Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика гена рокристаллина лягушки Rana temporaria

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Микаелян, Арсен Суренович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 577.1

МИКАЕЛЯН АРСЕН СУРЕНОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА р-КРИСТАЛЛИНА ЛЯГУШКИ RANA TEMPORARIA.

Специальность 03.00.15 -генетика.

Научные руководители:

кандидат биологических наук С.М. Долгилевич кандидат биологических наук Р.Д. Зиновьева

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1998

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................9

1.1 КРИСТАЛЛИНЫ: ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕДСУЩЕСТВУЮЩИХ БЕЛКОВ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ НОВЫХ ФУНКЦИЙ............................................................................................................9

1.2 КАНОНИЧЕСКИЕ КРИСТАЛЛИНЫ, ИХ РОДСТВО СО СТРЕСС-ИНДУЦИРУЕМЫМИ БЕЛКАМИ...................................................................11

1.2.1 а-кристаллины: стресс-индуцируемые белки и шапероны...................11

1.2.2 (3- и у-кристаллины: белки осмотического шока...................................12

1.3 ТАКСОН-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ-КРИСТАЛЛИНЫ........16

1.3.1 е-кристаллин I лактатдегидрогенеаза...................................................18

1.3.2 5-кристаллины \аргининсукцинатлиазы.................................................20

1.3.3 т-кристаллин\ а-энолаза и т]-кристаллин\алъдегиддегидрогеназа........22

1.3.4 р-кристаллин I альдо-кеторедуктазы...................................................22

1.3.5 /и-кристаллинI орнцтинциклодеаминаза и Л-кристаллин\ гидроксиацил-СоА-дегидрогеназа............................................................................................23

1.3.6 £-кристаллин\алкоголъдегидрогеназа.....................................................24

1.4 КРИСТАЛЛИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.................................................25

1.5 Экспрессия кристаллиновых генов..............................................................26

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................34

2.1 Объект исследования....................................................................................34

2.2 Выделение тотальной РНК..........................................................................34

2.2.1 Выделение тотальной РНК горячим фенолъным методом с использованием гуанидинизотиоцианата.........................................................34

2.3 Получение ро1у(А)+-РНК.............................................................................35

2.4 Получение кДНК банка...............................................................................35

2.4.1 Синтез первой цепи кДНК.....................................................................35

2.4.2 Синтез второй цепи кДНК....................................................................36

2.4.3 Клонирование кДНК...............................................................................37

2.5 Выделение хромосомной ДНК из семеников лягушки..............................37

2.6 Получение библиотеки геномной ДНК Rana temporaria...........................37

2.6.1 Приготовление хромосомной ДНК для клонирования...........................37

2.6.2 Приготовление векторной ДНК...........................................................38

2.6.3 Лигирование............................................................................................38

2.6.4 Получение экстрактов для in vitro упаковки.........................................39

2.6.5 Упаковка in vitro...............................................................'......................40

2.6.6 Амплификация библиотеки....................................................................40

2.6.7 Выделение рекомбжантной фаговой ДНК из фаговых бляшек.........41

2.7 Выделение плазмидной ДНК.......................................................................42

2.8 Трансформация клеток Е. cotí......................................................................43

2.9 Рестрикция ДНК...........................................................................................44

2.10 Электрофорез ДНК в ПААГ и агарозных гелях.....................................45

2.11 Элюция ДНК из ПААГ............................................................................45

2.12 Элюция ДНК из агарозного геля.............................................................46

2.13 Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы..................................................46

2.14 Мечение препаратов ДНК..................................................'......................47

2.14.1 Ник-трансляция препаратов ДНК........................................................47

2.14.2 Мечение фрагментов ДНК методом полимеразного копирования с использованием мулътипраймеров....................................................................47

2.15 Дот- гибридизация РНК...........................................................................47

2.16 Блот- гибридизация..................................................................................48

2.17 Перенос клеточных колоний и фаговых бляшек с чашек Петри на нитроцеллюлозные фильтры.........................................................'......................49

2.18 Определение нуклеотидной последовательности ДНК..........................49

2.18.1 Метод полимеразного копирования с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и ддНТФ в качестве терминирующих аналогов (Sanger, 1977)....................................................................................................49

2.19 Определение первичной структуры ДНК методом терминации цепей с использованием фермента "sequenase"...............................................................50

