Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика клонотеки кДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика клонотеки кДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов"



Л->"

#

л

а РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ имени Н. К. Кольцова

На правах рукописи УДК 57.017.6:052:577.21

КОЗЛОВ Константин Андреевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНОТЕКИ кДНК ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА ЛЯГУШКИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛОНОВ, КОДИРУВДИХ ПОЛИПЕПТИДЫ БЕТА-КРИСТАЛЛИНОВ

(03.00.30 - биология развития)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова (директор - академик РАН Н.Г. Хрущов)

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор А.Т. Михайлов доктор биологических наук Г.Г. Гаузе

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор Л. И. Корочкин доктор биологических наук, профессор Д.В. Попов

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится и 27 " мая 1998 года в _ часов на

заседании Диссертационного совета Д002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, ул. Вавилова 26, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова 26).

Автореферат разослан " СМт^ёЛ^ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Волина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Хрусталик глаза позвоночных на протяжении десятилетий широно используется как модельный объект в эмбриологии, цитологии, а в последнее время и молекулярной биологии развития. Разделение структурных водорастворимых белков хрусталика - кристаллитов - на три основных класса, а, р и 7-кристаллины, было обосновано Мернером еще в 1894 году (Мбгпег, 1894). Специфичной укладкой именно этих белков, по массе составляющих около 90% всех белков хрусталика, объясняют его важнейшие свойства: прозрачность и способность фокусировать изображение на сетчатке. Уникальность хрусталика состоит также и в том, что клетки его эпителия дифференцируются в волокна на протяжении всей жизни органа; при этом клетки различных стадий дифференци-ровки занимают в хрусталике различные, но строго определенные зоны. Указанные особенности делают хрусталик удобным объектом исследования механизмов действия разнообразных дифференцировоч-ных факторов посредством выделения различных его частей. Кроме того, именно линза амфибий позволяет исследовать свойственный некоторым их видам процесс регенерации хрусталика из радужки (вольфовская регенерация; см. Лопашов, Строева, 1963).

Изучение перечисленных выше процессов требует наличия маркеров, позволяющих как идентифицировать хрусталиковые клетки, так и определять отдельные стадии их диффервнцировки, в частности In vitro при формировании атипичных хрусталиков или единичных хрус-таликовых клеток. Совершенствование методов белковой химии привело к ситуации, при которой более изопфенными методами идентифицировалось все большее количество белков. Так, методом изота-хофореза выявляются 14 р- и 16 7-кристаллинов (Bours, Delmotte, 1979). Принципиально новые возможности исследований создает применение технологии рекомбинантных ДНК. Фракционирование кодирующих кристаллит генов посредством их клонирования позволяет не только изучать процессы диффервнцировки и регенерации на более ранних этапах, используя клонированные последовательности в качестве зондов, изучать активность, но и определять структуру генов, а, соответственно, и их количество для всех классов кристалликов.

- г -

Цель и задачи исследования. Основная цель данного исследования состояла в получении банка структурных генов, содержащего кодирующие последовательности всего спектра водорастворимых белков хрусталика глаза - кристаллинов, что создает основу для изучения механизмов дифференцировки и регенерации хрусталика амфибий вплоть до самых ранних этапов этих процессов и открывает возможность анализа непосредственно самих кристаллиновых генов.

Для достижения указанной цели было необходимо:

- выделить и оценить физико-химические характеристики матричной поли(А)+РНК хрусталика травяной лягушки Rana temporaria;

- используя поли(А)РНК+ в качестве матрицы, синтезировать полноразмерную двуспиральную комплементарную ДНК (дек ДНК);

- встроить дек ДНК в вектор и проклонировать ее в клетках Escherichia coll;

- провести скрининг полученной клонотеки, выделить и охарактеризовать клоны, кодирующие кристаллины;

- выделить и провести рестрикционный анализ клонов, содержащих последовательности наиболее гетерогенного и трудно идентифицируемого поликлональными антисыворотками белков хрусталика -ß-кристалшгаов.

Научная новизна. В данной работе впервые в нашей стране осуществлено клонирование двуспиральной комплементарной ДНК. В результате получен первый в мире банк клонов, содержащих последовательности, кодирующие кристаллины.

Практическая значимость. Выявленные в результате проведенного исследования кристаллинспецифичные клоны использованы в работах по изучению ранних стадий дифференцировки клеток хрусталика лягушки Rana temporaria, а также структурном анализе кристаллиновых генов. Вследствие значительной межвидовой гомологии кристаллинов полученные данные могут быть использованы исследователями, изучающими кристаллины других видов позвоночных, а также регенерацию хрусталика.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XIY International Embryologlcal Conference (Patraa, Greece, 1980); Second Soviet-Italian Symposium (Puahchino, 1980); VI Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981); Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Пущино, 1982); Двустороннем симпозиуме

СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982); 16th FEBS Congreas (Moscow, 1984).

Апробация диссертации проведена на заседании объединенного семинара по гистологии, цитологии и гистогенезу Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 6 апреля 1998 г.

