Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная характеристика клонированных генов (кДНЮ, кодирующих бета-кристаллины лягушки)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная характеристика клонированных генов (кДНЮ, кодирующих бета-кристаллины лягушки)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К К^ЛЛЮВА

На правах рукописи

ЛУЧИН Сергей Викторович

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ. (кДНК), ЩЦИРУВДКХ ^-КРИСТАЛЛИШ М'УШКИ

ОЗ. 00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа тлюлнена в Институте биологии развития им. Е К. Кольцова Российской АН.

Научный руководитель:

локтор биологических наук Г. Г. Гауве

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. Т. Михайлов

кандидат химических наук В. Е Носиков

Ведущэе учреждение:

Институт молекулярной биологии им. Е А. Энгельгардта Российской да

Зашита состоится "¿о'' ЗкУарз 1993 года в, час. на заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте биологии развития им. Е К. Кольцова Российской АН по адресу: иэсква, ул. Вавилова, 26, конференц-зал.

Автореферат разослан _199 '

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е. М. Протопо!

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Хрусталик глаза позвоночных животных содержит набор структурных белков, носящих название кристалликов. На основании различий в их структуре и свойствах их разделяют на три основные класса: ot-, fi- и ¿'-кристаллииы. Специфической укладкой этих белков в надмолекулярные структуры обеспечивается прозрачность хрусталика, его высокий показатель преломления, способность к аккомодации. Нарушения в ансамбле кристаллиновых белков могут приводить к помутнению хрусталика, что вызывает образование катаракт и потерю зрения. Неудивительно, что кристаллины являются-объектом интенсивных исследований на протяжении почти ста лет.

Новый этап в исследовании кристалликов возник в связи с возможностью клонировать кодирующие их гены. Клонирование генов открывает перспективы изучения первичной структуры ДНК, а тем самым и аминокислотной последовательности самих кристаллинов. Появляются возможности изучать регуляцию активности генов, кодирующих кристаллины в ходе диффереицировки хрусталика, открываются возможности эволюционных исследований, которые прольют свет на взаимоотношения мэдду различными классами кристаллинов и позволят ответить на вопрос, какие белки являются их предшественниками в эволюции. Кроме того, на основании структурных данных возможно построение моделей трехмерной укладки кристаллинов и их взаимодействия между собой в хрусталике.

Все это делает выделение кристаллиновых генов и изучение их структуры весьма актуальной задачей генетики и биологии развития.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выделению и характеристике клонированных кДНК-генов, кодирующих полипептиды ^-кристаллинов хрусталика глаза травяной лягушки Rana temporaria. Конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

- из клонотеки кДНК, содержащих последовательности мРНК хрусталика лягушки, выделить рекомбинантные клоны, кодирующие ^-кристаллины;

- определить первичную структуру рекомбинантных клонов pRt(1) 1053 и pRt(l) 1003, кодирующих jSAl-кристаллин;

- установить первичную структуру клона pRt(l) 1473, кодирующего ^В2-кристаллин и содержащего вставку кДНК наибольшей длины;

- построить модель трехмерной структуры ^Al-кристаллина методами компьютерной графики на основании данных о его аминокис-

лотной последовательности;

- оценить темпы молекулярной эволюции ^-кристалликов.

Научная новизна и практическая значимость работа Впервые в мировой литературе в данной работе описано выделение и идентификация рекомбинантных клонов кДНК, кодирующих je-кристаллины низшего позвоночного (травяная лягушка Rana temporaria).

Установлена первичная структура клонированных кДНК, кодирующих jjAl- и j}B2-кристаллины лягушки. Получены доказательства дупликаций в ходе формирования индивидуальных генов ^-кристалликов. Впервые проведена оценка темпа молекулярной эволюции полипептидов ji- кристалликов.

Построена модель трехмерной структуры jAl-кристаллина Показано, что трехмерная структура этого белка сходна с трехмерной структурой соответствующих полипептидов млекопитающих и птиц. Установлен факт высокой консервативности аминокислотных остатков поверхности молекулыjsAl-кристаллина Высказано предположение, что j6Al-кристаллины участвуют в образовании агрегатов нативных _д-кри-сталлинов.

Полученные нами результаты используются в ряде лабораторий Института белка РАН, Института биологии развития им. Я К. Кольцова РАН, Института общей генетики РАН.