2.19.1 Секвенирующие (структурные) полиакриламидные гели.....................51

2.20 Компьютерный анализ первичных структур..........................................51

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................................52

3.1 Введение........................................................................................................52

3.2 ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ р-КРИСТАЛЛИНА......54

3.3 Получение полноразмерной кДНК р-кристаллина хрусталика глаза лягушки Rana temporaria......................................................................................57

3.3.1 Получение и скрининг библиотеки кДНК из хрусталика глаза лягушки Rana temporaria.................................................................................................58

3.4 Получение и скрининг геномного банка травяной лягушки Rana temporaria..............................................................................................................64

3.4.1 Получение банка хромосомной ДНК лягушки R. temporaria................64

3.4.2 Скрининг геномного банка. :...................................................................65

3.5 Анализ клонов и построение рестрикционных карт..................................66

3.6 Экзон-Интронная структура ДНК геномных клонов................................76

3.7 Идентификация промоторного участка гена р-кристаллина лягушки Rana temporaria........................................ .............................................................80

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................84

5 ВЫВОДЫ.........................................................................................................93

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................94

ВВЕДЕНИЕ

Изучение структуры и функции генов, а так же механизмов их дифференциальной экспрессии в различных органах и. тканях в ходе развития организма представляет одну из центральных проблем биологии, находящуюся на стыке генетики, молекулярной биологии и биологии развития.

В настоящее время акцент в этой области делается на выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки и органогенеза.

Одной из классических моделей является процесс формирования биологической линзы или хрусталика глаза позвоночных и беспозвоночных. Это объясняется ограниченным набором кристаллинов, белков формирующих хрусталик, а соответственно и генов их кодирующих. Сами кристаллины -удобный объект для изучения таких вопросов как дифференцировка, трансдифференцировка, эмбриональная индукция, регенерация, старение и молекулярная эволюция (Mitashov et al.,1990?; Grainger et al.,1992; Wistow et al., 1988). Последние годы гены кристаллинов активно используются в качестве модели для изучения молекулярных механизмов регуляции тканеспецифической экспрессии (Cvekl et al.,1994, 1995; Goring et al., 1993).

Настоящая диссертационная работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории молекулярной генетики Института биологии развития им Н.К. Кольцова и посвященных изучению генов, кодирующих кристаллины позвоночных и беспозвоночных животных. Одним из наиболее выдающихся достижений является установление того, что позвоночные и беспозвоночные в ходе эволюции использовали сходную стратегию формирования глаза. Рекрутирование на роль кристаллинов предсуществующих белков, в основном ферментов и стресс-индуцируемых

белков. Это было показано на примере р-кристаллина лягушки Rana temporaria, имеющего эволюционное родство с альдо-кеторедуктазами, и S-кристаллинов кальмара, имеющих общее эволюционное происхождение с глютатион-S-трансферазами (Carper et al., 1987, Tomarev et al., 1992).

В настоящее время исследования генов, кодирующих кристаллины, ведутся на уровне изучения механизмов регуляции экспрессии этих генов: структурно-функциональные исследования регуляторных участков генов кристаллинов, изучение регуляторных генов, принимающих участие в формировании глаза, исследование механизмов взаимодействия их между собой и с генами, кодирующими кристаллины (Duncan et al., 1996; Sekido et al., 1994).

Целью настоящих исследований явилась структурно-функциональная характеристика гена р-кристаллина лягушки R.temporaria. Экспериментальной основой для решения поставленных задач явилась совокупность методов генной инженерии, включающая иммунохимическую технику, клонирование кДНК и геномной ДНК, рестрикционное картирование, молекулярную гибридизацию, определение нуклеотидной последовательности ДНК и другие методы.

Основными задачами настоящей работы явились:

1. Доказательство хрусталикоспецифической экспрессии гена р-кристаллина лягушки.

2. Выделение геномных клонов, содержащих фрагменты гена р-кристаллина и полная их структурная характеристика.

3. Доказательство многокопийности гена р-кристаллина.

4. Установление экзон-интронной структуры гена р-кристаллина.

5. Идентификация и структурная характеристика 5'-концевого участка исследуемого гена.

6. Сравнительный анализ с помощью банка данных промоторного участка р-кристаллина.

Полученные результаты и выводы выносятся на защиту.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 КРИСТАЛЛИНЫ: ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕДСУЩЕСТВУЮЩИХ БЕЖОВ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ НОВЫХ

ФУНКЦИЙ.

Хрусталик позвоночных, а также некоторых беспозвоночных, - это прозрачная, несосудистая, клеточная ткань, основной функцией которой является преломление (рефракция) света. Необходимые рефрационные свойства хрусталика достигаются агрегацией нескольких растворимых белков, которые обеспечивают "кристальность" (прозрачность) хрусталика и поэтому получили название кристаллинов (Bloemendal, 1981). У некоторых видов кристаллины составляют до 90% всех белков хрусталика.

Хрусталик растет в течение всей жизни животного, образуя новые слои клеток поверх старых (Piatigorsky, 1981). В процессе взросления дифференцированные клетки хрусталиковых волокон теряют ядро и другие органеллы, чем напоминают ранние стадии апоптоза (Gao et al., 1994). Таким образом, во взрослых клетках волокон практически не происходит обновления белков. Поскольку хрусталик должен служить в течении всей жизни животного, кристаллины должны поддерживаться в стабильном состоянии.

Следует отметить, что кристаллины, несмотря на свои специфические функции по поддержанию прозрачности хрусталика на протяжении всей жизни, не являются высоко специализированными структурными белками. Напротив, в основном это белки нехрусталикового происхождения, которые приобрели новые функции в хрусталике в результате генного рекрутирования и тканеспецифического усиления экспрессии (Wistow, 1993b).

Некоторые семейства кристаллинов, а-, Р- и у -кристаллины, так называемые канонические, - достаточно древние. По этому они широко представлены у многих видов позвоночных. Эти кристаллины произошли от стресс-индуцируемых белков. Некоторые из них, а именно а-кристаллины, являются членами небольшого семейства белков теплового шока (Klemenz et al., 1991b; de Jong et al., 1993) и обладают свойствами шаперонов (Horwitz, 1992), которые могут способствовать стабилизации и солюбилизации других белков. Суперсемейство р-/у-кристаллинов имеет эволюционное родство с белками спор некоторых бактерий и могут индуцироваться под воздействием стресса или осмотического шока (Ingolia, Craig, 1982).

Другие кристаллины возникли позднее в ходе формирования зрительных систем у различных видов (Wistow, 1993b). Эти, таксон-специфические кристаллины являются в основном ферментами, причем большинство из них кодируются единственным геном, который характеризуется суперэкспрессией в хрусталике, сохраняя при этом изначальные каталитические функции и низкий уровень экспрессии в других тканях. Благодаря этому обстоятельству в хрусталике некоторых видов содержится большое количество активных ферментов. Например, грубый водорастворимый экстракт хрусталика утки имеет одну четверть активности аргининсукцинатлиазы (ACJI/8-кристаллин) от

активности этого фермента, выделенного из человеческой печени (Piatigorsky et al., 1988), что значительно больше, чем активность многих продажных препаратов этого фермента.

Последние достижения молекулярной биологии кристаллинов привели к идентификации тканеспецифичных генных промоторов, обеспечивающих экспрессию соответствующих генов в хрусталике у различных видов (Piatigorsky and Zelenka, 1992). Этот обзор суммирует данные о природе и свойствах

канонических кристаллинов (стресс-индуцируемых белков) и тканеспецифических кристаллинов (ферментов).

1.2 КАНОНИЧЕСКИЕ КРИСТАЛЛИНЫ, ИХ РОДСТВО СО СТРЕСС-

ИНДУЦИРУЕМЫМИ БЕЛКАМИ.

1.2.1 а-кристаллины: стресс-индуцируемые белки и шапероны.

а-кристаллины в большом количестве присутствуют в хрусталике всех позвоночных животных (de Jong, 1993). Семейство генов а-кристаллинов состоит из двух родственных генов: а А и аВ. У разных видов а А-кристаллины могут составлять от 7% до 40% тотального белка хрусталика (Wistow, 1994). Будучи высокоспецифическими белками хрусталика, а-кристаллины, тем не менее экспрессируются и в других тканях. Так экспрессия а А обнаружена в селезенке и тимусе (Kato et al., 1991), а аВ - в сердце, мозге, почках и сетчатке (Dubin et al., 1989; Bhat and Nagineni, 1989). Структура генов а-кристаллинов млекопитающих и птиц высококонсервативна и состоит из трех экзонов (King and Piatigorsky, 1983; Quax-Jeuken et al., 1985a,b; Dubin et al., 1990; Thompson et al., 1987). Первый экзон кодирует 60 аминокислот и состоит из двух 30-аминокислотных мотивов. Второй и третий экзоны кодируют участок, гомологичный малым белкам теплового шока shsp - small heat shock protein (Ingolia and Craig, 1982; Wistow, 1985). Из литературы известно, что аВ-кристаллин может индуцироваться в культивируемых фибробластах мыши при осмотическом стрессе (Dasgupta et al., 1992), тепловом шоке (Klemenz et al., 1991b), ишемии (Chiesi et al., 1990) и под воздействием некоторых онкогенов (Klemenz et al., 1991a).

