяснено, что процесс смены специфических синтезов связан либо с синтезом белков de novo (S-100, белки нейрофиламентов), либо с активацией синтеза белков, наличие которых возможно обнаружить и в исходных клетках (a, ft- кристаллины, белки нейрорецепторов) Результаты исследования специфических синтезов в клетках ПЭС и ПЭР показали также, что нег прямого переключения с одног о специфического синтеза на другие в исходных клетках или в первом поколении их дочерних клеток. В результате высказано предположение, что транзитные, возникающие в процессе трансдифференцировки активно пролиферирующие клетки, на основе морфологического анализа прежде рассматривающиеся как дедифференцированные, с точки зрения протекающих в них специфических биохимических процессов таковыми не являются. Это предположение подтверждено в результате анализа взаимозамены в трансдифференцирующихся клетках специфических белков цитоскелета Показано, что

специфические белки промежуточных филаментов цитоскелета клеток ПЭС — цитоке-ратины, рано, но постепенно замещаются белками нейрофиламентов. При этом такая замена не зависит от пролиферации и миграции клеток. Кроме того выяснено, что смена специфических синтезов, пролиферация и миграция трансдифференцнрующихся клеток ПЭС и ПЭР сопровождаются значительной (в 2—4 раза) активацией синтезов РНК, общих и негистоновых ядерных белков.

Научная новизна работы заключается в исследовании экзогенных факторов, контролирующих трансдифференцировку пигментированных клеток глаза. Впервые показана роль адгезионных молекул внеклеточного матрикса, фибронектина в инициации и на ранних этапах трансдифференцировки клеток ПЭС и ПЭР. Это исследование позволило поставить вопрос о механизмах регуляции дифференцировкн клеток со стороны микроокружения, активно разрабатывающийся в настоящее время (Mazaki et al., 1996).

Роль ростовых факторов в регуляции трансдифференцировки клеток изучена с помощью как обработки трансплангатов вентральной радужки (ш vivo не превращающейся в хрусталик) фактором роста гидры, так и при трансплантации в полость лин-зэктомироканных глаз фрагментов ПЭС, превращающихся в сетчатку. В результате было индуцировано образование хрусталиков из клеток вентральной радужки. Эти результаты явились одним из первых свидетельств возможное™ стимуляции трансдифференцировки через активацию пролиферации клегок посредством факторов роста. Работа с использованием ретиноевой кислоты была первой, показавшей ингибирую-щий эффект морфогена на пролиферацию клеток радужки, который не приводит, однако, к каким-либо нарушениям или изменениям в регенерации хрусталика.

Регулирующая роль межтканевых взаимодействий в трансдифференцировке клеток ПЭС бьша показана при сохранении/снятии подлежащих ПЭС тканей и культивировании таких фрагментов в полости глаза В результате удалось показать, что мор-фогенетичсские условия, создаваемые соседними тканями, необходимы для нормального формообразования возникающей сетчатки, терминальной дифференцировкн ее клеток, т е для завершения трансдифференцировки. Роль взаимодействий трансдифференцнрующихся клеток с субстразом только сейчас формируется в самостоятельную область исследований — цитомеханику трансдифференцировки (Opas, Dziak, 199-4).

Изучение на примере клеток глаза явления трансдифференцировки с точки зрения экспрессии специфических и общих макромолекул позволило впервые предложить

порядок - схему этого процесса, а исследование факторов регуляции трансдифферен-цировки — привязать их действие к последовательным этапам этого процесса Создание впервые такой схемы позволяет в настоящее время использовать данные модели для изучения тонких молекулярно-генетических механизмов трансдифференцировки.

Новизна работы заключается также в обнаружении впервые новых источников регенерации в нейральной сетчатке Обнаружено превращение биполяроподобных клеток нейральной сетчатки в фоторецепторы. Наличие клеточного резерва в дифференцированной сетчатке для пополнения популяции фогорецепторов до си\ нор было показано только у рыб (Raymond, 1991; Hitchcock, Raymond, 1992). Нам удалось не только продемонстрировать его у животных, принадлежащих к друюму типу, но и лас i. детальное морфологическое описание и сравнительную характеристику Эта находка открывает путь дальнейшего изучения явления пластичности клеточной диффсренци-ровки на примере постмитотических клеток нейральной сетчатки.

Научно-практическое значение.

Данное исследование, предпринятое с целью познания процесса изменения клеткой т ипа уже приобретенной дифференцировки и факторов его регуляции, необходимо в первую очередь для расширения наших теоретических представлений о пластичности клеточного фенотипа Дифференцировка, если имегь в «илу ее конечный результат, устойчива, что обеспечиваег живому организму его нормальные строение и слаженное выполнение всех функций Но если говорить о процессе ее приобретения (диффероне), то на его пути может быть обнаружен этап, при котором фенотип, приобретенный к этому моменгу клеткой, может быть изменен Это не является опровержением стабильности генома, а, напротив, его подтверждением, так как превращение дифференцировки только еще раз доказывает наличие в ядре полной информации н возможности активации соответствующих сайтов генома

Изучение цитологических основ трансдифференцировки на примере клеюк гла-ia позволяет понять многоступенчатый и сложный механизм этого процесса, основанный на полном или неполном подавлении исходных биосинтетических процессов п активации биосинтезов, хранящихся в «памяти» трансдифференцирующейся клетки Работа определила также, что такое переключение находится иод контролем ряда внеклеточных факторов, способных запускать и активировать отдельные этапы клеточной конверсии Последнее позволяет говорить о дальнейшем использовании изученных

факторов для искусгвенной инициации и стимуляции трансдифференцировки, являющейся одним из механизмов регенерации органов н тканей.

Полученные в настоящем исследовании данные могут быть использованы для поиска способов лечения некоторых заболеваний глаз человека, связанных со сменой клетками фенотипа и функции. При сравнении результатов нашего исследования с данными литературы о поведении ПЭС млекопитающих и человека при некоторых патологиях глаза видно, что оно имеет очень большое сходство с началом процесса конверсии ПЭС тритонов и других позвоночных животных. У млекопитающих, так же как и у других животных, клетки ПЭС меняются морфологически и претерпевают перестройку мембраны, цитоскелета и биохимических процессов, в результате чего приобретают способность мифировать и пролиферировать. Подробное изучение в работе факторов инициации и регуляции конверсии клеток ПЭС у тритонов помогает понять причину изменения поведения ПЭС у млекопитающих и подойти к разработке способов предотвращения трансформации этих клеток в глазах человека.

Практическое значение имеют также данные диссертации по стимуляции регенерации хрусталика из вентральной радужки с помощью ростовых факторов. Результаты показывают, что при направленных научно-обоснованных воздействиях оказывается возможным стимулировать регенерацию хрусталика в тех областях глаза, где она обычно не происходит, и добиваться формирования дополнительных регенератов.

Важным с практической точки зрения является и обнаружение еще одного реге-нерационного резерва в нейральной сетчатке. Превращение биполяроподобных клеток в фоторецепторы при отслойке сетчатки у тритонов ставит под сомнение утвердившуюся точку зрения о крайней устойчивости дифференцировки нейральных клеток и дает импульс для дальнейшего поиска источников регенерации нейральной ткани у других позвоночных животных

Детально разработанные в работе модели и методы могут служить для широкого дальнейшего изучения молекулярно-генетических механизмов клеточной конверсии и основанной на ней регенерации тканей, а также для использования в прикладных исследованиях. Примером такого приложения разработок диссертации является сегодня широкое применение моделей регенерации хрусталика и сетчатки глаза у тритонов для исследования влияния космических полетов (микрогравитации) на воеаанови-тельные процессы у позвоночных животных (Мка$Ьоу е1 а!., 1987, 1996, Grigoryan е! а!, 1998)

Препараты, приготовленные во время выполнения работы, в настоящее время используются на кафедре эмбриологии МГУ и в Институте Зоологии Кельнского Университета Данные, полученные в работе, включены в лекции по регенерации на кафедре эмбриологии и в курс по цитологии и гистологии Кёльнского Университета

Структура и объем работы. Диссертация написана по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение, заключение и выводы, список литературы и приложение. Глава «Обзор литературы» состоит из шести разделов, суммирующих сведения по транедифференцировке клеток ПЭР и регенерации хрусталика (I), изменению дифференцировки клеток ПЭС и регенерации сетчатки (II), по транедифференцировке клеток ПЭС в клетки хрусталика (III), по транедифференцировке клеток эмбриональной нейральной сетчатки (IV), по изменению дифференцировки клеточных типов нейральной сетчатки взрослых животных (V) В конце обзора литературы приводится заключение (VI). Глава «Материал и методы» в основном тексте диссертации представлена в кратком виде, а в полном, легализированном — в приложении к диссертации. Глава «Результаты» разбита на три больших раздела, соответствующих трем основным моделям исследования 1) превращение ПЭС в клетки нейральной сетчатки, 2) превращение ПЭР в клетки хрусталика, 3) превращение биполяроподобных клеток нейральной сетчатки в фоторецепторы сетчатки Глава «Обсуждение» включает четыре раздела: «Изучение явления транедифференци-ровки клеток на модели превращения пигментированных тканей глаза взрослых тритонов» (I); «Изучение внешних факторов, контролирующих транедиффереицировку пигментированных эпителиальных тканей глаза взрослых триюнон» (И), «Изменение дифференцировки клеток нейральной сетчатки и факторы, его кошролирующие» (I"). «Теории молекулярно-генетической регуляции конверсии клеточного феногина» (IV) Завершается диссертация общим заключением и выводами Приведен цкже полный список цитированной литературы и публикаций автора по теме диссертации (последнее в приложении)

Диссертация содержит. . . страниц,.. . таблиц; рисунков В списке ли-

тературы приведены ^^/'работы

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих рабочих. Всесоюзных, Российских и Международных конференциях, со-

вещаниях и симпозиумах: на VI, VII совещаниях эмбриологов (Москва, 1981; Ленинград, 1986). на симпозиуме «Клеточные источники регенерации» (Москва, 1979), на симпозиуме «Цитологические механизмы гистогенезов» (Ташкент, 1980), на II и III школах по проблемам регенерации (Йошкар-Ола, 1982; 1986), на симпозиуме «Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации» (Карачарово,

1985), на I и II совещаниях по морфогенетическм активным факторам (Пущино, I98S;

1986); дважды на секции цитологии, гистологии и эмбриологии МОИП, на конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, 1998), на финляндско-советских симпозиумах (Таллин, 1981; Тбилиси, 1984, Ташкент, 1988), на европейском конгрессе по биологии развития (Хельсинки, 1987), на I и II конференциях международной ассоциации исследователей регенерации (Женеьа, 1990, Кёльн, 1997), на VI и VII международных симпозиумах по нейральной регенерации (Асиломар, США, 1995; 1997). Во время работы в качестве приглашенного исследователя в Кельнский Университет автором прочитаны лекции в Институте Зоологии (Кельн, 1991; 1994) и Институте Биологии Развития (Тюбинген, 1992)

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

(Ith,скт uccieikmiiHuU Объектом наших исследовании служили взрослые половозрелые тритоны (Vrixlela) различных видов: обыкновенные — iritiirtis vulgaris, гребенчатые - frituras crislalus и иглистые — ¡'¡enrodeles wähl. Тритонов первых двух видов получали из подмосковных водоемов; тритоны Pleurtxkles wähl постоянно разводятся в аквариальной Института биологии развития РАН. Эти животные являются излюбленным объектом исследователей, изучающих процессы регенерации, так как во взрослом состоянии они демонстрируют уникальные способности к восстановлению утраченных органов и тканей Одной из ряда восстановительных реакций у этих животных является транедифференцировка клеток. Изучение именно этого свойства клеток являешя основой настоящей диссертации. Кроме того, эти животные неприхотливы и не требуют для содержания ни приготовления сложных сред, ни сложного оборудования Они легко переносят различного рода операции, так как не имеют типичной для теплокровных развитой воспалительной реакции.

Mixte и/ Hcc ietUmaiiuii. Работа была проведена на трех моделях. I) транедифференцировка клеток ПЭС в нейральные и глиальные клетки сетчатки, 2) транс-

днфференцнровка клеток ПЭР в клетки хрусталика, 3) превращение клеток ней-ральной дифференцированной сетчатки

Все три модели для выбранной нами темы исследований обладают рядом преимуществ Во-первых, изучаемые ткани топографически четко отграничены друг от друга: двуслойный пигментированный листок радужки и хрусталик, многослойная нейральная сетчатка и подстилающий ее однослойный ПЭС, сама нейральная сетчатка, обладающая крупными клетками, число которых ниже, чем у других позвоночных, и где легко идентифицируются как отдельные слои, так и типы клеток Во-вторых, среди клеток ПЭС и ПЭР а также в дифференцированной нейральной сетчатке (исключая ростовую область глаза) не найдено недифференцированных мульпшотентных клеток и клеток крови, затрудняющих обычно исследования такого рода И, наконец, ПЭС и ПЭР содержат естественный маркер дифференцировки — меланиновые гранулы Все названные ткани глаза хорошо изучены, а сведения по их строению и функциям представлены в ряде полных обзоров (см напр Лопашов, Строева, 1963, Школьник-Яррос, 1986; Панова, 1993, 1994, Ы(5иеп-1л^г05, 1978; Кеуег, 1977, Уатайа, 1977, Яиоеча, М^Ьоу, 1983).

Опе/кщии. При проведении экспериментов использовались различные операции, направленные на индукцию изменений названными клетками глаза их дифференцировки Операции включали полное удаление сетчатки и хрусталика одновременно или только хрусталика Кроме того использовалась техника оюлойки сетчатки после удаления хрусталика Все операции были проведены микрохирургическн, после наркотизации животных в растворах этилуретана или \1S-222, в соответствии с правилами РАН работы на живых объектах.

Цитирование тканей липа. Выделение тканей глаза проводилось микрохнрур-гнческн на холоде в средах, предотвращающих клеточкую гибель и сохраняющих клеточные мембраны. Вначале изолировали передний сектор глаза (роговицу, радужку, хрусталик), затем задний (сетчатка, пигментный эпителий, сосудистая и склеральная оболочка) Дальнейшие процедуры сводились к сепарации названных тканей друг от друга и накоплению их необходимых количеств для дальнейшего анализа (или трансплантации)

Панирование клеток глаза. При исследовании изменения экспрессии специфических белков промежуточных филаментов цитоскелета ПЭС (цитокератинов) было проведено окрашивание антителами изолированных клеток (как единичных, так и их

групп). Для этого проводились изоляция пласта ПЭС и диссоциация его клеток агентами, разрушающими клеточные контакты и адгезию к субстрату, перенос клеток на стекла и кратковременное культивирование.

Культивирование в полости глаза. Для ауто- и аллотрнсплантаций в качестве камеры культивирования использовали линзэктомированные глаза взрослых тритонов. В полость глаза микрохирургически пересаживали фрагменты ПЭС вместе с подлежащими сосудистой и склеральной оболочками, либо без последней Кроме того были использованы пересадки вентральной радужки после предварительной обработки ее ростовым фактором (фактором роста гидры). В последнем случае, и в эксперименте по изучению синтеза кристаллинов. проводилось также кратковременное органное культивирование in vitro.

Гистологические иссле()ования Гистологический анализ материала проводился по общепринятым методикам с использованием ядерных и реже цитоплазматических красителей С помощью гистологического анализа велось изучение морфологического состояния клеток на разных этапах их превращений, а также сравнение поведения клеток в различных областях исследуемых тканей.

