Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная характеристика клонированных генов (кДНК), кодирующих бета-кристаллины лягушки

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная характеристика клонированных генов (кДНК), кодирующих бета-кристаллины лягушки"

РОССЙЯСЯАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ЮСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗБИТИЯ ии. Е К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

ЛУЧИН Сергей Викторович

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ. (КДНЮ, КОДИРУЮЩИХ /-КРИСТАЛЛИНЫ МУШКИ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1982

Рнбота выполнена в Институте биологии развития им. Е К. Кольцова Российской АН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Г. Г. Гауве

Официальные оппоненты;

до1сгор биологических наук А. Т. Михайлов

кандидат химических наук Е Е Носиков

Ведущее учреждение:

Институт молекулярной биологии им. Е А. Энгельгардта Российской АЕ

Зяшга состоится "2о" я* д 1993 года в.. /¿'час.

на заседании специализированного совета по эащите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте биологии развития им. Е К. Кольцова Российской АН но адресу: Ыэсква, ул. Вавилова, 26, конференц-аал.

Автореферат разослан "/-7" 109 £ г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук'

Е. М. Протопопе

«л^-у^' . : ______

госудл*'.

БИБЛИОТЕКА ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблем Хрусталик глаза позвоночных животных содержит набор структурных белков, носящих название кристаллинов. На основании различий а их структуре и свойствах их разделяют на три основные класса: ы.-, и ^-кристадяииы. Специфической укладкой этих белков в иадшлекулярные структуры обеспечивается прозрачность хрусталика, его высокий показатель преломления, способность к аккомодации. Нарушения в ансамбле кристаллиновых белков могут приводить к помутнению хрусталика, что вызывает образование катаракт и потерю зрения. Неудивительно, что кристаллики являются, объектом интенсивных исследований на протяжении почти ста лет.

Нэвый этап в исследовании кристаллинов возник в связи с возможностью клонировать кодирушке их гены. Клонирование генов открывает перспективы изучения первичной структуры ДНК, а тем самым и аминокислотной последовательности самих кристаллинов. Появляются возмогпности изучать регуляцию активности генов, кодирующих кристаллины в ходе дифференцировки хрусталика, открываются возможности эволюционных исследований, которые прольют свет на взаимоотношения кету различными классами кристаллинов и позволят ответить на вопрос, какие белки являются их предшественниками в эволюции. Кроме того, на основании структурных данных возможно построение моделей трехмерной укладки кристаллинов.и их взаимодействия медду собой в хрусталике. '

Все это делает выделение кристалдиновых генов и изучение их структуры весьма актуальной, задачей .генетики и 'кологии развития.

Дель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выделению и характеристике клонированных кДНК-генов, кодирующих полипептиды ^-кристаллинов хрусталика глаза травяной лягушки Яапа Ьепрогаг!а. конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

- из клонотеки кДНК, содержащих последовательности мРНК хрусталика лягушки, выделить рекомбинантные клоны, кодирующие ^-кристаллины;

- определить первичную структуру рекомбинантных клонов рИЬ(1) 1053 и рЩ1) 1003, кодирующих кристаллии;

- установить первичную структуру клона р!?Ц1) 1473, кодирующего ^В2-кристаллин и содержащего вставку кДНК наибольшей длины;

- построить модель трехмерной структуры А1 -кристаллика методами компьютерной графики на основании данных о его аминокис-

- г -

лотной последовательности;

- оценить темпы молекулярной эволюции -криеталлинов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в мировой литературе в данной работе описано выделение и идентификация рекомбинантных клонов кДНК, кодирующих jj-кристаллины низшего позвоночного (травяная лягушка Rana temporaria).

Установлена первичная структура клонированных кДНК, кодирующих jsAl- и ^В2-кристаллины лягушки. Получены доказательства дупликаций в ходе формирования индивидуальных генов jj-кристалликов. Впервые проведена оценка темпа ^молекулярной эволюции полипептидов ^-кристалликов.

Построена модель трехмерной структуры кристаллика Показано, что трехмерная структура этого Селка сходна с трехмерной структурой соответствующих полипептидов млекопитающих и птиц. Установлен факт высокой консервативности аминокислотных остатков поверхности молекулыjflAl-кристаллика Высказано предположение, что jeAl-кристаллины участвуют в образовании агрегатов нативных ^-кристалликов.

Полученные нами результаты используются в ряде лабораторий Института белка РАН, Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН. Института общей генетики РАН.

Публикации и апробация результатов. Основные научные результаты представляемой работы опубликованы в 15 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на V! симпозиуме СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых гаслот'ЧЦхалтубо, 1982), Всесоюзной конференции "Рекомбинантиые ДНК" (Пущино, 1882), V Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983), VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984), XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 78 стр. машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов исследования и изложение полученных результатов с их обсуждением, выводов. Список цитированной литературы включает 86 работ отечественных и иностранных авторов.

- 3- -МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реконбинантныо клони, кодирующие js-кристаллшш, наделяли из полученной ранее в лаборатории клоногеки рекомбинантиых ДНК, соде ряащей нуклеогндаыэ последовательности 1Я хрусталика глаза лягушки R. terporaria (Козлов и др. , 1980; Tomarev et al., 1982).

Выделение пдазыидной ДНК проводим по методу Бирнбойма и Доли (Birnboim, Doly, 1979). Для дальнейшей очистки плазмидной ДНК использовали равновесное центрифугирование в градиенте плотности CsCl, содер«ащем бромистый этидий (Radloff et al., 1967).

Трансформации клеток Е. col 1 плазмидныш ДНК проводили по стандартной схеие с кебольпими модификациями (Mandel, Higa, 1970).

Рестрикционный анализ ДНК проводили в условиях, рекомендуем!« производителями рестриктаз. Разделение рестрикционных фрагментов ДНК проводили в агарозных и полиакриламидных гелях как описано в литературе (Sharp et al., 1973; Maniatis et al., 1Ö75).

Гибрид-селектированную трансляцию препаратов РНК проводили in vj'tro в бескдеточной системе из ретикулоцитов кролика ( Ricciаг-dl et al., 1979). Иммунопреципитацию продуктов трансляции проводили по Шыке и др. (Schimke et al., 1981).

Гибридизационные катоды. Блог-гибридизацию разделенных путем электрофореза препаратов РНК проводили, как описано Томас (Thomas, 1980). Гибридизацию колоний проводили, как описано (Ktanlatls et al.. 1982).

Определение первичной структуры ДНК проводили по модифицированному методу Максама-Гилберта (Maxam and Gilbert, '1977; 1980). Разделение продуктов реакций специфической химической модификации проводили в полиакриламидных структурных гелях различной концентрации (20Z, 8Î, 6Х, 42) и длины (обычно 40 см и 60 см).

Компьютерный анализ последовательностей проводили согласно опубликованным алгоритмам (Waigel and Lenk, 1981). Поиск гомологичных последовательностей проводили, используя стандартные программы (Wilbur and Lipman, 1983).

Построение модели трехмерной структуры кристаллика проводили методом компьютерной графики, используя программу FR0D0'( Ja nes, 1978), модифицированную для Evans and Sutherland Pi ctur® -tem). В качестве ос новы для построения модели трехмерной структурп'-jîAl-кристаллина лягушки были взяты координаты /П-кристаллшга Оика, установленные с помощью рентгеноструктурного анализа при?разрешении 1,6 X (Summers et al. , 1984).

РЕЗУЛЬТАТУ й ОЮУВДШйЕ

Выделение рекомбинантных кДНК-клонов, кодирующих ^й-кристал-и их характеристика путем гибрид-селектироваяной трансляции.

Из описанной ранее коллекции клонированных кДНК (Козлов И др. н>во; Tonarev et al., 1882) выделяли ЕЕаашдкую ДНК и фракциониро-ишш ее электрофорезом в агарозноы гелз. Сракщш с размерами более 5000 пар нуклеогидов (длина вектора pBR 322 составляет 4352нукле-отида! использовали для трансформации Escherichta coli HB 101. Шя уупдные Д!!К из 49 независимых трансфоршнтов бшш-охарактеризован, гель-электрофорезом и расцеплением рестрикционнши эндонуклеазаш. 4 (слона этой группы (pRt(l) 1003, pRt(l) 1053, pRt(l) 1054 и pRt(l) 1074 имеют сходныз рестршсционныэ карты; длины кДНН-вставок составляют от 740 до 820 нуклзотидных пар.

Для характеристики полипептидов, кодируемых выделенный! кло-г< «ми, проводили опыты по гкбрзугселэкгмровашгай трансляции (Fslh&n and Jackson, Шб). Тотальную поди(А)+ РШ хруоташка глаза ллгуа-ки гибридкзовали. с иммобтиаовашшзд на нктрацэлвааознык фильтрах ДНК клонов pRt(1) 1003 л pRt(1) 1053, боеодцло в состав гибрида иРДО элшровалл и транслировал!! в системе на реткну-Еоцотов кролика с Зн-лейцином. Шченш полете птидн фракционировали в полиа!филом1д-ном геле. Полученная флуорогргйсла геля представлена па ркс. 1. мРШ, гибридазукгчаяся с ДНК клонов pRt( 1) 1003 в pRt( 1) 1053, направляет в бесклзгочной скстгз синтез одного основного, с кадуиэ-р.ся молекулярной иассой 25 кД, и трек ютгаркнх ка&пснеигов с кажущимися шлекуляряьам ызссш! 26,. 24 и 22,5 кД. Црадстазляется наиболее вероятны;,!, что эта гетерогенность обусловлена гкбридизацкей с ДНК каддого из данных клонов из одной, а нескольких обладало;« взаимной гомологией, ио не идентичных мРНК.

По критерия молекулярной кассы, а такта по результатам ииму-нопреципитации со специфической анткеывороткой (ке приведено),. 25 кД полишшгвд хрусталика глаза лягуаки пршгадлея;т к ^-крпстал-линам. Это дало нам основания предяолоккть, что выделенные» реком-бинаитные клоны содержат последовательности, кодирующие один из ß-кристаллинов хрусталика глаза лягуши. Для провор}® этого предположения мы проведи структурные исследования кДНК-вставок отобранных клонов. ' ■ ,

кОа

46 а

• 30 сгэ

-

• О,

1 1 ¡4;. 3 ¿»ТТГГ!!*' . . . «

12 3 4 5

Р1!С. 1. Флуорограк?:а 12,5% ПААГ-ДДС-Ма после разделения продуктов трансляции,. направляемой тотальной поли(А)*РНК из хрусталика глаза лягушки (2) и мРНК, коьшленентарными ДНК клонов 1) 1003, рИЦП 1053 и рШ1) 473 СЗ, 4 и 5 соответственно); 1 -стандарты иолекулярной ыассы.

Структурная характеристика клонов рЩ1) 1053 и рЩ1) 1003, кодирущих^А1-кркста1иин, и клона рЩ1) 1473, кодирующего _рВ2-кристадлин.

Для точной идентификации кодирующего потенциала ионов рКЦ 1) 1053 и р%(1) 1003 мы определили нуклеотидную последовательность их кДНК-вставок. Полученная нуоеотидная последовательность приве-- дена на рис. 2. Компьютерная трансляция последовательности обнаружила присутствие одной протяженной рамки считывания длиной 609 ну-клеотидов. Вычисленная молекулярная масса производной аминокислотной последовательности составляет 23,2 кД.

№1А1аал11еАзпРго1еиРгоУа1 1

. . 100

алстоосшхтасААСАгпгаст^^

РгоЬ2иС1уРгаТгрЬу$11еТ1г^а1ТугА^^ 10

PhEffl\rSeI^tCVaЛla^nIle^btGllíCysGlyPheAspfiзnIleAr^зSerLeuLysVal 31

- ' 200 1 . ' .

сииСу8С1уС1уТгр11£С1уТугС1и1ав1ЬгБегРЬ^зС1^ЬС111РЬсУа1Ьеиа1и 52 . '

^алжАстлохшттаз^

Лг^1уС1иТугРголгчТпэДзрМаТп>5е^

73 -

300 . .

лтетстгшзтэдтотлтстост^^ ^^гРЬеЛгдРго^еС/Боег^айзп^вЬу^иЗ^

94-----------------------

<00 . _.

115---------------:---

ТССХЛйААСМТОйгатаЗШО^

136-----------------

500 .

схххзслзмажххладзюя^^

ProGlyTyтAr^gGly^УIGlnTyrIleIfiuGluSвEДspHisHisGlyGlyGllПVrLys^^is 157--------------------------

500

Та^^ЖУЛТШ^ТСССДШЗ^ ТцЛг^<ПиТгрС1у5ег!11£А1гС1л11игРЬ^

173------------------------

талмсосслАтахггссгстс^^

Stаcl--------------------

700 .

тастхж^тхмстггазамтйс^

Рис. 2. Нукяэотидная последовательность "цепи кДНК, кодирующей кристаллик лягушки, и ПАП. Щтелеотидная последовательность в положениях 1-743 представлена в кДНК клона рЩ1) 1053, нуклеотид-ная последовательность в положениях 253-648 и 732-794 (подчеркнуты на рисунке) установлена на основании секвенирования кДНК 1слона рЩ1) 1003. Нукл&отидная последовательность пронумерована сверху строк, аминокислотная - снизу.

Сопоставление этой аминокислотной после довательносг-: с раэ-личньми J - кристалликами вьивило 84-831-нуп гомологию cjjAl-кри-стадяином человека (Ноге et al., 1986), мыши (Inana et al., 1982) быка (Quax-Jeukeri et al., 1984) и цыпленка (Peterson and Piatigo-rsky, 1986). Более того, все пять полипептидов колинеарны друг другу. Гомология с jsBl- кристалликом крысы, быка и цыпленка, jBB2-кристаллиноы быка, ^ВЗ-кристалликом крысы не превышает 45-50Х и требует введения в анализируемые последовательности разрывов. Гомология с различными ¿'кристаллинаш! еще более низка На основании этих данных был сделан вывод, что кДНК клонов pRt(l) 1053 и pRtOJ 1003 кодируют _/А1-крисгаллин хрусталика глаза лягушки.

В опытах по гкбрвд-сеяектировагагой трансляции рекомбинантньй клон pRt(l) 473 был идентифицирован наш как клон, кодирующий 24 кД полипептид _/3-крксташшна лягушки (Рис. 1). Поскольку длина кДНК-вставки клона pRt(l) 473 ( 320 п.о.) представлялась недостаточной для получения информации о структуре кодируемого ею^-кристаллика, iîu провели скрининг банка pRt(l), используя £32 Р)-меченую КДНК клона pRt(1) 473 в качестве зонда В результате экспериментов по гибридизации колоний был отобран клон pRt(l) 1473 с длиной КДНК-вставки около 560 нуклеотидов. Построение карт расщепления кДНК изучаемых клонов показало, что структуры кДНК-вставок клоков pRt(l) 473 il pRt(l) 1473 являются сходными (Рис. 3).

pRt (1)473

Pst Г Psl I . Hind И Pit I •

peu 121

isjjRi

pRt(I)l«73

Sou ЗА Sou ЗА Sou ЗА Sou ЗА

Pill Hoe Et Pitll I HlnaraPstl BijRt

-J ll ill I | f

pan 322

Рис. 3. Ресгрикционные карт« кДНК-вставок рекомбинантных кло-. ков рЩ1) 473 и 1) 1473, кодирующих ^В2-'кристал-лзд лягужи. Стратегия секвенирования подана горизонтальными стрелка)«!. Направление трансляции показано стрелкой внизу .рисунка.

На рисунке 4 представлена нуклеотидная последовательность кодирующей цепи кДНК-вставки клона pRt( 1) 1473, а также производная аминокислотная последовательность. Производная аминокислотная последовательность проявляет 86Х-ную гомологию с последовательностью ^В2-кристаллина быка и колинеарна ему, начиная с положения 86. в то время как гомология с последовательностями других полипептидов .¿-кристалликов не превышает 5031. Был сделан вывод, что кДНК-встав-ка клона pRt(l) 1473 кодирует ^Ей-кристашшн хрусталика глаза лягушки.

В кДНК и полипептидах js-кристалликов лягушки выявляются области внутренней гомологии, соответствующие единицам укладки или мотивам белковых молекул. В частности, в нуклеотидных последовательностях кДНК клонов pRt(l) 1053 и pRt(l) 1003 бОХ-ной взаимной гомологией обладают участки, соответствующие позициям 151-230 и 436-515 (рис. 2). На основании этих и имеющихся в литературе данных (Berbers et al., 1984; Den Dünnen et al.. 1985; Hejtmancik et al., 1988) можно сделать вывод, что гены ^-кристалликов возникли в процессе .эволюции в результате двух тандеиных дупликаций минигена-предшественника, кодировавшего один мотив белковой молекулы.

Гомология нуклеотидных последовательностей кДНК клонов pRt(l) 1053 и pRt(l) 1473 в кодирующей области превышает 507.. На основании этих данных можно полагать, что у лягушки, как и у других позвоночных, гены ^-кристаллинов образуют семейство, сформировавшееся р результате дупликаций генов-предшественников и их последующей дивергентной эволюции. Предположительно, семейство генов ^-кристалликов эволюционно "старое" по сравнению с семействами генов других классов кристалликов. Формирование семейства генов jj-кристал-линов, вероятно, завершилось до иррадиации позвоночных, следствием чего является наличке ортологичных полипептидов je-кристаллинов у всех изученных позвоночных,, включая лягушку.

Анализ модели трехмерной структуры молекулы AI-кристаллика.

Наличие аминокислотной последовательности ^Al-кристаллина позволило нам построить модель его трехмерной структуры используя метод компьютерной графики. В качестве основы для построения модели были взяты координаты ¿П-кристаллйна быка, установленные с помощью рентгеноструктурного анализа при разрешении 1,6 & (Summers . et al., 1984). Выравнивание аминокислотных последовательностей

- а -

1 . .

ТААСАССССАААСАСССАСАССАТСТССГССТТСАСАСС^ТСААА&ТССАТАСТСАССАА Азп5егА*е1,у85егА5р5ег11е8ег5ег1.еиАгБРгоПе1,уз7а1Азр!;егС1п01и 66

100 ' .

сатаасатгстссхтгатсаааасссааастттасссссаасаасатасааатааттсат Н1зЬув11еУа1ЬеиГугС1иА5пРгоА5пРЬеТЬгС1уЬузЬу811еС1и11еИеА8р 106

слтсатстассаастгтссатсстсасасстатсассааааастатсттсастсаааста А5рА8р7а1Рго5егР1\еН1бА1аН1БС1уТугС1п01л)ЬузЧа15ег5ет\'а11.у8,>!а1 126

200 . . сааастссаасстсссттсссгатсаатасссассттасасассатассастасстсттт С1п5вгС1уП1гТгрУа1С1уТугС1пТугРгоС1уТугАГЕС1уТугС1пТугЬеиРЬе 146

, . . . 300

сасаасссосаттатаассаслсстсасатасттсссссссассассссасатссастст С1иЬу5С1уА5рТугЬуБЛзрЗег5егЛ5рТНгТгрАг£РгоА1аРгоС1п11сС]_п5ег 166

СТСЛСССССЛТТСетСАТЛТССАСТОССАССАСАССССААССТТССАСССТАССААСТААЛ Уа1АгаАг»11еА^АзрМе1С1пТгрН15С1пАг£С1уТЬгРЬеШ.5РгоТЬгАзп51:ор 186

400

асааасасттсстстгтстсттсхсссастссасасааасатсттсааассс^татасст

САТСТССТССТСТТТТТССТСССССА1ССП:АТСССССАТасСАСТСТСТСАСТАААССТ

500 .... сстсаассаасттаатаааасстттсасгттаааастсааааааааааааааааа

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность цепи кДНК клока р{?Ь( 1) 1473, кодирующей ^Е8-кристаллик лягупси, и ПАЕ Цгклеотидная последовательность пронуьэ-рована вверху строк, аминокислотная - внизу. Первая аминокислота соответствует полокэшш 86 в ^В2-кристадлинэ быка (Опезиеп оЬ а1., 1980, 1981).

- 10 -

друг относительно друга приведено иа рис. Б.

Хотя ^А1-кристаллни лягушки проявляет только 38%-ную гомологию с ¿-II-кристалликом быка, их трехмерные структуры, согласно данным моделирования, в основном сходны. Как и ¿'-кристаллины, кристаллин состоит ив двух сходным образом организованных доменов.

И» С » «иГУЦС»

и с в у

I I» »

Л"УУ>Я >« ИЯ1*УУ»С*»Г0в«*МЗГГЗ

'-44 <Ь РК1 |

Ь* >и |

«»-„-.«•к ри |

04 рц

Аьи /и с г < »я в не» с»

Г» ю

> С1н 1 я; (сг с » |*Ц| *|г

г у • а м V

г у % * Ы V

Г V» V | к *

е ^ 1С •» » к* к в|

рЫ А 1 Ч Г

IV.* мг* >А1 А V 6 | V

ал - |Л с я ь »гмо II г 1 • о в V э 9 н с 4 гдкгс *т

ММ 100 110 ц»„

мау*я рк\ 111» 1Г III »г >с п» 1ИС » с » * » Ю* "С" V* «<У61М* УОГ

«4* I Т ■ I г |

АК ДА1 I Т 1 г I

•л«« /ч »1 II 1 II

и< г»** 11 » 1>

'Л* /11ГЯИ1ГИ»0Я0«*1Т с А »Г* II И 1« 1С

1М

/га ума I *1 с| но. А

•ч< ) А1 А

ДА1 л А

1. «м

I V С I

V м В »

Рис. 5. Выравнивание последовательностей кристалликов

относительно последовательности 1-кристаллина быка. Гомологичные области, соответствующие мотивам белковой молекулы, помешены друг под другом. Аминокислотная последовательность _^А1-кристаллина лягушки приведена полностью. Для остальных последовательностей показаны только отличающиеся аминокислотные остатки. Нумерация аминокислотных остатков кристаллика лягушки проведена согласно нумерации рентгеноструктур-ных координат /II-вристаллина быка (М^оог еЬ а1., 1983).

и -

каддый из которых в свою очередь состоит из двух пространственно и структурно сходных компактных »ютивов (рис. 6). Такое сходство трехмерных структур достигается за счет сохранения определенных критически важных аминокислотных остатков, существенных для правильного сворачивания каждого из мотивов. Два остатка абсолютно консервативны во всех четырех мотивах: й1у-13 (52, 100, 141) и Бег-34 (77, 123, 166). Эти аминокислотные остатки вовлечены в стабилизацию трехмерной структуры белковой молекулы. Другие, консервативно вариабельные остатки, также помогают стабилизировать пространственную структуру ^М-кристаллина Меддоменный контакт обеспечивается взаи-шдействием шести гидрофобных аминокислотных остатков (43, 56, 81, 132, 145 и 170) и двух ионных пар ((3111-58 - Аге-168 и Аг^-79 -61 и-147).

В отличие от кристалликов, -/А1-кристаллин обладает выступающей за пределы компактной укладки концевой последовательностью длиной 13 аминокислотных остатков. В _у9А1-кристаллине выступающий и-конец молет формировать полипролиновую спираль.

Рис. 6. Стереопара модели трехмерной структуры ^А^кристал-

Поскольку кристаллшш формируют агрегаты, это дает возможность предположить наличие участков агрегации на поверхности молекулы 0А1-кристаллина. Одним из таких возможных участков молот

лииа лягушки.

служить гидрофобная площадка, образуемая остатками аминокислот Leu -3, Pro -1, Trp 1, Pro 80 и Oys 82. Другой предположительный участок агрегации молекул _/А1-кристаллина образуется остатками Тгр 103, Met 115, Trp 117 и, вероятно, Ггр 154 и РЬв 162,

Сравнительный анализ ^g-кристалликов

Сравнение аминокислотных ¡замен в молекулах^Ai-кристаллгаюв лягушки, цьшленка и ряда млекопитающих позволило нам провести оценку темпа молекулярной эволюции этого полипептида. Считая, что дивергенция предков млекопитающих и амфибий произошла 350 миллионов лет тому назад (Dayhoff, 1972), текл эволюции ^Al-кристалли-на в области комлактной укладки молекулы составляет 3,8 аминокислотных замены на 100 аминокислотных остатка за 100 миллионов лет. При сопоставлении аминокислотных последовательностей ^В2-кристал-лина лягуики и ^В2-кристаллина быка (Drlessen et al., 1981) также обнаруживается их высокая консервативность: только 4,1 аминокислотных остатка из 100 изменяются за 100 миллионов лет. В то кз время для_/В1-кристелштна (сравнивалисьjsBl-кристаллшщ цыпленка (Hejtrrancik et al. ,1985), крысы (Den Dünnen et al., 1985)' и быка (Quax-Jeuken et al., 1984)) эта величина составляет 9 аминокислотных замен на 100. остатков за 100 миллионов лет. Возможно, что jäAl-кристадлин - это один из наиболее медленно изменяющихся полипептидов jß-кристаллитов.

Наличие модели трехмерной структуры позволяет провести анализ темпа накопления аминокислотных замен "в различных функциональных областях молекулы ^Al-кристаллина." Наиболее вариабельными (вааимная гоюлогия 61-92Х) являются 13 аминокислотных остатков N-концевой последовательности пяти ортологичных jjAl-крнсталлинов (Таблица 1). Для 54 остатков, скрытых в гидрофобном "ядре'* молекулы гомология выше (81-95%.), а для 131 остатка, находящихся на поверхности белковой молекулы и доступных для растворителя, ещэ выше (87-97%). Обычно в эволюционно родственных глобулярных белках остатки, локализованные на поверхности, менее консервативны, чем остатки, скрытые внутри молекулы (Chothia and Lesk, 1986). Консервативность поверхностных остатков в jsAl-криеталлинах (рис. 7) может быть обусловлена тем, что эти остатки принимают участие в ыекшлекулярных взаимодействиях и поэтому находятся под сильным селективным давлением, препятствующим их.изменениям в эволюции. Весьма возможно, что молекулы jÄl-кристаллика находятся вну-

КИСТЛЛШ! ОСТАТКИ Бык Лягушка Бик !.'ииь Че/.оь.;к Циглснок |П JAI /AI JAI /АХ jkl

DiK JII В Лдгуика >А1 В Бак /AI В «ышь }Л1 В Человек >А1 В Цыпленок /AI В 1005 38? 37? 3BÍ 37? за; iuo? ви? ea£ oaí ш? I00S 97? 92? 80? loo? 93? еа? ICO? 65? 100?

Бык ¡(И Я Лягуижа /А1 Я Бык К Киж J AI Л Человек /А1 Я Цщиеиох /А1 Я 100? 54? 52? 50? 52? 48? JOüí 81? 81? 81? 81? I OLI? 96? 94? 88? ICO? 91? 87? 10U? 85? I00>

Бык ¡11 II Тягут а П Бик >А1 П Мцаь _fAI П Человек }К1 Л Цыпленок JAI П 100? 31? 31? 31? 29? 33? IOU? 94? 92? 8« 91? 1Ш? 97? 92? 90? 10u> 92? 91? 100? 07? 100?

Дягукка }к\ К Бык /А! К Itet /А1 ■ К Челоьек /А1 К ЦыПленск /А! К IÜL? 61? 69? 69? 65? 100? 92? 85? _ 69? 100? 92?' ' 69? 100? 69? 100?

Таблица 1. Гомология различных функциональных областей молекул -кристаллитов различных видов и /11-кристаллика быка. Обозначения: В - гомология между полными последовательностями, за исключением делений и вставок (см. рис. 5); Я - гомология между 54 остатками, скрытыми в "ядре" молекулы; П -гомология меаду 118 (/II-) и 131 (/А1-) остатками, находящимися на поверхности молекулы; К - гомология между 13 М-концевыми остатками.

три нативного агрегата ./-кристаллина, и большая часть поверхности кристаллина существенна для межмолекулярных взаимодействий с другими полипептидами ^-кристаллинов.

Рис. 7. Внешний вид поверхности модели jsAl-кристаллина лягушки. Вариабельные аминокислотные остатки jgAl-кристалликов лягушки, быка и мыши показаны белым цветом, консервативные - серым.

ВЫВОДЫ

1. Из полученной ранее в лаборатории коллекции клонированных кДНК, содержащих нуклеотидные последовательности поли(А)+ РНК хрусталика глаза лягушки Rana tenporari а, выделены клоны, кодирующие jéAl-кристаллик и ^В2-кристаллин.

2. Определена нуклеогидная последовательность кДНК рекокби-нантных клонов pRt(l) 1053 и pRt(l) 1003. В данных клонах представлена информация о первичной структуре /А1-кристаллина лягушки, начиная с аминокислоты 1 и заканчивая аминокислотой 198.

3. ' 8 кДНК для jAí-кристаллина выявлены области внутренней гомологии, что подтверждает представления о возникновении генов

j-кристаллинов в результате последовательных дупликаций гена-пре-ДЕественника.

4. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК тона pRt( 1) 1473, кодирующего ^вг-криеталлия лягупки. В структуре ¡слона содержится инфор*гшшя об ашиоютяотиой последовательности ^вг-кристалдзгаа,. начиная с шдшокислоты 86 и заканчиаш! аминокислотой 204.

5. Проведена оценка тейпа юлэ!^уляр::ой эволюции аминокислотный последовательностей _/А1- и ,дВ2-кркстадл:шов, СредикЛ тем! ш-лзкулярной эволюции для С-концэвого дон?на ^Кг-кристаллжа сестас-ляет 4,1 замены на 100 аглигскнслотких остат!сов за 100 шллионов лег. Дгл сблгсти коьяактной укладки ¡:олэку.ш _/А1-!фнсташша тега ¡.»лэкулярной зволюцш составляет 3,8% sa:,'.en ашшоккслотних остатков за 1GO (сяллионов лет.

6. С по;.;о~ьг) ь-этодов ¡сошьгаерной графгаси построена шдель трэхг.'эрпой структуры !»лэкулы /Al-крнсталлина. Анализ модели выявил высокую степень консервативности ашгаожслотних остатков, рзепологзкшя на поверхности ьюлекул jsЛ1 -кр.чстал-inron ш.фтОий, (.!ле1сопи?аг™гх и птиц.

Основные результат» диссертации опубликованы в работах:

1. Лучин С. Е, Токарев 0. И. , Долгилевич С. II, Краев A.C., Скрябин К Г., Гаузе Г. Г. Выделение и структура клока рекомбипант-ггой кДШС, кодирующей /-кристаллии хрусталика глаза лягушки Rana iorporariа - Доклады All СССР, 279, N1, 1984,' стр. 233-237.

2. Luchin S.V. , Zinoviova R. D., Tcnvarov S. I., Dolgilevlch S. M , Gause G. G., Bax B. , Driessen H. , Blundell T. L. Frc? Ions jAl-crystallin: tho nucleotide sequence of the cloned.cDMA and computer graphics modelling'of tho. three-dimensional.structure. -Biochim. Biophys. Acta, 916, Ho. 2, 1987, 163-171.

3. Лучин C.K , Токарев С.It, Долгилевич С. !i Структура гена, кодирующего 26 кД полипептид jS-кристаллина хрусталика глаза лягушки Rana temporäriа. - Тезисы докладов республиканского симпозиума "Ядерные белки и зкспрессия генома", Клев, 1983, стр. 90-91.

4. Тоиаров С. К., До лгилэвич С. Е , Зиновьева Р. Д.. Козлов RA-, Лучин С. а , Нгуен Кыонг, крутит КГ., Ераав А. С., Скрябин К.Г., Гауае Г.Г. Характериетта 1Шшированншс гоное, кодирующих крисгаллшш хрусталика глаза лягужи. - ?ввиеы докладов саотого двухстороннего.скыпоаиую СССР-Сранцкя "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", Пладтубо, 1982, с. 22.

6. Тошф-зв С. ií , Далгшквкч С. x.L , Зиновьева Р. Д., Ковдов К. к , Лучин С. К , Нгуен Кданг, Арутиняя К. Г., Крага Л. С., Скрябин К.Г., Гауза Г.Г. Структурой гомологии в генах крисуаляшов глаза. - Тезисы всесоюзной конференции "Рекоибинантнш ДНК", Нунцию, 1S82, е.. 60.

5. Токарев С, JL , Зиновьева Р. Д., й>лгщэвич С.Ц , Хучяа С. Е , Кразв А. С,, Скрлбин К. Г., Гауае Г. Г. Уэде^'лярноа клонирование и отруктура генов, кодирующих ровкиа классы крнсташаюв хрусталика глава. - Тевиси докладов V Гсосовоиого сиипозиуш "АЬлекулярниэ мгханизш генетически* npopcoos", "}Ьу>ш", 1Ьскаа, с. 49-50.

7. Тоиарер, C.1L , Зшовьэеа Р. Д. , Долгндевич С. Я , Лучки С. Е , Краев А. С., Скрябин К. Г.. Гауве Г. Г. Сош£згез 1фастод»шов12 генов лягу^ш Rana temporaria - Тезисы VIII Всасоазиого стаозкуга "Структура и функции иуижшого ядра", nyi^yjo, 1084, с. 226.

8. Тоиарэв С. Я , Зиновьева Р. Д., ^одгилевич С. 11, Лучин С. Е , rayes Г. Г, Гены крксташшов лягуисс струизура и эволюция. - Тезисы Щ «зифзрешиш ФЕЮ, Уоскей, 1984, с. 334.

' 3. Токарев С. Е., Зиновьева Р. Д., Дэдпзловкч С. Ш,, Лучин С. Е , Гауво Г. Г. Кдошгрованиэ и структура гоккых последовательностей кристалликов лягуики. - Онтогенез, 1984, т. 15, с. 440.

10. Bausa а а , Tonarev S. I. , Zinovieva R. D., Dolgilevich S.M. , Lachin S. V. Geno sequences coding for crystallins of the frog Ram tertporana. - Abstracts VI International Congress of Eye Research, Spain, Alicante, 1984. p. 139.

11. Томар&в С. Л , Зиновьева Р. Д., Долгклевич С. И., Лучин С. Е , Краев А. С. , Скрябин К. Г. , Гаузе Г. Г. Шлзкуллрное клонирование и струотура генов, кодирующих разные классы кристалликов хрусталика глаза - В кн.: Шлэкулярныэ механизмы генетических процессов, "Наука", Уосква, 1985, с. 56-64.

12. Qause G.G. , Tonarev S. I., Zinovieva R. D. , Dolgilovich S.il, Luchin S. V., Arutyunyan K.G. A study of cloned cDNA sequences codins for eye lens crystallins of tho frog Rana tewpurnria -Proceedings of the 16th FEBS Congress, VNU Science Press,

p. 03-106.