Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация нуклеотидных последовательностей генов, экспрессирующихся при регенерации хрусталика и сетчатки у хвостатых амфибий

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация нуклеотидных последовательностей генов, экспрессирующихся при регенерации хрусталика и сетчатки у хвостатых амфибий"

РГ6

, б (Р

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591. 596/599

маркитантова Юлия Владимировна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРУСТАЛИКА И СЕТЧАТКИ У ХВОСТАТЫХ АМФИБИЙ. ,

специальность - 03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Директор Института академик Н.Г. Хрущов) и в лаборатории структуры и функции генов человека Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Директор Института академик В.Т. Иванов).

Научные руководители:

Доктор биологических наук В. И. Миташов Кандидат биологических наук С. А. Лукьянов

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН Л. И. Корочкин Кандидат биологических наук О. Л. Васильев

Ведущее учреждение: Институт обшей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится JY МЛЛф&г 1996 г. u 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.85.01 по защите диссертаций при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, 26)

Автореферат разослан J J" 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Кандидат биологических наук: , // Е.В.Волина

характеристика работы

актуальность проблемы. Исследование механизмов регенерации является одной из актуальных проблем в современной биологии развития. Наиболее эффективный путь к решению этой проблемы - выявление и изучение экспрессии генов, контролирующих регенерационные процессы у представителей разных систематических групп животных (Brockes, 1994; Tabin, 1995; Bryant, Gardiner, 1994; Stocum, 1995; Миташов, 1996; Mitashov, 1996). Одной из удачных моделей для изучения механизмов восстановительных процессов, является феномен трансдифференцировки клеток пигментного эпителия сетчатки в нейроны сетчатки, а также клеток пигментного эпителия дорсальной области радужки в клетки хрусталика у взрослых испанских тритонов Plcurodcles waltl, в то время как из вентральной хрусталик в норме не регенерирует.

цели и Задами исследования: Основная цель настоящей работы состояла в выявлении и изучении нуклеотидных последовательностей генов, экспрессирующихся при регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых испанских тритонов Pleurodeles waltl, и модификации для этой цели метода конструирования библиотек кДНК на основе микроколичеств РНК. Поиск таких генов проводился путем дифференциального скрининга полученных в результате вычитающей гибридизации амплифицированных библиотек кДНК, обогащенных последовательностями, специфичными для мРНК из дорсальной и вентральной областей радужки 14-х суток регенерации. В ходе работы решались следующие задачи:

1. Разработка эффективного метода получения библиотек кДН К на основе малых количеств РНК.

2. Поиск новых последовательностей ДНК, экспрессирующихся в процессе регенерации хрусталика и сетчатки.

3. Структурный анализ идентифицированных последовательностей ДНК.

4. Анализ экспрессии идентифицированных новых последовательностей ДНК в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов.

5. Анализ экспрессии идентифицированных новых последовательностей ДНК в интактных тканях и органах.

6. Анализ экспрессии идентифицированных новых последовательностей ДНК в процессе эмбрионального развития тритона.

7. Получение полноразмерпой копии кДНК идентифицированных последовательностей с использованием метода 5'-RACE-PCR.

научная новизна и практическая значимость. К началу нашей работы, в литературе не было найдено ни одной публикации об экспрессии генов в процессе регенерации хрусталика у взрослых тритонов. Во всех исследованиях регенерации разных моделей использовался метод скрининга геномной библиотеки регенерирующих органов известными зондами генов. Ключевые события регенерации могут регулироваться специфическим набором генов, не имеющих близких гомологов у представителей других систематических групп. Основная особенность наших исследований - направленный поиск неизвестных регуляторных генов, контролирующих ранние и ключевые события при регенерации. Для поиска таких генов на модели регенерации хрусталика у тритонов мы впервые предприняли путь скрининга полученных в результате вычитающей гибридизации амплифициро-ванных библиотек кДНК, обогащенных последовательностями кДНК, специфичными для дорсальной и вентральной зон радужки. С использованием данного подхода мы идентифицировали новые последовательности ДНК, экспрессирующиеся в ходе регенерации хрусталика и сетчатки. Клон ДНК, выделенный из дорсальной области радужки мы назвали LeR-i (Lens Regeneration), а клон ДНК из вентральной области радужки - VcR-l (Ventral iris during Regeneration). В настоящей работе был разработан новый метод конструирования библиотек кДНК на основе малых количеств ткани, который обеспечивает высокую воспроизводимость результата анализа генной экспрессии. Были сконструированы библиотеки кДНК из дорсальной и вентральной зон радужки на разных стадиях регенерации хрусталика, интактных тканей, разных стадий развития тритона. Выявлена экспрессия двух новых последовательностей ДНК - LeR-1 и VcR-l в интактных тканях и в эмбриогенезе тритона. С использованием модификации нового метода быстрой амплификации концов кДНК (RACE) клонирован фрагмент в сторону 5'-региона последовательности кДНК LeR-1.

Практическая значимость работы определяется возможностью использовать разработанный метод конструирования амплифици-рованных библиотек кДНК, основанный на ПЦР, для анализа экспрессии генов в ограниченных объемах тканей.

апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на Конференции молодых ученых ИБР им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 1995), были представлены на

Мсждународном симпозиуме "Механизмы развития (онтогенетические и эволюционные аспекты)" (Москва, 1994), на конференции "Регенерация сегодня и завтра" (Миннесота. США. 1995), на Европейском конгрессе по Биологии Развития (Тулуза. Франция, 1995), на 15 Зингеровском Симпозиуме по развитию и регенерации (Лондон. Англия, 1996).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований № 93-04-07376; № 96-04-48446.

публикации. По теме диссертации опубликовано_4 статьи, 6 тезисов.

структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Изложена на /о ^ страницах машинописного текста, иллюстрирована <2/ рисунками. Список литературы содержит J. Pf источника, в том числе на русском языке.

содержание работы.

В работе дана общая характеристика предшествующего этапа экспериментально-морфологических исследований регенерации разных моделей. Рассмотрены методические подходы к анализу механизмов развития и регенерации. Отмечены достоинства и недостатки основных подходов для выявления генов в процессе регенерации. Рассмотрены результаты исследований последних лет по изучению экспрессии генов в процессе регенерации хрусталика, сетчатки, конечности у низших позвоночных животных в условиях

in vitro и in vivo, полученные с использованием - разных---------

молекулярно-биологических подходов. Представлены результаты дифференциального скрининга полученных в результате вычитающей гибридизации библиотек кДНК, обогащенных последовательностями кДНК, специфичными для дорсальной и вентральной зон радужки тритона. Приведены данные структурного анализа идентифицированных новых клонов ДНК VcR-I и LeR-1. Предложен эффективный метод получения амплифицированных библиотек кДНК из малого количества РНК. Представлены результаты анализа экспрессии идентифицированных новых последовательностей ДНК в процессе регенерации хрусталика и сетчатки, в интактных тканях и органах у взрослых тритонов, а также в эмбриогенезе тритона.

МАТЕРИЛЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались тритоны Pleurodeles waltl. Из обоих глаз взрослых тритонов после их наркотизации в 2 % растворе этилуретана на 0.65% р-ре NaCl, удаляли хрусталик и сетчатку. В одном эксперименте па 7-е, 14-е, 21-е (1, 11-111, V-V1 стадии регенерации хрусталика, соответственно), а в другом на 14-е, 27-е, 41-е (1, II-I1I-IV, VI-VIII, стадии регенерации соответственно) сутки после операции из глаз вырезали дорсальную и вентральную зоны радужки. Для анализа экспрессии идентифицированных последовательностей ДНК также были взяты образцы из регенератов сетчатки на 21-е сутки после ее удаления (III стадия регенерации), клетки интактных дорсальной и вентральной зон радужки, сетчатки, пигментного эпителия с сосудистой оболочкой; эксплантаты из интактных органов и тканей взрослых тритонов: сердца, печени, переднего мозга, скелетной мышцы конечности, мышцы хвоста, хрусталика, роговицы; целые зародыши тритона ранних стадий развития (20, 24, 26, 28, 30). Из исследуемых образцов по стандартной методике экстракции с гуанидинтиоционатом выделяли тотальную РНК для приготовления амплифицированных библиотек кДНК.

