Селективная супрессия полимеразной цепной реакции - новый подход к анализу структуры и экспрессии сложных геномов

Лукьянов, Сергей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Селективная супрессия полимеразной цепной реакции - новый подход к анализу структуры и экспрессии сложных геномов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Селективная супрессия полимеразной цепной реакции - новый подход к анализу структуры и экспрессии сложных геномов"

_ российская академия наук

О5

о/

Сгч

институт биоорганической химии

о" ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

-Г

На правах рукописи

лукьянов Сергей Анатольевич

СЕЛЕКТИВНАЯ СУПРЕССИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ -НОВЫЙ ПОДХОД К АНАЛИЗУ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ СЛОЖНЫХ

ГЕНОМОВ

03.00.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

в форме научного доклада

Москва, 1999

Работа выполнена в Институте Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Научный консультант:

доктор химических наук, академик РАН Е.Д. Свердлов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Ю.А. Берлин

доктор химических наук, член-корр. РАН Л.И. Корочкин

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский

Ведущая организация:

Институт биологии развития РАН

Защита состоится "22" декабря 1999 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Инстит; биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адре 117871 ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической хим им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "Э]" 1/1р 1999 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Важнейшие процессы, происходящие в различных биологических системах (клеточная дифференшровка и морфогенез в ходе эмбрионального развития и регенерации, программируемая гибель клеток или их опухолевое перерождение и т.д.) находятся под контролем специфических регуляторных генов. Для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе биологических процессов, необходимо выявление и изучение генов, вовлеченных в регуляцию этих процессов. В настоящее время большинство методов молекулярной биологии, направленных на решение этих задач, основаны на использовании полимеразной цепной реакции, сделавшей доступным работу с малыми количествами биологического материала. Однако для применения ПЦР необходимо знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой ДНК. И если методики амплификации известных последовательностей разработаны очень хорошо, то применение ПЦР в случаях, когда нуклеотидная последовательность частично или полностью неизвестна, наталкивается на серьезные проблемы, особенно в вопросах искусственного присоединения к ДНК олигонуклеотидных последовательностей, могущих служить местом посадки праймера в ПЦР, а так же во избежание "фоновой" амплификации (во многих случаях количество "балластной" ДНК на несколько порядков превышает количество "целевой" ДНК).

Цель работы. Целью данной работы являлось создание высокоэффективных методов работы со сложными образцами ДНК, позволяющими выявлять и исследовать новые, функционально важные гены. В ходе исследования решались следующие задачи: изучение эффекта селективной супрессии ПЦР (ССП) и оптимизация параметров, влияющих на эффективность ССП, разработка ряда новых методов основанных на

эффекте ССП, таких как метод создания библиотек кДНК из малых количеств клеток, методы выявления дифференциально экспрессирующихся генов путем прямого сравнения сложных популяций мРНК, методы получения полноразмерных копий кДНК и выявления регуляторных областей генов, метод создания нормализованных библиотек кДНК, метод клонирования ДНК in vitro и некоторых других.

Предложенные методы были использованы для исследования молекулярно-генетических основ ряда важных биологических процессов, включая тканеспецифическую экспрессию генов, изменение метастатического потенциала опухолевых клеток, изменение экспрессии генов в ходе репаративной регенерации у планарий и регенерации хрусталика глаза у тритонов, раннего эмбрионального развития нервной системы у позвоночных животных н некоторые другие.

Научная новизна и практическая ценность работы. Описанный в настоящей работе эффект селективной супрессии ПЦР позволил разработать ряд высокоэффективных взаимодополняющих методов выявления и анализа новых функционально важных последовательностей ДНК и РНК при полном или частичном отсутствии информации об их первичной структуре. ССП-эффект практически полностью ингибирует амплификацию нежелательной фракции ДНК, сохраняя экспоненциальный характер амплификации целевых последовательностей. Это позволяет отказаться от трудоемких и низкоэффективных методов физической сепарации различных фракций ДНК и делает разработанные на основе ССП методы более удобными, быстрыми и воспроизводимыми.

Описанные в данной работе методы в настоящее время используются для решения широкого круга задач молекулярной биологии по изучению геномов и продуктов их экспрессии. Например, использование предложенных методов позволило нам выявить и клонировать полноразмерные кДНК копии ряда функционально важных генетических последовательностей, вовлеченных в регуляцию регенерации у планарий. Анализ экспрессии выявленных генов позволил впервые продемонстрировать индукционные взаимодействия в теле планарий при регенерации. Предложенные в настоящей работе методы поиска дифференциально экспрессирующихся генов могут применяться для выявления генов, зменения в экспрессии которых связаны с развитием различных

заболеваний. Полученная информация о структуре таких генов может быть использована для создания лекарственных препаратов, обладающих высокой специфичностью действия.

Выявление новых флуоресцентных белков с помощью описанных в работе методов открывает новые перспективы развития систем анализа экспрессии генов in vivo, что имеет важное практическое значение для биотехнологии и медицины.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VIII Международном симпозиуме по клеточной дифференцировке (Хиросима, 1994), Русско-немецком симпозиуме по молекулярной и медицинской генетике (Кельн, 1995), Международном форуме по регенерации (Миннеаполь, 1995), Конгрессе Европейского общества по биологии развития (Тулуза, 1995), V Всеросийской конференции "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1995), 24-том Съезде Европейского биохимического общества (Барселона, 1996), Международной конференции по регенерации (Кельн, 1997).

Циклы работ по созданию методов поиска и анализа дифференциально экспрессирующихся генов и по исследованию регенерации хрусталика глаза у тритона, в которых были представлены отдельные этапы этого исследования, получили премии МАИК "Наука" за 1996 год, а так же журнала Биоорганическая химия за 1996 и 1998 годы.

Публикации.

Диссертация обобщает данные 40 основных публикаций.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений исследований, разработке и экспериментальной проверке всех предложенных в настоящей работе методов, обсуждении и оформлении полученных результатов в совместных исследованиях с сотрудниками ИБХ РАН, ИБР РАН, ИЭМЖ РАН, института Биохимии РАН, Кардиологического Центра, Центра развития биотехнологии Бостонского университета (США) и Clontech Laboratories Inc. (США).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Эффект селективной супрессии ПЦР

Предложенные в данной работе методики основаны на эффекте селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ССП-эффекте). ССП-эффект состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертироваными концевыми повторами (ГОСП) в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП (рис. 1) [19]. Этот факт объясняется следующим образом. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация ИКП (самоотжиг) происходит раньше, чем отжиг праймера, поскольку температура самоотжига ИКП выше температуры отжига праймера. Только небольшая часть молекул ДНК достигает температуры отжига праймера без формирования структуры типа "сковородка", закрывающей сайт посадки праймера. Те молекулы, на которые праймер все-таки отжегся, после синтеза ДНК восстанавливают исходную структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах ПЦР. Степень ингибирования амплификации зависит от многих параметров, из которых основными являются следующие:

1. Различия в температурах отжига ИКП и амплификационного праймера Соотношение длины и ОС-состава ИКП в целом и последовательности, соответствующей структуре праймера существенно влияют на эффективность ССП. Оптимальным представляется использование ИКП длиной 40-50 п.о. и повышенным содержанием ОС-пар во внутренней (супрессионной) части ИКП и амплификационного праймера, соответствующего внешней половине ИКП (длиной 20-25 о.).

2. Длина молекулы ДНК, несущей ИКП. Чем длиннее молекула, тем меньше вероятность встречи и внутримолекулярной гибридизации ИКП (меньше концентрация концов молекулы относительно друг друга). Таким образом, ССП-эффект не ингибирует (или слабо ингибирует) амплификацию очень длинных молекул ДНК (пороговая длина зависит от конкретных условий, обычно она составляет 6-8 т.п.о.).

3. Концентрация праймера в ПЦР. ССП-эффект зависит от конкуренции между внутримолекулярной гибридизацией ИКП и отжигом праймера, используемого для

ПЦР. Поэтому ССП происходит более эффективно при низких концентрациях праймера.

ССП-эффект может быть использован для подавления амплификации нежелательной фракции ДНК. Для этого в структуру ДНК необходимо ввести подходящие длинные ИКП - так называемые супрессионные последовательности.

ИКП

Следующий цикл ПЦР

ИКП

3' 51

Структура типа

I* м

сковородка

охлаждение

▼

самоотжиг

отжиг праймера

Следующий цикл ПЦР

синтез ДНК

Рис. 1. Схема селективной супрессии ПЦР.

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптора (ИКП), соответствующая (ишши)-праймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть супрессионного адаптора.

2. Методы, разработанные на основе ССП 2.1. Получение образцов ДНК, содержащих ИКП

Разработано два основных способа присоединения супрессионых последовательностей к молекулам ДНК [35].

1. Лигирование двухцепочечных фрагментов ДНК с двухцепочечным супрессионным адаптером.

2. ПЦР с длинным (супрессионным) праймером, З'-концевая часть которого повторяет последовательность, уже имеющуюся в структуре фрагментов ДНК.

Первый способ является практически универсальным, поскольку не требует наличия каких-либо искусственно введенных последовательностей в составе молекул ДНК. Например, образец ДНК для лигирования может быть получен в результате синтеза двухцепочечной кДНК, а также в результате обработки кДНК или геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. Очевидно, оптимальным является наличие фрагментов ДНК. с тупыми (а не с липкими) концами, поскольку в этом случае возможно универсальное использование супрессионных адаптеров, имеющих тупой конец для лигирования. Второй способ удобен в тех случаях, когда образец ДНК уже подвергался амплификации и имеет в составе молекул известные последовательности. Примером этого могут служить образцы кДНК, полученные с помощью гомополимерного тэйлирования первой цепи кДНК и последующей ПЦР с Т-праймером или С- и Т-праймерами [2,8].

2.1.1. Получение содержащей ИКП кДНК с помощью лигирования ДНК с супрессионным адаптером (рис2А)

Первым этапом является синтез двухцепочечной кДНК на основе тотальной или поли(А)+ РНК с помощью стандартных технологий. В качестве затравки для синтеза первой цепи берегся Т-праймер. Использование БирегБсир! ревертазы дает возможность получать близкую к полноразмерной кДНК.

лигирования. Поскольку олигонуклеотиды не фосфорилированы, фосфодиэфирную связь образует только длинный олигонуклеотид, который лигируется своим 3'-концом к 5'-концу каждой цепи кДНК. После достройки З'-концов дуплексов молекулы кДНК оказываются симметрично фланкированы последовательностью адаптера.

Полученный таким образом образец кДНК (са-кДНК, Супрессионный Адаптер-кДНК) может быть использован для создания библиотек на основе черезвычайно малых количеств исходного биологического материала, а так же для быстрого клонирования полноразмерных кДНК.

2.2. Получение библиотек кДНК на основе малого количества биологического материала

Для широкого круга задач, связанных с изучением функциональных и структурных аспектов экспрессии генов, необходимы библиотеки кДНК. Методики их получения из относительно больших количеств изучаемого биологического материала были детально разработаны уже давно и сейчас входят в разряд рутинных и повсеместно используемых генно-инженерных технологий. Однако в случаях ограниченного количества биологического материала и, следовательно, невозможности выделения достаточного количества поли(А)+ РНК (на современном этапе развития молекулярной биологии таких случаев большинство) классические методы оказываются неприменимы. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилось основанием для развития новых методов получения библиотек кДНК из малых количеств тотальной РНК. Для использования ПЦР, однако, необходимо знание хотя бы части нуклеотидной последовательности амплифицирумой ДНК. Наличие в мРНК подавляющего большинства генов поли(А) последовательности дает возможность проводить ПЦР с олиго(<1Т)-содержащего праймера (Т-праймера). Для экспоненциальности амплификации необходим второй праймер, последовательность для отжига которого приходится присоединять к молекулам кДНК искусственно. На сегодняшний день описано несколько методов введения такой последовательности:

1. присоединение гомополимерной последовательности к З'-концу первой цепи кДНК с помощью концевой нуклеотидилтрансферазы (тэйлирование);

2. лигирование синтетического одноцепочечного олигонухлеотида к З'-концу первой цепи кДНК (Dumas 1991) или к 5'-концу мРНК (Liu 1993) с помощью РНК

лигазы фага Т4;

3. лигирование двухцепочечного олигонуклеотидного адаптера с двуцепочечной кДНК с использованием ДНК лигазы фага Т4.

Лигирование двухцепочечных молекул с помощью Т4 ДНК лигазы является более эффективным и воспроизводимым подходом, чем тэйлирование- или лигирование одноцепочечных субстратов с использованием Т4 РНК лигазы. Однако метод, основанный на использовании Т4 ДНК лигазы имеет очень существенный недостаток: он позволяет работать только с поли(А)+ РНК. В том случае, если синтез кДНК ведется на основе суммарной РНК. даже использование Т-праймера в качестве затравки не предотвращает синтеза большого избытка фоновой кДНК на матрице рибосомальной РНК.

Предложенный в настоящей работе метод основан на лигировании супрессионного адаптера к двухцепочечной кДНК и последующей ПЦР-амплификации кДНК с использованием Т-праймера и праймера. соответствующего внешней половине адаптера (Out-праймер, Out - от англ. "outer", внешний). Схема предлагаемой процедуры получения библиотек кДНК приведена на рис.2.

Следует отметить, что при синтезе са-кДНК в случае тотальной РНК кДНК синтезируется не только на матрице поли(А)+ РНК, но и в значительной мере на основе рибосомальной РНК за счет неизбежно присутствующих в образце РНК коротких фрагментов РНК и ДНК, выступающих в роли затравок. Однако после лигирования пеевдодв\ цепочечного адаптера и достройки концов, такая '"фоновая" кДНК оказывается фланкирована ИКП.

Далее са-кДНК амплифицируется в ПЦР с Т-праймеро.м и праймером, идентичным внешним 22 нуклеотидам адаптера. В ходе такой ПЦР происходит селективная амплификация фракции кДНК, имеющей в своей структуре Т-праймер. Ингибирование амплификации остальной кДНК, несущей на обоих концах молекул последовательность адаптера, достигается за счет ССП. Таким образом, оказывается возможным получать библиотеки кДНК на основе малых количеств суммарной РНК без выделения фракции поли(А)+- РНК.

Использование системы "long and accurate" ПЦР позволяет получать близкие к полноразмерным библиотеки кДНК, а также значительно снижать количество

А.

ро1у А (+) фракция

РНК ЛЛ^Л^ЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛ ФФФФ

ро1у А (-) фракция

клнк:

сиктез 1 иепи кДНК синтез 2 цепи кДНК

пигирование супрессионных адаптеров

Т-праймер

достройка выступающих концов кДНК

атгп гпп

Б.

са

кДНК|

ПЦР с Т- >=э) и СМ $хп) праймерами

экспоненциальная амплификация

нет амплификации

Рис.2. Схема получения образцов кДНК на основе суммарной РНК с поношью ССП. А.- получение кДНК, содержащей ИКП (са-кЛНК). Б. -приготовление кДНК библиотек из малого количества биологического материала.

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптора (ИКП), соответствующая СМ-праймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть супрессионного адаптора. Белый прямоугольник- Т-праймер и комплементарная ему последовательность.

нуклеотидных замен в ходе ПЦР.

Возможности предлагаемой методики были продемонстрированы на модельной системе, в качестве которой была использована тотальная РНК скелетной мышцы человека. Было показано, что предложенный метод позволяет получать близкие к полноразмерным репрезентативные библиотеки кДНК из малых (10-100 нг) количеств суммарной РНК, по качеству не уступающие библиотекам, получаемым классическими методами из 5-10 мкг поли(А)+ РНК [21]. В дальнейшем библиотеки кДНК, полученные указанным образом, успешно использовались нами для выявления и анализа функционально важных экспрессирующихся последовательностей в различных биологических системах [3,4,5,7,22,25,31].

2.3. Метод амплификации 5' и 3' концевых фрагментов кДНК

Одной из наиболее важных и технически трудных задач при характеризации генов является получение полноразмерных кДНК. Традиционные методы выявления генетических последовательностей, такие как скрининг библиотек кДНК, клонирование генов, относящихся к консервативным семействам, с помощью ПЦР и вырожденных олигонуклеотидных праймеров, идентификация дифференциально экспрессирующихся генов с помощью дифференциального дисплея мРНК или вычитающей гибридизации кДНК, обычно позволяют идентифицировать только фрагмент последовательности кДНК. Для быстрого и эффективного клонирования полноразмерных кДНК (на основе имеющейся у исследователя информации о структуре фрагмента кДНК) в последние годы был предложен целый ряд методов для in vitro амплификации концов кДНК под общим названием Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). Большинство описанных в литературе методов RACE основано на введении на 3' конец первой цепи кДНК дополнительных нуклеотидных последовательностей, служащих в дальнейшем сайтами отжига для праймеров в ПЦР. Однако проблема подавления амплификации неспецифических последовательностей при использовании RACE стратегии для малопредставленных генов является еще более сложной, чем при амплификации поли(А)+ РНК фракции при получении библиотек кДНК. Использование ССП-эффекта позволяет преодолеть это затруднение. Для амплификации фланкирующих последовательностей полноразмерных кДНК образец са-кДНК подвергается ПЦР-амплификации с Out-праймером и специфическим праймером (сконструированным на

известная

<1в кДНК последовательность

пшшши-1-1-■■ешш шпшши-■ншш

пшф фгз

I ПЦР с праймерами I

| тш$> и |

ШЛИ—) щшшши^. )

экспоненциальная амплификация супрессия амплификации

Рис. 3. Схема метола быстрой амплификации 5'- и 3'- концевых фрагментов ДНК.

Вертикально заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптера, соответствующая СМ-праймеру (заштрихованная стрелка) в ПЦР, и комплементарная ей послеловательность. Черный прямоугольник - внутренняя часть адаптера и комплементарная ей последовательность. Белый прямоугольник - известная послеловательность ДНК. Белая стрелка - специфический праймер.

основе уже известной последовательности изучаемого гена). При этом селективно амплифицируются только молекулы, содержащие сайт для отжига специфического праймера, т.е. 5'- или З'-концевые (в зависимости от направления специфического праймера) последовательности интересующего гена. Амплификация молекул, не содержащих сайта для отжига специфического праймера, подавляется, благодаря ССП-эффекту (рис.3).

Эффективность описанного метода была проверена в модельных экспериментах на уже известных генах (рис.4) [10,37]. Метод был также успешно использован для клонирования полноразмерных кДНК копий ряда выявленных нами генов [7,16,17,25,31] и в настоящее время широко применяется во многих российских и зарубежных лабораториях.

poly A1-RNA

total RNA

Рис. 4. 5'- и 3'- RACE актина трансферннового рецептора (TFR) с использованием полиА(+) и тотальной РНК в качестве матрицы лля синтеза кДНК.

Лля полиА(+) РНК было сделано 25 циклов П1-1Р, для тотальной РНК -27 циклов ПЦР. М - маркер (lkb ladder, Life Tech.); 1,6 - продукт ПЦР с использованием одного Out-праймера (контроль); 2-5,7-10 -продукты ПЦР с использованием Out и специфических праймеров:2,7 - 5'-RACE актина 3,8 - З'-RACE актина; 4,9 - 5'-RACE TFR; 5,10- З'-RACE TFR.

2.4. Метод выделения промоторных участков генов путем прямой амплификации из геномной ДНК

Анализ геномной организации выделенных последовательностей и клонирование регуляторных областей генов является важной задачей при структурно-функциональном анализе этих генов, однако, существующие методы прогулки по хромосоме с использованием ПЦР достаточно трудоемки и неэффективны. Использование ССП-эффекта и системы "long and accurate" ПЦР ведет к существенному упрощению метода и повышению его чувствительности.

Для получения образца ДНК, содержащего ИКП, геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции так, чтобы получить фрагменты с тупыми концами, и лигируют полученный образец с псевдодвуцепочечным адаптером. После достройки З'-концов дуплексов молекул ДНК все полученные фрагменты содержат ИКП. Выделение регуляторных областей интересующего гена производится в ходе дальнейших ПЦР полученного образца ДНК с использованием специфических праймеров по той же схеме, что и выделение полноразмерных кДНК в ходе описанной выше процедуры RACE.

Для подтверждения эффективности предложенной технологии прогулки по хромосоме нами была клонирована промоторная зона гена интерлекина IL-ip мыши (Рис 5) [6]. Метод был так же использован при клонировании гена, кодирующего Л-

kb M 1 2 3 i 5 M

0.5-

4.03.0" 1.6" l.o-

Рис. 5. Результаты амплификации промоторной зоны гена

IL-10 мыши.

Амплифицированный продукт был получен в ходе двух последовательных "long and accurate" ПЦР (34 и 20 циклов) с использованием Out - праймера и двух последовательных специфических праймеров. В качестве матрицы использовалась геномная ЛНК, обработанная различными эндонуклеазами рестрикции: 1 - EcoR V; 2 - Seal; 3 - Dral; 4-PuuII; 5-SspI; M - маркер (1 kb ladder).

латрокрустотоксин из ядовитых желез паука каракурта [39].

2.5. Методы выявления дифференциально экспрессирующихся генов

Для понимания молекулярных механизмов биологических процессов необходимо выявление и изучение генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе этих процессов. В основе методов идентификации таких генов лежит выявление молекул мРНК, по-разному представленных в тех или иных тканях и на разных стадиях биологического процесса. Идентификация изменений в составе и содержании клеточной мРНК может осуществляться несколькими способами. В настоящее время наибольшее распространение получили две стратегии - вычитающая гибридизация и дифференциальный дисплей мРНК [32].

2.5.1. Дифференциальный дисплей.

Техника дифференциального дисплея мРНК, основанная на использовании короткого олигонуклеотидного праймера, имеющего низкую температуру отжига и способного вести ПЦР-амплификацию ограниченного пула фрагментов кДНК, была предложена в 1992 году Liang и Pardee и до сих пор весьма популярна при поиске дифференциально экспрессирующихся генов. Однако, использование праймеров произвольной структуры делает невозможным проведение систематического сравнения

анализируемых образцов по всем видам мРНК. Кроме того, использование олигонуклеотидных праймеров с низкой температурой отжига сопровождается неспецифической амплификацией и приводит к многочисленным артефактам. Принципиально другой подход, ориентированный на систематическое сравнение образцов по всем видам мРНК и основанный на разделении З'-концевых рестриктных фрагментов кДНК, был предложен Ивановой и Белявским в 1995 году. К недостаткам этого подхода можно отнести его ограниченную чувствительность и трудоемкость процедуры.

Предлагаемый в настоящей работе метод Упорядоченного Дифференциального Дисплея мРНК (УДД) также основан на анализе З'-концевых рестриктных фрагментов кДНК. Однако в предлагаемой нами технологии отбор этих фрагментов осуществляется не с помощью физической сепарации, а в результате ПЦР, в ходе которой селективно амплифицируются только З'-концевые фрагменты кДНК, что ведет к существенному упрощению метода и повышает его чувствительность.

Последовательность экспериментальных процедур УДД схематически представлена на рис.6. Двуцепочечная кДНК подвергается обработке определенной эндонуклеазой рестрикции. Выбор эндонуклеазы определяется следующими условиями: она должна опознавать сайт, который встречается хотя бы один раз почти во всех последовательностях кДНК, и образовывать фрагменты кДНК с тупыми концами. Затем фрагменты кДНК лигируются с супрессионным псевдодвухцепочечным адаптером. В результате достройки 3'-концов ДНК все фрагменты кДНК, за исключением содержащих последовательность Т-праймера концевых фрагментов, соответствующих 3'-концевым последовательностям мРНК, оказываются фланкированными с обеих сторон ИКП.

На следующем этапе проводится избирательная амплификация З'-концевых фрагментов кДНК в ходе ПЦР с Т-праймером и Ош-праймером. В результате каждый вид мРНК оказывается представленным в образце единственным 3'-концевым фрагментом кДНК характерной длины.

концевых фрагментов кДНК на субпопуляции, содержащие не более 150-200 индивидуальных фрагментов кДНК. Это достигается путем "прореживающей амплификации" полученных образцов кДНК в ПЦР с двумя заглубленными на два дополнительных основания со стороны З'-конца праймерами - ЕТ-праимером (Extended Т-праимер) и EIn-праПмером (In от английского Inner, внутренний праймер), соответствующим внутренним 22 нуклеотидам адаптера. Существует 16 вариантов

кДНК

обработка энлонуклеазой рестрикции

лигирование адаптеров

ПЦР с праймерами нет амплификации

экспоненциальная амплификация

ПЦР с

заглубленными праймерами

иш-XlYl

анализ на ПААГ

Рис.6. Схема упорядоченного дифференциального дисплея (УДД).

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптера (ИКП), соответствующая ОиЬпраймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть адаптора, соответствующая 1п-праймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Белый прямоугольник - Т-праймер и комплементарная ему последовательность.

1==>ХУ3' ,.

□rcD-Xl Y1

- ЕТ-праймер

- Е1п-праймер

заглубления для праймера Ein и 12 - для праймера ET (4 праймера ET-tn, где "п" -любое нуклеотидное основание, очевидно, нефункциональны и исключены из рассмотрения).

Рис. 7. Выявление с помощью метола УДД последовательностей, дифференциально распределенных влоль передне-задней оси тела планарии.

А. - на диаграмме показаны зоны на которые была разрезана планария. Полученные фрагменты тела были использованы для выделения тотальной РНК и приготовления на ее основе образцов для УДД. Б,- Радиоавтограф полиакриламидного геля продуктов ПЦР с тремя комбинациями заглубленных праймеров (ET и Ein). Номера дорожек (1-6) соответствуют зонам тела планарии на диаграмме А. Дифференциальные полосы помечены стрелками.

Таким образом, существует 192 возможные комбинации заглубленных праймеров (16x12), причем любое из сочетаний теоретически способно амплифицировать только небольшую часть пула 3'-концевых фрагментов кДНК. Если предположить, что в анализируемом образце присутствует 10 000-20 000 различных типов мРНК, в ходе ПЦР с каждой комбинацией заглубленных праймеров будет амплифицироваться примерно 100-200 различных фрагментов. Такой продукт ПЦР может быть разделен по длинам на секвенсовом геле. Перебирая возможные сочетания заглубленных праймеров, можно исследовать весь пул 3 '-концевых фрагментов кДНК.

Все получаемые с помощью УДД фрагменты кДНК оказываются асимметрично фланкированы последовательностями адаптера и Т-праймера и могут бьггь легко реамплифицированы после элюции из геля.

Эффективность метода УДД была продемонстрирована на примере выявления генетических последовательностей, дифференциально экспрессирующихся вдоль переднезадней оси тела планарии D. tigrina (рис.7). Было идентифицировано пять таких последовательностей, их дифференциальный характер экспрессии был подтвержден с помощью RT-ПЦР и whole mount in situ гибридизации [24,34].

Аналогичная УДД технология - направленный геномный дифференциальный дисплей - была разработана для анализа полиморфизма геномов в локусах, содержащих повторяющиеся элементы [36,38].

2.5.2. Вычитающая гибридизация кДНК

Вычитающая гибридизация кДНК представляет собой процесс гибридизации двух образцов кДНК, называемых драйвером и трейсером, в результате которой общие для двух образцов транскрипты подлежат удалению (вычитаются). Вычитающую гибридизацию проводят для выделения дифференциально экспрессирующихся последовательностей (мишеней), специфических для кДНК трейсера, но отсутствующих в драйверной кДНК (или содержащихся в драйвере на низком уровне). Вычитающая гибридизация включает в себя гибридизацию трейсера с избытком драйвера и последующее отделение фракции гибридных молекул от фракции молекул мишени.

В литературе представлен широкий спектр различных модификаций метода вычитающей гибридизации, применение которых привело к открытию значительного

числа функционально важных генов, участвующих в процессах эмбрионального развития, клеточной дифференцировки, опухолевой трансформации и метастазирования. Однако низкая репрезентативность получаемых с помощью этих методик "вычтенных" библиотек, небольшие степени обогащений, трудоемкость и многостадийность процедур очистки обогащенной фракции не позволяли использовать существующие методы для поиска генов, имеющих дифференциальный характер экспрессии, в целом ряде интересных биологических систем. Наибольшие трудности возникали при работе с ограниченным количеством биологического материала и при идентификации генов, транскрипты которых содержатся в клетке в небольшом количестве (от 1 до 10 копий на клетку).

Разработанная нами процедура вычитающей гибридизации кДНК позволяет преодолеть проблему поиска редких транскриптов путем введения в протокол стадии выравнивания (нормализации) концентрации различных транскриптов в исследуемом образце кДНК. Это достигается благодаря использованию ССП-эффекта, поэтому метод получил название Suppression Subtractive Hybridization (SSH).

Принцип метода SSH схематически представлен на рис. 8. В качестве трейсера и драйвера используется двуцепочечная кДНК, расщепленная эндонуклеазой рестрикции, генерирующей тупые концы. Трейсер разделяется на два образца (А и Б), к каждому из которых присоединяют 5'-концевые последовательности двух различных супрессионных адаптеров. К каждому образцу трейсера добавляют избыток драйверной кДНК и после денатурации проводят первую стадию вычитающей гибридизации в двух отдельных пробирках. На второй стадии вычитания образцы А и Б смешивают и гибридизуют совместно.

На первой стадии гибридизации трейсерных образцов с драйвером (молекулы драйвера не несут супрессионного адаптера) образуются несколько типов молекул: одноцепочечный и двуцепочечный драйвер, одноцепочечный трейсер, а также гетерогибриды трейсер-драйвер, образованные общими для образцов драйвера и трейсера молекулами, и гомогибриды трейсер-трейсер, образовавшиеся в результате самореассоциации молекул трейсера и имеющие одинаковые выступающие 5'-концы. На второй стадии вычитания в ходе гибридизации кроме вышеописанных возникает новый тип молекул - геторогибриды трейсер-трейсер, возникшие при реассоциации

Трейсер А

Трейсер Б

лигирование ^

Драйвер (в избытке)

Цитирование

денатурация гибридизация

трейсер-трейсер 1 гомогибриды трейсер-драйвер гетерогибрилы ds-дpaйвep ^-драйвер

| эз-трейсер |

смешивание гибридизация

Продукты стадии I

денатурация гибридизация

\Стадия1

>Стадия П

трейсер-трейсер гетерогибриды

Достройка З'концов РСЯ с праймерами но + ва

. трейсер-драйвер гетерогибриды

ds-дpaйвep ^-драйвер

й-грейсер

линейная амплификация нет амплификации

трейсер-трейсер

] гомогибриды

супрессия Г д амплификации

структура типа "сковородка"

экспоненциальная амплификация

клонирование и анализ

'ис. 8. Схема метода вычитаюшей гибридизации вБН.

1ерные и белые прямоугольники - внутренние части адаптеров А и Б и юмплементарные им последовательности. Вертикально и оризонтально заштрихованные прямоугольники - внешние части [Даптеров А и Б, соответственно, и комплементарные им оследовательности.

молекул из разных образцов трейсера и имеющие различные выступающие 5'-концы.

После вычитающей гибридизации прюизводится достройка концов гибридных молекул, вследствие чего на концах гомогибридов трейсер-трейсер формируются ИКП. В ходе последующей ПЦР с парой Ош-праймеров происходит экспоненциальная амплификация только гетерогибридов трейсер-трейсер, фракции, обогащенной специфическими молекулами. Амплификация гомогибридов трейсера подавляется благодаря ССП-эффекту. Гибриды трейсер-драйвер способны только к линейной амплификации, а молекулы одно- и двуцепочечного драйвера и одноцепочечного трейсера вообще не амплифицируются, так как не содержат сайтов для отжига Ош-праймеров.

На первой стадии вычитающей гибридизации в одноцепочечной фракции трейсера происходит как обогащение молекулами мишеней, так и нормализация - выравнивание концентраций транскриптов с разной исходной представленностью. Нормализация обеспечивается тем, что скорость гибридизации индивидуального фрагмента пропорциональна квадрату его концентрации и мажорные последовательности реассоциируют быстрее, чем минорные.

Согласно компьютерному анатизу кинетики процесса гибридизации [18], полученная после объединения двух образцов фракция гетерогибридных молекул трейсера должна примерно равно представлять молекулы кДНК мишени, различные по содержанию в исходном образце. Обогащение для редких транскриптов при этом составляет более чем в I ООО раз относительно их исходной представленности.

Представленная общая схема метода ББН может подвергаться различным технически несложным модификациям для более успешного решения конкретных задач. Например, для получения более высоких степеней обогащения можно ввести дополнительное добавление денатурированного драйвера на второй стадии гибридизации, что создает значительно больший, чем в начале гибридизации, избыток драйвера по отношению к оставшимся в одноцепочечной фракции молекулам трейсера Этот избыток особенно велик для общих молекул с высоким содержанием. Таким образом, второе добавление денатурированного драйвера преобразует исходную диспропорцию в концентрации общих молекул так, что транскрипты, исходно присутствующие в высокой и средней концентрации, будут практически полностью

удалены из одноцепочечной фракции трейсера.

Эффективность предложенной методики была подтверждена в модельных экспериментах с использованием в качестве мишени экзогенной вирусной ДНК, добавляемой к образцу трейсера в определенных концентрациях [1]. Метод был применен для выявления последовательностей, дифференциально экспрессирующихся в ходе различных биологических процессов, таких как активация иммунного ответа в культуре иммунокомпетентных клеток [13] (рис.9), изменение метастатического потенциала опухолевых клеток [12], репаративная регенерация плоских червей планарий [22,31], регенерация хрусталика глаза тритона [4,27], раннее эмбриональное развитие амфибии [20,28]. Кроме того, предложенный метод был использован для создания тканеспецифических библиотек кДНК человека [11,30], а также модифицирован для проведения сравнительного анализа бактериальных геномов близкородственных штаммов патогенных микроорганизмов [33].

Элементы разработанной нами техники вычитающей гибридизации оказалось

Рис. 9. Саузерн-блот гибридизация амплифицированной кЛНК трейсера (активированные Лигка! Т-клетки), кДНК драйвера (неактвированные <1игка1 Т-клетки)и образца кДНК после вычитаюшей гибридизации ввН с (А) -к ДНК гена рецептора интерлекина2 (активируется при активации имунного ответа в культуре имунокомпетентных клеток) и (В) - кДНК генов глицерид-3-фосфат-дегидрогеназы (обшая последовательность).

1 - кДНК трейсера; 2 - кДНК драйвера; 3 - вычтенный образен кДНК.

возможным применить для решения некоторых других задач, таких как создание нормальзованных библиотек кДНК, вьшление эволюционно консервативных экспрессирующихся последовательностей и т.д.

2.6. Получение нормализованных библиотек кДНК

Как уже упоминалось выше, по некоторым подсчетам, в геноме человека закодировано около 100 ООО генов, а в разных типах клеток экспрессируется 10 00050 000 различных генов. Уровень их экспрессии может варьировать от 200 000 до 1 и менее копий на клетку. По уровню экспрессии гены можно условно разделить на три класса: мажорные, средние и минорные. Обычно в клетке экспрессируется 10-20 мажорных генов (мРНК каждого из которых содержится в числе нескольких тысяч копий), несколько сотен средних генов (по несколько сотен молекул мРНК каждого вида) и несколько тысяч минорных генов (от одной до нескольких десятков копий каждой мРНК). Столь большая разница в представленности мРНК чрезвычайно усложняет задачу анализа библиотек кДНК, особенно при работе с редкими генами. Так, интенсивно разрабатываемый в настоящее время проект секвенирования всех кДНК человека требует анализа 106-108 клонов из каждой библиотеки для выявления редкопредставленных последовательностей, в то время как высоко- и среднепредставленные последовательности будут представлены многими клонами. Для решения этой проблемы необходимы так называемые нормализованные библиотеки, т. е. библиотеки, в которых разные виды кДНК имеют приблизительно равную представленность. Наиболее эффективный подход к созданию нормализованных библиотек основан на том, что реассоциацкя денатурированной двухцепочечной ДНК является реакцией второго порядка, и, следовательно, мажорные последовательности реассоциируют значительно быстрее, чем минорные. Таким образом, если образец двухцепочечной кДНК денатурировать и оставить ренагурировать, то основная масса высокопредставленных молекул перейдет в двухцепочечную (ds) форму, и одноцепочечная (ss) фракция кДНК станет в значительной мере нормализованной. Отбор этой ss-фракции представляет наибольшую проблему при создании нормализованных библиотек. В ранее опубликованных работах эта проблема решалась низкоэффективным физическим разделением ss- и ds-фракций с помощью гидроксиапатитовых колонок или магнитных шариков.

Предлагаемый в данной работе метод создания нормализованных библиотек использует тот же принцип, который применялся в ходе вычитающей гибридизации для нормализации трейсерной кДНК. Образец кДНК разделяется на две пробирки и обрабатывается так же, как трейсер для вычитающей гибридизации. Дальнейшие процедуры также соответствуют стадиям вычитающей гибридизации, однако, проводятся в отсутствие кДНК драйвера. При этом в ходе первой гибридизации происходит нормализация зэ-фракции кДНК. ЭБ-фракция после первой гибридизации представлена только гомодуплексами - молекулами, несущими на 5-концах обеих цепей одинаковые последовательности супрессионного адаптера. После смешивания двух образцов, в ходе второй гибридизации только молекулы, принадлежащие нормализованной ББ-фракции, способны к образованию гибридов. Так как в растворе присутствуют молекулы из обоих образцов, наряду с гомодуплексами формируются гетеродуплексные молекулы, фланкированные разными супрессионными адаптерами. Таким образом, нормализованная зэ-фракция кДНК, образовавшаяся в результате первой гибридизации, после второй гибридизации частично переходит во фракцию гетеродуплексов. После достройки З'-концов гетеродуплексные молекулы, т.е. нормализованная фракция, в отличие от всех остальных могут быть селективно амплифицированы с помощью ПЦР с ОгИ-праймерами [15].

2.7. Селективная амплификация эволюционно консервативных последовательностей

Оказалось возможным использовать ССП-эффект не только для вычитания образцов кДНК, но и для создания библиотек экспрессирующихся последовательностей, общих для двух образцов биологического материала. Этот подход был применен для выявления эволюционно консервативных последовательностей кДНК. В настоящее время опубликовано лишь несколько работ по клонированию последовательностей, общих для двух образцов ДНК. Все они направлены на анализ геномной ДНК с целью поиска хромосомоспецифических последовательностей или идентификации эволюционно консервативных районов на данном участке хромосомы. Поиск консервативных участков ДНК при этом ведется путем сравнения уже известных последовательностей, принадлежащих различным организмам. Наша методика может применяться для обнаружения новых консервативных и, следовательно, функционально

важных, экспрессирующихся последовательностей путем их селективного клонирования.

В предложенном методе "сложения" в общие (высококонсервативные) для двух изучаемых образцов молекулы кДНК вводятся некомплементарные друг другу 3'- и 5'-концевые части, позволяющие вести амплификацию с соответствующих лраймеров, в то время как низкоконсервативные последовательности получают ИКП и их амплификация блокируется.

Метод был применен для поиска экспрессирующихся последовательностей, консервативных для человека и китайского хомячка. В результате "сложения" образцов кДНК клеточной линии HeLa и клеточной линии фибробластов китайского хомячка была получена библиотека кДНК, обогащенная такими последовательностями и выявлен ряд генов, высококонсервативных для человека и грызунов [9].

2.8. Клонирование ¡п vitro

Несмотря на то, что в последние годы большинство классических методов генной инженерии было улучшено или даже полностью вытеснено более удобными и эффективными методиками, использующими ПЦР, в области молекулярного клонирования ДНК старые методы сохранили ведущую роль (клонирование в бактериальных, фаговых и других системах in vivo). Это делает актуальным разработку альтернативных методов клонирования, позволяющих ачплифицировать с помощью ПЦР и затем секвенировать индивидуальные молекулы ДНК неизвестной последовательности без клонирования in vivo. Метод, названный клонированием in vitro, включает в себя следующие основные этапы [26]:

1. Лигирование подлежащих клонированию фрагментов двухцепочечной ДНК одновременно с двумя супрессионными адаптерами. Предпочтительным является использование адаптеров с идентичной внешней половиной.

2. Многократное разведение полученного образца до получения единичных молекул ДНК на объем, который будет взят для амплификации.

3. ПЦР-амплификашя индивидуальных молекул ДНК с использованием Out-праймеров.

Полученные таким образом продукты ПЦР, названные in vitro клонами, соответствуют индивидуальным молекулам ДНК. Благодаря ССП-эффекту in vitro клоны обязательно фланкированы последовательностями разных адаптеров, что

позволяет секвенировать клонированный фрагмент ДНК любым методом, пригодным для продуктов ПЦР.

Следует отметить несколько очевидных преимуществ клонирования in vitro по сравнению с обычными методами клонирования.

1. Для клонирования in vitro используется только ПЦР вместо продолжительных процедур клонирования в бактериях или фагах и последующего выделения ДНК или ПЦР-амплификации вставок (при дифференциальном скрининге использование чистой ДНК вместо бактериальных колоний или фаговых бляшек дает значительный выигрыш в чувствительности).

2. Хотя клонирование in vitro требует более 40 циклов ПЦР, точковые нуклеотидные замены, внесенные термостабильной ДНК полимеразой, не выявляются прямым секвенированием in vitro клонов по причине случайного распределения этих замен в каждой амплифицированной молекуле ДНК. В то же время, обычное клонирование вычтенных образцов, полученных с помощью ПЦР (метод SSH требует около 40 циклов амплификации), приводит к выявлению нуклеотидных замен.

3. Клонирование in vitro решает проблему конкуренции в скорости амплификации и в эффективности клонирования между разными последовательностями в составе сложных смесей кДНК. Например, обычной причиной артефактов при стандартном клонировании сложных образцов амплифицированной кДНК является избыточное число циклов ПЦР. После насыщения амплификации из-за нехватки праймеров кДНК в ходе последующих температурных циклов становится денатурированной. После окончания ПЦР только частопредставленные виды к ДНК успевают ренатурировать и перейти, таким образом, в подходящую для клонирования форму. Редкие виды кДНК преимущественно остаются в одноцепочечной форме и поэтому элиминируются из клонированной библиотеки. В результате представительность полученной библиотеки не соответствует представительности исходного образца.

Метод клонирования in vitro может применяться для решения широкого ряда задач молекулярной биологии вместо обычного клонирования в бактериальных, фаговых и других системах in vivo. Предлагаемый метод особенно удобен в тех случаях, когда необходимо получить не более чем несколько десятков клонов (например, для дифференциального скрининга, субклонирования длинных фрагментов ДНК и др.).

10 11 12

(b)

„счг, юзс^мсп - ^r — • м м гч

¿<<<<<юдаиамм1Ш1.ьР011

Рис. 10. Типичный результат клонирования in vitro в 96-луночном планшете в присутствии бромистого этидия.

(а) Планшет в проходящем УФ-свете после ПЦР. (б) Электрофорез в 2% агарозном геле продуктов ПЦР из окрашенных бромистым этидием проб (2 мкл из каждой пробы). М - маркер длин (1 kb ladder, Gibco BRL). Над остальными дорожками указаны номера соответствующих лунок планшета.

)крашены, в то время как лунки без кДНК остаются темными. Это избавляет от [еобходимости электрофоретического анализа содержимого всех лунок. Типичный результат получения in vitro клонов в 96-луночном планшете показан на рис. 10. Мы использовали данный подход для дифференциального скрининга библиотек кДНК, полученных с помощью вычитающей гибридизации [14,30]. Кроме того, нами был разработан протокол для быстрого получения панели перекрывающихся субкпонов для секвенирования длинных (5 т.п.о.) фрагментов ДНК [29].

Таким образом, открытие СПП-эффекта привело к созданию набора дополняющих друг друга технологий анализа сложных образцов ДНК: получение библиотек кДНК на основе черезвычайно малых количеств исходного биологического материала, вычитающая гибридизация и дифференциальный дисплей мРНК для выявления дифференциально эксрпессирующихся последовательностей, быстрое клонирование полноразмерных кДНК (RACE), прогулка по хромосоме для клонирования промоторных и других регуляторных областей генома, клонирование in vitro и т.д.

Комплексное использование разработанных методов идентификации и анализа генетических последовательностей, основанных на ССП-эффекте, позволило выявить и клонировать полноразмерные кДНК копии ряда генов, вовлеченных в регуляцию различных биологических процессов, таких как эмбриональное развитие, регенерация, опухолевое метастазирование и др. Одним из наиболее удачных примеров применения предложенных методов может служить исследование регенерации планарий, приведшее к идентификации нового семейства лекгиновых генов, вовлеченных в регуляцию восстановительных процессов, и открытию индукционных взаимодействий между различными регионами тела планарии.

3. Выявление и анализ генов, вовлеченных в контроль репаративной регенерации у планарий

Одно из важнейших свойств живых существ - способность восстанавливать целостность организма после ранения или утраты части тела Это свойство может быть обнаружено у самых разных животных - от простейших до высших млекопитающих. В отличие от большинства других систематических групп животных пресноводные планарии обладают способностью к восстановлению утраченного патерна даже из

небольших фрагментов тела и являются удобным объектом для изучения генетических основ репаративной регенерации.

3.1. Выявление гомеобокссодержащих генов у планарии

Формирование структур в ходе репаративной регенерации напоминает в общих чертах эмбриональное развитие соответствующих тканей и органов. И хотя эти процессы имеют ряд существенных различий, особенно на ранних стадиях (например, формирование утраченных систем при регенерации происходит у взрослого животного из дифференцированных тканей, тогда как в эмбриональном развитии участвуют исходно недифференцированные эмбриональные ткани), предположение, что формирование новых структур в ходе репаративной регенерации может регулироваться представителями генных семейств, контролирующими аналогичные процессы в ходе эмбрионального развития и имеющими высокую структурную и функциональную гомологию у всех до сих пор изученных животных различных систематических групп, являлось достаточным основанием для выявления и анализа генов-регуляторов эмбрионального развития при регенерации.

С этой точки зрения особый интерес представляло выделение и изучение гомеобокссодержащих генов семейства АтеппаресНа планарий. Продукты генов этого семейства являются транскрипционными факторами и широко известны как регуляторы ключевых этапов формирования плана строения в развитии животных различных систематических групп, таких как насекомые, круглые черви, высшие и низшие позвоночные. В литературе также представлены данные об участии гомеобоксных генов в регуляции процессов репаративной регенерации конечности у амфибий.

igrina asexual race homeobox gene). Для сравнительного анализа идентифицированных "енов планарии с известными гомеобокссодержащими генами из других организмов необходимо было клонировать полные последовательности гомеобоксов этих генов.. Это было достигнуто с помощью оригинальной техники RACE, изложенной выше [раздел 2.3).

Сравнение выявленных нуклеотидных последовательностей, а также соответствующих им последовательностей аминокислот, с последовательностями гомеобокссодержащих генов других организмов показало, что Dutarh-3, Dutarh-4 принадлежат к семейству Antennapedia, гомеодомен Dutarh-l обнаруживает сходство с Hoxl.5-, AbdB- и Dfd - гомеодоменами, а гомеодомен Dutarh-6 - с гомеодоменам подсемейства, которое включает мышиные белки Мох-1 и Мох-2, и крысиный Сах. Полученные данные дают основание предполагать, что гомеобокссодержащие гены планарии объединены в кластер, как и у высших животных (рис. 11).

Исследования экспрессии идентифицированных генов показало, что они экспрессируются на низком уровне в теле нерегенерирующих планарий и что уровень их экспрессии не меняется в регенерационных бластемах на ранних стадиях (первый-третий дни) регенерации. Исследования, направленные на выявление роли гомеобокссодержащих генов при регенерации планарий, осуществленные испанскими исследователями (Багуна и сотруд., Барселона, Испания) так же показали, что у планарии, в отличие от представителей других систематических групп, #о.х-гены не вовлечены в контроль полярности и детерминации структур вдоль переднезадней оси тела. Эти данные указывают на наличие других генов, вовлеченных в регуляцию восстановительных процессов и поддержание паттерна тела у взрослых планарий и, возможно, не имеющих близких гомологов у представителей других систематических групп. Для поиска таких генов необходимо применение методов прямого выявления генетических последовательностей, дифференциально экспрессирующихся в ходе регенерации.

3.2. Поиск генов, вовлеченных в регуляцию полярности регенерации у планарий

После перерезания тела планарии каждый из образующихся кусочков восстанавливает недостающую часть, образуя в конечном итоге новую особь с

: Hydra C.elegans

j Planaria

! Drosophila

j Mouse

i Hox A

Hox В Hox С Hox D

cen-13

cnox2

ceh-15

cnoxl спохЗ

таЬ~5

сеЛ-If

Dutarrn DvtarM : Dutarh2 DutM5 DutarM Dthl

cnoxS-Hm

DutirhS

lab pb z2 zen1 bed Did ta Scr Antp Ubx abd-A Abd-8

Z-Z-. „-Ш-Щ-И—В-//-И—Я—■

1.7 1.3 ■ 3

1.10.

2.9\! 2.8

2.6 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

—0—Щ—Ü—Щ—4

3.4 3.3

3.1

4.9:1

: 3.2 3.7 3 3 : 4.4 4.5 4 6 4 7 4.8 ! I

Mox2'

Anterior 3' A-

Early

Posterior

- 5'

Late

Рис.11. Сопоставление гомеобокссодержашнх генов семейства Antennapedia у животных различных систематических групп.

По материалам McGinnis and Krumlauf (1992) and Burglin et al. (1991). H - гены, имеющие гомологов у Drosophila В - гены, не имеющие выраженных гомологии.

[ J - гены Drosophila zenl. z2 и bed , не имеющие гомологов у других видов.

нормальными пропорциями тела. Простые опыты по смешению линии перерезания вдоль передне-задней оси тела пданарии показывают, что отрезанный '"хвост" всегда (независимо от уровня перерезки) будет восстанавливать "голову", а "голова" - "хвост".

ибридизации. Использование стратегии получения кДНК из малого количества ¡сходного материала (раздел 2.2) позволило получить образцы кДНК из тканей одной )соби планарии, чтобы избежать накопления в вычтенном образце случайных юследовательностей, обусловленного индивидуальными различиями между особями.

Для получения библиотек кДНК, обогащенных последовательностями, :пецифически экспрессирующимися в ходе регенерации различной полярности, было троведено две вычитающей гибридизации (SHH, раздел 2.5.2) - в одном случае грейсером служил образец ХБ кДНК, а драйвером - образец ГБ кДНК, в другом случае в качестве трейсера выступала ГБ кДНК, а драйвера - ХБ кДНК. В результате было получено два образца кДНК, обогащенных последовательностями специфическими для головной бластемы или для хвостовой бластемы.

Дифференциальный скрининг полученных вычтенных образцов кДНК, который проводили методом клонирования in vitro (раздел 2.8), позволил выявить ряд последовательностей, специфичных для регенерации различной полярности. В настоящей работе представлены результаты анализа одной из этих последовательностей (соответствующий ген был назван scarf], специфичной для хвостовой бластемы.

Рис.12. Схема операции и изоляции тканей для приготовления образцов кДНК из головной и хвостовой регенераиионных почек и прилегающих к ним тканей.

"ГБ" кДНК -образец кДНК из головной бласгемы;"ХБ" кДНК -образец кДНК из хвостовой бластемы.

3.3. Ген scarf - представитель нового семейства генов, кодирующих полидоменные лектины С-типа

На основании нуклеотидной последовательности выделенного фрагмента гена scarf были сконструированы специфические олигонуклеотидные праймеры и с помощью оригинального метода RACE (раздел 2.3), был клонирован полный

кодирующий регион кДНК гена scarf. Суммарная длина полноразмерной кДНК ген scarf составляет 875 п.о. (EMBL асс. num. Z66536) и соответствует длине мРНК определенной с помощью Нозерн-блот гибридизации. Наиболее длинная открыта; рамка считывания кодирует полипептид длиной 263 аминокислоты (начиная от первой N-концевого метионина). Анализ последовательности этого полипептида показал, чт< первые 19 аминокислот составляют сигнальный пептид, за которым следуют дв; высокогомологичных углеводсвязываюших домена (УСД), характерных для белков относящихся к семейству лекгинов С-типа (рис. 13).

.Пектины С-типа беспозвоночных имеют защитную функцию, обеспечивав неиммунный ответ на бактериальную инфекцию. В последнее время появились данньи об участии белков этого семейства также в регуляции морфогенеза. Напичш

10 20 30 40 50 60

Scarf A QTTHLNKNKMNTNDAVKTCNSKE IRLVKITDSQTNAAVFEIASKNaiGTTWMNGNDIAIEGTW

Scarf В EN—Г-----Т---------DRNMG----PN-EV-VN-TN—L-HNL----------------

Р-салвктин WT—YSTKAÏSW-ISR---QNRYTD--A-QHKNEIDÏLNKVLPYYSS . 1—IGIRK.NN.K--

МВР KFFVT-HER-PFSKVKAL-SELRGTVÄIPRKAEE-K-IQ-V-KT. . . .SAFLGIT-EVT—QE

70 80 90 100 110

ScarfA V.DTENKPLV. . rXNWTKCEPNNWGGNQNCI/VAAY. . . HPNEWWFDIGCNTLNSVICEIV

ScacfB -.--------..-----------------------...-------------------ТКА

Р-С0Л0КТИН TWGTK-A-TNEAE—ADN----KRN-ED-VEIYIKSPSAPGK-N-EH-LKKKHAL-TTA

МВР MÏV.TGGR-T. . -S—K-D---DH-SGED-VTIV.....D-Gb-M—S-QASHTAV—FP

Рис. 13. Сравнение аминокислотной последовательности двух углеводсвязываюших доменов, входящих в состав клонированного фрагмента гена scarf (scarf А и scarf В) с углеводсвязываюшими доменами лекгинов С-типа млекопитающих: маннозевязываюшего белка крысы (МВР) и Р-селектина человека.

Совпадающие аминокислоты обозначены прочерками. Звездочками обозначены аминокислотные последовательности, ответственные за связывание субстрата.

сигнальной последовательности в структуре Scarf указывает на его принадлежность к секретируемым белкам и позволяет предположить его принадлежность к компонентам межклеточного матрикса.

Кроме двух углеводсвязываюших доменов, в последовательности Scarf не

******

одержится других функциональных доменов. Отсутствие линкера между УСД (они азделены только одной аминокислотой) может говорить о жестком закреплении этих оменов относительно друг друга в составе белковой молекулы. На основании итературных данных о пространственной организации УСД лектинов С-типа была моделирована возможная трехмерная структура Scarf. Так как оба конца юлипептидной цепи УСД располагаются на стороне глобулы, противоположной ктивному центру, отсутствие между ними линкера приводит к тому, что их центры вязывания повернуты в разные стороны. Scarf УСД имеют идентичную лшнокислотную последовательность в С-концевой области, обеспечивающей :пецифичность связывания с лигандом. В то же время их N-концевые регионы начительно различаются. Согласно предлагаемой моделе эти участки соответствуют юласти междоменного контакта.

В литературе представлены данные о нескольких различных группах лектинов I-типа, однако растворимых поливалентных лектинов этого семейства, не содержащих фугих, кроме УСД, функциональных доменов, до настоящего времени описано не эыло. Таким образом, можно предположить что белковый продукт гена Scarf является тредставителем нового семейства лектинов С-типа.

Двухвалентность и секреторность белка Scarf, предсказанные на основе его 1минокислотной последовательности, позволяют предположить его функциональное :ходство с белками другого семейства - пектинами S-типа. Поливалентные, секреторные эелки этого семейства служат сигнальными молекулами, индуцирующими пролиферацию, и агентами, организующими белковые комплексы на поверхности клетки.

3.4. Анализ экспрессии гена scarf у интактных плапарий и в ходе регенерации

Было показано, что в теле интактной планарии ген scarf экспрессируется в регионспецифической манере и что характер его экспрессии по-разному меняется в ходе регенерации различной полярности. Таким образом, ген scarf является первым выявленным у планарий генетическим маркером, дифференциально экспрессирующимся в ходе восстановительных процессов. Выявленный маркер был использован для исследования взаимодействий регионов тела планарии в ходе

регенерации [23,31].

В теле интакгной планарии распределение мРНК гена scarf имеет выраженную зону максимума в предглоточной зоне в виде двух шарообразных сгущений и дв идущих от нее в каудальном направлении вдоль нервных стволов тяжа, состоящих и отдельных 5саг/-экспрессирующих групп клеток. Был проведен следующи эксперимент: Планарий перерезали в предглоточной области выше (А), через (Б) и ниж (В) зоны максимальной экспрессии scarf. Для контроля за уровнем перерезки один и получившихся кусочков сразу фиксировали, а второй оставляли регенерировать. Чере 1, 3, 5, 7, 12, 14 суток после операции регенерирующих планарий каждой сери: фиксировали и подвергали whole mount in situ гибридизации со scarf рибозондом Результаты эксперимента и схема операции суммированы на рис. 14 и 15.

<s>

Дни О 1

8-14

Рис.14. Диаграмма суммирующая результаты анализа (с помошью whole moui in situ гибридизации)измененн экспрессии гена scar/в ходе регенерации различной полярности планарий при различных уровнях перерезки тела (А, Б, В).

Регион, экспрессируюший scarf отмечен серым.

Рис.15. Примеры whole mount in situ гибридизации с антисмысловым scarj-рибозондом планарий на разных сроках регенерации при различных уровнях перерезки тела (А, Б, В).

Ph - глотка; е - глаза. Масштабная линия соответствует 200 мкм.

Как следует из представленной схемы, в ходе регенерации удаленной головш части падение уровня экспрессии гена scarf происходит при удалении бол антериорного (чем зона максимальной экспрессии) региона тела (серии Б и Е Восстановление исходного паттерна экспрессии этого гена происходит пос. восстановления головного фрагмента (7 день). При неполном удалении антериорнс гоны (серия А) картина экспрессии гена scarf не изменяется. В ходе регенерат удаленного хвостового отдела оставшаяся после перерезания зона, экспрессирующ; scarf, длительное время не подвергается видимым изменениям (серия Б и В). Пр перерезании выше зоны максимальной экспрессии scarf в регенерирующих головах i интактном состоянии экспрессия гена scarf в них не детектируется) наблюдаете включение scarf на 5-7 день регенерации.

Полученные результаты позволяют постулировать наличие в теле планари постоянных индукционных взаимодействий между зоной экспрессии scarf и боле антериорным регионом тела, причем этот регион является источником активирующег сигнала для гена scarf. При удалении этого региона происходит падение уровь экспрессии гена scarf. Восстановление исходной картины экспресии scarf связано восстановлением региона, экспрессирующего активатор. При этом зон; экспрессирующая scarf подавляет активацию этого гена в прилегающих регионах тел: При полном удалении этой зоны в головном фрагменте тела (где остается активатор наблюдается увеличение уровня экспрессии scarf.

Таким образом, исследование изменений экспрессии выявленного нами гена scat позволило впервые продемонстрировать регулирующие регенерацию индукционны взаимодействия в теле планарии.

4. Новые флуоресцентные белки из кораллов

Другим примером удачного применения методов идентификации и анализ генетических последовательностей, основанных на ССП-эффекте, является выявлени новых флуоресцентных белков из кораллов.

Идентификация гена, кодирующего «зеленый флуоресцентный белок» (grec fluorescent protein, GFP) из биолюминесцентной системы медузы Aequorea victorù открыло новую эру в биотехнологии. GFP стал прекрасным маркером, позволяющш исследовать экспрессию, локализацию и регуляцию генов in vivo. Однако данных по

10 20 30 40 __ 50

f TG. V^P?Lré£t)3D0MGHK?SVs3EGEGPATr5KZrbKÍlCTr. GKLPVPTTÍ

LC]

ti's-

LSIt_____________

LSíÍAI^OTmiá;

¿ШШёШИ: bwtf&cmi

SbTGH. .

sSeísekgn. . k3dÍsmeed..

ZFP506 SFP538

dsFP483 dtFP5Ö3

aaFP486 СГР484 cns. Anthozoa. cns. all

ZFP50 б IFP538

dsFP483 drFP583

ашГР48б CFP4B4 en*. Anlhozoa. cus. all

0 130

IV3RÍE£KSID PkedgnÍ

.1 Л j * 9 W

IYHESKJYOVNSPADG" "

ÍTBLNÍPPNG!

ärjHgVNfPADG! ' iRJDGWJPPNG! ^ S«N|P dGPyá B8n? dG íá

.40 150 160^ 170

я.я 1"TT¡~ rnm

Ky^DNWEP|C|KJI PVPKSCriraD^S^yiLI-KDGGRLH QWTTGWEPSTERbYP. . P£)GVk IGDIHÜALTVEGGGHYA

о I Я i la" ----Sk|e|-|-|klkd----l

AK3TÍG3DP|F|K^TV. . CDGItK.gDvTAFLHLQGGGiiYR

QíSTtKgEpjjTSItffV. .RDGvEvgDlsSsELLEGGGHYR KÍtI jjepg B»| dG@3+y-0 в 3 1 GG+y ra 1 в lid t+Я 1 В Я a g

IFPS06 JFP538

dsFP483 drFP583

amFP486 CFP484 cns. Anthozoa. cns. all

¡0 190 200 210 220 230

ÍDHiffoÑTPIGDG. PVI^PDl.flYCsfQSACSKDPHEFTOHM^'SLgf-VTAAGrTHGHDEL'/K

:ofdtv?KAKSV. . PRKMPDl JDIK'

RAKKA. .ALKMPG1 l|M---. . .PVQL—

¡QFHtSYKTKK. . . PVTHPP1 DEKai^KAKK. . .WKLPDI j | jSjjkaftt pvkJP

'ñ

в Я ^ Q )j ¡

"T^DRSDAXNOKÍWbTEHAI&SGSALP

-.....—EQ3-S

jVIWINDKEFM, KVlgH|IAVAP.HHPF'/EPKKDK -|-|D3TSHNEDYT. ii-ÖYäRXEä---L-L

4TDLDKGGN. sgObTÍH^vy ITSWFF

eílnhdkdyn.k4t£y|hAvasysllpsqa

2FP50 б 2FP538

dsFP483 drFP583

amFP486 CFP484 cns. Anfltozoa. cns. all

ic. 16. Множественное выравнивание флуоресцентных белков.

!мераиия приведена в соответствии с GFP из Aequorea victoria. Два белка из anthus и вше два из Discosoma сравнивались попарно: в последовательности эрого белка из каждой пары инвариантные остатки представлены прочерками, эопуски отмечены точками. В последовательности A. victoria GFP участки, разуюшие бета-слои, подчеркнуты. Остатки, боковые цепи которых формируют угретюстъ бета-банки, выделены серым. В консенсусных последовательностях :ns."), "О" обозначает ароматический остаток (F, Y, W, Н); = крупный дрофобный остаток (V,KL,KI,KM,KF,KW); "+" = положительно заряженный остаток , R, К);"" = отрицательно заряженный остаток (D,KE).

структуре GFP оказалось недостаточно для понимания механизмов флуоресценщ-

Клонирование и сравнительный анализ белков гомологичных GFP из друг

организмов позволили бы значительно расширить наше понимание в этой облает

Кроме того, идентификация GFP-подобных белков, имеющих иные спектральш

характеристики; могла бы стать хорошей основой для дальнейшего развил

технологий анализа экспрессии генов.

Используя разработанный в нашей лаборатории метод быстрого клонирован]

полноразмерных кДНК, основанный на эффекте ССП, и вырожден!

олигонуклеотидные праймеры, мы идентифицировали шесть новых генов, продуктами

которых являются гомологичные «зеленоА

белку» из A.victoría флуоресцентные беЛ1

(рис.16) [40].

Все шесть генов были выявлены

неспособных к биолюминесценщ

кораллов (класс Anthozoa), что опроверга

общепринятое мнение о функционировав

GFP-подобных белков исключительно

составе биолюминесцентных систе\

Спектральные характеристики для двз

выделенных нами белков имен

принципиальные отличия от GFP. Ог

имеют максимумы флуоресценции в желтс

и красной частях спектра (рис.17). Эз

открывает широкие перспективы дг

развития систем анализа экспрессии гене

in vivo. Нами была продемонстрировав

экспрессия новых флуоресцентных белков

клетках млекопитающих и в эмбриона

шпорцевой лягушки, что подтвердил

подобных флуоресцентных белков, возможность использования вьщеленны выделенных из неспособных к био- нами белков в репорТер„Ь[Х системах [40]. люминесценции кораллов (класс Anthozoa).

Рис.17. Спектры поглощения (сплошная линия) и эмиссии (пунктирная линия) ряда вРР-

выводы.

1. Описан эффект селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ССП) с нощью инвертированных концевых повторов. Исследованы факторы, влияющие на фективность ССП и подобраны условия для успешного использования открытого 'П эффекта для разработки новых методов анализа сложных образцов ДНК

2. Разработан новый метод быстрого клонирования полноразмерных кДНК на гаве информации о структуре фрагмента кДНК.

3. Разработан новый метод "прогулки по хромосоме", позволяющий быстро онировать промотерные области новых генов.

4. Разработан новый метод приготовления библиотек кДНК из малых количеств чмарной РНК, позволяющий получать близкие к полноразмерным и едставительные библиотеки кДНК из 10-100 нг суммарной РНК.

5. Разработан новый метод, позволяющий создавать библиотеки кДНК с иблизительно равной представленностью всех видов транскриптов всего за один унд нормализации.

6. Разработан новый метод поиска эволюционно консервативных гпрессирующихся последовательностей. Получена обогащенная библиотека кДНК, актически на 100% состоящая из последовательностей (преимущественно 3' кодирующих областей транскриптов), высококонсервативных для человека и мячка.

7. Разработан новый высокоэффективный метод вычитающей гибридизации [НК, позволяющий выявлять низкопредставленные дифференциально спрессирующиеся гены.

8. Разработан новый метод поиска дифференциально экспрессирующихся генов упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК, позволяющий проводить

сгематическое сравнение популяций экспрессирующихся последовательностей.

9. Разработан новый метод, названный клонированием in vitro, позволяющий

амплифицировать с помощью ПЦР и затем секвенировать индивидуальные молеку ДНК неизвестной структуры без использования бактериальных, фаговых и других vivo систем клонирования.

10. Использование основанных на ССП эффекте методов для анализа процес* репаративной регенерации планарий привело к открытию нового семейс полидоменных лектиновых генов, вовлеченных в регуляцию формирования пл; строения тела планарий. Анализ экспрессии одного из выявленных генов эт( семейства - гена scarf - позволил впервые продемонстрировать индукциот взаимодействия между различными регионами тела планарии, регулируюи клеточную дифференцировку и морфогенез в ходе регенерации.

11. Использование основанных на ССП эффекте методов привело к идентификш шести новых генов, кодирующих флуоресцирующие белки, из кораллов, не способны биолюминесценции. Два белка имеют принципиальные отличия в спектралы характеристиках от GFP и флуоресцируют в желтой и красной частях спектра.

шовные результаты диссертационной работы изложены в следующих бликациях:

Лукьянов С.А., Гурская Н.Г., Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Свердлов Е.Д. Высокоэффективная вычитающая гибридизация кДНК. Биоорганическая химия

1994, Т. 20 (6), 701-704.

Лаунер Г.А., Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Лукьянов С.А. Простой метод амплификации суммарной кДНК на основе малых количеств суммарной РНК. Молек. генетика, микробиология и вирусология 1994, № б, 38-41.

Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Потапов В.К., Бекман Е.П., Лукьянов С.А. Клонирование фрагментов гомеобокссодержащих генов экспрессирующихся в ходе регенерации планарии. Онтогенез 1994, Т. 25 (6), 28-32.

Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Снеговая И.Ю., Долгилевич С.М., Тарабыкин B.C., Зарайский А.Г., Лукьянов С.А., Знойко С.Л., Микаэлян А.С., МиташовВ.И. Идентификация новых генов и анализ их экспрессии в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов. Известия Академии Наук. Серия биологическая 1995, № 3, 271-275.

Миташов В.И. Лукьянов С.А., Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Долгилевич С.М., Снеговая И.Ю., Знойко С.Л., Микаэлян А.С. Молекулярно биологические подходы в исследованиях генов в процессе регенерации. Известия Академии Наук. Серия биологическая 1995, № 3, 276-280.

Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov К.А. and Lukyanov S.A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Research

1995, V. 23,1087-1088.

Tarabykin V. S., Lukyanov K.A., Potapov V. K., Lukyanov S.A. Detection of planarian Antenriapedia-\ike homeobox genes expressed during regeneration. Gene 1995, V. 158, 197-202.

Lukyanov K.A., Launer G.A., Tarabykin V. S., Zaraisky AG. and Lukyanov S.A. Inverted terminal repeats permit the average length of amplified DNA fragments to be

regulated during preparation of cDNA libraries by polymerase chain reaction. Analytica Biochemistry 1995, V. 229, 198-202.

9. Лукьянов, Н.Г. Гурская, Е.П. Копанцев, С.А. Лукьянов Селективная амплификац эволюционно консервативных экспрессирующихся последовательносте Биоорганическая химия 1996, Т. 22 (1), 49-54.

10. Chenchik,A., Diachenko, L., Tarabykin, V., Lukyanov, S., and Siebert, P.D. Full-lenj cDNA Cloning and Determination of mKNA 5'- and 3'- ends by Amplification adapter-ligated cDNA. BioTechniques /996, V. 21, 526-534.

11. Diachenko, L., Lau Y.-F.C., Campbell A.P., Chenchik,A., Mogadam, F., Huang, 1 Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D., and Siebert, D. Suppressi Sabtracive Hybridization: A metthod for generating differentially regulated or tissi specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, V. 93, 6025-602

12. Гурская Н.Г., ШагинД.А., Лукьянов К. А., Вагнер Л.Л., ШтутманМ.1 Мусаткина Е.А., Моинова Е.В., Татосян А.Г., Лукьянов С.А., Свердлов Е. Клонирование с помощью вычитающей гибридизации кДНК гена ha-SDGF линии клеток сирийского хомячка с повышенным потенциалом метастазироваи Биоорганическая химия 1996. Т. 22(6), 425-431.

13. Gurskaya N.G., Diachenko L, Chenchik A., Siebert P.D., Khaspekov G.L., Lukyar K.A., Vagner L.L., Ermolaeva O.D., Lukyanov S.A. and Sverdlov E.D. The Equalizi cDNA Subtraction Based on Selective Suppression of Polymerase Chain Reacti Cloning of the Jurkat Cells' Transcripts Induced by Phytohemaglutinin and Phorbol myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 1996, V. 240,90-97.

14. Lukyanov K.A., Matz M.V., Bogdanova E.A., Gurskaya N.G., Lukyanov S.A. Molec by molecule PCR amplification of complex DNA mixtures for direct sequencing: approach to in vitro cloning. Nucleic Acids Research 1996, V. 24,2194-2195.

15. Лукьянов K.A., Гурская Н.Г., Матц M.B., Хаспеков Г.Л., Дьяченко Л.Б., Чен* А.А., Ильевич-Стучков., Лукьянов С.А. Метод получения нормализовали библиотек кДНК, основанный на эффекте супрессии полимеразной цеш реакции. Биоорганическая химия 1996. Т. 22 (9), 686-690.

Zavalova L., Lukyanov S., Baskova I., Snezhkov E., Akopov S., Berezhnoy S., Bogdanova E., Barsova E., Sverdlov E.D. Genes from the medicinal leech for unusual enzymes that specifically split endo-e(-g-GLU)-LYS isopeptide bonds and help to dissolve blood clots. Mol. Gen.Genet. 1996, V. 253,20-25.

Fradkov A.F., Berezhnoy S., Barsova E.V., Zavalova L.L., Baskova I.P., Lukyanov S.A., Sverdlov E.D. Enzyme from the medical leech that specifically splits endo-e(-y-Glu)-Lys isopeptide bonds: cDNA cloning and protein primary structure. FEBS Lett. 1996, V. 390, 145-148.

Ermolaeva, O.D., Lukyanov, S.A. and Sverdlov, E.D. The mathematical model of subtractive hybridization and its practical application. Ismb 1996, 52-58.

Chenchik A., Diachenco L., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G., Tarabykin V. S., Sverdlov E.D., Method for supression DNA fragments amplification during PCR. US patent № 5, 565, 340 (1996).

Васильев O.JI., Лукьянов C.A., Белявский A.B., Казанская О.В., Зарайский А.Г. Новый метод вычитающей гибридизации кДНК, позволяющий клонировать гены, дифференциально экспрессирующихся в микропопуляциях клеток. Биоорганическая химия 1996, Т. 22 (12), 894-899.

Lukyanov К.А., Diachenko L, Chenchik A., Nanisetti A., Siebert P.D., Usman N.Y., Matz M.V., Lukyanov S.A. Construction of cDNA libraries from small amounts of total RNA using the suppression PCR effect. 8iophis.Biochem.Res.Com. 1997, V. 230, 285288.

Богданова E.A., Матц M.B., Тарабыкин B.C., Усман Н.Ю., Лукьянов С.А. Дифференциальная экспрессия генов при репаративной регенерации различной полярности у планарий. Онтогенез 1997, Т. 28 (2), 132-137.

Usman N. J., Tarabykin V. S., Matz M.V., Bogdanova E.A. and Lukyanov S.A. Whole-mount in situ hybridization on freshwater planarian. Technical Tips Online 1997, (http://www.elsevier.com/locate/tto).

Matz, M., Usman N., Shagin D., Bogdanova E. and Lukyanov S. Ordered differential

display: a simple method for systematic comparision of gene expression profiles. Nuci Acids Research 1997, V. 25, 2541-2542.

25. Kazanskaya O.V. , Severtzova E.A., Barth K.A., Ermakova G.V. , Lukyanov S Benyumov A.O., Pannese M., Boncinelli E., Wilson S.W., Zaraisky A.G. Anf. a n class of vertebrate homeobox genes expressed at the anterior end of the main embrii axis. Gene 1997, V. 200,25-34.

26. Лукьянов K.A., Лукьянов C.A. Клонирование фрагментов ДНК за с иолимеразную цепную реакцию. Биоорганическая химия 1997, Т. 23 (11), 882-8?

27. Маркитантова Ю.В., Лукьянов С.А., Казанская О.В., Мигашов С.А., Лукьянов < Анализ экспрессии генов, содержащих последовательности Ler-1 и Ver-эмбриогенезе, при регенерации и в интактных тканях у тритонов. Онтогенез 1' Т. 28 (4), 262-270.

28. Vasiliev O.L., Lukyanov S.A., Belyavsky A.V. , Kazanskaya O.V. , Zaraisky A.C novel marker of early epidermal differenciation: cDNA subtractive cloning starting ' single explant ofXenopus Jaevis gastrula epidermis. Intl. J. DeV. Biol 1997, V. 41, i 882.

29. Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Matz M.V., Diatchenko L.B., Siebert P., Lukyanov Sequence-independent method for in vitro generation of nested deletions for sequen large DNA fragments. Anal. Biochem. 1998, V. 256,169-172.

30. Diatchenko L., Lukyanov S., Lau Y.-F.C., Siebert P.D. Suppression subtrai hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Me Enzym. 1999, V. 303, 349-380.

31. Bogdanova E., Matz M., Tarabykin V. , Vsman N„ Shagin D., Zaraisky A., Luky; S.A. Inductive interaction regulating body patterning in planarian, reveald by analys expression of novel gene Scarf. DeV. Biol. 1998, V. 194,287-293..

32. Matz M.V. , Lukyanov S.A., Different strategies of differential display: Area application. Nucleic Acids Research 1998, V. 26, 5537-5543.

33. AkopyansN.S., Fradkov A.F., Diatchenko L.B., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Sverdl

E.D., Berg D.E. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helikobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, V. 95, 1310813113.

4. Матц M.B., Шагин Д.А., Усман Н.Ю., Богданова Е.А., Фрадков А.Ф., Лукьянов С.А. Клонирование регион-специфических генетических маркеров планарии с помощью нового метода - упорядоченного дифференциального дисплея. Биоорганическая Химия 1998, Т. 24 (12), 916-921.

5. Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Богданова Е.А., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции. Биоорганическая Химия 1999, Т. 25 (3), 163-170.

6. Lavrentieva I., Broude N.E., Lebedev Y., Gottesman I.I., Lukyanov S.A., Smith C.L., Sverdlov E.D. High polymorphism level og genomic sequences flanking insertion sites of human endogenous retroviral long terminal repeats. FEBSLett. 1999, V. 443, 341-347.

7. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Lukyanov S., Diatchenko L., and Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Research 1999, V. 27, 1558-1560.

8. Broude N.E., Storm N., Malpel S., Graber J.H., Lukyanov S., Sverdlov E., Smith C.L. PCR based targeted genomic cDNA differential display. Genet. Anal. 1999, V. 15, 51-63.

9. Данилевич B.H., Лукьянов C.A., Гришин E.B. Клонирование и структура гена, кодирующего Л-латрокрустотоксин в составе ядовитых желез паука каракурта. Биоорганическая Химия 1999, Т. 25 (7), 537-548.

0. Matz М„ Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky А.Р., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology 1999, V. 17 (10), 969-973.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лукьянов, Сергей Анатольевич

Актуальность проблемы. Важнейшие процессы, происходящие в различных биологических системах (клеточная дифференцировка и морфогенез в ходе эмбрионального развития и регенерации, программируемая гибель клеток или их опухолевое перерождение и т.д.) находятся под контролем специфических регуляторных генов. Для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе биологических процессов, необходимо выявление и изучение генов, вовлеченных в регуляцию этих процессов. В настоящее время большинство методов молекулярной биологии, направленных на решение этих задач, основаны на использовании полимеразной цепной реакции, сделавшей доступным работу с малыми количествами биологического материала. Однако для применения ПЦР необходимо знание нуклеотвдной последовательности амплифицируемой ДНК. И если методики амплификации известных последовательностей разработаны очень хорошо, то применение ПЦР в случаях, когда нуклеотидная последовательность частично или полностью неизвестна, наталкивается на серьезные проблемы, особенно в вопросах искусственного присоединения к ДНК олигонуклеотидных последовательностей, могущих служить местом посадки праймера в ПЦР, а так же во избежание "фоновой" амплификации (во многих случаях количество "балластной" ДНК на несколько порядков превышает количество "целевой" ДНК).

Несмотря на значительный прогресс в развитии методов, использующих ПЦР, наличие множества технологических трудностей в работе со сложными популяциями фрагментов ДНК (геномной ДНК или суммарной кДНК) не позволяет считать разработку этого раздела генной инженерии близкой к завершению. Таким образом, создание новых высокоэффективных методов анализа геномов и продуктов их гхярессии является актуальной проблемой современной молекулярной биологии. работы. Целью данной работы являлось создание высокоэффективных методов со сложными образцами ДНК, позволяющими выявлять и исследовать новые, •ионально важные гены. В ходе исследования решались следующие задачи: ие эффекта селективной супрессии ПЦР (ССП) и оптимизация параметров, ■ дих на эффективность ССП, разработка ряда новых методов основанных на эффекте ССП, таких как метод создания библиотек кДНК из малых количеств клеток, методы выявления дифференциально экспрессирующихся генов путем прямого сравнения сложных популяций мРНК, методы получения полноразмерных копий кДНК и выявления регуляторных областей генов, метод создания нормализованных библиотек кДНК, метод клонирования ДНК in vitro и некоторых других.

Публикации.

Диссертация обобщает данные 40 основных публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Эффект селективной супрессии ПЦР

Предложенные в данной работе методики основаны на эффекте селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ССП-эффегсте). ССП-эффект состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертироваными концевыми повторами (ИКП) в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП (рис. 1) [19]. Этот факт объясняется следующим образом. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация ИКП (самоотжиг) происходит раньше, чем отжиг праймера, поскольку температура самоотжига ИКП выше температуры отжига праймера. Только небольшая часть молекул ДНК достигает температуры отжига праймера без формирования структуры типа "сковородка", закрывающей сайт посадки праймера. Те молекулы, на которые праймер все-таки отжегся, после синтеза ДНК восстанавливают исходную структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах ПЦР. Степень ингибирования амплификации зависит от многих параметров, из которых основными являются следующие:

1. Различия в температурах отжига ИКП и амплификационного праймера. Соотношение длины и ОС-состава ИКП в целом и последовательности, соответствующей структуре праймера существенно влияют на эффективность ССП. Оптимальным представляется использование ИКП длиной 40-50 п.о. и повышенным содержанием ОС-пар во внутренней (супрессионной) части ИКП и амплификационного праймера, соответствующего внешней половине ИКП (длиной 20-25 о.).

ГГЦР. Поэтому ССП происходит более эффективно при низких концентрациях праймера.

Следующий цикл ПЦР

Структура тала "сковородка отжиг праймера синтез ДНК

Рис. 1. Схема селективной супрессии ПЦР.

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного алаптора (ИКП), соответствующая (ШШШ)-праймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть супрессионного алаптора.

2. Методы, разработанные на основе ССП 2.1. Получение образцов ДНК, содержащих ИКП

Разработано два основных способа присоединения супрессионых последовательностей к молекулам ДНК [35].

1. Лигирование двухцепочечных фрагментов ДНК с двухцепочечным супрессионным адаптером.

Первый способ является практически универсальным, поскольку не требует наличия каких-либо искусственно введенных последовательностей в составе молекул ДНК. Например, образец ДНК для лигирования может быть получен в результате синтеза двухцепочечной кДНК, а также в результате обработки кДНК или геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. Очевидно, оптимальным является наличие фрагментов ДНК с тупыми (а не с липкими) концами, поскольку в этом случае возможно универсальное использование супрессионных адаптеров, имеющих тупой конец для лигирования. Второй способ удобен в тех случаях, когда образец ДНК уже подвергался амплификации и имеет в составе молекул известные последовательности. Примером этого могут служить образцы кДНК, полученные с помощью гомополимерного тэйлирования первой цепи кДНК и последующей ПЦР с Т-праймером или С- и Т-праймерами [2,8].

2.1.1. Получение содержащей ИКП кДНК с помощью лигирования ДНК с супрессионным адаптером (рис 2А)

Первым этапом является синтез двухцепочечной кДНК на основе тотальной или поли(А)+ РНК с помощью стандартных технологий. В качестве затравки для синтеза первой цепи берется Т-праймер. Использование superscript ревертазы дает возможность получать близкую к полноразмерной кДНК.

На следующем этапе производится лигирование полученной кДНК со специальным псевдодвуцепочечным адаптером (супрессионный адаптер). Адаптер представляет собой смесь двух олигонуклеотидов - длинного и короткого, причем короткий олигонуклеотид комплементарен 3'-концевой части длинного. Эти олигонуклеотиды в дуплексе формируют "тупой конец", участвующий в процессе лигирования. Поскольку олигонуклеотиды не фосфорилированы, фосфодиэфирную связь образует только длинный олигонуклеотид, который лигируется своим З'-концом к 5'-концу каждой цепи кДНК. После достройки З'-концов дуплексов молекулы кДНК оказываются симметрично фланкированы последовательностью адаптера.

2.2. Получение библиотек кДНК на основе малого количества биологического материала

Для широкого крута задач, связанных с изучением функциональных и структурных аспектов экспрессии генов, необходимы библиотеки кДНК. Методики их получения из относительно больших количеств изучаемого биологического материала были детально разработаны уже давно и сейчас входят в разряд рутинных и повсеместно используемых генно-инженерных технологий. Однако в случаях ограниченного количества биологического материала и, следовательно, невозможности выделения достаточного количества поли(А)+ РНК (на современном этапе развития молекулярной биологии таких случаев большинство) классические методы оказываются неприменимы. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилось основанием для развития новых методов получения библиотек кДНК из малых количеств тотальной РНК. Для использования ПЦР, однако, необходимо знание хотя бы части нуклеотидной последовательности амплифицирумой ДНК. Наличие в мРНК подавляющего большинства генов поли(А) последовательности дает возможность проводить ПЦР с олиго(ёТ)-содержащего праймера (Т-праймера). Для экспоненциальности амплификации необходим второй праймер, последовательность для отжига которого приходится присоединять к молекулам кДНК искусственно. На сегодняшний день описано несколько методов введения такой последовательности:

1. присоединение гомополимерной последовательности к 3'-концу первой цепи кДНК с помощью концевой нуклеотидилтрансферазы (тэйлирование);

2. дотирование синтетического одноцепочечного олигонуклеотвда к З'-концу первой цепи кДНК (Dumas 1991) или к 5'-концу мРНК (Liu 1993) с помощью РНК лигазы фага Т4:

Лигирование двухцепочечных молекул с помощью Т4 ДНК лигазы является более эффективным и воспроизводимым подходом, чем тэйлирование или лигирование одноцепочечных субстратов с использованием Т4 РНК лигазы. Однако метод, основанный на использовании Т4 ДНК лигазы имеет очень существенный недостаток: он позволяет работать только с поли(А)+ РНК. В том случае, если синтез кДНК ведется на основе суммарной РНК. даже использование Т-праймера в качестве затравки не предотвращает синтеза большого избытка фоновой кДНК на матрице рибосомальной РНК.

Предложенный в настоящей работе метод основан на лигировании супрессионного адаптера к лв\лцепочечной кДНК и последующей ПЦР-амплификации кДНК с использованием Т-праймера и праймера. соответствующего внешней половине адаптера (Out-праймер, Out - от англ. "outer", внешний). Схема предлагаемой процедуры получения библиотек кДНК приведена на рис.2.

Следует отметить, что при синтезе са-кДНК в случае тотальной РНК кДНК синтезируется не только на матрице поли(А)+ РНК, но и в значительной мере на основе рибосомальной РНК за счет неизбежно присутствующих в образце РНК коротких фрагментов РНК и ДНК, выступающих в роли затравок. Однако после лигирования псевдодвуцепочечного адаптера и достройки концов, такая "фоновая" кДНК оказывается фланкирована ИКП.

Далее са-кДНК амплифицируется в ПЦР с Т-праймером и праймером, идентичным внешним 22 нуклеотидам адаптера. В ходе такой ПЦР происходит селективная амплификация фракции кДНК, имеющей в своей структуре Т-праймер. Ингибирование амплификации остальной кДНК, несущей на обоих концах молекул последовательность адаптера, достигается за счет ССП. Таким образом, оказывается возможным получать библиотеки кДНК на основе малых количеств суммарной РНК без выделения фракции поли(А)+ РНК.

Использование системы "long and accurate" ПЦР позволяет получать близкие к полноразмерным библиотеки кДНК, а также значительно снижать количество poly А (+) фракция poly А (-) фракция кДНК: синтез 1 цепи кДНК синтез 2 цепи кДНК

Т-праймер лигирование супрессионных адаптеров достройка выступающих концов кДНК тгп ТТЛ гтги гтти кДНК|

ПЦР с Т- (=3) и Out раз) праймерами экспоненциальная амплификация нет амплификации

Рис. 2. Схема получения образцов кДНК на основе суммарной РНК с помошью ССП. А.- получение кДНК, содержащей ИКП (са-кЛНК). Б. -приготовление кДНК библиотек из малого количества биологического материала.

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптера (ИКП), соответствующая ОиЬпраймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть супрессионного адаптора. Белый прямоугольник- Т-праймер и комплементарная ему последовательность.

РОСП./ЛТ' гос. ~ - ? нуклеотидных замен в ходе ПЦР.

Возможности предлагаемой методики были продемонстрированы на модельной системе, в качестве которой была использована тотальная РЖ скелетной мышцы человека. Было показано, что предложенный метод позволяет получать близкие к полноразмерным репрезентативные библиотеки кДНК из малых (10-100 нг) количеств суммарной РНК, по качеству не уступающие библиотекам, получаемым классическими методами из 5-10 мкг поли(А)+ РНК [21]. В дальнейшем библиотеки кДНК, полученные указанным образом, успешно использовались нами для выявления и анализа функционально важных экспрессирующихся последовательностей в различных биологических системах [3,4,5,7,22,25,31].

2.3. Метод амплификации 5' и 3' концевых фрагментов кДНК

ПШШИИШ

•шшпшш

ПЦР с праймерами

ШШ#> И экспоненциальная амплификация супрессия амплификации

Рис. 3. Схема метода быстрой амплификации 5'- и 3'- концевых фрагментов ЛНК.

Вертикально заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптера, соответствующая ОиЬпраймеру (заштрихованная стрелка) в ПЦР, и комплементарная ей последовательность. Черный прямоугольник - внутренняя часть адаптера и комплементарная ей последовательность. Белый прямоугольник - известная последовательность ЛНК. Белая стрелка - специфический праймер. основе уже известной последовательности изучаемого гена). При этом селективно амплифицируются только молекулы, содержащие сайт для отжига специфического праймера, т.е. 5'- или 3'-концевые (в зависимости от направления специфического праймера) последовательности интересующего гена. Амплификация молекул, не содержащих сайта для отжига специфического праймера, подавляется, благодаря ССП-эффекту (рис.3).

Рис. 4. 5'- и 3'- RACE актина и трансферинового рецептора (TFR) с использованием полиА(+) и тотальной РНК в качестве матрицы для синтеза кДНК.

Для полиА(+) РНК было сделано 25 циклов ПЦР, для тотальной РНК-27 циклов ПЦР. М - маркер (lkb ladder, Life Tech.); 1,6 - продукт ПЦР с использованием одного Out-праймера (контроль); 2-5,7-10-продукты ПЦР с использованием Out и специфических праймеров:2,7 - 5-RACEактина; 3,8 - З'-RACE актина; 4,9- 5-RACE TFR; 5,10- З'-RACE TFR.

2.4. Метод выделения промоторных участков генов путем прямой амплификации из геномной ДНК

Для подтверждения эффективности предложенной технологии прогулки по хромосоме нами была клонирована промоторная зона гена интерлекина IL-lp мыши (Рис 5) [6]. Метод был так же использован при клонировании гена, кодирующего Аpoly А+ RNA total RNA

12.0 ~

3.02.01.

1.0 kb М 1 2 3 <1 5 М з.о~-1.6" 1.0

Рис. 5. Результаты амплификации промоторной зоны гена

IL-1|3 мыши.

Амплифицированный продукт был получен в ходе двух последовательных "long and accurate" ПЦР (34 и 20 циклов) с использованием Out - праймера и двух последовательных специфических праймеров. В качестве матрицы использовалась геномная ДНК, обработанная различными эндонуклеазами рестрикции: 1 - EcoR V; 2 - Seal; 3 - Dral-4 - PvuII; 5 - Sspl; M - маркер (1 kb ladder). латрокрустотоксин из ядовитых желез паука каракурта [39].

2.5. Методы выявления дифференциально экспрессирующихся генов

2.5.1. Дифференциальный дисплей.

Техника дифференциального дисплея мРНК, основанная на использовании короткого олигонуклеотидного праймера, имеющего низкую температуру отжига и способного вести ГЩР-амплификацию ограниченного пула фрагментов кДНК, была предложена в 1992 году Liang и Pardee и до сих пор весьма популярна при поиске дифференциально экспрессирующихся генов. Однако, использование праймеров произвольной структуры делает невозможным проведение систематического сравнения анализируемых образцов по всем видам мРНК. Кроме того, использование олигонуклеотидных праймеров с низкой температурой отжига сопровождается неспецифической амплификацией и приводит к многочисленным артефактам. Принципиально другой подход, ориентированный на систематическое сравнение образцов по всем видам мРНК и основанный на разделении 3'-концевых рестриктных фрагментов кДНК, был предложен Ивановой и Белявским в 1995 году. К недостаткам этого подхода можно отнести его ограниченную чувствительность и трудоемкость процедуры.

Предлагаемый в настоящей работе метод Упорядоченного Дифференциального Дисплея мРНК (УДД) также основан на анализе 3 '-концевых рестриктных фрагментов кДНК. Однако в предлагаемой нами технологии отбор этих фрагментов осуществляется не с помощью физической сепарации, а в результате ПЦР, в ходе которой селективно амплифицируются только 3'-концевые фрагменты кДНК, что ведет к существенному упрощению метода и повышает его чувствительность.

На следующем этапе проводится избирательная амплификация 3'-концевых фрагментов кДНК в ходе ПЦР с Т-праймером и Ош-праймером. В результате каждый вид мРНК оказывается представленным в образце единственным 3'-концевым фрагментом кДНК характерной длины.

Согласно литературным данным, в эукариотической клетке обычно экспрессируется не менее 10 ООО различных генов. Для проведения сравнительного анализа образцов с помощью ПААГ необходимо разделение полученного пула 3'концевых фрагментов кДНК на субпопуляции, содержащие не более 150-200 индивидуальных фрагментов кДНК. Это достигается путем "прореживающей амплификации" полученных образцов кДНК в ПЦР с двумя заглубленными на два дополнительных основания со стороны 3'-конца праймерами - ЕТ-праимером (Extended Т-праймер) и EIn-праймером (In от английского Inner, внутренний праймер), соответствующим внутренним 22 нуклеотидам адаптера. Существует 16 вариантов кДНК г==И обработка эндонуклеазой рестрикции | лигирование адаптеров

ПЦР с праймерами нет амплификации экспоненциальная амплификация

ПЦР с заглубленными праймерами mm-XlYl анализ на ПААГ

Рис.6. Схема упорядоченного дифференциального дисплея (УДЛ).

Заштрихованный прямоугольник - внешняя часть супрессионного адаптора (ИКП), соответствующая Out-праймеру в П1ЛР и комплементарной ему послеловательности. Черный прямоугольник - внутренняя часть адаптора, соответствующая In-праймеру в ПЦР и комплементарной ему последовательности. Белый прямоугольник - Т-праймер и комплементарная ему последовательность. CHZ3-XY , -ET-праймер пгш-ХТ Y Г -Ein -праймер заглубления для праймера Ein и 12 - для праймера ET (4 праймера ET-tn, где "п" -любое нуклеотидное основание, очевидно, нефункциональны и исключены из рассмотрения).

Б. InE-TA

ТЕ-СА

InE-TT ТЕ-СА

InE-TT TE-GC

123456!

Рис. 7. Выявление с помошью метода УДД последовательностей, дифференциально распределенных вдоль передне-задней оси тела планарии.

А. - на диаграмме показаны зоны на которые была разрезана планария. Полученные фрагменты тела были использованы для выделения тотальной РНК и приготовления на ее основе образцов для УДД. Б.- Радиоавтограф полиакриламидного геля продуктов ПЦР с тремя комбинациями заглубленных праймеров (ET и Ein). Номера дорожек (1-6) соответствуют зонам тела планарии на диаграмме А. Дифференциальные полосы помечены стрелками.

Все получаемые с помощью УДД фрагменты кДНК оказываются асимметрично фланкированы последовательностями адаптера и Т-праймера и могут быть легко реамплифицированы после элюции из геля.

2.5.2. Вычитающая гибридизация кДНК

В литературе представлен широкий спектр различных модификаций метода вычитающей гибридизации, применение которых привело к открытию значительного числа функционально важных генов, участвующих в процессах эмбрионального развития, клеточной дифференцировки, опухолевой трансформации и метастазирования. Однако низкая репрезентативность получаемых с помощью этих методик "вычтенных" библиотек, небольшие степени обогащений, трудоемкость и многостадийность процедур очистки обогащенной фракции не позволяли использовать существующие методы для поиска генов, имеющих дифференциальный характер экспрессии, в целом ряде интересных биологических систем. Наибольшие трудности возникали при работе с ограниченным количеством биологического материала и при идентификации генов, транскрипты которых содержатся в клетке в небольшом количестве (от 1 до 10 копий на клетку).

На первой стадии гибридизации трейсерных образцов с драйвером (молекулы драйвера не несут супрессионного адаптера) образуются несколько типов молекул: одноцепочечный и двуцепочечный драйвер, одноцепочечный трейсер, а также гетерогибрады трейсер-драйвер, образованные общими для образцов драйвера и трейсера молекулами, и гомогибриды трейсер-трейсер, образовавшиеся в результате самореассоциации молекул трейсера и имеющие одинаковые выступающие 5'-концы. На второй стадии вычитания в ходе гибридизации кроме вышеописанных возникает новый тип молекул - геторогибриды трейсер-трейсер, возникшие при реассоциации лигирование ^

Драйвер (в избытке) ригиро; р ц ^ вание денатурация гибридизация агш ша трейсер-трейсер , т гомогибриды трейсер-драйвер гетерогибриды (^-драйвер к-драйвер денатурация гибридизация

Стадия зэ-треисер смешивание гибридизация +

Продукты стадии I

СталияП трейсер-трейсер гетерогибриды

Достройка З'концов РСЯ с праймерами шп + в треисер-драивер гетерогибриды

Зэ-драйвер ^-драйвер

Бэ-трейсер J линейная амплификация нет амплификации

I трейсер-трейсер

I ) гомогибриды супрессия / Л амплификации структура типа "сковородка" экспоненциальная амплификация клонирование и анализ

Рис. 8. Схема метола вычитаюшей гибридизации БвН.

Черные и белые прямоугольники - внутренние части адаптеров А и Б и комплементарные им последовательности. Вертикально и горизонтально заштрихованные прямоугольники - внешние части адаптеров А и Б, соответственно, и комплементарные им последовательности. молекул из разных образцов трейсера и имеющие различные выступающие 5'-концы.

После вычитающей гибридизации производится достройка концов гибридных молекул, вследствие чего на концах гомогибридов трейсер-трейсер формируются ИКП. В ходе последующей ПЦР с парой СМ-праймеров происходит экспоненциальная амплификация только гетерогибридов трейсер-трейсер, фракции, обогащенной специфическими молекулами. Амплификация гомогибридов трейсера подавляется благодаря ССП-эффекту. Гибриды трейсер-драйвер способны только к линейной амплификации, а молекулы одно- и двуцепочечного драйвера и одноцепочечного трейсера вообще не амплифицируются, так как не содержат сайтов для отжига Ош-праймеров.

Согласно компьютерному анализу кинетики процесса гибридизации [18], полученная после о&ьединения двух образцов фракция гетерогибридных молекул трейсера должна примерно равно представлять молекулы кДНК мишени, различные по содержанию в исходном образце. Обогащение для редких транскриптов при этом составляет более чем в 1000 раз относительно их исходной представленности.

Представленная общая схема метода ББН может подвергаться различным технически несложным модификациям для более успешного решения конкретных задач. Например, для получения более высоких степеней обогащения можно ввести дополнительное добавление денатурированного драйвера на второй стадии гибридизации, что создает значительно больший, чем в начале гибридизации, избыток драйвера по отношению к оставшимся в одноцепочечной фракции молекулам трейсера. Этот избыток особенно велик для общих молекул с высоким содержанием. Таким образом, второе добавление денатурированного драйвера преобразует исходную диспропорцию в концентрации общих молекул так, что транскрипты, исходно присутствующие в высокой и средней концентрации, будут практически полностью удалены из одноцепочечной фракции трейсера.

Эффективность предложенной методики была подтверждена в модельных экспериментах с использованием в качестве мишени экзогенной вирусной ДНК, добавляемой к образцу трейсера в определенных концентрациях [1]. Метод был применен для выявления последовательностей, дифференциально экспрессирующихся а ходе различных биологических процессов, таких как активация иммунного ответа в культуре иммунокомпетентных клеток [13] (рис.9), изменение метастатического потенциала опухолевых клеток [12], репаративная регенерация плоских червей планарий [22,31], регенерация хрусталика глаза тритона [4,27], раннее эмбриональное развитие амфибии [20,28]. Кроме того, предложенный метод был использован для создания тканеспецифических библиотек кДНК человека [11,30], а также модифицирован для проведения сравнительного анализа бактериальных геномов близкородственных штаммов патогенных микроорганизмов [33].

Элементы разработанной нами техники вычитающей гибридизации оказалось

Рис. 9. Саузерн-блот гибридизация амплифицированной кДНК трейсера (активированные Лигка! Т-клетки), кДНК драйвера (неактвированные Лигка1 Т-клетки)и образца кДНК после вычитаюшей гибридизации ввН с (А) -кДНК гена рецептора интерлекина2 (активируется при активации имунного ответа в культуре имунокомпетентных клеток) и (В) - кДНК генов глицерид-3-фосфат-дегидрогеназы (обшая последовательность).

1 - кДНК трейсера; 2 - кДНК драйвера; 3 - вычтенный образец кДНК. возможным применить для решения некоторых других задач, таких как создание нормальзованных библиотек кДНК, вывление эволюционно консервативных экспрессирующихся последовательностей и т.д.

2.6. Получение нормализованных библиотек кДНК

Как уже упоминалось выше, по некоторым подсчетам, в геноме человека закодировано около 100 000 генов, а в разных типах клеток экспрессируется 10 00050 000 различных генов. Уровень их экспрессии может варьировать от 200 000 до 1 и менее копий на клетку. По уровню экспрессии гены можно условно разделить на три класса: мажорные, средние и минорные. Обычно в клетке экспрессируется 10-20 мажорных генов (мРНК каждого из которых содержится в числе нескольких тысяч копий), несколько сотен средних генов (по несколько сотен молекул мРНК каждого вида) и несколько тысяч минорных генов (от одной до нескольких десятков копий каждой мРНК). Столь большая разница в представленности мРНК чрезвычайно усложняет задачу анализа библиотек кДНК, особенно при работе с редкими генами. Так, интенсивно разрабатываемый в настоящее время проект секвенирования всех кДНК человека требует анализа 106-108 клонов из каждой библиотеки для выявления редкопредставленных последовательностей, в то время как высоко- и среднепредставленные последовательности будут представлены многими клонами. Для решения этой проблемы необходимы так называемые нормализованные библиотеки, т. е. библиотеки, в которых разные виды кДНК имеют приблизительно равную представленность. Наиболее эффективный подход к созданию нормализованных библиотек основан на том, что реассоциация денатурированной двухцепочечной ДНК является реакцией второго порядка, и, следовательно, мажорные последовательности реассоциируют значительно быстрее, чем минорные. Таким образом, если образец двухцепочечной кДНК денатурировать и оставить ренатурировать, то основная масса высокопредставленных молекул перейдет в двухцепочечную (ds) форму, и одноцепочечная (ss) фракция кДНК станет в значительной мере нормализованной. Отбор этой ss-фракции представляет наибольшую проблему при создании нормализованных библиотек. В ранее опубликованных работах эта проблема решалась низкоэффективным физическим разделением ss- и ds-фракций с помощью гидроксиапатитовых колонок или магнитных шариков.

Предлагаемый в данной работе метод создания нормализованных библиотек использует тот же принцип, который применялся в ходе вычитающей гибридизации для нормализации трейсерной кДНК. Образец кДНК разделяется на две пробирки и обрабатывается так же, как трейсер для вычитающей гибридизации. Дальнейшие процедуры также соответствуют стадиям вычитающей гибридизации, однако, проводятся в отсутствие кДНК драйвера. При этом в ходе первой гибридизации происходит нормализация вв-фракции кДНК. Из-фракция после первой гибридизации представлена только гомодуплексами - молекулами, несущими на 5'-концах обеих цепей одинаковые последовательности супрессионного адаптера. После смешивания двух образцов, в ходе второй гибридизации только молекулы, принадлежащие нормализованной вв-фракции, способны к образованию гибридов. Так как в растворе присутствуют молекулы из обоих образцов, наряду с гомодуплексами формируются гетеродуплексные молекулы, фланкированные разными супрессионными адаптерами. Таким образом, нормализованная зБ-фракция кДНК, образовавшаяся в результате первой гибридизации, после второй гибридизации частично переходит во фракцию гетеродуплексов. После достройки З'-концов гетеродуплексные молекулы, т.е. нормализованная фракция, в отличие от всех остальных могут быть селективно амплифицированы с помощью ПЦР с Ош-праймерами [15].

2.7. Селективная амплификация эволюционно консервативных последовательностей

В предложенном методе "сложения" в общие (высококонсервативные) для двух изучаемых образцов молекулы кДНК вводятся некомплементарные друг другу 3'- и 5'-концевые части, позволяющие вести амплификацию с соответствующих праймеров, в то время как низкоконсервативные последовательности получают ИКП и их амплификация блокируется.

2.8. Клонирование in vitro

Несмотря на то, что в последние годы большинство классических методов генной инженерии было улучшено или даже полностью вытеснено более удобными и эффективными методиками, использующими ПЦР, в области молекулярного клонирования ДНК старые методы сохранили ведущую роль (клонирование в бактериальных, фаговых и других системах in vivó). Это делает актуальным разработку альтернативных методов клонирования, позволяющих амплифицировать с помощью ПЦР и затем секвенировать индивидуальные молекулы ДНК неизвестной последовательности без клонирования in vivo. Метод, названный клонированием in vitro, включает в себя следующие основные этапы [26]:

1. Дотирование подлежащих клонированию фрагментов двухцепочечной ДНК одновременно с двумя супрессионными адаптерами. Предпочтительным является использование адаптеров с идентичной внешней половиной.

3. ПЦР-амплиф икация индивидуальных молекул ДНК с использованием Out-праймеров.

Полученные таким образом продукты ПЦР, названные in vitro клонами, соответствуют индивидуальным молекулам ДНК. Благодаря ССП-эффеюгу in vitro клоны обязательно фланкированы последовательностями разных адаптеров, что позволяет секвенировать клонированный фрагмент ДНК любым методом, пригодным для продуктов ПЦР.

3. Клонирование in vitro решает проблему конкуренции в скорости амплификации и в эффективности клонирования между разными последовательностями в составе сложных смесей кДНК. Например, обычной причиной артефактов при стандартном клонировании сложных образцов амплифицированной кДНК является избыточное число циклов ПЦР. После насыщения амплификации из-за нехватки праймеров кДНК в ходе последующих температурных циклов становится денатурированной. После окончания ПЦР только частопредсгавленные виды кДНК успевают ренатурировать и перейти, таким образом, в подходящую для клонирования форму. Редкие виды кДНК преимущественно остаются в одноцепочечной форме и поэтому элиминируются из клонированной библиотеки. В результате представительность полученной библиотеки не соответствует представительности исходного образца.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И

Рис. 10. Типичный результат клонирования in vitro в 96-луночном планшете в присутствии бромистого этндия. а) Планшет в проходящем УФ-свете после ПЦР. (б) Электрофорез в 2% агарозном геле продуктов ПЦР из окрашенных бромистым этидием проб (2 мкл из каждой пробы). М - маркер длин (1 kb ladder, Gibco BRL). Над остальными дорожками указаны номера соответствующих лунок планшета.

Для получения удобного материала для дифференциального скрининга и секвенирования возможно получение панели in vitro клонов. На старт амплификации берется столько молекул кДНК, чтобы большая часть пробирок не содержала кДНК и только в некоторых из них имелись одиночные in vitro клоны. Амплификацию удобно проводить в 96-луночных планшетах в присутствии бромистого этидия в составе смеси. После амплификации лунки, содержащие кДНК, при облучении уф-светом оказываются окрашены, в то время как лунки без кДНК остаются темными. Это избавляет от необходимости электрофоретического анализа содержимого всех лунок. Типичный результат получения in vitro клонов в 96-луночном планшете показан на рис. 10. Мы использовали данный подход для дифференциального скрининга библиотек кДНК, полученных с помощью вычитающей гибридизации [14,30]. Кроме того, нами был разработан протокол для быстрого получения панели перекрывающихся субклонов для секвенирования длинных (5 т.п.о.) фрагментов ДНК [29].

Комплексное использование разработанных методов идентификации и анализа генетических последовательностей, основанных на ССП-эффекте, позволило выявить и клонировать полноразмерные кДНК копии ряда генов, вовлеченных в регуляцию различных биологических процессов, таких как эмбриональное развитие, регенерация, опухолевое метастазирование и др. Одним из наиболее удачных примеров применения предложенных методов может служить исследование регенерации планарий, приведшее к идентификации нового семейства лектиновых генов, вовлеченных в регуляцию восстановительных процессов, и открытию индукционных взаимодействий между различными регионами тела планарии.

3. Выявление и анализ генов, вовлеченных в контроль репаратнвной регенерации у планарий

Одно из важнейших свойств живых существ - способность восстанавливать целостность организма после ранения или утраты части тела. Это свойство может быть обнаружено у самых разных животных - от простейших до высших млекопитающих. В отличие от большинства других систематических групп животных пресноводные планарии обладают способностью к восстановлению утраченного патерна даже из небольших фрагментов тела и являются удобным объектом для изучения генетических основ репаративной регенерации.

3.1. Выявление гомеобокссодержащих генов у планарии

С этой точки зрения особый интерес представляло выделение и изучение гомеобокссодержащих генов семейства АШеппареШа планарий. Продукты генов этого семейства являются транскрипционными факторами и широко известны как регуляторы ключевых этапов формирования плана строения в развитии животных различных систематических групп, таких как насекомые, круглые черви, высшие и низшие позвоночные. В литературе также представлены данные об участии гомеобоксных генов в регуляции процессов репаративной регенерации конечности у амфибий.

Для поиска нуклеотидных последовательностей гомеобокссодержащих генов, экспрессирующихся в регенерационной бластеме планарии, был приготовлен амплифицированный образец кДНК из тканей головной регенерационной бластемы одной особи планарии (раздел 2.2). Продукт амплификации этого образца кДНК в ПЦР с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров, гомологичных наиболее консервативным участкам гомеодомена, был клонирован и секвенирован. В результате было выявлено шесть фрагментов различных ранее неизвестных гомеобокссодержащих генов, которые получили названия йи 1агк-1-6 (ЬшагИ, Dugesia tigrina asexual race homeobox gene). Для сравнительного анализа идентифицированных генов планарии с известными гомеобокссодержащими генами из других организмов необходимо было клонировать полные последовательности гомеобоксов этих генов. Это было достигнуто с помощью оригинальной техники RACE, изложенной выше (раздел 2.3).

Сравнение выявленных нуклеотидньгх последовательностей, а также соответствующих им последовательностей аминокислот, с последовательностями гомеобокссодержащих генов других организмов показало, что Dutarh-3, Dutarh-4 принадлежат к семейству Antennapedia, гомеодомен Dutarh-i обнаруживает сходство с Hoxl.5-, AbdB- и Dfd - гомеодоменами, а гомеодомен Dutarh-6 - с гомеодоменам подсемейства, которое включает мышиные белки Мох-1 и Мох-2, и крысиный Gax. Полученные данные дают основание предполагать, что гомеобокссодержащие гены планарии объединены в кластер, как и у высших животных (рис. 11).

Исследования экспрессии идентифицированных генов показало, что они экспрессируются на низком уровне в теле нерегенерирующих планарий и что уровень их экспрессии не меняется в регенерационных бластемах на ранних стадиях (первый-третий дни) регенерации. Исследования, направленные на выявление роли гомеобокссодержащих генов при регенерации планарий, осуществленные испанскими исследователями (Багуна и сотруд., Барселона, Испания) так же показали, что у планарии, в отличие от представителей других систематических групп, Нох-гвны не вовлечены в контроль полярности и детерминации структур вдоль переднезадней оси тела. Эти данные указывают на наличие других генов, вовлеченных в регуляцию восстановительных процессов и поддержание паттерна тела у взрослых планарий и, возможно, не имеющих близких гомологов у представителей других систематических групп. Для поиска таких генов необходимо применение методов прямого выявления генетических последовательностей, дифференциально экспрессирующихся в ходе регенерации.

3.2. Поиск генов, вовлеченных в регуляцию полярности регенерации у планарий

Hydra спохг и I ж lu

C.elegans ceh-13 ceh-15 шк тао-5 Ml

Planaria (Marti Г DutarM В ■ Dutarhi Outartii OutarM ■ ■ ■ Dthi\ m\ cnoxS-Hm |

DutarhB

Рис.11. Сопоставление гомеобокссодержаших генов семейства Antennapedia у животных различных систематических групп.

По материалам McGinnis and Krumlauf (1992) and Burglin et al. (1991). Я - гены, имеющие гомологов у Drosophila И - гены, не имеющие выраженных гомологий. - гены Drosophila zenl, z2 и bed , не имеющие гомологов у других видов. нормальными пропорциями тела. Простые опыты по смещению линии перерезания вдоль передне-задней оси тела планарии показывают, что отрезанный "хвост" всегда (независимо от уровня перерезки) будет восстанавливать "голову", а "голова" - "хвост".

Для поиска генов, вовлеченных в регуляцию полярности регенерации, нами была выбрана следующая модель [31]. Планария была перерезана в предглоточной области, в морфологически однородной зоне, как показано на рис. 12. Через сутки после операции головная и хвостовая регенерационные бластемы и прилегающие к ним ткани были изолированы и использованы для выделения тотальной РНК и приготовления на ее основе образцов амплифицированной кДНК ("ГБ" - кДНК из головной бластемы и "ХБ" - кДНК из хвостовой бластемы) для проведения вычитающей гибридизации. Использование стратегии получения кДНК из малого количества исходного материала (раздел 2.2) позволило получить образцы кДНК из тканей одной особи планарии, чтобы избежать накопления в вычтенном образце случайных последовательностей, обусловленного индивидуальными различиями между особями.

Для получения библиотек кДНК, обогащенных последовательностями, специфически экспрессирующимися в ходе регенерации различной полярности, было проведено две вычитающей гибридизации (SHH, раздел 2.5.2) - в одном случае трейсером служил образец ХБ кДНК, а драйвером - образец ГБ кДНК, в другом случае в качестве трейсера выступала ГБ кДНК, а драйвера - ХБ кДНК. В результате было получено два образца кДНК, обогащенных последовательностями специфическими для головной бластемы или для хвостовой бластемы.

Дифференциальный скрининг полученных вычтенных образцов кДНК, который проводили методом клонирования in vitro (раздел 2.8), позволил выявить ряд последовательностей, специфичных для регенерации различной полярности. В настоящей работе представлены результаты анализа одной из этих последовательностей (соответствующий ген был назван scarf}, специфичной для хвостовой бластемы.

Рис.12. Схема операции и изоляции тканей лля приготовления образцов кДНК из головной и хвостовой регенераиионных почек и прилегающих к ним тканей.

ГБ" кДНК -образец кДНК из головной бластемы;"ХБ" кДНК -образец кДНК из хвостовой бластемы.

3.3. Ген scarf - представитель нового семейства генов, кодирующих полидоменные лектины С-типа

На основании нуклеотвдной последовательности выделенного фрагмента гена scarf были сконструированы специфические олигонуклеотидные праймеры и с помощью оригинального метода RACE (раздел 2.3), был клонирован полный кодирующий регион кДНК гена scarf. Суммарная длина полноразмерной кДНК гена scarf составляет 875 п.о. (EMBL асс. num. Z66536) и соответствует длине мРНК, определенной с помощью Нозерн-блот гибридизации. Наиболее длинная открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 263 аминокислоты (начиная от первого N-концевого метионина). Анализ последовательности этого полипептида показал, что первые 19 аминокислот составляют сигнальный пептид, за которым следуют два высокогомологичных углеводсвязывающих домена (УСД), характерных для белков, относящихся к семейству лектинов С-типа (рис. 13).

Лектины С-типа беспозвоночных имеют защитную функцию, обеспечивая неиммунный ответ на бактериальную инфекцию. В последнее время появились данные об участии белков этого семейства также в регуляции морфогенеза. Наличие

ScarfA QYTBLNKNKMNTNDAVXYCNSKEII&VKXTDSQTNAAVFEIiASKNGMGTTIÏMNGÏŒIAIEG^

ScarfB EN—T-----T---------DRNMG----PN-EV-VN-TN—L-HNL

Р-селектин WT—YSTKAYSW-ISR---QNRÏTO—A-QNKNEIDYLHKVbPTÏSS. Y—IGIRK. NN. К—

MBP KFFVT-HER-PFSKVKAL-SELRGTVAIPRKAEE-K-IQ-V-KT. . . . SAFLGIT-EVT—QF

ScarfA V. DTENKPLV. . YKNWYKGEPNNWGGNQNCLVAAY. . .HPNEMWFDIGCNTLNSVICEIV

ScarfB -.--------.-----------------------.--------------------YNA

Р-свлектин TWVGTK-A- TNEAE—ADN----KRN-ED-VEIYIKSPSAPGK-N-EH-LKKKHAL-YTA

MBP MYV.TGGR-T. .-S—K-D---DH-SGED-VTXV.D-GL-N—S-QASHTAV—FP ******* ****

Рис. 13. Сравнение аминокислотной последовательности двух углеводсвязываюших доменов, входящих в состав клонированного фрагмента гена scarf (scarf А и scarf В) с углеводсвязываюшими доменами лектинов С-типа млекопитающих: маниозсвязываюшего белка крысы (МВР) и Р-селектина человека.

Совпадающие аминокислоты обозначены прочерками. Звездочками обозначены аминокислотные последовательности, ответственные за связывание субстрата. сигнальной последовательности в структуре Scarf указывает на его принадлежность к секретируемым белкам и позволяет предположить его принадлежность к компонентам межклеточного матрикса.

Кроме двух углеводсвязывающих доменов, в последовательности Scarf не содержится других функциональных доменов. Отсутствие линкера между УСД (они разделены только одной аминокислотой) может говорить о жестком закреплении этих доменов относительно друг друга в составе белковой молекулы. На основании литературных данных о пространственной организации УСД пектинов С-типа была смоделирована возможная трехмерная структура Scarf. Так как оба конца полипептидной цепи УСД располагаются на стороне глобулы, противоположной активному центру, отсутствие между ними линкера приводит к тому, что их центры связывания повернуты в разные стороны. Scarf УСД имеют идентичную аминокислотную последовательность в С-концевой области, обеспечивающей специфичность связывания с лигандом. В то же время их N-концевые регионы значительно различаются. Согласно предлагаемой моделе эти участки соответствуют области междоменного контакта

В литературе представлены данные о нескольких различных группах лектинов С-типа, однако растворимых поливалентных лектинов этого семейства, не содержащих других, кроме УСД, функциональных доменов, до настоящего времени описано не было. Таким образом, можно предположить что белковый продукт гена Scarf является представителем нового семейства лектинов С-типа.

Двухвалентность и секреторность белка Scarf, предсказанные на основе его аминокислотной последовательности, позволяют предположить его функциональное сходство с белками другого семейства - лектинами S-типа. Поливалентные, секреторные белки этого семейства служат сигнальными молекулами, индуцирующими пролиферацию, и агентами, организующими белковые комплексы на поверхности клетки.

3.4. Анализ экспрессии гена scarf у интактных планарий и в ходе регенерации

В теле интактной планарии распределение мРНК гена scarf имеет выраженную зону максимума в предглоточной зоне в виде двух шарообразных сгущений и два идущих от нее в каудальном направлении вдоль нервных стволов тяжа, состоящих из отдельных «са/^-экспрессирующих групп клеток. Был проведен следующий эксперимент: Планарий перерезали в предглоточной области выше (А), через (Б) и ниже (В) зоны максимальной экспрессии scarf. Для контроля за уровнем перерезки один из получившихся кусочков сразу фиксировали, а второй оставляли регенерировать. Через 1, 3, 5, 7, 12, 14 суток после операции регенерирующих планарий каждой серии фиксировали и подвергали whole mount in situ гибридизации со scarf рибозовдом. Результаты эксперимента и схема операции суммированы на рис. 14 и 15.

Рис.14. Диаграмма суммирующая результаты анализа (с помошью whole mount in situ гибридизации) изменений экспрессии гена scarf в ходе регенерации различной полярности планарий при различных уровнях перерезки тела (А, Б, В).

Регион, экспрессируюший scarf отмечен серым.

О лень регенерации £5»* — 1 лень регенерации 7 лень регенерации

Рис.15. Примеры whole mount in situ гибридизации с антисмысловым sea г/-рнбозондом планарий на разных сроках регенерации при различных уровнях перерезки тела (А, Б, В).

Ph - глотка; е - глаза. Масштабная линия соответствует 200 мкм.

Как следует из представленной схемы, в ходе регенерации удаленной головной части падение уровня экспрессии гена scarf происходит при удалении более антериорного (чем зона максимальной экспрессии) региона тела (серии Б и В). Восстановление исходного паттерна экспрессии этого гена происходит после восстановления головного фрагмента (7 день). При неполном удалении антериорной зоны (серия А) картина экспрессии гена scarf не изменяется. В ходе регенерации удаленного хвостового отдела оставшаяся после перерезания зона, экспрессирующая scarf, длительное время не подвергается видимым изменениям (серия Б и В). При перерезании выше зоны максимальной экспрессии scarf в регенерирующих головах (в интактном состоянии экспрессия гена scarf в них не детектируется) наблюдается включение scarf на 5-7 день регенерации.

Полученные результаты позволяют постулировать наличие в теле планарии постоянных индукционных взаимодействий между зоной экспрессии scarf и более акгериорным регионом тела, причем этот регион является источником активирующего сигнала для гена scarf. При удалении этого региона происходит падение уровня экспрессии гена scarf Восстановление исходной картины экспресии scarf связано с восстановлением региона, экспрессирующего активатор. При этом зона, экспрессирующая scarf подавляет активацию этого гена в прилегающих регионах тела. При полном удалении этой зоны в головном фрагменте тела (где остается активатор) наблюдается увеличение уровня экспрессии scarf

Таким образом, исследование изменений экспрессии выявленного нами гена scarf позволило впервые продемонстрировать регулирующие регенерацию индукционные взаимодействия в теле планарии.

4. Новые флуоресцентные белки из кораллов

Другим примером удачного применения методов идентификации и анализа генетических последовательностей, основанных на ССП-эффекте, является выявление новых флуоресцентных белков из кораллов.

Идентификация гена, кодирующего «зеленый флуоресцентный белок» (green fluorescent protein, GFP) из биолюминесцентной системы медузы Aequorea Victoria открыло новую эру в биотехнологии. GFP стал прекрасным маркером, позволяющим исследовать экспрессию, локализацию и регуляцию генов in vivo. Однако данных по

MSKGEEbfTG. VVplLVE2D3DSN6HKgSVs3E5ESDAlr5K2TbKElSTT. GKLFVP. .W

MAQSKHGlTK. EmlSK$l&

§DGH

§V§T

EGGPLPFAE

ZFPS06 ZFP dsFP483 drFP amFP486 CFP4 84 ens. Anthozoa. ens. all

ZFP5Q6 2FPS dgFP483 drFP amFP486 CFP484 ens. Anthozoa. ens. all tlvíípíeEkSid SkedgnSEghk

CMÍÍEIUSÍSvíI PADGP"

Sm^IMADKQKblGÍK^NTKÍRHNIEDGSVQL

- - ■• ото

I PVPKQGIÉKi^SS&fSLLKDGGRLR ÍYP. . RDI

KjjTV. .CDGI. I^fTV. .BDl dl

ZFP506 ZFP dsFP483 drFP amFP486 CFP484 ens. Anihozoa. ens. all

SDHY^KIPIGDG.P'nj.PDt^YgsiQSASSKDPNEKREHi^I^FgiAAaiTHtMlELYK cq$dtv?kaksv . prkmpdv^fÍcÍÍk|

§£drsdaknqi iVIWNNDKEFM.

IdStshnedyt

TDLDKGGN. EÍLNHDKDÍN. ens. Anthozoa. ens. all

Рис. 16. Множественное выравнивание флуоресцентных белков.

Нумерация приведена в соответствии с GFP из Aequorea victoria. Два белка из Zoanthus и еше два из Discosoma сравнивались попарно: в последовательности второго белка из каждой пары инвариантные остатки представлены прочерками. Пропуски отмечены точками. В последовательности A. victoria GFP участки, образующие бета-слои, подчеркнуты. Остатки, боковые цепи которых формируют внутренность бета-банки, выделены серым. В консенсусных последовательностях ("ens."), "О" обозначает ароматический остаток (F, Y, W, Н); = крупный гидрофобный остаток (V,KL.KI,KM,KF,KW); "+" = положительно заряженный остаток (Н, R, К);"" = отрицательно заряженный остаток (D,KE). структуре GFP оказалось недостаточно для понимания механизмов флуоресценции. Клонирование и сравнительный анализ белков гомологичных GFP из других организмов позволили бы значительно расширить наше понимание в этой области. Кроме того, идентификация GFP-подобных белков, имеющих иные спектральные характеристики, могла бы стать хорошей основой для дальнейшего развития технологий анализа экспрессии генов.

Используя разработанный в нашей лаборатории метод быстрого клонирования полноразмерных кДНК, основанный на эффекте ССП, и вырождение олигонуклеотидные праймеры, мы идентифицировали шесть новых генов, продуктами которых являются гомологичные «зеленому белку» из A.victoria флуоресцентные белки (рис.16) [40].

Все шесть генов были выявлены у неспособных к биолюминесценции кораллов (класс Anthozoa), что опровергает общепринятое мнение о функционировании GFP-подобных белков исключительно в составе биолюминесцентных систем. Спектральные характеристики для двух выделенных нами белков имеют принципиальные отличия от GFP. Они имеют максимумы флуоресценции в желтой и красной частях спектра (рис.17). Это открывает широкие перспективы для развития систем анализа экспрессии генов in vivo. Нами была продемонстрирована экспрессия новых флуоресцентных белков в клетках млекопитающих и в эмбрионах шпорцевой лягушки, что подтвердило

Рис.17. Спектры поглощения (сплошная линия) и эмиссии (пунктирная линия) ряда СИР-подобных флуоресцентных белков, возможность использования выделенных выделенных из неспособных к биолюминесценции кораллов (класс Ап^огоа). нами белков в репортерных системах [40].

ВЫВОДЫ.

1. Описан эффект селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ССП) с помощью инвертированных концевых повторов. Исследованы факторы, влияющие на эффективность ССП и подобраны условия для успешного использования открытого ССП эффекта для разработки новых методов анализа сложных образцов ДНК

2. Разработан новый метод быстрого клонирования полноразмерных кДНК на основе информации о структуре фрагмента кДНК.

3. Разработан новый метод "прогулки по хромосоме", позволяющий быстро клонировать промотерные области новых генов.

4. Разработан новый метод приготовления библиотек кДНК из малых количеств суммарной РНК, позволяющий получать близкие к полноразмерным и представительные библиотеки кДНК из 10-100 нг суммарной РНК.

5. Разработан новый метод, позволяющий создавать библиотеки кДНК с приблизительно равной представленностью всех видов транскриптов всего за один раунд нормализации.

6. Разработан новый метод поиска эволюционно консервативных экспрессирующихся последовательностей. Получена обогащенная библиотека кДНК, практически на 100% состоящая из последовательностей (преимущественно 3' некодирующих областей транскриптов), высококонсервативных для человека и хомячка.

7. Разработан новый высокоэффективный метод вычитающей гибридизации кДНК, позволяющий выявлять низкопредставленные дифференциально экспрессирующиеся гены.

8. Разработан новый метод поиска дифференциально экспрессирующихся генов - упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК, позволяющий проводить систематическое сравнение популяций экспрессирующихся последовательностей.

9. Разработан новый метод, названный клонированием in vitro, позволяющий амплифицировать с помощью ПЦР и затем секвенировать индивидуальные молекулы ДНК неизвестной структуры без использования бактериальных, фаговых и других in vivo систем клонирования.

10. Использование основанных на ССП эффекте методов для анализа процессов репаративной регенерации планарий привело к открытию нового семейства полидоменных лектиновых генов, вовлеченных в регуляцию формирования плана строения тела планарий. Анализ экспрессии одного из выявленных генов этого семейства - гена scarf - позволил впервые продемонстрировать индукционные взаимодействия между различными регионами тела планарии, регулирующие клеточную дифференцировку и морфогенез в ходе регенерации.

11. Использование основанных на ССП эффекте методов привело к идентификации шести новых генов, кодирующих флуоресцирующие белки, из кораллов, не способных к биолюминесценции. Два белка имеют принципиальные отличия в спектральных характеристиках от GFP и флуоресцируют в желтой и красной частях спектра.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Лукьянов С.А., Гурская Н.Г., Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Свердлов Е.Д. Высокоэффективная вычитающая гибридизация кДНК. Биоорганическая химия

1994, Т. 20 (6), 701-704.

2. Лаунер Г.А., Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Лукьянов С.А. Простой метод амплификации суммарной кДНК на основе малых количеств суммарной РНК. Молек. генетика, микробиология и вирусология 1994, № 6, 38-41.

3. Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Потапов В.К., Бекман Е.П., Лукьянов С.А. Клонирование фрагментов гомеобокссодержащих генов экспрессирующихся в ходе регенерации планарии. Онтогенез 1994, Т. 25 (6), 28-32.

4. Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Снеговая И.Ю., Долгилевич С.М., Тарабыкин B.C., Зарайский А.Г., Лукьянов С.А., Знойко С.Л., Микаэлян А.С., Миташов В.И. Идентификация новых генов и анализ их экспрессии в процессе регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов. Известия Академии Наук. Серия биологическая 1995, № 3, 271-275.

5. Миташов В.И. Лукьянов С.А., Казанская О.В., Маркитантова Ю.В., Долгилевич С.М., Снеговая И.Ю., Знойко С.Л., Микаэлян А.С. Молекулярно биологические подходы в исследованиях генов в процессе регенерации. Известия Академии Наук. Серия биологическая 1995, № 3, 276-280.

6. Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov К.А. and Lukyanov S.A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA Nucleic Acids Research

1995, V. 23, 1087-1088.

7. Tarabykin V. S., Lukyanov K.A., Potapov V. K., Lukyanov S.A. Detection of planarian Antennapedia-Vke homeobox genes expressed during regeneration. Gene 1995, V. 158, 197-202.

8. Lukyanov K.A., Launer G.A., Tarabykin V. S., Zaraisky A.G. and Lukyanov S.A Inverted terminal repeats permit the average length of amplified DNA fragments to be regulated during preparation of cDNA libraries by polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry 1995, V. 229, 198-202.

9. Лукьянов, Н.Г. Гурская, Е.П. Копанцев, С.А. Лукьянов Селективная амплификация эволюционно консервативных экспрессирующихся последовательностей. Биоорганическая химия 1996, Т. 22 (1), 49-54.

10. Chenchik,A., Diachenko, L., Tarabykin, V., Lukyanov, S., and Siebert, P.D. Full-length cDNA Cloning and Determination of mRNA 5'- and 3'- ends by Amplification of adapter-ligated cDNA. BioTechniques ¡996, V. 21, 526-534.

11. Diachenko, L., Lau Y.-F.C., Campbell A.P., Chenchik,A., Mogadam, F., Huang, В., Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D., and Siebert, D. Suppression Sabtracive Hybridization: A metthod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, V. 93, 6025-6030.

12. Гурская Н.Г., ШагинД.А., Лукьянов К.А., Вагнер Л.Л., Штутман М.С., Мусаткина Е.А., Моинова Е.В., Татосян А.Г., Лукьянов С.А., Свердлов Е.Д. Клонирование с помощью вычитающей гибридизации кДНК гена ha-SDGF из линии клеток сирийского хомячка с повышенным потенциалом метастазирования. Биоорганическая химия 1996. Т. 22 (6), 425-431.

13. Gurskaya N.G., Diachenko L, Chenchik A., Siebert P.D., Khaspekov G.L., Lukyanov K.A., Vagner L.L., Ermolaeva O.D., Lukyanov S.A. and Sverdlov E.D. The Equalizing cDNA Subtraction Based on Selective Suppression of Polymerase Chain Reaction: Cloning of the Jurkat Cells' Transcripts Induced by Phytohemaglutinin and Phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 1996, V. 240, 90-97.

14. Lukyanov K.A., Matz M.V., Bogdanova E.A., Gurskaya N.G., Lukyanov S.A. Molecule by molecule PCR amplification of complex DNA mixtures for direct sequencing: an approach to in vitro cloning. Nucleic Acids Research 1996, V. 24, 2194-2195.

15. Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Матц M.B., Хаспеков Г.Л., Дьяченко Л.Б., Ченчик А.А., Ильевич-Стучков., Лукьянов С.А. Метод получения нормализованных библиотек кДНК, основанный на эффекте супрессии полимеразной цепной реакции. Биоорганическая химия 1996. Т. 22 (9), 686-690.

16. Zavalova L., Lukyanov S., Baskova I., Snezhkov E., Akopov S., Berezhnoy S., Bogdanova E., Barsova E., Sverdlov E.D. Genes from the medicinal leech for unusual enzymes that specifically split endo-e(-g-GLU)-LYS isopeptide bonds and help to dissolve blood clots. Mol. Gen.Genet. 1996, V. 253,20-25.

17. Fradkov A.F., Berezhnoy S., Barsova E.V., Zavalova L.L., Baskova I.P., Lukyanov S.A., Sverdlov E.D. Enzyme from the medical leech that specifically splits endo-e(-y-Glu)-Lys isopeptide bonds: cDNA cloning and protein primary strucrure. FEBS Lett. 1996, V. 390, 145-148.

18. Ermolaeva, O.D., Lukyanov, S.A. and Sverdlov, E.D. The mathematical model of subtractive hybridization and its practical application. Ismb 1996,52-58,

19. Chenchik A., Diachenco L., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G., Tarabykin V. S., Sverdlov E.D., Method for supression DNA fragments amplification during PCR. US patent № 5, 565, 340 (1996).

20. Васильев О.Я., Лукьянов C.A., Белявский A.B., Казанская О.В., Зарайский А.Г. Новый метод вычитающей гибридизации кДНК, позволяющий клонировать гены, дифференциально экспрессирующихся в микропопуляциях клеток. Биоорганическая химия 1996, Т. 22 (12), 894-899.

21. Lukyanov К.A., Diachenko L, Chenchik A., Nanisetti A., Siebert P.D., Usman N.Y., Matz M.V., Lukyanov S.A. Construction of cDNA libraries from small amounts of total RNA using the suppression PCR effect. Biophis.Biochem.Res.Com. 1997, V. 230, 285288.

22. Богданова E.A., Матц M.B., Тарабыкин B.C., Усман Н.Ю., Лукьянов С.А. Дифференциальная экспрессия генов при репаративной регенерации различной полярности у планарий. Онтогенез 1997, Т. 28 (2), 132-137.

23. Usman N. J., Tarabykin V. S., Matz M.V., Bogdanova E.A. and Lukyanov S.A. Whole-mount in situ hybridization on freshwater planarian. Technical Tips Online 1997, (http://www.elsevier.com/locate/tto).

24. Matz, M., Usman N., Shagin D., Bogdanova E. and Lukyanov S. Ordered differential display: a simple method for systematic comparision of gene expression profiles. Nucleic Acids Research 1997, V. 25, 2541-2542.

25. Kazanskaya O.V. , Severtzova E.A., Barth K.A., Ermakova G.V. , Lukyanov S.A., Benyumov A.O., Pannese M., Boncinelli E., Wilson S.W., Zaraisky A.G. Anf. a novel class of vertebrate homeobox genes expressed at the anterior end of the main embrionic axis. Gene 1997, V. 200, 25-34.

26. Лукьянов K.A., Лукьянов C.A. Клонирование фрагментов ДНК за одну полимеразную цепную реакцию. Биоорганическая химия 1997, Т. 23 (11), 882-887.

27. Маркитантова Ю.В., Лукьянов С.А., Казанская О.В., Митащов С.А., Лукьянов С.А. Анализ экспрессии генов, содержащих последовательности Ler-1 и Ver-1 в эмбриогенезе, при регенерации и в интакгных тканях у тритонов. Онтогенез 1997, Т. 28 (4), 262-270.

28. Vasiliev O.L., Lukyanov. S.A., Belyavsky A.V. , Kazanskaya O.V. , Zaraisky A.G. A novel marker of early epidennal differentiation: cDNA subtractive cloning starting on a single explant ofXenopus laevis gastrula epidermis. Intl. J. DeV. Biol 1997, V. 41, 877882.

29. Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Matz M.V., Diatchenko L.B., Siebert P., Lukyanov S.A. Sequence-independent method for in vitro generation of nested deletions for sequencing large DNA fragments. Anal. Biochem. 1998, V. 256, 169-172.

30. Diatchenko L., Lukyanov S., Lau Y.-F.C., Siebert P.D. Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Method Enzym. 1999, V. 303, 349-380.

31. Bogdanova E., Matz M., Tarabykin V. , Usman N., Shagin D., Zaraisky A., Lukyanov S.A. Inductive interaction regulating body patterning in planarian, reveald by analysis of expression of novel gene Scarf. DeV. Biol. 1998, V. 194,287-293.

32. Matz M.V. , Lukyanov S.A., Different strategies of differential display: Areas of application. Nucleic Acids Research 1998, V. 26, 5537-5543.

33. Akopyans N.S., Fradkov A.F., Diatchenko L.B., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Sverdlov

E.D., Berg D.E. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helikobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, V. 95, 1310813113.

34. Матц M.B., Шагин Д.А., Усман Н.Ю., Богданова Е.А., Фрадков А.Ф., Лукьянов С.А. Клонирование регион-специфических генетических маркеров планарии с помощью нового метода - упорядоченного дифференциального дисплея. Биоорганическая Химия 1998, Т. 24 (12), 916-921.

35. Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Богданова Е.А., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции. Биоорганическая Химия 1999, Т. 25 (3), 163-170.

36. Lavrentieva f., Broude N.E., Lebedev Y., Gottesman I.I., Lukyanov S.A., Smith C.L., Sverdlov E.D. High polymorphism level og genomic sequences flanking insertion sites of human endogenous retroviral long terminal repeats. FEBS Lett. 1999, V. 443, 341-347.

37. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Lukyanov S., Diatchenko L., and Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Research 1999, V. 27, 1558-1560.

38. Broude N.E., Storm N., Malpel S., Graber J.H., Lukyanov S., Sverdlov E., Smith C.L. PCR based targeted genomic cDNA differential display. Genet. Anal. 1999, V. 15, 51-63.

39. Данилевич B.H., Лукьянов C.A., Гришин E.B. Клонирование и структура гена, кодирующего /f-латрокрустотоксин в составе ядовитых желез паука каракурта. Биоорганическая Химия 1999, Т. 25 (7), 537-548.

40. Matz М., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky А.Р., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology 1999, V. 17 (10), 969-973.

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Печать офсетная. Усл.п.л 1,5. Тираж 100 экз. Заказ №

Информация о работе

Лукьянов, Сергей Анатольевич
доктора биологических наук
Москва, 1999
ВАК 03.00.03

Диссертация

Селективная супрессия полимеразной цепной реакции - новый подход к анализу структуры и экспрессии сложных геномов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы