Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика клонотеки к ДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козлов, Константин Андреевич, Москва

россшокая академия наук

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 57.017.6:052:577.21

КОЗЛОВ Константин Андреевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНОТЕКИ кДНК ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА ЛЯГУШКИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛОНОВ, КОДИРУЮЩИХ ПОЛИПЕПТИДЫ

БЕТА-КРИСТАЛЛИНОВ

(03.00.30 - биология развития)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор А. Т. Михайлов доктор биологических наук Г. Г. Гаузе

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ................................................6

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ......................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................II

Глава I. Структура и макромолекулярный состав линзы

глаза позвоночных............................II

1.1. Клеточное строение хрусталика и общая характеристика его белков ....................II

I.I.I. Структурные белки хрусталика ..... . . 14

1.2. Тканеспецифичные белки хрусталика и кодирующие

их полинуклеотидные последовательности .... 17

1.2.1. Альфа-кристаллины ........................17

1.2.2. Структура альфа-кристаллиновых мРНК ... 22

1.2.3. Клонирование кодирующих последовательностей альфа-кристаллинов ......................25

1.2.4. Гамма-кристаллины..................23

1.2.5. Структура гамма-кристаллиновых мРНК

и их клонирование ....... ..... 32

1.2.6. Дельта-кристаллины ......................34

1.2.7. Динамика синтеза мРНК дельта-кристаллинов

в ходе дифференцировки хрусталика .... 37

1.2.8. Клонирование дельта-кристаллиновых мРНК . 38

1.2.9. Другие таксон-специфичные кристаллнны . . 39 Глава II. Еета-кристаллины: белки, мРНК, гены.

Молекулярное клонирование комплементарной ДНК 41

11.1. Физико-химические свойства нативных бета-кристаллинов ................................41

11.2. Свойства и структура бета-кристаллиновых субъвдинщ..................................42

11.3. Клонирование и анализ кодирующих последовательностей бета-кристаллинов .... 49

11.3.1. Основные характеристики бета-кристаллиновых мРНК................49

11.3.2. Клонирование и анализ бета-кристаллиновых последовательностей ......................51

11.4. Молекулярное клонирование комплементарной ДНК 53

11.4.1. Векторы клонирования ....................53

11.4.2. Стратегии клонирования кДНК ..............57

11.4.3. Методы клонирования кДНК................63

11.5. Заключение..................................66

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................68

I. Материалы....................................68

II. Методы........................................69

11.1. Получение хрусталиков лягушки ................69

11.2. Выделение суммарной РНК из хрусталиков лягушки 69

11.3. Выделение поли(А)РНК хроматографией

на олиго(дТ)-целлюлозе ........................"О

11.4. Синтез комплементарной цепи ДНК...... . 71

11.5. Синтез второй цепи кДНК......................72

11.6. Обработка двуспиральной кДНК нуклеазой В1 . . 73

11.7. Синтез дГ- и дЦ-коннекторов..................74

11.8. Отжиг дскДНК и вектора pBR 322 ........ 75

Н.Э. Трансформация бактериальных клеток ...... 76

11.10. Лизис бактериальных колоний

на нитроцеллюлозных фильтрах......... 77

11.11. Гибридизация колоний............. 78

11.12. Радиоавтография фильтров ........... 79

11.13. Выделение плазмидной ДНК с помощью ДОН-лизиса 79

11.14. Выделение плазмидной ДНЕ быстрым фенольным методом........................80

11.15. Выделение плазмидной ДНК щелочным методом . . 81

11.16. Препаративное выделение плазмидной ДНК неионно-детергентным лизисом......... 83

11.17. Центрифугирование плазмидной ДНК в равновесном градиенте хлористого цезия с бромистым этидием 84

11.18. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК..... 85

11.19. Электрофоретический анализ ДНК в агарозных

гелях и радиоавтография........... 86

11.20. Электрофоретический анализ рестрицированной

ДНК в полиакриламидных гелях ......... 87

11.21. Электрофоретический анализ одаоцепочечной кДНК

в денатурирующем полиакриламидном геле .... 88

11.22. Иммобилизация плазмидной ДНК

на нитроцеллюлозных мембранах ........ 89

11.23. Гибридизация поли(А)РНК с иммобилизованной плазмидной ДНК................ 90

11.24. Трансляция элюированной поли(А)РНК

в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика . 91

11.25. Диск-электрофорез продуктов трансляции

в ПАА-гелях с ДОН............................93

11.26. Флуорографиче ский анализ продуктов трансляции после разделения в ПМ-гелях с ДСН............94