Публикации и апробация результатов. Основные научные результаты представляемой работы опубликованы в 15 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на VI симпозиуме СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот"(Цхалтубо, 1982), Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Пущино, 1982), V Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983), VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Цущино, 1984), XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 78 стр. машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов исследования и изложение полученных результатов с их обсуждением, выводов. Список цитированной литературы включает 86 работ отечественных и иностранных авторов.

- з-~

ЫАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рекокбкнантные клоны, кодирующие _£-кристаллинн, выделяли из полученной ранее в лаборатории клонотеки рекомбинантных ДНК, соде-рдацэй нуклеотидные последовательности мРНК хрусталика глаза лягушки R. teirporaria (Козлов и др., 1980; Tomarev et al. , 1982).

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу Бирнбойма и Доли (Blrnboim. Doly, 1979). Для дальнейшей очистки плазмидной ДНК использовали равновесное центрифугирование в градиенте плотности CsCl, содеряадрм бромистый этидий (Radloff et al. , 1967).

Трансформацию клеток Е. col i плазмидныыи ДНК проводили по стандартной схеме с неболызмн модификациями (Mande1, Higa, 1970).

Рестрикционный анализ ДНК проводили в условиях, рекомендуемых производителями рестриктаз. Разделение рестрикционных фрагментов ДНК проводили в агарозных и полиакриламидных гелях как описано в литературе (Sharp et al. , 1973; Maniatis et al. , 1975).

Гибрид-селектированную трансляцию препаратов РНК проводили in vitro в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика (Ricciar-di ot al. , 1979). Иммулопреципитацию продуктов трансляции проводили по Шике и др. (Schimko et al., 1981).

Гибрндизационные метода Блот-гибридизацию разделенных путем электрофореза препаратов РНК проводили, как описано Томас (Thomas, 1980). Гибридизацию колоний проводили, как описано (Maniatis et al., 1982).

Определение первичной структуры ДНК проводили по модифицированному методу Максама-Гилберта (Maxam and Gilbert, 1977; 1980). Разделение продуктов реакций специфической химической модификации проводили в полиакриламидных структурных гелях различной концентрации (20Z, 8Z, 67., 4%) и длины (обычно 40 см и 60 см).

Компьютерный анализ последовательностей проводили согласно опубликованным алгоритмам (M3izel and Lenk, 1981). ГЬиск гомологичных последовательностей проводили, используя стандартные программы (Wilbur and Lipman, 1983).

Построение модели трехмерной структуры_дА1-кристаллина проводили методом компьютерной графики, используя программу FR0D0 '(Ja--nés, 1978), модифицированную для Evans and Sutherland Picture -•iTvc.--tem). В качестве основы для построения модели трехмерной структур«1. ^А1-кристаллина лягушки были взяты координаты /11-кристаллина быка, установленные с помощью рентгеноструктурного анализа таги?разрешении 1,6 X (Summers et al. , 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение рекомбинантных кДНК-кдонов, кодирующих jS-кристал-лины, и их характеристика путем гибрид-селектированиой трансляции.

Из описанной ранее коллекции клонированных кДНК (Козлов и др. 1980; Tomarov et al., 1082) выделяли плаз (ладную ДНК и фракциониро-i .'uir ее электрофорезом в агарозном геле. Фракцию с размерами более Г;000 пар нуклеотидов (длина вектора pBR 322 составляет 4362 нукле-отида) использовали для трансформации Escherichia coli HB 101. 11лн ададные ДИК из 49 незавнсишх трансформантов были охарактеризовал!; гель-злектрофорезом и расщеплением рестрикционными андонуклеазами. 4 клона этой группы (pRt(l) 1003, pRt(l) 1053, pRt(l) 1054 и pRt(l) 1074 имеют сходныз рестрикционные карты; длины кДНК-вставок составляют от 740 до 820 нуклзотидных пар.