Публикации. Основные данные по теме диссертации представлены в 8 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа изложена на 179 страницах, включая 119 страниц машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы включает 12 работ отечественных и 324 - иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на взрослых лягушках Rana temporaria L., из которых выделяли хрусталики.

Выделение суммарной РНК из хрусталиков лягушки. Примерно 500600 хрусталиков растирали в ступке с жидким азотом до мелкодисперсного состояния, полученный материал вносили в десятикратный объем стерильного сахарозного буфера и гомогенизировали при 0° С в течение 1-2 мин. Материал дважды депротеинизировали в течение 15 мин с равным объемом смеси фенол:хлороформшзоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, водную фазу доводили до к.к. 0,2 М ацетатом натрия, осаждали РНК тремя объемами этанола, осажденную РНК отделяли центрифугированием.

Выделение поли(А)РЖ хроматографией на олиго(дТ)-целлюлозе

проводили в колонке размером 8x6, элюируя вначале поли(А)"- фракцию при температуре 37°С буфером Б (10 мМ трис, 0,5 М NaCl,0,5 % ДСН; рН 7,8), затем поли(А)+ЕНК при 65°С 3 мл 10 мМ трис, рН 7,8/ 0,5% ДСН (буфер А).

Синтез комплементарной цепи ДНК проводили в условиях, описанных Фроловой и соавт. (1977) в течение I час при 37° С ; при

синтезе кДНК-зондов с высокой удельной активностью использовали а-[32Р]дЦТФ при концентрации в смеси 2,5 х Ю-6 М.

Синтез второй цепи кДНК проводили в течение 80 мин при 30°С в

.______ОГ>

смеси трифосфатов, содержащих 0,5 мкМ [ Р1ТТФ, 20 мкг/мл оскДНК и 280 ед/мл акт. ДНК-полимеразы I, pH 7,5; реакцию останавливали и смесь хроматографировали, аликвоты элюата объемом I мкл наносили на мишени из хроматографической бумаги Ватман ЗЫМ и просчитывали в толуольном сцинтилляторе ЖС-106; фракции, содержащие дскДНК, объединяли и осаждали 3 объемами холодного этанола.

Обработка двуспиральной кДНК нуклеазой S1 проводилась по методу Вогта (Vogt, 1973).

Синтез дГ- и дЦ-коннекторов терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазой (ТдТ) из тимуса теленка проводили в течение 25-45 мин при 36°С в какодилатном буфере, модифицируя условия в зависимости от введенного в реакции катиона: в случав необходимости присоединения к вектору дГ-коннекторов значительной длины использовали Mg-зависимую систему, pH 6,9; синтез коротких ДГ- или дЦ-трактов проводили в смеси, содержащей в качестве кофактора двухвалентный кобальт, pH 7,6.

Отжиг дскДНК и вектора pBR 322 проводили по методу Кларк и

Карбона (Clarke, Carbon, 1975).

Трансформация бактериальных клеток проводилась по методу Ман-деля и Хиги (Mandel, Higa, 1970); для трансформации использовали штамм Е. coli HB 101.

Лизис бактериальных колоний на нитроцэллюлозных фильтрах проводили по методу Сэйера (Thayer, 1979); все операции по обработке фильтров производили при комнатной температуре, за исключением инкубации с лизоцимом, которую проводили в бане со снегом.

Гибридизация колоний проводилась по методу Грюнштейна и Хог-несса (Grunstein, Hogaess, 1975) в нашей модификации при 42°С в течение 24 час; по окончании процедуры фильтры отмывали под вакуумом на воронке Бихнера по одному литру/фильтр сначала смесью 0,2хССЦ/0,055Б ДСН, затем 3 мМ трис-HCl, pH 9,1.

Выделение плазмидной ДНК с помощью ДСН-лизиса в аналитических количествах из 1,4 мл культуры Е. coll проводили по методу Броуча и Хикса (Broach, Hlcka, 1980).

Выделение плазмидной ДНК быстрым фенольным методом в голупре-паративных количествах из 20 мл культуры клеток Е. coll проводили как описано в литературе (Klein et al., 1980).

Препаративное выделение плазмидной ДНК осуществляли щелочным методом по методу Бирнбойма и Доли (Birnboim, Doly, 1979) или неионно-детергентным методом (Humphreys et al., 1975).

Препаративная очистка ковалентно-замкнутой плазмидной ДНК проводилась с помощью центрифугирования или § равновесном (Radloff et al., 1967), или двухслойном (Brunck, Leick, 1969) градиенте хлористого цезия с бромистым этидием.

Рестрикционный гидролиз плазмидной ДНК проводили из расчета 2-3 ед. активности фермента / мкг ДНК в течение 1,5-7 час в буферных системах, соответствующих инструкциям производителей конкретных ферментов.

Электрофоретический анализ ДНК в агарозных гелях проводили в вертикальных блоках или горизонтальных камерах как описано в литературе (Sharp et al., 1973)

Электрофоретический анализ рестрицированной ДНК в полиакрил-амидных гелях осуществляли из расчета 0,8-1,2 мкг ДНК/дорожку; концентрация геля составляла 5% при толщине 1,5 мм.