Ра(>иоавтографическг<е исследования проводились с помощью различных меченых предшественников: синтеза ДНК — 'Н-тимидина, синтеза РНК — 'Н-уридина, синтеза общих белков — меченых по тритию аминокислот, синтеза негистоновых белков — '[ [-триптофана, синтеза меланина — 3Н-дигидроксифенилапанина ('Н-ДОФА). Меченые по тритию предшественники вводились внутрибрюшинно в специально рассчитанных концентрациях. Исследование включения ядерных маркеров оценивалось по индексам меченых ядер; цитоплазматических — по индексам клеток с меченой цитоплазмой и по интенсивности метки (обычно по числу зерен восстановленного серебра на выбранную единицу площади цитоплазмы). В случаях, когда интенсивность ме-чения была очень высокой (например, при включении 'Н-триптофана в ядра клеток зачатка сетчатки или 'Н-уридина — в ядрышки клеток), метку анализировали фотометрическим методом с помощью прибора МИА-11 (JIOMO), основанном на определении отношения фотоэлектрического сигнала от суммы зерен восстановленного серебра в зоне измерения к сигналу от одного зерна

Иммуногистохимические нсс.пчктитя. Для иммуногистохимического анализа были использованы различные антитела, маркирующие: гликопротеин поверхности и базальныч мембран (фибронектин), промежуточные филаменты цитоскелега (цитоке-

ратины и белки нейрофиламентов высокого мол веса), кальции-связывающий белок S-100 и разные классы кристаллинов хрусталика Экспрессию названных молекул в тканях глаза изучали методом непрямой иммунофлуоресценции на срезах. Появление, исчезновение и распределение анализируемых белков проводили с помощью высокоразрешающей микроскопии в режиме флуоресценции. Для анализа синтеза кристалли-новых антигенов в тканях глаза использовали метод нммунорадиавтографии, а для выявления кристаллинов на окрашенных срезах глаз — метод ретроспективной нмму-ногистохимии.

Электротюмикроскопические иссжчкжания. Изучение ультраструктуры клеток было необходимо для идентификации клеток нейральной сетчатки, способных к изменению своего фенотипа. Для этого было проведено исследование как серий полутонких срезов сетчатки тритонов, так и отдельных ультратонких срезов Их приготовление проводилось по стандартным методикам электронной микроскопии при использовании фрагментов задней стенки глаза ( нейральная сетчатка, ПЭС, сосудистая оболочка, склера)

ОСцнтотка ,чито.'еиом и ингибитором пролиферации. Обработка рост-стимулирующим фактором (фактор роста гидры) проводилась \п vitro при добавлении фактора в различных концентрациях в среду инкубации, где находились выделенные образцы вентральной радужки. Ретиноевая кислота, ингибитор пролиферации и стимулятор дифференцировки, вводилась в составе растворителя ДМСО внутрибрюшинно с помощью микрошприца 'Hamilton'

Радиолиганднын анапи применялся для исследования /i-адренсрг ических и мус-кариновых холинэргических рецепторов клеток ПЭС и сетчатки Для этого готовились препараты клеточных мембран, к которым затем добавляли меченые и немеченые ли-ганды, после чего проводился анализ связывания лигандов с изучаемыми рецепторами

Анализ морфологии клеток, иммуноспецифического свечения и включения радиометки проводились с помощью микроскопов Jenaval, Olimpus, Zeiss IM 35, JF.M 100 CX и других. Полученные в результате применения указанных методов количественные данные обрабатывались статистически, для построения гистограмм и графиков использовались обычные способы изображения и компьютерные программные про-дукгы (Hxel. Corel, Visio)

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК НА МОДЕЛЯХ ПИГМЕНТИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ ГЛАЗА ВЗРОСЛЫХ ТРИТОНОВ

Изменение паттернов синтеза меланина и пролиферации в процессе транс-дифферснцировки клеток ПЭС и ПЭР. Для того чтобы продвинуться в понимании процесса трансдифференцировки эпителиальных тканей глаза, пигментного эпителия сетчатки и радужки (ПЭС и ПЭР), прежде всего было необходимо проследить изменения синтеза специфического продукта — меланина и сопоставить их с изменениями пролиферативной активности пигментированных клеток. Использование нами маркера специфического синтеза клеток ПЭС и ПЭР — 'Н-ДОФА явилось хорошим инструментом для демонстрации изменения специфической дифференцировки этих клеток и их пластичности по данному критерию На модели трансдифференцировки ПЭС в сетчатку было обнаружено, что только клетки, вступающие на путь аллотипической диф-ферецировки в области дна глаза, прекращают синтезировать меланин (рис.1) Остановка синтеза меланина происходит еще в слое ПЭС на самых ранних этапах в области инициации трансдифференцировки Другие же клетки, на периферии и в центре ПЭС

21-27 15-19

А.

Г И»}» «|)ИЯ <!>«. ' 11-.Ч

1>|Ч. I

Включение 'Н-ДОФА (А) и Н-I и м И1МП.1 (Ь) в ра чнчные области пш менжок) лип един и иски (ж сетчатки на последовательных стадиях восстановления паи С\с\и Цифрами >каины ИМЦ(А) н ИМЯ (Б) ";.

4-6

0-1

(здесь после образования зачатка сетчатки), сохраняют способность синтезировать специфический продукт. При одновременном использовании двух маркеров — 'Н-тимидина и 'Н-ДОФА — было обнаружено, что эти процессы не исключают друг друга и могут осуществляться одновременно в одной и той же клетке. Такими клетками, однако, являлись только те, что находились в составе слоя ПЭС, где они обеспечивали восстановление его целостности и дифференцлровки. В областях ПЭС с максимальной пролиферативной активностью (дно глаза — область транедифференцировки) отсутствовал синтез меланина, а на периферии, где значения ИМЯ и МИ были значшельно ниже, напротив, имел место активный синтез этого специфического продукта Это позволило выявить в ПЭС две субпопуляции клеток, различающиеся по пролиферативной и меланнн-синтезирующей активности: популяции транс- и редифференцирую-щихся клеток. Первая из них по нашим подсчетам составила 2/3 от общего числа клеток ПЭС. Причиной различающегося поведения клеток по критериям пролиферативной активности, синтеза меланина и способности к миграции является влияние со стороны прилежащих к ПЭС клеток ростовой зоны глаза на периферии и его отсутствие в центре глаза. Не исключены тахже региональные огличия в ПЭС по степени прочности контактов между клетками и их адгезии к батальной мембране

При анализе превращения клеток ПЭР в хрусталик были сделаны сходные выводы При одновременном применении 1Н-тимиди«а и/Н-ДОФА также было обнаружено прекращение синтеза меланина в транслифференцирующихся клетках радужки (рио. 2). Клеточная конверсия в этой системе происходит в зрачковой области дорсальной радужки и именно здесь обнаруживаются наиболее яркие изменения в синтезе исходною продуктами пролиферативной активности клеток Во время ледифференци-ровки клеток в этой зоне радужки и формирования зачатка хрусталика резко снижается число меланин-синтезирующих клеток в наружном листке, а во внутреннем на 1(> • — 24 сутки после операции активно пролиферирующие- клетк» вовсе не включают меченый предшественник синтеза меланина Таким образом, транедифференцировка клеток радужки также происходит при подавлении синтеза исходного специфического продукта Зоны радужки, клетки которых в хрусталик не превращаются, после недолгого периода дедифференциревки и пролиферации возвращаются к своему исходному состоянию, ресинтезируя меланин ц постепенно выходя из фазы клеточных делений. В результате этой части наших исследований удалось расширить представления о процессе транедифференцировки В основе их оказался факт подавления в гранеднффе

Put 2

Включение Н-тимшина (А) и 'Н-ДОФА (Б) в клетки дорсальной рад\ жки ичагка \р>сталика на полсдотпсльныч стадияч восстановления гла и Схема Цифрами>кланы: ИМЯ (А). ИМЦ(Б).%

ренцирующихся клетках исходного специфического синтеза на фоне высокой проли-феративнои активности клеток, их морфологической дедифференцировки и смещения относительно ткани — источника. Что касается клеток ПЭР, то существует также информация о сохранении ими в процессе транедифференцировки высокой активности ключевого фермента биосинтеза меланина — тирозиназы (Achazi, Yamada, 1972). Относительно клеток ПЭС есть указания на то, что подавление в процессе транедифференцировки синтеза меланина может быть связано с нарушением синтеза белков пре-меланосом ММР115 и рР344 (Mochii et а!., 1988 a, b, Eguchi, 1988). О связи генов, ответственных за биосинтез меланина, с прогрессом транедифференцировки ПЭС свидетельствуют результаты работы, проведенной на клетках ПЭС перепела, несущих мутацию по гену Silver Plumage, вызывающую частичное подавление меланинового синтеза (Fuji, VVakasugi, 199?) Пока представляется, что прекращение транедифференцнрую-

шимися клетками специфического синтеза может быть связано с нарушением не всех, а некоторых его звеньев - наиболее вероятно, синтеза коровых белков премеланосом.

Результаты работы позволили сделать предположения о факторах, определяющих выбор пути дифференцировкн клеток ПЭС и ПЭР. остаться в исходном состоянии, либо приобрести новое. Такими факторами могут быть те, что составляют клеточное микроокружение. Мы проследили локализацию и состояние клеток, прекращающих синтез меланина, и выяснили, что ими являются те клетки, которые обладают способностью быстрее и легче покидать ПЭС и ПЭР и смещаться витреальнее в полость глаза. Напротив, те клетки, что сохраняют свои исходные взаимодействия с соседними в слое и с базальной мембраной, способны лишь вернуться к своей исходной дифференцировке. Становится понятным, что изменяя экспериментальные условия, направленно меняя при этом условия микроокружения, можно добиват ься выхода в трансднфференцировку большего или меньшего числа потенциально способных к этому клеток. Работа по исследованию специфического синтеза и пролиферации пигментированных клеток глаза дала ответ на существенный вопрос об обратимости трансдифференцировки этих клеток. В настоящее время можно говорить о том, что она начиная с определенного этапа становится необратимой Прекращенный сннтез меланина в покидающих слой клетках ПЭС и ПЭР не может быть инициирован вновь, по крайней мере в используемых нами условиях экспериментов.

Синтез кристаллинов в интактных и трансдифференцирующихся тканнх глаза. Далее был поднят вопрос, не обладают ли исходные пигментированные эпителиальные клетки способностью синтезировать на низком уровне продукты аллотипи-ческой дифференцировкн и не является ли это предусловием трансдифференцировки В период решения этого вопроса Р. Клейтон (Clayton, 1979) с помощью кДНК выявила транскрипты кристаллнмовых генов в сетчатке и ПЭС эмбрионов кур, позже Бовер с соавт. (Bower et al., 1983) подтвердили эти результаты. В результате была обнаружена активность, правда на низком уровне, кристаллиновых генов во внехрусталиковых тканях глаза. В этой связи нами была поставлена задача исследования синт еза кристал-линоподобных антигенов во внехрусталиковых тканях глаза взрослых животных, как способных к трансдифференцировке в хрусталик (тритоны), так и не обладающих такой способностью (лягушки). При использовании метода иммунорадиоавтографии нами было показано, что в интактных ПЭР и роговице лягушек и тритонов клетки способны к следовому синтезу белков, иммунохимическн сходных с

Таблица I. Синтез кристаплиноподобных антигенов в тканях глаза взрослых амфибий

Ткань R. temporaria Т. vulgaris X. laevis

а э г а р г а Р т

Эпителий роговицы -4+) + + - 0 +(+)

Радужина +.<+) + + - 0 -К+)

Эпителий хрусталика •П+) 0 0 0 0 +(+)

Волокна хрусталика +<+) 0 0 0 +(+) ■4+) -п

Сетчатка - край -дно Ч) 0 0 0 "~<Г 0 „ -

-<-) 0

Примечание. '*+" - антигены выявляются на автографе, " - антигены не выявляются на автографе, "(Г - синто антигенов не шучался В скобках представлены данные, полученные с использованием меченого пиролиза та белка, бет скобок - с исполыованисм нескольких меченых аминокислот.

«— и/? — кристаллинами, хотя только клетки ПЭР тритонов, как известно, способны трансдифференцироваться в хрусталик (табл. 1) Таким образом, синтез по крайней мере двух классов кристалликов оказался не связан прямо со способностью ткани к транедифференцировке Затем с помощью метода ретроспективной иммуногистохимии мы проследили экспрессию и, /3 и у-кристалликов при регенерации хрусталика и выяснили, что первые два класса кристаллинов могут бьггь обнаружены на ранних этапах клеточной конверсии, а у — кристаллин выявляется позже, только в волокнах новообразовании} хрусталика Таким образом, независимо от существующего в исходных клетках синтеза отдельных классов кристаллинов и сохранения его в процессе клеточной конверсии, полный спектр этих белков в количествах, делающих их доступными для идентификации, формируется на поздних стадиях транедифференцировки Если все же синтез кристаллиновых белков в интактном ПЭР взрослых животных и определяет их потенции к превращению в хрусталик, то очевидно, что только одного этого фактора для проявления транедифференцировки недостаточно Накопление специфических продуктов, определяемое, в частности, интенсивностью их синтеза, требует создания в изменяющихся клетках и вне их необходимых для такой работы условий.

Синтез РНК, общих н негнегоновых ядерных белков в процессе транедифференцировки ПЭС и ПЭР. Предполагалось, что морфологические, специфические

биохимические и пролиферативные процессы при траисдиффереицировке ПЭГ и ПЭР глаза взрослых тритонов происходят на фоне активации биосинтеза РНК и основных белков. Это, хотя и очевидное, предположение требовало экспериментальной проверки. Были поставлены эксиеримешы по анализу динамики синтеза РНК, общих, нсгнс-тоновых ядерных белков с помощью радиоавтографии с использованием соответствующих меченых предшественников. Результаты свидетельствуют о том, чго в клетках интактного ПЭС синтез РНК и белков происходит на относительно низком уровне. Вскоре после инициации трансдифференцировки синтезы РНК и белков активируются. Максимальные значения интенсивности этих процессов наблюдаются, однако, несколько позже, в период наибольшей пролиферативной активности транслифференци-рующихся клеток, во время формирования регенерата сетчатки, после осуществления клетками морфологической дедифференцировки По мере дифференцировки вновь образованной клеточной популяции активность синтезов РНК и «house-keeping» белков постепенно снижается Детально радиоавтографически было щучено включение 'Н-триптофана (5Н-Т) в ядра клеток ПЭС и зачатка сетчатки и дана сравнительная оценка интенсивности мечения. В результате было обнаружено постепенное, но значительное (в 7 — 13 раз) увеличение интенсивности мечения ядер клеток ПЭС в центральной части дна глаза, претерпевающих транедифференцировку В периферических юнах гла)а, не меняющих дифференцировку и не участвующих в регенерации сетчатки, интенсивность влючения 'Н-Т в ядра увеличивалась только в 2 ■) раза (рис 3) При использовании радиоавтографни мы не могли выявить белки, необходимые для пролиферации, дедифференцировки, перестройки цитоскелета, рспрограммированпя работы генов или миграции клеток и др. Однако, в связи с тем, чго 'Н-Т является компонентом синтеза негистоновых ядерных белков, можно рассмотрен, их связь с отмеченными основными событиями конверсии клеток ПЭС Высокая интенсивность включения 'Н-Т в трансдифференцирующиеся клетки ПЭС и в клетки зачатка сетчатки, возможно, отражает формирование пула кислых ядерных белков, среди которых могут быть и те, чья регуляторная роль в транскрипции и пролиферации предполагалась (Reyer, 1977, Rao, 1980) В процессе регенерации сетчатки резко меняется продолжительность митотических циклов (Мнташоп, 1969, 1980), таким образом, кислые ядерные белки могут играть регуляторную роль и в репрограммировании митотических циклов. Хотя триптофан принадлежит к специфическим предшественникам кислых ядерных белков, он принимает участие и в метаболизме общих белков Так же, как это

1.2

0,8

0.6

0,2

0,4

4 6 8 10 12 16 18 22 26

Рис.?