Для характеристика! полипептидов, кодируемых вддедэнныьги клонами, проводили опиты по гкбрид-селектированной трансляции (Pelham and Jackson, 1976). Тотальную поди(А)+РНК хрусталшса глаза лягушки гибридизовали с иммобилизованными на шггроцэдляЕозных фильтрах ДНК клонов pRt(l) 1003 н pRt(l) 1053, вошодсую в состав гибрида мРНК элшровали и транслировали в система из ретикулоцитов кролика с 3Н-лейцином. Меченые полипептиды фракционировали в полиакриламид-ном геле. Полученная флуорограша геля представлена на рис. 1. мРНК, гибридизующаяся с ДНК клонов pRt(l) 1003 н pRt(l) 1053, направляет в бесклеточной система синтез одного основного, с каяущэ-йся молекулярной кассой 25 кД, и трех юшорных компонентов с каку-нщмися молекулярными массами 26, .24 и 22, Б кД. Представляется наиболее вероятным, что эта гетерогенность обусловлена гибридизацией с ДНК кавдого из данных клонов не одной, а нестольких обладахкцих взаимной гомологией, но неидентичных мРНК.

По критерию молекулярной массы, а также по результатам нмму-нопреципитации со специфической антисывороткой (tie приведено), 25 кД полипептид хрусталика глаза лягушки принадлежит к кристалликам. Это дало нам основания предположить, что выделенные реком-бинантные глони содержат последовательности, кодирующие один из J5-кристаллинов хрусталика глаза лягупки. Для проверю! этого предположения мы провели стру1сгурные исследования кДНК-вставок отобранных клонов.

кОа 92.5 69

46 30

а.

(Г—1 '4 ' -'Ч_

14.3

12 3 4 5

Рнс. 1. Флуорограют 12.57. ПАЛТ-ДЛС-Иа после разделении продуктов трансляции, направляемой тотальной поли(А)*РНК из хрусталика глаза лягушки (2) н мРНК, комплементарными ДНК клонов рЩ1) 1003, рЯЦ1) 1053 и р(?Ц1) 473 (3. 4 и 5 соответственно); 1 -стандарты молекулярной классы.

Структурная характеристика клонов рЩ1) 1053 и рЩ1) 1003. кодирующих^!-кристаллин, иклонарЩ!) 1473, кодирующего _рВ2-кристаллин.

Для точной идентификации кодирующего потенциала клонов рЩ1) 1053 и р(?Ц1) 1003 мы определили нуклеотидную последовательность их кДНК-вставок. Полученная нуклеотидная последовательность приведена на рис. 2. Компьютерная трансляция последовательности обнаружила присутствие одной протяженной рамки считывания длиной 609 ну-клеотидов. Вычисленная молекулярная масса производной аминокислот-1;ол последовательности составляет 23,2 кД.

- 6 -1 . .

АТСЮСГСПТ^\АЛАТООООСДСДта

MetAlaGlnIleAsnProIeuPrбVal 1

. . 100

Гго1£иС1уРггЯ^рЬуз11е'1Т^а1ТугАБра1гй1^^ 10

ТХСЛОЛХХЛХХГГСТКХУААСА^ - .

РЬеТ^гБегБегСувЛ1аАзп11еМг1Х31иСу8С1уРЬеАзрАзп11еАгчЗегЬеиЬу8Уг>1 31

200 . . . • .

(^ОТЖСАаГАТООТГОСАТ^^

Г,1иСуБС1уС1уТгр11сС1уТугС1иН1БТТи^егРЬеСу

52 •

АгчС1уС1иТугРгсАгчТп^рМаТгт>3^^

73 . -

300 . . .

лтсжлтгсссахААтстеттста^

^15егРЬсАг*зРгоХ1еС^з5егА1аАЕпН18ЬуБС1иЗег^уа1£и7а111еРЬеС1иЬу8

94----------------

400

сАСААптсАтгссасостзтахмАтсл^^

С1иЛзпРЪе11еС1уАгдС1пТгрС1и№1СузАгрА5рДугРгоЗег1>еиС1пА1а№г1С1у 115-------------------

Тгр7а1АггЛзгй1и7а1С1уЗе1^ЬЬузУа1С1п^

136--------:-

500 . . . .

СССССТГЛТССТСОТ/ССАСТАСАТО^^

РгоС!1уТугАгдС1уТугС1гПуг11е1£иС1иЗехАзрН15Ш.ЕС1уС1уС11ЛугЬуаН1з

157------------------'

. 600

ТгрЛгдС1иТгрС1уЗегН1ЕМаС1п1Ьг^^

178------------------г

ТЛАЛЛС0ССЛАСДаЭСТССТС1^^

БЬзо-------------

700 . . ' . .

ССГПХЛетССГОСТАа^ТТСПХ^^

ТССХКЖААТССЛТСТгаХ^и^^

Рис. 2. Нукдеотидная последовательность "цепи кДНК, кодирующей ^А1-кристаллин лягушки, и ПАП. Нукдеотидная последовательность в положениях 1-743 представлена в кДНК клона р!?Щ) 1053, нукдеотидная последовательность в положениях 283-648 и 732-794 (подчеркнуты на рисунке) установлена на основании секвенирования кДНК клона р1?Ц1) 1003. Нукдеотидная последовательность пронумерована сверху строк, аминокислотная - снизу.

«

Сопоставление этой аминокислотной последовательности с различными J -кристаллинами выявило 84-88Х-ную гомологию с jiAl-кристалликом человека (Ноте et al., 1986), ыыши (Inana et al., 1982) быка (Quax-Jeuken et al.. 1984) и цыпленка (Peterson and Piatlgo-rsky, 1986). Более того, все пять полипептидов колинеарны друг другу. Гомология с jsBl-кристаллином крысы, быка и цыпленка, jBZ-кристаллином быка, ^ВЗ-кристаллином крысы не превышает 45-507. и требует введения в анализируемые последовательности разрывов. Гомология с различными ^кристаллинами еще более низка. На основании этих данных был сделан вывод, что кДНК клонов pRt(l) 1053 и pRt(l.) 1003 кодируют jeAl-кристаллин хрусталика глаза лягушки.

В опытах по гибрид-селектированной трансляции рекомбинантный клон pRt(l) 473 был идентифицирован нами !сак клон, кодирующий 24 кД полипептид ^в-кристаллина лягушки (Рис. 1). Поскольку длина кДНК-вставки клона pRt(l) 473 ( 320 п.о.) представлялась недостаточной для получения информации о структуре кодируемого ею ^з-крис-таллииа, мы провели скрининг банка pRt(l), используя С32 Р]-меченую ¡сДНК клопа pRt( 1) 473 в качестве зонда. В результате экспериментов по гнбридгаации колоний был отобран клон pRt(l) 1473 с длиной кДНК-встаикл около 560 иуклеотидов. Построение карт расщепления кДНК изучаемых клонов показало, что струютуры кДНК-вставок клонгт pRt(l) 473 и pRt(l) 1473 являются сходни.« (Рис. 3).

pRl It) 473

p»ii

I

Hindra P»Ii.

(41

pRIII)U73

Sof3* Sog ЗА Sou 3* Sou ЗА

05fRI I P»" Но« Д| (ЧП| j Hind BW I B»pRI

pBfl 322

i_1 100 bp

Рис. 3. Рестрикционныэ карты кДНК-вставок рекомбинантных клонов рЩ1) 473 и рЩ 1) 1473, кодирующих ^К-'кристал-лин лягушки. Стратегия секвенирования показана горизонтальными стрелками. Направление трансляции показано.стрелкой внизу рисунка.

На рисунке 4 представлена нуклеотидная последовательность кодируют й цепи кДНК-вставки клона pRt(l) 1473, а также проиаводная аминокислотная последовательность. Производная аминокислотная последовательность проявляет 86Х-ную гомологию с последовательностью _^зВ2-кристаллина быка и колинеарна ему, начиная с положения 86, в то время как гомология с последовательностями других полипептидов ji-кристалликов не превышает 50Х. Был сделан вывод, что кДНК-встав-ка клона pRt(l) 1473 кодирует ^вг-кристаллин хрусталика глаза лягушки.

В кДНК и полипептидах ^з-кристаллинов лягушки выявляются области внутренней гомологии, соответствующие единицам укладки или мотивам белковых молекул. В частности, в нуклеотидных последовательностях кДНК клонов pRt(l) 1053 и pRt(l) 1003 бОХ-ной взаимной гомологией обладают участки, соответствующие позициям 151-230 и 436-515 (рис. 2). На основании этих и имеющихся в литературе данных (Berbers et al., 1984; Den Dunnen et al., 1985; Hejtmancik et al., 1086) можно сделать вывод, что гены кристалликов возникли в процессе эволюции в результате двух тандемных дупликаций ыинигена-предшественника, кодировавшего один мотив белковой молекула

Гомология нуклеотидных последовательностей кДНК клонов pRt(1) 1053 и pRt(l) 1473 в кодирующей области превышает 502. На основании этих данных можно полагать, что у лягушки, как и у других позвоночных, гены ^-кристалликов образуют семейство, сформировавшееся р результате дупликаций генов-предшествелников и их последующей дивергентной эволюции. Предположительно, семейство генов ^-крист-аллинов эволюционно "старое" по сравнению с семействами генов других классов кристаллинов. Нормирование семейства генов кристалликов, вероятно, завершилось до иррадиации позвоночных, следствием чего является наличке ортологичных полипептидов jB-кристаллинов у всех изученных позвоночных,, включая лягушку.