Электрофоретический анализ одноцепочечной кДНК в денатурирующем полиакриламидном геле проводили как описано в литературе (Maniatis et al., 1975)

Гибридизация поли(А)РНК с иммобилизованной плазмидной ДНК

проводилась в течение 2 час при 50°С с фрагментированными нитро-целлюлозными фильтрами в растворе 65% забуференного формамида, содержащего 50 мкг/мл поли(А)РНК хрусталика лягушки.

Трансляция элшрованной поли(А)РНК в бесклегочной системе ре-тикулоцитов кролика осуществлялась в двухкомпонентной смеси, состоящей из обработанного микрококковой нуклеазой лизата ретику-лощггов кролика и трансляционной смеси с 40 мкМ [%]- В,Ь-лейцина из расчета 150-200 мнКюри/пробу, в течение Z час при 30°С.

Диск-электрофорез продуктов трансляции в полиакриламидных гелях с ДСН проводили в системе "двойного Лэммли" с некоторыми модификациями (Thomas, Romberg, 1975); в качестве маркеров молекулярного веса использовали смесь -метилированных белков с

- б -

диапазоном молекулярных масс 14,3-200 кД (Амершам, Англия).

Флуорографический анализ продуктов трансляции в полиакрил-амидных гелях с ДОН, основой которого является повышение эффективности анализа транслированных полипептидов в результате обработки гелей 2,5-дифенилоксазолом (РРО), проводили, насыщая гель диметилсульфоксидом, затем 22% РРО в течение часа, осаждали РРО в геле 2% глицерином, гель высушивали и экспонировали при -70° С на пленку КоОак Х-Ошаг ХИ 1Ч1ш в течение 1-2 недель.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Общая схема создания клонотеки представлена на рис. I.

иРНК6- -----

+ t н]дЩЧ>

+ОЛИГО дТ

обратная транскрнптааа

4

гидролиз NaOH

оскДНКс—jT^-

+ [ИР]ТГФ +

ДНК-полимераза 1

4

"шпилечная дек ДНК

терминальная вуклео-тидилтрансфераза + дГГФ + Со2 3.

4 „

нуклеаза Sj

4

а'

4

терминальная нуклво-тндилтр ансфвр аза дЦГФ + С<>

(с

CTCCAG р1в_1в)С О -

(ClJ-IslCC-

-ccfe-i»)

-00(tu_u)ll*CG'rC

Рис. 1. Схема клонирования кДНК хрусталика

трансформация клеток Е. coli с последующей внутри- травяной лягушки клеточной репарацией брешей-сайтов рестрикции Pst ] Rana temporaria L.

5)

Ферментативный синтез двухспиральной кДНК на матрице поли(А)РНК хрусталика лягушки.

Первый этап работы заключался в получении готового для последующей трансформации клеток Escherichia coli материала посредст-

вом целой серии ферментативных обработок, в начальной из которых несанкционированную ■ поли(А)РНК использовали в качестве матрицы для синтеза одноцепочечной кДНК в системе обратной транскрипции. Электрофоретический анализ меченной тритием односпиральной кДНК в 4%-ном ПААГ с 98% формамидом после гидролиза исходной матрицы щелочью показал, что в препарате присутствуют молекулы с максимальной длиной до 1200 нуклеотидов, причем размеры основной части материала составляют 400-600 нуклеотидов (рис. 2).

имп/мин

1400 -

1200 -

1000

800 -

600 -

Рис. 2. Фракционирование одноцепочечной кДНК хрусталика травяной лягушки 200 в 4% полиакрил-амидном геле, содержащем 98% фориамид.

О

12 8 ее 3х 100 н 1IIII 1 i ■

. оц кДНК i ■

w СТАРТ —t> < i «А 1 i \í J 1 \ / i\ i » t

10

20

30

40

No

СРЕЗА

Синтез комплементарной цепи проводили на матрице нефракциони-рованной оцкДНК с помощью ДНК-полимеразы I из E.coli в присутствии а-[32Р]ТТФ. Полученный "шпилечный" продукт переводили из од-нотяжевой в двутяжевую форму в результате обработки нуклеазой S,, гидролизующей однотяжевые участки в нуклеиновых кислотах.

Материал после S1-нрлеазного гидролиза подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле. Радиоавтографический анализ геля показал, что основная фракция дскДНК имеет средний размер около 1000 пн.

Синтез гомополимерных дГ- и дЦ-трактов, необходимых для последующего встраивания дскДНК в плазмидный вектор, осуществляли с помощью терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы из тимуса теленка. В векторе pBR 322, линеаризованном эндонуклеазой Pst I, синтезировали дГ-, а в дскДНК - дЦ-коннекторы. При формировании липких концов для введения в вектор дскДНК, кодирующей последовательности мРНК хрусталика лягушки, применяли систему, содержащую катионы Со24. В наших условиях реакция быстро затухала после включения 18-20 остатков уже в первые 15 мин синтеза.

Клонирование дскДНК и предварительный скрининг клонов.