Изменение относительной интенсивности вклотсния 'Н-тригттофана в ядра клеток пигментного эпителия в центральной части дна i.i.iu (I > и на периферии (2) в ходе трансди(|н|>срениировки. По оси аосцисс - время после операции ( сут). по оси ординат - относительная интенсивность мечения (|рану.т/ мкч1).

было показано на модели транедифференцнровки клеток ПЭС тритонов, конверсия клеток радужки в хрусталик сопровождалась значительным усилением включения меченого предшественника синтеза кислых белков — Н-Т При этом максимальная интенсивность мечения отмечалась в области радужки, претерпевающей изменения, — в зрачковом крае дорсальной радужки. Результаты этого исследования соответствуют другим данным об активации синтеза общих белков и РНК в процессе транедифференцнровки пигментированных клеток глаза и свидетельствуют о возможном участии не-гнетоновых ядерных белков в регуляции экспрессии генома клеток п изменении при этом параметров митотических циклов

Изменения экспрессии специфических белков цитоскелета в процессе транедифференцнровки клеток ПЭС. Эти белки в настоящее время служат хорошими маркерами клеточной специализации и используются многими авторами для идентификации клеточных типов (см. напр. Franke et al., 1982, Fliegner, Liem, 1991) Мы предположили, что клетки ПЭС и клетки нейральной сетчатки должны экспрессиро-вать различные типы промежуточных филаментов, которые, во)можно, способны замещать друг друга в процессе транедифференцнровки. Было решено проследить имму-ногистохимически экспрессию цитокератинов и белков нейрофнламентов (НФ-200) в

Рис 4

Региональные отличия в трансдифференцирующемся пигментном эпителии сетчатки тритонов по экспрессии фибронектина, белков промежуточных филаментов цитоскелета и синтезам ДНК, РНК, общих белков и синтезу меланина.

тканях неоперированного глаза и в процессе конверсии клеток ПЭС в клетки нейраль-ной сетчатки. Полученные данные затем были сопоставлены с результатами дру1 их наших исследований, проведенных на этой модели (рис 4) Трансдифференцировка клеток ПЭС вызывалась как удалением сетчатки, так и ее отслойкой у тритона В не-оперированных глазах цитокератины были локализованы в эпителиальных тканях - п ПЭС, роговице и коже. Белки нейрофиламентов НФ-200 в клетках ПЭС обнаружены не были как при использовании иммуномечения срезов 5 мкм, так и при использовании иммунной электронной микроскопии НФ-200' — клетки в неоперированном глазу наблюдались только в нейральноЛ сетчатке и зрительном нерве Вскоре после удаления (или отслойки сетчатки) характер иммунореактивности цитокератинов резко менялся клетки ПЭС, частично диссоциированные в результате нарушения их нормальною взаимодействия с сетчаткой, демонстрировали постепенное разрушение окрашенных филаментарных структур и снижение интенсивности иммунореакции В то же время, когда большинство клеток ПЭС были НФ-200-негативны и слабо мечены анти-цитокератинами, первый сигнал, говорящий о появлении НФ-200 мог быть в редких отдельных клетках обнаружен. Последнее свидетельствовало о том, что первые признаки нейроспецифической дифференцировки могут возникать в процессе клеточной

конверсии рано — задолго до появления первых морфологических черт нейральных клеток. Спустя 2-3 недели после операции, в период наиболее активной пролиферации клеток ПЭС и образования популяции дедифференцированных клеток ПЭС (раннего зача!ка сетчатки), было возможно обнаружение как цитокератинов, так и НФ-200. Первые обладали слабой иммунореактивностью, вторые демонстрировали более яркое окрашивание. В дальнейшем НФ-200 иммунореакция постепенно возрастала. На поздних стадиях трансдифференцировки клеток ПЭС, в период дифференцировки в нейроны и глшо, все клетки зачатка сетчатки имели негативную реакцию при окрашивании на цитоксратины, но ярко окрашивались антителами против НФ-200. Изолирование отдельных клеток ПЭС и их групп, кратковременное культивирование и последующая инкубация с антителами против цитокератинов показали, что содержание этих белков цитоскеле1а выше в группах (минипластах) ПЭС и ниже — в изолированных клетках. Это свидетельствовало о зависимости экспрессии цитокератинов от межклеточных взаимодействий и объясняло снижение экспрессии этих белков в начале трансдифференцировки Данные о снижении экспрессии цитокератинов в клетках ПЭС после удаления или огслойки сетчатки и постепенном ее исчезновении в трансдиффсренцирую-щихся клст ках раннего зачатка сетчатки находится в хорошем соответствии с результатами Кляйна и соавт. (Klein et al., 1990), не так давно идентифицировавших молекулы, связанные с ЭПР, которые экспрессируются только в ПЭС нормального глаза, но в процессе конверсии клеток ПЭС исчезают. В каких взаимоотношениях находятся исчезающие при трансдифференцировке клеток ПЭС цитокератины и белки, связанные с ЭПР, предстоит выяснить в будущем На основании полученных результатов мы полагаем также, что существует интервал времени, когда регенерат сетчатки представлен клетками, имеющими промежуточное двойственное состояние цитоскелета, в составе которого присутствуют как цитокератины, так и белки нейрофиламентов В тоже время установлено, что пролиферация и миграция клеток сами по себе не являются причиной замены одних специфических белкон цитоскелета другими Все описанные временные ншснення этого компонента цитоскелета, региональные отличия в их экспрессии в ПЭС и сетчатке интактного глаза, результаты экспериментов с изолированными клетками свидетельствуют о явной корреляции экспрессии белков промежуточных фи-ламетов со степенью устойчивости дифференцировки клеток Последняя, в свою очередь, определяется положением клетки и ее микроокружением Это предположение вместе с принятой в настоящее время идеен о том, что промежуточные фнллменты

призваны интегрировать и организовывать внутриклеточное пространство, модулировать межклеточные контакты и свойства клеточной мембраны (Gcorgatos, Maison, 1996), позволяют думать, что описанная трансформация шггоскелета может быть включена в механизм регуляции активности генов в процессе трансдифференцировки клеток ПЭС, контролируемой клеточным микроокружением.

Появление и накопление нейроспецифических признаков в регенерирующей сетчатке, возникшей в результате конверсии клеток ПЭС. Другие наши попытки выявить нейроспецифические признаки в процессе клеточной конверсии позволили убедиться в том, что последние, как правило, приобретаются поздно, во время завершения трансдифференцировки и с началом функционирования образованной сетчатки. Одним из критериев нейральной дифференцировки ткани является наличие в ее клетках кальций-связывающего белка S-100 (Sviridov et al., 1972, Вязовая и др , 1975) Мы же использовали белок S-100 в качестве маркера для изучения появления нейроспецифических признаков в трансдифференцирующихся клетках ПЭС и в образующемся регенерате сетчатки после ее удаления у тритонов. В результате иммуногистохими-чески было показано, что белок S-100 появляется в клетках регенерата сетчатки на поздних стадиях восстановления глаза Интактный ПЭС, а также трансднфференци-рующиеся его клетки и клетки раннего зачатка сетчатки пот белок либо не жспресси-руют, либо экспрессия находится на не детектируемом данным методом уровне Отчетливая нммунореакция была обнаружена в гаиглиозных клетках только на сутки после операции, что свидетельствовало об их более раннем по сравнению с другими нейронами сетчатки созревании при регенерации Таким образом, появление и накопление белка S-100 зависит от накопления числа клеток и формирования ими новых межклеточных взаимоотношений, что происходит только на поздних стадиях развития регенерата сетчатки. Есть основание также полагать, что позднее выявление S-I00 обусловлено возможным участием этого белка в проведении и трансформации светового сигнала Это предположение косвенно подтверждается нашими радиолигандными исследованиями по изучению становления нейрорецепторных систем в процессе превращения клеток ПЭС в клетки сетчатки

Исследование двух нейрорецепторных систем (М-ацетилхолиновых и р-адренорецепторов) в процессе регенерации сетчатки было предпринято также впервые. Вначале с помощью раднолигаидного анализа было исследовано присутствие указанных нейрорецепторов на мембранах клеток ПЭС (с сосудистой оболочкой) и

сетчатке в норме. Было продемонстрировано высокое содержание М-холино- и (1-адренорецепторов как в сетчатке, так и в ПЭС с сосудистой оболочкой неопернрован-ных глаз. На 7-й неделе после удаления сетчатки в не закончившем дифференцировку регенерате сетчатки было выявлено несовершенное состояние изучаемых систем рецепторов, выражающееся в низких величинах связывания и наличии нехарактерных, имеющих «колена« кривых насыщения (рис.5 а, б) На 10 и 13-й неделе регенерации сетчатки величины и характер связывания постепенно приходили в соответствие с таковыми в неоперированной сетчатке. Анализ по Скетчарду также продемонстрировал сходство в функционировании данных рецепторов на 10, 13-й неделе и в контроле Полученные результаты мы объясняем: во-первых, отсутствием или нефункционированием изученных систем рецепторов на ранних этапах регенерации (гранедифферен-цировки клеток ПЭС), во-вторых, их становлением по мере дифференцировки клеток — потомков в нейральном и глиальном направлениях и, в-третьих, зависимостью степени функционирования изученных систем рецепторов от постепенного увеличения доли морфологически дифференцированных клеток в регенерате сетчатки Настоящие данные о развитии двух нейрорецепторных систем соответствуют результатам изучения синтеза нейротрансмиттеров, постепенное накопление которых предшествет появлению ЭРГ при регенерации сетчатки у тритона (Sarthy, Lam, 1983) В совокупности с нашими иммуногистохимическими данными по S-100 белку и данными других авторов о временн появления зрительных пигментов (Балаев и др., 1990, Hicks et al, 1990, Bugra et al., 1992) эти результаты свидетельствуют о достаточно позднем приобретении клетками в процессе транслифференцировки свойств, присущих функционирующим нейронам сетчатки.

Суммируя этот раздел, можно сказать, что наши данные, полученные на двух моделях |рансдифференцировкн тпмонтированных тканей глаза тршонов, позволяют дать более определенную характеристику процессу конверсии клеточного фенотипа Мы определили, что R исходных клетках возможен на низком уровне синтез «чужеродных» белков (кристаллинов) Во-вторых, потеря клетками их исходных специфических синтезов может происходить как вскоре (меланин), так и с небольшим запаздыванием (кератины) после индукции транедифференцировки. При этом не исключено выпадение только отдельных звеньев биосинтеза специфических продуктов В-третьих, специфические признаки аллотипической дифференцировки, если они не присутствуют в исходных клетках, то возникают в процессе транедифференцировки не в них, а в их

Рис 5а.

Спсцифнмссюс связывание мембранными М-холи норе це торами клегок реюнеркр^юшен сетчатки 'Н-хину клсяиннл-бенттлта в ювисимоети от концентрации вносимого лигандл I - 7 нед; 2 • 1п нед. 3 -13 недель после операции: 4 - контроль

Специфическое связывание мембранными /^-адрснорсцепторамн клеток регенерирчюшен сстчиткн 'Н-дещдроальпренолола в зависимости от концентрации вносимого лиг айда I ■ 7 нед ; 2 - И) нед .3-13 недель после операции. 4 • контроль

потомках При этом появление признаков новой дифференцировки происходит либо вскоре после индукции трансдифферснцнровки (белки нейрофиламентов). либо, напротив, поздно в процессе морфологической дифференцировки популяции вновь возникших клеток и начала их функционирования (S-100, белок, нейрореценторы). Кроме того, появление нового специфического признака в полном объеме происходит не внезапно, а в процессе накопления молекул, его определяющих, и поэтому при оценке клеточного фенотипа клеток следует разграничивать его морфологическое и биохимическое проявления. В свою очередь, все это дает основание полагать, что транзитная популяция клеток, ранее расценивающаяся как дедифференцированная, строго говоря, таковой не является. Ясно также, что дальнейшее прояснение этих событий может быть осуществлено с использованием молекулярных подходов, способных более точно определить время начала и завершения того или иного биосинтетическою процесса на уровне работы, ответственных за него генов. Мы определили также, что помимо специфических «luxurious» синтезов процесс трансдифференцировки сопровождается значительным повышением активности синтеза ДНК, РНК и общих белков Активность биосинтеза этих макромолекул обеспечивает в первую очередь клеточную пролиферацию, но кроме этого процессы клеточной миграции и перестроек внутри и на поверхности клегток. Еще одним важным, на наш взгляд, наблюдением, является связь и зависимость всех событии трансдифференцировки с изменениями клеточного микроокружения. Все изученные и описанные выше внутриклеточные события, во время инициации процесса .клеточной конверсии, его разворачивания и завершения определяются межклеточными взаимодействиями и взаимодействиями с окружающими тканями. Ото, в свою очередь, обуславливает в тканях пространственные различия в реализации ее клетками заложенных генетических потенций х трансдифференцировке. Все это до-казывет, что свойство пластичности фенотипа находится наряду с генетическим и под эпигенетическим контролем.

ИЗУЧЕНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ТРАНС-ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ПИГМЕНТИРОВАННЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ГЛАЗА ВЗРОСЛЫХ ТРИТОНОВ Изменение экспрессии фибронектнна в тканях глаза в процессе трансдифференцировки ПЭС и ПЭР. В попытке определить роль молекул адгезии в конверсии клеток ПЭС мы проследили изменения экспрессии и распределения фибронектина

(Фн) с помощью иммунофлуоресцентною исследования при использовании поликло-нальных антител. Были проанализированы базальная пластинка ПЭС + мембрана Бруха, поверхность клеток ПЭС и других тканей глаза в норме и после отслойки сетчатки у тритонов. Данные были сопоставлены с результатами исследования пролифератив-ной активности клеток разных областей ПЭС, полученными методом радиоавтографии. Было выяснено, что при трансдифференцировке клеток ПЭС происходят и шене-ния распределения и интенсивности иммунореакции с антителами против Фн как в мембране Бруха + базальной пластинке ПЭС, так и в самом ПЭС Было обнаружено, что на 17 — 24-е сутки после операции снижается экспрессия фибронектина в мембране Бруха и ее базальной части — базальной пластинке ПЭС в центральной части глаза, соответствующей области конверсии клеток ПЭС в клетки сетчатки (рис 4) Известно, что Фн способствует прикреплению клеток ПЭС к субстрату (Avery,' Glazer, 1986), поэтому снижение его содержания в базальной мембране в области трансдифференци-ровки клеток можно рассматривать как фактор, способствующий выходу делящихся клеток из общего пласта, и в конечном счете как фактор инициации трансдифференци-ровки клеток. Следует отметить, что на роль регуляторов трансдифференцировкн претендуют и другие компоненты ЭЦМ и базальных мембран ламинин, стимулирующий нейральную дифференцировку клеток ПЭС лягушек in vitro (Reh et al , 1987), и коллаген, ингибирующий дедифференцировку этих клеток у зародышей кур т vnro (Yasuda, 1979) Кроме того, недавно иммуногисгохимически было продемонстрировано, что в морфогенетические события, имеющие место при регенерации сетчатки у тритонов, могут быть вовлечены и другие молекулы адгезии, такие как тенасцин и N-CAM (Mitashov et al, 1995). Появление и диффузное распределение Фн вокруг трансднффе-ренцирующихся клеток ПЭС в центральной зоне глаза коррелировало с началом их миграции Аналогичные изменения локализации Фн наблюдали в культуре клеток ПЭС куриного зародыша in vitro (Turksen et al , 1984, Crowford, Vielkind. 1985) и на поверхностях других мигрирующих клеток (Buck, Horvitz, 1987) Были обнаружены и региональные отличия в ПЭС в распределении и интенсивности экспрессии Фн На периферии ПЭС, где клетки не претерпевают конверсии, высокая экспрессия ФН сохранялась на базальной поверхности клеток и возникала на апикальной В центральной части, где происходила трансдифференцировка, поверхности клеток обладали слабой имму-нореактивностью. Таким образом, распределение Фн закономерно изменяется во время транслнференцировки клеток ПЭС тритонов, что свидетельствует о его роли в этом

процессе Важно отметить, что изменения в паттерне экспрессии Фн наблюдаются уже на ранних стадиях превращения клеток ПЭС и поэтому Moiyr быть одним из сигналов клеточного микроокружения, приводящего к изменению типа клеток ПЭС. На ключевую роль адгезионных молекул указывают и данные Ортиза с соавторами (Ortiz et al., 1992), исследовавшими позднее экспрессию Фн наряду с другими компонентами ЭЦМ — ламинином, гепарансульфат-протеогликанами и нндоген-энтактином. На основании собственных и литературных данных, можно считать, что роль молекул адгезии, к которым принадлежит и фибронектин, заключается в обеспечении устойчивости диффе-ренцировки клеток ПЭС. Их перераспределение и/или частичная потеря в батальной пластинке ь мембране Бруха, вероятно, способны освобождать клетки от стабилизирующего дифференцировку сигнала, «разрешая« клеткам вымещаться из слоя и затем менять свой фенотип. В настоящее время исследуются тонкие механизмы этих адгезионных взаимодействий (Mazaki et al., 1996) Учитывая данные этой работы можно предположить, что инициация превращения дифференцировки клеток ПЭС после разрушения нормальных клеточных взаимодействий в результате операции обусловлена сигналом об изменении взаимодействия белков клеточной адгезии с интегриновыми белками поверхности клеток ПЭС Есть основания также предполагать (Evans, Steele, 1997), что изменения цитоскелета, участвующего в проведении такого сигнала, могут оказывать влияние на экспрессию генов на начальных этапах трансдифференцнровки.