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ..................................96

I. Ферментативный синтез двуспиральной кДНК

на матрице поли(А)РНК хрусталика лягушки ... 96

II. Ферментативный синтез дГ- и дЦ-коннекторов . . 99

III. Клонирование дскДНК в векторе pBR 322 .... 102 17. Первичный скрининг и предварительная

характеристика рекомбинантных клонов ..........103

V. Характеристика клонотеки редкощепящими эндо-

нуклеазами и методом гибридизации/трансляции . 105 VI. Идентификация рекомбинантов, кодирующих

полипептиды бета-кристаллинов хрусталика . . . 109 VII. Рестрикционная характеристика рекомбинантов,

кодирующих бета-кристаллины лягушки ..........113

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ....................................124

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................136

ВЫВОДЫ..........................140

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................141

ВВЕДЕНИЕ

Все вида взаимодействий, лежащих в основе детерминации и дифференцировки, в принципе определяются взаимодействиями на молекулярном уровне. Детерминированное состояние клетки невозможно выявить ни одним из существующих в настоящее время экспериментальных подходов. Дифференцировку рассматривают как внешнее выражение детерминации, характеризующееся специализацией в клеточной морфологии, физиологической функции и биосинтетической активности.

Основа генетического контроля цитодифференцировки обусловлена тканеспецифичностью действия генов. Для определения места действия генов в экспериментальной эмбриологии применяют такие традиционные методы исследования, как парабиоз, трансплантацию тканей, клеток или клеточных органелл, культивирование тканей или клеток in vitro, получение химерных животных. Достаточно эффективные, сами по себе эти методы дают лишь косвенные результаты. В этом плане совершенно новые возможности предоставляет технология рекомбинантных ДНК, возникшая на основе обнаруженных в 70-х годах ферментов нуклеинового обмена, а также экстрахромосомных факторов устойчивости к лекарственным препаратам и бакте-риоциногенных факторов (Mandel, Higa, 1970; Cohen et al., 1972, 1973).

Учитывая специфику генноинженерных методов, дифференцировку целесообразно рассматривать с точки зрения производства клеткой определенных специализированных молекул. Подобный подход вмещает в себя и такое понятие, как тканеспецифичность. Рассматривая ци-тодифференцировку, обычно подразумевают, что в ее основе лежит синтез специфических белков. Специфичные белки определяют харак-

тернов строение и специализированные функции конкретных клеточных систем. Клетки, дифференцированные в разных направлениях, должны отличаться друг от друга хотя бы одним специфическим белком; специфичность характеризуется первичной структурой белковой молекулы, а также ее относительным количественным содержанием. Количественное содержание бежа служит косвенной мерой экспрессии соответствующих генов. Следовательно, выделение индивидуальных генов позволяет исследовать процессы, связанные с более ранними этапами реализации генетической информации.

Таким образом, ценность технологии клонирования заключается и в том, что этот подход открывает возможность исследования не только тканеспецифичности, т.е. дифференциальной активности генов в пространстве, но и углубляет изучение их стадиеспецифично-сти, отражающей дифференциальную активность генов во времени. На ранних стадиях эмбриогенеза - моруле, бластуле, когда клетки то-типотентны - дерепрессируются гены, отвечающие за процессы роста и общего метаболизма; начиная со стадии гаструлы происходит активация тканеспецифичных генов, контролирующих синтез тканеспе-цифичных молекул белка и дифференцировку определенных типов клеток (Конюхов, 1980; Korochkin, 1981; Davidson, 1986).

Настоящее исследование посвящено созданию экспериментальной основы для изучения дифференциальной активности тканеспецифичных генов в развитии. В качестве объекта исследования выбран хрусталик глаза лягушки Rana temporaria. Причина выбора обусловлена несколькими обстоятельствами: хрусталик позвоночных отчетливо морфологически выражен, легко доступен в значительных количествах, функционально высокоспециализирован, однороден по молекулярному составу; белковые компоненты хрусталика - кристаллины -

до настоящего времени довольно интенсивно изучались. Как следствие, линза глаза давно уже стала традиционным объектом экспериментальной эмбриологии.

Цель нашего исследования состояла в получении банка клонов, содержащих нуклеотидные последовательности мРНК, кодирующей структурные водорастворимые белки хрусталика глаза лягушки-кри-сталлины, и идентификации полученных клонов. При этом основной акцент был сделан на идентификацию клонов, кодирующих ¡3-кристал-лины - наиболее гетерогенный по составу класс полипептидов хрусталика. Решение поставленной задачи обусловило не только получение молекулярных зондов, обеспечивающих возможность исследования структуры геномных кристаллиновых генов, изучения экспрессии кристаллиновых генов на разных этапах нормального развития линзы глаза и в процессе регенерации хрусталика, но также предоставило потенциальный путь практического применения - исследования молекулярной основы таких патологических процессов, как катарактоге-нез.

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

поли(А) - полирибоадениловая кислота

поли(А)РНК - поли(А)-содержащая РНК

поли (А) ""РНК - поли (А )-не со держащая РНК

(+)-цепь ДНК - ДНК, комплементарная РНК

(-)-цепь ДНК - ДНК, идентичная по структуре РНК

дскДНК - двуспиральная комплементарная ДНК

кДНК - комплементарная ДНК

оцкДНК - одноцепочечная кДНК

оскДНК - односпиральная кДНК

кзДНК - ковалентнозамкнутая ДНК

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза

РНКаза - рибонуклеаза

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

НТФ - рибонуклеозидтрифосфат

ТдТ - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза тпн - тысячи пар нуклеотидов по - пары оснований

УПН - узнаваемая последовательность нуклеотидов

кД - килодальтон

к.к. - конечная концентрация

БМЭ - р-меркаптоэтанол

БФС - бромфеноловый синий

ДГТ - дитиотрейтол

БСА - бычий сывороточный альбумин

АкА - акриламид

МбА - метилен-бисакриламид

ДОН - додецилсульфат натрия

ПАА - полиакриламидный

ПМГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ИЗФ - изоэлектрическое фокусирование

ИМЭФ - иммуноэлектрофорез

РРО - 2,5-дифенилоксазол

ССЦ - стандартный солевой цитрат

(0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат Na) УТБ - стандартная питательная среда (0,5% NaCl, 1% триптона,

0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,2) ФАМ - формамид

ЗДТА - натриевая соль этилендааминтетрауксусной кислоты ЭтБр - этидиумбромид

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Структура и макромолекулярный состав линзы глаза позвоночных 1.1. Клеточное строение хрусталика и общая характеристика его белков

Хрусталик глаза представляет собой высокоспециализированный орган, основная функция которого состоит в получении адекватной рефракции падающих лучей света для обеспечения необходимой остроты зрения. Трофика хрусталика обеспечивается с помощью диффузии из окружающей жидкости, называемой водянистой влагой глаза.

Линза является эпителиальным образованием и состоит из эк-тодермальных клеток разной степени дифференцировки. Хрусталик подразделяют на несколько составных частей: переднюю и заднюю капсулу (секретируются клетками поверхностных слоев линзы), эпителий, расположенный только на передней поверхности линзы, кору и ядро хрусталика (см. рис. I; капсулы не показаны).

Основная часть хрусталика состоит из однотипных клеток, называемых волокнами, и этим хрусталик отличается от любого другого органа. Волокна образуются из монослоя эпителиальных клеток передней поверхности линзы - единственной популяции клеток, имеющей митотическую активность (I на рис. I).

Вблизи экватора линзы находится герминативная зона, где происходит деление эпителиальных клеток - процесс, который совершается с постепенно замедляющейся скоростью на протяжении всей жизни организма. На экваторе расположена зона клеточной элонгации; здесь инициируется дифференцировка образуемых в гер-

Рис. I. Схема строения хрусталика амфибий.

1 - эпителий хрусталика, сохраняющий митотическую активность;

2 - экватор хрусталика - зона клеточной элонгации, начальной дифференцировки волокон хрусталика;

3 - кора хрусталика, состоящая из волокон, сохранивших клеточные ядра и органеллы;

4 - ядро хрусталика, содержащее терминально дифференцированные волокна без ядер и органелл.

минативной области эпителиальных клеток в лентоподобные волокна хрусталика (2 на рис. I). Вскоре после начала элонгации клетки волокон постепенно утрачивают свои ядра и большинство органелл, уменьшая таким образом рассеивание света внутри линзы (Лигапй, Уашайа, 1967; КшаЬага, 1975). Вместе с тем, в периферическом слое волокон линзы, составляющем кору хрусталика (3 на рис. I) белоксинтезирующий аппарат еще полностью сохраняется.

Помимо однотипности основной массы клеток, хрусталик уникален также и тем, что, несмотря на непрерывный рост линзы, старые ее клетки не отторгаются. Они становятся более компактными, сда-вливаясь в центре линзы молодыми клетками с периферии, которые, в свою очередь, покрываются вновь образующимися хрусталиковыми волокнами, постепенно компактизуясь по направлению к ядру хрусталика (4 на рис. I). Это перемещение клеток к центру отражается в морфологических различиях клеточных слоев, образованных в различные периоды развития организма. Рост клеток, протекающий на протяжении всей жизни в пределах капсулы линзы, ведет к постепенному затвердеванию ядра по мере старения, в то время как кора хрусталика остается мягкой.

Линза глаза позвоночных имеет сферическую форму, и для обеспечения своей основной функции не должна иметь одинаковый индекс рефракции, т.к. в этом случае лучи будут фокусироваться на различном расстоянии от линзы. Суммарное содержание воды и белка в хрусталике составляет 98%, причем ядро линзы позвоночных содержит 60% белка, а кора - только 20% (РМИрзоп, 1969). Индекс рефракции прямо зависит от концентрации белка, поэтому градиент концентрации последнего обусловливает наличие градиента рефракции в хрусталике от максимального значения в ядре хруста-

лика с резким убыванием по направлению к коре (Fernald, Wright, 1983).

I.I.I. Структурные белки хрусталика

Исследование структурных макромолекул линзы глаза имеет уже вековую историю. Структурные белки хрусталика крупного рогатого скота были впервые выделены Мёрнером в 1894 г. (Могпег, 1894), который подразделил их на водорастворимые кристаллины и водоне-растворимую фракцию, названную им альбуминоидом.

По сравнению с другими тканями, хрусталик глаза позвоночных имеет наиболее высокое содержание белка, который составляет около 20 - 60% сырого веса и почти весь сухой вес этого органа (Zigler, Goosey, 1981; Wistow, Fiatigorsky, 1988). В первом приближении структурные белки линзы подразделяют на водорастворимые и водонерастворимые. Кристаллины, относящиеся к водорастворимым белкам, составляют 80-90% общего белка хрусталика (Piatigorsky et al., 1980).

Кристаллины являются легко идентифицируемыми маркерами экспрессии генов при дифференцировке и в процессе регенерации линзы. В основе классификации кристаллитов позвоночных до настоящего времени используются обозначения, предложенные более ста лет назад (Могпег, 1894). Исходя из иммунологических и физико-химических характеристик, можно выделить встречающиеся у всех видов позвоночных а- и кристаллины p/7-сверхсемвйства. Гамма- кристаллины, утратившие присвоенное им Мёрнером смысловое значение, отсутствуют у птиц и рептилий. За исключением обнаруженного ранее дельта-кристаллина, с середины 80-х г.г. идентифицирован целый ряд других кристаллинов: е, р, ^ и т, что позволило выделить эти белки в отдельный класс таксон-специфичных кристаллитов.

Дельта-кристаллин обнаруживается только у рептилий и птиц (Manski, Haibert, 1965; Piatigorsky et al., 1972; Fiatlgorsky, 1980). Таксон-специфичные кристаллины как на генетическом, так и аминокислотном уровне в значительной степени гомологичны -вплоть до 100% - ферментам цикла окисления жирных кислот и другим ферментам (Fiatlgorsky, Wistow, 1989).

В литературе описаны также кристаллины с высокой подвижностью при электрофорезе: IM- или пре-а-кристаллины (van Dam, ten Gate, 1966; Campbell et al., 1968; Brahma, 1977). Fl-кристаллины и а-кристаллины теленка полностью отличаются друг от друга по аминокислотному составу и иммунохимически (Bloernendal, 1981). В свою очередь, пре-а-кристаллины, обнаруживаемые в хрусталиковых волокнах амфибий (Campbell et al., 1968; Brahma, Doorenmaalen, 1969; McDevitt, Collier, 1975), антигенно неродственны FM-кри-сталлину теленка (Brahma, Doorenmaalen, 1976).

Характерным свойством большинства кристаллитов является их способность образовывать полимерные мультисубъединичные комплексы значительного молекулярного веса (Fiatlgorsky, 1981). Для а-кристаллинов характерны агрегаты массой около 800 ООО, для р-кристаллинов - 50 000-160 ООО и даже до 500 ООО, ö-кристаллина -приблиз