Вектор pBR 322 с наращенными по Pst I-сайту дГ-коннекторами и дскДНК с комплементарными дЦ-трактами отжигали в эквимолярном соотношении, полученный материал использовали далее для трансформации клеток Е. coli HB 101. Эффективность трансформации на-тивной pBR 322 в выбранных условиях составляла более I07 кол/мкг ДНК; эффективность трансформации рекомбинантной ДНК - I05 кол/мкг ДНК. Вектор pBR 322 содержит генетические маркеры устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Узнаваемая последовательность рестриктазы Pst I, по которой производили встраивание дскДНК, расположена в гене, контролирующем устойчивость к ампициллину. В результате трансформации было получено более 1500 колоний трансформантов, устойчивых к тетрациклину, из которых 863 были чувствительны к ампициллину. Эти клоны были обозначены как клоны серии pRt(b), т.е. трансформанты, несущие нуклеотидные последовательности мРНК хрусталика (линзы) Rana temporaria.

Полученный банк ампициллинчувствительных клонов был проанализирован на наличие нуклеотидных последовательностей поли(А)РНК хрусталика с помощью метода гибридизации колоний с применением в качестве зонда [32Р]кДНК, синтезированной путем обратной транскрипции на поли(А)РНК хрусталика. Радиоавтограф одного из фильтров с колониями после гибридизации приведен на рис. 3. Колонии, дающие сильный сигнал или сигнал умеренной интенсивности, составляют более 2/3 от всех Ар3 Тсг-клонов.

« f -

* ■ -Щ; V [ф :

«m Aák. '

* . V

Рис. 3. Радиоавтограф

фильтра с колониями

АрэТсг-клеток

после гибридизации с я?

[ Р]кДНК, полученной путем транскрипции поли(А)+РНК хрусталика лягушки R. temporaria.

Выборка из 80 клонов полученного банка была использована для определения размера вставок дскДНК (рис. 4). Размер определяли методом электрофореза в агарозных гелях. Длина вставок варьирует от 0,2 до 1,2 тпн, причем более 1/3 клонов содержат 20 • вставку размером около 500 пар нуклеотидов.

16 -

Рис. 4. Распределение

размеров вставок д двуспиральной к ДНК для 00 клонов банка.

4

N - количество клонов данного размера

ПН - размер вставки 0 в парах нуклеотидов

200 400 600 В00 1000 1200

ПН

Характеристика клонотеки редкощепящими эндонуклеазами и методом гибридизации/трансляции

Рекомбинантные клоны, длина вставок которых составляла нв мэ нее 400 пн, были проанализированы четырьмя редкощепящими реет риктазами: Pst I, Вага HI, Eco RI и Hind III.

Охарактеризованные рестрикцией клоны, в основном с наиболыни ми вставками, были исследованы методом гибридизации/трансляции ДНК рекомбинантов гибридизовали с суммарной поли(А)+ РНК хруста лика, РНК элюировали и транслировали в бесклеточной системе Продукты трансляции анализировали электрофоретически с последую щей радиоавтографией. Радиоавтограф одного из гелей показан н рис. 5. В трансляте суммарной поли(А)+РНК хрусталика (дор. I область 17-22 кД соответствует а- и 7-кристаллинам; фракци меньшей подвижности вплоть до 33 кД - ß-кристаллинам. кд

46

30

14,3

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Радиоавтограф электрофореграммы продуктов трансляци индивидуальных клонов.

Дорожка I - транслят суммарной поли(А)+РНК хрусталика скобками выделены альфа, бета и гамма-полипэптиды Дорожки 2-7 - полипептида, кодируемые индивидуальным клонами, по подвижности соответствующие молекулярно: массе 19, 19, 17, 19, 17 и 22 кД соответственно. Оправа указаны молекулярные массы маркерных белков.

Идентификация рекомбинантов, кодирующих бета-кристаллины.

Данные экспериментов с использованием метода гибридизации/ трансляции показали, что в полученном банке наиболее широко представлены клоны, соответствующие по электрофоретической подвижности а- и 7-кристаллинам лягушки. Дальнейшие усилия были сосредоточены на поиске клонов, кодирующих р-кристаллины. Гибридн-зационно-трансляционный тест позволил выявить три клона, направляющих синтез полипептидов соответствующей бета-кристаллинам молекулярной массы. На рис. 6 представлены результаты радиоавтографии ДСН/ПАА- гелей, демонстрирующие подвижность полипептидов, кодируемых этими клонами, с порядковыми номерами 72, 44 и 473. кД кД

69 --- 69

46 -36

30 -

/9 26

** - 46

30

§ 24 '8в

1 2 3

Рис. 6. Радиоавтографические данные анализа продуктов трансляции клонов, соответствующих бета-кристаллинам.

I - клон рШ;(Ь)72, 2 - клон р^(Ь)44, 3 - клон рШ;(Ь)473 (ДСН-электрофорез в 12,5%!полиакриламидном геле); стрелками указаны кодируемые полипептиды и их массы, линиями - расположение и молекулярные массы маркерных полипептидов. Фракции с подвижностью около 45 и 50 кД, присутствующие на всех дорожках, являются эндогенным фоном системы трансляции.