Поскольку в нашей работе были проведены одновременно удаление хрусталика и отслойка сетчатки, мы имели возможность сравнить данные, полученные по ПЭС, с результатами исследования распределения фибронектина в трансдифференцирующейся радужке тех же тритонов Основным наблюдением было смещение в ходе конверсии клеток внутреннего листка дорсальной радужки специфического свечения с базальных и латеральных на апикальные поверхности клеток. Эти результаты согласуются с данными о распределении Фн в радужке при регенерации хрусталика после его удаления без отслойки сетчатки (Elgert, Zalik, 1986, 1989), а также с появившимися позже результатами исследования изменений распределения Фн в радужке и регенерирующем хрусталике, полученным в эксперименте с одновременным удалением, хрусталика и сетчатки у тритонов Notophthalmus virUlvsceiis (Ortiz et al , 1992) Снижение экспрессии Фн в области между внутренним и наружным листками зрачкового края дорсальной радужки в процессе трансдифференцнровки ее клеток может, так же как и в случае конверсии клеток ПЭС, свидетельствовать о корреляции снижения количества и/или

Пролиферотивноя активность Синтезы кристаллиное. РНК. ЛНК общих негмстомоеых ядермл бвдков

Дорсальная радужка

Адгезионные молекулы ЭЦМ фибронектин ^N1 ЗЛ сингеэ меланина

Присутствие 2М1-36 и фибронектина

Вентральная радужка

Рис(>

Пространственные различия в трансдиффсренцируютцейся радужке тритонов по экспрессии компонентов ЭЦМ. сикте ту ДНК. РНК. общих и специфических белков.

перераспределения этих адгезионных молекул с выходом клеток радужки в транедиф-ференцировку (рис. 6) В лаборатории Егучи (Eguch¡, 1988, 199.1) также был и предприняты попытки идентифицировать молекулы межклеточных пространств в радужке, связанные с первыми этапами потери клетками исходного фенотипа. В результате с помощью моноклональных антител было обнаружено, что в ЭЦМ межклеточного пространства нормальной радужки тритонов постоянно присутствует гликопротеин 2Ы1-36, имеющий молекулярную массу 80-200 кДа и ответственный за поддержание стабильности исходного фенотипа клеток. На ранних этапах транедифференцировки ПЭР 2М-36 исчезает. Предполагается, что описанные изменения в ЭЦМ и на поверхности клеток способствуют инициации транедифференцировки клеток радужки

Стимулирующее влияние фактора роста гндры на траисдифференцировку клеток вентральной радужки и регенерацию хрусталика. Другим, очень широко и давно обсуждаемым, вопросом явлется зависимость транедифференцировки от пролиферации клеток, от числа клеточных циклов. Этой проблеме отведено большое мест во многих обзорах, посвященных изучению конверсии клеточного типа в тканях итаза (Миташов. 1980, Биоеуа, МиавИоу, 1983; Уатас)а, 1977, 1982, 1989, Окаёа, 1983, 199|) Основным в этих работах являлось постулирование необходимости завершения клет-

ками определенного числа клеточных циклов для приобретения ими новой дифферен-цировки При этом было установлено, что для клеток радужки их должно быть шесгь (Yamada, 1977, 1989), а для клеток ПЭС — семь (Миташов, 1980) После того как стало ясно, что пролиферация клеток глаза в развитии и при регенерации зависит от ростовых факторов, данная проблема перешла в плоскость изучения роли митогенов в трансдифференцировке (Yamada, 1989) В последнее время показано, что основным митогеном, стимулятором трансдифференцировки клеток глаза, является фактор роста фибробластов (FGF) (Park, Hollenberg, 1989, 1991, Pittack et al., 1991; Zhou, Opas, 1994, Zhao et al. 1995; Знойко,1997; Sakaguchi et al, 1997) Вопросу влияния рост-стнмулирующих и poci-iiHi ибирующнх факторов в процессе трансдифференцировки пигментированных эпителиальных тканей глаза тритонов нами были посвящены специальные и оригинальные исследования, где использовались иные факторы и подходы. Нами были разработаны экспериментальные условия для стимуляции регенерации хрусталика из клеток вентральной радужки тритонов с помощью синтезированого митогена, идентичного фактору роста гидры, и последующего культивирования обра-ботаных митогеном фрагментов вентральной радужки в полости линзэктомированных глаз Вентральную радужку выделяли из глаз тритонов на 10-й день после удаления у них хрусталиков, инкубировали в среде, содержащей митоген, затем трансплантировали и культивировали в полости глаза С помощью радиоавтографии было оценено действие каждого из указанных условий на пролиферативную активность клеток вентральной радужки Показано, что преинкубация в среде Игла в присутствии фактора роста гидры сохраняет максимальный уровень пролиферации клеток в выделенной вентральной радужке (рис. 7). Культивирование последней в полости глаза поддерживает высокий уровень пролиферации еще в течение 10-15 дней и пролонгирует общее время пролиферации клеток вентральной радужки В результате клетки имплантированной вентральной радужки проходят 6-7 митотических циклов, что оказывается достаточным для завершения трансдифференцировки и регенерации хрусталиков Последние регенерируют из клеток имплант ированной вентральной радужки примерно в 40% случаев Рс(ультаты настоящей работы объяснили причины незавершенности трансдифференцировки клеток вентральной радужки in situ и свидетельствовали о существенной роли пролиферации и связанных с ней внутриклеточных событий в процессе трансдифференцировки клеток. Мы, а также другие исследователи (Yamada, 1989, McDevitt. 1989) рассматриваем наши результаты как прямое доказательство того, что

вл

А.

Рис.7.

Индекс меченых ядер (%) в вентральной радужхе тритонов (К) дн. п/оп) срату (А ) и на 5-й день после инку бации в среде с фактором роста гидры (ФРГ) (Б) ВЛ - внутренний листок; НЛ - наружный листок.

ростовые факторы (и даже те, что обладают эффектом на иных типах животных и иных тканях) способны стимулировать транедифференцировку. При этом сгимуляция транедифференцировки происходит через активацию пролиферации и увеличение числа клеточных циклов. Рассматривался также вопрос, что происходит с транедифферен-цирующимися клетками ПЭС и ПЭР при прохождении ими клеточных циклов. Подчеркивалась роль клеточных делений для окончательного освобождения клеток от признаков исходной дифференцировки (меланина), для накопления определенного числа клеток, при котором возможно формирование новых межклеючных взаимодействий, необходимых для изменения экспрессии генома и т. д Понятно, что ни одно из этих предположений не может быть исключено, поскольку, действительно, по мере клеточной пролиферации меняется дифференцировка клеток, внутриклеточные биосинтетические процессы, состав органелл в клетках, поверхность клеток. Однако все это в комплексе справедливо для моделей транедифференцировки ПЭС и ПЭР тритонов. На других же системах, например при транедифференцировке клеток медузы, известны случаи либо прямого изменения клеточного фенотипа (исчерченно-мышечные клетки в гладко-мышечные), либо через 2-3 клеточных поколения (при регенерации манибриума) (Alder, Schmid, 1986, Weber et al, 1987) Поэтому при рассмотрении вопроса зависимости транедифференцировки от числа клеточных циклов следует принимать во внимание особенности конкретной модели: глубину специализации исходных

клеток и степень изменений их дифференцировки (по одному признаку или по совокупности их большою набора) Был проанализирован также вопрос, являются ли ми-тогены индукторами или промоторами трансдифференцировки Т. Ямада (Yamada, 1980) полагает, что ростовые факторы, в том числе используемый нами фактор роста гидры, воздействуют на клетки, в которых уже «запущена« пролиферация Другие же авторы считают, что факторы роста запускают трансдифференцировку, действуя на самых ранних этапах клеточной конверсии, но все же после того, как клетки приобрели другую форму и поверхность и способность образовывать рецепторы к мнтогену (Okada, 1991; Park, Hollenberg, 1993). В своей работе мы использовали фрагменты вентральной радужки, клетки которой уже обладали высокой пролнферативной активностью Поэтому можно сказать определенно, что данный митоген оказывал влияние на пролиферацию уже дедифференцированных клеток. Подтверждение того, что мишенями для ростовых факторов являются уже дедифференцированные клетки, было найдено недавно при изучении трансдифференцировки клеток ПЭС цыпленка in vitro (Zhou, Opas, 1994) В работе было показано, что это действие осуществляется на позитивные по N-CAM клетки с низким уровнем рН, в которых процесс трансдифференцировки инициирован и созданы необходимые внутриклеточные условия и свойства мембраны для восприятия рост-индуцирующего сигнала При этом предполагается возможность действия bFGF и на процесс транскрипции (Zhao et al , 1995) Несмотря на различные точки зрения по поводу времени действия митогенов, их роли и характера дифференцировки клеток, способных на них реагировать, анализ собственных результатов н всех приведенных выше сведении дает основание считать, что факторы роста являются стимуляторами трансдифференцировки, способными оказывать действие на ранних этапах клеточной конверсии, активируя впоследствии иролиферативную активность

Стимуляция трансдифференцировки и пролиферации клеток глаза путем трансплантации фрагментов ПЭС. Одно из наших исследований но изучению влияния экзогенных факторов на трансдифференцировку было проведено с помощью трансплантации в полость глаза фрагментов трансдифференцнрующегося в сетчатку ПЭС. В опытах но трансплантации ПЭС в полость линзэкгомированных uiai был удален хрусталик. Полученные результаты свидетельствовали о том, что наличие в полости глаза сетчатки, образующейся благодаря трансдифференцировке трансплантированного ПЭС, приводит к значительному увеличению пролнферативной активности кле-

ток вентральной радужки. Значения ИМЯ в дорсальной и вентральной радужках оказались в результате сходны, независимо от обычного участия (дорсальная) или неучастия (вентральная) их в регенерации. В результате этого в вентральной радужке произошло

значительное разрастание ее внутреннего листка и образование складок Нсть основа/

ния полагать, что фактором, способствующим увеличению пролифсративной активности клеток вентральной радужки и более яркому, чем обычно, проявлению здесь трансдифференцировки, явился трансплантат ПЭС, развивающийся в атипичную сетчатку Сходные, но более отчетливые результаты мы получили в нашем втором эксперименте но трансплантации в полость глаза клеток ИХ вместе со склеральной оболочкой и без нее. С 5-х по 20-е сутки после удаления хрусталика и имплантации пласта ПЭС клетки дорсальной радужки претерпевали характерные изменения, связанные с восстановлением хрусталика (пролифернровали и депигментировались) После 20-х суток в связи с завершением регенерации хрусталика, пролиферативная активность во всех отделах радужки снижалась, но оставалась высокой в цилмарной зоне (40,0±3,1°/о) Это приводило к образованию дополнительных хрусталиков, находящихся на разных стадиях регенерации, и их число могло достигать трех-четырех Было замечено и формирование регенератов сетчатки, образующихся из проксимальной части внутреннею листка радужки, куда смещаются и клетки цилиарной зоны. Клетки внутреннего листка вентральной радужки, из которой в норме хрусталик не регенерирует, при наличии в полости глаза трансплантата так же, как и в предыдущем эксперименте, активно делились, образуя складки, разрастания, а в двух случаях была найдена регенерация почт полностью дифференцированных хрусталиков (1Х-Х стадии) Таким образом, в этих экспериментах была доказана возможность стимуляции трансдифференцировки и пролиферации клеток глаза реципиента со стороны факторов, продуцируемых трансплантированными фрагментами ПЭС/сетчатки Какова химическая природа влияния трансплантата на окружающие его ткани глаза реципиента, на основе морфологических данных сказать трудно, но учитывая сведения литературы можно предположить, что она заключена также в факторах роста, которыми богаты как ПЭС, так и сетчатка всех изученных позвоночных (Courty et al, 1985, Campochiaro, 1993)

Влияние ретиноевой кислоты на пролиферацию клеток радужки в процессе регенерации хрусталика. Параллельно сведениям, касающимся миюгенного действия ростовых факторов в развитии и регенерации, накапливались данные о существовании группы соединений, ингибирующих пролиферацию и индуцирующих дифферен-

цировку Выло показано, что ДМСО, Л'.Л-диметилформамид и ретиноевая кислота обладают рост-ингибирующим эффектом, приводящим к быстрому выходу неопластических или эмбриональных клеток in vitro из фазы пролиферации в дифференцнровку (Boyd, Metealf, 1984; Masui et al., 1986, Mummery et al., 1987, Pollerberg et al., 1995, Pagan et al, 1997). Был показан также модифицирующий эффект ретиноевой кислоты на развитие ЦНС эмбрионов шпорцевой лягушки (Altaba, Jessell, 1991) и регенерацию конечности (Oliver et al., 1988, 1989, Savard et al., 1988, Brockes, 1989) Учитывая то, что трансдифференцирующиеся клетки глаза тритонов по некоторым своим характеристикам близки к неопластическим, и то, что часть процессов, имеющих место при регенерации хрусталика, сопоставима с таковыми при регенерации конечности, было решено использовать ретиноевую кислоту в качестве фактора, осуществляющего негативный контроль за клеточным ростом и индуцирующего дифференцнровку. Кроме проведенной нами работы с использованием ретиноевой кислоты на модели регенерации хрусталика из клеток радужки у тритона in situ, других исследований по действию рост-шн ибирующих факторов на транеднфференцировку тканей глаза не существовало. Живошым на 7-е сутки после удаления хрусталика была инъецирована ретиноевая кислота (0,25 мг), растворенная в ДМСО Контролями служили животные, которым в те же сроки после операции инъецировали только ДМСО или инъекции не проводились вовсе Па 8-й день после инъекции пролиферативная активность в дорсальной и вентральной областях радужки снижалась в 2-3 раза по сравнению с контролями (табл 2) Наиболее значительные изменения клеточной пролиферации были выявлены в ци-лнарной области радужки, ответственной за транспорт различных веществ полости глаза Однако снижение пролиферативной активности клеток, относящихся к различным зонам радужки (претерпевающим транеднфференцировку и нет), было кратковременным В последующие сроки пролиферативная активность клеток радужки возрастала и доспи ала значений, сходных с таковыми в контролях Выявленное кратковременное действие ретиноевой кислоты на пролиферацию клеток радужки свидетельствует о том, что способ и время введения PK, а также различия в доступности ее для разных тканей глаза тритонов являются решающими условиями для выявления эффекта действия морфогена на регенерацию хрусталика у тритонов. Подтверждением этого служат полученные позже данные о влиянии ретиноевой кислоты на регенерацию хрусталика с использованием разных способов ее введения (Gonzales, Ortiz-Fernandez, 1990) Временное подавление пролиферативной активности ретиноевой кислотой в использован

Таблица 2. Изменения индекса меченых 'Н-тимидином ядер (ИМЯ) во внутреннем и наружном листках дорсальной области радужки после инъекции ретиноевой кислоты (РК) н в контролях (Л/ ± т, %)

Время Время Внутренний листок Наружный листок

после после

операции, инъекции pars cilians pars iridica pars ciliaris pars iridica

сут РК, сут

16,310,6* 28,6±2,2 5,611,4 25,6Ю,9

8 1 12,312.1** 30,9±2,4 1,110,3 23,1 ±2,6

28,418,4*** 33,7±6,4 0,4+0,3 15,7+2,2

4,3+1,3 7,7±1,1 0,710,3 6,711,5

15 8 18,910,8 12,6+3,8 0,910,3 6,8+1,7

11,7+2,5 12,912,1 0,610,4 4,910,8

3,911,2 3,4+0,8 0,410,1 2,6+0,7

20 13 1,8+0,7 1.110,9 0.810,6 1,510,4

3,2+1,9 2,5+1,0 0,410,1 3,011,1

30 23 Выход клеток дорсальной радужки из цикла репродукции

40 33 То же

60 50 »

* Инъекции ретиноевой кислоты. * * Контроль с введением только 'li-тимидина.