По два оперированных глаза тритонов в тс же сроки после операции были подготовлены по общепринятой методике для гистологического анализа. Морфологические стадии регенерации хрусталика определяли по классификации Ямада (Yamada, 1967), а стадии развития тритона по классификации Гальена и Дюроше (Gallien, Durocher, 1957).

результаты и их обсуждение.

1. РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК кДНК, ОСНОВАННОГО НА СУПРЕССИОННОМ ЭФФЕКТЕ ПЦР, ИЗ МАЛЫХ КОЛИЧЕСТВ СУММАРНОЙ РНК.

Для анализа экспрессии генов в процессе регенерации хрусталика и сетчатки прежде всего необходимо было отработать и адаптировать к исследуемым моделям регенерации методы получения амплифицированных библиотек кДНК. Для создания амплифицированных кДНК библиотек из небольших фрагментов тканей в настоящее время с успехом используется стратегия получения библиотек кДНК на основе малых количеств мРНК с

помошью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Ве1уаУ5ку е1 а!., 1989; Сигг а а!., 1991; РшШпа Л а!., 1992).

Данная стратегия обычно включает следующие этапы: 1) Синтез суммарной кДНК с олиго(дТ)-содержащим праймером (Т-праймер), 2) Олиго(дГ)-тейлинг З'-конца первой цепи кДНК и 3) Амплификация кДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием Т-праймера и С-праймера. Этот метод подготовки кДНК к амплификации требует количественного удаления избытков Т-праймера после синтеза первой цепи кДНК. Т-праймер, не будучи удаленным, подвергается олиго(дГ)-тейлированию, эффективно амплифицируется, образуя димер праймеров. Это может полностью подавлять ПЦР, поскольку исходная концентрация кДНК, используемая для проведения ПЦР, как правило, очень низкая. В то же время, высокая эффективность амплификации коротких молекул кДНК при использовании данной стратегии, приводит к обогащению образца кДНК короткими молекулами. Метод реамплификации фракционированной по размерам кДНК устраняет этот недостаток (Ве1уау$ку е1 а1., 1989), но делает методику крайне трудоемкой.

Применение олиго(дА)-тейлирования и далее амплификация кДНК с олиго(дТ)-содержащим праймером позволяет преодолеть отмеченные недостатки предыдущих методик (Лукьянов и др., 1994). Стратегия данного метода состоит из следующих этапов: 1) Синтез первой цепи кДНК на матрице тотальной РНК с помощью обратной транскриптазы, с использованием в качестве затравки олиго(дТ)-содержащего праймера. 2) Проведение олиго(дД)-тейлирования I цепи кДНК. 3) Амплификация кДНК с помощью полимеразной—цепной—реакции-с-использованиемТ-праймера-(Рис. 1).

Несмотря на очевидные преимущества метода, он не лишен недостатков. Образование самоотожженных молекул в ходе ПЦР при амплификации гетерогенных популяций молекул кДНК с использованием одного амплификационного праймера, может снижать эффективность амплификации.

Учитывая это обстоятельство, мы считаем более эффективным разработанный нами метод конструирования амплифицированных библиотек кДНК, основанный на введении инвертированных концевых повторов (ИКП) в амплифицирующиеся молекулы (Рис. 2). Он заключается в лигировании к двухцепочечной кДНК бимодальных олигонуклеотидных адаптеров.

£

Эксплантаты радужки

Выделение РНК Синтез 1 цепи кДНК, ^ (Т) праймер

3'

5' , 3"

АААА

РНК

-ро!у А' «ваш

3'

Олиго (с!А) тэйлинг

5"

5' 3''

4

ПЦР амплификация с (Т) праймером.

3' 5'

Рис. 1. Схема получения амплифицированных библиотек кДНК с помощью олиго(дА)-тейлирования 1-ой цепи кДНК.

РНК

Синтез 1-ой цспн кДНК

РНК ДНК'

Синтез 2-ой цепи кДНК

Лигирование адапторов

тггт

■ АААА

АААА ТТГТ1

ДНК поликераза 1 ДНК лигаза РНКаза Н

_ААААс

-ТТЛ с

Т4 ДНК лигаза кДНК адаптеры

сш—

—I м II

ПДР с

+ Т-пранмером

Экспоненциальная амплификация

библиотека к ДНК

Подавление амплификации нежелательной фракции

Рис. 2. Схема получения амплифицированных библиотек кДНК легированием бимодального олигонуклеотидного адаптера с двухцепочечной кДНК.

Предлагаемый нами метод основан на эффекте селективного ингибирования ПЦР - происходит ингибирование амплификации "фоновых" молекул кДНК, фланкированных длинными ИКП, в ПЦР с праймером, комплементарным внешней части ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП. Стратегия метода состоит из следующих этапов:

1. Синтез 1-ой цепи кДНК на матрице тотальной (или поли(А) РНК с помощью Superscript обратной транскриптазы (ревертазы) MMLV (РНКаза Н-), (200 ед/мкл), с использованием в качестве затравки олиго(дТ)-содержащего праймера. Однако, на этом этапе в случае тотальной РНК кДНК синтезируется не только на матрице poly(A) РНК, но и в значительной степени на основе рибосомальной РНК.

2. Синтез II цепи кДНК без проведения олиго(дА)-тейлиро-вания I цепи кДНК, с помощью смеси ферментов, (second-strand Enzyme coctail), включающей: ДНК полимеразу I E.coli, ДНК лигазу E.coli, РНКазу Н.

3. Создание "тупых" концов 2-х цепочечной кДНК с помощью Т4 ДНК полимеразы (5 ед.).

4. Лигирование 2-х цепочечной кДНК (Юнг) со специальным псевдодвухцепочечным бимодальным олигонуклеотидным адаптером (43 нуклеотида) с помощью Т4 ДНК лигазы (5 ед/мкл). Адаптер состоит из двух олигонуклеотидов неравной длины, причем короткий олигонуклеотид комплементарен З'-концевой части длинного нуклеотида. Поскольку олигонуклеотиды не фосфоршш-рованы, лигируется только длинный олигонуклеотид своим 3'-концом к 5'-концу цепи. После достройки З'-концов дуплексов молекулы кДНК, соответствующие мРНК, оказываются фланкированы последовательностями Т-праймера и адаптера, в то время как "фоновая" кДНК, синтезированная без участия Т-праймера, оказывается симметрично фланкирована последовательностью адаптера.

5. Амплификация 2-х цепочечной кДНК, фланкированной ИКП с олиго(дТ)-содержащим праймером и праймером, комплементарным внешним 20 нуклеотидам (внешнему модулю) адаптера, в ходе которой происходит селективная амплификация интересующей фракции кДНК, имеющей в своей структуре Т-праймер. Амплификация нежелательной фракции кДНК, несущей на обоих концах молекул последовательность адаптера, подавляется за счет супрессионного ПЦР-эффекта.

Присутствие ИКП в амплифицируемых молекулах кДНК приводит к тому, что часть молекул на каждом цикле ПЦР образуют в результате самоотжига 3'- и 5'- концов одной молекулы структуру, названную "сковородкой", что препятствует отжигу амплификаци-онного праймера и снижает скорость амплификации. В настоящей работе мы использовали явление внутримолекулярной гибридизации ИКП. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация (самоотжиг) происходит раньше, чем: отжиг праймера, поскольку температура самоотжига ИКП выше температуры отжига праймера. Небольшая часть молекул кДНК достигает температуры отжига праймера без формирования структуры типа "сковородка", закрывающей сайт посадки праймера. Те молекулы, на которые праймер отжегся, после синтеза кДНК восстанавливают исходную структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах ПЦР. Ингибирующее воздействие самоотжига зависит от длины амплифицируемых молекул: более короткие молекулы подвергаются более сильному дискриминирующему давлению самоотжига концов (вплоть до полного ингибирования амплификации димера праймеров), что позволяет предотвратить потери длинных транскриптов и сделать методику менее трудоемкой. Данная методика позволяет получить амплифицированную кДНК из образца, содержащего малое количество исследуемого материала (1000 клеток) в течение 2-х дней. Важное преимущество метода - большая гибкость в отношении стартового материала и возможность получения стабильных библиотек кДНК.

Использование данного метода позволяет повысить эффективность амплификации и получать более представительные библиотеки кДНК за небольшое количество циклов ПЦР, что немаловажно, так как позволяет значительно снизить вероятность возникновения ошибок при проведении ПЦР. Большим достоинством метода является высокая воспроизводимость результата.

2. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ.

Амплифицированные библиотеки кДНК из дорсальной и вентральной областей радужки, полученные в результате вычитающей гибридизации, после переосаждения с этанолом, обработки рестриктазой Sal I, лигировали с вектором pTZ19R, обработанным той же рестриктазой и дефосфорилированным щелочной фосфотазой (ВАР). Полученные библиотеки содержали около 400 клопов ДИК каждая. По 96 рекомбинантных клонов из каждой

библиотеки были отобраны для дифференциального скрининга. Индивидуальные клоны, переносили в лунки 96-луночного иммунологического планшета для подращивания и после добавления глицерина замораживали для длительного хранения, используя в дальнейшем для дифференциального скрининга. Бактериальный осадок переносили на парные фильтры в эквивалентных количествах. Парные реплики использовали для проведения дифференциального скрининга путем гибридизации с Р32-радиоактивно меченными обогащенными "дорсальной" и "вентральной" гибридизационными пробами. В результате дифференциального скрининга библиотек кДНК, обогащенных последовательностями, специфичными для дорсальной и вентральной зон радужки тритона, мы выделили 10 распределенных клонов ДНК, 4 из которых преимущественно гибридизовались с дорсальной пробой, а 6 - с вентральной. В настоящей работе мы ограничились подробным исследованием двух распределенных клонов ДНК - по одному из каждой группы. Клон, выявленный в библиотеке кДНК дорсальной области радужки был назван LeR-1 (Z.ens Regeneration), а клон из кДНК библиотеки вентральной области радужки - VcR-I {Ventral iris during Regeneration).

3. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК LeR-1 И VeR-t.

Клоны ДНК LeR-1 и VeR-1 были структурно охарактеризованы. Вставки, размером 459 н.п. и 306 н.п., соответственно, несущие последовательности 3'-области соответствующих генов, секвенированы по методу Сенгера (Sanger, Nicklen and Coulson, 1977).

Структурный анализ показал присутствие предполагаемой консенсусной последовательности сигнала полиаденилирования на З'-конце клонов ДНК LeR-1 и VeR-1. Нуклеотидные последовательности клонов LeR-1 и VeR-1, представлены на рисунке (Рис.3 А, Б).

Компьютерный анализ первичной структуры клонов ДНК LeR-1 и VeR-1 с помощью программы Fasta с использованием Gene Bank базы данных не выявил существенной гомологии с имеющимися на данный момент известными нуклеотидными последовательностями представителей других систематических групп. Это указывает на то, что нами возможно выделены новые, еще не изученные нуклеотидные последовательности, экспрессируюшиеся в процессе регенерации хрусталика.

A (LeR-í)

5'-GCCACATAAATTGGTCAACCCTGCCTCATAATTTGGTATTTTCCTGCCGCATA A1TCTAGTGGCCCTGCATA TAACTAAAGCACTTCTATTTACCTCTTCCTCTACCT GCAGCCAAAAATAAAAACC ТТТЛССАТ CCTAACTTAAAGGTGCCATGCTAATTC GAATAGAATATCACTTTGCACCACCCCACC ATCGGAGTTGCCTGGCTGGCTAG GACATTTTGCAAAAAGAAAAGACACAAGACGCCATGGAGGAGTAACGGGAGAA ATAAACTAGAAGGGTCACCCAAGCATATC AACAGTGTTAAAACAGTATTGGTGT AATAAGAATGTTGGTTGGCC TGAATCATGGTTATAATTGTATTAAAGAGAGATT ATTAAAACATATACAATTATATATAAACCTTTATCAGAAATAAACGTTTAGCATTA GACTGAAATGCGCCAGAACAGCCCATAGG-3'

Б (VeR-í)

5'-CAATGTAAAGCAAATCTXGXTCTGTGAACATAAGGAGCACCACATXXXTCAC TGGTTTCTG TGTCCCGATTT GCAAGATTTGTCTGTTTGTCTGTGAATCTCAAG CATG G ACTAATATG TG CACAG ACAATAAG CAG ATTGTAAGTAG ACTG AATTG AA CAGCTACCACTGGGCTCACCACCAC TTCCTCATTCAAAGAGCTATTTATCCATA ATATGCTGATGAATGTCACATGGACATTGATTGGAATAAATTCTAGGTGTTGAA G AAGTTGACATC G С AG GAAGTG AC ACCACTTG GCCTTTTACCAG АТА-У

Рис. 3. Нуклеотидные последовательности исходных клонов ДНК LeR-í (А) и VcR-l (Б). Жирным шрифтом выделены терминирующие кодоны; предполагаемые сайты полиаденилирования выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

4. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

LeR-I И VeR-I.

Для проверки наличия мРНК нуклеотидной последовательности LcR-1 в геноме тритона и анализа консервативности мы провели Southern-блот гибридизацию образцов геномной ДНК тритона Pleurodeles-waitl и травяной лягушки Rana temporaria с меченной Р-32 кДНК фрагмента последовательности LeR-1, используемой в качестве зонда. Эксперименты по Southern-блот гибридизации выявили в геномных ДНК тритона Pleurodeles waltlи лягушки Rana temporaria по два аналогичных фрагмента размером 600 и 800 н. п. (Рис. 4, результаты совместных исследований со С.М. Долгилевич и И.Ю. Снеговой). В ПЦР со специфическими праймерами к нуклеотидной последовательности LeR-1 также показано наличие данной последовательности в геномных ДНК тритона Pleurodeles waltl\ лягушки Rana temporaria, и выявлено наличие нуклеотидной последовательности LeR-I в геномной ДНК лягушки Xcnopus ¡aevis (Рис. 5).

Эти данные, полученные с помощью двух разных методик указывают на эволюционную консервативность нуклеотидной

последовательности LeR-1, а также адекватности полученных результатов.

свидетельствуют об

■

9Д0 659, 656 ; •

, >

257

- " ч «

100 Р

,, А

Рис. 4. Southern-блот гибридизация образца геномной ДНК тритона Pleurodeles waltl с меченным Р-32 кДНК-зондом клона LeK-l. В качестве маркера молекулярных весов использовалась ДНК pBR322, гндролизованная рсстриктазой Alul. Размер фрагментов ДНК указан в п.н. слева от рисунка.

1 2 3

-дат

mm

9 * *

tíím

tM

v

Рис.5. Анализ экспрессии с помощью ПЦР нуклеотидной последовательности LeR-¡ в геномных ДНК иглистого тритона Pleurodeks waltl (]), травяной лягушки Rana temporaria (2), шпорцевой лягушки Xenopus laevis (3).

В связи с низким уровнем экспрессии нуклеотидных последовательностей и УеЕ-/ исследование пространст-

венно-временного распределения мРНК этих генов проводили с помощью ПЦР со специфическими праймерами. При исследовании пространственного распределения синтезировали кДНК на основе всей РНК, выделенной из 3-х независимых эксплантатов соответствующих образцов.

При изучении временного распределения мРНК, на каждой из исследуемых стадий первую цепь кДНК для ПЦР синтезировали на основе одного и того же количества тотальной РНК (100 нг).

Для того, чтобы избежать появления артефактов при проведении ПЦР, принимались специальные меры для повышения ее надежности - использовался "горячий старт", при котором ДНК-полимеразу добавляли к реакционной смеси после нагревания до температуры денатурации. После 20-25 циклов ПЦР образцы анализировали электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (ЕсВг).