Рестрикционная характеристика рекомбинантов,

кодирующих бета-кристаллины лягушки

Отобранные по результатам гибридизации/трансляции соответствующие бета-кристаллинам клоны pRt(L)44, pRt(L)72 и pRt(L)473 были далее детально проанализированы с помощью редко- и частоще-пявдх рестрикционных. эндонуклэаз.

I. Определение длины клонированных последовательностей.

С целью получения прецизионных данных о размере фрагментов, электрофорез проводили, как правило, в 5% полиакриламидных гелях. На первом этапе была проведена оценка размера вставок путем их вырезания с помощью рестриктазы Pst I по регенерированным в ходе клонирования Pst I-сайтам. Результаты выщепления вставок из рекомбинантов 72 и 44 иллюстрирует электрофореграмма на рис. 7.

СТАРТ .

11 Бис. 7. Электрофоре грамма анализа

размера вставок клонов pRt(L)44 и pRt(L)72 эндонуклеазой Pst I (разделение в 5% ПААГ).

1 - клон pRt(Ь)72, обработанный Pst I;

2 - клон pRt(Ь)44, обработанный Pst I.

Незаштрихованными стрелками показано расположение вставок этих клонов.

3 - маркерные фрагменты, полученные обработкой ДНК вектора pBR 322 эндонуклеазой Hlnf I.

Цифрами указаны размеры фрагментов в парах нуклеотидов.

420

290

154

Выщепление вставки из рекомбинанта 473 выявило наличие двух фрагментов размером 170 и 154 пн, что указывает на присутствие Pst I-сайта внутри вставки, полная длина которой равна 324 пн.

2. Картирование клонированных последовательностей.

По результатам картирования, из 8 использованных нами вндону-клеаз клон pRt(L)44 содержит только участок узнавания рестрикта-зы Eco RI, расщепляющей вставку на два фрагмента размером 90 и 200 пн.

Клон pRt(L)72 содержит сайты рестрикции двух эндонуклеаз -Bam HI и Eco RI. Эндонуклеаза Ват HI расщепляет рекомбинантную вставку клона pRt(b)72 на фрагменты длиной 100 и 320 пн.

Анализ фрагментов рестрикции, образующихся при картировании 72 клона эндонуклеазой Eco RI, проводили в 1% агарозных и 5% по-лиакриламидных гелях. В результате одновременного гидролиза ДНК клона pRt(L)72 рестриктазами Eco RI и Pst I образуется 4 фракции. Две фракции с наибольшей подвижностью являются фрагментами вставки и имеют размеры 160 и 260 пн, сумма которых - 420 пн -полностью согласуется с ранее произведенной оценкой длины нере-стрицированной вставки.

Рестрикционное картирование клона pRt(L)473 обнаружило во вставке наличие узнаваемых последовательностей редкощепящих эндонуклеаз P3t I и Hlnd III, а также частощепящей Alu I. Расщепление рекомбинантной последовательности 473 клона по внутреннему сайту эндонуклеазой Pst I приводит к образованию фрагментов размером 170 и 154 пн. Двойной гидролиз клона ферментами Hlnd III и Pat I показал, что Hind Ill-сайт расположен в большем Pot I-фрагменте длиной 170 нуклеотидных пар. Из совокупности полученных данных следует, что Hind Ill-сайт делит вставку на участки длиной 120 и 204 пн.

Анализ клона pRt(L)473 как гидролизом только эндонуклеазой Alu I, так и двойным гидролизом рестриктазами Alu I + Pst I выявил, что Alu I-сайт содержится в меньшем из Pst I- фрагментов длиной 154 пн, и при его расщеплении рестриктазой Alu I образуется фракция размером 140 пн.

Совокупность данных по Hind III- и Alu I-картированию клона pRt(L)473 указывает на то, что УПН Alu I находится на противоположном от Hind Ill-сайта конце рекомбинантной последовательности.

Итоговые рестрикционные карты соответствующих бета-кристаллинам клонов рИ(1)44, рМ(Ь)72 и рШ;(Ъ)473 представлены на рис. 8. Здесь же перечислены рестрикционные эндонуклеазы, узнаваемые последовательности которых в указанных рекомбинантах отсутствуют.

Fat I

pRt(L) 44

pRt(L) 72

pRt(L) 473

Eco RI

I

Fat I

Fat I

Eco RI Bam HI

1 1

Fat I

Fat I

Hind III

Fat I г

Alu I

Fst I

Л_L.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

ПАРЫ НУКЛЕ0ТИД0В

Рис. 8. Рестрикционные карты трех p-кристаллиновых клонов.

pRt(L) 44: отсутствуют УИН Bam HI, Hind III, Pst I, Sal GI,

Alu I, Hind II, Hlnf I.

pRt(L) 72: отсутствуют УПН Hind III, Pst I, Sal GI, Hind II.

pRt(L) 473: отсутствуют УПН Ваш HI, Eco RI, Sal GI, Hind II.

■__ i

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Отличительной чертой технологии клонирования комплементарной ДНК является то, что наибольшую сложность здесь представляют этапы проведения ферментативных реакций: в некоторых процедурах их суммарное количество достигает семи. Контаминация используемых ферментов эндо- или экзонуклеазныш активностями может приводить к частичной и даже полной утрате клонируемых последовательностей, а присутствие фосфатазной или киназной активностей - к резкому снижению числа клонов. Первоочередное значение поэтому имеет отработка оптимальных условий энзиматических реакций.

При подборе оптимума на первом втапе - реакции синтеза од-ноцепочечной кДНК - ориентирами могут служить два критерия: средняя длина оцкДНК и выход оцкДНК на единицу веса мРНК. Для большинства работ по клонированию практически важен именно первый критерий. Недостаточность сведений о механизме обратной транскрипции послужила причиной использования самых разнообразных модификаций реакции.

В наших условиях был использован 10-кратный избыток обратной транскриптазы по отношению к количеству добавленной мРНК. Размер основной массы оцкДНК составил 400-600 нуклеотидов, и около 10% продукта имело длину 900-1200 нуклеотидов (рис. 2), что согласутся с размерами фракций исходной мРНК.

Синтез второй цепи кДНК можно осуществлять как с помощью обратной транскриптазы, так и ДНК-полимеразы I Е.со11 или ДНК-полимеразы фага Т4. Применение разных ферментов на последовательных этапах синтеза уменьшает вероятность тврминации реакции на одних и тех жэ участках цепи.

Для обеспечения последующих манипуляций в синтезированной "шпилечной" дскДНК необходимо гидролизовать фосфодиэфирные связи "шпильки", а также удалить возможные одаоцепочечные участки молекулы. Обе задачи решаются с помощью одностадийной обработки нуклеазой из Авре^Шиз огугае. Оценка содержания метки в препарате до и после нуклеазной обработки показала, что резистентно к нуклеазе . т.е. имеет совершенную двуспиральную структуру, около 80% дскДНК, при максимальной длине около 1000 пн, что несколько ниже максимального размера односпиральной кДНК.

Непосредственное введение дскДНК в плазмиду обеспечивается формированием одноцепочечных "липких концов", комплементарных концевым последовательностям клонируемого вектора. Использованная нами для синтеза комплементарных последовательностей терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза из тимуса теленка катализирует нематричное связывание нуклеотидов по свободным 3 -0Н-группам. Для образования химерной молекулы можно применять как дА/дТ-, так и дГ/дЦ-гомополимеры. Использование дГ/дЦ- коннекторов предпочтительно в связи с большей стабильностью дГ/дЦ-гибридов по сравнению с гибридами дА/дТ, причем короткие коннекторы в меньшей степени влияют на эффективность трансформации

р ,

клеток Escherihia coli. Включение дНТФ в присутствии Со пока-

ч

зало, что к 20 минуте реакции на 3 -ОН-концы наращивается лишь около 20 нуклеотидов, после чего синтез прекращается. Данная кинетика свойственна реакции формирования как дЦ-, так и дГ-коннекторов. При необходимости синтеза протяженных (более 50 оснований) последовательностей, применяли смесь, содержащую в качестве кофактора катионы Такой вариант наш был использован при клонировании кДНК а-глобина голубя (Скобелева и др., 1981).

Первый этап поиска трансформантов с введенными последовательностями проводили методом гибридизации колоний (рис. 3). Зондом в этом методе могут служить как меченая РНК, так и одноцепочеч-ная кДНК, однако использование оцкДНК снижает неспецифическое связывание. Интенсивность сигнала слабо коррелировала с размером клонированной последовательности. Примерно 11% рекомбинантов, сохранивших устойчивость к обоим антибиотикам, давали положительный сигнал, что свидетельствует о сохранении синтеза кодируемой ампициллиновым геном бета-лактамазы, несмотря на наличие вставки. Впервые подобный факт был отмечен в работе по клонированию кДНК препроинсулина (Villa-Komaroff et al., 1978).

Дальнейший анализ клонотеки включал в себя характеристику позитивных по предыдущим тестам клонов редкощепящми эндонуклеаза-ми и методом гибридизации/трансляции.

Сопоставление данных оценки длины одноцепочечной кДНК (рис. 2) и гистограммы распределения размера вставок двуспиральной кДНК (рис. 4) указывает на соответствие размера более 1/3 клонированных последовательностей длине мажорной фракции оцкДНК, составляющей около 500 пн. Можно заключить, что полученная кло-нотека по размеру вставок достаточно репрезентативна.

Рекомбинанты, преимущественно с наибольшими вставками, были протестированы методом гибридизации/трансляции. Основная масса индивидуальных клонов, что отражает и радиоавтограф одного из гелей (рис. 5, дор. 2-7), соответствует по подвижности альфа-и гамма-кристаллинам. Анализ транслята суммарной поли(А)- содержащей РНК хрусталика лягушки методами иммунопреципитации и имму-ноэлектрофореза с использованием специфичных антисывороток также показал, что выявляемые обоими методами антигены представляют

собой преимущественно альфа- и гамма-кристаллины. Эти результаты согласуются с данными по процентному содержанию кристаллинов в хрусталике лягушки, согласно которым на долю а- и 7-кристаллинов приходится около 70Х белка, и менее 20Ж - на бета-кристаллинн (СМои, 1987). Таким образом, полученный нами банк клонов репрезентативен не только по размеру исходной матрицы, но так же и по полипептидному составу белков хрусталика.

Дальнейшие усилия были сосредоточены на характеристике и идентификации рекомбинантов, кодирующих бета-кристаллины. Относительно низкое содержание и наибольшая гетерогенность полипептидного состава этого класса кристаллинов не благоприятствовали поиску рекомбинантов, несущих бета- нристаллиновые последовательности. Гибридизационная селекция позволила выявить три клона, направляющих синтез полипептидов с молекулярной массой, соответствующей p-кристаллинам. Порядковые номера клонов - pRt(L) 44, 72 и 473, аббревиатура означает плазмиды Rana temporaria (Линзы).

Клон pRt(L)72 кодирует полипептид массой 26 кД; клон pRt(L)44 - 24 кД, и клон pRt(L)473 - 26 кд (I, 2 и 3 на рис. б соответственно). Молекулярная масса бета-кристаллинов лягушки находится в диапазоне 24-32 кД (Zigler, Sidbury, 1976), в то время как масса гамма-кристаллинов не превышает 22 кД (Bindels et al., 1983). Очевидно, что указанные три клона кодируют полипептиды, относя-шися к бета-кристаллинам хрусталика лягушки. В транслятах клонов pRt(L)72 имеется также минорная фракция массой 36 кД. Фракции массой 36-37 кД были обнаружены в ряде работ у других видов амфибий (Zigler, Sidbury, 1976; Bindels et al., 1983; Chiou et al., 1986) и, видимо, видоспецифичны.

Сопоставление транслятов индивидуальных клонов со спектром полипептидов в транслятах суммарной поли(А)РНК (рис. 5, дор. I) показывает присутствие 36 кД- фракции среди кодируемых тотальной мРНК белков. Появление данного полипептида в виде минора в тран-сляте клона pRt(L)72 клонов можно объяснить спецификой применяемого метода гибридизации/ трансляции.

Гибридизация проводилась в стандартных условиях, которые не исключают возможности проявления эффекта перекрестного связывания кДНК с гомологичными участками мРНК. Варьирование условий

гибридизации полезно в отдельных случаях для выявления близкородственных клонов. Поскольку подобная цель нами не преследовалась, строгие условия гибридизации не использовались из-за возможной утери относительно коротких последовательностей, а также клонов, обогащенных AT- участками. На всех дорожках в транслятах присутствуют также две дополнительные полосы, по подвижности соответствующие 45 и 50 кД. Появление данных фракций не связано с гибридизацией, они являются эндогенным фоном используемой трансляционной системы.

Заключительный этап работы состоял в рестрикционной характеристике трех соответствующих бета-кристаллинам клонов. Полученные с помощью электрофореза в 5% ПААГ размеры вставок клонов 44, 72 и 473 равнялись соответственно 290, 420 и 324 пн.

Рестрикционное картирование клонированных последовательностей рекомбинантов pRt (Ъ)44, 72 и 473 осуществляли с помощью 8 различных эндонуклеаз. Из них рестриктазы Pst I, Hind III, Bam HI, Eco RI и Sal Gl относятся к классу редкощепящих, а эндонуклеазы Alu I, Hin! I и Hind II - частощепящих.

Клон pRT(L)44 имеет единственный сайт из всех восьми использованных эндонуклеаз - Eco RI, делящий вставку на фрагменты длиной 90 и 200 пн.

Клон pRT(L)72, при общей длине 420 пн, содержит по одному сайту эндонуклеаз Eco RI и Ваш HI, каждый из которых долит вставку на фрагменты размером 260 пн + 160 пн и 320 пн + 100 пн соответственно.

Клон pRT(L)473 общей длиной 324 пн имеет внутренний сайт рестриктазы Pst I, что ведет при выщеплении вставки к образованию фрагментов длиной 170 и 154 пн. Кроме Pst I-сайта, данный клон содержит по одной УПН эндонуклеаз Hlnd III и Alu I, причем УПН Hind III находится в большем, a Alu I - в меньшем из Pst I-фрагментов.

Сочетание участков узнавания редкощепящих эндонуклеаз, статистически имеющих I УПН на 4000 пн, в нуклеотидных последовательностях размером существенно меньшим среднестатистического, может служить специфичным маркером кодирующей пооледовательности, а, соответственно, и голипептида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная вше совокупность данных свидетельствует о том, что нами достигнута основная цель работы: получен банк ре-комбинантов, содержащих нуклеотидные последовательности кристаллитов хрусталика глаза лягушки. В результате многостадийного скрининга полученной клонотеки идентифицированы три рекомбинан-та, по молекулярной массе соответствующие бета-кристаллинам. Эти клоны далее охарактеризованы рестрикцией часто- и редкощепящими эндонуклеазами. Использованная методика клонирования не исключает возможности получения рекомбинантов с некристаллиновыми последовательностями. Такие клоны, в первую очередь не кодирующие белковых продуктов рибосомные или водонерастворимые мембранные, отсеиваются на этапах скрининга.