***Инъекцня 'Н-тимнднна и ДМС'О.

ных нами дозах (0,25 мг/животное) не приводило к изменению морфогенеза регенерирующих хрусталиков, их полярности или размеров. В результате чего нами был сделан вывод, что по крайней мере в условиях данного эксперимента ретиноевая кислота хотя и способна ингибировать пролиферацию, не может вызвать преждевременную индукцию новой дифференцировки или изменение морфогенеза хрусталика. Таким образом, действие экзогенных факторов — ингибиторов пролиферации, по крайней мере в данной модели in situ, не играет столь же существенной роли, как, например, при регенерации конечности.

Итак, проведенные нами исследования по изучению экзогенных факторов, регулирующих транедифференцировку, дали результаты, хорошо согласующиеся с многочисленными данными, появлявшимися по этому вопросу в мире Они доказали, чго наиболее важными из них являются факторы ЭЦМ и поверхности клеток (в нашем случае фибронектин), стабилизирующие дифференцировку и дестабилизирующие ее при их снятии и/или перераспределении Вторая группа факторов - - факторы, стимулирующие пролиферацию (прогрессию клеточных циклов), способные стимулировать

не только клеточный рост, но и дедифференцировку клеток. Как показали наши результаты, среди таких факторов могут быть не только те, что хорошо изучены и уже утверждены на эту роль для клеток глаза (FGF), но и те, которые известны как стимуляторы рег енерации у беспозвоночных животных (фактор роста головного отдела гидры) Мы установили также, что рост-ингибирующие факторы, например ретиноевая кислота, хотя и способны временно подавлять пролиферативную активность клеток в условиях in situ, оказываются недейственными в плане изменения хода конверсии клеток радужки и морфогенеза образующихся хрусталиков.

Роль соседних с ПЭС тканей на поздних этапах транедифференцировки в процессе специализации клеток образующейся сетчатки Не меньший интерес представляли также факторы, способные осуществлять контроль за транедифференци-ровкой на поздних ее этапах - при формировании новых структур (хрусталика или сетчатки) и дифференцировке их клеток. Ведь именно на этом этапе, с приобретением клетками полного спектра новых морфологических свойств и новой специализации, окончательно реализуются потенции клеток к конверсии. Для того чтобы понять, какую роль играет присутствие подлежащих ПЭС тканей в его транедифференцировке и дифференцировке клеток образующейся сетчатки, мы провели два исследования. В первом из них разрабатывалась техника трансплантации ПЭС в полость безлинзового глаза тритона. Полученные в этом исследовании результаты свидетельствовали о том, что клетки имплантированного ПЭС способны трансдифференцироваться и быть источником регенерации сетчатки Затем был поставлен эксперимент, в котором ПЭС имплантировали либо со склеральной оболочкой, либо без нее При имплантации ПЭС вместе с сосудистой и склеральной оболочками, благодаря активной пролиферации и транедифференцировке его клеток происходила регенерация дифференцированной сетчатки Морфологически процесс регенерации осуществлялся сходным образом с восстановлением сетчатки in л//;/. Пролифсративная активность клеток ПЭС импланта-та на последовательных стадиях образования сетчатки была также сопоставима с нро-лиферагивной активностью клеток ПЭС при регенерации сетчатки in situ Уровень пролиферативной активности клеток ПЭС имплантатов ПЭС без склеральной оболочки в первые 10 суток оказался выше уровня пролиферации там же при сохранении склеральной оболочки (табл. 3). Причиной более высокого уровня пролиферации в таких трансплантатах может быть разобщение клеток агрегата также в результате отсутствия склеральной оболочки Сравнение поведения клеток ПЭС птиц, млекопитаю

Таблица 3. Пролиферативная активность клеток пигментного эпителия, имплантированных в полость линзэктомированного глаза тритона (М±т, %)

Сутки После Операции Способ имплантации пигментного эпителия

вместе со склеральной оболочкой без склеральной оболочки

ИМЯ МИ ИМЯ МИ

5 17.911,6 1» 27,013,2 2*

10 29,1 ±3,9 1,410,4 1,110,3 34,113,5 27,013,1 26,110,3 2,3iO,6 1,410,3

15-20 31,0±2,6

25-30 13,712,7 11,510,1 4*

35-60

* Даны абсолютные числа митотических клеток.

щих и тритонов при культивировании т vitro и в ПЭС тритонов в полости глаза показывает следующее Сходство заключается в том, что в обоих случаях клетки входят в фазу пролиферации и депигментируются Однако в условиях культивирования in vitro в результате образуются клоны единичных клеток, из которых »атем формируются лен-тоиды В последних иммуногистохимически выявляются кристаллины (Eguchi, Okada, 1973; Eguchi, 1976, 1980, Yasuda et al, 1981). В редких случаях при культивировании ПЭС тритонов возникают колонии, по морфологическим критериям и окрашиванию по Боднану имеющие нейральную дифференцировку (Eguchi, 1976) Напротив, при культивировании ПЭС в полости глаза тритонов лентоиды или хрусталики из его клеток не образуются, а формируются либо дифференцированная сетчатка, либо «сетчат-коподобные» структуры. При этом потенциями к трансдифференцировке обладают не единичные, а все клетки ПЭС Различия в проявлении потенций клеток ПЭС к сетча-точной, либо хрусталиковой дифференцировке в разных условиях культивирования свидетельствуют о том, что условия окружения могут быть существенным и решающим фактором для проявления потенций ПЭС к формированию лентоидов, либо сетчатки Условия окружения включают в себя, во-первых, морфогенетические факторы, ответственные за состояние клеток в пласте ПЭС (их контакты, полярность, взаимоотношения с субстратом); во-вторых, химические факторы среды культивирования. Последние неизвестны, хотя не вызывает сомнений, что in vitro и в полости глаза они различны При имплантации ПЭС тритонов вместе с сосудистой и склеральной обо-

ломкам» регенерирует сетчатка. В случае имплантации ПЭС только с сосудистой оболочкой образование дифференцированной сетчатки не происходит, а вместо нее образуется агрегат, состоящий из большого числа недифференцированных клеток. Причины таких различий также видятся в отсутствии необходимых морфогенетических факторов (натяжения пласта ПЭС) для завершения транедифференцировки клеток ПЭС и образования дифференцированною регенерата при снятии склеральной оболочки. В подтверждение этого суждения можно привести недавнюю работу Опаса и Джака (Opas, Dziak, 1994) В работе авторы использовали различные подложки для анализа роли механических свойств субстрата на финальных этапах конверсии клеток ПЭС цыпленка, индуцированной FGF Все субстраты имели одинаковое содержание макромолекул батальной мембраны, но различались по своим механическим свойствам. Только в случае использования нормальных базальных мембран происходила дифференциров-ка клеток в нейральном и глиальном направлениях Авторы сделали вывод, что просто механические свойства субстратов ПЭС могут быть решающим фактором в завершении транедифферениировки. В настоящее время предполагается, что все эти находки в будущем могут составить новую область исследований конверсии клеточного фенотипа — цигомеханику транедифференцировки (Opas, Dziak, 1994, Sakaguchi et al., 1997) Таким üñpaiOM, результаты наших исследований по влиянию подлежащих ПЭС тканей на его транедифференцировку в полости глаза и приведенные данные, полученные ш vilrii. свидетельствуют о важной роли третьей группы факторов — факторов, ответственных за конечные этапы транедифференцировки, за морфогенез вновь образованных структур (сетчатки и «сетчаткоидов») и днфференцировку их клеток По-видимому, в будущем они будут описаны не только в терминах механики, но и в терминах биохимии и молекулярной биологии, так как такие факторы, как натяжение и изменение формы клеток, способны модулировать клеточное поведение и ответ на другие факторы микроокружения через систему интегринов и сигнальной транедукции (Geiger, 1983).

ИЗМЕНЕНИЕ ДНФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК НЕЙРАЛЫЮН СЕТЧАТКИ И ФАКТОРЫ, ЕГО КОНТРОЛИРУЮЩИЕ

Число работ, где используется сетчатка для изучения нейралытой днфференци-ровкн в развитии, — велико, а при регенерации — несправедливо мало Это явилось одной из причин, почему нами была выбрана нейральная сетчатка тритонов для анали

16 14 12 10 8

6 _

(0) 5 10 20 30 40 60

Дни после операиии

Рис 8. .

Относительное число биполяроподобных клеток в наружном ядерном слое сетчатки тритона PL wlill(х±о%)

за клеточного поведения в ответ на травму. Кроме того, эта работа была необходимой и с целью выявления не найденных до сих пор у тритонов внутренних источников регенерации нейральной дифференцированной сетчатки Была использована модель экспериментальной отслойки сетчатки у взрослых l'l.waltl На серийных полу- и ультратонких epejax сетчатки, взятой в разные сроки после операции, были прослежены изменения морфологии, локализации, поведения и численности клеток разных слоев сетчатки, а затем радиоавтографически определен пролиферативный статус клеток в разные сроки после операции В результате был выявлен новый класс клеток п наружном ядерном слое, отличный от фоторецепторов, но обладающий морфологическим сходством с некоторыми биполярами склеральной части внутреннего ядерною слоя Последние представляли небольшую по численности популяцию интернейронов, не имеющих выраженные аксон и дендрит, но обладающих специфическим апикальным отростком — колбой Ландольта (Landolt, 1871, Hendrickson, 1968) и тонким коротким базальным отростком По этой причине клетки базальной части наружного ядерного слоя были названы нами биполяроподобными Биполяроподобные клетки, составляющие 10 — 12 % (рис 8) от всех клеток слоя, оказались способны продуцировать

сетчатка кооперированного сетчатка после отслойки глаза

^ Снятие инигибирующих сигналов. ^ которые в норме ограничивают митозы и клеточную дифференцировку. Факторы пролиферации и дифференцировал, связанные с клеточными контактами.

Рис V

Схема, демонстрирующая вн>трсннис источники регенерации кейральмой сетчшки н их регенерационные ответы на отслойку сетчатки.

ПЭС - пигментный эпителий сетчатки: НЯС - наружный ядерный слой. НСС - наружный сетчатый слой: НЯС - вн> гренний ядерный слой. ВСС - внутренний сегштый слой. СГКл - слон (англиотных клеток. К - колбочки: 11 - палочки: Б-П - биполярололобные клетки: Г - горн юнгхтьные клетки. Б - бнполяры: А - амакрииовые клетки: ГКл - ганглио шыс клетки: М - клетки Мюллера

новые фоторецепторы в процессе восстановления сетчатки после отслойки Мы выяснили, что на 15 — 30 дни после операции происходят морфологические изменения этих клеток, выражающиеся в активации ядер (появление 1-2-х крупных, плотно окрашивающихся ядрышка, гетерохроматина, пристеночного хроматина, укрупнение и изменение формы ядра), а затем — в дифференцировке внутреннего и наружного сегментов Дифференцировка этих клеток в фоторецепторы выражается в формировании внутреннего сегмента из очень сходной с ним колбы Ландольта и наружного сегмента, образование которого происходит апикальнее от уже имеющейся реснички Процесс такого превращения биполяроподобных клеток в фоторецепторы, по нашему мнению, может отражать присущее этим клеткам свойство пластичности фенотипа Эту популяцию клеток сетчатки тритонов можно сравнить с постмитотическими клетками в развивающейся нейральной сетчатке птиц и млекопитающих, способными к развитию в двух направлениях (Adler, Hatlee, 1989; Reh, Cljavin, 1989) Мы предполагаем, что у тритонов, в отличие от птиц и млекопитающих, такие клетки могут присутствовать во взрослой дифференцированной сетчатке Выявленная нами популяция биполяроподобных клеток обнаруживает некоторое сходство с клетками-предшественниками палочек, обнаруженными ранее у рыб П. Раймонд ((Raymond-Johns, Femald, 1981; Raymond-Johns, 1982, Raymond, 1985a; Raymond, Rivlin, 1987, Raymond, 1991, Hitchcock, Raymond, 1992). Они также локализованы во внутренней части наружного ядерного слоя, присутствуют как в нормальной, так и регенерирующей сетчатке и способны продуцировать новые фоторецепторы Однако популяция биполяроподобных клеток имеет и характеристики, отличающие ее от клеток-предшественников палочек у рыб Во-первых, — особенности морфологии, определяющие сходство с биполярами внутреннею ядерного слоя, имеющими колбу Ландольта Во-вторых, эти клетки способны дифференцироваться в фоторецепторы без предварительного деления И, наконец, численность их вдвое выше, чем предполагаемая (3-5°Ь) для клеток-предщественников палочек у рыб Таким образом, популяция биполяроподобных клеток в сетчатке тритона имеет свойства «молчащей» популяции постмитотических, но не достигших терминальной дифференцировки клеток, способных активироваться и дифференцироваться в ответ на повреждение сетчатки и гибель фоторецелторов Процесс превращения биполяроподобных клеток может быть назван трансдифференцировкой (согласно Okada. 1991) Однако до тех пор, пока не будет окончательно определен их фенотип с помощью набора специфических маркеров, мы избегаем такого определения Предполагает -

ся также, что источниками биполяроподобных клеток наружного ядерного слоя являются биполяры с колбой Ландольта внутреннего ядерного слоя, смещающиеся скле-ральнее при гибели части фоторецепторов. Эти предположения подтверждаются данными о локализации на поверхности биполяров, имеющих колбу Ландольта, визинина. одного из кальций-связывающих белков фоторецепторов (Negishi et а!., 1992) и антигена RB-1, также специфически окрашивающего колбочки сетчатки тритонов (Saito et al., 1994).

При длительной отслойке сетчатки (на поздних сроках) обнаружены нейробла-сты, возникающие во внутреннем ядерном слое. ">ти клетки, смещаясь апикальнее и делясь в области наружной пограничной мембраны, формируют радиальные «вставки«, клетки которых дифференцируются и восстанавливают клеточный состав всех трех ядерных слоев отслоенной сетчатки. Происхождение этих клеток пока не определено. Это связано с тем, что наши радиоавтографические исследования на полутонких срезах продемонстрировали сразу несколько популяций клеток нейральной сетчатки, способных включать меченый предшественник синтеза ДНК 5Н-тимидин: клетки Мюллеров-ской глии, клетки ПЭС. клетки ростовой зоны глаза и мелкие клетки внутреннего ядерного слоя, расположенные в его витреальной части. В настоящее время предпринимаются попытки использования различных иммунологических маркеров для окончательной идентификации как фенотипа бипаляролодобпых клеток, так и для более -точной идентификации нсточника/ов пролиферирующих нейроэлителиальцых клеток, в отслоенной сетчатке.

Данных о роли клеточных или внеклеточных факторов, контролирующих диф-ференцировку фоторсиспгоров из кдетак-предшественников при регенерации сетчатки пока совсем немного В настоящее время пр>г обсуждении модели превращение в фоторецепторы клеток-предшествснников палочек у рыб особое внимание уделяется механизмам. инициирующим регенерацию и индуцирующим клетки к дифференцировке в фоторецепторы По и» мнению, особую роль здесь могут играть компоненты ЭЦМ, связанные с областью наружной пограничной мембраны и локализованными в ней многочисленными межклеточными контактами (Raymond et al, }995) На роль таких молекул ЭЦМ, по П Раймонд с соавторами, претендуют молекулы адгезии — кадхе-рины и ассоциированные с ними катенины С другой стороны, извет но. что кадхери-ны и катенины включены в процесс сигнальной транедукцни в развитии (Takeichi, 1988, Reides. Takeichi, 1993) Все это дает основание полагать, 'по образование клеточ-

ных типов сетчатки из клеток-предшественников регулируется изменением межклеточных взаимоотношений и, в частности, межклеточной адгезией Полученные нами данные при изучении превращения биполяроподобных клеток в фоторсцепторы сетчатки взрослых тритонов после ее отслойки являются только вторым примером восстановления ненральной сетчатки при использовании собственных внутренних источников Эта информация получена недавно, и поэтому нам пока трудно определенно судить о факторах, контролирующих способность постмитотическнх биполяроподобных клеток дифференцироваться в фоторецепторы Однако в общем виде уже сей"ас ясно, что отслойка сетчатки от ПЭС у тритонов и последующая элиминация части клеток сетчатки являются основными событиями, индуцирующими клетки-предшественники к дифференцировке в фоторецепторы (рис 9) Эти события могут приводить к устранению неких сигналов, ингибируюших митозы и клеточные превращения в сетчатке. Значение ингибиторных взаимодействий в морфогенезе и скорости дифференцировки в нейральной сетчатке уже доказано некоторыми наблюдениями (Reh, Tally. 1986) Существуют сведения о том, что клетки ПЭС, взаимодействующие с фоторецепторами in situ, могут также оказывать ингибирующий эффект на дифферен-цировку фоторецепторов в развивитии (Schlosshauer el al, 1997) В нашем случае можно предположить, что ПЭС, разобщенный с сетчаткой в результате отслойки, геряет свое ингнбирующее влияние, в результате чего биполяроподобные клетки «получают разрешение» осуществить дифференцировку в фоторецепторы

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении, опираясь на данные диссертации мы рассмотрим последовательность предполагаемых цитологических и молекулярных событий, лежащих в основе процесса транедифференцировки клеток глаза у взрослых тритонов.

1 Исходно в дифференцированных клетках masa взрослого тритона имеет место определенное соотношение биосинтезов специфических макромолекул например, синтез в клетках ПЭР на незначительном уровне отдельных классов кристаллмнов (сами кристаллины при этом нммунологически не детектируются) и на высоком — меланина Это соотношение, наряду с другими биостпетическимп характеристиками, обеспечивает проявление исходной днфференцировки клеток пигментированного чпи-1елия, гак как идентификация днфференцировки связана с мажорными, ле1 ко выни-ляемыми на морфологическом или иммунологическом уровнях, макромолекулами Состояние терминальной дифференцировки клеток поддерживается стабилишрующи-

ми ее факторами, заключенными в микроскружении и сохраняющимися благодаря нормальным связям клеток между собой, клетками соседних тканей и субстратом (ба-зальными мембранами). В качестве одного из таких факторов нами был показан фиб-ронектин

2 При повреждении ткани, разобщении ее с окружающими тканями, ее выделении или обработке диссоциирующими агентами происходит разрушение нормальных межклеточных взаимодействий и привычного микроокружения. В результате снимается действие факторов, стабилизирующих исходную дифференцировку и ингнбирующих клеточную пролиферацию. Например, потеря или перераспределние макромолекул поверхности или базальных мембран (по нашим данным — адгезионных молекул ЭЦМ, таких как фибронекгин). Этот этап является самым существенным для инициации процесса транедиффергнцировки

3 Вслед за этим появляются и начинают воздействовать факторы, разрешающие пролиферацию и клеточную конверсию Эти факторы могут иметь различное происхождение факторы, локализующиеся в ЭЦМ, базальных мембранах, связанные с поверхностью клеток или высвобождающиеся из цитоплазмы клеток при их разрушении Информация об изменении поверхности клеток при разрушении их нормальных взаимодействий и об активности новой группы факторов передается внутрь клетки Передача этой информации может осуществляться с помощью механизма сигнальной транедукции (£^исШ, 1998)

4 Трансмембранно передающийся сигнал с поверхности приводит к цитоплаз-матическон реорганизации Но нашим данным на этом этапе возможны перестройки цитоскелета. постепенная замена одних специфических белков промежуточных фила-ментов цишекеле.а на другие (цитокератинов на нейрофиламенты при транедиффе-ренцировке клеток ПЭС в нейральную сетчатку) Известно, что цитоскелет клеток ответственен за компартментализацию цитоплазмы и органелл и проведение сигнала с поверхности к ядру. Не исключено, что изменения цитоскелета наряду с другими факторами участвуют в регуляции синтеза специфических макромолекул

5 Чатем разворачиваются пролиферативные события и сопровождающая их де-днфференцнровка клеток, которые находятся под контролем митогенов По данным литературы последними могут быть факторы роста фибробластов, по нашим результатам — также фактор роста гидры и факторы роста, выделяемые трансплантированным в полость глаза ПЭС Наши данные демонстрируют также резкое увеличение в это

время синтеза ДНК, РНК, общих белков и среди последних ядерных негистоновых белков

6. В процессе пролиферации и дедифференцировкн клеток на фоне активированных синтезов РНК, ДНК и белков происходит изменение работы генов, ответственных за специфические синтезы Нами показано угнетение на этом этапе в пигментированных клетках глаза специфического синтеза исходной дифференцировки, синтеза меланина. Однако, это не означает, что все звенья синтеза специфических продуктов (от транскрипции кодирующих их генов до посттрансляционных событий) репрессируются. Опираясь на собственную информацию и данные литературы, мы допускаем сохранение отдельных участников биосинтеза специфических продуктов (например, ключевого фермента биосинтеза меланина — тирозиназы) и посттрансляционные изменения синтезированных молекул, делающие их недетектируемыми.

7 Увеличение в результате пролиферации числа клеток с изменившимся паттерном экспрессии генов и формирование ими новых взаимоотношений между собой и окружением приводят к работе факторов, разрешающих дифферснцировку клеток в новом направлении Нами показано, что существенную роль в это время могут играть морфогенез ические факторы, такие как агрегация клеток, формирование контактов, натяжение клеток Например, только при наличии подстилающих Г1ЭС оболочек происходит трасдифференцировка его клеток в сетчатку при трансплантациях ПЭС в полость глаза

8 В результате морфогенеза агрегатов, состоящих из завершающих трансдиф-ференцировку клеток, и окончательного приобретения клетками своего места во вновь образованной структуре активируются новые специфические синтезы и происходит накопление продуктов, определяющих новую аллотнпическую дифферснцировку и функции возникших клеток По нашим данным в этот период появляется и накоплива-ется 5-100 белок, происходит окончательное становление систем нейрорецепторов в возникшей благодаря трансдифференцировке клеток ПЭС сетчатке, а также накопление а,Ц- и /-кристалликов во вновь образованном из клеток радужки хрусталике.

9 В результате накопления в клетках новых специфических продуктов и иши-бированного синтеза (или деградации) «старых« возникает новое определенное соотношение специфических макромолекул внутри клетки. Это соотношение становится устойчивым и определяет проявление новой специфической дифференцировки.

Таким образом, в данной работе нам удалось покатать, что процесс транедиф-фереицнровкн клеток глаза позвоночных животных, помимо изученных ранее изменений морфологии и пролиферативной активности клеток, сопровождается заменой специфических макромолекул. Меланиновый синтез пигментированных эпителиальных клеток сетчатки и радужки ингибируется, а на смену ему после образования нескольких поколений клеток приходит синтез S-100 белка, накапливаются белки нейроре-цепторов и кристаллинов, соответсвенно. При этом появление нового специфического продукта может быть связано с его синтезом de novo (белок S-100, нейрофиламенты) или только с накоплением («- и /?-кристаплины, белки нейрорецепторов). Смена специфических синтезов проходит на фоне 2 — 3-х кратного повышения активности синтезов РНК, общих и нет истоновых ядерных белков Изменение дифференцировки клеток сопровождается также заменой специфических белков цитоскелета (белков промежуточных филаментов). при транедифферекцировке клеток ПЭС цитокератины замещаются белками нейрофиламентов Все эти превращения осуществляются в ряду нескольких поколений трансдифференцирующихся, активно пролиферирующих клеток. Однако возникающие транзитные клеточные популяции, являясь дедифференцирован-ными морфологически, по ряду биохимических критериев таковыми не являются. Каждый из этапов транедифференцировки (инициация, прогресс и завершение процесса) зависит от ряда контролирующих факторов. Контроль процесса клеточной конверсии осуществляется как со стороны клеточного микроокружения, в частности адгезионных факторов внеклеточного матрикса и базальных мембран (фибронектин), так и со стороны экзогенных (фактор роста гидры, ретиноевая кислота) и эндогенных (сетчаточ-ный фактор) регуляторов роста и морфогенеза. В работе также удалось впервые найти, разработать и описать новую модель изменения клеточной дифференцировки — превращение бнполяроподобных клеток дифференцированной нейральной сетчатки в фоторецепторы у тритона Модель демонстрирует наличие феномена конверсии клеточного типа в нейральной ткани взрослых позвоночных и открывает путь к дальнейшему ее изучению. Использованные в работе экспериментальные приемы и подходы являются оригинальными, а полученные данные находят подтверждение в сведениях литературы, в том числе и тех, что появляются только сейчас По нашему мнению, данные работы иошолили создать необходимую и достаточную базу для описания процесса конверсии клеток глаза позвоночных в терминах молекулярной биологии

Какими же видятся дальнейшие пути исследования трансдифференцировки'? В настоящее время, как представляется, их — два Первый связан с исследованием молекулярных взаимодействий факторов мпкроокружения с трансдифферснцирующнмися клетками, с исследованием проведения поступившего в результате этих взаимодействий сигнала и механизмов специфической экспрессии генома в соответствии с информацией, полученной извне. Второй путь — поиск и исследование роли генов, в том числе и гомеобоксных, специфически экспрессирующихся в процессе изменения клетками их фенотипа. Есть уверенность, что на стыке этих двух направлений очень скоро будет достигнута основная цель многолетних исследований и станет понятен в больших деталях механизм, ответственный за регуляцию превращений клеточной диффе-ренцировки у позвоночных Это, в свою очередь, позволит решить проблемы регенерации тех тканей и органов, клетки которых способны к изменению своей специфической дифференцировки.

ВЫВОДЫ

I Изучены пролиферативная активность и динамика синтеза специфического продукта — меланина в клетках пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и радужки (ПЭР) в процессе их трансдифференцировкн у тритонов. Выяснено, что превращение этих клеток в нейробласты сетчатки и волокна хрусталика осуществляется при условии освобождения клеток от признаков исходной дифференцировки — в пролиферирую-щих клетках ПЭС и ПЭР подавляется синтез меланина В случае одновременно протекающих процессов пролиферации и синтеза меланина, имеющих место в клетках областей ПЭС и ПЭР, не претерпевающих конверсию, происходит стабилизация исходной эпителиальной дифференцировки и восстановление числа клеток. Подавление синтеза исходного специфического продукта при трансдифференцировке ПЭС и ПЭР происходит при сохранении отдельных звеньев процесса биосинтеза меланина

2. Исследованы время появления и локализация специфических макромолекул новых возникающих дифференцировок 8-100 белка, белков нейрорецепторов и кри-сталлинов при превращении ПЭС в нейральную сетчатку и ПЭР в хрусталик, соответственно Показано, что кальций-связывающнй белок 5-100 и М-холино- и /?-адренергические рецепторы в детектируемых количествах появляются на поздних стадиях регенерации сетчатки в процессе восстановления функции регенерата Выяснено, что в ингактных ПЭР и роговице лягушек и тритонов клегки способны к следовому синтезу белков, нммунохнмически сходных с </ и /¡-крпсталлинами Этосвидегелыяву-

ет о том, что синтез по крайней мере двух классов кристалликов ке связан прямо со способностью ткани к трансдифференцировке. Эти же два класса кристалликов обнаруживаются на ранних этапах конверсии ПЭР, хотя у-кристаллин выявляется позже — в волокнах регенерата хрусталика. Таким образом, при существовании в исходных и начинающих превращение клетках синтеза отдельных классов кристалликов полный их набор формируется на поздних стадиях траисдиффсрениировки.

3. Радиоавтографически изучена активность синтезов РНК, общих и негистоно-вых ядерных белков в процессе конверсии клеток Г1ЭС и ПЭР. Выяснено, что вскоре после инициации трансдифференцировки синтезы ДНК и РНК активируются. Максимальная интенсивность этих процессов наблюдается в период высокой пролифератив-ной активности клеток и в тех облатях ПЭС и ПЭР, которые претерпевают изменения дифференцировки. Позже активность синтезов РНК, общих и негистоновых ядерных белков снижается, свидетельствуя о завершении в клетках активных биосинтетических перестроек и пролиферации

4. Иммуногистохимически изучена эхспрессия специфических белков цитоске-лета в процессе превращения клеток ПЭС. Обнаружено, что в процессе трансдифференцировки клеток ПЭС происходит снижение, а затем и подавление экспрессии цито-кератинов, белков специфичных для промежуточных филаментов эпителиальных клеток, и появление белков нейрофиламентов НФ-200 — маркера нейральных клеток Последние обнаруживаются рано, задолго до появления морфологических черт нейральных клеток. В процессе трансдифференцировки клеток ПЭС белки НФ-200 синтезируются Je novo, а затем аккумулируются и входят в состав цитоскелета клеток зачатка сетчатки, замещая цитокератиновые промежуточные филаменты. Временные и пространственные изменения экспрессии этого компонента цитоскелета в ПЭС коррелируют со степенью устойчивости дифференцировки клеток, зависимой от микроокружения

5 При анализе специфических синтезов, а также экспрессии белков цитоскелета выяснено, что прямого перехода ог исходной дифференцировки к новой не происходит. В процессе трансдифференцировки ПЭС и ПЭР в нейральную сетчатку и хрусталик образуется особая промежуточная популяция Не клетки, обладающие активной пролиферацией и не имеющие каких-либо специфических морфологических черт, все же не являются (как предполагалось ранее) дедифференцированными и сходными с эмбриональными По наличию следовых исходных синтезов (некоторых классов кри-

сталлинов). сохранению отдельных звеньев меланнмового синтеза (фермента тирози-назы), сосуществованию белков промежуточных филаментов разной специфичности клетки этой популяции в большей мере сопоставимы с неопласт ическими

б Иммуногистохимически изучена экспрессия адгезионного компонента ЭЦМ и базальных мембран — фибронектина в процессе трансдифференцировки клеток ПЭС и ПЭР. Выяснено, что распределение фибронектина в базальных мембранах и на поверхности клеток закономерно изменяется: происходит перераспределение фибронектина с базальных поверхностей клеток на латеральные и апикальные, а также снижается его количество в выстилающих трансдифференцирующиеся клетки базальных мембранах Снижение жспрессии фибронектина на самых ранних стадиях трансдифференцировки расценивается как один из дестабилизирующих сигналов клеточного микроокружения, приводящего впоследствии к изменению фенотипа клеток.