Функции семейства белков shsp еще до конца неясны. Как известно, члены других семейств белков теплового шока, например hsp, являются, так

называемыми, шаперонами и выполняют активную роль при формировании третичной и четвертичной структуры белков при их транспорте (Hartl et al., 1994). Наиболее распространенные из них, HSP70, являются АТФазами, структурно близкими актину (Flaherty et al., 1991).

Недавние исследования показали, что а-кристаллин также может функционировать как молекулярный шаперон, защищая другие кристаллины и ферменты от тепловой денатурации (Horwitz, 1995). Существуют данные, которые позволяют предположить, что shsp белки деполимеризуются с актином, и а-кристаллины могут участвовать в формировании и разрушении цитоскелета в клетках хрусталика и других тканей (Miron et al., 1991; Nicholl and Quinlan, 1994).

а-кристаллины претерпевают ряд пост-трансляционных модификаций, включая сАМФ-зависимое фосфорилирование (Voorter et al., 1986, 1989; Chiesa et al., 1987a,b), автофосфорилирование (Kantorow and Piatigorsky, 1994) и цитоплазматическое гликозилирование (Roquemore et al., 1992), которые могут влиять на их способность к агрегации и другие свойства. Четвертичная структура а-кристаллинов продолжает дискутироваться (de Jong et al., 1993). Считается, что будучи шаперонами, а-кристаллины и другие белки shsp семейства могут демонстрировать несколько типов агрегации и динамично их менять (Wistow, 1993с).

1.2.2 ¡3-й у-кристаллины: белки осмотического шока.

Помимо а-кристаллинов к каноническим относят также суперсемейство Р-у-кристаллинов (Driessen et al, 1980; Wistow et al., 1981). У позвоночных встречаются 6-7 основных полипептидов p-кристаллинов (Ostrer and Piatigorsky, 1980; de Jong, 1981; Berbers et al., 1984; Wistow and Piatigorsky, 1988). Они

образуют димеры и более высоко организованные агрегаты смешанного состава (Harding and Crabbe, 1984).

Большинство видов позвоночных имеют такое же количество у-кристаллинов, которые, в противоположность p-кристаллинам, строго мономерны (Harding and Crabbe, 1984). Наиболее изучены у-кристаллины млекопитающих, которые преимущественно экспрессируются в раннем развитии и поэтому преобладают в центральной области, ядре хрусталика, состоящей из клеток эмбрионального происхождения (Wistow et al., 1994). Эта группа у-кристаллинов практически отсутствует у птиц (Treton et al., 1984). Однако, хрусталик птиц содержит мажорный белок yS-кристаллин, наиболее далекий по структуре от остальных у-кристаллинов, который экспрессируется у млекопитающих только в позднем развитии в кортикальных областях хрусталика (Harding and Crabbe, 1984; Quax-Jeuken et al., 1985; van Rens et al., 1991).

Четвертичная структура p- и у-кристаллинов хорошо изучена благодаря рентгено-кристаллографическим исследованиям (Blundell et al., 1981; Wistow et al., Summers et al., 1984; Bax et al., 1990). Эти белки имеют абсолютно симметричную структуру и состоят из двух доменов, каждый из которых, в свою очередь, содержит двойной повтор четырех характерных мотивов, так называемых "греческих ключей" (Hogg et al., 1986; Peterson and Piatigorsky, 1986). "Греческий ключ" - чрезвычайно стабильная структура, составленная из Р-слоистых структур, скрученных в конфигурацию, напоминающую традиционный узор, украшающий античную греческую посуду (Blundell et al., 1981). Каждый из данных мотивов (состоящий из 100-150 п.н.) код