Анализ модели трехмерной структуры молекулы ^¿А1-кристаллина

Наличие аминокислотной последовательности ^А1-кристаллина позволило нам построить модель его трехмерной структуры используя метод компьютерной графики. В качестве основы для построения модели были взяты координаты /П-кристаллина быка, установленные с помощью рентгенострукгурного анализа при разрешении 1,6 К (Summers . et al., 1984). Выравнивание аминокислотных последовательностей

- и -

ТААСАССССАААСАСССАСАССАТСТССТССТТСАСАСС^ЛТСАААСТССАТАСТСАССАА АзпБегА'гвХ.убЗегАзрЗегИеБегЗегХ.еиАгвРгоПеЪузУа^зрБегСШИи 66

100 ' .

САТААСАТТСТССТТТАТСААААСССАААСТТТАСССССААСЛАСАТАСАААТААТТСАТ ШвЬувНеУаНлиТугСХиАвпРгоАбпРЬеТЬгСХуЬузЬувИеСЫПеНеАвр 106

САТСАТСТАССААСТТТССАТССТСАССССТАТСАССАААААСТАТСТТСАСТСАААСТА А5рА8рУа1Рго5егРЬсН18А1аН18С1уТугС1пС1иЬузУа1$ег5егУа1ЬувУа1 126

200 ...

САААСТССААССТСОСТТСССТАТСААТАСССАССТТАСАСАССАТЛССАСТАССТСТТТ С1п5егС1уТЬгТгр\?а1С1уТугС1пТугРгоС1уТугА^С1уТугС1пТуг1.еиРЬе 1А6

300

САСМСССССАТТАТМССЛСАССТСАСЛТАСТТСССССССЛССАССССАСАТССАСТСТ С1иЬувС1уАарТугЬузАзрЗег5егА5рТЬгТгрАгЕРгоА1аРгоС1л11сС1п5ег 166

СТСАСССССАТТССТСАТАТССАСТСССАССЛСАССССААССТТССАСССТАССААСТААА. Уа1Аг§Аг5Х1ЕАгЕАврМесС1пТгрН1ЕС1пАгЕС1уП1гРЬеН15РгоТЬгАзп51ор 186

400

АСАААСАСТТССТСТГГСТСТТСТСССАСТССАСАСАААСАТСТТСАААСССТТАТАССТ

САТСТССТССТСТТТТТССТСССССАТССТТАТСССССАТСССАСТСТСТСАСТАААССТ

500 . .

ССТСААССААСТТААТААААССТТТСАСТТТААААСТСААААААААААААААААА

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность цепи кДНК клона рКЦ1) 1473, кодирующей ^В2-кристаллин лягупси, и ПАП. Нуклеотидная последовательность пропукэ-рована вверху строк, аминокислотная - внизу. Первая аминокислота соответствует пологэнию 86 в ^Б2-кристаллине быка (Опеэзеп оЪ а1., 1980, 1981).

- 10 -

друг относительно друга приведено на рис. б.

Хотя ^А1-кристаллин лягушки проявляет только 38%-ную гомологию с /П-кристаллином быка, их трехмерные структуры, согласно данным моделирования, в основном сходны. Как и ^кристаллины, кристаллин состоит из двух сходным образом организованных .доменов.

•I)

1 пс»

1 И СИ

Г Т 6 I т п

-гм ми

м«1ТУтос(*госк«и;гт}

/ы »

»

)>• 13

цщссго

VI • И VI I к VI * I

А* с Г «»10 Н< г С • 1 • 0 1

♦0 V» м те • » < # 1» •и

лтуао вси|С1<11Т1Г(ооог«1Н

* 1

А« А V

* 1 N г

* V е 1 У

Л* - 1» С >1 ь »»■40 я и * 0 В Т Э 0 и - • - - Г « 6 » 1 1 С к » о ■ т с • *

М м (М 119 11*4

мум

т

«пум /и

• II* д

»

/А! А А

ь «Й • я I «

о о

« а

» V » с

I »

I 9 » к С

1>4 к"*»«*

1>кс «1«

П«« к

9 10*

■ 010«

Рис. 5. Выравнивание последовательностей _/А1-кристаллинов

относительно последовательности 1-кристаллина быка. Гомологичные области, соответствующие мотивам белковой молекулы, помещены друг под другом. Аминокислотная последовательность ^А1-кристаллина лягушки приведена полностью. Для остальных последовательностей показаны только отличающиеся аминокислотные остатки. Нумерация аминокислотных остатков ^А1-кристаллина лягушки проведена согласно нумерации рентгеноструктур-ных координат 1-кристаллина быка (У^ок е1 а1., 1383).

каждый из которых в свою очередь состоит из двух пространственно и структурно сходных компактных мотивов (рис. 6). Такое сходство трехмерных структур достигается за счет сохранения определенных критически важных аминокислотных остатков, существенных для правильного сворачивания каждого из мотивов. Два остатка абсолютно консервативны во всех четырех мотивах: Gly-13 (52, 100, 141) и Ser-34 (77, 123, 166). Эти аминокислотные остатки вовлечены в стабилизацию трехмерной структуры белковой молекулы. Другие, консервативно вариабельные остатки, также помогают стабилизировать пространственную структуру^Al-кристаллина. Междоменный контакт обеспечивается взаимодействием шести гидрофобных аминокислотных остатков (43, 56, 81, 132, 145 и 170) и двух ионных пар (Glu-58 - Arg-168 и Arg-79 -Glu-147).

В отличие от /-кристаллинов, ^А1-кристаллин обладает выступающей за пределы компактной укладки N-концевой последовательностью длиной 13 аминокислотных остатков. В ^А1-кристаллине выступающий N-конец может формировать полипролиновую спираль.

Рис. 6. Стереопара модели трехмерной структуры jjAl-кристал-

лина лягушки.

Поскольку _£-кристаллины формируют агрегаты, это дает возможность предположить наличие участков агрегации на поверхности молекулы аА1-кристаллина. Одним из таких возможных участков может

служить гидрофобная площадка, образуемая остатками аминокислот Leu -3, Pro -1, Тгр 1, Pro 80 и Cys 82. Другой предположительный участок агрегации молекул jsAl-кристаллина образуется остатками Тгр 103, Mat 115, Тгр 117 и, вероятно, Тгр 154 и Phe 162.

Сравнительный анализ ^-кристадлинов

Сравнение аминокислотных замен в молекулах _/А1-кристаллинов лягушки, цыпленка и ряда млекопитающих позволило нам провести оценку темпа молекулярной эволюции этого полипептида. Считая, что дивергенция предков млекопитающих и амфибий произошла 350 миллионов лет тому назад (Dayhoff, 1972), темп эволюции jgAl-кристалли-на в области компактной укладки молекулы составляет 3,8 аминокислотных замены на 100 аминокислотных остатка за 100 миллионов лет. При сопоставлении аминокислотных последовательностей ^В2-кристал-лина лягушки и ^В2-кристаллина быка (Driessen et al., 1981) также обнаруживается их высокая консервативность: только 4,1 аминокислотных остатка из 100 изменяются 8а 100 миллионов лет. В то хз время для jBl-кристаллина (сравнивались^В1-кристаллины цыпленка (Höjtmancik et al. ,1986), крысы (Den Dünnen et al., 1985) и быка (Quax-Jeuken et al., 1984)) эта величина составляет 9 аминокислотных замен на 100 остатков за 100 миллионов лет. Возможно, что jAl-кристаллин - это один из наиболее медленно' изменяющихся полипептидов ^-кристалликов.

Наличие модели трехмерной структуры позволяет провести анализ темпа накопления аминокислотных замен в различных функциональных областях молекулы ^Al-кристаллина. Наиболее вариабельными (взаимная гомология 61-92Z) являются 13 аминокислотных остатков N-концевой последовательности пяти ортологичных jkl-кристалликов (Таблица 1). Для 54 остатков, скрытых в гидрофобном "ядре" молекулы гомология выше (81-96Х), а для 131 остатка, находящихся на поверхности белковой молекулы и доступных для растворителя, еще выше (87-97Х). Обычно в эволюционно родственных глобулярных белках остатки, локализованные на поверхности, менее консервативны, чем остатки, скрытые внутри молекулы (Chothia and Lesk, 1986). Консервативность поверхностных остатков в jjAl-кристаллинах (рис. 7) может быть обусловлена тем, что эти остатки принимают участие в межмолекулярных взаимодействиях и поэтому находятся под сильным селективным давлением, препятствующим их изменениям в эволюции. Весьма возможно, что молекулы jsÄl-кристаллина находятся вну-

ЮТСТШИ!

ОСТАШ

Бык

I"

Лягушхд JAI

Бик JAI

JAI

Чехоьек )М

fkl

Бик J" В iooi зв* 37* 38* 37* зв;

Ллгуска >А1 В 100* 88* 89* (И* во*

Сих >А1 , В IOCS 975 щ; eo*

taisb >А1 В 100* 93* mi

Человек Mi В 100* 85*

Цыпленок }К1 D ioci

Бык Я юо* 5',*

Лягуижа Я1 Я ioo;

Бик /А I Я

>A1 я

Челоьек /А I я

Цыпленок i" я

52* 50* 52* 48*

ш* ei* 81* Bit

iou* %* 942 ea*

ioui 94i 87*

IOO* 85*

100л

Бик i" 11

•Глгуит ;ai П

Бик jki n

Миэь jpa i П

Человек ^ai П

UullifcHOK )ai П

IOO*

31* 31* 29* 33*

ice,: 94* 92* 87* 91*

IOU* 97* 92* 90*

10«. 92* IOO* 91* Ь7* IOC*

JldTyi'KO fkl

Бик >AI

Мила /А1

Челоьск /А1

ЦшМенсг. /А1

la*

61* IOO*

69* 69* 85*

92* 85* 69*

100* 92*' 69*

100* 69*

IOO*

Таблица 1. Гомология различных функциональных областей молекул ^Al-кристаллинов различных видов и /П-кри-сталлина быка. Обозначения: В - гомология между полными последовательностями, за исключением де-леций и вставок (см. рис. 5); Я - гомология между 54 остатками, скрытыми в "ядре" молекулы; П -гомология между 118 (/1I-) и 131 (/А1-) остатками, находящимися на поверхности молекулы; К - гомология между 13 N-концевыми остатками.

три нативного агрегата ^-кристаллика, и большая часть поверхности _^А1-кристаллина существенна для межмолекулярных взаимодействий с другими полипептидами _д-кристаллинов.

Рис. 7. Внешний вид поверхности модели jjAl-кристаллина лягушки. Вариабельные аминокислотные остатки jsAl-кри-сталлинов лягушки, быка и мыши показаны белым цветом, консервативные - серым.

ВЫВОДЫ

1. Из полученной ранее в лаборатории коллекции клонированных кДНК, содержащих нуклеотидные последовательности поли(А)+РИК хрусталика глаза лягушки Rana temporaria, выделены клоны, кодирующие jflAl-кристаллин и ^Вй-кристаллин.

2. Определена нуклеотидная последовательность кДНК рекомби-нантных клонов pRt(l) 1053 и pRt(l) 1003. В данных клонах предста влена информация о первичной структуре ^Ш-кристаллина лягушки, начиная с аминокислоты 1 и заканчивая аминокислотой 198.

3. В кДНК для ^А1-кристаллина выявлены области внутренней гомологии, что подтверждает представления о возникновении генов

кристаллитов в результате последовательных дупликаций гена-предшественника.

4. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК клона р№(1) 1473, кодирующего ^В2-кристаллин лягушки. В структура тона содержится информация об аминокислотной последовательности

^В2-крисгаялина, начиная с аминокислоты 86 и заканчивая аминокислотой 204.

5. ПроЕедена оценка теша молекулярной эволюции аминокислотных последовательностей ¿А1- и ¿В2-кристаллинов. Средний темп молекулярной эболюции для С-концевого доиена ^В2-крксталлина составляет 4,1 замены на 100 ашшокислотных остатков за 100 миллионов лет. Для области компактной укладки молекулы ^А1-кристаллина темп молекулярной эволющм составляет 3.8Х замен аминокислотных остатков за 100 миллионов лет.

6. С помощью методов компьютерной графики построена модель трехмерной структуры молекулы _/А1-кристаллипа.. Анализ модели выявил высокую степень консервативности шяшокислотных остатков, распологэшшх на поверхности молекул ^А1-кристадягков шф'бий, млекопитающих и птиц.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Лучин С. Е , Томарев С. И., Долгилевич С. !i , Краев А. С. , Скрябин К. Г., Гаузе Г. Г. Выделение и структура клона рекомбинант-ной кДНК, кодирующей крнсталлин хрусталика глаза лягушки Rana teirporaria. - Доклады АН СССР, 279, HI, 1984,' стр. 233-237.

2. Luchin S. V., Zinovieva R. D., Tomarev S. I., Dolgilevlch S. M., Gausa G. a, Вах a, Drlessen H., Blundell T. L. Frog lens jAl-crystallin: the nucleotide sequence of the cloned.cDNA and corputer graphics modelling of the. three-dimensional.structure. -Biochim. Biophys. Acta, 916, No. 2, 1987, 163-171.

3. Лучин С. R , Томарев С. И., Долгилевич С. М. Структура гена, кодирующего 26 кД полипептид /-кристаллина хрусталика глаза лягушки Rana temporarla.. - Тезисы докладов республиканского симпозиума "Ядерные белки, и экспрессия генома", Киев, 1983, стр. 90-91.

, 4. Токарев С. И., Долгилевич С. Е , Зиновьева Р. Д., Козлов К. А., Лучин С.Е , Нгуен Кьшг, Арутюнян К.Г., Краэв A.C., Скрябин К.Г., Гауае Г.Г. Характеристика клонированных генов, кодиру-юци* кристаллины хрусталика глаза лягушки. - Тезисы докладов иэ<?того двухстороннего симпозиума СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", ЦХалтубо, 1982, с. 22.

6. Токарев С. И., Дэлгилевич С. U., Зиновьева Р. Д., Козлов К. А., Лучин С. Е , Нгуен Кыонг, Арутюнян К. Г., Краэв А. С., Скрябин КГ., Гаузе Г.Р. Структурные гомологии в генах кристалликов глаза - Тевисы всесоюзной конференции "Рекоыбинантньга ДНК", Цу-иино, 1982, с. 60.

6. Томарев О, И., Зиновьева Р. Д., Долгилевич С. U., Дучин С. Е , Краев A.C., Скрябин К.Г., Гауае Г.Г. Шлекулярное клонирование и структура генов, кодирующих разные классы кристашшов хрусталика глаза. - Тевисы докладов V Всесоюзного сиыпозиуш "Молекулярные механизмы генетических процессов", "Наука", Шсква, с. 49-50.

7. Томарев С. И., Зиновьева Р. Д., Долгилевич С. и., Лучин С. Е , Краев А. С., Скрябин К. Г., Гаузе Г. Г. Сешймво [фисталлкковых генов лягушки Rana temporaria. - Тезисы VIII Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра", Пусдао, 1984, с. 226.

8. Томарев С.И., Зиновьева Р.Д., Долгилевич C.Ii , Дучин С.Е , Гаузе Г. Г. Гены кристе. шшов лягушек структура и эволюция. - Тезисы XVI конференции СЕБО, Уосква, 1084, с. 384.

' 9. Тоыарев С. Л., Зиновьева Р. Д.,. Долгилевич С. Е , Лучин С. Е , Гаузе Г. Г. Клонирование и структура генных последовательностей кристаллинов лягушки. - Онтогенез, 1984, т. 16, с. 440.

10. Qauso G. G. , Tomarov S. I. , Ztnovleva R. D. , Dolgilevich S.M. , Luchin S.V. Gene sequences coding for crystallins of the frog Rana temporaria. - Abstracts VI International Congress of Eye Research, Spain, Alicante, 1984, p. 139.

11. Томарев С. И., Зиновьева Р. Д., Долгилевич С. U., Лучин С. Е , Краев А. С., Скрябин К. Г., Гаузе Г. Г. Молекулярное клонирование и структура генов, кодирующих разные классы кристаллинов хрусталика глаза. - В кн. : Молекулярные механизмы генетических процессов, "Наука". Шсква, 1985, с. 56-64.

12. Gause G.Ü, Tomarev S. I., Zinovleva R. D. , Dolgilevich

S. M., Luchin S.V., Arutyunyan K.6. A study of cloned cDNA sequences coding for eye lens crystallins of the frog Rana temporaria. -

Proceedings of the 16th FEBS Congress, VNU Science Press, îûW), p. 09-106.