7. Показана роль рост-стимулирующих факторов в прогрессе трансдифференцировки клегок ПЭР в хрусталик Выяснено, что превращение клеток вентральной радужки в хрусталик возможно при их обработке фактором роста гидры с последующим культивированием в полости глаза. Влияние этих условий приводит к активации пролиферации клеток, в результате чего они оказываются способны осуществить необходимое для завершения трансднфференцировки в клетки хрусталика число клеточных циклов. Обнаружено, что другим стимулирующим трансдифференцировку фактором является ГПС, культивируемый в полости глаза Он вызывает формирование дополнительных хрусталиков из клеток дорсальной радужки, образование хрусталика из клеток вентральной радужки и формирование несовершенных сетчаток из клеток ПЭР.

8. Исследование роли рост-ннгибирующего фактора и морфогена — ретиноевой кислоты — продемонстрировало его подавляющее пролиферацию действие на клетки всех областей радужки in situ после однократной инъекции. Однако временное ингиби-рование пролиферативной активности трансдифференцирующихся клеток ПЭР не приводило в дальнейшем к изменениям хода конверсии или нарушению морфогенеза образующихся хрусталиков

9. В экспериментах по трансплантации ПЭС показана роль меж! каневых взаимодействий для осуществления финальных этапов трансдифференцировки его клеток Выяснено, что сохранение подлежащих ПЭС тканей необходимо для завершения трансдифференцировки в сетчатку в условиях культивирования фрагментов ПЭС в полости глаза Снятие оболочек ПЭС и нарушение в результате этого необходимых мор-

фогенетических условий для формирования сетчаткоподобных струюур приводит к активной пролиферации клеток ПЭС, но и к невозможности их дифференцировки в нейроны.

10 Впервые обнаружен и изучен процесс превращения дифференцированных клеток нейральной сетчатки после ее отслойки у взрослых тритонов Морфологически описана и количественно охарактеризована популяция биполярополобных клегок наружного ядерного слоя сетчатки, составляющих 10-12% от общей численности клеток слоя и способных к дифференцировке в фоторецепторы. Показано, что в сетчатке вскоре после гибели клеток, вызванной отслойкой, биполяроподобные клетки смещаются апикальнее и формируют внутренний и наружный сегменты фоторецепторных клеток Это превращение происходит без дополнительных делений, поэтому сами клетки расцениваются как постмитотические, но не достигшие терминальной дифференцировки Источником биполяроподобных клеток являются нетипичные биполяры с колбой Ландольта, расположенные во внутреннем ядерном слое и способные пополнять популяцию биполяроподобных клеток наружного ядерного слоя после повреждения сетчатки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 А/шпанки, И. И.. Григорян Э. II. (1976) Пролиферация клеток радужины и пигмент-

ного эпителия сетчатки на ранних стадиях после удаления линзы и сетчатки у испанских тритонов // Онтогенез Т. 7 № 2. С 141 —147.

2 Григории Э. //., Миташов И. П. (1976) Реутилизация меченых предшественников

ДНК* клетками радужины при регенерации линзы и сетчатки у триюнов // Онтоге-нет Т 7 Л» 1 С 64-69

3 Мипшинш Н II. ('виршЬж ('. Л/.. Ко/мчкин Л. П., Григории 3. II., Ми пч/кин J.. I/.

(1978) Синтез нсйроспепифического белка S-100 в клетках сетчатки во время регенерации глаза у взрослых тритонов // Онтогенез. Т. 9. № 4 С. 401—406.

4 Григорян 3. //.. Миташов В. И. (1979). Радиоавтографическое исследование проли-

ферации и синтеза меланина в клетках пигментного эпителия при регенерации гла>а у тритонов // Онтогенез Т. 10 №2. С. 137—144.

5 Митшиоп В. 11.. Г/тгорнн Н. (1980). Радиоавтографическос исследование пролиферации и синтеза специфических белков в клетках радужины при регенерации глаза у тритонов // Онтогенез. Т. 1 I. № 2. С. IbO—167 6. MitashovV.I., Grigoryaii Е. N. (1980). Macromolecular Syntheses in Cell TransdifTerentiation // Proceeding of XIV International Embryolology Conference (Greece). P 86

7 Григорян Э. H, (1981). Пролиферация и специфические синтезы при регенерации глаза // VI Всесоюзое совещание эмбриологов Тез. докл. М. Наука . С 42

8. Afitashov Г. /.. (iri^oryan /■'.. N.. Moskovkin (!. N. (1981) Autoradiographic Investigation

of the Regeneration of Retina and Tectum in Adult Newts // Ontogenesis of the Brain Praha: Univerzita Karlova. V. 3. P. 105—108.

9. MitashovV.I., Grigoryan !•'.. N. (1981) Changes in Melanin Synthesis during Cell

TransdifTerentiation // Proceed of III European Workshop on Melanin Pigmentation. (Prague, Czechoslovakia). P 74

10. Григорян Э. H. (1982) Пролиферация и специфические синтезы в процессе гранс-днфференцировкн клеток регенерирующего глаза тритонов: Автореф дис канд биол наук/ПБР РАН М Изд МГУ 25 с.

11. Григорян Э. Н. (1982). Радиоавтографическое исследование синтеза РНК и мела-

нина в клетках глаза в процессе регенерации сетчатки у тритонов // Современные проблемы регенерации. Йошкар-Ола Изд. МарГУ С 233. 12 Митшшт Н. И., Григорян 3. Н., Чернова Н. И. (1983). Радиоавтофафическое исследование синтеза негистоновых белков в процессе регенерации хрусталика и сетчат ки у взрослых тритонов // Онтогенез. Т. 14 . № 4 С 390—397 13. Григорян 3. Н., Митаикт В. //. (1983). Соотношение пролиферации и синтезов специфических и кислых белков в процессе транедифференцировки клеток при регенерации глаза у тритонов // Цитологические механизмы гистогенезов Ташкент Изд ФАН С 48—50

14 Григорян 3. Н. (1983) Современные пути изучения регенерации глаза у низших позвоночных животных // Современные проблемы регенерации Йошкар-Ола Изд МарГУ С 46 -58.

15. Григорян Э. Н. (1983). Изменения дифференцировки клеток пигментного эпителия сегчагки при регенерации и в условиях культивирования // Докл МОИП Сер. биол С 104—113.

16. Миташов В. И., Григории Э. Н. (1984) Радиоавтографическое исследование пролиферации клеток пигментного эпителия тритонов после трансплантации в полость безлинзового глаза//Онтогенез Т. 15. № 1. С. 49—55.

17. Самарский В. Н., Григорян Э. Н„ Миташов В. И., Михайлов А. Т. (1986) Соотношение морфологической и биохимической дифференцировки хрусталика в эмбриог-незе и н процессе его регенерации из радужки тритона // Закономерности индивидуального развития живых организмов Материалы VII Всесоюзн. совет эмбриол. Ч 1С 100

18 Симирский В. Н., Григории Э. П., Миташов В. II., Михайлов А. Т. (1984) Синтез кристаллиноподобных антигенов (КПА) в эпителии роговицы, радужке и сетчатке взрослых амфибий // Онтогенез. Т. 15. № 4. С. 439—440

19 Симирский В. И.. Григорян '). П.. Миташов В. II., Михайлов А. Т. (1984) Синтез кристаллиноподобных антигенов и способность тканей взрослых амфибий к превращению в хрусталик: Доклады АН СССР. Т. 276, № 6. С 1488—1490

20 Григорян Э. Н., Миташов В. И. (1985). Пролиферация и транедифференцировка клеток при регенерации сетчатки из клеток культивированного в полости глаза тритонов пигментного эпителия // VII Всесоюзн. конф. по регенерации. Л.: Наука С 70-73

21. Григорян Э. #., Миташов В. И. (1985). Культивирование пигментного эпителия сетчатки в полости линзэктомнрованного глаза тритонов // Онтогенез. Т. 16, № 1. С 34 - 43

22 Григории Э. Н., Мальчевская И. /.'., Миташов В. И. (1986). Пролиферация пигментированных клеток глаза и морфогенез множественных хрусталиков у амфибий // Закономерности индивидуального развития живых организмов (Материалы VII Всесоюзн совет эмбриол.) М.: Наука С.75

23. Симирский В. И., Григорян Э. Н., Миташов В. И., Михайлов А. Т. (1986). Соотношение морфологической и биохимической днфференцировок хрусталика в эмбриогенезе и в процессе его регенерации из клеток радужки тритона // Закономер-

ности индивидуального развития живых организмов: (Материалы VII Всеооюзн. совет эмбриол ) М.: Наука. С. 100.

24.Григорян Э. Н. (1987). Трансдифференцировка как один из механизмов регенерации //Современные проблемы регенерации Йошкар-Ола Изд МарГУ. С 97 107

25. Григории Э. //.. Мальчевская И. /•„'., Митаиюв В. И., Рубина А. Ю , Вшюг/чккш В. А.

(1987) Стимуляция регенерации хрусталика из клепок вентральной радужки тритонов // Онтогенез. Т. 18. № б. С. 605—613.

26. Grigoryan К. N.. Malchevskaya I.E., Mitashov V.l. (1987). Experimental stimulation of lens regeneration from the ventral part of the newt iris // Cell Differentiation V 20, suppl P. 88S

27. Mitashov V. I., Grigoryan E. N.. Svistunov S. (1987). Regularities of macromolecular syntheses in the process of lens and retina regeneration in adult lower vertebrates // Arch. Anat mic. Morphol. exper. V. 75. № 4. P. 286—287.

28. Григории Э. H., Мальчевская И. E., Mumautoe B. If. (1988) Фактор роста гидры попытка использования в стимуляции регенерации хрусталика из клеток вентральной радужки тритонов Онтогенез Т. 19 № 5, С 537.

29. Григорян Э. Н., Тучкова С. Я., Мальчевская И. Е., Сичнков С..//., Миташон В. II.

(1988) Влияние ретиноидов на дифференцировку, пролиферацию и морфогенез при регенерации хрусталика и конечности у амфибий // Онтогенез Т. 19 №4 С 438

30. Grigoryan Е N , Dolnikova А Е , Belkin V М. (1989). Expression of fibronectin (Fn) in eye tissues after lens removal and retina detachment in the newt // Cell Differ Develop V.27, suppl. P. 78S.

31. Grigoryan E. N.. Mitashov V. I., Malchevskaya I. E. (1990). Exo- and endogenous factors

regulating cell transdifFerentiation during lens and retina regeneration in the newt // Proceed, of Europ Conf on Tissue and Posttraumatic Regeneration (Geneva, Switzerland, September 1990) P 85 32 Григорян Э. H.. Долыткооа А. Э., Нелкин В. M. (1990). Распределение фибронектина в процессе транедифференцировки и пролиферации клеток глаза после отслоим! сетчатки и удаления хрусталика у тритонов//Онтогенез Т .21. №4 С. 403 408

33 (¡пошлин !■'.. N.. Moskovkih U. N. (1990) M-Cholinergic (M-C'h) and beta-adrenergic (beta-Ad) receptor system maturation during retina iexoneration in the newt eye // Proceed, of Europ. Conf. on Tissue and Posttraumatic Regeneration (Geneva, Switzerland, September 1990) P. 75

34. Grigoiyan E. N.. MoskovkinC. N. (1990) Development of M-cholinergic (M-ChR) and beta-adrenergic (beta-AdR) receptor systems during retina regeneration in the newt // Proceed of 9th 1CER (Helsinki, Finland, July 1990) P.48

35. 1'ригорян 3. H . Московкип Г. H. (1991) М-ацетилхолиновые и бегта-

адренергические рецепторы клеток сетчатки и пигментного эпителия в процессе регенерации глаза у тритонов // Изв. АН СССР. Сер. биология. № 1. С. 13—23. 36 Григории Э. Н., Знойно С..'/.. Мальченская И. /•-'., Миташов И. И. (1991). Сравнительная характеристика влияния ретиноевой кислоты на регенерацию хрусталика и конечности у взрослых тритонов // Изв АН СССР. Сер биология. № 5. С. 726— 734

37. Григории Э. Н. (1992). Регенерация глаза после отслойки и отрыва сетчатки у три-

тием l'leurotleh.\ walllii // Изв РАН: Сер биология № I.C. 18—24.

38. (1пцогучп Г.. N.. Anion H.J. (1993) Neurofilament protein expression by

transdillercntiating retinal pigment epithelium cells during neural retina regeneration in the adult newt II Proceed, of 1SD13 Congress (Vienna, Austria, September 1993). P. 062.

39 Григорян Э. H. Антон Г. J (ж. (1993). Появление и распределение белка ненрофи-ламентов НФ-200 в трансдифференцирующихся клетках пигментного эпителия и других клетках глаза в процессе регенерации сетчатки у тритонов // Онтогенез. Т. 24 №4 39--52.

40 (Iriyotywi Г.. N.. Anion Н. .1. (1995) Changes in specific cytoskclctal proteins in transdifferentiating retinal pigment epithelium during neural retina regeneration in the newt // Wound Repair and Regeneration. V. 3. № I. P 111

41. (inyoryan !■'.. N.. Anion II. J. (1995) Changes in the cytokeratin expression pattern in transforming pigment epithelium cells during retina regeneration in the newt // Proceeding of ISDB Congress (Toulouse, France, July 1995). P. 122

42. Григории Э. H., Антон Г. Дж. (1945) Анализ экспрессии кератинов в клетках пигментного эпителия сетчатки в процессе их транедифференцировкн у тритонов // Онтогенез. Т. 26 №4 С. 310 323.

43. Григории Э. Н. (1995) Полная отслойка сетчатки вызывает изменения экспрессии цитокератинов в клетках пигментного эпителия сетчатки у тритонов // Изв РАН Сер. биология № 4 С 412—421

44 Grigoryan Е. N.. PoplinskayaV. А., Ivanova 1. Р. (1995) Identification of alternative internal cell sources for neural retina regeneration in the newt // 6th Internat Symp «Neural Regeneration» (Pacific Grove, USA, December 1995) P 77

45. Григории Э. H.. Иванова If. П.. Поптнская H. А. (1096) Обнаружение новых, внутренних источников регенерации ненралыюй сетчатки после ее отслойки у тритонов 1 Морфологическое и количественное исследования // Изв РАН Сер. биология №3 С 319- 332

46 Григории Э. H (1996). Сетчатка хвостатых амфибий как модель для изучения реге-нерационных возможностей сетчатки других позвоночных И Онтогенез Г 27. Л» 3 С 173 185

47. Григорян '). Н. (1998) Смена белков промежуточных филаментов цитоскелета в процессе транедифференцировкн клеток пигментного эпителия сетчатки глаза тритона // Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкуции тканей Гез докл С 9 - 10

48 (¡пцогуап Е. N.. Pophnskaya Г А.. Ivanova 1. Р. (1998) Ultrastructural and radioaulographic identification of alternative internal cell souices lor neural retina regeneration in the newt Pleurodeles uultl // Онтогенез. T 29

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Григорян, Элеонора Норайровна, Москва

Го*'"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛБЦОВА

На правах рукописи /< УДК 591 169

А ^ ;............