Несмотря на то, что хрусталик амфибий является традиционным объектом исследования процессов дифференцировки, а кристаллины изучаются классическими физико-химическими и иммунохимичвскими методами около трех десятилетий, работ по характеристике крис-таллиновых генов амфибий ранее не проводилось. Клонирование комплементарной ДНК хрусталика лягушки Вала temporaria позволяет решить несколько принципиальных задач: ввести в область исследования кристаллиновых генов новый объект - амфибии; получить возможность изучения на новом уровне процессов регенерации и дифференцировки хрусталика; создать основу для анализа структуры кристаллиновых генов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в стране осуществлено клонирование комплементарной ДНК, в результате чего получен первый в мире банк клонов кДНК, кодирующей белки хрусталика глаза.

2. Показано, что содержащиеся в банке рекомбинантные последовательности репрезентативны как по длине исходного материала, так и по полипептидному составу различных классов кристаллинов хрусталика глаза травяной лягушки Rana temporaria.

3. Идентифицированы три клона комплементарной ДНК, соответствующих полипептидам бета-кристаллинов - наименьшего по со-

держанию и наболев гетерогенного из кристаллинов хрусталика глаза лягушки. Порядковые номера клонов pRT(I)44, pRT(I)72 и pRT(L)473; молекулярная масса полипептидов составляет 24, 26 и 26 кД соответственно.

4. Осуществлено подробное рестрикционное картирование соответствующих бета-кристаллинам клонов. Картирование выявило различие всех трех рекомбинантов. Клоны pRt(L)72 и pRt(L)473, кодирующие полипептида равной молекулярной массы, могут в совокупности представлять практически полный структурный ген полипептида массой 26 кД.

5. Выявленные сайты рестрикции часто- и редкощепящих эндо-нуклеаз позволяют первоначально идентифицировать кодирующие последовательности полипептидов данного семейства белков хрусталика, в том числе и других видов позвоночных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Козлов К.А., Томарев С.И., Джумагалиев Е.Б., Долгилевич С.М., Скобелева Н.А., Фролова Л.Ю., Гаузе Г.Г. Получение клоно-теки (банка клонов) рекомбинантных ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности мРНК хрусталика лягушки Rana temporaria. // Докл. Академии Наук СССР. 1980.- Т. 255.- JS 6.- С. 1503-1506.

2. Cause G.G., jr., Kozlov К.А., Tomarev S.I., Dzhumagaliev Е.В., Dolgilevich S.M., MiMiailov А.Т., Skobeleva N.A. Construction and characterization of a cloned DNA library containing nucleotide sequences of mHNA from the frog. // XIY Intern. Bnbryological Conf. Patras, Greece. Abstr.-1980.~ P. 67.

3. Gause G.G., jr., Kozlov K.A., Tomarev S.I., Dzhumagaliev E.B., Dolgilevich. S.M., Mikhailov A.T., Skobeleva N.A., Frolova L.Yu. Construction and characterization of a cloned DNA library containing nucleotide sequences of mRNA from the frog lens. // Second Sov.-Ital. Symp. " Macromolecul eз in the functioning cell" (Pushchino, 1980). Abstr.- В 2.- P. 149.

4. Козлов К.А., Томарвв С.И., Джумагалиев Е.Б., Долгилевич О.М., Скобелева Н.А., Фролова Л.Ю., Гаузе Г.Г. Получение банка рвкомбинантных ДНК, содержащих нуклеотиднне последовательности мРНК хрусталика лягушки. // В kh.YI Всесоюзное совещание эмбриологов. Москва. I9BI. Тезисы докл.- Москва.-"Наука".-1981.-С. 85.

5. Томарев С.И., Долгилевич С.М., Зиновьева Р.Д., Козлов К.А., Лучин С.В., Нгуен Кыонг, Арутюнян К.Г., Краев А.С., Скрябин К.Г., Гаузе Г.Г. Характеристика клонированных генов, кодирующих кристаллины хрусталика глаза лягушки. // В кн.-."Структура и функция белков и нуклеиновых кислот". Материалы шестого двустор. симпоз. СССР-Франция. Тезисы докл. - Цхалтубо.- 1982.-С. 22-23.

G. Томарев С.И., Долгилевич С.М., Зиновьева Р.Д., Козлов К.А., Лучин С.В., Нгуен Кыонг, Арутюнян К.Г., Краев А.С., Скрябин К.Г., Гаузе Г.Г. Структурные гомологии в генах кристаллитов глаза. // В кн.: "Реномбинантные ДНК". Тезисы докл. Всесоюзн. конф. - Пущино.- 1982.-С. 60.

7. Tomarev S.I., Dolgilevlch S.M., Kozlov К.A., Zlnovieva R.D., Dzhumagaliev E.B., Kogan G.L., Skobeleva N.A., Mikhallov А.Т., Prolova b.Yu., Gause G.G. Molecular clonirig of double stranded cDNA from the eye lens of the frog Rana temporaria: construction of the cDNA clonotheque and Identification of a clone containing the nucleotide aequences of the crystallin gene. // Gene.-1982.-V. 17.-P. 131-138.

8. Козлов К.А. Кристаллины позвоночных - от белков к генам. // Онтогенез.-1998. (в печати).