Необходимо указать, что наша основная задача заключалась в изучении пространственно-временного распределения экспрессии идентифицированных нуклеотидных последовательностей 1сЯ-1 и УеЯ-1, а не в получении строгих количественных данных об уровне их экспрессии на различных стадиях регенерации тканей глаза, в различных тканях тритона и на различных стадиях развития тритона. Использованный нами вариант метода анализа экспрессии нуклеотидных последовательностей ¿е/?-/ и К"/?-/ с помощью ПЦР не япляется строго количественным и полученные данные не позволяют судить о точных соотношениях между концентрациями мРНК указанных генов в исследуемых образцах. В то же время, получение аналогичных паттернов экспрессии в 3-х независимых сериях опытов свидетельствует о правильном качественном соответствии полученных данных. Это указывает на,адекватность использованного метода анализа экспрессии нуклеотидных последовательностей ЬеЯ-1 и УеЯ-1 в нашей работе.

4.1. ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ¿с/?-/И 1-е-А"-/В

БИБЛИОТЕКАХ кДНК, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ ОЛИГО(дА)-ТЕЙЛИРОВАНИЯ

1-ой ЦЕПИ кДНК, ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРУСТАЛИКА И СЕТЧАТКИ ТРИТОНА.

Мы выявили динамику ~ экспрессии нуклеотидных последовательностей СеЯ-/ и УсЯ-1, при регенерации хрусталика (Рис. 6 А, Б). Библиотеки кДНК готовили по схеме, приведенной на рисунке 1. Кроме того, экспрессия нуклеотидной последовательности ЬеЯ-1 была выявлена при регенерации сетчатки (21 сутки), в период формирования промежуточной клеточной популяции - нейроэпителиального зачатка сетчатки (Рис. 6 А). Резкое повышение уровня экспрессии нуклеотидной последовательности УеИ-1 наблюдали в вентральной радужке на 14 сутки регенерации (П-1П стадии регенерации), во всех других исследуемых образцах уровень экспрессии нуклеотидной последовательности оказался очень низким (Рис. 6 Б).

23456 7 8 9 10

VeR-7

LeR-1

Рис. 6. Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 (А) и VeR-1 (Б) и процессе регенерации тканей глаза поданным ПЦР. Амплифицированные библиотеки кДНК получены с помощью олиго(дА)-тейлирования 1-ой цепи кДНК. 1. 2 - дорсальная и вентральная зоны интактной радужки; 3, 4 -дорсальная и вентральная зоны радужки, 7 сут. после удаления хрусталика (1 стадия регенерации); 5, 6 - дорсальная и вентральная зоны радужки, 14 сут. после удаления хрусталика (П-1П стадии регенерации); 7, 8 - дорсальная и вентральная зоны радужки, 21 сут. после удаления хрусталика (V-VI стадии регенерации); 9 - интактнаи сетчатка; 10 - регенерат сетчатки, 21 сут. после удаления сетчатки (III стадии регенерации).

4 2. ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LeR-1 И VeR-1 В ЬИЬЛИОТЕКАХ кДНК, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ ЛИГИРОВАНИЯ ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ кДНК С БИМОДАЛЬНЫМ АДАПТЕРОМ.

ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРУСТАЛИКА И СЕТЧАТКИ ТРИТОНА.

При анализе экспрессии нуклеотидной последовательности LeR-I в двух других сериях библиотек кДНК исследуемых тканей глаза, полученных с помощью олиго(дА)-тэйлирования 1-ой цепи кДНК, дифференциальное распределение не было обнаружено. Одним из главных критериев надежности амплифицированных библиотек кДНК является воспроизводимость результатов. Мы предположили, что отсугствие воспроизводимости результата в независимых сериях опыта связано с недостатками метода, используемого нами для конструирования библиотек кДНК с помощью одного Т-праймера. Для проверки этого предположения, мы разработали новый, более эффективный способ получения библиотек кДНК из малого количества ткани (Рис. 2). Были получены амплифицированные кДНК-библиотеки из дорсальной и вентральной зон радужки на 7-е, 27-е, 41-е сутки после удаления хрусталика (соответственно: I; II-II1-IV; VI-VII-VIII стадии регенерации хрусталика), соответствующих интактных зон.

Известно, что регенерация хрусталика и сетчатки у хвостатых амфибий зависит от влияния не только различных внешних факторов, но и в какой-то степени от индивидуальных особенностей организма животного. У одного и того же животного могут наблюдаться небольшие различия в скорости процесса регенерации хрусталиков правого и левого глаза. Для того, чтобы исключить эту возможную причину нестабильности библиотек кДНК, при их приготовлении на каждую точку брали по 3 независимых эксплантата соответствующих образцов.

Анализ экспрессии нуклеотидной последовательности ¿еЯ-/ в новых библиотеках показал, она действительно экспрессируется в дорсальной и вентральной зонах радужки на всех исследуемых стадиях регенерации хрусталика, а также в интактных образцах (Рис. 7 А).

Экспрессия нуклеотидной последовательности . ЬеЯ-1 усиливается с началом регенерационного процесса (I стадия регенерации). На этой стадии регенерации хрусталика клетки внутреннего и наружного листков дорсальной области радужки интенсивно пигментированы и по морфологическим критериям почти не отличаются от состояния контроля.

Ш-1

УеЯ-1

Рис. 7. Динамика экспрессии нуклеотидных последователь!)остей ¿е/?-/ (А) и УеЯ-1 (Б) в процессе регенерации хрусталика по данным ПЦР. Амплифицированныс библиотеки кДНК. получены лигированием адаптера к 2-х цепочечной кДНК. 1,2- дорсальная и вентральная зоны интактной радужки; 3, 4 - дорсальная и вентральная зоны радужки, 14 сут. после удаления хрусталика (I стадия регенерации); 5, 6 - дор-сальная и вентральная зоны радужки, 27 сут. после удаления хрусталика (И-ПЫУ стадия регенерации); 7, К - дорсальная и вентральная зоны радужки 41 сут. после удаления хрусталика (У1-УШ стадия регенерации).

Ha II-III-IV стадиях регенерации хрусталика уровень экспрессии нуклеотидной последовательности LeR-J несколько снижается. В этот период заметна депигментация клеток радужки в зрачковой области и начинает формироваться небольшая щель между наружным и внутренним листками радужки. На стадии сформированного зачатка хрусталика (VI-VIII стадия регенерации) экспрессия нуклеотидной последовательности LeR-J вновь усиливается. Определенный интервал экспрессии нуклеотидной последовательности LcR-I (ранние стадии) из длительного периода регенерации (35-40 суток) дают основания надеяться, что LeR-J специфически экспресспруется в ходе регенерации.

Экспрессия нуклеотидной последовательности VeR-1 выявлена в интактной вентральной радужке, в интактной дорсальной радужке этот ген экспрессируется на очень слабом уровне. Уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-l заметно снижается в вентральной области радужки на I стадии регенерации хрусталика. Экспрессия нуклеотидной последовательности VeR-l не обнаружена в вентральной области радужки на 11-I11-IV стадиях регенерации. По данным радиоавтографических исследований, проведенным ранее, клетки дорсальной области радужки должны пройти 5-6 циклов деления, прежде чем в них начнут появляться белки хрусталикового типа дифференцировки. Клетки вентральной области радужки частично деиигментируются, проходят в среднем два цикла деления, затем пигментируются и на II-1I1 стадии регенерации хрусталика выходят из клеточного цикла. На стадии сформированного зачатка хрусталика (стадия VI-VI1I) уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-l в вентральной области радужки восстанавливается, приближаясь к норме (Рис. 7 Б). Возможно снижение уровня экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-l на ранних стадиях регенерации хрусталика связано с событиями, связанными с ингибированием пролиферативной активности клеток вентральной области радужки. Полученные нами данные были подтверждены в 2-х других сериях образцов, что свидетельствует об их достоверности, а также о надежности разработанного нами метода приготовления библиотек кДНК.

4.3. ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LcR-I И VeR-l В ИПТАКТНЫХ ТКАНЯХ И ОРГАНАХ ТРИТОНА.

Анализ экспрессии нуклеотидной последовательности LeR-J в библиотеках кДНК из разных интактных тканей и органов

взрослого тритона, полученных с использованием новой стратегии, выявил довольно широкое распределение экспрессии ¿е/?-/. Высокий уровень экспрессии обнаружен в дорсальной радужке, мышце конечности, мышце хвоста. Существенно ниже уровень экспрессии в вентральной радужке, хрусталике, переднем мозге, печени, сетчатке, на более низком уровне экспрессия выявлена в сердце. В роговице экспрессия нуклеотидной последовательности ¿еУ?-/ не обнаружена (Рис. 8).

1 2

Ц/ГТЫГИГ-т^»

? ! » <

3 4 5

-" 'Г "ппГ*

Рис. 8. Анализ экспрессии с помощью ПЦР нуклеотидной последовательности н интактных тканях и органах тритона Р!сиго(1с!с.ч

\vultl. 1 - роговина, 2 - сетчатка, 3 - дорсальная радужка, 4 - вентральная радужка, 5 - хрусталик, 6 - сердце, 7 - печень, 8 - передний мозг, 9 - мышца конеч-ности, 10 - мышца хвоста.

Экспрессия нуклеотидной последовательности УеЯ-1 выявлена в библиотеках кДНК всех исследуемых интактных тканей (Рис. 9). Тем не менее, картина распределения уровня экспрессии нуклеотидной последовательности УеК-1 отличается от таковой, полученной для нуклеотидной последовательности ¿еЯ-/.

12 3.4 56 789 10

< ч"«* «ну «'-да ,'111"1

'уу'^чу^?' 'Ч' "здзуздр*1""" т"1"

• Ря , , V.

» '

Рлс. 9. Анализ экспрессии с помощью ПЦР нуклеотидной последовательности Ус 11-1 в интактных тканях и органах тритона Ркигоёскь 1 - роговица, 2 - сетчатка, 3 - хрусталик, 4 - дорсальная радужка, 5 -вентральная радужка, 6 - мышца хвоста, 7 - мышца конечности, 8 - передний мозг, 9 - печень, 10 - сердце.

Наиболее высокий уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-1 характерен для вентральной радужки, мышиы конечности и мышцы хвоста. Более низкий уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-1 обнаружен в хрусталике, дорсальной радужке, переднем мозге и сердце. Очень низкий уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-1 детектируется в роговице, сетчатке и печени.

Данные по анализу экспрессии нуклеотидных последовательностей LcR-1 и VeR-1 в интактных тканях и органах указывают на то, что эти последовательности не являются тканеспецифичными.

4.4. ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ UR-I И VeR-t В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ТРИТОНА.

Для анализа экспрессии нуклеотидных последовательностей LeR-I и VeR-1 в развитии тритона, с помощью ПЦР со специфическими праймерами, приготовили амплифицированные кДНК библиотеки ранних стадий развития тритона: 20 (поздняя пейрула), 24. 26, 28, 30 (стадии хвостовой почки). Экспрессия нуклеотидной последовательности LeR-1 выявлена на всех исследуемых эмбриональных стадиях тритона. Максимум экспрессии LeR-1 приходится на 28-30 стадию развития (Рис.10 А).

1 2 3 4 5

Рис. 10. Анализ экспрессии с помощью ПЦР нуклеотидных последовательностей LcR-l (А) и VcR-1 (Б) па разных стадиях развития тритона Plcuroihics waltf. 20 (1), 24 (2), 26 (3), 28 (4), 30 (5).

В процессе развития тритона выявлена экспрессия нуклеотидной последовательности VeR-I. Что касается характера

распределения уровня экспрессии, то здесь обнаружено следующее отличие. На 20, 24, 26 стадиях развития тритона уровень экспрессии нуклеотидной последовательности VeR-1 изменяется незначительно, но резко усиливается на 28 стадии. На 30 стадии развития тритона экспрессия нуклеотидной последовательности VeR-1 не обнаружена (Рис. 10 Б). Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-1 в эмбриогенезе тритона по времени совпадает с закладкой глаза.

5. КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТА кДНК НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ LeR-1 В СТОРОНУ 5'-РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ПОДХОДА 5'-RACE-PCR.

С целью клонирования близкой к полноразмерной кДНК копии гена, фрагмент которого содержит клон LeR-1 мы использовали модификацию метода получения полноразмерных фрагментов кДНК - 5'-RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), разработанную группе C.A. Лукьянова (Рис. 11). Принимая во внимание данные о том, что экспрессия нуклеотидной последовательности LeR-l была обнаружена не только в процессе регенерации хрусталика взрослого тритона, а также в ходе развития тритона, на основе поли(А) РНК 28-30 стадии развития тритона с использованием метода лигирования 2-х цепочечной кДНК с бимодальным олигонуклеотидным адаптером (Not-Sri) получали библиотеки кДНК, которые использовали для проведения RACE. В основе метода также лежит введение в структуру амплифицируемых молекул кДНК инвертированных концевых повторов (ИКП), которые не позволяют амплифицйроваться всему пулу молекул кДНК при использовании праймеров, комплементарных ИКП. Амплификацию специфических последовательностей проводили в два этапа. На первом этапе ПЦР проводили с использованием "внешнего" неспецифического праймера к адаптору T7Not-Srf (праймер Т7) и наиболее удаленного от него "внешнего" специфического праймера к кДНК последовательности LeR-1 - (праймер R1). На втором этапе, материал с предыдущей стадии после 1000-кратного разведения использовали в качестве матрицы в ПЦР с "внутренним" неспецифическим Not-Srf и "внутренним" специфическим R2 праймерами. В результате получили фрагмент кДНК последовательности LeR-1, длиной 700 н.п., который был клонирован в вектор pcDNAII. Общая длина фрагмента кДНК гена LeR-1 составляет 1120 н.п., с учетом длины исходного идентифицированного фрагмента кДНК.

РНК

Сшггез 1-ой цепи «ДНК

__АААА

ТТТТ I I обратная транскриптаза

РНК ДИК-

Синтез 2-ой цепа кДНК

JI игирование адаптеров r7NotSrf

Т7

■=0 NotSrf

АААА

- ТТТТс

ДНК полимераза 1 ДНК л и газа РНКаза Н

-АААА с

-ТТТТ с

| Т4 ДНК лигаза \ кДНК адапторы I

известная последовательность

ш

lillaü,

R2

R1

ПЦР

Т7

R1 праймер, Т7 праймер, Taq полимераза

— *.....н

R1

I R2 праймер, ПЦР NotSrf праймер,

^ Taq полимераза

R2

17 .фаз R1

NotSrf

NotSrf | К2

Клонирование фрагмента в вектор pcDNA II по сайтам Notl, Pstl. Ссквсшфованис фрагмента

Рис. 11. Схема клонирования фрагмента кДНК. последовательности LeR-l п сторону 5'-рспюна с использованием 5'-RACE-PCR.

GCAAAGAGTTTTTCCCCTACAGGTGGCATCTCTAGTCCCGTTCCTCAAT TGATCTTGGGAGGACAGTTGTCCATTGACTITAAATGGAGCTGTGGGT TG GGCATATAG CAATGTG ATCCATTTCAG CATAG CCTTTCG CCCG CCTA CTCTClTGACAAGTATCAGAGGAGCAGGTGATTCA(nTAAATTAAAAGC CTrGGTrGCATCTAGAAACAG"l'ACAG ITGCCAGCAC'CCC I AGG 1ТЛЛТС TGATG GGTTATATAGATI GTA СЛСAATTA'ITAACTG TAGA I'IAG GAAT

УАА-У.........-----------------------------------------------------------------

5'-GATATCCTAATGCC AGTATC1TGCCCTG GATTTGTTATCCAATGAGA GTGG G СAATATGAATAAACTAXATTTGСAATG СAATAGА TCTCACACTT G TTTG АСТГАААС G TATTG G CTTTGTAAA'ITC ATAACTG G ACTHTCTTG CCACATAAATTGGTCAACCCTGCCTCATAATTTGGTA TTTTCCTGCCGC ATAATTCTAGTG G CCCTG CATATAACTAAAG CACTT CTATTTACCTCTTC CTCTACCTGCA GССАААААТЛЛАААССПТА GCATCCTAACTTAAAGGT GCCATGCTAATTCGAATAGAAT ATCACTriGCACCACCCCACCATCGGA GTTGCCTGGCTGGCTAGGACATTTTGCAAAAAGAAAAGACACAAGACG CCATGGAGGAGTAACGGGAGAAATAAACTAGAAGGGTCACCCAAGCAT ATCAACAGT GTTAAAACAGTATTGGTGTAATAAGAATGTTGGTfGGCCT (! AATCATG GTTATAATrGTATTAAAG AG AG АТГАТТААААС AA ТАСАА ГТ Al'ATATAAACCTTTATCAGAAATAAACG 1TTAGCA1TAGACGAAATGCGC CAGAACAGCCCATAGG- 3'

Рис. 12. Нуклеотидная последовательность полученного с помощью RACE-PCR фрагмента кДИК клопа LeR-l. Пунктирной линией обозначена неизвестная часть последовательности. Жирным шрифтом выделены терминирующие кодоны. Предполагаемый сайт полиаденилирования выделен жирным шрифтом и подчеркнут.

Секвенирование фрагмента подтвердило, что он соответствует идентифицированному нами фрагменту кДНК последовательности LeR-l в сторону 5'-области. Структурный анализ показал, что по всем трем рамкам—считывания отсутствуют—достаточно протяженные открытые рамки (Рис. 12). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что полученный нами фрагмент нуклеотидной последовательности LeR-l соответствует 3'-нетранслируемой области.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый эффективный метод получения библиотек кДНК из микроколичеств РНК, основанный на супрессионном эффекте полимеразной цепной реакции. Получены амплифицированные библиотеки кДНК из дорсальной и вентральной зон радужки I, II-III-IV, VI-VIII стадий регенерации хрусталика, из интактных образцов: дорсальной и вентральной зон радужки, хрусталика, пигментного эпителия сетчатки, роговицы, сердца, печени, переднего мозга, скелетной мышцы конечности,

мышцы хвоста, а также зародышей тритона Pleurodeles waltlранних стадий развития (20, 24, 26, 28, 30).

2. Проведен дифференциальный скрининг библиотек кДНК, обогащенных последовательностями кДНК, специфичными для дорсальной и вентральной областей радужки тритона Pleurodeles waltl 14-х суток регенерации хрусталика. В результате выделены и клонированы новые нуклеотидные последовательности: клон выделенный из дорсальной области радужки, назван LeR-1 {Lens Regeneration), а клон из вентральной области - VeR-í (Ventral Iris during Regeneration).

3. Результаты Southern-гибридизации и ПЦР со специфическими праймерами, показали присутствие нуклеотидных последовательностей, комплементарных LeR-1 в геноме иглистого тритона Pleurodeles waltl, травяной лягушки Rana temporaria, и шпорцевой лягушки Xenopus laevis, что указывает на эволюционную консервативность последовательности ДНК LeR-1.

4. Выявлена динамика экспрессии нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-í в процессе регенерации хрусталика. Активация экспрессии LeR-1 выявлена на ранних стадиях регенерации сетчатки (IJJ стадия), в период формирования промежуточной клеточной популяции - нейроэпителиального зачатка сетчатки. События, связанные с изменением уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-J в процессе регенерации хрусталика и сетчатки могут использоваться в механизме регуляции регенерации.

5. Результаты анализа экспрессии нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-í в разных интактных тканях и органах тритона указывают на отсутствие тканеспецифичности в экспрессии идентифицированных последовательностей ДНК.

6. Выявлена экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-l на ранних эмбриональных стадиях развития тритона Pleurodeles waltl. 20 (стадия поздней нейрулы), 24, 26, 28, 30 (стадии хвостовой почки). Экспрессия данных последовательностей ДНК совпадает по времени с закладкой глаза.

7. С использованием нового подхода 5'-RACE-PCR клонирован фрагмент, длиной 700 н.п., в сторону 5'-области кДНК последовательности LeR-1. В результате общая длина фрагмента кДНК клона LeR-1 составляет 1120 н.п., с учетом длины исходного идентифициронан-ного фрагмента кДНК. Структурный анализ показал, что клоны LeR-1 (1120 н.п.) и VeR-l (306 н.п.) несут последовательности З'-области соответствующих генов.

СГ1ИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ 110 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Снеговая И.10., Долгилевич С.М., Тарабыкин B.C., Зарайский А.Г., Лукьянов С.А., Знойко С.Л., Микаэлян А.С., Миташов В.И. Идентификация новых генов и анализ их экспрессии в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов // Известия РАН, сер. биол., 1995, № 3, стр. 276-279.

2. Миташов В.И., Лукьянов С.А., Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Долгилевич С.М., Снеговая И.10., Знойко С.Л., Микаэлян А.С. Молекулярно-биологические подходы в исследованиях экспрессии генов в процессе регенерации // Известия РАН, сер. биол., 1995, № 3, стр. 280-284.

3. Миташов В.И., Маркитантова 10.В., Знойко С.Л. Экспрессия генов в процессе регенерации структур глаза и конечности у низших позвоночных животных // Известия РАН, сер. биол., 1995, № 4, стр. 403-411.

4. Mitashov V.I., Arsanto J.-P., Markitantova Yu.V., Thouveny Y. Remodeling processes during neural retina regeneration in adult newt urodeles: An immunocytochemical survey // Inter. J. Dev. Biol. 1995, № 39, P. 993-1003.

♦

ТЕЗИСЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Mitashov V.I., Arsanto J.-P., Markitantova Yu.V., Thouveny Y. Immunocytochemical study of spesific and glial proteins and extracellular matrix components during neural retina regeneration in the adult newts // Ontogenez. 1994. V. 25. №_4. p. 71-72.

2. Mitashov V.I., Kazanskaya O.V., Luk'yanov S.A., Dolgilevich S.M., Snegovaya I.U., Markitantova Yu.V., Znoiko S.L., Mikaelyan A.S., Gurskaya N.G. Genes expressed at the different stages of lens regeneration in the adult newt// Ontogenez. 1994. V. 25. № 4. P. 38-39.

3. Mitashov V.I., Kazanskaya O.V., Lukyanov S.A., Markitantova Yu.V., Dolgilevich S.M., Snegovaya I.Yu, Znoiko S.L., Mikaelyan A.S. and Gurskaya N.G. Identification and expression of the novel regeneration-specific genes in the newt lens regenerates // Wound Repair Regeneration. 1995. V. 3. P. 113 .

4. Markitantova Yu., Arsanto J.P., Thoveny Y., Mitashov V. Expression of specific and glial proteins and biological active factors during retinal regeneration in the adult newt // Wound Repair ard Regeneration// 1995. V. 3, № 1, p. 112.

5. Markitantova Yu.V., Arsanto J.-P., Kasanskaya O.V., Tarabykin V.S., Zaraisky A.G., Thouveny Y., Mitashov V.I. Expression pattern of

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркитантова, Юлия Владимировна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591. 596/599

МАРКИТАНТОВА Юлия Владимировна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРУСТАЛИКА И СЕТЧАТКИ У ХВОСТАТЫХ АМФИБИЙ.

специальность - 03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук

B.И. Миташов

кандидат биологических наук

C.А. Лукьянов

Москва - 1996

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................6

1.1. Предшествующий этап исследования регенерации................6

1.2. Модели регенерации..................................................................9

1.3. Молекулярно-биологические подходы к исследованию механизмов регенерации.........................................................18

1.4. Экспрессия специфических белков и генов в процессе регенерации конечности и хвоста у низших позвоночных животных..........................................................................27

1.4 а. Иммуноцитохимические исследования экспрессии специфических белков..................................................................27

1.4 б. Экспрессия гомеобокс-содержащих генов............................30

1.4 в. Экспрессия рецепторов ретиноевой кислоты.......................34

1.5. Экспрессия генов при регенерации хрусталика в системе in vivo и in vitro.................................................................39

1.5 а. Культивирование клеток пигментного эпителия на

эмбриональных стадиях развития. Экспрессия генов при формировании лентоидов...............................................41

1.6. Экспрессия специфических белков и генов при регенерации сетчатки в системе in vivo и in vitro......................48

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................65

Оборудование...........................................................................65

Реактивы и ферменты.............................................................65

Лабораторные животные и методы исследования................70

Клонирование кДНК..............................................................72

Дифференциальный скрининг...............................................78

Анализ дифференциальных клонов.......................................80

Получение амплифицированных библиотек кДНК

методом олиго(дА)-тейлирования 1-ой цепи кДНК............82

Эффективный метод получения амплифицированных библиотек кДНК дотированием 2-х цепочечной кДНК

с бимодальным олигонуклеотидным адаптером...................84

Анализ экспрессии нуклеотидных последовательностей генов с помощью ПЦР.....................................................87

Клонирование фрагмента кДНК в сторону 5'-области нуклеотидной последовательности LeR-1 с помощью

метода RACE-PCR..................................................................89

III. РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................................95

III. 1. Разработка нового эффективного метода получения библиотек кДНК из малых количеств суммарной

РНК, основанного на супрессионном эффекте ПЦР........95

III. 1 а. Получение амплифицированных библиотек кДНК

методом олиго(дА)-тейлирования 1-ой цепи кДНК........95

III. 1.6. Эффективный метод получения амплифицированных библиотек кДНК лигированием 2-х цепочечной кДНК с бимодальным олигонуклеотидным адаптером.................................................................................99

111.2. Дифференциальный скрининг обогащенных библиотек кДНК. Идентификация новых нуклеотидных последовательностей: LeR-1 и VeR-1.................................104

111.3. Структурный анализ кДНК клонов LeR-1 и VeR-1...........106

III. 4. Экспрессия идентифицированных нуклеотидных последовательностей в процессе регенерации тканей

глаза у взрослых тритонов...................................................108

III.4 а. Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-1 в процессе регенерации хрусталика и сетчатки в библиотеках кДНК, полученных методом

олиго(дА)-тейлирования 1-ой цепи кДНК..........................110

III.4 б. Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-1 в процессе регенерации хрусталика и сетчатки в библиотеках кДНК, полученных методом лигирования 2-х цепочечной кДНК с бимодальным олигонуклеотидным адаптером.................................112

III.4 в. Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-1 в интактных тканях и органах тритона...................................................................................119

111.5. Экспрессия нуклеотидных последовательностей LeR-1 и VeR-1 в процессе эмбрионального развития тритона...................................................................................122

111.6. Клонирование фрагмента кДНК нуклеотидной последовательности LeR-1 в сторону 5'- региона с использованием нового подхода 5'-RACE-PCR....................124

IV. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................129

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................147

ВЫВОДЫ...............................................................................149

ЛИТЕРАТУРА........................................................................151

ВВЕДЕНИЕ

Регенерация - одна из актуальных проблем в современной биологии развития. Основная задача в изучении регенерации -понять механизмы восстановительных процессов. Наиболее эффективный путь к решению этой проблемы - выявление и изучение структурных и функциональных аспектов экспрессии генов, контролирующих регенерационные процессы у представителей разных систематических групп животных (Brockes, 1994; Tabin, 1995; Bryant, Gardiner, 1994; Stocum, 1995; Миташов, 1996; Mitashov, 1996). Одной из немногих удачных моделей для изучения механизмов регенерации, является феномен трансдифференцировки клеток пигментного эпителия сетчатки в нейроны сетчатки, а также клеток пигментного эпителия дорсальной области радужки в клетки хрусталика у взрослых испанских тритонов Pleurodeles waltl, в то время как из вентральной области радужки хрусталик в норме не регенерирует (Reyer, 1977; Yamada, 1977; Строева, Миташов, 1970; Stroeva, Mitashov, 1981, 1983).

Цель данной работы состояла в выявлении и изучении нуклеотидных последовательностей генов, специфично экспрессирующихся в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых испанских тритонов Pleurodeles waltl, и модификации для этой цели метода конструирования библиотек кДНК на основе микроколичеств РНК. Поиск таких последовательностей проводился путем дифференциального скрининга полученнных в результате вычитающей гибридизации библиотек кДНК, обогащенных последовательностями, специфичными для мРНК, из

дорсальной и вентральной областей радужки 14-х суток регенерации. В ходе работы решались следующие задачи:

1. Разработка оптимального метода получения библиотек кДНК на основе малых количеств РНК из исследуемых тканей.

2. Поиск нуклеотидных последовательностей генов, экспрессирующихся в процессе регенерации хрусталика и сетчатки.

3. Структурный анализ идентифицированных нуклеотидных последовательностей.

4. Анализ экспрессии идентифицированных новых нуклеотидных последовательностей в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов.

5. Анализ экспрессии идентифицированных новых нуклеотидных последовательностей в интактных тканях и органах.

6. Анализ экспрессии идентифицированных новых нуклеотидных последовательностей в процессе эмбрионального развития тритона.

7. Получение полноразмерной копии идентифицированных последовательностей генов с использованием метода RACE-PCR.

В результате были выделены новые нуклеотидные последовательности, экспрессирующиеся в процессе регенерации хрусталика и сетчатки. Клон, выделенный из дорсальной области радужки, назван LeR-1 (Lens Regeneration), а клон из вентральной области - VeR-1 (Ventral Iris during Regeneration). Экспрессия идентифицированных нуклеотидных последовательностей обнаружена также в раннем развитии тритона.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Предшествующий этап исследования регенерации.

Многие из основных вопросов регенерации, на которые до сих пор не получены удовлетворительные ответы, были сформулированы на закате доменделевской эры в биологии Морганом и Дришем (Morgan, 1901; Driesch, 1908). Исследования регенерации со времени открытия этого явления в работах известных естествоиспытателей XVIII века Реомюра, Бонне, Блюменбаха, Трамбле, Спаланцани продолжаются свыше двухсот лет (Карлсон, 1986; Dinsmore, 1992; Динзмор, 1992). Регенера-ционные потенции у позвоночных животных выражены в разной степени. Наиболее яркими регенерационными потенциями обладают представители низших позвоночных животных хвостатые амфибии. У взрослых тритонов хорошо регенерируют конечность, хвост, хрусталик и сетчатка глаза, вследствие чего эти животные издавна являются излюбленным объектом исследований регенерации. Поэтому основные данные о клеточных событиях в процессе регенерации были получены на перечисленных выше моделях регенерации у тритонов. К настоящему времени с использованием ядерных и цитоплазматических маркеров установлено, что удаленный хрусталик регенерирует в результате трансдифференцировки клеток дорсальной области радужки в условиях in vivo или из клеток пигментного эпителия и сетчатки в условиях in vitro.

Регенерация сетчатки при ее удалении или повреждении происходит в результате трансдифференцировки клеток

пигментного эпителия сетчатки у взрослых тритонов, а также на эмбриональных стадиях развития у амфибий, рыб, птиц и млекопитающих. За период экспериментально-морфологических исследований накоплен огромный материал, посвященный анализу регенерации на разных моделях (Stone, 1957; Hasegawa, 1958; Лопашов, Строева, 1963; Миташов, 1968, 1976, 1980, 1990; Clayton, 1982; Stroeva and Mitashov, 1983; Okada 1983, 1991; Okada et al., 1986; Reyer, 1962, 1971, 1977; Keefe, 1973 a, b; Levine, 1975; Yamada, 1977; 1986, 1989; Moscona, 1986; McDevitt, 1989; Карлсон, 1986; Brockes et al., 1989; Dupin et al., 1991; Raymond, 1991; Eguchi, 1988, 1993; Hitchcock, Raymond, 1992; Park, Hollenberg, 1989, 1991, 1993; Geraudie et al., 1994, 1995; Reh, Pittack, 1995; Stocum, 1995).

Главная цель исследований в изучении регенерации -понять ее механизмы, открыть основной принцип наиболее просто объясняющий закономерности восстановительного процесса. Несмотря на многие попытки, цель эта не достигнута. На разных моделях регенерации к настоящему времени накоплена достаточно полная информация о закономерностях протекания последовательных событий на цитологическом, ультраструктурном и биохимическом уровнях исследований. Значительная часть полученных данных, вследствие преимущественного использования экспериментально-морфологических подходов имеют описательный характер. В ряде детальных работ были предприняты подробные описания общей картины регенерации на разных моделях (Карлсон, 1986). Однако, реконструкция истинных последовательных событий по серии статичных картин затруднительна. В результате, общая картина регенерации разбита

на многочисленные исследования, направленные на то, чтобы объяснить частные явления в различных структурах и у разных видов животных. И хотя полученные на этом уровне исследования данные оказались весьма полезными для понимания определенных аспектов регенерации и морфогенеза, они не решили основные, и более того, породили новые вопросы, касающиеся поведения клеток, без ответа на которые понимания механизмов регенерации не может быть достигнуто. Что заставляет клетку выбирать тот или иной путь развития, иными словами, каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе выбора судьбы клеток? Какая цепь событий из выявленных морфологическими и цитологическими методами приводит к инициации регенерации? Как соотносятся процессы регенерации и развития? Регенерация настолько сложный процесс, включающий каскад реакций, что объяснить это явление регуляцией одного единственного вариабельного фактора кажется с биологических позиций несколько наивным.

Наиболее существенные достижения в изучении механизмов регенерации в последнее десятилетие связаны с внедрением иммунохимических методов, позволивших с использованием моно-и поликлональных антител маркировать клеточные популяции в сложных структурах регенератов и изучить клеточные источники регенерации, закономерности проявления и смены специфических синтезов, эффекты факторов межклеточного матрикса и биологически активных факторов в конкретных событиях в процессе регенерации хвоста, конечности и структур глаза у низших позвоночных животных (Kintner, Brockes, 1984, 1985; Brockes, 1987, 1989, 1992; Brockes et al., 1989; Maden, 1982, 1984, Maden et al.,

1989, Maden and Scadding, 1994; Stocum, 1989, 1991, 1995; Стокум, Миташов, 1990; Григорян и др., 1990; Григорян, Антон, 1993; Giguere et al., 1987, 1989; Ragsdale et al., 1989; Fekete, Brockes, 1987; Ferretti et al., 1991; Arsanto et al., 1990; Onda et al., 1990, 1991; Yang et al., 1992; Ortiz et al., 1992; Bryant, Gardiner, 1994; Poulin et al., 1993; Mitashov et al., 1993).

Задача данного обзора - рассмотреть результаты исследований последних лет по изучению экспрессии генов в процессе регенерации хрусталика, сетчатки и конечности у низших позвоночных животных, полученных с использованием разных молекулярно-биологических подходов и показать значимость этого направления исследований для понимания механизмов регенерации. Следует отметить, что проведенные исследования пока не имеют систематического характера, а относятся они к некоторым стадиям регенерации исследуемых моделей в условиях in vivo или in vitro.

1.2. Модели регенерации.

Основными моделями исследования в нашей работе являются регенерация хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов. Глаз у всех позвоночных имеет типичное строение (Рис. 1). В составе сетчатки у взрослых тритонов различают следующие слои в направлении от базальной поверхности сетчатки, к апикальной поверхности: слой ганглиозных клеток, внутренний сетчатый слой, внутренний ядерный слой, наружный сетчатый слой, наружный ядерный слой, фоторецепторный слой палочек и колбочек,

Рис. 1. Строение глаза взрослого тритона.

(поперечный срез, 1 мкм) х 40. ( по: Леуег, 1977).

вв - верхнее веко; нв - нижнее веко; р - роговица; др- дорсальная

радужка; х - хрусталик; с - сетчатка; пэ - пигментный эпителий; со

- сосудистая оболочка; ск - склера.

который контактирует с однорядным слоем интенсивно пигментированных эпителиальных клеток, названных ретинальным пигментным эпителием (Рис. 2). В периферической области глаза локализованы малодифференцированные клетки, являющиеся клеточным источником роста глаза в течении всей жизни животных. Хрусталик у представителей хвостатых амфибий округлый, а у бесхвостых слегка уплощенный. Хрусталик у взрослых тритонов имеет строение, типичное для всех позвоночных животных. Он образован радиально расположенными хрусталиковыми волокнами (fibra lentis) и заключен в капсулу {capsula lentis), представляющую собой утолщенную базальную мембрану. У взрослых лягушек от экваториальной зоны капсулы отходят тонкие волокна зонулы, образующие ресничный поясок (.zonula ciliaris) и прикрепляющиеся в периферической части глаза к цилиарному телу (Ганиева, Дабагян, 1982). У тритонов хрусталик прикреплен к серповидному отростку, содержащему сократимые компоненты., который крепится к вентральной радужке. Радужка состоит из наружного и внутреннего листков. Желеобразное стекловидное тело заполняет пространство между волокнами зонулы, хрусталиком и сетчаткой.

Регенерация хрусталика из пигментного эпителия радужки и сетчатки - из пигментного эпителия сетчатки у хвостатых амфибий являются наиболее интересными моделями трансдифференцировки клеток, поскольку в нормальном эмбриогенезе хрусталик и сетчатка из пигментного эпителия никогда не образуются (Sato, 1951; Reyer, 1977; Yamada, 1977; Stroeva, Mitashov, 1983) (Рис. 3). Источником регенерации хрусталика у взрослых испанских

■■■•Я*

Рис. 2. Сетчатка взрослого тритона, вом - внутренняя ограничивающая мембрана; нв - слой нервных волокон; гк - слой ганглиозных клеток; всс -внутренний сетчатый слой; вяс - внутренний ядерный слой; нее - наружный сетчатый слой; няс - наружный ядерный слой; ном - наружная ограничивающая мембрана; ф - фоторецепторы: слой палочек и колбочек; пэ -пигментный эпителий со - сосудистая оболочка.

Рис. 3. Схема регенерации хрусталика и сетчатки. I - периферическая область глаза; II - центральная область дна глаза; 1 - зачаток сетчатки, образующийся за счет пролиферации клеток ростовой зоны глаза (комплекса pars ciliaris-ora serrata); 2 -зачаток сетчатки, образующийся за счет пролиферации клеток пигментного эпителия; 3 - ретинальный пигментный эпителий; 4 -клетки пигментного эпителия радужки; 5 - зачаток хрусталика, сформированный за счет пролиферации клеток зрачковой области внутреннего и наружного листков дорсальной радужки.

тритонов (Pleurodeles waltl) являются клетки дорсальной области радужки (обзоры: Reyer, 1962; Stroeva, Mitashov, 1983; Миташов 1990). В процессе регенерации хрусталика клетки дорсальной области радужки постепенно депигментируются, начинают активно пролиферировать и продуцировать специфические белки - кристал-лины, что приводит к восстановлению удаленного хрусталика. Вентральная область радужки в норме не способна к такой регенерации, однако при некоторых экспериментальных воздействиях клетки этой области формируют хрусталикоподобные структуры - лентоиды и даже полноценные хрусталики (Eguchi et al., 1974, 1979, 1988, 1993; Eguchi and Iton 1982; Iton and Eguchi, 1986 a, 6; McDevitt, Borst, 1987; Imokawa et al., 1992 a, 6; Agata et al., 1986, 1993). Таким образом, клетки вентральной и дорсальной областей радужки, неотличимые по морфологии и имеющие общее эктодермальное происхождение, реализуют в ходе регенерации хрусталика разные программы, п