ГРИГОРЯН Элеонора Норайровна

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ТКАНЯХ ГЛАЗА ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.11 —эмбриология, гистология, цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

Посващастса любимьм моим родителям Татьяне Ьолковой Норайру Григоряну

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

I. Пластичность дифференцировки клеток пигментного эпителия радужки.

Регенерация хрусталика из трансдифференцирующихся клеток пигментного эпителия радужки у взрослых тритонов. 15

II. Пластичность дифференцировки клеток пигментного эпителия

сетчатки (ПЭС).

II. 1.Регенерация нейральной сетчатки из трансдифференцирующихся

клеток ПЭС у тритонов. 35

II.2. Регенерация нейральной сетчатки из клеток ПЭС

у бесхвостых амфибий. 49

II. 3. Регенерация нейральной сетчатки у птиц благодаря

трансдифференцировке клеток ПЭС. 52

II.4. Свойства клеток ПЭС млекопитающих и его превращения

в развитии и при патологии. 55

III. Трансдифференцировка клеток пигментного эпителия сетчатки

в клетки хрусталика. 62

IV. Трансдифференцировка клеток эмбриональной нейральной сетчатки. 67

V. Изменения дифференцировки клеточных типов нейральной сетчатки взрослых животных.

VI. Строение и развитие сетчатки позвоночных. 71

V.2. Пластичность клеток нейральной сетчатки рыб. 73

V.3. Вероятность пластичности клеток нейральной сетчатки у

бесхвостых амфибий. 77

V.3. Пластичность дифференцировки клеток нейральной сетчатки

птиц и млекопитающих. 78

VI. Заключение к обзору литературы. 81

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 85

РЕЗУЛЬТАТЫ 92

I. Изучение трансдифференцировки и ее регуляции на модели

превращения клеток пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в клетки нейральной сетчатки при регенерации глаза у тритонов.

1.1. Радиоавтографическое исследование пролиферации и синтеза

меланина в клетках ПЭС при регенерации сетчатки у тритонов. 92

1.2. Радиоавтографическое исследование синтеза негистоновых белков в процессе трансдифференцировки пигментированных клеток глаза при регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов. 102

Содержание

1.3. Анализ экспрессии кератинов в клетках ПЭС в процессе их трансдифференцировки у тритонов после удаления сетчатки 108

1.4. Полная отслойка сетчатки вызывает изменения экспрессии цитокератинов в трансдифференцирующихся клетках

ПЭС у тритонов. 124

1.5. Появление и распределение белка нейрофиламентов НФ-200 в трансдифференцирующихся клетках пигментного эпителия и других клетках глаза в процессе регенерации сетчатки у тритонов. 136

1.6. М-ацетилхолиновые и/î—адреналиновые рецепторы клеток сетчатки и пигментного эпителия в процессе регенерации глаза у тритонов. 150

1.7. Синтез кальций-связывающего нейроспецифического белка S-100

в клетках сетчатки во время регенерации глаза у взрослых тритонов. 163

1.8. Распределение фибронектина в процессе трансдифференцировки и пролиферации клеток глаза после отслойки сетчатки и удаления хрусталика у тритонов. 169

1.9. Культивирование пигментного эпителия сетчатки в полости линзэктомированного глаза тритонов. 176

И. Изучение трансдифференцировки и ее регуляции на модели превращения клеток пигментного эпителия радужки (ПЭР) в клетки хрусталика при регенерации глаза у тритонов.

II. I. Синтез кристаллиноподобных антигенов и способность тканей глаза

взрослых амфибий к превращению в хрусталик. 190

II.2. Радиоавтографическое исследование пролиферации и синтеза специфического белка в трансдифференцирующихся клетках радужки при регенерации глаза у тритонов. 193

II. 3. Радиоавтографическое исследование синтеза негистоновых белков в процессе трансдифференцировки ПЭР и регенерации хрусталика у взрослых тритонов 203

И.4.Распределение фибронектина в процессе трансдифференцировки и пролиферации клеток радужки после отслойки сетчатки и удаления хрусталика у тритонов. 205

II. 5. Стимуляция регенерации хрусталика из клеток вентральной радужки тритонов с помощью фактора роста гидры

и культивирования в полости глаза. 208

II.6. Активация пролиферации и конверсии клеток радужки при трансплантации в полость глаза фрагментов

трансдифференцирующегося ПЭС. 219

II. 7. Влияние ретиноевой кислоты на пролиферацию и трансдифференцировку клеток радужки при регенерации хрусталика у взрослых тритонов. 226

III. Обнаружение новых, внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов.

Пластичность фенотипа одного из субклассов биполяров. 234

ОБСУЖДЕНИЕ 261

I. Изучение явления трансдифференцировки клеток на моделях превращения пигментированных тканей глаза взрослых тритонов.

II. Изучение внешних факторов, контролирующих трансдифференцировку

пигментированных эпителиальных тканей глаза взрослых тритонов. 288

III. Изменение дифференцировки клеток нейральной сетчатки и факторы,

его контролирующие. 305

IV. Теории молекулярно-генетической регуляции конверсии

клеточного фенотипа 313

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 332

ВЫВОДЫ 336

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 340

ПРИЛОЖЕНИЕ 376

I. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ 376

II. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 396

ВВЕДЕНИЕ

Проблема изменения типа дифференцировки клеток возникла давно, примерно столетие назад. Своим происхождением она обязана исследованиям по регенерации, в которых было обнаружено, что некоторые взрослые животные обладают удивительной способностью образовывать новые ткани из клеток, исходно имеющих совсем иные морфологические свойства. Самым ярким таким примером было обнаружение В. Колюччи (СоЬдса, 1891) и Г. Вольфом (\УоНТ, 1895) регенерации хрусталика из клеток пигментного эпителия радужки. В дальнейшем, в этом столетии, несмотря на то, что число примеров, подтверждающих возможность изменений клеточной дифференцировки, росло, развитие проблемы в целом имело сложную "судьбу". Всякий раз, когда в результате экспериментальных биологических или медицинских исследований поднимался вопрос о "клеточном превращении", он наталкивался на определенный скептицизм и недоверие. Даже 30 лет назад, во время перехода проблемы изменения клеточного типа (тогда "метаплазии") из области патологической анатомии в область биологии, названный феномен все еще подвергался большому сомнению. Вопрос тогда остро нуждался в конкретном содержании, которое могло быть получено путем твердых экспериментальных доказательств, найденных на разных видах животных и на разных этапах их индивидуального развития. Это могло быть достигнуто методами, вызывающими изменения клеточной дифференцировки и описывающими их как количественно, так и качественно. Требовалось также и накопление примеров превращений дифференцировки клеток, так как 30 лет назад их были только единицы.

В период усовершенствования техники исследований и разработки новых подходов можно было ожидать, что изменение дифференцировки клеток будет, по-прежнему, считаться исключением или произойдет увеличение числа примеров этого явления. Внедрение в обиход биологии техники электронной микроскопии, иммуногисто- и цитохимических исследований, широкое использование радиоактивных меченых предшественников синтеза различных макромолекул, разработка методов культивирования и методов молекулярной биологии сделали более точными определение фенотипа клеток и описание его изменений. Это привело к быстрому накоплению новых сведений, подтверждающих существование феномена пластичности дифференцировки. Использование специфических маркеров исходных

клеток позволило достоверно оценивать как их дифференцировку, так и дифференцировку возникающих клеток - потомков с точки зрения новизны их морфологической и биохимической специфики. Благодаря маркерам специфической дифференцировки и клеточных линий теперь удается проследить весь путь конверсии и доказывать, что клетки, обладающие новой дифференцировкой имеют дифференцированные предшественники, а не происходят из минорной популяции мультипотентных клеток. Появилась возможность использования экспериментальных систем и агентов, вызывающих или стимулирующих превращения клеточного фенотипа. И, наконец, в последнее время стало возможным описание факторов, регулирующих процесс изменения клеточной дифференцировки, языком биологической химии и молекулярной биологии. Все это в конце этого столетия дало новый импульс для изучения превращений клеточной дифференцировки.

В основе теоретических предпосылок данной проблемы видятся следующие. Геном клеток, как известно, стабилен в структурном отношении. Хотя рекомбинация и амплификация генов в ходе клеточной дифференцировки в некоторых случаях и происходит, дифференцировка основных клеточных типов в процессе развития все же не сопровождается изменениями генома (Gurdon, 1974; Davidson, 1986; Maclean, Hall, 1987). Каждая клетка многоклеточного организма имеет равное и полное число генов, свойственных данному организму, и на определенной стадии развития из этого общего фонда (генома) работает лишь определенный набор генов. При возникновении соответствующих условий (а они постоянно меняются в ходе онтогенеза) происходят изменения в работе генов, в паттернах транскрипции и трансляции (Gurdon, 1974; Корочкин, 1977; Конюхов, 1980). Дифференцировка, если иметь в виду ее конечный результат, устойчива, что обеспечивает живому организму его нормальное строение и выполнение всех функций. Но если иметь в виду процесс ее приобретения (дифферон), то в нем может быть обнаружен этап, при котором фенотип, приобретенный к этому моменту клеткой, может быть изменен. Наличие этого шага не есть опровержение стабильности генома, но - его подтверждение, так как превращение дифференцировки является только доказательством наличия в ядре полной информации и возможности активации соответствующих сайтов генома. Таким образом, понятие "стабильности" не может быть основной характеристикой процесса дифференцировки. Более аккуратным термином в настоящее время представляется "приобретение стабильности" (Nathanson, 1986). Раньше также постулировалось, что процесс дифференцировки

является необратимым (Отсчет, 1959), но теперь современные исследования показывают, что в условиях направленных воздействий - стимулов, клетки способны оказывать "сопротивление приговору", (т. е. коммитированности) и приобретать иной фенотип. Однако, как показывает сегодняшнее состояние дел в этой проблеме, это явление все же не является абсолютно универсальным, а его распространение не так широко, как это предполагалось еще 10-20 лет тому назад.

Вопрос пластичности фенотипа является одновременно вопросом клеточной дифференцировки и вопросом регенерации, а поэтому всегда актуален и имеет как теоретическое, так и большое практическое значения. Именно пластичность клеточной дифференцировки является одним из механизмов (наряду с участием недифференцированных, либо стволовых клеток), обеспечивающих регенерацию многих органов и тканей у низших позвоночных и некоторых тканей высших позвоночных животных. Например, частные сведения, полученные в результате изучения нами трансдифференцировки клеток глаза, могут быть использованы для поиска способов лечения некоторых заболеваний глаз человека, связанных с изменением клетками фенотипа и функции. С другой стороны, вопрос пластичности клеточного типа является фундаментальной теоретической проблемой, так как в основе этого явления лежит нарушение стабильности клеточной дифференцировки (спецификации), клеточный рост, клеточная миграция и смена типов функциональной нагрузки. Исследование изменений клеточной дифференцировки помогает ответить на основные вопросы биологии развития - как возникают фенотипические различия и становятся стабильными клеточные линии многоклеточного организма, когда и при каких условиях происходит расхождение путей дифференцировки и т. д.

Как будет видно из обзора литературы пластичностью дифференцировки в большей мере обладают эмбриональные, но коммитированные клетки и в меньшей -окончательно дифференцированные клетки взрослых животных. Характер изменений дифференцировки и тех и других связан с происхождением, а глубина превращения -часто со способностью к пролиферации. В обзоре литературы приведены сведения, касающиеся некоторых экспериментальных систем для изучения пластичности дифференцировки, хотя хорошо известны случаи изменений дифференцировки клеток и в процессе нормального развития. Среди наиболее известных примеров является трансдифференцировка клеток имагинальных дисков дрозофилы, лабиальных желез шелкопряда, эпителиально-мышечных клеток гидры, туболоцитов печени некоторых

рыб, клеток адренальных желез крыс и некоторые другие (см. обзор Okada, 1991). Все эти случаи демонстрируют смену клеткой своей дифференцировки не в ответ на направленное искусственное воздействие, но в результате реализации естественно существующей программы ее дифферона. Эти примеры, убедительно доказывают, что "дифференцировка может быть нестабильной перед тем как стать стабильной". Однако число таких примеров и спектр флуктуаций дифференцировки в этих системах все же ограничены, и это ограничение жестко связано с клеточным происхождением.

Для описания процесса изменения дифференцировки клеток глаза, начиная с 70-х годов группой японских исследователей стал широко использоваться термин "трансдифференцировка" ("transdifferentiation", Yamada, 1977). Но до этого, он впервые появился в работах, описывающих смену клеточной дифференцировки в норме в развитии насекомых (Selman, Kafatos, 1974). По мнению Т. Окады (Okada, 1991) термин трансдифференцировка, означающий "переключение или репрограммирование клеток на развитие в иной клеточный тип, отличный от исходного набором фенотипических признаков", может и должен быть использован только в случаях, когда происходит полная и необратимая смена типа дифференцировки уже дифференцированных клеток взрослого организма на иной. Результатом трансдифференцировки может быть возникновение только нормальных клеток, чья дифференцировка идентична некоей нормальной и реально существующей. Важно отметить, что поскольку идентификация всех специфических черт исходных клеток порой затруднительна, авторы допускают, что примеры трансдифференцировки могут включать превращения не только терминально, но и не до конца дифференцированных (недодифференцированных) клеток (Okada, 1991).

В диссертации наряду с термином "трансдифференцировка" мы используем термин "пластичность клеточного типа" (cell type plasticity). Это связано с тем, что в последнее время в литературе он вымещает другие термины, определяющие те или иные изменения клеточной дифференцировки у взрослых животных. Последнее, вероятно, обусловлено тем, что использование иных определений зачастую путано и противоречиво. Так, употребляли и продолжают использовать термин "конверсия клеточного типа", применяя который можно оставить без ответа некоторые, до конца не исследованные детали. В литературе этот термин обычно приводится без каких-либо определений или комментариев. Термин "трансформация", как правило связан со случаями изменений в геноме клеток, как, например, злокачественная трансформация.

И хотя большинство изменений клеточной дифференцировки таких изменений не предусматривает, термин тем не менее произвольно (и довольно широко) используется. В качестве примера, можно привести изменение морфологии и поведения клеток пигментного эпителия после отслойки сетчатки у млекопитающих, обычно называемое в офтальмологии "трансформацией". "Метаплазия" является традиционным термином в описаниях появления клеток новой дифференцировки из клеток иной исходной. Однако, этот термин был введен не благодаря экспериментальным исследованиям, а в результате анатомических и гистологических наблюдений появления чужеродной ткани. Во многих случаях (но не всегда) * метаплазия объяснялась преимущественным ростом небольшой клеточной популяции, исходно присутствующей в ткани, или ростом недифференцированных (стволовых) ; клеток. И только в редких случаях этот термин описывал истинную смену клеточной ; дифференцировки (клеточную метаплазию). "Клеточная модуляция" (реже "клеточная модификация") термин, предполагающий обратимые изменения некоторых черт клеточной дифференцировки, таких, например, как изменение набора пигментов в меланоцитах, нейротрансмиттеров в нейральных клетках, или превращение фибробластов в хондроциты в специально подобранных для этого условиях культивирования.

Каждое из приведенных определений безусловно может быть закреплено за тем или иным примером превращения клеточной дифференцировки, однако в этом случае должно быть дано с�

Информация о работе

Григорян, Элеонора Норайровна
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.11

Диссертация

Цитологические основы трансдифференцировки в тканях глаза позвоночных животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы