Экспериментально вызванные патофизиологические состояния и их компенсация методами биоинженерии

Куликов, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментально вызванные патофизиологические состояния и их компенсация методами биоинженерии
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментально вызванные патофизиологические состояния и их компенсация методами биоинженерии"

На правах рукописи

Куликов Александр Владимирович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ВЫЗВАННЫЕ ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ И ИХ КОМПЕНСАЦИЯ МЕТОДАМИ БИОИНЖЕНЕРИИ

03.00.13 - «Физиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Владимир Иванович Новоселов;

доктор биологических наук Владимир Иванович Архипов;

доктор биологических наук Ирина Владимировна Ермакова

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

Защита состоится 2?- ОК. УЛА. 2004 г. в 14 часов на заседании специализированного Диссертационного совета Д002.093.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизике РАН по адресу: 142290, г.Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г.Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «2-2)» С&.\Л*Л\ & 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.ф.-м.н.

Актуальность проблемы

Известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами относительной иммунопривилегированности. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам в первую очередь относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и семенник. Связано это с особым строением гисто-гематических барьеров этих областей, в норме не пропускающих иммунокомпетентные клетки. Те же активированные иммунные клетки, которые все же проникают в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-ligand, экспрессированного в этих участках. Функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L - система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

К настоящему времени в область ЦНС трансплантированы почти все участки эмбрионального и фетального мозга от соматосенсорной коры, гиппокамппа и мозжечка (Александрова, 1999; Bragin et al., 1988; Shetty et al., 1997; Sommer et al., 1997) до участков спинного мозга (Nornes et al., 1984) и других виды нейронов, способных к выживанию и росту в области ЦНС.

Если в мозг пересаживали в основном ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы от нейрональных и опухолевых до эндокринных (Green, 1967; Hoffer, Seiger, 1974; Weber et al., 1975; Братин, Виноградова, 1983; Миронов, 1988).

В семенник пересаживали тиреоидную ткань, лейдиговские клетки, клетки гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и др. (Scothorne 1977; Setchell et al., 1995; Кирпатовский и др., 1994,1999; Каитова, 2003).

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС, переднюю камеру глаза и тестюсул успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al.,1979; Bjorklund, Stenevi, 1979).

В восьмидесятые годы прошлого века широкое применение получила экспериментальная алло- и ксенотрансплантация инсулинпродуцирующих клеток и тканей в печень, в пульпу селезенки, внутрибрюшинно, под капсулу почки (Скалецкий 1987;Скалецкий,Шальнев 1988; Tze, Tai, 1983; Brown etal., 1984;Bretzel, 1984; David et al., 1988; Powell, 1987; Kaufman et al., 1990; Hiller et al., 1991). По результатам исследований в этом направлении разработан ряд новых подходов для клинической трансплантации.

Разработанная в НИИТиИО МЗ РФ в эксперименте и внедренная в клиническую практику трансплантация культур островковых клеток аллогенного и ксеногенного происхождения, приводит к тому, что в процессе культивирования происходит снижение иммуногенности трансплантата. Этот способ позволяет применять в качестве места для пересадки не только печень и селезенку, но и мышцы передней брюшной стенки, что делает операцию значительно менее травматичной для пациента. Трансплантация проходит без иммуносупрессии. Положительное влияние пересадки проявляется в виде снижения

лабильного течения диабета и торможения прогрессирования поздних осложнений диабета (Шумаков и др. 1981; 1998;Скалецкий, Онищненко, 2001; Скалецкий и др. 2002; Shumakov et а1., 1989).

Несомненный интерес представляет возможность пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в те области, в которых в силу анатомического строения и выработки иммуномодулирующих агентов, они могут функционировать длительное время. В настоящее время накоплен значительный клинический опыт в области нейротрансплантации при болезни Паркинсона, начаты операции при других нейродегенеративных заболеваниях ЦНС - хорее Гентинггона, при эпилепсии, травме спинного мозга (Макаренко и др., 1998; Ьтёуа1 й а1., 1994; ^гашоу й а1., 1996; 01апо«^ й а1., 1997). Несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ по трансплантации тканей в относительно иммунопривилегированные зоны организма, в этой области осталось еще большое количество нерешенных проблем. В ходе выполнения работы были поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате проведенных исследований предложены оригинальные модели компенсации экспериментального диабета, норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса. Несомненно, с помощью экспериментальных физиологических работ в этом направлении можно заложить основу для разработки новых медицинских методов долговременной компенсации ряда нейродегенеративных и эндокринных патологий.

Цель работы

Использование свойства относительной иммунологической привилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника для разработки трансплантологических способов компенсации патологических состояний у животных. Оптимизация использования этих способов в экспериментальной биологии.

Задачи исследования

1.Разработка трансплантологических способов компенсации норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса, диабета. Разработка методов оценки их эффективности.

2. Исследование физиологических, биохимических и иммунологических особенностей протекания экспериментальных патологий в период их инициации, течения и долговременной компенсации с помощью трансплантации тканей в мозг, переднюю камеру глаза, семенник.

Научная новизна работы

1. Показана возможность долговременной компенсации норадренергической недостаточности и поведенческих реакций после воздействия нейротоксина (6-ОДА) и последующей трансплантации ткани синего пятна.

2. Разработаны способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс. Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных.

3. Разработаны новые способы долговременной компенсации экспериментального аллоксанового диабета с помощью трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированные участки организма — мозг, передняя камера глаза, семенник. Показано, что при этом происходит полная или частичная нормализация основных физиологических и биохимических показателей. При

трансплантации поджелудочной железы в семенник сохраняется фертильность животных.

Результаты исследований носят приоритетный характер. Положения, выносимые на защиту

1. С помощью нейротрансплантации можно добиться заметной нормализации экспериментальной норадренергической недостаточности и связанного с ней нарушения поведенческих реакций у животных.

2. Возможна приостановка возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных с помощью алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей.

3. Относительная иммунологическая привилегированность мозга и передней камеры глаза позволяет с помощью трансплантации эмбриональной поджелудочной железы частично или полностью компенсировать экспериментальный диабет у животных на сроки соизмеримые с естественной продолжительностью их жизни.

4. Трансплантация неонатальной поджелудочной железы в семенник при экспериментальном диабете восстанавливает основные метаболические показатели. Сама трансплантация поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника не влияет на фертильность животных.

Научно-теоретическое и практическое значение работы

Проведенные исследования направлены на решение нескольких важных проблем. В первую очередь, это возможность восстановления физиологических, биохимических, а в некоторых случаях, иммунологических сдвигов при различных патофизиологических состояниях. Разработанные трансплантологические способы позволяют проследить особенности метаболических изменений в различных системах организма в период возникновения, течения и компенсации таких патофизиологических состояний, как диабет, старение, последствия радиационного облучения, нейродегенеративные изменения. В процессе выполнения работы использованы различные схемы алло- и ксенотрансплантации ткани в различные области организма, что позволяет сравнить их преимущества и недостатки.

Разработанные модели могут быть использованы как сравнительные при проверке влияния новых лекарственных препаратов в период проведения их доклинических испытаний.

Полученные данные расширяют возможности оценки метаболических сдвигов, наблюдающихся в организме больных, получивших радиационное облучение либо подвергшихся серьезному стрессу, страдающих диабетом, а также у пожилых людей.

Отсутствие значительного воздействия трансплантации неонатальной поджелудочной железы в семенник на фертильность позволяет предположить возможность разработки метода для применения в клинической практике.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на Ученом совете ИТЭБ РАН и секции ученого совета «Клеточная инженерия», а также более чем на 30 конференциях, симпозиумах, съездах. Некоторые из них: «III International school-conference of scientists of socialist countries» (Германия, Prieros, 1989); «Signal molecule and mechanisms of animal behavior» (Pushchino, 1989); «III Всесоюз. съезд эндокринологов» (Ташкент, 1989); «Soviet-Indian simposium on neurotransplantation and developmental neurobiology» (Puschino, 1991); «Workshop on intercellular communication»: (Puschino, 1994); IV Всероссийское совещание «Культивирование клеток животных и человека» (Пущино, 1994); Всероссийской конференции «Новые технические средства в диагностике и

лечении заболеваний органов пищеварения» (Фрязино, 1995); Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1996); Всероссийская научно-практическая конференция «Распространение эндокринопатии: сахарный диабет, остеопороз, эндемический зоб» (Пущино, 1997); II съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997); Первый международный симпозиум «Фундаментальные науки и альтернативная медицина» (Пущино, 1997); IIIV конференция «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998); III Международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков, 1998); XVII съезд Всероссийского физиологического общества имени И.П.Павлова (Ростов-на Дону, 1998); IV Международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2000); Международный симпозиум «Оптимизация функций сердца и мозга» (Тамбов, 2000); Ш Национальный геронтологический конгресс Украины (Киев, 2000); Всероссийская научная конференция «Проблемы гериатрии в хирургии» (Москва, 2000); VI RFBR international conference «Molecular medicine» (Puschino, 2001); XXVIII съезд физиологического общества имени И.П.Павлова (Казань, 2001); Всероссийская научная конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001); IV съезд по радиационным исследованиям (Москва, 2001); III съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V Международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2002); Russian - South Korean conference of innovative scientific and technical projects in the field of biotechnology (Puschino, 2002); II Всероссийская научная конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002); конференция «Новые технологии в медицинской практике» (Москва, 2003); I Международная медицинская конференция «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав с результатами исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена пи страницах машинописного текста, включающих графики, диаграммы, микрофотографии. В списке цитируемой литературы 59% источников ( Ю О в отечественных и в зарубежных изданиях).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали крыс-самцов Вистар и беспородных. Для операции отбирали животных одного возраста, с начальной массой 200-230 г. Кролики-самцы породы Шиншилла, используемые в экспериментах, имели начальный вес 25003000 г., самки-доноры более 4500 г. Мыши SHK разного возраста. Все животные выращивались в условиях вивария на стандартной диете. Эмбриональных цыплят и 1-месячных поросят получали в специализированных хозяйствах Московской области. Длиннохвостые якутские суслики Citellus Undulatus, привозились из экспедиции и затем содержались в специализированных помещениях с необходимым температурным режимом.

Всего в работе использовали более 4000 крыс, 30 кроликов, 7 сусликов, 360 мышей, эмбриональных цыплят 21,1-месячных поросят-2.

Получение крыс с норадренергической недостаточностью

Новорожденным крысам в первые трое суток ежедневно вводили подкожно нейротоксин 6-оксидофамин (6-ОДА, «Sigma», США) 100мг/кг в результате чего

достигалось хроническое снижения уровня норадреналина в мозге (Jonsson et al., 1975, 1982, Семенова и др. 1983, Медвинская 1997).

Трансплантация участков синего пятна

Животных 6-месячного возраста с депривацией норадренергической системы оперировали в стерильных условиях в специально оборудованной операционной комнате. Для пересадки брали ткань 17-дневных эмбрионов. Ткань для трансплантации объемом около 1 мм3 иссекали из области синего пятна или из закладки гиппокампа. Последний был использован для контрольных опытов как структура, не содержащая норадренергических нейронов. Выделенный материал помещали в раствор Игла. Крысам реципиентам под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) слева на черепе делали трепанационное отверстие диаметром 2-3 мм, центр которого располагался над фронтальной корой, и отсасывали небольшой участок коры. Далее первой группе животных посредством шприца со стеклянным наконечником вводили ткань из области закладки синего пятна. Один трансплантат вводили под углом через боковую стенку ямки в паренхиму коры контрлатерального полушария, другой помещали на дно ямки. Второй группе таким же образом вводили участки ткани гиппокампа. Третьей группе (ложнооперированные) вводили эквивалентный раствор Игла.

Изучение ориентировочно-исследовательской двигательной активности

Установка для изучения у крыс ориентировочно-исследовательской двигательной активности представляет собой квадратную площадку размером 1 м2, расчерченную на 100 одинаковых квадратов и окруженную барьером высотой 40 см. Поле освещали электрической лампочкой мощностью 200вт, расположенной на высоте 1 м от его центра. Эксперименты проводили в утренние часы (с 9 до 11) в звукоизолированной камере с рассеянным освещением. Длительность эксперимента составляла 3 минуты при ярком освещении поля. При этом учитывали, число пересеченных квадратов (показатель горизонтальной исследовательской активности) и число вставания на задние лапки (показатель вертикальной исследовательской активности). Работа проводилась совместно с к.б.н. Н.И.Медвкнской, д.б.н. Т.П.Семеновой.

Трансплантация тимуса и костного мозга в переднюю камеру глаза животных

Трансплантируемую ткань тимуса выделяли из крыс самцов "Wistar" массой 120 г. Костный мозг выделяли из бедренной кости. В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса либо костного мозга измельчали до размера частиц примерно 1 мм3. Крысам-реципиентам на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина с тем, чтобы максимально раскрылся зрачок, и уменьшилась площадь радужной оболочки. Через 5 минут на глаз наносили по 1 капле 0,5%-раствора дикаина, что в еще большей степени снижало чувствительность глаза при операции. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом. Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом. В разрез длиной 1,5-2 мм медленно (7-10 сек) выдавливали трансплантируемые кусочки ткани объемом 3-5 мм3 и помещали их на радужную оболочку глаза, как можно дальше от разреза. Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете.

Облучение животных

Эксперименты по облучению проводили на гамма-установке биологического эксперимента в специальных контейнерах, куда помещали не более 5 животных

одновременно. Облучение осуществляли y-лучами 60Со с мощностью дозы 1,51,6 Гр/мин в течение 2,5-5 минут при комнатной температуре.

Получение экспериментального диабета

Экспериментальный диабет у крыс получали с помощью аллоксана фирмы "Chemapol", «ДИАэМ», «Sigma», обладающего избирательным токсическим действием на У?-клетки, продуцирующие инсулин. Внутрибрюшинно вводили 5%-раствор токсина, из расчета 200-280 мг сухого вещества на 1 кг массы тела. У кроликов экспериментальный диабет вызывали внутривенным введением 170мг/кг 5%-раствора аллоксана.

Алло- и ксенорансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза

Для трансплантации отбирали животных, у которых в течение 2-х и более недель гликемия была не менее 19,5 ммоль/л, а глюкозурия, как правило, превышала 2%. В большинстве случаев гликемия составляла 21-25 ммоль/л. Пересадку ткани проводили в стерильных условиях. В работе использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью, для чего предварительно за 17-18 дней к 5 самкам подсаживали 1 самца. В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорожденных крысят.

Поджелудочную железу выделяли у эмбрионов под стереомикроскопом МБС-9. С хвостового конца железы отрезали 1-2 кусочка объемом 0,8-1 мм3, которые переносили в чашку Петри со стерильной средой Игла. Крысам-реципиентам с острым экспериментальным диабетом на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина и 0,5%-раствора дикаина. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза туберкулиновым шприцом, фиксированным на препаратоводителе. На наконечник шприца надевали тефлоновую трубочку длиной 20 см, заполненную средой Игла. Трубочка заканчивалась стеклянным наконечником (внутренний диаметр 0,8 мм), куда и попадали трансплантаты.

Разрез длиной 1,5-2 мм производили простерилизованным глазным скальпелем либо лезвием, закрепленном в держателе. Трансплантаты общим объемом 3-4 мм3 с помощью описанного приспособления медленно (7-10 сек) выдавливали и помещали на радужную оболочку глаза, как можно дальше от разреза. Позднее в качестве инструмента для трансплантации стали использовать модернизированную микропипетку с изменяющимся объемом от 5 до 25 мкл.

В случае ксенотрансплантации плодной железы человека или цыпленка объем пересаживаемого материала был в среднем 3-4 мм3, в случае пересадки поджелудочной железы 1-месячного поросенка до 6 мм3, что связано с меньшим количеством эндокринной ткани в их поджелудочной железе в сравнении с плодной поджелудочной железой. Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете.

Аллотрансилантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру

глаза кроликов

Методика трансплантации принципиально не отличалась от описанной выше, но объем трансплантируемой ткани в этом варианте составлял, в среднем, 20 мм3. Самку-донора брали с 24-26-дневной беременностью. Операции по извлечению плодов у самки-донора и трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю

камеру глаза диабетических кроликов проводили под нембуталовым наркозом в стерильных условиях.

Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в боковые желудочки

мозга крыс

Животных-реципиентов под нембуталовым наркозом (45 мг/кг) скальпировали и фиксировали в стереотаксическом аппарате. Затем в кости черепа с помощью зубного бора делали отверстие диаметром 2 мм с координатами центра АР=+1, L=0,5 MM. (Bares, Petron, 1967). Осторожно без повреждения сосудов вырезали твердую оболочку мозга. Трансплантат поджелудочной железы (Э 17-18) объемом 2-3 мм3 вводили в левый боковой желудочек мозга с помощью туберкулинового шприца со стеклянным наконечником, прикрепленным к основанию инъекционной иглы. После забора ткани поджелудочной железы в туберкулиновый шприц его закрепляли на стереотаксисе, конец стеклянного наконечника погружали в область левого бокового желудочка мозга и трансплантат медленно(20-30 сек) вводили в мозг реципиента. Затем вынимали наконечник и послойно сшивали мягкие ткани. Животных содержали в стандартных условиях, иммунодепрессантов не применяли. Трансплантацию ткани плодной поджелудочной железы в боковые желудочки мозга крыс проводили совместно с д.б.н. А.Г. Брагиным.

Получение абортивного материала

Абортивный материал (10-12 нед.) получали из гинекологического отделения Пущинской городской больницы. Аборты проводились кюретой N4, N6 и абортцангом под общим наркозом без использования вакуум-экскохлеатора. Сразу же после операции материал помещали в охлажденную стерильную среду Игла. Время от забора материала до трансплантации плодной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза диабетических животных составляло от 20 до 40 минут.

Определение потребления воды

Животных помещали в клетки по 3-5шт. По градуированным поилкам определяли количество потребляемой воды за сутки. Сопоставляя результат с весом животных в клетке, определяли среднее потребление воды на 100 г веса животного.

Подготовка трансплантата микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы крыс

Трансплантат готовили из ткани поджелудочной железы новорожденных крысят. После вскрытия брюшной полости поджелудочная железа удалялась и помещалась в раствор Хэнкса, где производилось ее механическое измельчение до микрофрагментов 1-3 мм в диаметре при помощи микрохирургического пинцета и ножниц. Для одной пересадки использовалось 25-30 мкл микрофрагментов измельченной поджелудочной железы, взятой от 3-4 доноров. Для введения микрофрагментов под белочную оболочку семенника использовался дозатор «MICROMAN».

Микрохирургический метод аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника

Метод трансплантации был разработан совместно с сотрудниками кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН (проф. И. Д. Кирпатовским, с.н.с. В.Н. Бродягиным, асп. Ю.И. Кистнер). Операция проводилась под общей анестезией парами эфира. По средней линии живота выполнялся разрез длиной 2 см.

Левый семенник выводился в рану. В бессосудистой зоне семенника производился прокол белочной оболочки. Строго под белочной оболочкой поверх семенных канальцев поочередно вводились микродилагагоры различного диаметра по ходу паравазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника, не проникая в паренхиму органа. В результате формировался искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев. Затем в созданный карман паравазальной клетчаточной щели вводились микрофрагменты ткани поджелудочной железы объемом 25-30 мкл с помощью дозатора «MICROMAN».

После пересадки прокол белочной оболочки ушивался атравматичной иглой с нитью 6/0. Семенник обрабатывался антисептическим раствором мирамистина и помещался в мошонку. Операционная рана ушивалась через все слои узловыми швами нитью 2-3/0.

После аллотрансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник, с целью проведения в дальнейшем биологического теста для определения фертильности животных, у крыс без диабета осуществлялось односторонняя перевязка и пересечение семенного протока интактного (правого) семенника.

Определение норадреналина в структурах мозга, определение количества тимоцитов у экспериментальных животных, определение фрагментированной ДНК, гистологические, иммуногистохимические исследования ткани, тестирование уровня глюкозы, динамическая тонометрия оперированных глаз, определение инсулина в сыворотке крови, определение инсулина в поджелудочной железе и трансплантате, тест на фертильность проводили по стандартным методикам.

Статистика

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Статистика. Для полученных величин проводился подсчет среднеквадратической ошибки. Различия средних величин признавалось достоверным при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

КОМПЕНСАЦИЯ НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ 6-ОДА И

ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ СИНЕГО ПЯТНА

Известно, что после раннего постнатального введения специфического нейротоксина 6-оксидофамина в мозге животных происходит снижение уровня норадреналина (Jonsson et al., 1982; Семенова и др., 1983,1988). Параллельно возникает устойчивое изменение поведения, которое, в частности, выражается в снижении исследовательской активности (Братин и др., 1984; Громова и др., 1985). Изучалась возможность восстановления уровня норадреналина мозга и нарушенного исследовательского поведения животных, вызванных 6-ОДА, с помощью трансплантации в мозг эмбриональной ткани синего пятна (Locus coeraleus) - основного источника восходящей норадренергической иннервации. Благодаря разработанному трансплантологическому методу удалось добиться восстановления исследованных биохимических и физиологических показателей.

Рис 1. Показатели норадреналина в неокортексе крыс различных групп.

Табл. 1. Показатели исследовательского поведения крыс различных групп

Поведение в открытом поле (за 3 мин)

Среднее значение по 4 тестам

Вариант опыта Горизонтальная активность (число пересеченных квадратов) Вертикальная активность(число вставаний)

Интактные крысы (n=10) 113+11 5,5±08

Трансплантация Locus coeruleus 115+13 4,1±0,8

(n=5)

Трансплантация гиппокампа 56±12 3,1±1,3

(n = 3) р < 0,01

Ложнооперированные животные с 6-ОДА 65±17 1,9±0,7

(n = 3) р<0,05 р < 0,01

Интактные животные характеризовались высоким уровнем исследовательской активности, оцениваемой по обоим использованным показателям, и высоким уровнем норадреналина в неокортексе. В отличие от этого у ложнооперированных крыс с постнатальным введением 6-ОДА оба показателя исследовательской активности были вдвое ниже. Содержание норадреналина даже через 15 месяцев после введения

нейротоксина составляло лишь 15% от нормы. У животных с контрольной трансплантацией ткани гиппокампа в неокортекс как поведенческие, так и биохимические показатели практически не отличались от показателей группы ложнооперированнных животных.

У животных с трансплантатами ткани синего пятна в неокортексе поведение в открытом поле статистически не отличалось от поведения интактных животных (горизонтальная активность) или незначительно отличалось от него (вертикальная активность). С этим коррелировало значительное повышение уровня норадреналина в неокортексе (до 60% от нормы) по сравнению с контрольными НА-депривированными группами.

Значительное повышение уровня норадреналина в коре при пересадке эмбриональной ткани синего пятна в неокортекс можно объяснить приживлением и длительным функционированием трансплантированных норадренергических нейронов. Возможность прорастания волокон от синего пятна на значительное расстояние (до 12 мм) была показана при его трансплантации в другие области мозга (ВргЫипё й а1., 1979). Вместе с тем, прорастающие аксоны не достигают отдаленных (стволовых) отделов мозга, где норадреналин остается на том же уровне, что и у контрольных групп животных.

Параллельная нормализация исследовательского поведения, зависимость которого от модулирующего влияния норадренергической иннервации хорошо известна (Громова, 1985; Семенова и др., 1988), обнаруживает высокую корреляцию с повышением уровня норадреналина в неокортексе. Трансплантаты занимали эктопическое положение в мозге и действовали как эндогенный источник, восполняющий дефицит норадреналина, не восстанавливая точной топографии, свойственной норадренергической системе в интактном мозге. Но даже в этом случае, с помощью нейротрансплантации удалось добиться значительной компенсации норадренергической недостаточности и достаточно сложных форм поведения, зависящих от хронического повреждения норадренергической иннервации.

Разработан способ восстановления уровня норадреналина мозга и нарушенного исследовательского поведения, животных при нейротоксинном разрушении норадренергической системы и последующей трансплантации в мозг эмбриональной ткани синего пятна - основного источника восходящей норадренергической иннервации.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ТКАНЕЙ

Следующими экспериментальными моделями, разработанными с использованием относительной иммунопривилегиованности передней камеры глаза, были способы модуляции возрастной инволюции тимуса и компенсации иммунологической недостаточности у крыс с помощью трансплантации иммунокомпетентных тканей.

Вначале была исследована динамика резкого снижения количества тимоцитов и увеличения фрагментированной ДНК в вилочковой железе с возрастом.

(п=12) {>1=11) (п=4) (п=14) (п=6) (п=5) (п=3)

Рис.2. Количество тимоцитов у крыс разного возраста (^количество животных).

Рис.3. Количество фрагментированной ДНК в тимоцитах у крыс разного возраста.

Количество тимоцитов у 20-месячных крыс по сравнению с 2,5-месячными животными уменьшилось более чем в 90 раз. С возрастом значительно увеличивается и количество фрагментированной ДНК в тимоцитах, хотя этот показатель более стабилен у молодых животных.

Трансплантологические модели были разработаны для проверки возможности алло- и ксенотрансплантов иммунокомпетентных клеток модулировать активность тимоцитов реципиента на различных возрастных группах и при разной продолжительности функционирования трансплантата.

Ксенотрансплантация ткани обычно дает худшие результаты, чем аллотрансплантация. Вместе с тем, известно, что у зимнеспящих животных происходит ежегодная инволюция тимуса в зимний период и последующая регенерация ткани тимуса летом (Колаева и др., 2003). Так как тимус гибернантов ежегодно проходит те же превращения что и тимус незимнеспящих животных в течение жизни, естественно предположить, что его потенциал превосходит пролиферативные возможности последних. Проводили ксенотрансплантацию тимуса сусликов в ПКГ 7-месячных крыс, а также аллотрансплантацию ткани тимуса.

Табл.2. Количество тимоцитов у 7-месячных крыс через месяц после алло- и ксенотрансплантации ткани тимуса в ПКГ

Показатель Интактный контроль Тр-ат тимуса суслика Тр-ат легкого суслика Тр-ат тимуса крысы

Число тимоцитов (х 107) 1,8±0,19 п = 9 2,8±0,35 п=8 р<0,05. 1,76±0,19 п = 7 2±0,25 п=10

п - количество животных.

После трансплантации ткани тимуса якутских сусликов СНеИш ипдиЫш в ПКГ крыс у последних наблюдалось достоверное торможение возрастной инволюции тимуса - количество тимоцитов по сравнению с интактным контролем возрастало на 55%. Трансплантация ткани легкого от сусликов (контроль на специфичность ткани) никак не повлияла на количество тимоцитов, этот показатель остался таким же как в интактном контроле. Таким образом, введение клеток суслика, находящегося на стадии ежегодной активной регенерации тимусной ткани (весна), в переднюю камеру глаза 6-месячных крыс дает лучшие, чем при аллотрансплантации, результаты, где показатель прироста тимоцитов составил только 10%. В другой серии экспериментов этот показатель достиг 36%.

В работе было важно показать, что у животных в ПКГ находятся именно тимоциты, а никакая другая, перерожденная, либо соединительная ткань. Для этого через месяц после аллотрансплантации тимуса от молодых крыс животным 6 и 19-месячного возраста трансплантаты были извлечены из глаза и по стандартной методике посчитано в них количество тимоцитов.

7 месяцев 20 месяцев

(п=3) (п=3)

Рис.4. Количество тимоцитов в трансплантатах у крыс разного возраста через 1 месяц после пересадки ткани в ПКГ.

Трансплантаты, извлеченные из передней камеры глаза у животных 7-месячного возраста, содержали тимоцитов в 9,7 раза меньше, чем в собственном тимусе у крыс того же возраста. А трансплантаты, извлеченные из ПКГ у крыс 20-месячного возраста, содержали тимоцитов в 2,3 раза больше, чем в собственном тимусе у этих животных.

На вопрос, можно ли предотвратить возрастную инволюцию тимуса у крыс разного возраста на более отдаленных сроках, мы попытались ответить в следующей

серии экспериментов.

Рис.5. Количество тимоцитов в вилочковой железе у животных разного возраста через 3 месяца после трансплантации ткани в ПКГ.

Количество тимоцитов через 3 месяца после трансплантации тимуса в ПКГ крыс увеличилось по сравнению с интактным контролем на 295% у 5-месячных животных, на 225% у 7-месячных и на 272% у 8-месячных крыс.

Разработаны способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру крыс. Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса у животных разных возрастных групп.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ТКАНЕЙ ПОСЛЕ РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ

Известно, что радиационный стресс, как и многие другие виды стрессов, приводит к обратимой атрофии тимуса. Мы выбрали этот вид стресса потому, что он является легко воспроизводимым и точным по дозировке.

В первой серии оценивали выживаемость крыс после облучения в дозе 8 Грей. Обычно такая доза вызывает гибель крыс в течение 30 дней после облучения. Эта форма гибели обусловлена поражением стволовых кроветворных клеток и, как следствие, дефицитом кроветворения.

Табл. 3. Влияние аллотрансплантации тимуса на выживаемость крыс после облучения в дозе 8 Гр

Условия Число крыс Выживаемость Число крыс (%)

Через 1мес Через З мес через б мес через 13 мес

Облучение 8 Гр 35 1 (2,9%) 0 0 0

Облучение 8 Гр + трансплантация тимуса 24 13 (54,2%) 6 (25%) 3 (12,5%) 1 (4,13%)

Показано, что в группе 3-х месячных крыс, которым после облучения в дозе 8 Гр трансплантировали в переднюю камеру глаза тимус, существенно увеличена выживаемость. В течение 1 месяца она составила 54%. В то время как в группе, которой после облучения трансплантации не проводили, через месяц была жива только 1 крыса (2,9%), она умерла на 5-ой неделе. Через 3 месяца в опытной группе выжило 6 животных, через 6 - три, и 1 крыса пережила 13 месяцев.

Затем было проведено несколько серий экспериментов с облучением животных сублетальной дозой ионизирующей радиации. Известно, что при облучении дозой 4 Гр происходит массовая гибель клеток в тимусе и костном мозге с последующим восстановлением клеточности через 20-40 дней (Белоусова, 1979). В геронтологии такое воздействие называется ускоренным старением. Исследовали клеточность тимуса у разных возрастных групп животных после облучения в дозе 4 Гр и последующей трансплантации ткани тимуса, костного мозга или легкого (контроль на специфичность ткани).

интактный облучение облучение облучение облучение контроль 4Гр (пш5) 4Гр * тр-я 4Гр + тр-я 4Гр+ тр-я

(п=11) р<0,02 тимуса (п*в) костного легкого (п*3) мозга (п=3) /Х0.05

Рис.6. Количество тимоцитов у 4-месячных животных при воздействии ионизирующей радиации (4 Гр) через 1 месяц после трансплантации иммунокомпетентных клеток (п - количество животных).

Как видно из рис.6, через месяц после облучения в группе без трансплантации иммунокомпетентных тканей количество тимоцитов достоверно ниже, чем в группе интактного контроля. Трансплантация ткани тимуса или костного мозга способствовала полному восстановлению клеточности тимуса. Через месяц после трансплантации количество клеток в вилочковой железе у животных с трансплантатами ткани легкого не отличалось от этого показателя в группе, которой трансплантацию ткани после облучения не проводили.

В группах животных 7,19 и 20-месячного возраста через месяц после облучения и последующей трансплантации тимуса или костного мозга мы также наблюдали полное восстановление количества тимоцитов в вилочковой железе.

Параллельно смотрели содержание фрэхментированной ДНК в тимоцитах разных экспериментальных групп.

интактный облучение облучение облучение облучение контроль 4Гр (п=$) 4Гр * тр-я 4Гр + тр-я 4Гр* тр-я

(п=11) тимуса (п^) костного легкого (п*!)

(р<0,05) мозга (п-3) (р<0,001)

Рис.7. Фрагментация ДНК в тимоцитах у 4-месячных животных при воздействии ионизирующей радиации (4 Гр) и последующей трансплантации иммунокомпетентных тканей (п - количество животных).

Показано, что с помощью разработанного метода трансплантации иммунокомпетентных тканей в ПКГ после сублетального облучения в течение месяца происходит достоверное снижение процента фрагментированной ДНК в тимоцитах даже по отношению к интактному возрастному контролю. Вместе с тем, трансплантация ткани легкого (контроль на специфичность ткани) не влияет на этот показатель. Это может говорить о хорошем состоянии клеток собственного тимуса после трансплантации.

_Разработаны способы аллотрансплантации иммунокомпетентных тканей в

переднюю камеру глаза крыс после радиационного облучения в дозе 4 и 8 Гр. Показано ускоренное восстановление иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и значительное снижение смертности после облучения животных в дозе 8 Гр, если им трансплантировали тимус или костный мозг.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА И БОКОВЫЕ ЖЕЛУДОЧКИ МОЗГА С ЦЕЛЬЮ КОМПЕНСАЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА

При разработке способов трансплантологической компенсации экспериментального диабета мы использовали широко распространенную модель аллоксанового диабета. После введения аллоксана наступают значительные гистологические изменения в поджелудочной железе животных и существенные метаболические отклонения в самых различных органах и тканях (Баранов, 1973; Boquist, 1977; Hans, 2003 и др.). При аллоксановом диабете страдают обменные процессы, сахарообразование превалирует над скоростью окисления глюкозы и синтеза из нее гликогена, что приводит к быстрому падению содержания депонированного гликогена в печени (Сагидова, 1979; Лебкова, 1980; и др.). Снижение скорости гликолиза и пентозофосфатного пути превращения глюкозы приводит к дефициту образования макроэргических соединений (Сидоренко, 1981; Тырышкина и др., 1986;). У животных с аллоксановым диабетом нарушен переход углеводов в жиры (Manchester, 1987). Уже через 2-3 дня после введения диабетогенных доз аллоксана тестируется высокий уровень глюкозы в крови и моче, высокое потребление воды, полифагия, полиурия, начинается падение веса животных.

В экспериментах мы использовали животных с острым диабетом, у которых концентрация глюкозы в крови превышала 20 ммоль/л, а в моче была более 2000 мг%. Было показано, что при столь высоком уровне глюкозы самопроизвольно выздоравливало только 2,9% крыс Вистар, 2,5% - беспородных крыс. В то же время, в следующих сериях экспериментов, проведенных через 9 и 10 лет на 82 и 171 крысах Вистар с высоким содержанием глюкозы в крови, ни одно животное не дало самопроизвольного выздоровления.

В процессе выполнения работы было разработано несколько моделей трансплантологической компенсации аллоксанового диабета. В данной серии использовали алло- и ксенотрансплантацию эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и боковые желудочки мозга крыс и кроликов.

Табл. 4. Результаты аллотрансплантации фетальной поджелудочной железы в

переднюю камеру глаза и боковые желудочки мозга животным с __экспериментальным диабетом__

Реципиент Донор КОМПЕНСАЦИЯ ДИАБЕТА шт/(%) Всего оперировано

Полная Частичная

Крысы Крысы Вистар 153 124 311

Вистар (49%) (40%) (100%)

Крысы Вистар Крысы беспородн. 15 (40,5%) 15 (40,5%) 37 (100%)

Крысы Вистар* Крысы Вистар* 6 (60%) 2 (20%) 10 (100%)

Кролик Шиншилла Кролик Шиншилла 3 (30%) 4 (40%) 10 (100%)

Время наблюдения не менее 3 месяцев.

* - в данном варианте трансплантацию ткани проводили в левый боковой желудочек головного мозга крыс.

Наиболее высокий процент компенсации экспериментального диабета был получен, когда в качестве донора и реципиента использовали крыс Вистар (89%). Полная компенсация (3,8-8,8 ммоль/л) отмечалась у 153 оперированных животных (49%), а частичная (8,8-13,8 ммоль/л) - у 124 крыс (40%). Для того чтобы убедиться, что нет больших различий при разных вариантах аллотрансплантации, была проведена серия экспериментов по трансплантации эмбриональной поджелудочной железы беспородных крыс крысам Вистар. Компенсация диабета наступала у 81% животных, полная - у 15 оперированных животных (40,5%), и частичная - также у 15 животных (40,5%).

Трансплантация ткани в боковые желудочки мозга дала хорошие результаты, причем число крыс с полной компенсацией количества глюкозы в крови втрое выше, чем с частичной, тогда как в других вариантах эти показатели примерно равны.

Использование кроликов для аллотрансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ имеет свои недостатки и преимущества. Кролики требуют повышенного, по сравнению с крысами, внимания при уходе за ними особенно в период индукции диабета и плохо переносят наркоз. Зато являются идеальной моделью для проведения динамической тонометрии оперированных глаз. Этот тест в силу его неприспособленности для мелких грызунов нельзя провести на крысах.

Из 10 оперированных животных полная компенсация экспериментального диабета в течение срока наблюдения отмечалась у 3 кроликов, частичная - у 4-х, не было компенсации у 3 кроликов (погибли в течение месяца после операции). В последней группе животных наблюдали выраженные признаки воспаления: наличие экссудата в передней камере глаза, помутнение роговицы и хрусталика. У них экссудат в передней камере рассосался на 7-10 сутки, но развилось стойкое помутнение роговицы, вероятно, из-за значительного повреждения роговичного эндотелия во время трансплантации и контакта трансплантата, расположенного в прикорневой зоне радужной оболочки, с эндотелием роговицы.

Двум кроликам с полной компенсацией аллоксанового диабета через 4 месяца после операции провели удаление глаз с трансплантатами, после чего у животных в течение двух недель наступил рецидив диабета. У всех семи кроликов с полной или частичной компенсацией аллоксанового диабета провели динамическую тонометрию оперированных глаз. Повышение внутриглазного давления, по сравнению с парным глазом без трансплантата и с внутриглазным давлением контрольных животных, обнаружено не было. Это говорит о том, что трансплантат не мешает нормальной циркуляции глазной жидкости и не блокирует Шлеммов канал, через который она оттекает от глаза. Как правило, трансплантат прикреплялся к радужной оболочке на том участке, куда его помещали во время операции. Не было отмечено особенностей развития трансплантата в зависимости от места его локализации на радужной оболочке. Через 3-4 недели после операции начиналась различной интенсивности пигментация

трансплантатов, так что со временем их было трудно различить на фоне радужной оболочки глаза.

Табл. 5. Результаты ксенотрансплантации поджелудочной железы в ПКГ

животным с экспериментальным диабетом

Реципиент Донор КОМПЕНСАЦИЯДИАБЕТА Всего

шт (%) оперировано

Полная Частичная

Крысы Плод 21 1 29

Вистар Человека (72%) (4%) (100%)

Крысы 1 мес. 5 1 9

Вистар Поросенок (55%) (11%) (100%)

Крысы Зародыш 3 2 9

Вистар Цыпленка (33%) (22%) (100%)

Время наблюдения не менее 3 месяцев.

При трансплантации поджелудочной железы 15-дневных куриных зародышей, в ПКГ крыс с аллоксановым диабетом только у 55% животных удалось добиться полной или частичной компенсации диабета. Относительно невысокий процент компенсации (66%) получен также при ксенотрансплантации хвостового, наиболее богатого клетками, сегмента поджелудочной железы 1-месячного поросенка. В то же время ксенотрансплантация плода человека в переднюю камеру глаза крыс дала довольно хорошие результаты - 76% полной или частичной компенсации диабета.

Снижение количества глюкозы в крови и в моче начиналось, как правило, на 3-5 день после трансплантации плодной поджелудочной железы и к концу второй недели после пересадки стабилизировалось на уровне, характеризующем полную либо частичную компенсацию по этому показателю.

В процессе выполнения работы у 17 крыс с хорошо оформленными аллотрансплантатами и компенсированным диабетом провели удаление оперированных глаз с трансплантатами. У всех 17 животных наблюдали рецидив диабета, развивавшийся в течение 2-4 недель, приведший к их гибели в течение месяца.

Из рассмотренного материала можно сделать выводы что аллотрансплантация ткани поджелудочной железы в относительно иммунопривилегированные области нервной системы с целью компенсации аллоксанового диабета в большинстве случаев дает лучшие результаты, чем ксенотрансплантация.

Известно, что именно иммунологическая несовместимость ткани донора и реципиента является в подавляющем большинстве случаев причиной тому, что трансплантированная ткань может функционировать в новом месте относительно короткий промежуток времени. Разработанный метод трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированную ПКГ позволяет проследить динамику метаболических отклонений на отдаленных сроках после пересадки. Иммунодепрессивная терапия в работе не применялась.

Одним из наиболее значимых метаболических отклонений, происходящих во время инициации диабета, является увеличение количества глюкозы в крови. На всех этапах проходило определение глюкозы крови оперированных животных с аллоксановым диабетом и у контрольных животных без операции.

Табл. 6. Содержание глюкозы в крови интактных, диабетических и с компенсированным аллотрансплантацией диабетом крыс на разных сроках

жизни

Возраст животных (мес.) Интактный контроль (ммоль/л) Глюкоза перед трансплантацией (ммоль/л) Компенсированный диабет (ммоль/л)

4 5,0+0,18 п=10 23±0,3 п = 32 р < 0,001 -

6 4,6±0,05 п=10 - 5,1±0,1 п = 5 р < 0,01

10 4,9+0,07 п=10 - 5,5+0,21 п=5 р < 0,05

20 5,7+0,03 п=10 - 6,4+0,1 п = 5 р < 0,001

п - количество животных.

Перед трансплантацией концентрация глюкозы в крови у подопытных животных была почти в 5 раз выше по сравнению с этим показателем у контрольной группы того же возраста. Мониторинг содержания глюкозы велся постоянно в течение всего эксперимента, как правило, 1 раз в неделю. С помощью трансплантации фетальной поджелудочной железы (ФПЖ) в ПКГ удалось снизить высокую гипергликемию до уровня близкого к интактному контролю. Основным результатом этой части работы было то, что удалось показать возможность именно долговременной трансплантологической компенсации высокой дооперационной гипергликемии.

Эксперименты с энуклеацией глаз у кроликов и крыс вместе с трансплантатами и последующего рецидива диабета дают достаточно убедительные доказательства роли трансплантата поджелудочной железы в компенсации экспериментального диабета. Но, вместе с тем, эти доказательства являются все-таки косвенными. Для того чтобы иметь прямое подтверждение способности трансплантата выделять инсулин и длительное время функционировать в ПКГ крыс с диабетом, было проведено определение концентрации иммунореактивного инсулина (ИРИ) непосредственно в трансплантатах, извлеченных из передней камеры глаза на разных сроках (вплоть до 16 месяцев) после операции. Табл. 7. Уровень иммунореактивного инсулина в трансплантатах, извлеченных _из передней камеры глаза на разных ^ сроках после операции

Время после операции (мес)

Вес трансплантата _(мг)

16+2,5 п=3

12,5±2,1 п=3

15,5±1,3 п=3

ИРИ

(млЕД/мг)

1,68+0,37 п=3

3,53±0,40 п=3

2,85±0,68 п=3

Содержание иммунореактивного инсулина в исходно трансплантируемой ткани поджелудочной железы 18-дневных эмбрионов составляло 0,95±0,03 млЕД/мг (п=12).

На всех сроках трансплантаты содержат значительное количество иммунореактивного инсулина. Через 2 месяца после операции оно несколько выше, чем в поджелудочной железе интактных животных того же возраста 1,68±0,37млЕД/мг и 1,61+0 млЕД/мг, соответственно. Через б месяцев это количество становится в 2,2 раза, а через 16 месяцев в 4,9 раза выше, чем в поджелудочной железе интактных животных соответствующего возраста. Кроме того, наблюдается некоторая корреляция с весом трансплантата: при меньшей массе трансплантата он выделяет несколько большее, а при большей меньшее количество инсулина на 1мг ткани, что может говорить о зависимости функционирования трансплантата от физиологических потребностей организма.

Для того чтобы ответить на вопрос, может ли пересаженная поджелудочная железа стимулировать частичное восстановление инсулинпродукции собственной pancreas, совместно с к.м.н. М.ИАрбузовой (ЭНЦ МЗ РФ) проведена работа по определению ИРИ непосредственно в эмбриональной поджелудочной железе перед трансплантацией а также в поджелудочной железе контрольной и опытной групп крыс через 2,6, и 16 месяцев после трансплантации инсулинпродуцирующей ткани.

Табл. 8. Содержание иммунореактивного инсулина в поджелудочной железе 18-дневных эмбрионов, у интактных животных и крыс с компенсированным трансплантацией диабетом

Возраст животных Контроль (млЕД/мг) Компенсирован, диабет (млЕД/мг)

18-дн. эмбрионы 0,95 ±0,03 n=12 -

6 мес. 1,61 ±0,02 0,14 ±0,01 n= 5 р < 0,001

n=10

10 мес. 1,60 ±0,02 0,14 ±0,02 n = 3 р < 0,001

n=10

20 мес. 0,58 ± 0,03 n=10 0,11 ±0,03 n= 3 р< 0,001

п - количество животных.

В поджелудочной железе диабетических крыс (п=10), которым не проводили трансплантацию плодной поджелудочной железы, через 3 недели после введения аллоксана ИРИ обнаружили лишь в количестве 0,0075±0,0025 млЕД/мг.

Показано достоверное увеличение количества иммунореактивного инсулина в собственной поджелудочной железе по сравнению с не лечеными животными на отдаленных сроках после трансплантации. Через 2 и 6 месяцев после операции - в 18,7 раза, через 16 месяцев - в 14,7 раза.

Таким образом, можно сделать вывод, что компенсация инсулиновой недостаточности происходит не только за счет выделения гормона непосредственно трансплантатом, но и за счет частичного постгрансплантационного восстановления собственной поджелудочной железы, чего не происходит у крыс с острым аллоксановым диабетом без последующей трансплантации.

Одним из важнейших показателей при инициации и компенсации диабета является помимо количества глюкозы, содержание инсулина в крови.

Табл. 9. Содержание глюкозы и иммунореактивпого инсулина в крови после инициации диабета и через 4 месяца после трансплантации фетальной

Интактный контроль Глюкоза 5,47+0,18

Возраст 4 мес Ммоль/л

п=6 ИРИ 23,2512,41

МкЕД/мл

Аллоксановый диабет Глюкоза 24,4+0,72

Возраст 4 мес Ммоль/л р< 0,001

п=11 ИРИ О,б±О,Об

МкЕД/мл р < 0,001

Интактный контроль Глюкоза 4,17+1,1

Возраст 8 мес Ммоль/л

п=3 ИРИ 10,60+3,39

МкЕД/мл

Компенсированный Глюкоза 5,7910,49

диабет Ммоль/л

Возраст 8 мес ИРИ 15,2±1,52

п=5 МкЕД/мл

Из таблицы 9 видно, что как количество глюкозы, так и количество иммунореактивного инсулина (ИРИ) после манифестации экспериментального диабета достоверно различаются у интактных животных и крыс с аллоксановым диабетом. ИРИ у диабетических животных определялся в следовых количествах, его было в 39 раз меньше, чем у животных контрольной группы.

Через 4 месяца после трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ животных с аллоксановым диабетом показатели ИРИ и глюкозы полностью нормализовались. Причем концентрация ИРИ у животных с компенсированным диабетом была даже выше, чем у контрольных крыс.

В этой серии 3 крысам с острым диабетом вместо поджелудочной железы трансплантировали равные по объему кусочки легкого (контроль на специфичность ткани), животные погибли при высоком уровне гипергликемии (более 20 ммоль/л) и глюкозурии (более 2%), через 7,19 и 23 дня.

Табл. 10. Содержание глюкозы в моче и потребление воды животными до и после

трансплантации

Количество Суточное потребл. воды

глюкозы на 100 гр. массы

в моче (мл)

(%)

Диабет

п=9 более 2 88,4+7,1

Через 2 мес. после

трансплантации 0-0,150 23,5+2,2

п=19

Интактный контроль

п=12 0-0,1 18,5+1,9

п - количество животных. * р < 0,001

Количество глюкозы в моче - важный прогностический показатель. Как видно из таблицы, с помощью трансплантации удается добиться полной компенсации по этому параметру.

Одним из важных физиологических показателей, характеризующих как диабет типа 1 у человека, так и острый аллоксановый диабет у животных, является повышенное потребление воды и, как следствие, полиурия. После трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ крыс с аллоксановым диабетом происходит снижение потребления воды в 3,8 раза, и эти показатель достоверно не отличается от потребления воды интактными животными того же возраста.

Известно, что при инициации аллоксанового диабета происходит также снижение массы животных.

Табл. 11. Масса животных до и после аллотрансплантации фетальнон поджелудочной железы в переднюю камеру глаза

СОСТОЯНИЕ МАССА ЖИВОТНЫХ

(г)

ОПЫТ КОНТРОЛЬ

Перед введением аллоксана 200+5 200+3

Через 2 недели после введения 175+4 208+2

аллоксана, п = 9 п=10

ПЕРЕД трансплантацией р < 0,01

Через 2 мес. после 277+4 282+3

Трансплантации п = 9 п=10

Через 5,5 мес. после 495+2 498+4

Трансплантации п= 9 п=10

п - количество животных.

В течение 2 недель животные с диабетом теряют 16% веса по сравнению с контрольной группой, но уже через 2 месяца после трансплантации эта разница становится только 2%, а через 5,5 месяцев и вовсе 0,6%, то есть оперированные животные по весу достоверно не отличаются от контрольной группы.

Известно, что концентрация внеклеточной ДНК в организме присутствует в очень низких количествах, и ее уровень способен увеличиваться при целом ряде патологических состояний, это случается при некоторых злокачественных опухолях, при инсультах, системной «красной волчанке», радиационном поражении и т.д. (Трубецкая и др. 1994; Шевчук, 2002). Была поставлена задача - исследовать этот показатель у крыс с аллоксановым диабетом и возможность компенсировать его увеличение при данной экспериментальной патологии с помощью трансплантации эмбриональной поджелудочной железы.

Рис.8. Концентрация сывороточной ДНК у интактных животных, крыс с экспериментальным диабетом и у компенсированных трансплантацией особей.

Определение ДНК проводили у животных через 3 месяца после трансплантации фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза. Оказалось, что диабетическое состояние приводит к 11-кратному увеличению сывороточной ДНК, а после трансплантации этот показатель возвращается к норме.

Разработаны способы трансплантации фетальной поджелудочной железы в ПКГ или боковые желудочки мозга, позволяющие добиться долговременной полной или частичной компенсации экспериментального диабета у животных.

Аллотрансплантация инсулинпродуцируюшей ткани в ПКГ или желудочки мозга дает лучшие результаты, чем трансплантация ксеногенная. т.к. различные ее варианты позволяют компенсировать аллоксановый диабет у 70 - 89 % животных, в то время как, разные варианты ксенотрансплантации дают ПОЛНУЮ ИЛИ частичную компенсацию диабета в 55-76% случаев.

Выявлено, что аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в ПКГ оперированных животных.

Трансплантация поджелудочной железы в ПКГ приводит к нормализации потребления воды, массы животных и содержанию глюкозы, инсулина, сывороточной ДНК в крови.

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ МИКРОФРАГМЕНТОВ ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПАРАВАЗАЛЬНУЮ КЛЕТЧАТОЧНУЮ ЩЕЛЬ СЕМЕННИКА С ЦЕЛЬЮ КОМПЕНСАЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА

Для работы с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД) отбирали животных с высокой гипергликемией более 20 ммоль/л и глкжозурией не менее 2%. В данной серии таких животных было 54, что составило18,9% от общего количества крыс в этой серии. Проверка выживаемости в этой группе животных показала, что все 12 крыс без пересадки поджелудочной железы погибли при высокой гипергликемии и

глюкозурии на сроках от 17 до 28 дней после введения аллоксана. Суточное потребление воды у них значительно возрастало к 3-5 дню, а к концу 2 недели достигло 84,5±4,7мл на ЮОг массы и сохранялось высоким на протяжении всего периода наблюдения. В то время как у интактных крыс (п=10) данный показатель составлял от 17,5 до 22 мл на протяжении того же периода наблюдения.

В опытной группе после введения аллоксана потребление воды постепенно повышалось и перед трансплантацией составляло 82±4,9мл на ЮОг веса. После проведения трансплантации повышенное среднее потребление воды постепенно снижалось в течение 2-3 недель и в течение всего последующего периода наблюдения находилось в пределах 25-35 мл.

100

я 80

I. 60

о о

я 40 х с = 20

0 I I ! I " ! I I ' " I 1 1 1 I

О 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84

дни после введения аллоксана

111 ""крысы с ЭСД без трансплантации* интактные крысы

"■"-""крысы с ЭСД после трансплантации

Рис 9. Потребление воды у интактных, диабетических крыс и животных с интратекстикулярной трансплантацией момент трансплантации).

Аллотрансплантация микрофрагментов неонатальной поджелудочной железы проводилась у 42 крыс с уровнем гликемии перед операцией от 20 до 33,3 ммоль/л и глгокозурией не менее 2%. Из них 10 крыс были декапитированы на 3 и 6 неделях (по 5 шт.) для гистологической оценки состояния трансплантата и семенника. Уровень глюкозы в крови у данной группы животных находился в пределах 4-8 ммоль/л, и отмечалась аглюкозурия.

Максимальный срок наблюдения за животными составил 9 недель. В конце срока наблюдения крыс декапитировались с последующим гистологическим исследованием гонад.

100 100

1 7 14 21

Дни с момента трансплантации

□ Крысы с ЭСД ■ Крысы с ЭСД после трансплантации

Рис. 10. Летальность диабетических крыс и животных после интратекстикулярной трансплантации.

Через 1 неделю после трансплантации, то есть через 3 недели после введения аллоксана, все крысы опытной группы были живы, в то время как в контрольной группе животных с диабетом без трансплантации погибло 58,4% животных. Показатель смертности на срок 2 недели после трансплантации был равен 9,5% (4 крысы), когда в группе животных с аллоксановым диабетом без трансплантации на этот срок отмечалась 100% гибель крыс. На 3 неделе после трансплантации смертность крыс в опытной группе достигла 11,9% (5 крыс). К концу срока наблюдения из 32 животных, оставленных для наблюдения, выжила 21 крыса. Смертность в группе составила 34%.

Результаты исследования показали, что аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника существенно снизила уровень смертности крыс с экспериментальным диабетом.

Средний вес животных в опытной группе до инициации диабета составил 194,4+19,4 г. За две недели после введения аллоксана (перед трансплантацией), отмечалось достоверное снижение веса на 15,4% (р<0,001), в среднем до 164,8+16,1 г. Трансплантация приводила к постепенной стабилизации и повышению веса. На 4 неделе после пересадки средний вес увеличился до 175,5+15,7г. В конце срока наблюдения отмечалось повышение веса по сравнению с показателем перед трансплантацией на 19,4% (р<0,001). Средний вес на 9 неделе после трансплантации достигал 196,7+22,3 г.

В группе интактного контроля за весь срок наблюдения, 11 недель, происходило естественное постепенное повышение веса от исходного среднего показателя 197+21,4г до 25 7+ 17,0 г. В контрольной группе животных с экспериментальным сахарным диабетом без трансплантации после введения аллоксана через 2 недели как и в опытной серии наблюдалось снижение веса от исходного среднего 180+21,7г до 152+15,4 г, то есть на 15,7%, далее до гибели всех животных этой группы вес менялся незначительно.

К концу наблюдения 9 недель из оставшегося количества крыс у 43% показатели гликемии находились в пределах 4-8 ммоль/л, а у остальных наблюдалось снижение показателя как минимум в 1,5-2 раза от исходного. Средний уровень гликемии составил 9,1 +3,6 ммоль/л. В группе животных с экспериментальным

диабетом без трансплантации снижения гликемии не происходило. В группе интактного контроля количество глюкозы в крови составляло от 4 до 6,5 ммоль/л.

|- момент трансплантации.

*Примечание: Динамика гликемии крыс с ЭСД без трансплантации отмечена на рисунке только до 28дня, так как в более поздние срокиэти животные погибли.

Рис.11. Динамика гликемии у интактных, диабетических крыс и животных с интратестикулярной трансплантацией.

После трансплантации инсулинпродуцирующей ткани также наблюдалось снижение глюкозурии. Динамика этого показателя довольно четко повторяет кривую снижения гипергликемии. К концу наблюдения из оставшегося количества крыс у 62% животных отмечалась аглюкозурия, а у остальных наблюдалось снижение показателя как минимум в 1,5-2 раза от исходного и не превышало 1%. В группе животных с экспериментальным диабетом без трансплантации снижения глюкозурии не происходило. В группе интактного контроля также наблюдалась аглюкозурия.

Необходимо отметить, что помимо оценки объективных показателей (смертность, гипергликемия, глюкозурия, потребление воды и вес) обращалось внимание на другие признаки сахарного диабета. В опытной группе животных после трансплантации наряду с улучшением описанных выше показателей происходило улучшение общего состояния крыс, что выражалось повышением активности животных, снижением полиурии, уменьшением выпадения шерсти.

Морфологическое состояние аллотравсплантата после пересадки микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника крыс

Для оценки состояния трансплантата проводилось гистологическое исследование семенников на сроках 3, 6 и 9 недель после аллотрансплантации ткани поджелудочной железы. Изучались окрашенные гематоксилином и эозином срезы. Для

части срезов применялся метод иммуногистохимии с обработкой моноклональными антителами против инсулина для выявления инсулинпродуцирующих клеток в трансплантате.

Для более детального изучения состояния трансплантата и ткани семенника в условиях отсутствия влияния аллоксанового диабета была проведена серия экспериментов аллотрансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника у интактных крыс. Всего для исследования были зафиксированы гонады 61 крысы.

На всех сроках были обнаружены жизнеспособные клетки трансплантатов, окрашенные гематоксилином-эозином. Инсулинпродуцирующие клетки, выявленные с помощью моноклональных антител против инсулина (в основном, смотрели трансплантаты поздних сроков) также определяются через 6 и 9 недель после трансплантации ткани поджелудочной железы.

Рис 12. Трансплантат и прилежащая к нему ткань семенника через 3 недели после аллотрансплантации поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника интактных крыс.

/- белочная оболочка; 2- клетки трансплантата; 3- лимфоцитарные инфильтраты. 4- близлежащие к трансплантату измененный семенной каналец; 5- семенные канальцы нормальной структуры с сохраненным сперматогенезом. Окраска гематоксилином и эозином. Об.20, ок.10.

Рис. 14. Инсулинсодержащие клетки трансплантата (1) через 9 недель после аллотрансплантации неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника у животных с экспериментальным диабетом. Обработка моноклоналъными антителами против инсулина. Окраска пероксидазой хрена и подкраска гематоксилином. Об. 60, ок.10.

Выживание клеток трансплантата на сроках более 2 месяцев может говорить о хороших перспективах использования разработанного метода в экспериментальных трансплантологических исследованиях.

Биологический тест на фертильиость у крыс после аллотрансплаитации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель

семенника

Для проведения теста на фертильность брали крыс-самцов без сахарного диабета, которым была проведена аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани неонатальной поджелудочной железы с одновременным пересечением семявыносящего протока контрлатерального семенника. На сроках 3,6 и 9 недель после трансплантации к одному самцу подсаживали 5 половозрелых самок. На каждый срок спаривание проводили у 5 самцов. В результате теста количество покрытых самок во всех сериях составило 100%. Было получено потомство в количестве от 5 до 11 крысят от каждой самки.

Таким образом, аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенников крыс не оказывает значимого отрицательного влияния на фертильность животных.

Разработан способ аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника при сахарном

диабете. С помощью новой методики удается полностью либо частично нормализовать исследованные физиологические показатели, состояние углеводного обмена в течение всего срока наблюдения.

Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 4,6.9 недель после пересадки.

Проведенное спаривание крыс на разных сроках после пересадки ткани поджелудочной железы в семенник с последующей перевязкой семявыяосящего протока контралатерального интактного семенника показало полную сохранность фертильности у животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные исследования были направлены на разработку трансплантологических способов компенсации экспериментальных патологических состояний и изучение физиологических, биохимических и иммунологических особенностей их протекания в период инициации патологии, течения и долговременной компенсации.

Наличие в организме млекопитающих относительно иммунопривилегированных областей позволяет значительно ослабить, либо вовсе избежать иммунологического конфликта между тканями донора и реципиента на длительное время. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее.

Трансплантацию тканей проводили в относительно иммунопривелегированные участки организма - неокортекс, боковые желудочки мозга, переднюю камеру глаза, семенник. Особое строение гисто-гематических барьеров этих областей, в норме не пропускающих иммунокомпетентные клетки, позволяет пересаживать туда ткани без опасения за их быстрое отторжение. Интерес к трансплантации ткани в мозг и переднюю камеру глаза связан еще и с тем, что в этих структурах нет лимфатического протока, в результате чего отсутствует афферентное звено иммунной реакции. Активированные иммунные клетки, которые все же могут проникнуть в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-L, зкспрессированного з этих участках. Например, функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003;Choi et al., 2004).

В процессе экспериментальных исследований в качестве реципиентов использовали крыс и кроликов, а в качестве доноров фетального, эмбрионального и неонатального материала - птиц, крыс, сусликов, свиней. Было разработано несколько новых трансплантологических моделей, которые можно разделить на группы по месту трансплантации (неокортекс, боковые желудочки мозга, передняя камера глаза, семенник) и по экспериментальным патологиям, на компенсацию которых направлены эти модели (дефицит норадреналина в мозге и связанное с этим нарушение исследовательского поведения животных, недостаточность по Т-клеточному звену иммунологической системы и связанные с этим возрастные изменения, диабет и нарушения физиологических и биохимических показателей. Проведенные эксперименты показывают возможность долговременной полной или частичной трансплантологической компенсации нейрофизиологических, поведенческих, иммунологических, физиологических и биохимических показателей. В качестве

сопутствующего метода для исследований стрессорной инволюции тимуса был разработан автоматизированный метод регистрации социального стресса в больших выборках животных. Трансплантация мозговой ткани

В исследованиях по трансплантации разных отделов эмбрионального неокортекса показано, что имплантированные клетки могут формировать эфферентные связи и получать афферентные аксоны из мозга хозяина (Castro et al., 1985; 1988; 1991; Neafsey et al., 1989; Sorensen et al., 1990; Shetty, Turner, 1997; Gamier et al., 1997). В первом случае происходит рост аксонов от эмбриональных клеток, во втором - регенерация нейритов от дифференцированных нейронов (Александрова 1999; Aubert et al., 1995).

Показано, что моноаминергические нейроны при их трансплантации в ЦНС дают достаточно длинные отростки (Bjorklund et al., 1979; Semenova et al., 1987). Вместе с тем необходимо учитывать, что все методы имплантации приводят к развитию глиального барьера между трансплантатом и тканью мозга реципиента. При одномоментной трансплантации, которую мы использовали в своей работе, могут развиваться проницаемые для растущих аксонов тотальные барьеры. При длительно отсроченной трансплантации формируется глиальный барьер, полностью блокирующий реципрокный рост волокон (Александрова, 1999).

О степени специфичности образуемых в трансплантатах синаптических связей существуют различные мнения. Одни исследователи обнаруживают высокую степень специфичности (Bjorklund, Stenevi, 1977; Lewis, Cotman, 1980; 1983;Mathews, 1985; Raisman et al., 1987; Fujii, 1993; Isacson, Deacon, 1997; Zhou et al., 1998). Другие считают возможным установление неспецифических связей и даже изменение химизма синаптической передачи (Hamori, 1980; Easter et al., 1985; Deller et al., 1995; Chevassus-An-Louis et al., 1998).

Наши результаты согласуются с точкой зрения сторонников относительной специфичности (Виноградова, 1984; Журавлева, 1999; Raisman, Ebner, 1983; Sunde, Zimmer, 1983; Zhuravleva, Vinogradova, 1991; 1994), которые считают, что аксоны при установлении контактов предпочитают свои природные мишени, но при отсутствии таковых могут занимать вакантные места независимо от происхождения и медиаторного химизма.

В нашем случае при трансплантации эмбрионального Locus coeruleus прорастающие из области неокортекса аксоны моноаминэргических нейронов восстанавливают нарушенные связи токсически поврежденного участка мозга. Кроме того, сам трансплантат выделяет недостающий норадреналин. Показано восстановление. уровня норадреналина мозга и нарушенного исследовательского поведения животных при нейротоксинном разрушении норадренергической системы и последующей трансплантации в мозг эмбриональной ткани синего пятна. Вероятнее всего, по ходу аксона идет также диффузная нейропередача, которая теперь рассматривается как комплиментарный механизм к химической синаптической передаче (Отеллин, 1987; Саульская, 1997; Самойлов, Мокрушин, 1999; Bach-y-Rita, 1994; Mrzljak et al., 1995; Rocha, 1997; Kullmann, Asztely, 1998; Huang, 1998). В настоящее время считается общепризнанным, что функционирование мозговой ткани обеспечивается координированностью синаптических и несинаптических форм межклеточных взаимодействий (Журавлева, 1999). Трансплантация иммунокомпетентных тканей

иммунной системы. Такая инволюция состоит в нарастающей потере клеточности с истощением лимфоидного пула клеток в зонах коры и кистозными изменениями эпителиальных клеток. Выход дифференцированных Т-клеток снижается с увеличением возраста (Globerson A.R et al., 1990). Прогрессивно снижаются синтез и секреция полипептидных гормонов тимуса, таких как тимозин, тимопоэтин и тимулин. Но в последние годы было установлено, что те же пептидные препараты тимуса могут восстанавливать компетентность иммунных клеток в старом организме и увеличивать продолжительность жизни животных (Лабунец И.Ф. и др., 1997; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1997; Anisimov V.N. et al., 1982; Anisimov V.N et al., 1998).

Считается установленным, что снижение эндокринной активности тимуса играет ключевую роль в возрастных дисфункциях иммунной системы, поскольку заместительная терапия введением гормонов способна частично восстановить различные иммунные функции в старости (Zatz M.M., Goldstein A.L, 1985). Кроме того, если принять во внимание, что введение тимусных гормонов старым мышам способствует повышению Т-клеточного звена лимфоидной системы, а подсадка тимуса в диффузной камере, не пропускающей клетки, неонатально тимэктомированным мышам обеспечивает устранение проявлений иммунодефицита, становится понятно, как велика роль гуморальных факторов тимусного происхождения при нормальном функционировании вилочковой железы (Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996; Goya R.G., 1991).

Известно, что половые железы находятся в антагонистических взаимоотношениях с тимусом. Именно в период полового созревания начинается резкая возрастная инволюция тимуса. А гонадэктомия приводит к повышению у старых животных массы и клеточности тимуса (Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996), т.е. отсутствие антагонизма между тимусными и половыми гормонами дает возможность вилочковой железе прогрессивно развиваться. Поэтому, мы в своих исследованиях брали для аллотрансплантации тимус неполовозрелых животных, еще не подвергшийся угнетающему действию половых гормонов. Пролиферативный потенциал и способность к гормональной продукции таких трансплантатов выше, чем у трансплантатов от взрослых животных. Если учесть, что пересадку ткани проводили в относительно иммуннопривилегированную переднюю камеру глаза, где она могла функционировать длительное время, становится понятно, почему относительно небольшой кусочек иммунокомпетентной ткани (это относится как к тимусу, так и к костному мозгу) мог дать ускоренное восстановление иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и приостановить инволюции тимуса у животных разных возрастных групп. У сусликов (зимнеспящие) тимус в отличие от основной массы млекопитающих проходит ежегодную осеннюю инволюцию и весеннее восстановление. Очевидно, что пролиферативный потенциал в данном случае имеет очень большой запас, поэтому даже при ксенотрансплантации тимуса сусликов в переднюю камеру глаза крыс мы получили результаты лучшие, чем при аллотрансплантации. Трансплантация инсулинпродуцирующей ткани

у наших экспериментальных животных) все крысы или кролики погибают, в среднем, на сроках до 1 месяца. После трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривиллегированные зоны (мозг, передняя камера глаза, тестикул) либо внутрибрюшинно, интрапортально, внутримышечно и.т.д. происходит снижение количества глюкозы в организме у животных и с высокой гипергликемией, и с относительно низкой. Такая физиологическая ситуация позволяет наращивать из резерва протокового эпителия -клетки в собственной поджелудочной железе.

Далее на сроках, как правило, до 2 недель происходит отторжение трансплантатов в неиммуннопривилегированных зонах. Но вновь образованные Р-клетки способны приводить к полной, либо частичной компенсации диабета на достаточно длительный срок от нескольких недель до нескольких месяцев. Чем иммунологически ближе донор и реципиент, тем дольше функционирует трансплантат, давая дополнительную возможность восстанавливаться собственной поджелудочной железе. -

Эта закономерность справедлива при внутрибрюпшнной, шпрапортальной, внутримышечной и других видах трансплантации, не связанных с иммунопривиллегированными областями организма. В наших работах трансплантацию поджелудочной железы проводили в мозг, переднюю камеру глаза, семенник. В этих областях до проведения физиологических, биохимических и иммунологических экспериментов пересаженная ткань функционировала, в среднем, 4 месяца. При трансплантации в тестикул - несколько меныпе(2,25 мес), а при интраокулярной пересадке - чаще всего намного больше, до 16 месяцев. Очевидно, что при столь длительном функционировании трансплантата открываются значительно большие возможности восстановления пула собственных р-клеток поджелудочной железы. Таким образом, длительная компенсация экспериментального диабета при трансплантации эмбриональной или неонотальной поджелудочной железы в относительно иммунопривиллегированные участки организма осуществляется в значительной степени за счет пролонгированной выработки инсулина трансплантатом. При этом происходит регенерация инсулшшродуцирующих клеток собственной поджелудочной железы, что и было показано в наших экспериментах.

Таким образом, использование относительно иммунопривилегированных участков организма для разработки новых методов трансплантологической компенсации экспериментальных патологических состояний, исследования особенностей их протекания и возможности нейтрализовать воздействие токсинов, радиационного облучения, стресса имеют существенное значение для экспериментальной физиологии. Результаты, полученные в работе, могут помочь в клинических исследованиях, интерпретировать результаты, находить новые пути для долговременной компенсации патологий в практике.

Основные выводы

1. Использование свойства относительной иммунологической привилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника позволило разработать новые трансплантологические методы компенсации экспериментальных нейрональных, иммунологических и эндокринных патологий.

2. Разработан способ восстановления уровня норадреналина мозга и нарушенного исследовательского поведения животных при 6-оксидофаминовом разрушении норадренергической системы и последующей трансплантации в мозг эмбриональной ткани Locus coeruleus - основного источника восходящей норадренергической иннервации.

3. Разработаны способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс. Показана возможность не только приостановки

возрастной инволюции тимуса у животных разных возрастных групп, но и увеличение количества тимоцитов в вилочковой железе на отдаленных сроках после трансплантации.

4. Аллотрансплантация иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс после радиационного стресса (облучения в дозе 4 и 8 Гр) приводит к ускоренному восстановлению иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и значительному увеличению выживаемости после облучения в дозе 8 Гр. Через 1 месяц после облучения (8 Гр) в контрольной группе выжило только 2,9%, а в опытной после трансплантации тимуса —54,2% крыс.

5. Разработаны способы трансплантации фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза или боковые желудочки мозга, позволяющие добиться долговременной полной или частичной компенсации экспериментального диабета у животных.

6. Аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в передней камере глаза оперированных животных.

7. Аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани в переднюю камеру глаза или боковые желудочки мозга дает лучшие результаты, чем трансплантация ксеногенная, т.к. различные ее варианты позволяют компенсировать аллоксановый диабет у 70 - 89% животных, в то время как разные варианты ксенотрансплантации дают полную или частичную компенсацию диабета в 55-76% случаев.

8. Выявлено, что интраокулярная аллотрансплантация поджелудочной железы приводит к нормализации потребления воды, массы животных, содержания глюкозы, инсулина, сывороточной ДНК в крови.

9. Разработан способ аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника при экспериментальном диабете. Получена полная либо частичная нормализация исследованных физиологических и биохимических показателей - количество глюкозы, масса животных, потребление воды.

10. Показана полная сохранность фертильности у животных после трансплантации. В результате проведенного спаривания крыс на разных сроках после пересадки ткани поджелудочной железы в семенник с последующей перевязкой семявыносящего протока контралатерального интактного семенника все самки были оплодотворены. Это позволяет предположить возможность разработки метода для применения в клинической практике.

11. Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 4, 6, 9 недель после интратестикулярной пересадки ткани поджелудочной железы.

Автор выражает сердечную благодарность учителям, коллегам, всестороннюю помощь в выполнении, написании и обсуждении работы.

друзьям за

Список публикаций по теме диссертации

Куликов А.В., Смирнова Г.Н. Изучение влияния 6-ОДА на содержание моноаминов и хроматина в различных структурах головного мозга крыс. // Труды ГХ межреспубликанской конференции по нейрофизиологии. -М.-1981 .-С.58. Братин А.Г., Куликов А.В., Журавлева З.Н., Третьяк Т.М. Компенсация аллоксанового диабета у крыс трансплантацией ткани эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и желудочки мозга.// Бюлл. экспер. биол. и мед.,-1983.-т. ХСУ.-№ 6.-С.100-108' ' "

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПотрбург 03 ООО акт

3. Братин А.Г., Виноградова О.С., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Трансплантация синего пятна в мозг увеличивает уровень норадреналина в неокортексе и нормализует поведение крыс с разрушением катехоламинергических систем.// Всесоюзный симпозиум "Нейрохимические организмы регуляции памяти". Тез. докл.-Пущино.« 1984.-С.48.

4. Куликов А.В. Содержание серотонина и норадреналина в структурах головного мозга крыс с экспериментальным и компенсированным диабетом.// Всесоюзный симпозиум " Нейрохимические механизмы регуляции памяти". Тез. докл.-Пущино.-1984.-С.62.

5. Братин А.Г., Виноградова О.С., Иваницкий Г.Р., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Влияние трансплантации норадренергической нервной ткани на уровень норадреналина мозга и поведение крыс с разрушением катехоламинергических систем. // ДАН СССР. -1984.-т.276.-№ 4.-С.999-1002.

6. Братин А.Г., Куликов А.В., Третьяк Т.М., Журавлева З.Н. (СССР) А.С. 1369039. МКИ А61В10/00 Способ моделирования компенсации сахарного диабета/ 2 ст.: ил.,

1986.

7. Kulikov A.V., Arkhipova L.V., Tretyak Т.М., Bragin A.G. Serotonin and norepinephrine content in brain structures of rats with experimental and transplantation-compensated diabetes .III. Hirnforsch.-1986.-v.27.-№ 5.-P. 495-499.

8. Иванов В.А., Терпиловская О.Н., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Репарация ДНК в нервных клетках млекопитающих. Синтез ДНК в неокортексе, индуцированный гамма-облучением крыс.//Цитология.-1987.-Т. ХХ1Х.-№ 1.-С. 73-78.

9. Куликов А.В. Попытка компенсации экспериментального диабета ксенотрансплантацией поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крыс. //2 международная конференция молодых ученых соц. стран. :Тез. докл.-Пущино.-1987.-С.75-76.

10. Semenova T.P., GromovaE.A., Kulikov A.V., Tretyak T.M., Bragin A.G. Behavioural, biochemical and histochemical effect of locus coeruleus transplantation in rats with neurotoxic lesions of the catecholaminergic system. //Neuroscience.-1987.-v.22.-N 3.-P. 993-1002.

11. Куликов А.В., Третьяк Т.М. Биохимические показатели головного мозга крыс при компенсации аллоксанового диабета трансплантацией эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза. // Современные проблемы экспериментальной и клинической эндокринологии //. Тез. докл.-Львов.-1987.-С211.

12. Третьяк Т.М., Куликов А.В., Рыбкин В.В. Получение долговременной компенсации аллоксанового диабета у крыс с помощью трансплантированной в переднюю камеру глаза эмбриональной поджелудочной железы плода человека. // Современные проблемы экспериментальной и клинической эндокринологии //. Тез. докл.-Киев.-

1987.-С.384.

13. Куликов А.В., Третьяк Т.М., Старосельцева Л.К., Арбузова М.И., ГоуфманЕ.И. Биохимические и гистологические показатели у крыс с трансплантированной в переднюю камеру глаза эмбриональной поджелудочной железой.// Трансплантация ткани мозга млекопитающих: Тез.докл. Всесоюз. симп.-Пущино.-1988.-С.40-41.

14. Третьяк Т.М., Куликов А.В., Григоренко Е.В. Некоторые биохимические показатели ткани головного мозга крыс с трансплантированной в переднюю камеру глаза эмбриональной поджелудочной железой. // Всесоюзный симпозиум "Трансплантация ткани мозга млекопитающих".-тез.докл.-Пупцшо.-1988.-С.62-63.

15. Куликов А.В., Третьяк Т.М., Арбузова М.И., ГоуфманЕ.И., ГорбатюкО.С. Трансплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крыс с целью компенсации экспериментального диабета. // Трансплантол. методы лечения сахарного диабета:Тез. докл. Республ. симпоз. - Рига.-1988.-С.31-32.

16. Третьяк Т.М., Куликов А.В., Григоренко Е.В., Рыбкин В.В. Алло- и ксенотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру

глаза крыс с аллоксановым диабетом. // Трансплантол. методы лечения сахарного диабета: Тез. докл. Республ. симпоз. - Рига.-1988.-С.40-41.

17. Архипова Л.В., Куликов А.В., Озолинь О.Н. РНК-синтезирующая способность хроматина мозговой ткани крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом. // Вопросы мед. химии.-1988.-№ 5.-С.76-79.

18. Kulikov A.V., TretyakT.M. Insulin as signal molecule for monoaminergic system of the brain. // Signal molecule and mechanisms of animal behaviour: Simp. Abstract,-Pushchmo.-l 989.-P.35-36.

19. Куликов А.В., Третьяк Т.М., Арбузова М.И., Старосельцева Л.К., Горбатюк О.С., Гоуфман Е.И., Акмаев И.Г. Компенсация экспериментального диабета у крыс с помощью трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза. // ДАН СССР.-1989.-т.304.-№ 2.-С.506-508.

20. Kulikov A.V. The anterior chamber of the eye as a site for transplantation of insulin-producting tissue. // 3 internation school-conference of young scientists of socialist countries: Abst-1989.- GDR.- Prieros.- P.30.

21. Арбузова М.И., Куликов А.В. Содержание иммунореактивного инсулина и проинсулинподобного компанента в эмбриональной поджелудочной железе, трансплантированной в переднюю камеру глаза крыс с экспериментальным диабетом. // 3 Всесоюз. съезд эндокринологов: Тез. докл.-Ташкент.-1989.-СЛ40.

22. Семенова Т.П., Братин А.Г., Виноградова О.С., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Компенсация нарушения поведения крыс, неонатально получавших 5,7-ДОТ, путем трансплантации эмбриональной ткани ядер шва. // Журнал высшей нервной деятельности.-1 990.-T.40.-C. 156-164.

23. Третьяк Т.М., Куликов А.В. Инсулин и мозг. // Успехи современной биологии.-1990.-т.109.-№2.-С.252-262.

24. Kulikov A.V., Arbuzova M.I. On possibility to compensate neuroendocrine deffects by transplatation of insulin-produsing tissue in the anterior chamber of the eye. // Soviet-Indian simposium on neurotransplantation and developmental neurobiology: Abstracts.-Puschino.-1991.-P.19.

25. Kulikov A.V. Changes in the activity of the enzimes of carbohydrate metabolizm in the brain of diabetic animals after transplantation of pancreas into the anterior chamber of the eye. // Soviet-Indian simposium on neurotransplantation and developmental neurobiology: Abstracts. - Puschino.-1991.-P.20-21.

26. Арбузова М.И., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Содержание иммунореактивного инсулина в поджелудочной железе и аллотрансплантатах в передней камере глаза при экспериментальном диабете. //Пр. эндокринолопш.-1991.-т.37.-№ 1.-С.42-44.

27. Куликов А.В., Арбузова М.И., Третьяк Т.М., Шкворченко Д.О., ЧайлахянЛ.М. Ксено- и аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани в переднюю камеру глаза, как способ компенсации экспериментального диабета. // Доклады РАН.-1993.-т.ЗЗО.-№ 5.-С.662-663.

28. Куликов А.В., Арбузова М.И., Третьяк Т.М.. Сравнительный анализ продуцирования инсулина поджелудочной железой, инкубируемой в среде с перфтораном и без него. // Перфторуглеродные активные среды для медицины и биологии (новые аспекты исследований) том 1 / под редакцией Г.Р.Ивашщкого, / Пущино.-1993.-С.208-211.

29. Трубецкая О.Е., Куликов А.В., Афанасьева Г.В., Резников К.Ю. Гиперпродукция ДНК в плазме крови у животных с экспериментальным диабетом и ее компенсация с помощью трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в переднюю камеру глаза. // Изв. АН серия биологическая -1994.-№ 1.-С.152-155.

30. Куликов А.В. Моделирование долговременной компенсации острого экспериментального диабета. // Математические теории биологических процессов / под ред. Д.С.Чернавского, -1994.-Калининград.-С.93-105.

31. Куликов А.В. Транспланто логический способ компенсации экспериментального диабета.//Вестн. РАН, 1994.-Т.64.-№2.-С.122-125.

32. Kulikov A.V. On the possibilitu to compensate diabetes by transplantation of insulin-producing tissue in the immunological privilege places of organism. // International Joraal ofImmunoreabilitation, 1994.-N1 .-P. 193.

33. Kulikov A.V., ArbuzovaMJ. Intercellular communications and diabetes compensation. // Workshop on intercellular communication: Abstracts.-Puschino.-1994.-P.61.

34. Afanasieva G.V., Reznikov K.Yu., Kulikov A.V., Trubetskaya O.E. Intercellular communication on the model of DNA hiperproduction in blood. // Workshop on intercellular communication: Abstracts.-Puschino.-1994.-P.l8.

35. Патент на изобретение № 1369039 "Способ моделирования компенсации сахарного диабета". Зарегистрирован в Государственном реесте изобретений, действует с 20 августа 1994г. (Патентообладатель А.В.Куликов. Соавторы А.Г.Брагин, З.И.Журавлева, Т.М.Третьяк).

36. Куликов А.В., Братин А.Г. Трансплантологические способы компенсации эндокринных и нейрональных дефектов.// IV Всероссийское совещание "Культивирование клеток животных и человека". - Цитология.-1994.-Т.36.-№ 6.-с.561-562.

37. Куликов А.В. Компенсация глубоких метаболических изменений в организме с помощью трансплантации инсулинпродуцирующей ткани. // Новые технические средства в диагностике и лечении заболеваний органов пищеварения. Тезисы доклада,- Фрязино.-1995.-С. 15-16.

38. Куликов А.В. Передняя камера глаза как место для долговременного культивирования инсулинпродуцирующей ткани с целью компенсации диабета. // Всероссийский симпозиум " Биология клетки в культуре " Санкт-Петербург, 24-26 октября 1995 г. // Тезисы доклада.-Цитология.- 1996.- Т.38.-№ 2.-С.215.

39. Kulikov A.V. Diabetes and transplantation pancrias.// Phisics of the alive.- 1996.- V.4.-N1.-P.129132

40. Белянина С.Н., Шапошникова В.В., Корыстов Ю.В., Куликов А.В. Изменение иммунологических и биохимических показателей у крыс с острым аллоксановым диабетом.// Городская научная конференция. Сборник трудов.- Пущине- 1996.-С.22-25.

41. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Арбузова М.И. Некоторые иммунологические и биохимические отклонения, наблюдающиеся при экспериментальном диабете.// Всероссийская научно-практическая конференция "Распространение эндокринопатии: сахарный диабет, остеопедез, эндемический зоб". Тезисы доклада.-Пущино.- январь 1997.- С. 114-115.

42. Куликов А.В. Исторические аспекты экспериментальной компенсации диабета.// "Распространение эндокринопатии: сахарный диабет, остеопедез, эндемический зоб"1 под редакцией проф.,А.В .Древаля ,-Пущино,-1997.-С. 74-78..

43. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Арбузова М.И., Шапошникова В.В., Архипова Л.В., ЛевитманМ.Х. Трансплантологическая компенсация экспериментальных метаболических нарушений.// II съезд биохимического общества РАН- Москва.- май 1997 г. :тезисы доклада,- С. 204-205.

44. Куликов А.В., Корыстов Ю.В., Шапошникова В.В., Архипова Л.В. Эффективны ли трансплантологические способы компенсации патологий? // Первый международный симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" - Пущино, 22-25 сентября 1997 г.: тезисы доклада, С.38-39.

45. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Шапошников В.В., Архилова Л.В. Восстановление иммунологического статуса стареющего организма с помощью аллотрансплантации тимуса и костного мозга. // Цитология.-1997, т.39.-№ 6.-С.483.

46. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Трансплантация ткани в иммунопривилегированные области организма как способ компенсации экспериментальных патологий.// VIII конференция "Новые направления биотехнологии", Москва, 27-29 апреля 1998г: тезисы доклада.- С. 80.

47. Куликов А.В., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Способ компенсации возрастной атрофии тимуса.// III Международный симпозиум "Биологические механизмы старения", Харьков, 19-21 мая 1998: тезисы доклада, С.57.

48. Куликов А.В., Чайлахян Л.М. Гисто-гематические барьеры ЦНС и компенсация экспериментальных патологий.// XVIII Съезд Всероссийского физиологического общества имени И.П.Павлова, Ростов-на Дону, 14-18 сентября 1998: тез. доклада, С.91.

49. Kulikov A.V., Korystov Yu.N., Arbuzova M.I., Shaposhnikova V.V.,Arkhipova L.V. Tissue transplantation as a compensation for deleterious effects of ageing, radiation, diabetes, and craniocerebral trauma.//Membr. Cell. Biol.-1998.- V.I l.-№ 6.- P.737-742.

50. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Шапошникова B.B., Архипова Л.В., Чайлахян Л.М. Компенсация пострадиационных и возрастных нарушений с помощью трансплантации тимуса или костного мозга в иммунопривилегированные зоны организма.//Доклады Академии Наук, 1998.-Т.361.-№ 6.-С.843-845.

51. Куликов А.В., Арбузова М.И., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Трансплантологические модели компенсации ряда моделей ассациированных со старением.//Биологический вестник.-1998.-Т.2.-№ 1.-С.20-22.

52. Куликов А.В., Смирнова Е.Г. ЦНС как место для трансплантационной компенсации экспериментальных патологий. // 5 Всероссийская школа "Актуальные проблемы нейробиологии", Казань,26-28 октября 1999, тезисы докладов, С. 76-78.

53. Куликов А.В. От трансплантации генов к трансплантации клеток и тканей: генно-клеточная терапия. Трансплантация фетальных тканей в иммунопривилегированные участки организма как способ компенсации экспериментальных патологий.// Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии,-2000.-№ 1.-С.42-47.

54. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В, Смирнова Е.Г. Модификация возрастной и стрессорной инволюции тимуса. // 4 Международный симпозиум "Биологические механизмы старения", Харьков, 24-27 мая 2000г: тезисы доклада, С.78.

55. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Способы компенсации возрастной и стрессорной инволюции тимуса.// 3 Международная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве", Боровск, 6-8 сентября 2000 г.: тезисы доклада, С.57.

56. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Экспериментальные трансплантологические способы компенсации физиологических, иммунологических и геронтологических отклонений.// В сб. "Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии" г. Омск,-2000,-С- 45-47.

57. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Трансплантологические способы компенсации патологий, снижающих среднюю продолжительность жизни животных.// Международный симпозиум "Оптимизация функций сердца и мозга", г. Тамбов, 2000г, тезисы доклада, С.73-74.

58. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Арбузова М.И., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Способы компенсации патологий, снижающих среднюю продолжительность жизни.// III Национальный геронтологический конгресс Украины, Киев, 26-28 сентября 2000г,СЛ72.

59. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Трансплантологический способ замедления возрастной инволюции тимуса. // Материалы Российской научной конференции "Проблемы гериатрии в хирургии".-Москва, 23-24 ноября 2000 г., С.150-152.

60. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В., Третьяк Т.М. Компенсация возрастной и стрессорной инволюции тимуса. //Доклады РАСН-2001.-№3.-С.41-43.

61. Kulikov A.V., SukbikhG.T., Smirnova G.N., Arkhipova L.V. Transplantological models

of compensation for pathologies related to endocrine deficiency and aging // 6 RFBR international conference "Molecular medicine", Pushchino, Abstracts, 2001, P. 42.

62. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н„ Смирнова Г.Н., АрхиповаЛ.В. Компенсация ускоренного старения организма и моделирование социального стресса на животных.// XIX съезд физиологического общества имени И.П.Павлова. Тезисы докладов, г.Казань, 2001г, С.535-536.

63. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Социальный стресс как модель старения иммунной системы организма. Способы долговременного мониторинга интенсивности социальных конфликтов в различных группах животных.// Тезисы докладов "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", г. Пущино, 24-26 октября 2001 г, С.70.

64. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Долговременная стимуляция иммунитета и повышение радиорезистенции животных за счет трансплантации ткани тимуса или костного мозга в иммунопривилегированные области организма.// Тезисы докладов " От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям". - Пущино, 24-26 октября, 2001 г., С. 71.

65. Куликов А.В., Сухих Г.Т., Арбузова М.И., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Полтавцева Р.А., Третьяк Т.М. Компенсация эндокринной патологии, ассоциированной со старением организма. // Тезисы докладов " От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям". - Пущино, 24-26 октября ,2001 г., С.71-72.

66. Кирпатовский И.Д., КистнерЮ.И., Бородягин В.Н., Куликов А.В. Трансплантация инсулин продуцирующей ткани поджелудочной железы в семенник.// Тезисы докладов "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям",- Пущино, 24-26 октября 2001г., С. 61.

67. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Радиационное ускоренное старение организма и трансплантологический способ быстрой компенсации сопутствующих иммуноногических нарушений. // Тезисы докладов "IV съезд по радиационным исследованиям". Москва, 20-24 ноября 2001 г., с. 146.

68. Куликов А.В., Сухих Г.Т., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Полтавцева Р.А., Третьяк Т.М., Чайлахян Л.М. Пролонгирование периода нормогликемии у животных с острым экспериментальным диабетом при помощи различных вариантов трансплантации ткани. //ДАН, 2001 г.- Т. 379- № 4,- С. 561-563.

69.Куликов А.В., КорыстовЮ.Н., АрбузоваМ.И., СмирноваГ.Н., АрхиповаЛ.В. Компенсация физиологических, иммунологических и возрастных отклонений с помощью тканевой трансплантации // Цитология, 2001,- Т.24.- №4.- С. 358.

70. Куликов А.В., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Демьянова Е.Г., Полтавцева Р.А.,' Сухих Г.Т. Способы компенсации ускоренного старения и смоделированного аутоиммунного заболевания у животных с помощью трансплантации адекватных тканей и стимуляции пролиферации стволовых клеток. // В сборнике «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)», Москва, 2002, С. 202-203.

71. Куликов А.В. Экспериментальная трансплантологическая компенсация последствий диабета, ускоренного старения и возможность стимуляции пролиферации стволовых клеток. // В сборнике «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)», Москва, 2002, С. 203-204.

72. Кирпатовский И.Д., Кистнер Ю.И., Куликов А.В., Бродягин В.Н., ПахомоваН.В. Аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы в семенник при экспериментальном сахарном диабете. // В сборнике «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)», Москва, 2002, С. 210-212.

73. Куликов А.В., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Полтавцева Р.А, Сухих Г.Т. Способы компенсации ускоренного старения и модельного аутоиммунного заболевания у

животных с помощью трансплантации адекватных тканей и стимуляции пролиферации стволовых клеток. // Тезисы докладов V международного симпозиума «Биологические механизмы старения». Харьков, 30.05-01.06.2002 г., С. 49-50.

74. Куликов А.В., Чайлахян Л.М., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Биохимические и нейрофизиологические показатели нормы и патологии при трансплантологической компенсации нарушений, связанных с диабетом, радиационным облучением и ускоренным старением. // «III съезд биохимического общества», тезисы докладов, Санкт-Петербург, 26.06 - 01.07.2002г., С. 56-57.

75. Kulikov A.V., SukhikhG.T., KulikovD.A. Stimulation of the stem cell pool by transplantation. Models of compensating for diabetes- and age-related pathologies. // Biotechnology - 2002. Russian - South Korean seminar-presentation of innovative scientific and technical projects in the field of biotechnology. Abstracts, September 12-13, Pushchino. 2002. P. 61-62.

76. Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов А.В. Моделирование экспериментального диабета на животных. // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 11-14 ноября 2002г., С. 48.

77. Кистнер Ю.И., Кирпатовский И.Д., Александров Н.Ю., Бродягин В.Н., Архипова Л.В., Куликов А.В. Пересадка аллогенной ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальное пространство семенника при экспериментальном сахарном диабете. // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 11-14 ноября 2002г., С. 79.

78. Корыстов Ю.Н., Куликов А.В., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н. Экспериментальное исследование социального стресса. // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 11-14 ноября 2002г., С. 83.

79. Куликов А.В., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Трансплантация эмбриональной или неонатальной тканей и возможность компенсации экспериментальных патологических состояний. // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». - Пущино, 11-14 ноября 2002 г, С. 88.

80.Куликов А.В., Семенова Т.П., Медвинская Н.И., Смирнова Г.Н. Трансплантация клеток с высокой пролиферативной активностью в мозг для компенсации экспериментальных нарушений нейродегенеративных нарушений. // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 11-14 ноября 2002 г., с. 88.

81. Кистнер Ю.И., Кирпатовский И.Д., Куликов А.В., Архипова Л.В., Александров Н.Ю., Бродягин В.Н. Возможность экспериментальной паравазальной субкапсулярной аллотрансплантации инсулинпродуцирующей ткани неонатальной поджелудочной железы в семенник // Материалы конференции «Новые технологии в медицинской практике».-Москва, 9 июня 2003.-С.64-67.

82.. Корыстов Ю.Н., Куликов А.В., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Шапошникова В.В., ЛевитманМ.Х. Автоматическая акустическая регистрация конфликта в группах мышей и методы определения последствий социального стресса. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г, С. 111-115.

83. Хлыстова З.С., Шмелева С.П., Минина Т.А., Куликов А.В., Бочарова Л.С., Архипова Л.В., Полтавцева Р.А., Рябчиков О.П., Сухих Г.Т. Структура поджелудочной железы крыс-диабетиков породы Вистар после имплантации им аллогенных и ксеногенных инсулинпродуцирующих и инсулиннепродуцирующих тканей и клеток. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г., С. 232-235.

84. Кистнер Ю.И., Кирпатовский И.Д., Куликов А.В. Результаты паравазальной

субкалсуляной аллотрансплантации ткани неонатальной поджелудочной железы в семенник. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. чл.-корр. РАН Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г., С. 235-240.

85. Куликов А.В., Сухих Г.Т., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Полтавцева Р.А., Рябчиков О.П., Третьяк Т.М., Куликов Д.А. Экспериментальная компенсация последствий диабета и возможность стимуляции пролиферации стволовых клеток трансплантацией эмбриональной или неонатальной поджелудочной железы. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого . Пущино, 2003г, С.245-247.

86. Кистнер Ю.И., Кирпатовский И.Д., Александров Н.Ю., Бродягин В.Н., Куликов А.В., Архипова Л.В Можно ли обеспечить длительное функционирование неонатальных островковых клеток поджелудочной железы после паравазальной субкапсулярной аллотрансплантации в семенник. //Тезисы доклада I международной медицинской конференции "Мужское здоровье и долголетие". - Москва, 2003г, С. 77-78.

87. Колаева С.Г., Новоселова Е.Г, Амерханов З.Г, Куликов А.В., Ивков В.Г. Ежегодная инволюция и регенерация тимуса у зимнеспяших и перспективы ее исследований в области геронтологии и пролиферации стволовых клеток.// Цитология, 2003,- Т.45.-№7.-С. 628-634.

88. Корыстов Ю.Н., Куликов А.В., Архипова Л.В, Смирнова Г.Н., Шапошникова В.В., ЛевитманМ.Х, ЧайлахянЛ.М. Социальный стресс в группах мышей: методы регистрации конфликта и его последствий.// ДАН, 2003.- Т. 390- № 6.- С. 847-849.

89. Кистнер Ю.И., Кирпатовский И.Д.,. Александров Н.Ю, Куликов А.В. Паравазальная субкапсулярная аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в семенник крыс.// Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2003.- №1. С. 30-33.

90. .Куликов А.В., Новоселова Е.Г., Воробьев Н.А., Куликов Д.А., ГлушковаО.В., Черенков Д.А. Торможение возрастной инволюции вилочковой железы у стареющих крыс после трансплантации им тимуса зимнеспяших сусликов. // Тезисы докладов VI международного симпозиума «Биологические механизмы старения». Харьков, 2004г., С. 35-36.

91. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Куликов Д.А. Экспериментальный способ компенсации последствий сублетального и летального радиационного облучения // Тезисы докладов конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», Санкт-Петербург, 2004г, С. 312-313.

92. Куликов А.В., Новоселова Е.Г., Третьяк Т.М., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Куликов Д.А., Глушкова О.В. Долговременная компенсация патофизиологических состояний новыми методами тканевой биотехолопш //Тезисы докладов конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 2004г, С. 16-17.

93. Новоселова Е.Г. Куликов А.В. Глушкова О.В., Черенков Д.А., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Влияние трансплантации тимуса зимнеспящих сусликов на возрастную инволюцию вилочковой железы стареющих крыс.// ДАН, 2004 .- Т. 397-№2.-С.277-280.

Принято к исполнению 02/09/2004 Исполнено 06/09/2004

Заказ № 302 Тираж 120 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

» Т 7 8 4 б

РНБ Русский фонд

2005-4 15257

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Куликов, Александр Владимирович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Трансплантация ткани в ЦНС и переднюю камеру глаза.

Гистогематические барьеры.

Иммунологические аспекты трансплантации ткани в мозг и переднюю камеру глаза.

История вопроса о трансплантации ткани в ЦНС и переднюю камеру глаза.

Нейротоксическое повреждение норадренергической системы мозга.

Эндогенные воздействия на различные системы организма. Тимус, старение, стресс.

Сахарный диабет, осложнения, аспекты консервативной терапии.

Аллоксановый диабет.

Органная трансплантация поджелудочной железы при сахарном диабете.

Клеточная трансплантация инсулинпродуцирующей ткани при сахарном диабете.

Роль способа и места алло- и ксенотрансплантации для выживания пересаженных островковых клеток.

Семенник как место для трансплантации островковых клеток.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные.

Получение крыс с норадренергической недостаточностью.

Трансплантация участков синего пятна.

Определение норадреналина в структурах мозга экспериментальных животных.

Изучение ориентировочно-исследовательской двигательной активности.

Регистрация конфликтов в группах животных.

Трансплантация тимуса и костного мозга в переднюю камеру глаза животных.

Определение количества тимоцитов у животных.

Облучение животных.

Определение фрагментированной ДНК.

Получение экспериментального диабета.

Получение абортивного материала.

Тестирование уровня глюкозы в биологических жидкостях экспериментальных животных.

Определение инсулина в поджелудочной железе, трансплантате и сыворотке крови.

Определение потребления воды.

Алло- и ксенорансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крыс.

Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза кроликов.

Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в боковые желудочки мозга крыс.

Гистологические исследования ткани.

Иммуногистохимические исследования.

Подготовка микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы крыс для трансплантации.

Микрохирургический метод аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника.

Одностороннее пересечение семявыносящего протока интактного семенника после аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в контрлатеральный семенник.

Тест на фертильность.

Статистика.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1.

Компенсация норадренергической недостаточности и поведенческих реакций после воздействия 6-ОДА и последующей трансплантации ткани синего пятна.

Глава 2.

Регистрация социального стресса во вновь образованных иерархических группах животных.

Глава 3.

Алло- и ксенотрансплантация тимуса.

Глава 4.

Трансплантация иммунокомпетентных тканей (тимус, костный мозг) после радиационного облучения.

Глава 5.

Алло- и ксенотрансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и боковые желудочки мозга с целью компенсации физиологических и биохимических отклонений при экспериментальном диабете.

Глава 6.

Аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника с целью компенсации при экспериментальном диабете.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментально вызванные патофизиологические состояния и их компенсация методами биоинженерии"

Известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами относительной иммунопривилегированности. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам, в первую очередь, относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и семенник. Связано это с особым строением гисто-гематических барьеров этих областей, в норме не пропускающих иммунокомпетентные клетки. Те же активированные иммунные клетки, которые все же проникают в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-ligand, экспрессированного в этих участках. Функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L - система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

К настоящему времени в область ЦНС трансплантированы почти все участки эмбрионального и фетального мозга от соматосенсорной коры, гиппокампа и мозжечка (Александрова, 1999; Bragin et al., 1988; Shetty et al., 1997; Sommer et al., 1997) до участков спинного мозга (Nornes et al., 1984) и других видов нейронов, способных к выживанию и росту в области ЦНС.

Если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы, от нейрональных и опухолевых до эндокринных (Schochet, 1920; Goodmann, 1943; Krametz , Greene, 1953; Falck, 1959; Green, 1967; Hoffer, Seiger, 1974; Weber et al., 1975; Брагин, Виноградова, 1983; Миронов, 1988; Adeghate,1998; Adeghate, Donath, 2000).

В семенник пересаживали тиреоидную ткань, Лейдиговские клетки, клетки гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и др. (Scothorne 1977; Setchell et al., 1995; Кирпатовский и др., 1994, 1999; Каитова, 2003).

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС, переднюю камеру глаза и тестикул успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al., 1979; Bjorklund, Stenevi, 1979).

В восьмидесятые годы прошлого века широкое применение получила экспериментальная алло- и ксенотрансплантация инсулинпродуцирующих клеток и тканей в печень, в пульпу селезенки, внутрибрюшинно, под капсулу почки (Скалецкий 1987; Скалецкий, Шальнев 1988; Tze, Tai, 1983; Brown et al., 1984; Bretzel, 1984; David et al., 1988; Powell, 1987; Kaufman et al., 1990; Hiller et al., 1991). По результатам исследований в этом направлении разработан ряд новых подходов для клинической трансплантации.

Разработанная в НИИТиИО МЗ РФ в эксперименте и внедренная в клиническую практику трансплантация культур островковых клеток аллогенного и ксеногенного происхождения приводит к тому, что в процессе культивирования происходит снижение иммуногенности трансплантата. Этот способ позволяет применять в качестве места для пересадки не только печень и селезенку, но и мышцы передней брюшной стенки, что делает операцию значительно менее травматичной для пациента. Трансплантация проходит без иммуносупрессии. Положительное влияние пересадки проявляется в виде снижения потребности экзогенного инсулина, стабилизации лабильного течения диабета и торможения прогрессирования поздних осложнений диабета (Шумаков и др. 1981; 1998;Скалецкий, Онищненко, 2001; Скалецкий и др. 2002; 8Ьишакоу ег а1., 1989).

Несомненный интерес представляет возможность пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в те области, в которых в силу анатомического строения и выработки иммуномодулирующих агентов они могут функционировать длительное время. В настоящее время накоплен значительный клинический опыт в области нейротрансплантации при болезни Паркинсона, начаты операции при других нейродегенеративных заболеваниях ЦНС - хорее Гентингтона, при эпилепсии, травме спинного мозга (Макаренко и др., 1998; 1лпсЬ/а1 е1 а1., 1994; Т^гшпоу е1 а1., 1996; 01апол¥ е1 а1., 1997). Несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ по трансплантации тканей в относительно иммунопривилегированные зоны организма, в этой области осталось еще большое количество нерешенных проблем. В ходе выполнения работы были поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате проведенных исследований нами предложены оригинальные модели компенсации экспериментального диабета, норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса.

Несомненно, с помощью экспериментальных физиологических работ в этом направлении можно заложить основу для разработки новых медицинских методов долговременной компенсации ряда нейродегенеративных и эндокринных патологий

Цель работы

Используя свойства относительной иммунологической привилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника разработать трансплантологические способы компенсации патологических состояний у животных. Оптимизация использования этих способов в экспериментальной биологии.

Задачи исследования

1. Разработка трансплантологических способов компенсации норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса, диабета. Разработка методов оценки их эффективности.

Научная новизна работы

1. Показана впервые возможность долговременной компенсации норадренергической недостаточности и поведенческих реакций после воздействия нейротоксина (6-ОДА) и последующей трансплантации ткани синего пятна.

2. Разработаны новые способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс. Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных.

3. Разработан новый автоматизированный метод регистрации социальных конфликтов в больших выборках мышей в период установления нового иерархического порядка.

4. Разработаны новые способы долговременной компенсации экспериментального аллоксанового диабета с помощью трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированные участки организма - мозг, передняя камера глаза, семенник. Показано, что при этом происходит полная или частичная нормализация основных физиологических и биохимических показателей. При трансплантации поджелудочной железы в семенник сохраняется фертильность животных. Перечисленные результаты исследований носят приоритетный характер.

Положения, выносимые на защиту

Научно-теоретическое и практическое значение работы

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНИ В ЦНС И ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА

Трансплантация ткани в различные участки мозга и переднюю камеру глаза имеет сегодня уже более чем вековую историю. Первые работы в этой области были опубликованы Дооремалом, Томпсоном, Салтыковым и Данн в конце позапрошлого, начале прошлого веков (Van Dooremaal, 1873; Thompson, 1890; Saltykov, 1905; Dunn, 1917).

В 80-х годах прошлого века начался очередной бум трансплантологических работ, посвященных пересадке тканей, чаще всего нейрональных, в различные структуры мозга. На современном этапе трансплантация в область ЦНС привлекает внимание исследователей в силу значительных достижений, базирующихся на современном уровне развития нейрофизиологии, нейрохимии, морфологии и иммунологии мозга. Успехи в этих областях позволяют понять основу относительной иммунологической привилегированности некоторых участков мозга, подтвердить предположения об уникальной структуре капилляров мозга и особенностях трофических процессов в тканях ЦНС. На сегодняшний день в область ЦНС трансплантированы почти все участки эмбрионального и фетального мозга от соматосенсорной коры (Bragin et al., 1988) до участков спинного мозга (Nornes et al., 1984). В различных трансплантатах были биохимически и радиоимму нохимически идентифицированы : холинергические (Lewis, Cotman, 1983; и др.), адренергические (Брагин, Виноградова, 1985; Lewis, Cotman, 1983; Cassel et al., 1995; Tarricone et al., 1996), холецистокениновые (Ebner et al., 1984; и др.), дофаминергические (Perlow et al., 1979; Bjorklund et al., 1979; Bjorklund et al., 1981; Deacon et al., 1994; Yurek et al., 1996; Bjorklund, Stromberg, 1997; Goto et al., 1997) и др.), норадренергические (Seiger, Olson, 1977; Lindvall et al., 1988; Murata et al., 1990; Clough et al., 1994; Ribotta et al., 1996), серотонинергические (Bjorklund et al., 1976; Armitia et al., 1981; McRae-Degueurce et al., 1984); и др.), соматостатинергические (Spemann, Mangold, 1924), m вазопрессинергические (Gash et al., 1980; Richards, Raisman, 1984; Kriger, Gibson, 1984) и другие виды нейронов, способные к выживанию и росту в области центральной нервной системы реципиента.

Много работ было посвящено гомо- и гетеротопическим пересадкам таких структур как гиппокамп (Kromer, et al., 1979; Sunde, Zimmer, 1983; Vinogradova et al., 1985; Stafekhina et al., 1995; Shetty, Turner, 1996; Shetty, Turner, 1997, 1997a), мозжечок (Das, Altman, 1972; Alvarado-Mallart, Sotelo, 1982; Holmes et al., 1992; Triarhou et al., 1995; Rossi et al., 1995; Zhang et al., 1996; Jankovski et al., 1996; Sommer et al., 1997), кора мозга (Отеллин, 1985; Брагин, 1990; Александрова, 1990, 1999; Das, 1974; Oblinger et al., 1980; Oblinger, Das, 1982; Castro et al., 1987; Gonzales et al., 1988; Bragin et al., 1989, 1992; Plumet et al., 1990, 1993; Onizuka et al., 1996; Garnier et al., 1997,), сетчатка (Turner et al., 1986; Del Cerro et al., 1990; Klassen, Lund, 1990; Aramant et al., 1991; Sasaki et al., 1996). Трансплантированные ткани образовывали специфические гистотипические конструкции в мозге реципиента, формировали сходные слоистые структуры (Александрова, 1999). Практически всегда была выражена тенденция к структурированию, и особенно четко она выявлялась в имплантатах гиппокампа, мозжечка и сетчатки. При морфологических исследованиях трансплантатов коры мозга, гиппокампа, мозжечка было выявлено, что в них формируются нейроны, по своему фенотипу сходные с типичными клеточными элементами исходной структуры (Брагин, Виноградова, 1981; Александрова, Полежаев, 1982; Полежаев, Александрова, 1986; Jaeger, Lund, 1981; Alvarado-Mallart, Sotelo, 1982; Das, 1985;). В тоже время многие авторы отмечали, что в ряде случаев нейроны имели искаженную форму дендритного ветвления (Alexandrova, Polezhaev, 1984; Plaschke et al., 1995).

При электронно-микроскопическом исследовании в нейропиле трансплантатов были описаны практически все виды синаптических контактов. Количественная оценка показала, что плотность распределения синапсов близка к нормальному уровню (Albert, Das, 1984; Aramant, Seiler, 1995).

Здесь приводятся работы, в основном, последних 20 лет, потому что, как сказано выше, именно на это время пришлось их наибольшее количество, вместе с тем это вовсе не означает, что до последней четверти прошлого века трансплантологических работ в этой области не было. Ниже в обзоре литературе мы остановимся на некоторых, ставших теперь уже классическими, исследованиях, но перед этим укажем на особенности трансплантации ткани в мозг и переднюю камеру глаза.

ГИСТОГЕМАТИЧЕСКИЕ БАРЬЕРЫ

Современные представления о гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ) сложились в результате многолетних исследований. Сама концепция барьера появилась в 1885 году, когда Пауль Эрлих обнаружил, что при внутривенном введении в организм животных кислого красителя церулина-S прокрашиваются все органы и ткани за исключением мозга (Ehrlich, 1885, 1886).

В 1913 году Гольдман, продолжая дело своего наставника, провел две серии экспериментов, показавших, что полуколлоидный краситель трипановый синий в пределах центральной нервной системы (ЦНС) ведет себя иначе, чем во всем организме. В одном случае краситель вводили в ток крови или в периферические органы и ткани. При этом все органы, за исключением ЦНС, оказались окрашенными. Периферические нервные узлы окрашивались всегда, в то время как ствол и сосок зрительного нерва оставались бесцветными. Окрашивались так же твердая мозговая оболочка, сосудистые сплетения, гипофиз (включая его заднюю долю), серый бугор, area postrema и эпифиз. В своих работах, проведенных на разных видах животных, Гольдман показал, что между кровью и нервными центрами существует препятствие, через которое данный краситель не проходит (Goldmann, 1913).

В другой серии краситель вводился непосредственно в цереброспинальную жидкость. У подопытных животных отмечались явления интоксикации, выражавшиеся в возбуждении нервных центров, подергивании отдельных мышц, нередко судорогах и т.д. При вскрытии обнаруживалось, что краситель проникает в ЦНС, преимущественно в ее участки, соприкасающиеся с цистернами мозга (Goldmann, 1913b).

Следующим после работ Гольдмана крупным этапом на пути изучения барьерных функций в ЦНС явились исследования Штерн и Готье (Stern, Goutier, 1921). По результатам многочисленных экспериментов на различных видах животных они показали, что значительное число химических веществ, при введении их в общую циркуляцию, не переходят в цереброспинальную жидкость, между тем как другие вещества, очень близкие к ним, могут быть обнаружены в головном и спинном мозге.

Таким образом, существует не менее важная функция ГЭБ, функция регулятора состава физико-химических и биологических свойств внутренней среды ЦНС (Чороян, 2003).

Гипотеза о том, что капилляры мозга являются анатомической основой ГЭБ, постулированная еще Гольдманом, нашла свое экспериментальное подтверждение лишь в 60-х годах с появлением высокоразрешающей оптики и электронного микроскопа. Известно, что клетки эндотелия, выстилающие просвет капилляров, соединены между собой непрерывными, плотными контактами так, что между клетками нет щелей. Каждая клетка, как правило, заключена в свою собственную наружную мембрану, состоящую из двух слоев, и внешние слои мембран двух соседних клеток оказываются физически соединены (Росин, 1981; Бредбери, 1983; Кассиль, 1983; Белова, Юнсон, 1985; Connell, Mercer, 1974; и др.). Следует обратить внимание на то, что во многих органах в эндотелии капилляров имеются поры или каналы, пронизывающие весь слой, а в эндотелии сосудов мозга такие каналы отсутствуют (Чернова, 1977; Отеллин и др. 1981; Гольдстейн, Бец, 1986; и др.).

В 60-х годах с появлением зондов, выявляемых с помощью электронного микроскопа, удалось увязать обнаруженные структурные детали с функцией ГЭБ. Рис и Карновски, а затем Рис и Бригман провели две серии экспериментов аналогичных опытам прародителей теории ГЭБ, Эрлиха и Гольдмана (Ehrkich, 1885, 1886; Goldman, 1913а, 1913b). В первом случае пероксидазу хрена (фермент по размеру сходный с белками, в норме присутствующими в крови) вводили в кровяное русло экспериментальным животным и через некоторое время проводили электронно-микроскопический анализ. В большинстве органов пероксидаза легко проникала сквозь стенки капилляров по каналам и щелям между стенками эндотелия. В мозгу же плотные контакты между эндотелиальными клетками останавливали пероксидазу, и лишь очень незначительное ее количество переносилось через клетки эндотелия с помощью везикул. Во втором случае пероксидазу хрена инъецировали в спинномозговую жидкость, и она распространилась в желудочке мозга и проникла во внеклеточное пространство мозговой ткани. Фермент не выходил из мозга, т.к. ему препятствовали плотные контакты между эндотелиальными клетками капилляров (Reese, Karnovsky, 1967; Brigman, Reese, 1969).

Таким образом, под ГЭБ принято подразумевать всю совокупность анатомических образований, расположенных между кровью и мозгом, включая цереброспинальную жидкость. ГЭБ является сложным механизмом, регулирующим и защищающим относительное постоянство химического состава, физико-химических свойств, физиологической активности внутренней среды мозга.

ГЭБ обладает регуляторной и защитной функциями. В основе регуляторной функции ГЭБ находится генетически обусловленная селективная проницаемость для веществ, которые физиологически необходимы мозгу. Защитная функция ГЭБ в нормальных условиях ограждает внутреннюю среду мозга от поступления веществ чуждых его функции. Они могут быть как биогенными, постоянно циркулирующими в крови, так и экзогенными, введенными в организм.

Термин гематоофтальмический барьер (ГОБ) был предложен Фрадкиным в 1927 году (Фрадкин и др., 1927).

Обмен между кровью и внутриглазным содержимым происходит через ряд барьерных структур. Между сетчатой оболочкой и кровью существует весьма эффективный барьер. Он обеспечен специальной структурой стенок капилляров, питающих эту

часть сетчатой оболочки. Внутренняя треть сетчатки снабжается кровью из ветви ее центральной артерии. Отходящие от артерии сосуды выстланы эндотелием, клетки которого плотно уложены, и каждая перекрывает своим телом места соединения с соседними клетками таким образом, что исключается возможность для межклеточного диапедеза клеток или мелких антигенных частиц из кровеносного русла (Пучковская, 1983; Розенфельд, 1987; Cunha-Var, 1980; и др.).

Остальная часть сетчатки зависит от кровообращения в хориоидее. От этой оболочки глаза она ограничена пластинкой Lamina vitrea (внутренний слой сосудистой оболочки) и слоем клеток пигментного эпителия (один из 10 слоев сетчатки, наружный), так же циркулярно охватывающий сосуды и места соединения эндотелиальных клеток. Эндотелий хориокапилляров имеет фенестрированную стенку и движение макромолекул и красителей типа флюоресцеина к сетчатке прекращается именно на уровне пигментного эпителия (Жаленько, 1969; Steinberg, Miller, 1973; Tze, 1980).

В переднем отделе глаза существует барьер между кровью и водянистой влагой передней камеры глаза (ПКГ). Анатомическими границами передней камеры глаза являются передние поверхности капсулы хрусталика и радужной оболочки, а также задний эпителий роговицы выстланы прочной, полупроницаемой мембраной - задней пограничной пластиной. Последняя, как и капсула хрусталика, являясь полупроницаемой биологической мембраной, оказывается резистентной к пассивному переносу биохимических субстанций между кровью и влагой передней камеры глаза (Жаленько, 1969; Мусаев, 1986; Barker, 1978; и др.). Установлено, что со стороны цилиарного тела барьер между кровью и водянистой влагой обеспечивается стенками сосудов и двумя слоями цилиарного эпителия, со стороны радужной оболочки - только стенками сосудов. Таким образом, ГЖГ защищена от диффузии антигенов из прилежащих тканей. Перенос веществ между кровью и ГЖГ возможен из цилиарного тела через стенки сосудов и два слоя цилиарного эпителия, а из радужной оболочки - только через стенки сосудов (Пучковская и др., 1983; и др.).

Гематоофтальмологический барьер является физиологическим механизмом, выполняющим барьерную функцию в отношении прозрачных сред глаза, регулирует относительное постоянство состава внутриглазных жидкостей и оказывает существенное влияние на метаболизм роговой оболочки хрусталика, сетчатки и других частей глаза.

Интерес к трансплантации ткани в ГЖГ и мозг связан еще и с тем, что в этих структурах нет лимфатического протока, в результате чего отсутствует афферентное звено иммунной реакции (Виноградова, 1984; Полежаев, Александрова, 1986; Fuchs, Bullard, 1988; и др.). Кроме того, трансплантаты незрелой ткани ЦНС имеют очень низкий уровень антигенов главного комплекса гистосовместимости (Ярыгин и др. 1997; Winder, Brindin, 1980; Hart et al., 1981; Schnizer et al., 1981; и др.).

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ТКАНИ В МОЗГ И ПКГ

Успешность приживления нейротрансплантата обусловлена, с одной стороны, иммунологической привилегированностью головного мозга за счет наличия ГЭБ, не пропускающего в мозг лимфоциты и др. (т.е. избирательной проницаемостью), а с другой стороны, низким уровнем антигенов главного комплекса гистосовместимости в незрелой мозговой ткани и синтезом активированными астроцитами ростовых факторов, обладающих иммуносупрессивными свойствами (например, TGF-P2). Кроме того, как в мозге, так и в структурах глаза Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Ермакова, 2001; Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

Shirai (1921), Murphy и Sturm (1923) были первыми, чьи работы дали толчок развитию исследованиям иммунологического статуса нейротрансплантации. Их работы по экзогенной трансплантации опухолевой ткани привели к исследованиям, в которых и была разработана классическая концепция иммунологической привилегированности мозга (Medawar, 1948; Barker, Billingham, 1977). Согласно этой концепции инородная ткань, трансплантированная в мозг, может жить достаточно долгий период времени по сравнению с аналогичными трансплантатами, помещенными в иммунологически непривилегированные области. Специальный иммунный статус был приписан мозгу, во-первых, в связи с неразвитостью лимфатических сосудов в паренхиме мозга, во-вторых - наличием ГЭБ и, в-третьих, -со слабо выраженной экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (АГКГ). Таким образом, не один фактор, а комбинация факторов отвечает за иммунный статус ЦНС.

В последнее время, однако, появились работы, указывающие на ограниченность иммунопривилегированности мозга. Было обнаружено, что в мозге имеется внутренняя система «иммунного надзора», связанная с наличием резидентных макрофагов и микроглии (Gehrman et al., 1995; Thomas, 1992). При действии провоцирующих факторов микроглия может выполнять роль антиген-презентирующих клеток, способных экспрессировать антигены главного комплекса гистосовместимости.

Как говорилось выше, в мозге достаточно низкий уровень АГКГ. Только определенные клетки, такие как эндотелиальные и периваскулярные клетки, микроглия и клетки соединительной ткани, экспрессируют АГКГ класса I. К тому же микроглия и астроциты могут экспрессировать АГКГ класса II (Widner, 1993), хотя, по мнению других авторов, АГКГ класса II могут экспрессироваться только микроглией (Finsen et al., 1991). При нейротрансплантации экспрессия АГКГ усиливается. При этом наиболее выраженная экспрессия наблюдается при аллотрансплантации (между животными разных линий одного вида) и ксенотрансплантации (между животными разных видов), чем при сингенной трансплантации (между животными одной линии).

Выделенный из незрелой ткани, a-fetoprotein уменьшает иммунную реакцию, в основном, за счет снижения экспрессии АГКГ класса II. Иммуносупрессорами являются также простагландин Е2 (PGE2) и ростовой фактор ß2 (TGF - ß2), продуцируемые активированными астроцитами (Fontana et al., 1984; Widner, 1993). У группы больных с глиомами наблюдался нарушенный иммунный статус, который был связан с высоким уровнем TGF-ß2, выделяемого опухолью.

Без иммунносупрессии аллотрансплантаты могут выживать длительное время (Mason et al., 1986; Лосева, 1999), но могут быть и отторгнуты на не очень длительном временном отрезке (Nicholas et al., 1987; Lawrence et al., 1990). Однако используемая в настоящее время техника внутримозговой трансплантации незрелой нервной ткани должна сводить до минимума возможность возникновения иммунного ответа (Лосева и др., 1990; Ермакова и др., 2000).

В отношении ПКГ следует добавить, что концентрация веществ, растворенных в жидкой фазе крови и во влаге ПКГ, находится в различных соотношениях. Наиболее существенное отличие между камерной влагой и плазмой заключается в крайне низком содержании белка в камерной влаге. Так, определенное различными способами содержание белка во влаге ПКГ составляет у кролика 20-60мг%, у вола и лошади 18-25мг%, у кошки 20-40мг%, у человека 19-34мг%. Тогда как в плазме крови эти цифры составляют 7500-9000мг% (Пири и др.,1968; Петрович, Боровик, 1973; Петрович, 1977; Пучковская и др., 1983). Крайне низко содержание во влаге ПКГ иммуноглобулинов. Лишь 5-10мг% следы ^А, а как правило, не обнаруживаются вовсе (РПс1ег,1979; ЯаЫ, 1984 и др.). Все это, а также возможность постоянного визуального контроля за развитием трансплантата делает переднюю камеру глаза очень удобной для экспериментальных трансплантологических работ.

ИСТОРИЯ ВОПРОСА О ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ В ЦНС И ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА

Ниже мы остановимся на некоторых работах, без которых трудно представить современный прогресс в этой области экспериментальной трансплантологии.

В 1890 году Томпсон пересадил кусочки затылочной коры между взрослыми собаками и от взрослых кошек взрослым собакам. Основываясь на гистологических исследованиях, проведенных через 3 дня и 7 недель после трансплантации, автор пришел к заключению, что на обоих сроках трансплантаты оставались жизнеспособными. Однако отсутствие в работе очевидных доказательств приживаемости нейронов в трансплантате вызывает сомнения в корректности данного вывода (Thomson, 1890).

В 1905 году Салтыков (Saltykov, 1905) удалял, а затем реимплантировал кусочки левого мозгового неокортекса 41 кролику возраста от 6 недель до нескольких месяцев. Нейрональное выживание было хорошо документировано до 8 дня после трансплантации.

Сомнения в результативности пересадки ткани, взятой от взрослых доноров, привели Элизабет Дан к заключению, что работать следует с тканью молодого организма. В 1917 году она опубликовала работу, в которой описывались результаты пересадки кусочков коры 9-10-дневных крыс крысам того же возраста. Из 44 животных, успешно перенесших операцию, (всего было оперировано 46 крысят) при гистологическом исследовании через 200 дней после трансплантации у 9 крыс в трансплантатах были обнаружены нейроны. Дан не только установила, что незрелая нервная ткань выживает в мозге с большей вероятностью, но и отметила, что чаще жизнеспособность сохраняют трансплантаты, которые на новом месте оказались хорошо обеспечены кровеносными сосудами. Так, успешно выживали кусочки ткани, помещенные в желудочки мозга, где обеспечен хороший контакт с сосудистой оболочкой, выстилающей эти образования. (Dunn, 1917).

В 1940 году Ле Гро Кларк получил данные, подтверждающие важность этих двух факторов, незрелость донорской ткани и хорошее кровоснабжение трансплантата в мозгу реципиента для выживания пересаженных нейронов. Он пересаживал 15-20-дневный эмбриональный неокортекс во фронтальную кору 6-недельных кроликов. Гистологические исследования, проведенные через 4 недели после операции, показали, что у большинства обследованных животных незрелые нейроны нормально завершали свое развитие (Le Gros Clark, 1940).

Просматривая ретроспективу нейротрансплантологических работ, приходится невольно сдерживать себя с тем, чтобы не уйти в слишком громоздкое и подробное описание всех известных нам исследований. Выделяя только некоторые, мы, безусловно, проявляем субъективизм, оставляя за рамками написанного много замечательных работ, с опытом использования которых и выполнены многие из исследований последних лет. При выборе мы руководствовались принципом, по которому выделяли не те работы, которые цитировать можно и нужно, а те, которые не цитировать нельзя. К таким работам можно отнести также исследования Даса и Альтмана 1971-1973 годов. Они убедительно показали, что незрелые нейроны мозжечка у молодых крыс и кроликов, помеченные перед трансплантацией радиоактивным тимидином, могут выживать и нормально дифференцироваться дальше. Для доказательства этого положения они через 2 недели после трансплантации срезы мозжечка реципиентов исследовали авторадиографически. На срезах была обнаружена радиоактивность, т.е. пересаженные нейроны не погибли и утилизировали "метку" (Das, Altman, 1971; Das, 1973).

Следует отметить, что, если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза трансплантировали ткани самой различной природы.

В 1930 году May опубликовал первую хорошо документированную работу по аллотрансплантации неонатальной (0-2 дня) коры в ПКГ крыс. Через 6 месяцев с помощью гистологических исследований автор обнаружил, что трансплантаты хорошо васкуляризованы, а нейроны в них жизнеспособны (May, 1930).

В более поздних своих работах автор наблюдал развитие трансплантатов незрелого мозжечка в ПКГ. Он показал, что в процессе развития и дифференцировки индивидуальные нейроны приобретают внешний вид, морфологически неотличимый от взрослых нейронов (May, 1954).

Нельзя не вспомнить начатые еще в 40-х годах работы Грина по трансплантации в ПКГ животных и птиц тканей самой разной природы. Гистологические исследования, проведенные автором на сроках наблюдения в 40 и более дней после трансплантации, позволили заключить, что ПКГ морских свинок является хорошим местом для роста, развития и дифференцировки трансплантатов при пересадке в нее куриной саркомы, мышиной опухоли С-1300; человеческой аденокарциномы, фибросаркомы, гемоангиобластомы а так же эмбриональной почки цыпленка (Green, Lund, 1944; Arnold, 1945; Green, 1967; и др.).

В более поздних исследованиях по трансплантации опухолевых клеток разной природы в ПКГ говорится о больших перспективах использования этого метода в онкологических исследованиях, поскольку наблюдается резкое снижение уровня дифференцированности и злокачественности некоторых опухолей, культивируемых в передней камере глаза (Швенбергер и др., 1977; Аль-Рубей и др., 1984; и др.).

Ткань головного мозга 2-3-месячных эмбрионов человека успешно пересаживали в ПКГ морских свинок, и нейроны трансплантата сохраняли жизнеспособность более 2 лет, как и при аллотрансплантации эмбриональной ткани мозга кролика. Следует, однако, заметить, что ткань коры больших полушарий взрослых людей и кроликов, трансплантированная в ПКГ, резорбировалась в течение значительно более короткого промежутка времени (Green, Arnold, 1945).

Olson, Malmform (1970) опубликовали первую работу по трансплантации адренергических нейронов в ПКГ крыс. В эксперименте нейроны были идентифицированы с помощью гистохимической, флюоресцентной и радионуклидной методик. Нейроны различных структур мозга, развивающиеся в относительной изоляции от внешних нервных влияний в передней камере глаза, ведут себя по-разному. Нейроны мозжечка через 3-4 недели после трансплантации обнаруживают высокую нерегулярную спонтанную активность, частота и паттерн которой воспроизводят активность клеток Пуркинье в естественных условиях (Hoffer, Seiger, 1974). Нейроны септума воспроизводят типичные черты активности диафферентированного септума со спонтанной активностью, как в инкубационной среде взрослые структуры (20-30 разрядов/с) (Брагин, Виноградова, 1983). В эмбриональных трансплантатах гиппокампа через 3-6 месяцев после пересадки наблюдались относительно регулярные спонтанные разряды, длительность которых в разных трансплантатах колебалась от нескольких десятков до нескольких сотен миллисекунд (Миронов, 1988). Таким образом, активность нейрональных структур в неодинаковой степени обнаруживает зависимость от нормальной внешней афферентации.

Относительная иммунологическая привилегированность передней камеры глаза (ПКГ) и возможность визуального наблюдения за состоянием помещенного в нее трансплантата делают этот участок очень удобным для экспериментальной трансплантации.

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС и переднюю камеру глаза, успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al., 1979; Bjorklund, Stenevi, 1979), в то время как единичные попытки скомпенсировать экспериментальный диабет трансплантацией ткани поджелудочной железы в переднюю камеру глаза в силу методических недоработок заканчивались неудачей (Browning, Resnik, 1951; Weber et al., 1975).

НЕЙРОТОКСИЧЕСКОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА

Катехоламинэргические системы мозга осуществляют иннервацию многих областей мозга, в частности, коры больших полушарий, гиппокампа и гипоталамических структур. Медиаторную функцию выполняют синтезируемые в них биогенные амины, метаболизм которых может быть изменен путем вмешательства на уровне различных звеньев их синтеза и катаболизма. Чрезвычайно сложная анатомическая организация КА-ергических систем мозга, диффузное расположение их ядер в глубинных структурах мозга является причиной того, что применение классических подходов для выяснения функциональной роли этих систем, а именно, повреждение нейрональных входов и деструкция ядер, неэффективно (Медвинская, 1997).

Появление в литературе данных о химических веществах, способных строго специфично вмешиваться в деятельность медиаторных систем, привело к представлению о новом понятии в нейробиологии, именуемой химической деиннервацией определенного типа нервных клеток. Эти химические соединения получили название нейротоксинов за свою способность вызывать деструкцию нейронов определенной химической природы. Так, 6-оксидофамин (6-ОДА) проявляет свое нейротоксическое действие только по отношению к нейронам катехоламинергических систем, фактически не затрагивая клетки других типов. А поскольку КА-эргические нейроны связывают с большим числом различных форм поведения и обучения, факт избирательного влияния на них 6-ОДА имеет большое значение для успешного проведения исследований в этой области (Медвинская, 1997; Semenova, 1987).

Впервые 6-ОДА был обнаружен и выделен в 1959 году при изучении ферментативного превращения дофамина в норадреналин в гомогенизированных тканях (Senoh et al., 1959). Показано, что он является одним из естественных метаболитов дофамина (Мецлер, 1980) и может синтезироваться эндогенно из дофамина в стриатуме. В случае развития метаболических нарушений синтез 6-ОДА способен усиливаться до потенциально токсических концентраций, например, в случае изменения активности цитохром P-450-редуктазы, локализованной в КА-ергических нейронах мозга крыс и обезьян (Haglund, 1984). Кроме того, некоторые фармакологические вещества также потенциируют его образование, в частности, метиламфетамин (Seiden, Vosmer, 1984; Schmidt, Lovenberg, 1985; Commins et al., 1987).

Эффективно захватывается и накапливается 6-ОДА, в основном, теми нейронами, которые обладают механизмом мембранного транспорта для катехо л аминов, что объясняет специфичность действия 6-ОДА на КА-эргичные нейроны. Этот нейротоксин обладает низким окислительно-восстановительным потенциалом и очень легко подвергается неэнзиматическому окислению - свойство, с которым связывается цитотоксическое действие 6-ОДА (Sacha, Gonsson, 1973). Весьма важным свойством 6-ОДА является также длительность его действия на КА-эргические нейроны, которая намного превышает таковую всех известных препаратов аналогичного действия. Системное введение 6-ОДА взрослым животным вызывает длительное снижение уровня содержания норадреналина в различных тканях животных кроме мозга, так как этот препарат не проходит через гематоэнцефалический барьер (Laverty et al., 1965).

В случае применения адекватных доз 6-ОДА разрушения захватывают только нейроны КА-эргических систем мозга (Hokfett, Ungerstedt, 1973; Sievers et al., 1980). Максимальный эффект 6-ОДА проявляется при введении этого препарата в первые сутки после рождения. Введение 6-ОДА 7-дневным крысятам оказывается уже неэффективным (Singh, De Champlain, 1972) , что, по-видимому, объясняется созреванием гематоэнцефалического барьера (Angeletti, 1971; Sachs, Jonsson, 1973). В биохимических исследованиях обнаружено выраженное снижение уровня содержания НА в неокортексе в случае введения препарата в первые пять дней постнатального онтогенеза и незначительное снижение уровня содержания НА (около 15%) в случае введения 6-ОДА на 11-15 сутки после рождения (Kostrzewa, Garey, 1977).

Степень снижения уровня содержания НА и ДА в различных структурах мозга находится в зависимости от дозы вводимого препарата и времени, прошедшего с момента введения (Туровский, 1985). При этом отмечена более высокая чувствительность к 6-ОДА НА-эргических нейронов по сравнению с ДА-эргическими. 6-ОДА, введенный в мозговые желудочки, уже через 2 часа вызывает снижение НА во многих областях мозга (Laverty, Taylor, 1970). Внутрижелудочковое введение 5 и 50мкг 6-ОДА снижает уровень содержания НА в целом мозге на 30% и 50% соответственно (Uretsky, Iversen, 1969), в то время как уровень содержания дофамина остается неизменным (Iversen, Uretsky, 1971).

Поструктурный анализ уровня содержания норадреналина в мозге животных в разные сроки после неонатального введения 6-ОДА показал, что максимальное снижение было в неокортексе (Jonsson, Sachs, 1975; Tassin et al., 1975; Thierry et al., 1975).

У животных, получавших 6-ОДА, наблюдается повышение раздражительности и реактивности к внешним стимулам. Такие животные сильнее контрольных реагируют на обдувание спины воздухом, прикосновение к усам стеклянной палочки, взятие их на руки. Реакция на эти раздражители выражается паническим прыжком, писком и агрессией (Singh, De Champlain, 1972; Vetulani et al., 1972; Herman et al., 1976).

Анализ поведения взрослых крыс с хронической депривацией КА-эргических систем, обусловленный введением 6-ОДА в первые сутки после рождения, показал, что у этих животных обнаружено понижение исследовательской активности, измеряемой числом пересеченных квадратов и числом вставания на задние лапки на фоне возросшего числа, так называемых, автономных реакций, то есть временем вылизывания, грызения и жевания как в ночное, так и в дневное время суток (Nyakas, Van Delft, 1975; Brittn et al., 1984; Luthman et al., 1989).

ЭНДОГЕННЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА РАЗЛИЧНЫЕ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА. ТИМУС, СТАРЕНИЕ, СТРЕСС

Известно, что нормальная работа организма обеспечивается слаженным взаимодействием нейро-эндокринной, иммунологической, гемопоэтической и других систем организма. Каждая из этих систем имеет свой предпочтительный ареал и особенности, но в свете достижений современной биологии и медицины с каждым годом все труднее определить границы между ними. Например, иммунная и гемопоэтическая система тесно связаны, поскольку имеют единое происхождение от общих поливалентных стволовых клеток, к тому же цитокины играют существенную роль в регуляции гемопоэза (Dexter, 1982; Dorshkind, 1990; Kittler et al, 1992; Sutherland et al., 1993; Hauser, 1998). Обе системы играют ключевую роль в защите организма, предупреждении развития опухолей и возникновении ответа на инфекционные агенты (Абелев, 1996; Акмаев, 1997; Лолор, 2000; Lipschitz, 1987; Goya, 1999). Вместе с тем, с возрастом основной гемопоэз у животных и у человека или не изменяется, или изменяется минимально (Lipschitz, 1987). Периферические лимфоидные органы, такие как селезенка и лимфоузлы, с возрастом не претерпевают серьезных изменений в размерах, не происходит значительных поражений костного мозга, продукция стволовых клеток, как правило, хорошо сохранена в старом возрасте, хотя и имеются данные о слабых изменениях скорости их репликации (Фрейдлин, 1997; Harrison et. al., 1978). Другие авторы, подтверждая минимальные изменения в гемопоэзе, говорят о снижении активности костного мозга с возрастом (Донцов и др., 2002).

На сегодня не вызывают сомнения объективные данные, свидетельствующие о значительной возрастной инволюции тимуса (Makinodan, Kay, 1980; Lipschitz, 1987; Miller, 1991; Anisimov et. al., 1993; Смирнов, Фрейдлин, 2002). Соответственно, снижается и продукция Т-лимфоцитов. Самая высокая продукция Т-лимфоцитов сохраняется до двух лет, а затем начинается ее падение. Возрастная инволюция тимуса происходит не только у человека. У мыши, например, к 24-месячному возрасту, продукция Т-клеток составляет 0,7% от уровня продукции этих клеток новорожденными особями. К этому возрасту у мыши происходит почти полная редукция тимуса: теряется и структура органа, и его функция (Фрейдлин, 1997). Сходные данные получены на крысах. При подсчете количества тимоцитов в вилочковой железе у 3-х и 20-месячных животных, оказалось, что их у старых крыс более чем в 25 раз меньше, чем у молодых. Считается, что инволюция тимуса, начинающаяся при половом созревании, является главным возрастным изменением иммунной системы. Такая инволюция состоит в прогрессивной потере клеточности тимуса с истощением лимфоидного пула клеток в зонах коры и кистозными изменениями эпителиальных клеток. Тимоциты являются источником различных пептидов, вовлекаемых в дифференцирующиеся лимфоидные клетки (Т-клетки) из более молодых лимфоидных клеток. Выход дифференцированных Т-клеток снижается с увеличением возраста (Globerson et al., 1990). Прогрессивно снижаются синтез и секреция полипептидных гормонов тимуса, таких как тимозин, тимопоэтин и тимулин. Показано, что некоторые иммуномодуляторы, в частности, те же пептидные препараты тимуса, могут восстанавливать компетентность иммунных клеток в стареющем организме и увеличивать продолжительность жизни животных (Лабунец и др., 1997; Морозов, Хавинсон, 1996; Морозов, Хавинсон, 1997; Anisimov et al., 1982; Anisimov et al., 1998).

Кроме того, с возрастом учащаются случаи различных инфекционных заболеваний, аутоиммунных процессов и опухолей. Возможно, это частично обусловлено возрастными дефектами иммунной системы. Связь столь широкого круга связанных с возрастом патологических процессов с дефектами иммунной системы привела даже к появлению предположения, что старение иммунной системы может ограничивать продолжительность жизни (Walford, 1969).

В то время как общее количество Т-клеток в периферической крови в старости заметно не изменяется, наблюдаются четкие различия в относительном количестве подтипов Т-клеток (Lipschitz, 1987; Thompson et al., 1987). Количество незрелых лимфоцитов Т-предшественников увеличивается с возрастом, так же как и процент частично активированных Т-лимфоцитов, несущих маркеры незрелого фенотипа тимуса. Имеют место относительное увеличение цитотоксических супрессорных Т-клеток и уменьшение количества хелперов/индукторов Т-клеток (Lipschitz, 1987; Thompson et al., 1987). Функциональные дефекты клеточно-опосредованного иммунитета коррелируют с уменьшением популяции хелперов/индукторов (Lipschitz, 1987). Клетки, полученные от старых людей или старых лабораторных животных, менее способны к ответу на аллогенные лимфоциты, фитогемаглютинин, конканавалин А и растворимый антиген. Лимфоциты от более старых мышей обладают меньшей способностью вызывать реакции отторжения, чем те, которые получены от более молодых особей тех же инбредных линий (Thompson et al., 1987). Половина здоровых людей в возрасте старше 50 лет страдает кожной гиперчувствительностью (Дильман, 1987, Lipschitz, 1987).

Как уже говорилось, система иммунитета функционирует в тесной и четко координированной взаимосвязи с нервной и эндокринной системами (Абрамов, 1988; Першин, 1994; Акмаев, 1997; Акмаев, Гриневич, 2001; Акмаев, 2003). Многочисленные исследования предоставляют доказательства, что эти системы взаимодействуют между собой в поддержании гомеостаза организма. Роль тимуса, как одного из центральных органов иммунитета, не подвергается сомнению. Вместе с тем, тимус - это и эндокринный орган, в котором синтезируется ряд биологически активных веществ пептидной природы. Многочисленные исследования свидетельствуют о влиянии различных факторов тимуса на нейроэндокринные функции. Пятая фракция тимозина в культуре нормальных и опухолевых клеток гипофиза повышает секрецию АКТГ и бета-эндорфина, продукцию пролактина и гормона роста. Тимозин-бета и 5-я фракция тимозина in vitro стимулируют секрецию гипоталамусом гонадотропин-рилизинг-факторов с последующей стимуляцией продукции лютинизирующего и фоликулостимулирующего гормонов гипофизом (Millington, Buckingam, 1992). Длительное введение 5-й фракции тимозина обезьянам приводит к повышению активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (Milenkovic et al., 1992; Корнева, 1993). Удаление тимуса приводит к дегрануляции соматотропных клеток гипофиза, снижению функции коры надпочечников и половых желез (Чеснокова и др., 1984). У мышей, тимэктомированных в неонатальном периоде, наблюдаются нарушения нейроэндокринных функций (Labunets, 1996; Кудинов, Хромяк, 1997). Не менее значимо и влияние нейроэндокринных факторов на функцию тимуса. Активность тимических эпителиальных клеток может модулироваться гипоталамо-гипофизарной областью. У детей и взрослых с дефицитом гормона роста снижено содержание в периферической крови тимулина, лечение соматотропным гормоном восстанавливает уровень тимического фактора (Mocchegiani et al., 1996). Гипофизэктомия снижает концентрацию в организме гормонов тимуса. Введение экспериментальным животным гипофизарных гормонов препятствует снижению эндокринной функции вилочковой железы (Чеснокова и др., 1984). Инъекции гормона роста старым собакам восстанавливают уровень тимулина до показателей, свойственных молодым животным. Введение пролактин- и гормон роста-секретирующих клеток старым крысам также способно восстановить атрофированный тимус до уровня молодых. Гормоны коры надпочечников (глюкокортикоиды) обладают тимиколитической активностью. Широко распространена точка зрения о том, что надпочечник и половые железы находятся в антагонистических взаимоотношениях с тимусом. Вместе с тем, удаление тимуса приводит к снижению функциональной активности адреналовых и половых желез. Следовательно, взаимоотношения между указанными органами гораздо более сложны. (Лабунец и др., 1997; Бутенко, 1998). Еще больше вопросов вызывают взаимоотношения между иммунной и нейроэндокринной системами при старении. Учитывая тот факт, что с возрастом происходит выраженная деградация вилочковой железы, можно полагать, что в процессе старения это вызывает существенные изменения не только в системе иммунитета, но и в регуляции нейроэндокринного гомеостаза (Goya, 1999). Большинство исследователей считают, что поскольку тимус у старых животных находится в состоянии атрофии, тимэктомию производить нецелесообразно (Goya R.G. et al., 1987). Однако, как показали исследования, у старых животных удаление тимуса привело к существенному снижению массы надпочечника и резкому падению уровня кортикостерона в крови (Butenko et al., 1999). Кроме того, было установлено, что при старении наблюдается резкое снижение внутрисистемных регуляторных связей, выражающееся в уменьшении взаимного влияния тимуса на периферические лимфоидные органы и в обратном направлении, снижение взаимодействия между периферическими лимфоидными органами - селезенкой, лимфоузлами, Пейеровыми фолликулами (Кудинов, 1994; Бутенко 1998; Бутенко 1998а). Исходя из приведенных данных, можно сделать вывод, что одна из задач диссертационной работы, связанная с экспериментами по трансплантологической компенсации последствий возрастной инволюции тимуса, имеет важное значение для понимания межсистемных отношений в организме.

Но работам по трансплантационной модуляции возрастной и стрессорной инволюции тимуса предшествовали эксперименты по исследованию значимости социальных конфликтов и их влиянию на вил очковую железу.

При интенсивном использовании территории животные образуют группы, члены которых связаны отношениями доминирования - подчинения (Шилов, 1976; Корыстов и др., 2003). Эту систему взаимоотношений принято называть иерархической. Формирование такой группы и изменение в ее структуре происходит за счет агрессивных взаимодействий, устанавливающих или изменяющих структуру доминирования - подчинения. При этом животные испытывают социальный стресс, обусловленный взаимодействием друг с другом. Социальный стресс является причиной различных заболеваний животных и может приводить даже к их гибели (Шилов, 1976; Машкин и др., 1990). Иерархическая организация групп характерна не только для разных видов животных, но и для человека. У человека социальный стресс также считается одной из основных причин нервных расстройств, сердечнососудистых, онкологических и других заболеваний (Эверли, Розенфельд, 1985; Корыстов, 1997; Garrity et al., 1977; Ader et al., 1990, 2003; Корыстов и др., 2003). Очевидна необходимость экспериментального изучения социального стресса, его влияния на организм и способов предотвращения или ослабления последствий стресса. Лабораторные исследования социального стресса выполнялись, в основном, на модели из двух мышей при их регулярных кратковременных контактах (Кудрявцева, 1999). В этих работах установлено, что результаты конфликтного взаимодействия не одинаковы для победителя и побежденного. Однако эта искусственная модель не отражает всех социальных взаимодействий, возникающих в больших группах животных. Отмечается, что психофизиологическая структура взаимодействий в большой группе животных изучена мало из-за отсутствия модели группового поведения с определенными показателями оценки. Предложенный коммуникационный аппарат позволил проводить исследование поведения в группах путем прямого наблюдения и обнаружить ряд закономерностей при формировании групп (Пошивалов, 1977, 1986). Однако этот метод очень трудоемкий и несет в себе элементы субъективности, например, зависит от квалификации и сосредоточенности наблюдателя. Некоторые авторы для снижения трудоемкости метода ограничиваются тремя наблюдениями в сутки по 15-20 минут (Осадчук, Науменко, 1981; Машкин и др., 1990). К сожалению, очевидно, что ограничение длительности наблюдения снижает точность метода, поскольку конфликт может произойти не в те 15-20 минут, в течение которых ведется регистрация. В связи с этим мы разработали новый метод долговременной регистрации социального стресса, который, при необходимости позволяет автоматически регистрировать конфликты в больших группах мышей круглые сутки.

САХАРНЫЙ ДИАБЕТ, ОСЛОЖНЕНИЯ, АСПЕКТЫ КОНСЕРВАТИВНОЙ ТЕРАПИИ

По данным ВОЗ в мире насчитывается более 170 млн. больных диабетом. Экспертная оценка распространенности сахарного диабета позволяет считать, что к 2010 г. в мире будет уже более 230 млн. больных. Удвоение количества больных этим недугом происходит каждые 10-15 лет (Балаболкин , 2000; Amos A. et al., 1997; King et al., 1998).

Диабет - слово греческое и означает "сифон" или " протекать". Использование этого слова для обозначения заболевания, которое протекает с большим употреблением воды и быстрым ее выведением из организма, принадлежит греческому врачу Аретерису Каппадокийскому (138-81 гг. до н.э).

Первое клиническое описание заболевания проведено египетскими врачами за 1500 лет до н.э. Сахарный диабет был известен в Индии, Китае, Древней Греции и Италии. В работе индийского врача Сусрата (400 лет до н.э.) приведено не только клиническое описание болезни, но и ее различные клинические формы. На основании вкуса мочи Томас Уиллис (1674) разделил диабет на сахарный (diabetes mellitus) и несахарный, безвкусный (diabetes insipidus). М.Добсон (1776) установил, что сыворотка крови и моча больных сахарным диабетом содержит сахар. На этом основании М.Добсон однозначно указал, что сахарный диабет является системным заболеванием организма, а не первичной почечной болезнью, как считалось до этого (Балаболкин, 1998, 2000).

В Российской Федерации по данным обращаемости в 1997 г. насчитывалось 1952410 больных сахарным диабетом. В соответствии с данными отдела медицинской статистики и информатики Минздрава РФ на 01.01.2003 г. по обращаемости в России насчитывается уже 2182408 больных. Однако истинная заболеваемость сахарным диабетом, как показывают проведенные эпидемиологические исследования (Дедов, и др., 1998; Дедов, 1998), должна составлять около 6-8 млн. человек. Эти данные базируются на основе проведенных эпидемиологических исследований в Москве, Санкт-Петербурге, Новосибирске и других городах Российской Федерации.

Большая социальная значимость сахарного диабета состоит в том, что он приводит к ранней инвалидизации и летальности в связи с поздними сосудистыми осложнениями диабета, в числе которых -микроангиопатии (ретинопатия и нефропатия) макроангиопатии (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей), невропатии. Сахарный диабет - очень частая причина слепоты, смерти от уремии, велик риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. На фоне сахарного диабета летальность таких больных увеличивается в 2-3 раза. Риск развития ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда возрастает более чем в 2 раза, патологии почек -в 17 раз, гангрены нижних конечностей - в 20 раз гипертонической болезни - более чем в 3 раза (Мазовецкий, Беликов, 1987; Ефимов, 1988; Жуковский, 1989; Балаболкин, 1989, 2000).

Сахарный диабет является тяжелым бременем для здравоохранения. Так, Rubin и соавт. (1994) указывают, что в 1992г. все расходы на здравоохранение США составили 720,5 млрд. долларов, из которых на сахарный диабет пришлось 105,2млрд. или 14,6%. О социальной значимости сахарного диабета свидетельствует постоянное увеличение расходов, связанных с этим заболеванием. В

ЬгАЬЛИОТЕк'А

1984 г. в США эти расходы составляли 14 млрд., в 1987 г. - 20,4 млрд., а в 1992г. - уже 105,2 млрд. долларов. В 1992 г. расходы на одного больного без диабета составили в год 2604 долларов, а на 1 больного диабетом 9493, при этом на 1 больного диабетом с тяжелым течением сахарного диабета - 11 157 долларов.

Как следует из данных литературы, слепота, ампутация конечностей, почечная недостаточность, поражения сердечно сосудистой системы, нейропатии и другие патологии в существенно большей степени выражены у больных диабетом, чем среди населения в целом. Но наиболее тревожны факты о том, что только 50% больных сахарным диабетом типа 1 доживают до 50 лет. Остальные погибают преимущественно от терминальной почечной недостаточности в возрасте от 20 до 40-50 лет (Дедов и др., 1992; Нестеров, 1997; Clare et al., 1995).

Сахарный диабет типа 1 - это болезнь, вызванная разрушением р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в большинстве случаев аутоиммунного генеза. Аутоиммунная реакция против (3-клеток может индуцироваться у лиц с генетической предрасположенностью, обусловленной несколькими генами, в том числе - генами области HLA на коротком плече 6-й хромосомы, под воздействием экзогенных факторов (вирусные инфекции, токсические вещества). Когда медленно и постепенно развивающийся диабет приводит к гибели 80-95% инсулинпродуцирующих клеток, возникает абсолютный дефицит инсулина, приводящий к тяжелым метаболическим нарушениям. Лечение таких пациентов требует назначения пожизненной инсулинотерапии (Касаткина, 1996; Lavin и др., 1996).

На сегодняшний день, как уже говорилось, главная причина высокой смертности пациентов с сахарным диабетом типа 1 - это поздние осложнения, такие как диабетическая микроангиопатия (ретинопатия, нефропатия, нейропатия) и макроангиопатия (атеросклероз). Развитие осложнений обусловлено хронической гипергликемией и сопутствующими метаболическими нарушениями (Дедов, 1996; Балаболкин и др., 1999).

К сожалению, достижение и поддержание постоянной нормогликемии оказывается довольно сложной задачей, и в подавляющем большинстве случаев результаты лечения оставляют желать лучшего. В серии работ последних лет показано, что в нашей стране в поликлинических условиях не более 15% больных компенсированы в достаточной мере, в то время как остальная часть находится в стадии субкомпенсации или декомпенсации. При этом, несмотря на относительно хорошее самочувствие и отсутствие выраженных клинических признаков декомпенсации, показатели углеводного обмена оказываются неудовлетворительными (Касаткина, 1996). По результатам исследования Эндокринологического научного центра (ЭНЦ) РАМН в 1995 году среди популяции детей с сахарным диабетом в Москве были удовлетворительно компенсированы только 18% пациентов (Петеркова, с соавт., 1997).

По данным международного аудита детской диабетологической службы 1997 года в Московской, Тульской, Тамбовской областях и Саутгемптоне (Великобритания) объективные показатели свидетельствуют о худшем качестве компенсации больных с сахарным диабетом в России и о наличии многочисленных осложнений основного заболевания (Betts, Logatchev, Volkov. с соавт., 1998).

Патогенетической терапией сахарного диабета типа 1 является экзогенный инсулин. Однако заместительная терапия инсулином не позволяет восстановить функцию [3-клеток. Частичное восстановление возможно после клинической манифестации заболевания (Щербачева и др., 1989; Дорошенко и др., 2001), но продолжающийся процесс деструкции (3-клеток приводит к полному переходу на заместительную терапию экзогенным инсулином. При этом известно, что какое-то время при уже текущем аутоиммунном процессе сохраняется нормальная секреция инсулина (Ziegler et al., 1987). Терапия даже высокоочищенными препаратами монокомпонентного человеческого инсулина, используемыми в последние годы, не позволяет избежать специфических осложнений диабета и добиться полной компенсации всех видов обмена (Фромен, 1985; Дорошенко и др. 2001; Зак и др. 2001; Podolsky et al., 1984; Andreani, 1984). В связи с этим большое значение в мире в последнее время приобретают исследования в области трансплантационных способов лечения сахарного диабета, но им педшествовали исследования и разработки по различным моделям экспериментальных эндокринопатий.

АЛЛОКСАНОВЫЙ ДИАБЕТ

В 1943 году было показано, что введение аллоксана животным вызывает состояние, сходное с сахарным диабетом у людей, с тех пор интерес к этому химическому соединению не ослабевает (Dunn et al., 1943). Это объясняется не только тем, что аллоксановый диабет является достаточно часто используемой моделью диабета, но также и наличием сведений о присутствии эндогенного аллоксана в крови человека (Николаева и др., 1986; Tipson, Ruben, 1945; Cooperstein, 1982).

Содержание аллоксана у людей, собак и крыс составляет 0,15* 0,25 мг%. После введения глюкозы наблюдается его увеличение; с этим, возможно, связано повреждение островковых клеток после внутривенного введения большого количества глюкозы (Sobotka, Luisado-Opper, 1954). Вероятно, что глюкозный тест хотя и является необходимым, но несет в себе некоторую опасность спровоцировать ухудшение состояния человека, находящегося в стадии преддиабета.

Аллоксан впервые получен в 1838 году (Wohler, 1838). Продукт распада мочевой кислоты, он представляет собой белое кристаллическое вещество, розовеющее на воздухе. Растворим в воде, эфире, спирте (Баранов и др., 1983; Lenzen, 1988; и др.). При внутривенном введении диабетогенные дозы для аллоксана составляют (в мг/кг): для обезьян - 100-150, собак - 50-100, кроликов -ф 150-200, крыс - 50-75; при внутрибрюшинном введении - 150-200 для крыс, 350-400 для мышей (Баранов и др., 1983; 1988; Басмаджян и др., 1987; Царенко и др., 1987).

После введения аллоксана наступают значительные гистологические изменения в поджелудочной железе животных и существенные метаболические отклонения в самых различных органах и тканях (Баранов, 1973; Boquist, 1977; и др.). При аллоксановом диабете серьезно страдают обменные процессы, сахарообразование превалирует над скоростью окисления глюкозы и синтеза из нее гликогена, что приводит к быстрому падению содержания депонированного гликогена в печени (Сагидова, 1979; Лебкова, 1980; и др.). Снижение скорости гликолиза и пентозофосфатного пути превращения глюкозы приводит к дефициту * образования макроэргических соединений. (Сидоренко, 1981;

Тырышкина и др., 1986; Третьяк и др., 1988; и др.). У животных с аллоксановым диабетом нарушен переход углеводов в жиры. С помощью радиоиммунологических методов было установлено, что у крыс превращение глюкозы в жирные кислоты составляло лишь 5% по сравнению с уровнем этого процесса у здоровых животных (Manchester, 1987). Снижается содержание всех фракций гликолипидов в тканях мозга, сердца, селезенки поджелудочной железы, скелетных мышц (Исаев и др., 1983). В периферических нервах при аллоксановом диабете отмечается демиелинизация и дегенерация аксонов (Прихожан, 1981; Eliason, 1969; и др.). В надпочечниках при этом на фоне дистрофических изменений клеток снижается концентрация адреналина, наблюдается дефицит тирозина и аскорбиновой кислоты (Каримова и др., 1986; Wexler, 1980).

К изменениям, обусловленным микроангиопатией при хроническом аллоксановом диабете, следует отнести и ретинопатию. У крыс она наступает примерно через 3 месяц с момента возникновения диабета. При длительно текущих формах описаны помутнение хрусталика и развитие катаракты (Пучковская, 1977; Collins, Corder, 1977).

Здесь представлен перечень наиболее характерных патологических изменений в организме при аллоксановом диабете, которые на фоне гипергликемии, глюкозурии, полифагии, полидипсии и полиурии являются характерными признаками сахарного диабета.

На сегодняшний день существует несколько гипотез диабетогенного действия аллоксана: от его реакции с немногочисленными сульфгидрильными группами или блокирования цинка в островках Лангерганса до образования гидроксильных радикалов, повреждающих ДНК, и инактивации глюкокиназы панкреатических островков (Лапин и др., 1973; Блох и др., 1987; Lozarow, 1954; Hammerstrom et al., 1967; Schmidt, 1967; Tomita, Watanabe, 1976; Boguist, 1977; Nelson, Boguist, 1981; Jamamoto, 1981;

Lenzen, Panten, 1988). Вместе с тем, несмотря на значительное количество работ, подтверждающих избирательное поражение аллоксаном ß-клеток, на сегодня не существует общепринятой теории, всесторонне объясняющей этот феномен, и для выяснения тонких механизмов действия аллоксана на островковый аппарат поджелудочной железы требуются дальнейшие исследования в этой области.

ОРГАННАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

В настоящее время аллотрансплантация поджелудочной железы на сосудистых связях является одним из методов, позволяющим стабилизировать уровень гликемии у пациентов с сахарным диабетом типа 1 и достигнуть достаточно стойкой инсулинонезависимости. Первая в мире успешная органная пересадка поджелудочной железы была проведена 17 декабря 1966г в США (Kelly W.D., 1967). К середине 1997 года в мире было выполнено почти 20000 трансплантаций поджелудочной железы в различных модификациях (Pirson, 1997, Поташов с соавт., 1997; и др.). Как правило, используется поджелудочная железа трупов, но части пациентам проводится пересадка сегмента поджелудочной железы от живых доноров родственников (Тарабарко и др., 1990).

Органная трансплантация поджелудочной железы в большинстве случаев осуществляется на поздних стадиях заболевания, когда у пациента имеются осложнения сахарного диабета. Несмотря на это, наблюдается некоторая положительная динамика в течение сосудистых диабетических осложнений после успешной пересадки поджелудочной железы (Ramsay, 1988;

Sutherland, 1988; Abendroth, 1989; Jorneskog, 1990; Kennedy, 1990; Fioretto, 1993; и др.).

Чаще всего проводят сочетанную пересадку поджелудочной железы и почки при диабетической нефропатии с почечной недостаточностью (Bilous с соавт., 1989; Morel, 1991; Remuzzi, 1994; Aragona, 2002; Sutherland, 1993; и др.).

По данным ведущих трансплантационных центров США и Западной Европы при удачном выполнении трансплантации поджелудочной железы обеспечивается стойкая нормализация гликемии и инсулинонезависимость в течение первого года после операции почти у 70% больных инсулинзависимым сахарным диабетом при одновременной пересадке им почки, а годичная выживаемость самих реципиентов достигает 90% (Robertson, Sutherland, 1992). В отдельных случаях при симультантной пересадке поджелудочной железы и почки ремиссия сахарного диабета типа 1 достигает 10-летнего срока (Dieterle et al., 2002).

Показанием для органной пересадки поджелудочной железы так же может быть наличие поздних диабетических осложнений без уремии. Увеличение доли необратимых органических изменений при длительном течении сахарного диабета 1 типа ставит вопрос о выполнении подобных операций на более ранних стадиях заболевания (Altman с соавт., 1989; Sutherland, 1981; 1993).

Несмотря на успехи в области органной трансплантации поджелудочной железы при сахарном диабете, нельзя забывать, что аллотрансплантация поджелудочной железы является сложным хирургическим вмешательством с высокой степенью риска для пациента (Блюмкин, 1984; Selles, 1987; Молитвословов, 1991; Молитвословов, 1996; и др.). После операции пациенты должны постоянно получать иммуносупрессивную терапию, которая может оказывать тяжелые побочные эффекты, в том числе на углеводный обмен. Так, многие иммуносупрессивные препараты обладают выраженной диабетогенностью: угнетают секрецию инсулина (FK 506, циклоспорин А) или индуцируют инсулинрезистентность (преднизолон). Кроме того, они обладают токсическим действием на печень и другие органы (Руке, 1990; и др.).

КЛЕТОЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ИНСУЛИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ ТКАНИ ПРИ САХАРНОМ

ДИАБЕТЕ

В последние годы получает все большее развитие клеточная трансплантация как наиболее физиологичный вариант заместительной терапии при различных формах эндокринной недостаточности (Комисаренко с соавт., 1991; Ricordi с соавт., 1991; Кирпатовский, 2003; Скалецкий, 2001; Слюсарев, 2002; и др.). Наиболее заметный прогресс достигнут в области пересадки островковых клеток поджелудочной железы при инсулинзависимом сахарном диабете (Shapiro с соавт., 2000; Benhamou с соавт., 2001; Federlin с соавт., 2001; и др.).

Клеточная трансплантация имеет ряд преимуществ по сравнению с пересадкой целых органов. Пересадка клеток является обычно достаточно несложной хирургической процедурой. При этом возможно проведение контроля на стерильность и предварительной обработки ткани перед трансплантацией с целью снижения иммуногенности донорского материала, что позволяет не применять иммуносупрессию или значительно уменьшить ее интенсивность. (Шумаков и др., 2001; 2002; и др.).

Свободная трансплантация островковой ткани поджелудочной железы развивается по двум основным направлениям:

• трансплантация островков, выделенных из поджелудочной железы взрослых доноров;

• трансплантация островковых клеток поджелудочной железы плодов и новорожденных.

Получение жизнеспособных изолированных островков поджелудочной железы в достаточном количестве является необходимым требованием для обеспечения успешного лечения сахарного диабета с помощью трансплантации панкреатических островков. Островки Лангерганса как анатомически и функционально обособленные образования четко выражены в поджелудочной железе взрослых особей, тогда как в плодной поджелудочной железе помимо островков Лангерганса эндокринные клетки обнаруживаются в эпителиальной выстилке мелких выводных протоков и в составе так называемых ацино-инсулярных комплексов. Поэтому, как правило, для изоляции панкреатических островков используется поджелудочная железа взрослых доноров, в которой островки составляют 1-2% всей массы поджелудочной железы. Разработаны различные методы изоляции островков (Lacy et al., 1967) В 1988г Ricordi с соавт. разработали автоматический метод изоляции островков из поджелудочной железы человека. С помощью этого метода удается выделить до 800 тыс. островков из одной донорской поджелудочной железы (Ricordi et al., 1988, 1991).

По результатам около 300 операций по аллотрансплантации островков, выделенных автоматическим методом, инсулинонезависимость была достигнута в течение недели у 12,4%, до года - у 8,2%, большинство этих пациентов перенесли до или после трансплантации островков пересадку почки и получали иммуносупрессивную терапию (Navarro, 1990; Groth, 1995; Liu, 2000; и др.). О большей продолжительности инсулинонезависимости сообщает Hering (1997). В течение года после трансплантации 9 из 12 пациентов не нуждались во введении инсулина, но при этом использовались иммуносупрессанты.

Следует отметить, что в последние годы снизилась активность применения этого метода трансплантационного лечения сахарного диабета. Прежде всего, это обусловлено тем, что пересадка островков поджелудочной железы взрослых доноров требует обязательного применения иммуносупрессантов, которые способны вызвать неблагоприятные эффекты у реципиентов, страдающих сахарным диабетом. Кроме того, как показал клинический опыт, для выделения необходимого количества островков надо в большинстве случаев использовать более чем одну донорскую поджелудочную железу, что зачастую очень сложно обеспечить. Значительный прогресс в клинической аллотрансплантации островков наметился благодаря работе канадских ученых, которые пересаживали большое количество выделенных островков (9-11,5 тыс. на килограмм веса) в воротную вену. При этом они, используя наименее токсичные иммуносупрессанты, исключили глюкокортикоиды. Авторам удалось добиться самых значительных на сегодняшний день результатов. В одной статье говорится о 7 пациентах, которые сохраняли инсулиннезависимость от 4,4 до 14,9 месяцев (ср. 11,9), а в другой уже о 12, инсулиннезависимость у которых сохранялась от 6,5 до 17,4 месяцев (ср. 10,2). При этом гипергликемия была снижена в 2 раза по сравнению с дотрансплантационным периодом. К сожалению, отсутствие необходимого количества донорского материала не позволяет широко использовать данную методику (Shapiro с соавт., 2000; Ryan et.al, 2001).

Значительно большее применение получило другое направление свободной пересадки островковой ткани - трансплантация островковых клеток поджелудочной железы плодов и новорожденных (Federlin с соавт., 1991; и др.).

Известно, что плодная поджелудочная железа более богата эндокринной тканью и обладает потенциально меньшей иммуногенностью по сравнению с поджелудочной железой взрослых (Fine, 1989). По данным Ferner (1974) доля эндокринной ткани в поджелудочной железе 4-5месячных плодов человека составляет более 30% общей массы органа. Это несравнимо выше содержания эндокринной ткани в поджелудочной железе взрослого человека, составляющего лишь 1%. В поджелудочной железе новорожденных доля эндокринной ткани также велика - около 10%. В то же время экзокринная ткань плодной поджелудочной железы развита слабо.

В настоящее время широкое распространение получила трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека и животных. Основной механизм культивирования заключается в селективном выживании эндокринных клеток и снижении иммуногенности ткани. Культивирование in vivo оказывает цитотоксический эффект на ацинарную ткань: экзокринные клетки быстро дегенерируют в течение первых нескольких суток культивирования (Блюмкин, Скалецкий, 1984; Thomson, 1983; и др). Важнейшим является иммуномодуляционное значение культивирования островковой ткани in vitro (Lacy с соавт., 1982; 1993). Это выражается в снижении иммуногенности ткани в результате элиминации «лейкоцитов-пассажиров» - носителей поверхностных антигенов II класса, играющих роль в инициации иммунного конфликта и направляющих агрессию Т-клеток против островкового трансплантата, так же в процессе культивирования происходит изменение поверхностных свойств островковых клеток и снижается иммуногенность самих культивируемых клеток (Скалецкий, 2002; Federlin с соавт., 1984; Tze, Tai, 1988; Lacy с соавт., 1982; Nishino с соавт., 1984; и др.). Кроме того, целесообразность предварительного культивирования обусловлена и тем, что в процессе инкубации панкреатической ткани можно убедиться в стерильности донорского материала, морфологической сохранности островковых клеток, их функциональной активности.

Большое количество работ по культивированию плодной поджелудочной железы человека и животных выполнено начиная с 1976г. в лаборатории культур тканей НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (НИИТиИО). Сотрудниками лаборатории были разработаны различные способы получения культур из поджелудочной железы плодов (Блюмкин, 1984; 1985).

Безусловно, наибольший эффект наблюдается при аллотрансплантации, и наиболее подходящим донором для трансплантации в клинике является поджелудочная железа человека. Однако в связи с трудностями получения такого материала, а также рядом этических и юридических проблем встает вопрос об использовании в качестве донора некоторых животных. Для получения культур ксеногенных островковых клеток используется поджелудочная железа плодов свиньи и крупного рогатого скота, а также новорожденных поросят. (Комиссаренко с соавт., 1983; Шумаков с соавт., 1984; Скалецкий, 1988; и др.).

В последние годы в НИИТиИО стали выполняться клинические трансплантации культур островковых клеток, полученных из поджелудочной железы кролика (Скалецкий с соавт., 1990). Одним из аргументов в пользу применения этого донорского материала была близость строения инсулина человека и кролика, а также возможность широкого разведения этих животных. В результате проведенных исследований был разработан оригинальный метод получения очищенных культур островковых клеток свободных от балластных элементов и состоящих на 70-80% из жизнеспособных ß -клеток. При этом ß -клетки обладают высокой инсулинпродуцирующей активностью и имеют сниженную иммуногенность (Скалецкий Н. Н. с соавт., 1990, 1994, 2001, 2002; и др.).

Успешная трансплантация островковых клеток приводит к частичной, реже к полной компенсации нарушений углеводного обмена, выражающейся в нормализации гликемии. Имеются немногочисленные сообщения об единичных случаях отмены инсулина у пациентов с сахарным диабетом на непродолжительное время. (Federlin et al., 1991; Hering et ah, 1997; Hu Yuang Feng et ah, 1988; 1989; Scharp et ah, 1990) Как говорилось выше, канадским ученым из Эдмонтона удалость добиться несколько лучших результатов, но их достижения на сегодня повторить довольно сложно (Shapiro et ah, 2000; Ryan et.ah, 2001).

Результаты исследований по трансплантации островковых клеток в эксперименте и клинике свидетельствуют о том, что основным эффектом пересадок на данный момент является предотвращение или торможение прогрессирования поздних диабетических осложнений, в наибольшей степени - диабетической полинейропатии, ранних стадий нефропатии и ретинопатии. Другой существенный эффект пересадки - стабилизация течения лабильного сахарного диабета 1 типа, что особенно актуально у детей и подростков (Gray с соавт., 1976; Шумаков, 1981, 1984, 1995; Блюкмин, 1984; Federlin с соавт., 1984; Словеснова, 1989; Бойко, 1987; Шумаков, Скалецкий, 2001). Указанные положительные сдвиги носят продолжительный характер и прослеживаются от нескольких недель до года и более.

В первое время перечисленные эффекты объясняли секрецией инсулина ß-клетками трансплантата. Позже было высказано другое предположение, согласно которому под влиянием трансплантации происходит мобилизация пролиферативного пула эпителиальных клеток собственной железы реципиента и дифференцировка клеток-предшественников в ß-клетки через стадию npe-ß-клеток, которые секретируют преимущественно проинсулин и не являются объектами аутоиммунной атаки. Так Righardt с соавт. (1984) наблюдали частичное восстановление собственной поджелудочной железы в виде гиперплазии и гипертрофии ß-клеток у крыс с интрапортальной трансплантацией островков поджелудочной железы изогенного донора. Согласно их мнению, частичное восстановление ß-клеток собственной поджелудочной железы происходит за счет плюропатентных эпителиальных клеток выводных протоков экзокринного отдела поджелудочной железы реципиента. Hahn с соавт. (1986) показали, что через 17 недель после трансплантации островков поджелудочной железы в селезенку крыс WLK со стрептозотоциновым диабетом в собственной поджелудочной железе у этих животных наблюдается достоверное увеличение объема островков и ß-клеток в них. После пересадки панкреатической ткани наблюдается преимущественное количественное увеличение эндокринных клеток по отношению к экзокринным, отмечается рост и дифференциацие островковых клеток в течение посттрансплантационного периода (Скалецкий, 1987; Жарков, 1989; Шумаков с соавт., 1988; Brown с соавт., 1984). Показано так же, что даже на отдаленных сроках после внутрибрюшинной трансплантации (более 6 месяцев) ткани неонатальной поджелудочной железы крысам с аллоксановым диабетом происходит увеличение количества ß-клеток, и повышенное разрастание протоковых частей собственной поджелудочной железы реципиентов, что позволяет обеспечить компенсацию углеводного обмена (Хлыстова с соавт.; 2003).

Последние годы группа шведских ученых, возглавляемая J. Wahren, активно разрабатывает проблему физиологической роли С-пептида, его синтеза и возможности применения в клинике с целью проведения патогенетической профилактики и терапии сосудистых осложнений сахарного диабета. Известно, что С-пептид отщепляется от молекулы проинсулина в момент освобождения активной формы инсулина. Ранее он считался биологически неактивным. Однако в течение последних лет ряд исследователей продемонстрировали, что использование С-пептида коротким курсом (1-3 кратно с интервалом в 60 минут) уменьшают гломерулярную гиперфункцию, увеличивают утилизацию глюкозы. Более длительная терапия в течение 1-3 месяцев приводит к полному купированию проявлений диабетической нефропатии (Wahren с соавт., 1994, 1996, 1998). С этой точки зрения имплантацию островковых клеток следует рассматривать как длительное введение инсулина и С-пептида в организм при диабете.

В качестве трансплантационного материала для лечения сахарного диабета ведутся также экспериментальные исследования по применению клеток инсулиномы - опухоли поджелудочной железы из ß-клеток, продуцирующих инсулин. (Reintgen, Feldman, 1980; Akimaru, Stuhlmiller, Seigier, 1981; Ohgawara с соавт., 1995; Dombrowski, Klingmuller, Pfeifer, 1998; и др.). Но в данном случае пока не разрешенной проблемой является контроль за делением онкогенных клеток.

Развитие генно-инженерных технологий, при которых возможно помещение фрагментов ДНК в клетку и присвоение им новых необходимых свойств, позволило проводить разработку генно-инженерных инсулинпродуцирующих клеток. Так Efrat с соавт. (1999) получили линейные ß-клетки от трансгенных мышей, которые вырабатывают инсулин, адекватно отвечая на физиологические стимулы. Репликация клеток тщательно контролируется как в культуре, так in vivo.

Среди методов, способствующих защите ß-клеток от иммунной агрессии, в последнее время применяется макро- и микроинкапсуляция островковых клеток в полунепроницаемые мембраны. Сообщают о трансплантации инкапсулированных человеческих островковых клеток пациенту с сахарным диабетом 1 типа с полной отменой инсулина. Данный метод изучается при ксенотрансплантации островковых клеток свиньи (Elliot, 1996). Для инкапсуляции используется сырье, добываемое из бурых водорослей - альгинат.

Положительные результаты были получены также организацией Neocrin, использующей для микроинкапсуляции островковых клеток свиней полиэтиленгликоль-полимер (Scharp с соавт., 1990). На сегодняшний день данные методики пока не имеют широкого применения при лечении сахарного диабета типа 1. Тем не менее, экспериментальные и клинические исследования по алло- и ксенотрансплантации с применением инкапсуляции продолжаются (Lanza, Ecker с соавт., 1999).

На сегодня в мире накоплен большой опыт алло- и ксенотрансплантации инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы (Шумаков, Блюмкин, Скалецкий, 1995; Шумаков, Скалецкий, 1995; Krishnamurthi et al., 2001; Odorico et al., 2002; Larsen et al., 2002;

Robertson et al., 2003; Nikolaidis et al., 2003). Значительная часть этих работ проводилась и проводится в научных учреждениях нашей страны (Беникова, Турчин, 1991; Бойко, 1991; Гаврилова, 1992; Голибин и др., 1992; Мальцев и др., 1994; Малик, 1990; Павловский, Бойко, 1990; Поташов и др., 1987; Розенталь и др., 1988; Шумаков и др., 1985; Шумаков и др., 1995; Шумаков, Скалецкий, 1995; Malik et al., 1990; Rosental et al., 1988; Rosental et al., 1989; Shumakov et al., 1987; Shumakov, 1989; Shumakov, Bljumkin, 1990; Shumakov et al., 1987; Slovesnova et al., 1987). Общей чертой этих работ является использование в качестве трансплантационного материала культур, получаемых из поджелудочной железы внутриутробных плодов человека, свиньи, крупного рогатого скота, а также некоторых животных в периоде новорожденное™ (поросята, кролики). Близкие по содержанию работы примерно в то же время проводились в Китае, Югославии, Венгрии (Басмаджян и др., 1987; Блюмкин и др., 1992; Djodjevic et al., 1987; Djodjevic et al., 1990; Farkas et al., 1983; Hu Y.E., 1992; Hu Y.E., 1988). В Италии, США, a также в ФРГ и Швеции в последние годы в практике стали использовать островки Лангерганса как анатомические отдельности, изолированные из поджелудочной железы взрослых трупных доноров методом Ricordi (Bretzel, Ricordi, 1997; Ricordi et al., 1989; Ricordi et al., 1992; Scharp, Lacy, Me Cullough, 1990; Scharp, Lacy, Santiago et al., 1990; Scharp et al., 1991; Secchi et al., 1997; Tzakis et al., 1990). Интрапортальная аллотрансплантация десятков и сотен тысяч таких островков сопровождалась химической иммуносупрессией. В большинстве случаев пересадка сочеталась с аллотрансплантацией почки трупного донора (в связи с претерминальной или терминальной стадией диабетической нефропатии у реципиента). В то же время чаще всего при алло- и ксенотрансплантации культур островковых клеток, осуществлявшихся в России, а также в Китае, Венгрии и Югославии, иммуносупрессию не применяли и, что особенно важно подчеркнуть, трансплантацию проводили больным, не находившимся на поздних этапах диабетической нефропатии. Основанием же для отказа от иммуносупрессии было то, что при достаточно длительном культивировании in vitro в микрофрагментах плодной донорской поджелудочной железы погибают так называемые лейкоциты-пассажиры (дендритные клетки, гистиоциты, эндотелий островковых капилляров), что приводит к снижению общей антигенности донорского материала (Блюмкин и др., 1992; Скалецкий, 1987, 1994; Шумаков и др., 1995; Bowen, Lafferty, 1980; Lacy et al., 1982; Lafferty, Prowse, 1984; Simeonovich et al., 1980; Snell, 1957). В условиях культивирования погибают и элиминируются также ацинарные клетки экзокринных отделов донорской плодной поджелудочной железы.

Вместе с тем, без иммуносупрессии трансплантаты, хотя и выживают благодаря перечисленным процедурам дольше, все же неизменно отторгаются, если не производить дорогостоящей процедуры подбора ткани донора и реципиента на иммунносовместимость. В России существуют все условия для того, чтобы создать широкую сеть банков данных донорских тканей и клеток, что могло бы весьма значительно повысить эффективность трансплантации любых тканей и органов.

РОЛЬ СПОСОБА И МЕСТА АЛЛО- И КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ ПЕРЕСАЖЕННЫХ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК

Из раздела о трансплантации тканей в область ЦНС и переднюю камеру глаза стало понятно, что эти области предпочтительны для экспериментальной трансплантации тканей самой различной природы. В этом разделе речь, в основном, пойдет о трансплантации инсулинпродуцитующих тканей в области, не являющиеся относительно иммунепривилегированными. По законам иммунологии ткани, пересаженные в такие области, не могут функционировать достаточно долго без иммуннодепрессивных препаратов. Вместе с тем экспериментальные данные показывают эффект трансплантации существенно более длительный, чем должен действовать сам трансплантат вследствие его отторжения.

Безусловно, выживание и функционирование пересаженных трансплантатов инсулинпродуцирующих клеток зависит от многих факторов, таких как качество, количество, предварительная обработка, видовая принадлежность островковых клеток и другие условия. Не последнюю роль играет место трансплантации. Учитывая физиологические механизмы секреции инсулина (Аметов, Кондратьева, 1995), который в первую очередь поступает в воротную вену и проявляет свой основной эффект в печени, наиболее оптимальным выглядит пересадка инсулинпродуцирующих клеток в область, анатомически близкую расположению самой поджелудочной железы (Бойко, Павловский, 1988; Евсеев, 1993). Действительно широкое применение получила, прежде всего, трансплантация в печень, а также в пульпу селезенки, внутрибрюшинно и под капсулу почки. Так по данным Kaufman с соавт. для достижения длительной нормогликемии у собак с экспериментальным диабетом необходимо трансплантировать в печень 4400, в селезенку 4650, а под капсулу почки до 5500 островков на килограмм веса животного. При этом после внутрипеченочного введения нормогликемия наступала раньше, чем после внутриселезеночного (через 1 и 7 сутки, соответственно) (Kaufman et al., 1990). С другой стороны эксперименты Hiller с соавторами на крысах показали прогрессивное ухудшение эндокринной функции островков при трансплантации в воротную вену, по сравнению с пересадкой под капсулу почки (Hiller et al., 1991; Kaufman et al., 1990).

В плане оценки влияния места трансплантации показательны многочисленные эксперименты по изотрансплантации островков, когда отсутствует ярко выраженная иммунная реакция. Результаты изотрансплантации островков в печень и селезенку оказались примерно одинаковыми и показали длительное развитие ремиссии диабета иногда в течение всей жизни реципиента (Federlin, Bretzel, 1984; Rajotte, 1983; Finch с соавт., 1977; Sandler, Andersson, 1981). В сравнительных экспериментах по введению изогенных островковых клеток в другие места, например, подкожно, внутримышечно и внутривенно, в некоторых работах было показано преимущество печени и селезенки для пересадки (Комисаренко с соавт., 1980; и др.). Dorn с соавт. (1977) показали, что при внутрибрюшинном введении изотрансплантатов островковых клеток рецидив диабетического статуса возникал через 3 месяца, в то время как при пересадке в воротную вену печени нормогликемия сохранялась до конца срока наблюдения 1 год.

Положительные эффекты были получены при изотрансплантации взвеси ткани и культур поджелудочной железы плодов и новорожденных в печень, в пульпу селезенки, под капсулу почки и внутрибрюшинно (Herge с соавт., 1976; Feldman с соавт., 1980; Brown с соавт., 1984; и др.). При этом важным является тот факт, что через 2-3 недели после изотрансплантации плодной поджелудочной железы под капсулу почки крысам с аллоксановым диабетом экзокринные клетки в месте трансплантации отсутствуют и преобладают крупные островки Ларгенганса, общая масса которых увеличивается за это время более чем в 20 раз (Herge с соавт., 1976). Brown с соавторами в экспериментах на крысах и карликовых свиньях также обнаружили, что в течение 10-14 дней экзокринные клетки плодной поджелудочной железы в основном элиминируются, а в месте трансплантации (почка) остаются лишь островковые клетки (Brown с соавт., 1984).

Безусловно, в экспериментах по аллотрансплантации островковых клеток наблюдалось более выраженное и быстрое развитие реакции отторжения, особенно при пересадках измельченной ткани поджелудочной железы или изолированных островков. Отторжение происходит, как правило, уже в течение нескольких дней (Комиссаренко, 1980; Reemtsma, 1981; Hegre, 1976; Sutherland, 1980; Tze, Tai, 1983), или 2-3 недель (Bowen, Lafferty, 1980; Lippert, 1983; Powell, 1987). Данная реакция отмечается при использовании различных мест пересадки - в мышцы, подкожно, в печень, селезенку, под капсулу почки, внутрибрюшинно. Garvey с соавторами (1980) проводили аллотрансплантацию ткани свежевыделенной поджелудочной железы крысам со стрептозотоциновым диабетом под капсулу почки. При гистологическом исследовании места пересадки они наблюдали моноклональную инфильтрацию уже через 3 дня, деструкция островковых клеток начиналась с 6 дня, к 14-дневному сроку трансплантаты были почти полностью замещены фиброзной тканью, а к месяцу на месте трансплантации оставалась лишь рубцовая ткань.

При ксенотрансплантации ткани поджелудочной железы период нормогликемии продолжается обычно еще более короткий промежуток времени по сравнению с длительностью данного эффекта при аллогенной пересадке той же ткани, а морфологические признаки реакции отторжения трансплантата существенно не отличаются от таковых при аллотрансплантации островковой ткани поджелудочной железы или же ее сегмента (Nakajima с соавт., 1982; David с соавт., 1988).

Как показывает опыт сотрудников НИИТиИО, разработка в эксперименте и внедрение в клиническую практику трансплантации культур островковых клеток аллогенного и ксеногенного происхождения, в процессе обработки которых показано снижение иммуногенности трансплантата, позволила применять в качестве места для пересадки не только печень и селезенку, но и мышцы передней брюшной стенки без иммуносупрессии. Так, например, у крыс со стабильным и тяжелым сахарным диабетом, индуцированным аллоксаном после ксенотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека наступала стойкая ремиссия диабетического статуса до окончания срока эксперимента (20 недель) (Скалецкий и др., 1983, 1985, 1987).

Результаты клинических исследований показывают эффект трансплантации культур островковых клеток в прямую мышцу живота от нескольких месяцев до года. Положительное влияние пересадки проявляется в виде снижения потребности экзогенного инсулина, стабилизации лабильного течения диабета и торможения прогрессирования поздних осложнений диабета. Полной ремиссии сахарного диабета с отменой введения инсулина не происходит (Скалецкий, Онищненко, 2001).

В исследовании, посвященном сравнительной оценке внутримышечных и внутрипортальных пересадок культур островковых клеток в клинике, показано, что при внутрипеченочной пересадке прикрепленной фракции культур островковых клеток поджелудочной железы отмечался более выраженный метаболический эффект, чем при внутримышечной пересадке флотирующей фракции культур (Евсеев, 1993).

О механизмах таких явлений как достаточно длительная трансплантологическая компенсация патологии с помощью трансплантации ткани в области организма, не являющиеся относительно иммунопривилегированными, речь пойдет в разделе «Заключение».

СЕМЕННИК КАК МЕСТО ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК

Известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами толерантности к трансплантату. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти области без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза (Жарков, Ярыгин, 1988, 1989; Брагин, 1983, 1986; Tze, Tai, 1988) и тестикул, а также тимус, матрикс волосяного фолликула, плаценту (Кирпатовский с соавт., 1994, 2003; Bellgrau, 1995; Duke с соавт., 1999; Rossini с соавт., 1999). Имеются работы по доказательству иммунопривилегированности семенника при трансплантации в него клеток и тканей. Шведскими учеными, которые пересаживали ауто- и аллотиреоидную ткань в семенник и подкожно у баранов и приматов, были получены хорошие результаты по приживлению ткани в семеннике. Алло- и аутотрансплантат при пересадке в семенник функционировал от 28 дней до 6 недель, в 5 из 6 случаев, пересадка аллотрансплантата под кожу была неэффективной (Setchell, Granholm, Ritzen, 1995).

Положительные результаты по трансплантации эндокринных клеток различной природы в мужскую половую железу были получены при пересадке в семенник аллогенных и ксеногенных андрогенпродуцирующих Лейдиговских клеток, клеток гипофиза и ядер переднего гипоталамуса (Кирпатовский, Дендеберов, 1994; Кирпатовский, Каитова, Лысенко, 1999; Пахомова, 2003; Каитова, 2003). В других исследованиях Ferguson, Scothorne (1977) пересаживали изолированные микродиссекцией аллотрансплантаты панкреатических островков морским свинкам в тестикул без применения иммуносупрессии. Время выживания островков достигало 11 недель.

Иммунопривилегированность тестикула объясняли вначале иммуносупрессорным эффектом тестостерона и (или) прогестерона, а также более низкой температурой в мошонке (Whitmore, Giftes, 1979; и др.). Однако, в 1984г Selawry и Wittington получили данные, что при аллотрансплантации культивированных островков крысам (10 островков на грамм веса) интрапортально, под капсулу почки и в ортотопически расположенный семенник не было достигнуто нормогликемии. Пересадка того же количества островков в интраабдоминально расположенный семенник вызывала аглюкозурию на протяжении более 50 дней (Selawry, Wittington, 1984). Более длительное благополучное выживание культивированных неонатальных ß-клеток свиньи в интраабдоминально помещенных тестикулах собак (срок наблюдения 100 дней) демонстрируют эксперименты Gores с соавторами (2003).

Полученные результаты по лучшему выживанию изолированных островковых клеток в интраабдоминально расположенном семеннике, когда в нем сохраняются преимущественно клетки Сертоли, поставили вопрос о том, что именно эти клетки играют решающую роль для приживления трансплантата в мужской гонаде.

Последующие исследования показали, что клетки Сертоли вырабатывают фактор, в дальнейшем названный Fas-ligand (CD 95 Ligand), оказывающий местный иммуносупрессорный эффект. Selawry, Kotb, Herrod, Lu (1991) исследовали влияние культуры клеток Сертоли in vivo на лимфоциты. Опыты показали, что вещество, вырабатываемое клетками Сертоли, ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов и снижает продукцию ими интерлейкина-2 (IL-2). В дальнейшем было выяснено, что фактор, вырабатываемый клетками Сертоли, Fas-ligand, относится к семейству факторов некроза опухолей (TNF). Fas-L (CD 95) и его рецептор Fas-R принимают участие в иммунном ответе. Fas-R имеется на неактивных Т и В-лимфоцитах в небольшом количестве, при их активации в иммунном конфликте количество Fas-R возрастает и при соединении Fas-L с Fas-R активированные Т-лимфоциты подвергаются апоптозу (Takeda, Goton с соавт., 1998; Chen, Sun, Duke с соавт., 1999). Fas-L действует на активированные Т-лимфоциты и макрофаги, вызывает их гибель, когда на них функционирует Fas-R (Nagata, Golstein, 1995). В экспериментах было выяснено, что Fas-L действует на активные эффекторные клетки иммунной системы (Duke с соавт., 1999). Эффекты Fas-ligand обусловленной иммунопротекции были отмечены так же в передней камере глаза (Lau et al, 1996; Chen, Sun, Nabel, 1998; и др.).

Так же было показано, что тестикулярная ткань и клетки Сертоли экспрессируют и другие факторы, способствующие иммуносупрессии - фактор-ß (TGF-ß), инсулино-подобный фактор-1 (IGF-1). (Allison с соавт., 1997; Kang с соавт., Schneider, Lin, 1997; и др.). Но в отличие от этих факторов в настоящее время наиболее широко исследован и продемонстрирован в экспериментах иммуносупрессивный эффект Fas-L.

Поскольку клетки Сертоли, вырабатывающие Fas-ligand, оказывают локальную иммуносупрессию для трансплантата (Bellgrau с соавт., 1995; Griffit, Brunner, 1995; Sanberg с соавт., 1996; Lau, Yu, Fontana с соавт., 1996; Ducke, 1999; и др.), возможно их использовать при совместной пересадке с основным трансплантатом для создания так называемых искусственных иммунопривилегированных зон. Это подтверждается рядом исследований по успешной аллотрансплантации в мозг крыс клеток striatum и клеток Сертоли без применения циклоспорина A (Sanberg с соавт., 1996; Saporta с соавт., 1997). Имеются данные о способности клеток Сертоли защищать от иммунного конфликта паратиреоидную ткань (Whitmore с соавт., 1979). Совместная пересадка аллогенных клеток почки и клеток Сертоли под ренальную капсулу у крыс пролонгирует выживание трансплантата (Zhao с соавт., 2002). Одновременная криоконсервация островковых клеток неонатальных поросят и клеток Сертоли качественно и количественно улучшает состояние ß-клеток (Selawry, Wang, Allouch, 1996).

Показано купирование гипергликемии у крыс с экспериментальным диабетом после трансплантации островковых клеток совместно с клетками Сертоли под капсулу почки. В эксперименте на крысах при трансплантации ß-клеток с 75% клетками Сертоли нормогликемия сохранялась более 95 дней. Если же клетки Сертоли составляли в трансплантате 50%, он функционировал только 10 дней. Вместе с тем, если диабетическим мышам Balb/c пересаживали только островковые клетки крыс Lewis; клетки Сертоли (Balb/c) совместно с островковыми клетками крыс Lewis; либо мышиную антилимфоцитарную сыворотку совместно с островковые клетками, выживание трансплантатов получали, соответственно, 10.9±0.8,

14.0±1.2 и 12.2+0.7 дней. И только совместное использование островковых клеток, клеток Сертоли и антилимфоцитарной сыворотки позволило увеличить время выживания трансплантатов до 64,9+8,1 дней (Selawry, Cameron, 1993; Dufour et al., 2003).

Takeda, Gotoh с соавторами (1998) получили достоверную пролонгацию выживания островков поджелудочной железы при их совместной трансплантации с Fas-ligand-экспрессирующей тканью семенника под капсулу почки у мышей со стрептозоциновым диабетом. Lau с соавт. (1996) экспрессировали Fas-L на миобластах и пересаживали их совместно с островковыми клетками под капсулу почки диабетическим мышам, что привело к увеличению продолжительности функционирования ß-клеток. Таким образом, трансплантация клеток Сертоли вместе с инсулинпродуцирующими клетками приводит к пролонгации их выживания без применения иммунной супрессии как при аллотрансплантации (Cai, Zhan, Не, 2001; Calafiore, Lucca, 2002; Kin с соавт., 2002), так и при пересадке ксеногенных ß-клеток (Dufour с соавт., 2003, 2003а).

Данные о наличии факторов естественной локальной иммуносупрессии в тестикуле заставляют по-новому оценить влияние места пересадки на функцию трансплантатов, в частности, островковых клеток и продолжить исследования возможности использования трансплантации инсулинпродуцирующих клеток в тестикулы для долговременной компенсации экспериментального диабета.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЖИВОТНЫЕ

В экспериментах использовали крыс-самцов породы Вистар и беспородных. Для операции отбирали животных одного возраста, чаще всего с начальной массой 200-230 г. Эмбриональный материал получали от половозрелых крыс-самок Вистар и беспородных. Кролики-самцы породы Шиншилла, используемые в экспериментах, имели начальный вес 2500-3000 г., самки-доноры - более 4500 г. Мыши SHK. Все животные выращивались в условиях вивария на стандартной диете. Эмбриональных цыплят, 1-месячных поросят и беременных свиноматок получали в специализированных хозяйствах Московской области. Длиннохвостые якутские суслики Citellus Undulatus привозились из экспедиции и затем содержались в специализированных помещениях с необходимым температурным режимом.

Всего в работе использовали более 4000 крыс, 30 кроликов «Шиншилла», 7 сусликов длиннохвостых якутских Citellus Undulatus, 360 мышей SHK, эмбриональных цыплят-21, 1-месячных поросят -2.

ПОЛУЧЕНИЕ КРЫС С НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

Новорожденным крысам в первые трое суток ежедневно вводили подкожно нейротоксин 6-оксидофамин («Sigma», США) 100мг/кг, в результате чего достигалось хроническое снижение уровня норадреналина в мозге (Jonsson et al., 1975, 1982; Семенова и др., 1983; Медвинская, 1997).

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ УЧАСТКОВ СИНЕГО ПЯТНА

Животных 6-месячного возраста с депривацией норадренергической системы оперировали в стерильных условиях в специально оборудованной операционной комнате. Для пересадки брали ткань 17-дневных эмбрионов. У зародышей, помещенных в раствор Игла, при комнатной температуре извлекали мозг. Ткань для трансплантации объемом около 1 мм иссекали из области синего пятна или из закладки гиппокампа. Последний был использован для контрольных опытов как структура, не содержащая норадренергических нейронов. Выделенный материал помещали в раствор Игла.

Крысам реципиентам под нембуталовым наркозом (40мг/кг, в/б) слева на черепе делали трепанационное отверстие диаметром 2-3 мм, центр которого располагался над фронтальной корой, и отсасывали небольшой участок коры. Далее первой группе животных посредством шприца со стеклянным наконечником вводили участки синего пятна. Один трансплантат вводили под углом через боковую стенку ямки в паренхиму коры контрлатерального полушария, другой помещали на дно ямки. Второй группе таким же образом вводили участки ткани гиппокампа. Последний был использован для контрольных опытов как структура, не содержащая норадренергических нейронов. Через 4, 6, 7, 9мес. - тестирование по методу открытого поля. Третьей группе (ложнооперированные) вводили эквивалентный раствор Игла (Брагин, Куликов и др., 1984, 1984а).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НОРАДРЕНАЛИНА В СТРУКТУРАХ МОЗГА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Исследования проводили по известной методике (Коган, Нечаев, 1979) с нашими модификациями (КиНкоу е1 а1., 1986; 8ешепоуа е1 а1., 1987). Измерение проводили на флюориметре марки «Регсеп-Е1тег МШ7 44В».

ИЗУЧЕНИЕ ОРИЕНТИРОВОЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

Установка для изучения у крыс ориентировочно-исследовательской двигательной активности представляет собой квадратную площадку размером 1 м2, расчерченную на 100 одинаковых квадратов и окруженную барьером высотой 40 см. 16 центральных квадратов отделены пограничной линией от остальных квадратов и условно приняты за центр поля. Поле освещали электрической лампочкой мощностью 200 вт, расположенной на высоте 1 м от его центра.

Ориентировочно-исследовательскую двигательную активность крыс тестировали по методике открытого поля. Эксперименты проводили в утренние часы (с 9 до 11) в звукоизолированной камере с рассеянным освещением. Длительность эксперимента составляла 3 минуты при ярком освещении поля. При этом учитывали число пересеченных квадратов (показатель горизонтальной исследовательской активности) и число вставания на задние лапки (показатель вертикальной исследовательской активности) (8етепоуа е1 а1., 1987; Медвинская, 1997).

РЕГИСТРАЦИЯ КОНФЛИКТОВ В ГРУППАХ ЖИВОТНЫХ

Для того чтобы регистрировать число конфликтов в большой выборке животных, нами была разработана система, которая состояла из пластикового отражателя, покрывающей почти всю площадь клетки с животными и встроенного в нее диктофона с автоматическим включением на звук и выключением после его прекращения. Систему включали в 1 бчасов и снимали в 10 часов следующего дня - всего 18 часов регистрации. Связано это с тем, что мыши являются сумеречными животными, и пик их активности приходится на вечернее и ночное время. Предварительно проведенные эксперименты подтвердили, что в период с 10 до 1 бчасов они существенно менее активны.

Микрофон был настроен на включение при интенсивной двигательной активности во время драк и погонь и писков, сопровождающих драки. В общем, интенсивность конфликта в группе отражалась уже метражом магнитофонной ленты. Для более детальной регистрации пленку прослушивали и подсчитывали число кратковременных и длительных конфликтов. Число конфликтов делили на длительность регистрации, таким образом, получали число конфликтов на клетку в час.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТИМУСА И КОСТНОГО МОЗГА В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА ЖИВОТНЫХ

Трансплантируемую ткань тимуса выделяли из крыс самцов * "\Vistar" массой 120 г. Костный мозг выделяли из бедренной кости.

В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса либо костного

1 з мозга измельчали до размера примерно 1 мм .

Крысам-реципиентам на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина с тем, чтобы максимально раскрылся зрачок и уменьшилась площадь радужной оболочки. Эта манипуляция помогает избежать последующих повреждений богатой капиллярами структуры. Через 5 минут на глаз наносили по 1 капле 0,5%-раствора дикаина, что в еще большей степени снижало чувствительность глаза при операции. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом. В разрез длиной 1,5-2 мм очень медленно выдавливали трансплантируемые кусочки ткани объемом 3-5 мм3 и помещали их на радужную оболочку глаза как можно дальше от разреза.

Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете (Брагин, Куликов, 1983; Kulikov et al., 1986).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТИМОЦИТОВ У ЖИВОТНЫХ

После декапитации животным вскрывали грудную полость, извлекали тимус и помещали его в солевой раствор Хенкса без фенолового красного с глюкозой (5 ммоль/л) и антибиотиком (гентамицин, 10мкг/мл), содержащий 20 ммоль/л HEPES ("Serva", США) рН 7,2, температуры 37°С. Тимусы протирали через капроновый фильтр, однократно отмывали после центрифугирования (700 g, 5 мин) и ресуспендировали в растворе Хенкса или RPMI-1640 с о

Serva", США) до разной концентрации в интервале 10-10 клеток в 1мл. Концентрацию клеток определяли подсчетом в камере Горяева.

Клетки инкубировали либо в пластиковых чашках Петри, либо в ячейках 96-луночного плоскодонного планшета (Куликов и др., 2001).

ОБЛУЧЕНИЕ ЖИВОТНЫХ

Эксперименты по облучению проводили на гамма-установке биологического эксперимента в специальных контейнерах, куда помещали не более 5 животных одновременно. Облучение осуществляли у-лучами 60Со с мощностью дозы 1,5-1,6 Гр/мин в течение 2,5-5 минут при комнатной температуре (Kulikov et.al., 1998).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТИРОВАННОЙ ДНК

Фрагментацию ДНК определяли согласно методу (Ferotti et al., 1990). 1,5-10 клеток осаждали центрифугированием (Юмин, 700g), ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфферного раствора, содержащего 5мм Tris-HCl, 20 mM EDTA, 0,5% Triton Х-100, рН 8,0. Лизис проводили в течение 15 мин на льду. Затем образцы центрифугировали при 13000 g в течение 25 минут для разделения высокомолекулярного хроматина (осадок) и фрагментированной ДНК (супернатант). Осадки ресуспендировали в 1мл буфера, содержащего ЮмМ Tris-HCl и 1мМ EDTA, рН 8,0. Осадки и супернатанты окрашивались дифениламином (Burton, 1956) для определения содержания ДНК. Количество ДНК определяли флуориметрическим методом по поглощению растворов при длине волны 600 мм, использовали спектрофлуориметр "Perkin Elmer". Количество фрагментированной ДНК определяли как отношение содержания ДНК в супернатанте к суммарному содержанию ДНК в супернатанте и осадке.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА

Экспериментальный диабет у крыс получали с помощью аллоксана фирм "Chemapol" «ДИАэМ», «Sigma», обладающего избирательным токсическим действием на /?-клетки островков Лангерганса. Внутрибрюшинно вводили 5%-раствор токсина, из расчета 200-280 мг сухого вещества на 1кг массы тела.

У кроликов экспериментальный диабет вызывали внутривенным введением 170 мг/кг 5%-раствора аллоксана.

ПОЛУЧЕНИЕ АБОРТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Абортивный материал (10-12 нед.) получали из гинекологического отделения Пущинской городской больницы. Аборты проводились кюретой N4, N6 и абортцангом под общим наркозом, без использования вакуум-экскохлеатора. Сразу же после операции материал помещали в охлажденную стерильную среду Игла. Время от забора материала до трансплантации плодной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза диабетических животных составляло от 20 до 40 минут.

ТЕСТИРОВАНИЕ УРОВНЯ ГЛЮКОЗЫ В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

На первых этапах работы концентрацию глюкозу определяли орто-толуидиновым методом. Орто-толуидиновый реактив представляет собой 8%-раствор орто-толуидина в 80% уксусной кислоте, стабилизированный тиомочевиной и щавелевой кислотой. Глюкоза при нагревании с орто-толуидиновым реактивом дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна ее концентрации в растворе (Меньшиков, 1973). Позже глюкозу сыворотки крови определяли глюкозооксидазным методом (Kadish et al., 1979) на автоанализаторе фирмы "Beckman" США. Для рутинных экспериментов при подготовке животных для трансплантации, когда требуется большое количество измерений, использовали диагностические полоски «Pentafan», «Labstix», «Uriskan» для определения глюкозы в моче, а также «Visidex 2», «Глюкохром Д», «Betachek» и др. для быстрого определения глюкозы в крови.

При проведении работ с интратестикулярной трансплантацией измерения гликемии проводились системой "Glucometer Elite®" с соответствующими тест-полосками (сенсорами), предоставленными фирмой Bayer (Германия). Диапазон измерения прибора составляет от 1,1 ммоль/л до 33,3 ммоль/л. При уровне сахара крови менее 1,1 ммоль/л дисплей глюкометр показывает "Lo", в случае гликемии более 33,3 ммоль/л - "Hi". Учитывая диапазон прибора, показание "Hi" условно принималось за 33,3 ммоль/л.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ, ТРАНСПЛАНТАТЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Инсулин в тканях определяли по известным методикам (Davoren, 1962; Orland, 1987) с нашими модификациями (Арбузова, Куликов, 1989, 1991). Образец ткани (трансплантат, собственную поджелудочную железу или эмбриональную поджелудочную железу) тщательно измельчали в гомогенизаторе, помещали в сосуд с охлажденным раствором А (375 мл абсолютного этанола и 7,5 мл концентрированной соляной кислоты) в соотношении 1 г ткани на 4 мл раствора. Экстракцию проводили в течение 48 часов при 4°С. Затем гомогенат центрифугировали 10 минут при 6000 q. Супернатант сохраняли, осадок ресуспендировали в растворе В (375 мл абсолютного этанола, 105 мл дистиллированной воды и 7,5 мл концентрированной соляной кислоты) в том же соотношении. Экстракцию проводили при 4°С в течение 24 часов, затем снова центрифугировали 10 минут при 6000 q. Объединенный после первой и второй стадии выделения супернатант разводили в зависимости от концентрации инсулина в 100-200 раз 0,1 М фосфатным буфером рН-7,4, содержащим 0,1%-бычьего сывороточного альбумина. Определение иммунореактивного инсулина в полученном растворе проводили с помощью стандартных наборов (125) I-insulin RIA KIT (Венгрия). Содержание иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сывортке крови измеряли радиоиммунным методом с помощью набора РИО-ИНС-ПГ-(125) I (Минск) или (125) I-insulin RIA KIT (Венгрия). В работе использовали гамма-счетчик "Nuclear-Chicago Ml 197" (США).

Определение иммунореактивного инсулина в крови, в собственной поджелудочной железе реципиента и в трансплантатах проводили в Эндокринологическом научном центре (Москва) совместно с к.м.н. М.И. Арбузовой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТРЕБЛЕНИЯ ВОДЫ

Животных помещали в клетки по 3-5 шт. По градуированным поилкам определяли количество потребляемой воды за сутки. Сопоставляя результат с общим весом животных в клетке, определяли каково среднее потребление воды на 100 г веса животного.

АЛЛО- И КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА КРЫС

Для трансплантации отбирали животных, у которых в течение 2-х и более недель гликемия была не менее 19,5 ммоль/л, а глюкозурия, как правило, превышала 2%. В большинстве случаев гликемия составляла 21-25 ммоль/л. Пересадку ткани проводили в стерильных условиях. Стерильность достигали за счет облучения специально оборудованной операционной комнаты ртутно-кварцевой лампой, а также обработкой операционного поля и инструментов этиловым спиртом непосредственно перед операцией.

В работе использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью, для чего предварительно за 17-18 дней попарно ссаживали самок и самцов на 6 часов. В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорожденных крысят.

В период подготовки к операции под нембуталовым наркозом проводили вскрытие самок-доноров по белой линии живота, извлекали зародыш, промывали в дистиллированной воде и спирте, переносили в стерильный раствор Игла. Поджелудочную железу выделяли у эмбрионов под стереомикроскопом МБС-9 . С хвостового конца железы отрезали 1-2 кусочка объемом 0,8-1 мм3, которые переносили в чашку Петри со стерильной средой Игла. Каждый последующий зародыш извлекали у донора только после того, как был отпрепарирован предыдущий, с тем, чтобы он как можно дольше находился в условиях оптимального температурного режима и естественного питания. Крысам-реципиентам с острым Я экспериментальным диабетом на глаз наносили по 1 капле 0,1%раствора атропина и 0,5%-раствора дикаина. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Разрез длиной 1,5-2 мм производили простерилизованным глазным скальпелем, либо, что оказалась более удобным, осколком бритвы, закрепленным в держателе. Трансплантаты общим объемом 3-4 мм с помощью описанного приспособления очень медленно выдавливали и помещали на радужную оболочку глаза как можно дальше от разреза. Позднее в качестве инструмента для трансплантации стали использовать модернизированную микропипетку с изменяющимся объемом от 5 до 25 мкл.

В случае ксенотрансплантации плодной железы человека или цыпленка объем пересаживаемого материала был также, в среднем, 34 мм3, в случае же пересадки поджелудочной железы 1-месячного поросенка несколько больше, до 6 мм3, что связано с меньшим количеством эндокринной ткани в их поджелудочной железе в сравнении с плодной поджелудочной железой. Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете (Брагин, Куликов, 1983; КиНкоу еХ а1, 1986).

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА КРОЛИКОВ

Методика трансплантации принципиально не отличалась от описанной выше, но объем трансплантируемой ткани в этом варианте составлял в среднем 20 мм3. Самку-донора брали с 24-26-дневной беременностью. Операции по извлечению плодов у самки-донора и трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза диабетических кроликов проводили под нембуталовым наркозом в стерильных условиях (Куликов, 2000).

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В БОКОВЫЕ ЖЕЛУДОЧКИ МОЗГА КРЫС

Животных-реципиентов под нембуталовым наркозом (45 мг/кг) скальпировали и фиксировали в стереотаксическом аппарате в соответствии с координатами атласа (Bares, Petron, 1967). Затем в кости черепа с помощью зубного бора делали отверстие диаметром 2 мм с координатами центра АР = +1, L = 0,5 мм. Осторожно без повреждения сосудов вырезали твердую оболочку мозга. Трансплантат поджелудочной железы (Э 17-18) объемом 2-3 мм3 вводили в левый боковой желудочек мозга с помощью туберкулинового шприца со стеклянным наконечником, прикрепленным к основанию иньекционной иглы. После забора ткани поджелудочной железы в туберкулиновый шприц его закрепляли на стереотаксисе, конец стеклянного наконечника погружали в область левого бокового желудочка мозга и трансплантат медленно вводили в мозг реципиента. Затем аккуратно вынимали наконечник и с помощью хирургического шелка послойно сшивали мягкие ткани. Животных содержали в стандартных условиях, иммунодепресантов не применяли.

Трансплантацию ткани плодной поджелудочной железы в боковые желудочки мозга крыс проводили совместно с д.б.н. А.Г. Брагиным (Брагин, Куликов с соавт., 1983).

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТКАНИ

Ткань фиксировался в растворе Боуэна в течение суток. Затем осуществлялась проводка по спиртам возрастающей концентрации с последующей заливкой ткани семенников в парафиновые блоки. Серийные парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм окрашивались гематоксилином и эозином (Меркулов, 1969).

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выявления инсулинпродуцирующих островковых клеток в пересаженном трансплантате использовали «сэндвич»-метод (Straus, 1982; Угрюмов, 1991). В этих целях депарафинированные срезы толщиной 6-7 мкм с помощью обычной нисходящей гистологической проводки доводили до забуференного физраствора. После блокирования эндогенной пероксидазы в течение 15 минут смесью абсолютного метанола с перекисью водорода на срезы в разведении 1:100 наслаивали моноклональные антитела против инсулина свиньи, перекрестно реагирующие с инсулином крысы. После этого срезы инкубировали во влажной камере при температуре 4°С в течение 16 часов. Затем трижды отмывали забуференным физраствором и наслаивали аффинные кроличьи антитела против иммуноглобулина мыши (1:20), меченые пероксидазой хрена (приготовлены в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии института морфологии человека РАМН). После 1-часовой инкубации при комнатной температуре под контролем глаза проводили проявление пероксидазы с помощью диаминобензидина, разведенного в 0,1%-перекиси водорода. Срезы заключались в канадский бальзам и изучались под световым микроскопом.

В результате получалась высокоселективная окраска в коричневый ^ цвет клеток, содержащих секреторные гранулы с инсулином (рклетки). Остальные клетки, входящие в состав ткани, не окрашивались и выглядели бесцветными. В некоторых случаях использовалась дополнительная подкраска гематоксилином для выявления ядер других клеток. Гистологические исследования проводили совместно с сотрудниками института морфологии человека

РАМН,

Рис. 1 .Ткань поджелудочной железы однодневных крысят при иммуногистохимическом исследовании.

1-крашеные в коричневый цвет островковые клетки, содержащие секреторные гранулы инсулина, 2-неокрашенные клетки ткани поджелудочной железы.

Обработка моноклональными антителами против инсулина «сэндвич»~методом. Об.40 , ок.10.

ПОДГОТОВКА МИКРОФРАГМЕНТОВ ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

Трансплантат подготавливался из ткани поджелудочной железы новорожденных крысят.

Рис. 2. Новорожденные крысята.

После вскрытия брюшной полости поджелудочная железа удалялась и помещалась в раствор Хэнкса, где производилось ее механическое измельчение до микрофрагментов 1-3 мм в диаметре при помощи микрохирургического пинцета и ножниц. Для одной пересадки использовалось 25-30 мкл микрофрагментов измельченной поджелудочной железы, взятой от 3-4 доноров. Для введения микрофрагментов под белочную оболочку семенника использовался дозатор «М1С1ШМАЫ»

Рис. 3. 1- микрофрагменты ткани неонатальной поджелудочной железы в питательной среде, 2- канюля дозатора « М1СЯ ОМА N», м икрофрагменты в канюле.

МИКРОХИРУРГИЧЕСКИЙ МЕТОД АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ МИКРОФРАГМЕНТОВ

ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПАРАВАЗАЛЬНУЮ КЛЕТЧАТОЧНУЮ

ЩЕЛЬ СЕМЕННИКА Для трансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник применялся метод, разработанный совместно с профессором И.Д. Кирпатовским, асп. Ю.И. Кистнер (кафедра оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН).

Рис. 5. Выведение семенника в операционную рану.

Операция проводилась под общей анестезией парами эфира. По средней линии живота выполнялся разрез длиной 2 см. Левый семенник выводился в рану. В бессосудистой зоне семенника производился прокол белочной оболочки. >

Рис. 6. Прокол белочной бессосудистой зоне. оболочки семенника в

МР

Рис. 7. Формирование кармана под белочной оболочкой с помощью микродилататора.

Строго под белочной оболочкой, поверх семенных канальцев, поочередно вводились микродилататоры различного диаметра, по ходу паравазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника, не проникая в паренхиму органа. В результате формируется искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев.

Затем в созданный карман паравазальной клетчаточной щели вводились микрофрагменты ткани поджелудочной железы объемом 25-30 мкл с помощью дозатора «MI CROM AN».

-' « ГТТ JT' т •щщщшщш

Рис 8. Введение трансплантата микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы с помощью дозатора «М1СКОМА№>

Рис 9. Ушивание белочной оболочки семенника после введения трансплантата

Рис.10. Семенник после аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы. /- трансплантат под белочной оболочкой;

2- узловой шов в месте прокола белочной оболочки;

3- придаток семенника.

К7

ОДНОСТОРОННЕЕ ПЕРЕСЕЧЕНИЕ СЕМЯВЫНОСЯЩЕГО » ПРОТОКА ИНТАКТНОГО СЕМЕННИКА ПОСЛЕ

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ МИКРОФРАГМЕНТОВ ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В

КОНТРЛАТЕРАЛЬНЫЙ СЕМЕННИК После аллотрансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник с целью проведения в дальнейшем биологического теста для определения фертильности животных у нелинейных крыс-самцов без диабета осуществлялось односторонняя перевязка и пересечение семенного протока интактного (правого) семенника. 5

Рис. 11. Перевязка семявыносящего протока интактного семенника.

J- семенник; 2~ семенной канатик;

3- придаток семенника; 4- сальник семенника; 5- rectum.

ТЕСТ НА ФЕРТИЛЬНОСТЬ

Для изучения фертильности нелинейных самцов-крыс после аллотрансплантации микрофрагментов ткани поджелудочной железы в левый семенник и пересечения семявыносящего протока правого семенника проводился биологический тест. Учитывая, что самки крыс нередко не допускают спаривания с больными, неполноценными самцами, что часто приводит к каннибализму, тест на фертильность проводился в группе животных без экспериментального сахарного диабета. Само по себе введение химического вещества аллоксана и период гипергликемии, проведение в данной серии двух операций даже при условии последующей компенсации диабета снижает шансы животного в выборе его самкой для спаривания. Было важно оценить влияние самой пересадки микрофрагментов неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника на фертильность крыс. Один самец подсаживался к 5 половозрелым самкам на 21, 42, 63 дни после трансплантации. На каждый срок по 5 самцов (всего 15). Оценивалось количество покрытых самок. (Западнюк с соавт., 1974).

Статистика

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Статистика. Для полученных величин проводился подсчет среднеквадратической ошибки. Различия средних величин по критерию Стъюдента признавалось достоверным при уровне значимости р<0,05.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Куликов, Александр Владимирович

VI. выводы

3. Разработан автоматизированный метод регистрации социального стресса в больших выборках мышей. Исследована динамика возрастной инволюции тимуса и изменения количества тимоцитов в вилочковой железе на разных сроках с начала социального конфликта. Показано увеличение с возрастом количества драк во вновь организованных иерархических сообществах.

4. Разработаны способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс. Показана возможность не только приостановки возрастной инволюции тимуса у животных разных возрастных групп, но и увеличения количества тимоцитов в вилочковой железе на отдаленных сроках после трансплантации.

5. Аллотрансплантация иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс после радиационного стресса (облучения в дозе 4 и 8 Гр) приводит к ускоренному восстановлению иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и значительному увеличению выживаемости после облучения в дозе 8 Гр. Через 1 месяц после облучения (8 Гр) в контрольной группе выжило только 2,9%, а в опытной после трансплантации тимуса -54,2% крыс.

6. Разработаны способы трансплантации фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза или боковые желудочки мозга, позволяющие добиться долговременной полной или частичной компенсации экспериментального диабета у животных.

7. Аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в передней камере глаза оперированных животных.

8. Аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани в переднюю камеру глаза или боковые желудочки мозга дает лучшие результаты, чем трансплантация ксеногенная, т.к. различные ее варианты позволяют компенсировать аллоксановый диабет у 70 -89% животных, в то время как разные варианты ксенотрансплантации дают полную или частичную компенсацию диабета в 55-76% случаев.

9. Выявлено, что интраокулярная аллотрансплантация поджелудочной железы приводит к нормализации потребления воды, массы животных, содержания глюкозы, инсулина, сывороточной ДНК в крови.

Ю.Разработан способ аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника при экспериментальном диабете.

Получена полная либо частичная нормализация исследованных физиологических и биохимических показателей - количество глюкозы, масса животных, потребление воды.

11.Показана полная сохранность фертильности у животных после трансплантации. В результате проведенного спаривания крыс на разных сроках после пересадки ткани поджелудочной железы в семенник с последующей перевязкой семявыносящего протока контралатерального интактного семенника все самки были оплодотворены. Это позволяет предположить возможность разработки метода для применения в клинической практике.

12. Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 4, 6, 9 недель после интратестикулярной пересадки ткани поджелудочной железы.

Автор выражает сердечную благодарность учителям, коллегам из ИТЭБ РАН и других институтов, с которыми проводились совместные исследования, друзьям за всестороннюю помощь в выполнении, написании и обсуждении работы.

VII. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГОБ - гемато-офтальмический барьер ГЭБ - гемато-энцефалический барьер ДА - дофамин

ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет

ИРИ - иммунореактивный инсулина

НА - норадреналин

ПКГ - передняя камера глаза

ЦНС - центральная нервная система б-ОДА-б-оксидофамин

ЭПЖ - эмбриональная поджелудочная железа ЭСД - экспериментальный сахарный диабет

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трансплантацию тканей проводили в относительно иммунопривелегированные участки организма - неокортекс, боковые желудочки мозга, переднюю камеру глаза, семенник. Особое строение гисто-гематических барьеров этих областей, в норме не пропускающих иммунокомпетентные клетки, позволяет пересаживать туда ткани без опасения за их быстрое отторжение. Интерес к трансплантации ткани в мозг и переднюю камеру глаза связан еще и с тем, что в этих структурах нет лимфатического протока, в результате чего отсутствует афферентное звено иммунной реакции. Активированные иммунные клетки, которые все же могут проникнуть в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Раз-Ь, экспрессированного в этих участках. Например, функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Раэ-Ь, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003;Choi et al., 2004).

В процессе экспериментальных исследований в качестве реципиентов использовали крыс и кроликов, а в качестве доноров фетального, эмбрионального и неонатального материала - птиц, крыс, сусликов, свиней. Было разработано несколько новых трансплантологических моделей, которые можно разделить на группы по месту трансплантации (неокортекс, боковые желудочки мозга, передняя камера глаза, семенник) и по экспериментальным патологиям, на компенсацию которых направлены эти модели (дефицит норадреналина в мозге и связанное с этим нарушение исследовательского поведения животных, недостаточность по Т-клеточному звену иммунологической системы и связанные с этим возрастные изменения, диабет и нарушения физиологических и биохимических показателей). Проведенные эксперименты показывают возможность долговременной полной или частичной трансплантологической компенсации нейрофизиологических, поведенческих, иммунологических, физиологических и биохимических показателей. В качестве сопутствующего метода для исследований стрессорной инволюции тимуса был разработан автоматизированный метод регистрации социального стресса в больших выборках животных.

Трансплантация мозговой ткани

Показано, что моноаминергические нейроны при их трансплантации в ЦНС дают достаточно длинные отростки (Bjorklund et al., 1979; Semenova et al., 1987). Вместе с тем необходимо учитывать, что все методы имплантации приводят к развитию глиального барьера между трансплантатом и тканью мозга реципиента. При одномоментной трансплантации, которую мы использовали в своей работе, могут развиваться проницаемые для растущих аксонов глиальные барьеры. При длительно отсроченной трансплантации формируется глиальный барьер, полностью блокирующий реципрокный рост волокон (Александрова, 1999).

О степени специфичности образуемых в трансплантатах синаптических связей существуют различные мнения. Одни исследователи обнаруживают высокую степень специфичности (Bjorklund, Stenevi, 1977; Lewis, Cotman, 1980; 1983;Mathews, 1985; Raisman et al., 1987; Fuji, 1993; Isacson, Deacon, 1997; Zhou et al., 1998). Другие считают возможным установление неспецифических связей и даже изменение химизма синаптической передачи (Hamori, 1980; Easter et al., 1985; Deller et al., 1995; Chevassus-An-Louis et al., 1998).

В нашем случае при трансплантации эмбрионального Locus coeruleus прорастающие из области неокортекса аксоны моноаминэргических нейронов восстанавливают нарушенные связи токсически поврежденного участка мозга. Кроме того, сам трансплантат выделяет недостающий норадреналин. Показано восстановление уровня норадреналина мозга и нарушенного исследовательского поведения животных при нейротоксинном разрушении норадренергической системы и последующей трансплантации в мозг эмбриональной ткани синего пятна. Вероятнее всего, по ходу аксона идет также диффузная нейропередача, которая теперь рассматривается как комплиментарный механизм к химической синаптической передаче (Отеллин, 1987; Саульская, 1997; Самойлов, Мокрушин, 1999; Bach-y-Rita, 1994; Mrzljak et al., 1995; Rocha, 1997; Kullmann, Asztely, 1998; Huang, 1998). В настоящее время считается общепризнанным, что функционирование мозговой ткани обеспечивается координированностью синаптических и несинаптических форм межклеточных взаимодействий (Журавлева, 1999).

Трансплантация иммунокомпетентных тканей

Роль тимуса, как одного из центральных органов иммунитета, не подвергается сомнению. Вместе с тем, тимус - это и эндокринный орган, в котором синтезируется ряд биологически активных веществ пептидной природы. Считается, что инволюция тимуса, начинающаяся при половом созревании, является главным возрастным изменением иммунной системы. Такая инволюция состоит в нарастающей потере клеточности с истощением лимфоидного пула клеток в зонах коры и кистозными изменениями эпителиальных клеток. Выход дифференцированных Т-клеток снижается с увеличением возраста (Globerson A.R et al., 1990). Прогрессивно снижаются синтез и секреция полипептидных гормонов тимуса, таких как тимозин, тимопоэтин и тимулин. Но в последние годы было установлено, что те же пептидные препараты тимуса могут восстанавливать компетентность иммунных клеток в старом организме и увеличивать продолжительность жизни животных (Лабунец и др., 1997; Морозов, Хавинсон, 1997; Anisimov et al., 1982; Anisimov et al., 1998).

Считается установленным, что снижение эндокринной активности тимуса играет ключевую роль в возрастных дисфункциях иммунной системы, поскольку заместительная терапия введением гормонов способна частично восстановить различные иммунные функции в старости (Zatz, Goldstein, 1985). Кроме того, если принять во внимание, что введение тимусных гормонов старым мышам способствует повышению Т-клеточного звена лимфоидной системы, а подсадка тимуса в диффузной камере, не пропускающей клетки, неонатально тимэктомированным мышам обеспечивает устранение проявлений иммунодифицита, становится понятно, как велика роль гуморальных факторов тимусного происхождения при нормальном функционировании вилочковой железы (Ярилин, Беляков, 1996; Goya, 1991).

Известно, что половые железы находятся в антагонистических взаимоотношениях с тимусом. Именно в период полового созревания начинается резкая возрастная инволюция тимуса. А гонадэктомия приводит к повышению у старых животных массы и клеточности тимуса (Ярилин, Беляков, 1996), т.е. отсутствие антагонизма между тимусными и половыми гормонами дает возможность вилочковой железе прогрессивно развиваться. Поэтому, мы в своих исследованиях брали для аллотрансплантации тимус неполовозрелых животных, еще не подвергшийся угнетающему действию половых гормонов. Пролиферативный потенциал и способность к гормональной продукции таких трансплантатов выше, чем у трансплантатов от взрослых животных. Если учесть, что пересадку ткани проводили в относительно иммунопривилегированную переднюю камеру глаза, где она могла функционировать длительное время, становится понятно, почему относительно небольшой кусочек иммунокомпетентной ткани (это относится как к тимусу, так и к костному мозгу) мог дать ускоренное восстановление иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и приостановить инволюции тимуса у животных разных возрастных групп. У сусликов (зимнеспящие) тимус в отличие от основной массы млекопитающих проходит ежегодную осеннюю инволюцию и весеннее восстановление. Очевидно, что пролиферативный потенциал в данном случае имеет очень большой запас, поэтому даже при ксенотрансплантации тимуса сусликов в переднюю камеру глаза крыс мы получили результаты лучшие, чем при аллотрансплантации.

Трансплантация инсулинпродуцирующей ткани

Токсическое воздействие на поджелудочную железу аллоксана, стрептозотоцина, либо других агентов приводит к резкому дефициту инсулинпродуцирующих клеток. При недостатке инсулина из протокового эпителия образуются новые ß-клетки (Бородатая и др., 2001; Righardt 1984; Kasper et al., 1991; Bouwens, 1998a,b). Но этот процесс может идти более или менее успешно, когда еще есть остаточная секреция инсулина, предохраняющая организм от диабетической комы. Такие условия создаются у крыс при уровне глюкозы в крови в пределах 10-15 ммоль/л, когда животные могут жить достаточно долго, причем иногда у них может происходить нормализация содержания глюкозы в организме. При уровне глюкозы в крови более 20 ммоль/л (именно такой был у наших экспериментальных животных) все крысы или кролики погибают, в среднем, на сроках до 1 месяца. После трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривиллегированные зоны (мозг, передняя камера глаза, тестикул) либо внутрибрюшинно, интрапортально, внутримышечно и.т.д. происходит снижение количества глюкозы в организме у животных и с высокой гипергликемией, и с относительно низкой. Такая физиологическая ситуация позволяет наращивать из резерва протокового эпителия ß-клетки в собственной поджелудочной железе.

Эта закономерность справедлива при внутрибрюшинной, интрапортальной, внутримышечной и других видах трансплантации, не связанных с иммунопривиллегированными областями организма. В наших работах трансплантацию поджелудочной железы проводили в мозг, переднюю камеру глаза, семенник. В этих областях до проведения физиологических, биохимических и иммунологических экспериментов пересаженная ткань функционировала, в среднем, 4 месяца. При трансплантации в тестикул - несколько меньше (2,25 мес.), а при интраокулярной пересадке - чаще всего намного больше, до 16 месяцев. Очевидно, что при столь длительном функционировании трансплантата открываются значительно большие возможности восстановления пула собственных р-клеток поджелудочной железы. Таким образом, длительная компенсация экспериментального диабета при трансплантации эмбриональной или неонатальной поджелудочной железы в относительно иммунопривиллегированные участки организма осуществляется в значительной степени за счет пролонгированной выработки инсулина трансплантатом. При этом происходит регенерация инсулинпродуцирующих клеток собственной поджелудочной железы, что и было показано в наших экспериментах.

Таким образом, использование относительно иммунопривилегированных участков организма для разработки новых методов трансплантологической компенсации экспериментальных патологических состояний, исследования особенностей их протекания и возможности нейтрализовать воздействие токсинов, радиационного облучения, стресса имеют существенное значение для экспериментальной физиологии. Результаты, полученные в работе, могут помочь в клинических исследованиях интерпретировать результаты, находить новые пути для долговременной компенсации патологий в практике.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Куликов, Александр Владимирович, Пущино

1. Абелев Г.И. Основы иммунитета // Соросовский Образовательный Журнал. - 1996. - № 5. - С. 4-10.

2. Абрамов A.B. Arg8. -вазопрессин стимулирует синтез инсулина в бета-клетках поджелудочной железы при хроническом интрацеребровентикулярном введении интактным и диабетическим крысам // ДАН.- 1998.- Т.358.- № 3.- С. 416-418.

3. Абрамов В.В. Взаимодействие иммунной и нервной систем. -Новосибирск: Наука. 1988. - 252с.

4. Акмаев И.Г. Взаимодействия основных регулирующих систем (нервной, эндокринной и иммунной) и клиническая манифестация их нарушений // Клиническая медицина. 1997. - № 11. - С. 8-13.

5. Акмаев И.Г. Гриневич В.В. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии// Бюлл. экспер. биол. и мед. 2001. -Т. 131.-№1.-С. 22-32.

6. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринология: истоки и перспективы развития // Успехи физиологических наук 2003. - Т. 34. - №4. -С.4-15.

7. Александрова М.А., Полежаев Л.В. Трансплантация нервной ткани мозга в головной мозг крыс // Доклады АН. 1982. - Т. 263. - N 2. -С. 460 - 463.

8. Александрова М.А. Тканевая дифференцировка коры мозга эмбрионов при трансплантации в головной мозг млекопитающих // Функциональная нейрохирургия. 1990. - N 3. - С. 5-6.

9. Александрова М.А. Механизмы дифференцировки нервной ткани и межклеточные взаимодействия при нейротрансплантации умлекопитающих: Автореф. Дис. д-ра биол. наук. М.: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 1999. - 48с.

10. Аметов A.C., Кондратьева Л.В. Препараты инсулина и их применение в лечении инсулинзависимого сахарного диабета // Международная программа «Диабет». 1995. - Ярославль.

11. Арбузова М.И., Куликов A.B., Третьяк Т.М. Содержание иммунореактивного инсулина в поджелудочной железе и аллотрансплантатах в передней камере глаза при экспериментальном диабете // Пр. эндокринологии. 1991. - Т. 37. -№ 1. - С. 42-44.

12. Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов A.B. Моделирование экспериментального диабета на животных // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино. 11-14 ноября 2002г. - С. 48.

13. Балаболкин М.И. //Эндокринология. М.: 1989. - С. 247-261.

14. Балаболкин М.И. Эндокринология. Москва.: «Универсум паблишинг». 1998. -. 582с.

15. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Диагностика и классификация сахарного диабета // Сахарный диабет. 1999. -№3.-С.15.

16. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете // Сахарный диабет. 1999. - №1. -С. 99-108.

17. Балаболкин М.И. Диабетология. М.: « Медицина». 2000. -. 672с.

18. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г., Ярошевский Ю.А., Никитин А.И. Экспериментальный сахарный диабет. Роль клинической диабетологии. Л.: Наука. 1983. - 240с.

19. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Ситникова А.М., Онегова Р.Ф. Развитие сахарного диабета у потомства крыс и самок с аллоксановым диабетом в 6 изученных поколениях // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1988. - Т. 105. - №1. - С. 13-15.

20. Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Овсепян М.Л., Мартиросян И.М. Коррекция аллоксанового диабета у крыс с помощью ксенотрансплантации пассированных культур бета-клеток поджелудочной железы плода человека // Проб л. эндокринол. -1987.-Т. 33,-N5.-С. 63-65.

21. Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Тананян O.A. Трансплантация бета-клеток поджелудочной железы эмбриона человека больным сахарным диабетом // Врачебное дело. 1987. - № 8. - С. 61-63.

22. Белова Т.И., Юнсон Ю.А. Гемато-энцефалический барьер при эмоциональном стрессе // Успехи физиол. наук. 1985. - N 2. -Т. 16.-С. 61-67.

23. Белоусова О.И. Радиация и система крови. М: Атомиздат. - 1979. -126с.

24. Беникова Е.А., Турчин И.С. Трансплантация культур бета-клеток в лечении инсулинозависимого сахарного диабета у детей // Пробл. эндокринол. 1991. - Т. 37. - № 4. - С. 17-19.

25. Блох К.О., Полторак В.В., Поверенный A.M. Молекулярные механизмы повреждения бета-клеток поджелудочной железы при действии диабетогенных факторов // Успехи современной биологии. 1987. - Т. 103. - № 1. - С. 96-108.

26. Блюмкин В.Н., Скалецкий H.H., Кауричева H.H.: "Флотирующие культуры клеток поджелудочной железы плода" // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1984. - № 6 - С. 764 - 766.

27. Блюмкин В.Н., Бабикова P.A., Кауричева H.H. Скалецкий H.H.: "Методы получения культур островковых клеток из поджелудочной железы плодов человека и некоторых млекопитающих животных" // Метод, рекоменд. М.: - 1985. - 19с.

28. Блюмкин В.Н., Скалецкий H.H., Кирсанова JI.A. Культуры островковых клеток поджелудочной железы и их трансплантация // Материалы 3-го Всесоюз. совещ. "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. - 1992. - С. 16-23.

29. Бойко Н.И. Аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы хирургическим больным сахарным диабетом: Дис. д-ра мед. наук. М.: - 1991.

30. Брагин А., Виноградова О.С. Гомо и гетеровидовая трансплантация эмбриональной ткани нервной системы // Бюлл. эксп. биол. и мед. -1981. -№ 10.-С. 486-489.

31. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Активность нейронов септума и гиппокампа трансплантированных в переднюю камеру глаза крысы // Ж. высш. нерв. деят. 1983. - Т. 33. - N 4. - С. 708-716.

32. Брагин А., Виноградова О.С. Электрическая активность нейронов септум и гиппокампа трансплантированных в мозг крысы // Нейрофизиология. 1985. - Т. 17. - №2. - С. 160-168.

33. Брагин А.Г., Куликов A.B., Третьяк Т.М., Журавлева З.Н. (СССР) A.C. 1369039. МКИ А61В10/00 Способ моделирования компенсации сахарного диабета/ 2 ст. : ил., 1986.

34. Брагин А.Г. Трансплантация нервной ткани методические, морфологические и функциональные аспекты: Автореф. дисс. доктора биологических наук. - 1990. - Москва. - С. 1-57.

35. Бредбери М. Концепция гемато-энцефалического барьера. М.: Медицина. 1983. - 420с.

36. Бутенко Г.М. Иммунология старения // 1мунолопя та алерголопя. -1998.-№ 1-2.-С.26-29.

37. Бутенко Г.М. Старение иммунной системы // Проблемы старения и долголетия.- 1998.- Т.7. № 3. - С. 100-108.

38. Виноградова О.С. Развитие нервной ткани млекопитающих при трансплантации в мозг и переднюю камеру глаза: проблемы и перспективы // Онтогенез. 1984. - Т. 15. - N 3. - С. 229-251.

39. Гаврилова H.A. Влияние гравитационного плазмафереза и * ретробульбарной трансплантации культуры островковых клетокподжелудочной железы на течение диабетической ретинопатии: Дис. канд. мед. наук. М.: - 1992.

40. Галибин О.В., Поташов JI.B., Черникова М.В., Бевзюк И.Б. Лечение больных с осложненными формами сахарного диабета в Ленинградском центре трансплантации // Тр. симпоз. "Трансплантационные методы лечения сахарного диабета". Рига. - 1988. - С. 62-63.

41. Гольдстейн Г.У., Бец А.Л. Гемато-энцефалический барьер // В мире науки. 1986. - N 11. - С. 40-49.

42. Громова Е.А. Реципрокность взаимоотношений 5-ОТ и НА систем мозга и ее значение для регуляции поведения в норме и патологии // Препринт НЦБИ. Пущино. - 1985. - 28с.

43. Гуревич Л.Е., Казанцева И.А., Бородатая Е.В. Роль стволовых и полипотентных клеток в дифференцировке и неопластической трансформации клеток поджелудочной железы // Известия АН. Серия биологическая. 2001. - № 6. - С. 753-759.

44. Гусев Е.Ю. Влияние глюкагона на первичный иммунный ответ, перчувствительность замедленного типа и отдельные этапы иммуногенеза // Регуляция иммунного ответа. Сб. науч. тр. / Пермский Гос. Мед. ин-т. 1987. - С. 26-32.

45. Дедов И.И. Поздние осложнения сахарного диабета. Актуальные проблемы эндокринологии // Тезисы докладов III Всероссийского съезда эндокринологов 4-7 июня 1996 г. М.: 1996. - С. 5-6.

46. Дедов И.И. Синдром диабетической стопы. М.: 1998. - 143.с.

47. Дедов И.И. Сахарный диабет в Российской Федерации: проблемы и пути решения // Сахарный диабет. 1998. - № 1. - С. 7-21.

48. Дильман В. М. Четыре модели медицины. М.: Медицина. - 1987. -288с.

49. Донцов В.И., В.Н. Крутько, Подколзин A.A. Фундоментальные механизмы геропрофилактики. М.: Биоинформсервис. - 2002. -464 с.

50. Дорошенко Е.О., Мартынова М.И., Арион В.Я., Смирнов В.В. Применение тактивина при сахарном диабете у детей. //Медицинский научный и учебно-методический журнал. 2001. -№ 3. - С.98-120.

51. Евсеев Ю.И. Сравнительная оценка интрамускулярной и интрапортальной трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы у больных с сахарным диабетом 1 типа //Автореф. дис. к.м.н. Москва. - 1993.

52. Ермакова И.В., Кузнецова Г.Д., Лосева Е.В., Сидоренко А.Е., Иоффе М.Е. Использование нейротрансплатации для подавления судорожной активности у крыс с генетической эпилепсией // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2000. - № 9. - С. 279-283.

53. Ермакова И.В. Компенсаторно-востановительные процессы при внутримозговой трансплантации незрелой нервной ткани // Автореф. дис.докт. биол. наук. М.: 2001. - 44с.

54. Ефимов A.C., Ткач С.Н. Электрофизиологическая характеристика диабетической полинейропатии // Сов. мед. 1988. - № 8. - С. 3-5.

55. Жарков В.П., Ярыгин В.Н., Гольцман Л. Л. Имплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза здоровым и диабетическим крысам // Бюллетень экспер. биол. и мед. 1988. - Т. 105. - № 2. - С. 216-218.

56. Жарков В.П., Ярыгин В.Н., Гольцман Л.Л. Развитие функционирование эмбриональных клеток панкриотическихостровков в передней камере глаза крыс // Бюллетень экспер. биол. и мед. 1989. - Т. 107. - № 3. - С. 342-345.

57. Жоленько А.Б. Глазные болезни. М.: Медицина. - 1969. - 184с.

58. Жуковский М.А. Сахарный диабет у детей. Куйбышев. - 1989. -160с.

59. Журавлева З.Н. Ультраструктурное исследование пластичности клеточных элементов и межклеточных взаимодействий в трансплантатах нервной ткани: Автореф. Дис. д-ра биол. наук. -Пущино.: ИТЭБ РАН 1999. - 78с.

60. Зак К.П., Малиновская Т.Н., Болыпова-Зубковская Е.В. Состояние иммунной системы у детей, больных сахарным диабетом 1 типа (обзор литературы и собственные исследования) // Эндокринология .-2001.-№2.-С. 191-203.

61. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. Киев. - 1974. - 212с.

62. Иммунофизиология. Под ред. Корневой Е.А. СПб: Наука. - 1993. -684с.

63. Исаев Э.И., Эргашева М.Ж., Салихаджаева Д.С., Туракулов Я.Х. Содержание сиаловых кислот индивидуальных гликолипидов тканей в норме и при аллоксановом диабете у крыс // Пробл. эндокринол. 1983. - Т. 2. - № 1. - С. 67-71.

64. Каитова 3. С. Варианты клинической пересадки гипофизарных клеток в мужскую половую железу // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». 2003. С. 64.

65. Каримова М.Х., Бондаренко М.Ф. Функциональное состояние мозгового слоя надпочечников у крыс с экспериментальнымаллоксановым диабетом // Пробл. эндокринол. 1986. - Т. 32.- № 5.-С. 61-63.

66. Касаткина Э.П.: "Сахарный диабет у детей и подростков" // Москва: Медицина. - 1996. - С. 7 - 49.

67. Кассиль Г.Н. Гемато-энцефалический барьер. Анатомия, физиология, методы исследования. Клиника. М.: - Из-во АМН СССР. - 1963.-408с.

68. Кассиль Г.Н. Внутренняя среда организма. М.: - Наука. - 1983. -224с.

69. Кирпатовский И.Д., Дендеберов Е.С. Аллотрансплантация культуральных неонатальных андрогенпродуцирующих клеток Лейдига // Вестник Российской Академии медицинских наук. -1994. -№ 4. С. 42-46.

70. Кирпатовский И.Д., Каитова З.С., Лысенко А.И. Пересадка клеток эндокринных органов при мужском бесплодии // Актуальные вопросы андрологии. Мат. конф. - М.: - 1999. - С. 25-27.

71. Кирпатовский И.Д. Нейроэндокринная трансплантация в андрологии // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». М.: - 2003. - С. 76.

72. Кеворков H.H., Гусев Е.Ю., Князев Ю.А. Влияние глюкагона и кратковременного голодания на взаимосвязь клеточного и гуморального иммунного ответа // Пробл. эндокринологии. 1991. - Т. 37. - № 6. - С. 54-55.

73. Коган Б.М., Нечаев Н.В. Чувствительный и быстрый метод одновременного определения дофамина, норадреналина,серотонина и 5-оксииндолуксусной кислоты в одной пробе // Лаб. дело. 1979.-N 5.-С. 301-303.

74. Комисаренко И.В., Рыбаков С.И., Лысенко П. Г. Трансплантация культуры клеток эндокринных желез новое направление в клинической эндокринологии // Эндокринология. - Респ. Межвед. Сборник. - «Здоровье». - 1991. - № 21. - С. 71-78.

75. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Гордиенко В.М., Кравченко В.И., Матвиенко Г.Ф. Особенности течения аллоксанового диабета у крыс при различных способах изотрансплантации островков Лангерганса // Проблемы эндокринол. 1980. - № 1. - С. 59-64.

76. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Комиссаренко И.В. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной желез плодов человека и животных как метод лечения сахарного диабета // Врач. дело. 1983. - № 4. - С. 52-57.

77. Корыстов Ю.Н. Эмоции, стресс, потребление алкоголя, курение и рак корреляционные и причинные связи // Журн. ВНД. - 1997. - Т. 47. - С. 627-657.

78. Корыстов Ю.Н., Куликов A.B., Архипова Л.В, Смирнова Г.Н., В.В. Шапошникова, М.Х Левитман, Л.М. Чайлахян. Социальный стресс в группах мышей: методы регистрации конфликта и его последствий // ДАН. 2003. - Т. 390. - № 6. - С. 847-849.

79. Кудинов Ю.Г. Взаемовщношення селезшки з шшими перифершними лимфощними органами та тимусом при старшш. Автореф. дис. канд. мед. наук. Юев. 1994. - 23с.

80. Кудинов Ю.Г., Хромяк В.Н. Изменение численности периферических CD4+ лимфоцитов у молодых и старых мышей СВА после однократного введения кортизола и гидроксимочевины // Экспериментальная онкология. Киев. - 1997. - № 1. - С.12-14

81. Кудрявцева H.H. Антагонистическое поведение: модель, эксперимент, перспективы // Росс, физиол. ж. 1999. - Т. 85. - С. 67-83.

82. Куликов A.B., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В., Куликова Л.И., Третьяк Т.М. Компенсация возрастной и стрессорной инволюции тимуса // Доклады РАСН -2001.-№3.-С. 41-43.

83. Кухарчук B.B. Антиоксидант пробу ко л предотвращает развитие аллоксанового диабета и снижение активности антиоксидантных ферментов в тканях крыс // Бюл. Экспер. Биол. и медиц. 1992. - № 9. - С. 279-282.

84. Лабунец И.Ф., Терешина О.П., Максюк Т.В. . Новые подходы к применению тималина и эпиталамина в стареющем организме // Фармакологический вестник. 1997. - № 1. - С.45-47

85. Лапин В.И., Корчин В.И., Мейрамов Г.Г., Пальмина Т.В., Сатосин В.Г. Влияние аллоксана на содержание инсулина и цинка в панкреатических островках у экспериментальных животных // Патол. экспер. физиол. терап. 1973. - № 4. - С. 36-40.

86. Лебкова Н.П., Бондаренко М.Ф., Колесова O.E., Азарян Г.П. Ультраструктурное проявление ранних метаболических нарушений в миокарде собак при аллоксановом диабете // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1980. - Т. 89. - № 5. - С. 614-617.

87. Лолор Г., Фишер Т, Адельма D. Клиническая иммунология и аллергология. Пер. с англ. М.: Практика. - 2000. - 806с.

88. Лосева Е.В., Ермакова И.В., Тарасова Л.Ю. Действие нейротрансплантации, на мозг крыс с поврежденной височной корой // Нейрофизиология. 1990. - Т. 22. - № 5. - С. 586-595.

89. Лосева Е.В. Структурно-функциональные перестройки в мозге реципиентов при трансплантации незрелой нервной тканиразличного генеза // Автор, дис. на соиск. докт. биол. наук. Москва. 1999. -34с.

90. Мазовецкий А.Г., В.К. Беликов. // В кн. " Сахарный диабет". -М.: "Медицина". 1987. - 288 с.

91. Малайцев В.В., Молнар Е.М., Скалецкий H.H. Трансплантация фетальной ткани человека — перспективный метод лечения сахарного диабета (обзор) // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. -№4. - С. 350-355.

92. Малик А. Изучение некоторых клинико-лабораторных показателей у больных инсулинозависимым сахарным диабетом после ксенотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы: Дис. . канд. мед. наук. Киев. - 1990.

93. Медвинская Н.И. Особенности поведения и обучения крыс с депривацией активности катехоламинэргической систем мозга: Автореф. канд. биол. наук. М.: - 1997. - 25с.

94. Меньшиков В.В. Определение глюкозы в биологических жидкостях по цветной реакции с орто-толуидином // Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования. М.: - 1973. - С. 59-60.

95. Меркулов Г. А. Окраска альдегид фуксином // Курс патологогистологической техники. Ленинград. - 1969. - С. 270275.

96. ИЗ. Мецлер Д. //Биохимия. М.: - 1980. - Т. 3. - 458с.

97. Миронов С.Ф. Синхронная активность нейронов гиппокампальных // Симпозиум "Трансплантация ткани мозга млекопитающих": Тез. докл. Пущино. - 1988. - С. 48-49.

98. Молитвословов А.Б., Бабаев М.А., Расбеков М.М. Современные аспекты трансплантации поджелудочной железы // Хирургия. -1991.-№7.-С. 130-136.

99. Молитвословов А.Б. Хирургия поджелудочной железы: Острый панкреатит, травмы поджелудочной железы. Трансплантация поджелудочной железы // Русский медицинский журнал. 1996. -Т. 4. - № 3. - С. 34-36.

100. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) // СПб: Наука. 1996. - 74с.

101. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы в профилактике и лечении возрастной патологии // Успехи геронтологии. 1997. - Т. 1. - С. 74-79.

102. Мошкин М.П., Герлинская A.A., Евсиков В.И. Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса. Новосибирск. - Наука. -1990. - С. 171-180.

103. Мусаев П.И. Полупроницаемые барьеры глаза. Баку. - Азерб. Гос. изд. - 1986. - 169с.

104. Нестеров А.П. Диабетические поражения органов зрения // Пробл. эндокринологии. 1997. - Т. 43. - № 3. - С. 16-19.

105. Николаева М.Я., Пархимович P.M., Зарайский A.B. Цитотоксичность аллоксана: новый аспект проблемы // Проблемы эндокринологии. 1986. - Т. 32. - N 3. - С. 75-79.

106. Осадчук A.B., Науменко E.B. Генетико-экологические механизмы дифференциального размножения у самцов лабораторных мышей // ДАН СССР. 1981. - Т. 261. - С. 1238-1241.

107. Отеллин В.А., Рыбаков В.Л., Байковская М.Н. Ультраструктурная организация участков соприкосновения ликвора и крови с тканью мозга. Гисто-гематические барьеры и нейрогуморальная регуляция. - М.: - Наука. - 1981. - С. 192-200.

108. Отеллин В.А., Гилерович Е.Г., Гусихина В.И. Пересадки эмбриональных закладок неокортекса человека в мозг крыс // Архив АГЭ. 1985. - Т. 89. - № 8. - С. 18 - 22.

109. Отеллин В.А. Межклеточное пространство и несинаптические межнейронные связи головного мозга, млекопитающих // Архив анат., гистол., эмбриол. 1987. - Т. 43. - № 9. - С. 5-19.

110. Павлов П.М. Современные представления о механизме действия глюкагона на углеводный обмен // Физиологический журнал. -1990. Т. 36. -Хо 1. - С. 113-121.

111. Павловский М.П., Бойко Н.И. Отдаленные результаты ал-лотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы // Вести хирургии им. И.И. Грекова. 1990. - №12. - С. 2629.

112. Пальчикова H.A., Селятицкая Ю.П., Шорин Ю.П. Количественная оценка чувствительности экспериментальных животных к диабетогенному действию аллоксана // Проблемы эндокринологии. 1987. - Т. 33. - № 4. - С. 65-78.

113. Патент на изобретение № 1369039 "Способ моделирования компенсации сахарного диабета" зарегистрированного в

114. Государственном реестре изобретений и действует с 20 августа1994 г. (Патентообладатель А.В.Куликов. Соавторы А.Г.Брагин, З.И.Журавлева, Т.М.Третьяк).

115. Пахомова Н. В. Сочетанные пересадки ядер переднего гипоталамуса в комплексе с нейрогипофизом у больных с несахарным диабетом // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». 2003. - С. 92.

116. Першин Б.Б. Стресс, вторичные иммунодефициты и заболеваемость. М.: - Наука. - 1994. - 263с.

117. Першин Б.Б., Кончугова Т.В. Стресс и иммунитет. Москва. -1996.- 155с.

118. Петеркова В.А., Щербачева Л.Н., Кураева Т.Л. Диагностика, лечение и профилактика диабетических осложнений у детей и подростков. Москва. - 1997. - С. 5-10.

119. Петрович Ю.А., Боровик Г.А. Ферменты углеводного обмена в глазу при нарушении его иннервации // ДАН СССР. 1973. - Т. 212. -С. 1465-1468.

120. Петрович Ю.А. Гемато-офтальмический барьер. Физиология гисто-гематических барьеров под. ред. Я.А. Росина. М.: Наука. -1977. - С. 313-329.

121. Пири А., Р. ван Гентинген. Биохимия глаза. М.: Медицина. -1968. - 400с.

122. Полежаев Л.В., Александрова М.А. Трансплантация ткани мозга в норме и патологии. М.: Наука. - 1986. - 152с.

123. Поташов Л.В., Благосклонная Я.В., Галибин О.В. Трансплантация островковой ткани поджелудочной железы в лечении осложненных форм сахарного диабета // Тр. 4-го съезда эндокринологов УССР, Львов, Киев. 29 сент. - 1 окт. 1987. - С. 308.

124. Поташов Л. В., Галибин О.В., Прокопчук С.Н. Трансплантация поджелудочной железы // Вестник хирургии. 2000. - Т. 159. - №2. -С. 123-126.

125. Пошивалов В.П. Групповое поведение мышей в коммуникационном аппарате // Журн. ВНД. 1977. - Т. 27. - С. 1011-1019.

126. Пошивалов В.П. Экспериментальная психофармакология агрессивного поведения. Ленинград. - Наука. - 1986. - 175с.

127. Прихожан В.М. Поражение нервной системы при диабете. М.: Медицина. - 1981. - 183с.

128. Пучковская H.A. Основы офтальмо-эндокринологии. М.: Медицина. - 1977. - 27с.

129. Пучковская H.A., Шульгина Н.С., Минев М.Г., Игнатов Р.Г. Иммунология глазной патологии. М.: Медицина. - 1983. - 223с.

130. Розенфельд И.А. Приборы и инструменты в офтальмологии. Флюориметрия в офтальмологии. Обзор литературы // Мед. реферат, журн. Офтальмология. 1987. - № 8. - С. 25-30.

131. Резенфельд И.А. Разработка метода исследования барьера кровь/сетчатка и возможности его научно-клинического применения: Дис.канд. мед. наук. М.: - 1989. - 176с.

132. Розенталь Р.Л., Закриевский Р.Л., Ильинский И.М. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом // Веста, хирургии. 1988. -№ 5. - С. 83-86.

133. Росин Я.А. Учение Л.С. Штерн о гисто-гематических барьерах. Гисто-гематические барьеры и нейрогуморальная регуляция. М.: Наука. - 1981.-С. 22-33.

134. Сагидова Р.З. Сравнительная характеристика некоторых метаболических сдвигов при аллоксановом диабете // Механизмы патологических процессов. Ташкент. - 1979. - С. 80-85.

135. Самойлов M.О., Мокрушин A.A. Роль объёмной передачи адаптогенных сигналов в формировании приспособительных реакций // Рос. физиол. журн. 1999. - Т. 85. - № 1. - С. 4-20.

136. Саульская Н.Б. Объемная передача как способ межнейронального взаимодействия в стриатуме // Журн. высш. нервн. деят. 1997. -Т. 47. -№ 2. - С. 362-373.

137. Сидоренко Д.С. Включение С-глицина и Н-метионина в общие и цитоплазматические белки скелетных мышц при дефиците инсулина и избытке глюкокортикоидных гормонов // Пробл. эндокринол. 1981. - Т. 27. - № 5. - с. 59-61.

138. Скалецкий H. Н. Внутримышечная ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы. Проблемы трансплантологии и искусственных органов. - М.: - 1983. - С. 79-81.

139. Скалецкий H. Н. Влияние культивирования островковых клеток поджелудочной железы на их выживание в организме ксеногенного реципиента //тез. Докл. Конф. "Трансплантация органов». Киев. -1985.-С. 219-222.

140. Скалецкий H. Н. Ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека крысам с экспериментальным сахарным диабетом: Афтореф. дис. канд. мед. наук.-М.: 1987.

141. Скалецкий H.H., Шальнев Б.И. Ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы в эксперименте //

142. Трансплантологические методы лечения сахарного диабета: Тез. докл. Рига. - 1988. - С. 39-40.

143. Скалецкий Н. Н., Кирсанова JI. А., Засорина О. В. Получение культур островковых клеток из поджелудочной железы кролика для трансплантации // Тез. Док. «Трансплантация органов». -Львов. 1990. - С. 124- 125.

144. Скалецкий Н. Н, Кирсанова Л. А., Блюмкин В. Н. Получение культур островковых клеток из поджелудочной железы и их трансплантация. Проблемы трансплантологии и искусственных органов. - М.: - 1994. - С. 73 - 80.

145. Скалецкий H.H., Фатеева Н.Л., Сухих Г.Т., Молнар Е.М. Трансплантация культур островковых клеток фетальной поджелудочной железы в лечении инсулинозависимого са-харного диабета (обзор) // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. - № 4. - С. 356-362.

146. Скалецкий Н. Н., Онищенко Н. А. Клеточная трансплантация: достижения и перспективы // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. - № 3-4. - С. 94-102.

147. Словеснова Т. А. Роль аллотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека в комплексной терапии больных сахарным диабетом: Дис. канд. мед. наук. М.: - 1989.

148. Слюсарев A.A. Клинико-иммунологические аспекты трансплантации культур фетальных эндокринных тканей // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. - № 3.- С. 96-97.

149. Смирнов B.C., Фрейдлин И.С. Иммунодефицитные состояния //СПб: "Фолиант". - 2002. - 568с.

150. Соболев JI.B. О строении поджелудочной железы при некоторых патологических условиях // Еженед. практ. мед. 1900.- № 7. С. 105-110.

151. Соболев JI.B. К морфологии поджелудочной железы при перевязки ее протока при диабете и некоторых других условиях: Дис. СПБ., 1901.

152. Тарабарко Н.В., Мойсюк Я.Г. Эвисцеральная методика изъятия поджелудочой железы и почек у донора // Хирургия. 1990. - № 3. -С. 95-98.

153. Туровский B.C. Влияние 6-оксидофамина на содержание НА в головном мозге крыс // Нейрохимия. 1985. - Т. 4. - № 3. - С. 339340.

154. Тырышкина A.M., Сальник Б.Ю., Долгих Е.В. Окислительное фосфорелирование, активность НАД-Н-оксидазной и сукцинатдегидрогеназной систем в митохондриях тестикул крыс при аллоксановом диабете // Вопр. мед. хим. 1986. - Т. 32. - №3. -С. 82-85.

155. Угрюмов М.В. Нейроэндокринная регуляция в онтогенезе. -М.:-Наука. 1989. -247с.

156. Угрюмов М. В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимиии. Мое. итоги науки и техники. Серия морфология человека и животных. - 1991. -Т. 15. - 121с.

157. Фрадкин М.Я., Гамзаева Е.М., Зверева В.А. Гемато-офтальмический барьер и влияние на него вегетативной нервной системы и эндокринного аппарата // Арх. офтальмол. 1927. - Т. 3. -С. 441-446.

158. Фрейдлин И.С. Загадки тимуса. Возраст и иммунитет. Соросовский образовательный журнала// 1997. № 5. - С. 26-29

159. Фромен Л.А., Фелинг Ф., Бродус А.Е. Эндокринология и метаболизм: Пер. с англ. М.: - Медицина. - 1985. - Т. 2. - 416с.

160. Царенко В.И., Попова Л.И., Дроздович И.Н. Пролангирование жизнедеятельности аллогенных бета-клеток с помощью антирецепторной сыворотки у крыс с аллоксановым диабетом // Пробл. эндокринол. 1987. - Т. 33. - № 4. - С. 60-61.

161. Червова И.А. Морфология гисто-гематических барьеров. В кн. "Физиология гистологических барьеров". Под ред. Я.А. Росина. -М.: Наука. - 1977. - С. 77-114.

162. Чеснокова В.М., Иванова М.Н., Грунтенко Е.В. Эндокринная функция тимуса // Успехи соврем, биол. 1984. - Т. 97. - вып. 3. - С. 435-436

163. Чороян О.Г. Нервная регуляция физиологических функций. В кн. "Физиология человека". Под редакцией В.М.Покровского, Г.Ф.Коротько. - М.: - 2003. - С. 97-111.

164. Швомбергер И.Н., Крыленко В.А., Степанян Л.И., Сангакова Е.В., Бахтин Ю.Б. Перспективы использования передней камеры глаза для изучения пролиферации, дифференциации и гибридизации опухолевых клеток // Цитология. 1977. - Т. 29. -№ 6. - С. 665-670.

165. Шевчук Н. А. Времяразрешённый иммунофлюоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека // Вопросы мед. химии. 2002. - Т. 47. - Вып. 4. - С. 37-42

166. Шилов И.А. Эколого-физиологические отношения у животных. -М.: МГУ. - 1976. -261с.

167. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Шальнев Б. И. Скалецкий H.H. Культуры островковых клеток поджелудочной железы плодов человека и трансплантация их больным сахарным диабетом // Пробл. эндокринол. 1981. - № 1. - С. 25 - 30.

168. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Игнатенко С.Н. Скалецкий H.H. Результаты трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом // Пробл. Эндокринол. 1985. - № 5. - С. 67-70.

169. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий H.H. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы (очерки). М.: - 1995. -381с.

170. Шумаков В.И., Скалецкий H.H. Трансплантация островковых и других эндокринных клеток // Трансплантология. Руководство. Под ред. В.И. Шумакова. М.: - Медицина; Тула: Репроникс Лтд, 1995.-С. 317-331.

171. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий H.H. // Двадцатилетний опыт разработки проблемы клинической трансплантации островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом: гипотезы, новые перспективы //

172. Трансплантация и искусственные органы. 1998. - № 2-3. - С. 35-43

173. Шумаков В.И., Тоневицкий А.Г. Современный взгляд на проблему ксенотрансплантации // Вестн. трансплантологии и искусств, органов. 1999. - №1. - С. 40-49.

174. Шумаков В.И., Тоневицкий А.Г. Иммунологические и физиологические проблемы ксенотрансплантации. М.: - Наука. -2000. - 144 с.

175. Щербачева J1.H., Лобанова A.M., Арбузова М.И. Функциональная активность островкового аппарата у детей с впервые выявленным сахарным диабетом // Педиатрия. 1989. - № 11.-С. 10-14.

176. Эверли Дж.С., Розенфельд Р. Стресс. Природа и лечение. М.: -Медицина. - 1985. - 287с.

177. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы //Иммунология. 1996. - №1. - С.4-10

178. Ярыгин В.Н., Малинина И.Е., Бибаева Л.В. Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на морфофункциональные характеристики нейронов Locus coeruleus // Бюлл. экспер. биол. мед. 1997. - Т. 7. - С. 106-108.

179. Abendroth P., Landraf R., Iller R., Land W. Pancreas transplantation: Curative Therapeutic approach to diabetic microangiopathy // Transp. Proc. 1988. - V.20. - №3. - P. 469-470.

180. Abendroth P., Landraf R., Iller R., Land W. Evidence for reversibility of diabetic microangiopathy following pancreas transplantation // Transplantation proceeding. 1989. - V.21. - №1. - P. 2850-2851.

181. Adeghate E., Donath T.Fixation and tissue preparation method for the localization of monoamine oxidase enzyme activity in the lung and in control and transplanted pancreas // Biogenic. Amines. 1993. - N 10. - P. 67-71.

182. Adeghate E. Host-graft circulation and vascular morphology of pancreatic tissue transplants in rats // Anat. Rec. 1998. - N 251. -P.448-459.

183. Adeghate E., Donath T. Tranaplatation of tissue grafts into the anterior eye chamber: a method to study intrinsic neurons // Brain Research Protocols. 2000. - N 6. - P.33-39.

184. Ader R., Felten D., Cochen N. Immune-derived modulation of behavior // Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1990. - V.30. - P.561-602.

185. Ader R. Conditioned immunomodulation: research needs and directions // Brain Behav. Immun. 2003. - Suppl 1. - S.51-57.

186. Akimaru K., Stuhlmiller G. M. Seigler H. F. Alio transplantation of insulinoma into the testis of diabetic rats // Transplant. 1981. - V.32. №3. - P.227-232.

187. Albert E.N., Das G.D. Neocortical transplants in the rat brain: an ultrastructural study // Experientia. 1984. - V. 40. - N 3. - P. 294 - 298.

188. Alexandrova M.A., Polezhaev L.V. Transplantation of various regions of embryonic brain tissue into the brain of adult rats // J. Hirnforsch. 1984. - V.25. - N 1. - P. 89 - 98.

189. Altman J.J. Treatment du diabetes insulino-dependant par les methods de substation // Diabete. Innov. Actual. Rech. 1989. -V.2. -№4. - P.23-28

190. Alvorado-Mallart R.M., Sotelo C. Differentiation of cerebellar anlage heterotopically transplanted to adult rat brain: a light andelectron microscopic study // J. Comp. Neurol. 1982. - V.212. - N 3. -P. 247 - 267.

191. Amos A.F., V. Carthy D.J., Zimmet P. The rising global burden of diabetes and its complications: estimates and projections to the year 2010 // Diabet Med. 1997. - V.14. - Suppl. 5. - S1-S85.

192. Andreani D., Federfin K.F., Di Mario U. // Immunology in diabetes. London-Edinburgh: Kimpton Med.Publ. - 1984. - P.298.

193. Angeletty P.U. Chemical sympathectomy in newborn animals // Neuropharmacology. 1971. - V. 19. - P. 55-59.

194. Anisimov V.N., Birnbaum L.S., Butenko G.M., Cooper R. Principles for Evaluating Chemical Effects on the Aged Population. Environmental Health Criteria 144 // Geneva: WHO. - 1993. - 159 p.

195. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., Morozov V.G. Effect of synthetic dipeptide Thymogen (Glu-Trp) on life span and spontaneoustumor incidence in rats // The Gerontologist. 1998. - V. 38. - Special Issue I. -P. 7-8.

196. Aramant R., Seiler M., Ehinger B. Transplantation embryonic retina to the retina of adult animals // In: Anderson R.E., Nollyfield J.G.,

197. Vail MM, Eds. Retinal Degeneration. Boca Raton: RCS Press. -1991. -P.275 -288.

198. Aramant R.B., Seiler MJ. Fiber and synaptic connections between embryonic retinal transplants and host retina // Exp. Neurol. 1995. -V.133. - P. 244-255.

199. Armitia E.C., Perlow M.J., Brennan M.J., Lander J.M. Fetal raphe and hippocampal transplants into adult and aged C 57BL 16N mice // Brain Res.Bull. 1981. - V.7. - P. 703 - 710.

200. Aubert I., Ridet J.L., Gage F.H. Regeneration in the adult mammalian CNS: Guided by development // Curr. Opin. Neurobiol. -1995. -N5. -P.625-635.

201. Bach-y-Rita. The brain beyond the synapse // Neuroreport. 1994. -N5. - P.1553-1557.

202. Banting F.G., Best C.V. The internal secretion of the pancreas // J. Lab.Clin.Med. 1922. - V.7. - P. 251-252.

203. Barker C.F., Billingham R.E. Immunologically privileged sites // Adv. Immunol. 1977. - V.25. - P. 1-52.

204. Bellgrau D., Gold D., Selawry H.P., Moore J., Franzusoff A., Duke R. c. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. -1995. V.377. - P.630-632.

205. Betts P., Logatchev M.F., Volkov I.E. "An Audit of pediatric diabetes care in Russia and England; an experience in international collaboration" // Hotm. res. 1998. - V.50. - P. 107-140.

206. Bilous R. W., Mauer S. I., Sutherland D.E.R. The effect of pancreas transplantation on the glomerular structure of renal allografts in patients with insulin-dependent diabetes // N. engl. J. Med. 1989. -V.31. - № 2.- P.80-85.

207. Bjorklund A., Stenevi U., Svendgaard N-A. Growth of transplanted monoaminoergic neurons into the adult hippocampus along the perforantpath// Nature. 1976. - V.262. - N 5571. - P.787-790.

208. Bjorklund A., Stenevi U. Reformation of the severed septohippocampal cholinergic pathway in the adult rat by transplanted septal neurons // Cell Tiss. Res. 1977. - N3. - P. 289-302.

209. Bjorklund A., Stenevi U. Reconstruction of the nigro-striatal dopamine pathway by intracerebral nigral transplants // Brain Res. -1979.-V. 177.-P. 555 560.

210. Bjorklund A., Stenevi U., Dunnett S.B., Iversen S.D. Funstional reactivation of the deafferented neostriatum by nigral transplants // Nature. 1981. - V.289. - P. 497 - 499.

211. Bjorklund L., Stremberg I. Dopaminergic innervation of striatal grafts placed into different sites of normal striatum: Differences in the tyrosine hydroxylase immunoreactive growth pattern // Exp. Brain Res.- 1997. V.113. - P. 13-23.

212. Bobzien B., Jasunami Y., Majercik M., Lacy P.E., Davie J.M. Intratesticular transplants of islet xenografts (rat to mouse) // Diabetes. -1983. V.32. - N3. - P.213-216.

213. Boguist L. Alloxan diabetes in mice: study of potentiatin and antogonizing factors // Diabetologia. 1977. - V.13. - N 4. - P.383-389.

214. Bogust L., Nelson L., Lorentzon R. Uptake of labeled alloxan in mouse organs and mitochondria in vivo and in vitro // Endocrinology. -1981. V.113. - № 3. - P. 943-948.

215. Bouwens L. Cytokeraatins as markers of ductal cell differentiate and islet neogenesis in neonatal rat pancreas // Diabetes. 1994. - V.43. - P. 1279-1283.

216. Bouwens L. Islet Morphogenesis and stem cell markers in rat pancreas // J.Histochem. Cytochem. 1996. - V. 44. - P. 947-951.

217. Bouwens L. Proliferation and differentiation in the human fetal endocrine pancreas // Diabetologia. 1997. - V.40. - P. 398-404.

218. Bouwens L. Transdifferentiation versus stem cell hypothesis for the regeneration of beta-cells in the pancreas // Microscopy Res. Technique. 1998a.-V. 43.-P. 332-336.

219. Bouwevs L. Citokertins and cell differentiation in the pancreas // J.Pathology. 1998b. - V.184. - P. 234-239.

220. Bowen K.M., Lafferty K.J. Reversal of diabetes by allogenic islet transplantation without immunosuppression // Austral. J. Exper. Biol, and Med. Sci. 1980. - V.58. - N 5. - P. 441-447.

221. Bragin A.G., Bohne A. The graft of the neocortex and hypocampus within barrel field of adult rats: the comparison of the morphological criteria of integration with the host brain // Rest. Neurol. Neurosci. -1989. suppl. 46-47.

222. Bragin A.G., Vinogradova O.S., Stafekhina V.S. Sensory deprivation prevents integration of neocortical grafts with the host brain // Rest. Neurol. Neurosci. 1992. - V.4. - P. 279 - 283.

223. Bretzel R., Ricordi C. Clinical islet transplantation // Diabetologia. -1997.-V.40.-P. B45-B46.

224. Brightman M.W., Reese T.S. Junction between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain I I J. Cell. Biol. 1969. - V.40. -P. 648-677.

225. Britton D.R. Ksir C., Yong D., Koob G.F. Brain norepinephrine depleting lesions selectively enhance behavioral responsiveness to novelty // Pysiology a. Behavior. 1984. - V.33. - P. 473-478.

226. Brown J., Danilovs J.A., Clark W.R., Mullen Y.S. Fetal pancreas as a donor organ// World J.Surg.- 1984.- V.8. P.152-157.

227. Browning H., Resnik R. Homologous and heterologous transplantation of pancreatic tissue in normal and diabetic mice // Yale J. Biol. Med. 1951.-V.24. -N 1. - P. 141-152.

228. Bures J., Petron M., Jackar I. Electrophysiological methods in biological research. Pragul. - 1967. - 695p.

229. Burton K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the calorimetric estimation of deoxyribonucleic acid // Biochem. J. 1956. - V.62. - P.315-323.

230. Butenko G.M., Tereshina O.P., Labunetz I.F., Magdich L.V. Stress and immune system in aging // Gerontologie und Geriatrie, Abst. Iyth European Congress of Gerontology. Berlin. - July 7-11, 1999. - P.l 17

231. Cai S., Zhan W., He Y. Effects of Fas-ligand expression on pancreatic islet allografts // Zhonghua. Wai Ke Za Zhi. 2001. - V.39. -N 8. - P.634-7

232. Castro A.J., Tonder N., Sunde N.A., Zimmer J. Fetal cortical transplants in the cerebral hemisphere of newborn rats a retrograde fluorescent analysis of connections // Exp. Brain Res. - 1987. - V.66. -N3.-P.533 -543.

233. Castro A.J., Tonder N., Sunde N.A., Zimmer J. Fetal neocortical transplants grafted to the cerebral cortex of newborn rats receive afferent from the basal forebrain, locus coeruleus and midline raphe // Exp. Brain Res. 1988. - V.69. - N3. - P.613-622.

234. Caterson I.B., Fuller S.J., Randle P.J. Effect of the fatty acid oxidation inhibitor 2-tetradecylglycidic acid on pyruvate dehydrogenase complex activity in slarved and alloxan diabetic rats // Biochem. J. - 1982. - V. 208. - N 1. - P. 53-60.

235. Chen J.J., Sun Y., Nabel GJ. Regulation of the proinflammatory effects of Fas-ligand (CD95L) // Science. 1998. - V.282. - N 27. - P.• 1714-1717.

236. Chevassus-An-Louis N., Rafiki A., Jorguera I. Neocortex in the hippocampus: an anatomical and functional study of CA1 heterotopiasafter prenatal treatment with methylazoxymethanol in rats // J. Comp. Neurol. 1998. - V.394. -N 4. - P.520-536.

237. Choi C., Benveniste E.N. Fas ligand/Fas system in the brain: regulator of immune and apoptotic responses // Brain Res. Rev. 2004. -V.44. - N1. - P.65-81.

238. Clare C.M., jr. Lee D.A. Prevention and treatment of the complications of diabetes mellitus // New England J. Med. 1995. - V. 332. - N 18. - P.1210-1217.

239. Collins I., Corder C. Aldose reductuse and sorbitol dehydrogenase of normal and diabetic rat lens // Invest. Opthalmol. Visual.Sci. 1977. -V.16.-N3.-P. 242-243.

240. Commins D. Axt K., Vosmer G. 5,6 dihydroxytryptamine, a serotonergic neurotoxin, is formed endogenously in the rat brain // Brain Res. - 1987. - V.403. - P. 7-14.

241. Connell C.J., Mercer K.Z. Freeze-fracture appearance of the capillary endothelium in the cerebral cortex of mouse brain // Amer. J. Anat. 1974. - V.140. - N 4. - P. 595-601.

242. Cooperstein S.J. The islets of Langerhans. New - York: - 1982. -P. 387-425.

243. Child C.G., Frey C.J., Frey W.J. A reppraisal of removal of ninety-five percent of the distal portion of the pancreas // Surg.Gynocol. Obstet. 1969. - V.129. - P. 49-56.

244. Cunha-Vaz J.G. Sites and functions of the blood-retinal barriers // The blood-retinal barriers ed. J.G. Cunha-Vaz. New -York and London. - 1980. - P. 101-117.

245. Dardenne M., Kelly P.A., Bach J.-F., Savino W. Identification and functional activity of prolactin receptors in thymus epithelial cells // Proc.Nath.Acad.Sci.USA. 1991. - V.88. - N 21. - P.9700-9704

246. Das G.D., Altman J. Transplanted precursors of nerve cells: their fate in the cerebellum of young rats // Science. 1971. - V. 173. - P. 637-638.

247. Das G.D., Altman J. Studies on the transplantation of developing neural tissue in the mammalian brain. I.Transplantation of cerebellar slabs into the cerebellum of neonate rats // Brain Res. 1972. - V.38. - N 2. - P.233 - 249.

248. Das G.D. Transplantation of cerebella tissue in the cerebellum of neonate rabbits // Brain Res. 1973. - V.50. - P. 170-173.

249. Das GD. Transplantation of embryonic neural tissue in the mammalian brain. I.Growth and differentiation of neuroblasts from various regions of the embryonic brain in the cerebellum of neonate rats // Life Sci. 1974. - V.4. - P. 93 - 124.

250. Das G.D. Development of neocortical transplants. In: Bjorklund A., Stenevi U., eds. Neural Grafting in the Mammalian CNS // Amsterdam. New York. Oxford: Elsevier. 1985. - P.101 - 123.

251. Date I. Parkinson's disease, trophic factors, and adrenal medullar chromaffin cell grafting: Basic and clinical studies // Brain Res. Bull. -1996.-V.40.-P. 1-19.

252. David E.R., Goetz F., Najarian J.S. Pancreas transplantation for diabetes//Lancet. 1988. -N 8594. - P. 1100-1101.

253. Davoren P.R. The isolation of insulin from a single cat pancreas // Biochem. Biophys. Acta. 1962. - V. 63. - N 2. - P. 150-153.

254. Deacon T.W., Pakzaban P., Isacson O. The lateral ganglionic eminence is the origin of cells committed to striatal phenotypes: Neural transplantation and developmental evidence // Brain Res. 1994. -V.668. -P.211 -219.

255. Del Cerro M., Yeh H.H., Marrerorodriguez A., Lazar E., del Cerro C. Intraocular transplantation of cell layers derived from neonatal rat retina // Brain Res. 1990. - V.534. - N 1-2. - P.25- 32.

256. Deller T., Frotscher M., Nitsch R. Morphological evidence for the sprouting of inhibitory commissural fibers in response to the lesion of the excitatory entorhinal input to the rat dentate gyrus // J. Neuroscience. 1995. - V.15. - N10. - P. 6868-6878.

257. Dexter TM. Stromal cell associated haemopoiesis // J. Cell Physiol. -1982. V.1.-P.87-94.

258. Dieterle C., Schmauss S., Hierl F. X., Illner W., Land W., Landgraf R. 10-years follow-up after successful pancreas transplantation // European Association for the Study of Diabetes. 38th annual meeting. Budapest, Hungary. 2002. - P. 43.

259. Djodjevic R., Brkic S.D., Micic D. Human fetal cell implantation in patients with IDDM // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreast". Vrnjacka Banja. - 1987. - Abstr. 31.

260. Djordjevic R., Heding L.G., Zamaklar M. Human fetal islet implantation in insulin dependent diabetics: changes in beta-cell function after implantation // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. - 1990. - Abstr. 33.

261. Dombrowski F., Klingmuller D., Pfeifer U.Insulinoma derived from hyperplastic intra-hepatic islet transplant // Am. J. Pathol. 1998.1. V.152. N 4. - P.1025-38.

262. Dorn A., Lorenz D., Koch G. Immunofluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Insulin und Glukagon in transplantirten isolierten1.ngerhansschen Inseln bei diabetischen Ratten und Hunden // Anat. Anz. 1977.-V.142.-№3. -P. 151-158.

263. Dorshkind K. Regulation of hematopoiesis by bone marrow stromal cells and their products // Annu. Rev. Immunol. 1990. - V.8. - P.l 11137.

264. Dufour J.M., Rajotte R.V., Kin T., Korbutt G.S. Immunoprotection of rat islet xenografts by cotransplantation with Sertoli cells and a single injection of antilymphocyte serum // Transplantation. 2003. - V.75. - N 9. - P. 1594-6.

265. Dufour J.M., Rajotte R.V., Seeberger K., Kin T., Korbutt G.S. Long-term survival of neonatal porcine Sertoli cells in non-immunosuppressed rats // Xenotransplantation. 2003. - V. 10. - N 6. -P.577-86.

266. Duke R. C., Newell E., Schleicher M., Meech S., Bellgrau D. Transplantation of cells and tissues Expressing Fas-ligand // Transplantation Proceedings. 1999. - V. 31. - P. 1479-1481.

267. Dunn E.H. Primary and secondary findings in a series of attempts to transplant cerebral cortex in the albino rat // J. Comp. Neurol. 1917. -V.27. - P. 565-582.

268. Dunn I., Mc. Letchie N., Sheehan H. Necrosis of islets of Langerhans produced experimentally // Lancet. 1943. - V.244. - N 6242. - P. 484-487.

269. Ebner F.F., Olschowka J.A., Jacobowitz D.M. The development of peptide-containing neurons with neocortical transplants in adult mice // Peptides. 1984. - V.5. - P. 103 - 113.

270. Efrat S. Genetically engineered pancreatic beta-cell lines for cell therapy of diabetes // Ann. N. Y. Acad. Sei. 1999. - V.875. - P.286-93.

271. Ehrlich P. Das Sauerstoffbedurfnis des Organismus // Fine farbenanalytische Studie. Berlin. - 1885. - P.69-73

272. Ehrlich P. Uber die Methylenblaureaction der lebenden Nervensubstanz // Dtsch. Med. Wochenschr. 1886. - V. 12. - N 4. -P.49-52.

273. Eliasson S. Properties of isolated nerve fibres from alloxanized rats // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1969. - V.32. - N 3. - P. 525-529.

274. Eloy R., Kedinger M., Haffen K., Grenier F. Role of embryonic chicken pancreas in the suppression of the diabetic state in the rat // Brit. J. Surg. 1978. - V.65. - N 5. - P. 368.

275. Eloy R., Haffen K., Kedinger M., Grenier J.F. Interest of endocrine embryonic tissue in transplantation immunology // Microsurgery. Proc. 5-th Int. Congr. Bonn. - 1978, Amsterdam-Oxford. - 1979. - P. 429432.

276. Falck B. Site of production of oestrogen in rat ovary as studied in microtransplants // Acta Physiol.Scand. 1959. - N47. - (Suppl. 63). -P.l-101

277. Farkas Gy, Karacsonyi S., Hodi M. Human embrionalis Langerhans-sziged szovettenyeszet klinikai tranplantalusa // Orvosi Hetilap. 1983. -V. 124.-N47- S. 2853-2856.

278. Easter S.S., Purves D., Rakic P. The changing view of neural specificity // Science. 1985. - N 230. - P.507-511.

279. Federlin K., Bretzel R.G. The effect of islet transplantation on complications in experimental diabetes of the rat // Word J. Surg. -1984,-N8.-P. 169-178.

280. Federlin K., Bretzel R. G., Hering B. Pancreatic transplantation in diabetes // Intern. J. Art. Organs. 1991. - V. 14. - N 2. - P. 74 - 77.

281. Federlin K. F., Jahr H., Bretzel R.G. Islet transplantation as treatment of type 1 diabetes: from experimental beginnings to clinical application // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2001. - №109. - Suppl. 2. - P. 373-383.

282. Feldman S.D., Scharp D.W., Lacy P.E., Ballinger W. F. Fetal pancreas isografts, cultured and uncultured to reverse streptozocin-induced diabetes mellitus // J. Surg. Res. 1980. - V.29. - № 4. - P. 309318.

283. Ferguson J., Scothorne RJ. Extended survival of pancreatic islet allografts in the testis of guinea-pigs // J. Anat. 1977. - V.124. - N 1. -P.1-8.

284. Ferguson J., Scothorne R.J. Furtcher studies on the transplantation of isolated pancreatic islet // J. Anat. 1977. - V. 124. - N 1. - P.9-20.

285. Ferner H. Anatomische Beziehungen zwischen exokrinen und endokrinen Pankreas. Disseminationsprobleme // Gastroenterol. Und Stoffwechsel Aktionen und Interaktionen. Baden-Baden - Brüssel. -1974.-P. 75-79.

286. Ferotti M., Toddei F., Mirabelli F., Vairetti M., Belomo G., McConkey D. and Orrenius S. Calcium-dependent DNA fragmentation in human synovial cells exposed to cold shock // FEBS Lett. 1990. -V.259. - P. 331-334.

287. Fielder A.R., Rahi A.U.S. Immunoglobulins of normal agueous humor// Trans. Ophthal. Soc. U. K. 1979. - V.99. - P. 120-125.

288. Finch D. R. A., Morris PJ. Passive enhancement of isolated pancreatic islet allografts // Transplantation. 1976. - V.22. - № 5. - P. 508-512.

289. Finch D. R. A., Morris P.J. The effekt of increasing islet numbers on survival of pancreatic islet allografts in immunosupressed diabetic rats // Transplantation. 1977. - V.23. - № 1. - P. 104-106.

290. Finch D. R. A., Wise P.H., Morris P.J. Successful intrasplenic transplantation of syngenic and allogenic isolated pancreatic islets // Diabetologia. 1977.-V.13.-N3.-P. 195-199.

291. Fine A. Human fetal tissue research: practice, prospects and poicy // Cell Transplanl. 1989. - N2. - P. 113 - 145.

292. Finsen B., Sorensen T., Gonzalez B., Castellano B., Zimmer J. Immunological reactions to neural grafts in central nervous system // Restorative Neurology and Neuroscience. 1991. - N 2. - P.271- 282.

293. Fontana A., Fierz W., Wekerle H. Astrocytes present myelin basic protein to encephalolitogenic T-cell lines // Nature. 1984. - V.307. -P.273-276.

294. Fujii M. Long distance transplant-to-host axon elongation without target differentiation // Neuroreport. 1993. - V.5. - N 2. - P. 161-164.

295. Gach D., Sladek J.R., Sladek C.D. Functional development of grafted vasopressin neurons // Science. 1980. - V.210. - P. 1367 -1369.

296. Garrity R.F., Somes G.W., Marx M.B. The relationship of personality, life change, psychophysiological strain and health status in a college population // Social. Sci. Med. 1977. - V.ll. - № 4 -P.257-263.

297. Garvey F.W., Millard P.R., Morris P.J. Experimental transplantation of fetal pancreas and isolated islets in the rat: studies of donor pretreatment and recipient immunosupression // Transplant.Proc. 1980. - Y.12. - № 4. - Suppl.2. - P. 186-189.

298. Gehrmann J., Matsumoto J., Kreutzberg G.W. Microglia: intrinsic immunoeffector cell of brain // Brain Res. Rev. 1995. - V.20. - N 3. -P.269-287.

299. Globerson A.R., Abel E.I, Ren-Menahem D. Developmental aspects of T-lymphocytes in aging // In: Goldstein A.L., ed. Biomedical Advances in Aging. New York, London: Plenum Press. - 1990. - P. 363-373.

300. Gonzales M.F., Sharp F.R., Loken J.E. Fetal frontal cortex transplanted to injured motor/sensory cortex of adult rats: reciprocal connections with host thalamus demonstrated with WGA-HRP // Exp. Neurol. 1988. - V.l. - P. 154 - 165.

301. Gores P.F., Hayes D.H., Copeland M.J., Korbutt G.S., Halberstadt C., Kirkpatrick S.A., Rajotte R.V. Long-term survival of intratesticular porcine islets in nonimmunosuppressed beagles // Transplantation. -2003.-V.75.-N5. -P.613-8.

302. Goto S., Yamada K., Yoshikawa M., Okamura A., Ushio Y. GABA receptor agonist promotes reformation of the striatonigral pathway by transplant derived from fetal striatal primordial in the lessened striatum // Exp. Neurol. 1997. - V.147. - P. 503 - 509.

303. Goya R.G., Takahashi S., Quigley K.L. Immune-neuroendocrine interactions during aging: age-dependent thyrotropin-inhibiting activity of thymosin peptides // Mech. Aging. Dev. 1987. - V.41. - N 2. -P.219-227

304. Goya R.G. Homeostasis, Thymus Hormones and Aging // Gerontology. 1999. - V.45. - N 3. - P. 174-178

305. Gray B.N., Watkins E. Isolated islet transplantation in experimental diabetes // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1976. - V. 54. - P. 57.

306. Gray B.N., Watkins E. Prevention of Vascular complication of diabetes by pancreatic islet transplantation // Arch. Surg. 1976. -V.lll. - N 3. - P 254-257.

307. Greene H.S.N., Lund P.K. The heterologous transplantation of human cancers // Cancer. Res. 1944. - V.2. - P. 352-360.

308. Greene H.S.N., Arnold H. The homologous and heterologous transplantation of brain and brain tumors // J. Neurosurg. 1945. - V.l 1.- N 4. P. 315-331.

309. Greene H.S.N. The use of transplanted tissue in biology and histology // In vivo techniques in histology/ed. Bourne G.H.- Boltimore.- 1967.-P. 80-112.

310. Griffit T.S, Brunner T., Fletcher S.M., Green .R., Fergusson T.A. Fas ligand induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. 1995. - V.270. - P.l 189-1192.

311. Haglund L., Kohler Ch., Haaparanta T., Goldstein M., Gustafson J. Presence of NADPH-cytochrome P450 reductase in central catecholaminergic neurons // Nature. 1984. - V.307. - P. 259-262.

312. Hahn H.J., Lucke S., Besch W., Kauert C. Effect of islet transplantation on the recipient endocrine pancreas // Biomed. Biochem. Acta. 1986. - V.44. - N 1. - P.137-142.

313. Hahn J.H., Laube F., Lucke S., Kloting I., Kohnert K.D., Warzock R. Toxic effect of cyclosporine on the endocrine pancreas of Wistar rats // Transplantation. 1986. - V.41. - P.44-49.

314. Hammerstrom L., Hellman B., Ullberg S. On the accumulation of alloxan in the pancreatic beta cell // Diabetologia. - 1967. -V.3. - № 3. - P. 340-345.

315. Hardikar A.A., Karandikar M.S., Bhonde R.R. Effect of partial pancreatectomy on diabetic statua in BALB/c mice // J. Endocrinol. -1999.-V.162.-P. 189-195.

316. Harrison D.E., Astle C.M., Delaittre J.A. Los of proliferate capacity in immunohemopoietic stem cells caused by serial transplantation rather than aging//J. Exp. Med. 1978. - V.147. - P. 1526-1531.

317. Hart D.N.I., Fabre Y.W. Demonstration and characterization of la-positive dendritic cells in the interstitial connective tissue of rat heart and other tissues, but not brain // J. Exp. Med. 1981. - V. 154. - P. 347361.

318. Hauser S.P., Allewelt M.C., Lipschitz D. A. Effects of myelotoxic agents on cytokine production in murine long-term bone marrow cultures // Stem. Cells. 1998. - V.16. - N 4. - P. 261-270

319. Herge O.D., Leonard R.J., Erlandsen S.L. Transplantation of islet tissue in the rat // Acta endocrinol. 1976. - V.83. - Suppl.205. - P.257-278.

320. Herge O.D., Leonard R.J., Rusin J.D., Lazarow A. Transplantation of the fetal pancreas: Quantitative morphological analyses of the islet tissue growth // Anat. Rec. 1976. - V. 185. - № 2. - P.209-221.

321. Hering B.J. Improved survival of single donor islet allograft in IDDM recipients by refined peritransplant management // Diabetes.1997. V.46. - Suppl.l. - P.64A.

322. Herman Z.S., Brus R., Slominska-Zurek J. Influence of 6-hydroxydopamine on the behavioral effects induced by apomorphine orclonidine in rats // Psych, pharmacology. 1976. - V.50. - № 1. - P.73-80.

323. Hiller W.F.A., Klempnauer J., Luck R., Steiniger B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation // Diabetes. 1991. -V.40. - №1. -P.134-140.

324. Hoffer B., Seiger A., Lundberg T., Olson L. Electrophysiological and cytological studies of brain grafts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo // Brain Res. 1974. -V.79.-N l.-P. 165-184.

325. Holmes G., Thompson J., Huh K., Stuart J., Carl G. Effects of neural transplantation on seizures in the immature genetically epilepsy-prone rat // Exp. Neurol. 1992. - V.l 16. - P. 52 - 63.

326. Hu Y.E., Gu Z.E, Zhang H.D. Islet transplantation in patients with type I diabetes in China // 1st Intern. Congr. on Pancreatic and Islet Transplantation. Stockholm. - 1988. - Abstr. 226.

327. Hu Y.E., Gu Z.E, Zhang H.D., Ye R.S. Fetal islet transplantation in China // Transplant. Proc. 1992. - V.24. - N5. - P.231-233

328. Hu Yuang Feng, Gu Zhi-feng, Zhang Hong-De, Ye Rong-Shao. Fetal islet transplantation // Diabetes. Proc. 13th Congr. Int. Diabetes Fed. Sydney- 20-25 Nov. 1988. Amsterdam etc. 1989. - P.725-728.

329. Hu Yuang Feng, Gu Zhi-feng, Zhang Hong-De. Fetal islet cell transplantation in China // Transpl. Proc. 1989. V.31. - №1. - P.2605-2607.

330. Huang E.P. Synaptic transmission: spillover at central synapses // Curr. Biol. 1998. - V.8. - N 17. - P. 613-615.

331. Isacson O., Deacon T. Neural transplantation studies reveal the brain's capacity for continuous reconstruction // Trends. Neurosci. -1997. V. 20. - N10. - P. 477-482.

332. Iversen L.L., Uretsky N.J. Biochemical effects or 6-hydroxydopamine on catecholamine-containing neurons in the rat central nervous system // In: "6-hydroxydopamine and Catecholamine neurons". 1971. - P. 171-186.

333. Jaeger C.B., Lund R.D. Transplantation of embryonic occipital cortex to the tectal region of the new born rat: A light microscopic study of organization and connectivity of the transplants // J. Comp. Neurol. -1980.-V. 194.-P. 571 597.

334. Jamamoto H., Ushigata J., Okomoto H. DNA strand breaks inpancreatic islets by in vivo administration of alloxan or streptozotocin // Biochem. Biophys. Res. Com. 1984. - V.103. - N 3. - P. 1014-1020.

335. Jankovski A., Rossi F., Sotelo C. Neuronal precursors in the postnatal mouse cerebellum are fully committed cells: Evidence from heterochronic transplantations // Eur. J. Neurosci. 1996. - V.8. - P. 2308 -2319.

336. Jindal R.M., Sidner R.A., Cummings O., Miller G.A., Filo R.S. Proliferation of rat ductal-epithelial cells in vitro, and in response to partial hepatectomy and pancreatectomy in vitro // Transplant. Proc. -1995.- V.27.-P.2991-2992.

337. Jonson G., Sacts Ch. On the mode of action of 6-hydroxydopamine // In: "Chemical Tools in Catecholamine Research". 1975. - V.l. - P. 41» 50.

338. Jorneskog G., Ostergren J., Tygen G. Does combined kidney and pancreas transplantation reverse functional diabetic microangiopathy // Transplant. Int. 1990. - V.3. -№ 3. - P. 167-170.

339. Kadish A.H., Litle R.L., Sternberg I.C. A new and rapid method for the determination of glucose by measurement of rate of oxygen consumption // Clinical. Chemistry. 1979. - V.14. - N 2. - P. 116-131.

340. Kasper M. Changesin the distributions of intermediate filamentes proteins and collagen in fetal and human pancreas // Histochemistry. -1991.-V.96.-P. 376-385.

341. Kaufman D.B., Morel Ph., Field M.J. Purified canine islet autografts: Functional outcome as influenced by islet number and implantation site // Transplantation. 1990. - V.50. - № 3. - P.385-391.

342. Kelly W.D., Lillehei R.C., Merkel F.K., Idezuki Y., Goetz F.C. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy // Surgery. 1967. - V.61. - N 6. - P. 827-837.

343. Kennedy W.R., Navarro X., Goetz F.C. Effects of pancreatic transplantation on diabetic neuropathy // N. Engl. J. Med. 1990. -V.322. - P. 1031-36

344. Kim B.-M., Han Y.-M., Shin Y.-J., Min B.-H., Park I.-S. Clusterin expression during regeneration of pancreatic islet cells in streptozotocin-induced diabetic // Diabetelogia. 2001. - V.44. -P.2192-2202.

345. Kin T., Rajotte R.V., Dufour J.M., Korbutt G.S. Development of an immunoprivileged site to prolong islet allograft survival // Cell Transplant. 2002. - V.l 1. - N 6. - P.547-52.

346. King H., Aubert RE., Herman W.H. Global burden of diabetes, 1995 2025: prevalence, numerical estimates, and projections // Diabetes Care. - 1998.-V.21.-P. 1414-1431.

347. Kittler E.L.W., Mc Grath H., Temeles D. Biologic significance of constitutive and subliminal growth factor production by bone marrow stroma// Blood. 1992. - V.79. - P.3168-3178.

348. Klassen H., Lund R.D. Retinal graft-mediated pupillary responses in rats: restoration of a reflex function in the mature mammalian brain // Neurosci. 1990. - V.l0. - P. 578 - 587.

349. Konigsrainer A., Dietze O., Habringer C. Morfology of acute rejection and corresponding cytological findings in exocrine secretion after pancreas transplantation in the rat // Transplantation. 1991. -V.52. - № 5. - P.770-777

350. Kopyov O.V., Jacques D., Lieberman A., Duma C.M., Rogers R.L. Outcome following intrastriatal fetal mesencephalic grafts for Parkinson's patients is directly related to the volume of grafted tissue // Exp. Neurol. 1997. - V.146. - P. 536-545.

351. Kordower J.H., Rosenstein J.M., Collier T.J. Functional fetal nigral grafts in a patient with Parkinson's disease: Chemoanatomic, ultrastructural, and metabolic studies // J. Comp. Neurol. 1996. -V.370. - P. 203-230.

352. Kostrzewa R.M., Garey R.E. Sprouting of noradrenergic terminals in rat cerebellum following neonatal treatment with 6-hydroxydopamine // Brain Res. 1977. - V.124. - № 2. - P. 385-391.

353. Krametz E.T., Greene H.S.N. Heterologous transplantation of neural tumors // Cancer. 1953. - N 6. - P. 100-110.

354. Krieger D.T., Gibson M.J. Correction of genetic gonadotropic hormone-releasing hormone deficiency by preoptic area transplants // In: Sladek J.R., Gash D.M., eds. Neural Transplants. New York: Plenum Press. 1984.-P. 187-203.

355. Krishnamurthi V., Philosophe B., Bartlett S.T. Pancreas transplantation: contemporary surgical techniques // Urol. Clin. North Am. 2001. - V.28. - N 4. - P.833-838.

356. Kromer L., Bjorklund A., Stenevi U. Intracephalic implants:A » technique for studying neuronal interaction // Science. 1979. - V.204.1. P. 1117-1119.

357. Kulikov A.V., Arkhipova L.V., Tretyak T.M., Bragin A.G. Serotonin and norepinephrine content in brain structures of rats with experimental and transplantation-compensated diabetes // J. Hirnforsch. 1986. -V.27. - № 5. - P. 495-499.

358. Kulikov A.V., Tretyak T.M. Insulin as signal molecule for monoaminergic system of the brain // Signal molecule and mechanisms of animal behaviour: Simp. Abstract. Pushchino. - 1989. - P.35-36.

359. Kulikov A.V., Sukhikh G.T., Smirnova G.N., Arkhipova L.V., Poltavtseva R.A., Korystov Yu. N., Shaposhnirjva V.V.

360. Transplantological models of compensation for pathologies related to endocrine deficiency and aging // 6 RFBR international conference "Molecular medicine". Abstracts. - Pushchino. - 2001. - P. 42.

361. Kullmann D.M., Asztely F. Extrasynaptic glutamate spillover in the hippocampus: evidence and implications // Trends. Neurosci. 1998. -V. 21. -N 1. -P. 8-14.

362. Labunets I.F. Age-related biorhythmical disfunction of the pineal gland, thymus and hypophysial-adrenal system in healthy subjects // Aging: immunology and infectious disease. 1996. - V.6. - N 3. - P. 167176.

363. Lacy P. E., Kostianovsky M. Method for the isolation of intact islets of Lancerhans from rat pancreas // Diabetes. 1967. - V. 16. - N 21. - P. 35 - 39.

364. Lacy P.E., Davie J.M., Finke E.H. The use of in vitro culture for prevention of immune rejection of the islets // Horm. and Metabol. Res. Suppl. Ser. 1982. - N 12. - P.27-33.

365. Lacy P.E. Status of islet cell transplantation // Diabetes Rev. 1993.- V.l. -P.76-92.

366. Lafferty K.J., Prowse S.J. Theory and practice of immunoregulation by tissue treatment prior to transplantation // World Surg. 1984. - V.8.- N 2. P. 187-197.

367. Lanza R.P., Ecker D.M., Kuhtreiber W.M., Marsh J.P., Ringeling J., * Chick W.L. Transplantation of islet using microencapsulation: studies indiabetic rodents and dogs // J. Mol. Med. 1999. - V.77. - N 1. - P.206-10.

368. Larsen J., Lane J., Mack-Shipman L. Pancreas and kidney transplantation // Curr. Diab. Rep. 2002. - V.2. - N 4. - P.359-64.

369. Lau H.T., Yu M., Fontana A., Stoeckert C.J. Prevention of islet allograft rejection With engineered myoblasts expressing Fas-L in mice //Scienc. 1996. - V.273. - P.109-112.

370. Laverty R., Taylor K. M. Effects of intraventricular 6-hydroxydopamine on rat behavior and brain catecholamine metabolism // Brit. J. Pharmacol. 1970. - V.40. - P.836-846.

371. Lavin N. Manual of Endocrinology and Metabolism. Boston/New York/ Toronto/London. 1994. - P. 759-824.

372. Lawrence J.M., Morris R.J., Wilson D.J., Raisman G. Mechanisms of allograft rejection in the rat brain // Neuroscience. 1990. - V.37. -P.431-462.

373. Lazarow A. Experimental diabetes // Oxford. 1954. - P. 10. Le Gros Clark W.E. Neuronal differentiation in implanted fetal cortical tissue // J. Neurol. Psychiat. - 1940. - V.3. - P. 263-272.

374. Lenzen S., Panten V. Alloxan: history and mechanism of action // Diabetologia. 1988. - V.31. - P. 337-342.

375. Lewis E.R., Cotman C.W. Mechanisms of septal laminated of the developing hippocampus revealed by outgrouwth of fibers from septal implants // Brain Res. 1980. - V. 196. - N2. - P. 307-330.

376. Lewis E.R., Cotman W. Neurotransmitter characteristic of brain grafts :strial and septal tissue from the same laminated input to the hippocampus // Neuroscience. 1983. - V.8. - N 1. - P. 57-66.

377. Li L., Seno H., Yamada I., Kojima I. Promotion of B-cell regeneration by betacellulin in ninety percent-pancreatectomy rats // J.

378. Endocrinol. 2001. - V.142. - P. 5379-5385.

379. Lindvall O. Neural transplantation: a hope for patients with Parkinson's disease // Neuroreport. 1997. - V.8. - III-IIX.

380. Lippert H., Lorenz D., Hahn H.J. Allogene transplantation isolierter Langerhansschen Inseln in die Leber diabetischer Hunde über Berücksichtigung immunologischer Aspekte // Z. Exp. Chir. -1983. -V.16. -№ 1. P.33-47.

381. Lipschitz D.A. Nutrition, aging and the immunhematopoietic system // Clin. Geriatr. Med. 1987. - V.3. - P.319-328.

382. Liu H. Eric, Kevan C.Hrold. Transplantation of the Islet of Langerhans: Hope for Treatment of Type 1 Diabetes Mellitus // Trends in Endocrin. and metab. 2000. - V.l 1. - N 9. - P.379-382.

383. Lowry O.H., Rosenbvough HJ., Farr A.L., Randall R.I. A protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol.Chem. 1951. -V.193.-N2.-P. 265-275.

384. Luthman J., Jonsson G., Archer T. Selective lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult stage // Behav. Brain Res. -1989. V.33.-P. 267-277.

385. Makinodan T., Kay M.M.B. Age influence on the immune system // Adv. Immunol. 1980. - Vol. 29. - P. 287-330.

386. Malik A., Yefimov A., Turchin I.S., Glebova L. The effect of xenotransplantation on lipid metabolism to type 1 diabetic patients // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. -1990. - Abstr.28.

387. Manchester K. Insulin and protein synthesis // Endocrin.pancreas and diabetes/- Amsterdam, Oxford. 1977. - P. 119-130.

388. Mason D.W., Charlton H.M., Jones A.J., Lavy C.B., Puklavec M., Simmonds S.J. The fate of allogeneic and xenogeneic neuronal tissue transplanted the third ventricle of rodents // Neuroscience. 1986. -V.19. - P.685-694.

389. Mathews M.A. Transplantation of fetal lateral geniculate nucleus to the occipital cortex: connectivity with host's area 17 // Exp. Brain Res. 1985.-N58.-P. 473-489.

390. May R.M. La greffe dans L oeil de rat blanc adulte du tiss cerebral de rat nouveaune // Archs. Anat. Microsc. Morph. Exp. 1930. - V.26. -P. 433-439.

391. May R.M. La greffe brephoblastigue intraoculaire ducervelet chez la Souris // Archs. Anat. Microsc. Morph. Exp. 1954. - V.43. - P. 42-56.

392. McEvoy R.C., Hegre O.D. Morphometric quantitation of the pancreatic insulin-, glucagon-, and somatostatin-positive cell populations in normal and alloxan-diabetic rats // Diabetes. 1977. -V.26. - № 12.-P. 1140-1146.

393. Me Evoy R.C., Leung P.E. Transplantation of fetal rat islet into the cerebral ventricles of alloxan-diabetic rats. Amelioration of diabetic by syngenic but not allogenic islets // Diabets. 1983. - V.32. - N 9. - P. 852-857.

394. Mc Rae-Degueurce A. Transplanted mesensephalic raphe neuronsrestore serotonin release in a denervated target area as revealed by invivo voltammetry // Abstracts E K Fernstrom Symposium "Transplantation in the mammalian CNS" Lund S. 1984. - P. 13.

395. Medawar P.B. Immunity to homologous grafted skin. Ill Fate of skin homografts transplanted to the brain, to subcutaneous tissue and to anterior chamber of eye //Brit. J. exp. Patch. 1948. - V.29. - P.58-69.

396. Mering J., Minkowski O. Diabetes mellitus nach Pancreas extirpation // Zbl. Klin.Med. 1889. - Bd 10. - S. 393-407.

397. Milenkovic L., Lyson K., Aguila M.C. Effect of Thymosin-al on Hypothalamic Hormone Release // Neuroendocrinology. 1992. - V.56. - N 5. - P.674-680

398. Miller R. Aging and immune system // Int. Rev. Cytol. 1991. - V. 124.-P. 187-216.

399. Millington G., Buckingam J.C. Thymic Peptides and Neuroendocrine-Immune Communications // J. Endocrinol. 1992. -V.133. - N 2. - P.163-169

400. Minkowski O. Weithere mittheilungen über der diabetes mellitus nach extirpation des Pancreas // Berl.Klin.Wochenschr. 1892. - V.29. -P. 90-94.

401. Morel P., Sutherland D.E.R., Almond P.S. Assessment of renal function in type I diabetic patients after kidney, pancreas or combined kidney-pancreas transplantation // Transplantation. 1991. - V.51. - P. 1184-89.

402. Muraille E., Pesesse X., Kuntz C., Erneux C. Distribution of the

403. SRC-homology-2-domain-containing inositol 5-phosphatase ship-2 in both nonhematopoietic and hematopoietic-cells and possibleinvolvement of ship-2 in negative signalling of B-cells // Biochemical Journal. 1999. - V.342. - P.697-705

404. Murata Y., Chiba T., Brundin P., Bjorklund A., Lindvall O. Formation of synaptic graft-host connections by noradrenergic locus coeruleus neurons transplanted into the adult rat hippocampus // Exp. Neurol. 1990. - V.110. - P. 258 - 267.

405. Murphy J.E., Sturm E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain // J. Exp. Med. 1923. - V.38. - P. 183-197.

406. Mrzljak L., Pappy M, Leranth C., et al. Cholinergic synaptic circuitry in the macaque prefrontal cortex // J. Comp. Neurol. 1995. -V.357. - N 4. - P.603-617.

407. Nagata S., Golstein P. The Fas death Factor // Science. 1995. -V.267. - P.1449-1456.

408. Nakajima Y., Nakano H., Nokagawa K., Segawa M., Shiratori T. Effect of total lymphoid irradiation on pancreatic islet xenografts survival in rats // Transplantation. 1982. - V. 34. - N 2. - P. 98-100.

409. Navarro X., Kennedy W.R., Loewenson R.B. Influence of pancreas transplantation on cardiorespiratory reflexes, nerve condition, and mortality in diabetes mellitus // Diabetes. 1990. - V.39. - P.802-806.

410. Neafsey E., Sorensen J., Tonder N, Castro A.J. Fetal cortical transplants into neonatal rats responds to thalamic and peripheral stimulation in the adult. An electrophysiological study of single-unit activity // Brain Res. 1989. - N493. - P.33-40.

411. Nicholas M.K., Antel J.P., Stefanson K., Arnason B.G.W. Rejection of fetal neocortical neural transplants by H-2 incompatible mice // J. Immunol. 1987. - V.139. - P.2275-2283.• 451. Nikolaidis P., Amin R.S, Hwang C.M, Mc Carthy R.M, Clark J.H,

412. Gruber S.A., Chen P.C. Related Role of sonography in pancreatic transplantation // Radiographics. 2003. -V.23. - N 4. - P.939-49.

413. Nishino H., Ohkita H., Fukamizu A. Prolongation of survival time of rat pancreatic islet allografts by tissue culture // Transplant. Proc. -1984. V.16. - N 6. - P. 1687-93.

414. Nornes H., Bjorklund A., Stenevi V. Transplantation strategies in spinal cord regeneration // Neural transplants: development and function/ ed. Sladek Y.R.H., Gast D.M. New York-Plenum. - 1984. -P. 407-421.

415. Nyakas C. Van Delft A.M.L. Behavioral and electrocortical activity in rats after neonatal intraventricular 6-hydroxydopamine administration // Pharmacol. Biochem. and Behav. 1975. - V.3. - P. 271-277.

416. Oblinger M.M., Hallas B.U., Das G.D. Neocortical transplants in the cerebellum of the rat: their affronts and efferent // Brain Res. 1980. -V.189.-Nl.-P. 228-232.

417. Oblinger M.M., Das G.D. Connectivity of neural transplants in adult rats: analysis of affronts and efferent of neocortical transplants in the cerebella hemisphere // Brain Res. 1982. - V.249. - N 1. - P.31- 49.

418. Odorico J.S, Sollinger H.W. Technical and immunosuppressive advances in transplantation for insulin-dependent diabetes mellitus // World J. Surg. 2002. - V.26. - N 2. - P. 194-211.

419. Olanow C.W., Freeman T.B., and Kordower J.H. Neural transplantation as a therapy for Parkinson s disease // Adv. Neurol. -1997. V.74. -P.249.

420. Onizuka K., Fukuda A., Kunimatsu M. Early cytopathic features in rat ischemia model and reconstruction by neural graft // Exp. Neurol.1996. V.137.-P. 324-332.

421. Orland M.J., Permutt M.A. Quantitative analysis of pancreatic proinsulin m RNA in genetically diabetic (db/db) mice // Diabetes. -1987. V.36. - N 3. - P. 341-347.

422. Perlow M. F., Freed W.F., Hoffer B.I., Seiger A., Olson L., Wyatt R.Y. Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system // Science. 1979. - V.204. - P. 643 -647.

423. Pirson Y., Squifflet J.P. La transplantation combines reinpancreas: quell prix, quell benefices, and quell beneficiaries? // Press. Med.1997. -V.26. № 19. - P.905-907.

424. Pipeleers D.G., Schit F.C. Interplay of nutrients and hormones on the regulation of insulin release // Endocrinology. 1985. -V.117. - N3. -P. 824-833.

425. Plumet J. Fetal cortical transplants reduce motor deficits resulting from neonatal damage to the rat's frontal cortex // Neurosci. Lett. -1990. V.109. - N 1-2. - P. 102 - 106.

426. Podolsky S., Viswanathan M. Secondary diabetes. The spectrum of the diabetic syndromes // New York. Reaven Press. 1980. - 602 p.

427. Powell C.S., Lindsey N.J., Nolan M.S., Wiley K.N., Boyle P.F., Herold A., Beck S., Fox M. The value of urinary anneals as marker early pancreatic allograft rejection // Transplantation. 1987. - V.43. - N 6.-P. 921-923.

428. Pyke D. A. A critique of pancreas transplantation // Clin. Transplant. 1990. - V.4. - N 4. - P. 235 - 237.

429. Qian H., Atherton S. Apoptosis and increased expression of Fas ligand after uniocular anterior chamber (AC) inoculation of HSV-1 // Curr. Eye Res. 2003. - V.26. - N 3-4. - P. 195-203.

430. Raghupathy R., Khan S.F., Syamasundar P.V., Bansal P., Azizieh F. A Placenta-derived suppressor factor with a T-cell bias // American journal of reproductive immunology. 1999. - V.42. - № 4. - P. 205218.

431. Rahi A.H.S. Immunopathology of the eye // Neuroimmunology/ ed. P. Behan and F. Spreafico. New - York. - Paven Press. - 1984. - P. 415-431.

432. Raju S., Grogan J.B. Immunology of anterior eye chamber of the eye // Trans. Proc. 1971. - N 3. - P.605-608.

433. Ramsey R.C., Goets F.C., Sutherland D.E.R. Progression of diabetic retinopathy after pancreas transplantation for insulin-dependent diabetes mellitus //N. Engl. J. Med. 1988. - V.318. -N 1. - P.208-211.

434. Raisman G., Ebner F.F. Mossy fiber projections into and out of hippocampal transplants // Neurosci. 1983. - N 9. - P.783-801.

435. Raisman G., Morris R.J., Zhou C.F. Specificity in the reinervation of adult hippocampus by embryonic hippocampal transplants // Progr. Brain Res. 1987. - N71. - P. 325-333.

436. Reese T.S., Karnovsky M.J. Fine structural localization of blood-ocular to exogenous peroxidaze // J. Cell Biol. 1967. - V.34. - N 1. - P. 207-212.

437. Reintgen D. S., Feldman J.M. Vervaert C.E., Segler H.F. Transplantation of insulinoma into the diabetic Syrian hamster // Ann. Surg. 1980.-V.191.-P.105.

438. Remuzzi G., Ruggenenti P., Mauer S. M. Pancreas and kidney/pancreas transplants experimental medicine or real improvement? // Lancet. 1994. - Jan 1. - V. 343. - Issue 8. - P. 27-31

439. Ribotta MG.Y., Roudet C., Sandillon F., Privât A. Transplantation of embryonic noradrenergic neurons in two models of adult rat spinal cord injuiy: Ultrastructural immunocytochemical study // Brain Res. 1996. -V.707. - P. 245 -255.

440. Richards S.J., Raisman G. Transplantation of vasopressin rich, embiyonic tissue into the Brattleboro rat // Abstracts E K Fernstrom Symposium "Transplantation in the mammalian CNS" Lund S 1984. -P.19

441. Ricordi C., Lacy P., Finke E. H. An automated method for the isolation of human pancreatic islets // Diabetes. 1988. - N37. - P. 413.

442. Ricordi C., Lacy R.E., Scharp D.W. Automated islet isolation from human pancreas // Diabetes. 1989. - V.38. - Suppl. I. - P. 140-142.

443. Ricordi C., Stanzl T.E. Cellular transplant // Transpl. Proc. 1991. -V.23. - № 1. - P.73-74.

444. Ricordi C., Tzakis A., Carroli P.B. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases // Transplantation. 1992. -V.53.-N2.-P. 407-414.

445. Righardt M., Menden A., Bretzel R.C., Kederlin K. Islet transplantation in experimental diabetes of the rats. B-cell restorationfollowing islet transplantation. Preliminary results // Hormone and Metab.Res. 1984. - N 10. - P. 551-552.

446. Robertson R. P., Sutherland D. E. R. Pancreas transplantation as therapy for diabetes mellitus // Annu. Rev. Med. 1992. - V.43. - P.395 -415.

447. Robertson R.P, Davis C., Larsen J., Stratta R., Sutherland D.E. Pancreas transplantation for patients with type 1 diabetes // Diabetes Care. 2003. - V.26. - Suppl 1. - P. 120.

448. Rocha A.F. The brain as symbol-processing machine // Progr. Neurobiol. 1997. - V.53. - N 2. - P. 121-198.

449. Rosental R.L., Ilyinsky I.M. Islet cell transplantation in diabetic patients with purulent septic complications // 1st Intern. Congr. On Pancreatic and Islet Transplantation. Stockholm. - 1988. - Abstr. -P.223.

450. Rosental R.L., Leinieks A., Ilyinski I.M., Bicans Y.B. Clinical improvement after islet cell transplantation in diabetes mellitus patients // 3 rd Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". -Vrnjacka Banja. 1989. - Abstr. - P.30.

451. Rossini A. A., Greiner D. L., Mordes J. P. Induction of immunologic tolerance for transplantation // Physiol. Rev. 1999. - V.79. - N 1. -P. 107, 110-112.

452. Rubin R.J., Altman W.M., Mendelson D.N. Health care expenditures for people with diabetes mellitus, 1992 // J. Clin. Endocrinol. Metab. -1994. V.78. - N 4. - P. 809A-809F.

453. Sachs C., Jonsson G. Developmental changes of the neurotoxic action of 6-hydroxydopamine on ventral noradrenaline neurons // Acta. Physiol. Scand. 1973. - V.89. - Suppl. 396. - P. 53.

454. Saltykow S. Versuche uber Gehirnreplantation, zugleich lin Beitrag zur Kenntniss reactiver Vorgange an den zelligen Qehirnelementen // Arch.Psychiat.Nerwenkrankh. 1905. - V.40. - P. 329-388.

455. Sanberg P.R, Borlongan C.V, Saporta S., Cameron D.F. Testis-derived Sertoli cells survive and provide localized immunoprotection for xenograft in rat brain // Nature Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 16921695.

456. Sandler S., Andersson A. Islet implantation into diabetic mice with pancreatic insulitis // Acta patol. Et microbiol. Scand. 1981. - V.89. -№22.-P.107-112.

457. Saporta S., Sanberg P.R, Borlongan C.V, Othber R.C, Cameron D.F. The testis-derived cultured Sertoli cell as a natural Fas-L secreting cell for immunosuppressive cellular therapy // Cell Transplant. 1997. - V.6. - N 2. - P.191-193.

458. Sasaki H., Coffey P., Villegas-Perez M.P. Light induced EEG desynchronization and behavioral arousal in rats with restored retinocollicular projection by peripheral nerve graft // Neurosci. Lett. -1996.-V.218.-P. 45-48.

459. Scharp D. W., Lacy P.E., Santiago J.V. Insulin independence after islet transplantation into type 1 diabetic patients // Diabetes. 1990. -V.30.-N4.-P.515-518.

460. Scharp D.W., Lacy RE., McCullough C Intraportal human islet transplantation // XIII Intern. Congr. of Transplant. Soc. San Francisco. - 1990. - P. 114.

461. Scharp D.W, Lacy P.E., Santiago J. et al. Results of our first nine intraportal islet allografts in type 1, insulin-dependent diabetic patients //Transplantation. 1991. - V.51. - P. 76-78.

462. Schmidt C.J., Lovenberg W. In vitro demonstration of dopamine uptake by neostriatal serotonergic neurons of the rat // Neurosci. Lett. -1985. V.59.-P. 9-14.

463. Schmidt R.E. Der alloxandiabetes. Morphologie, Chemismus und Literatur//Haransg. K.Mothes.Leipzig. 1967. - Bd. 1. - S.142-149.

464. Schochet S.S. The physiology of ovulation //Surg. Obst. Gynecol. -1920. -N31. -P.148-149.

465. Schnitzer I., Schachner M. Expression of Thy-1, H-2, and NS-4 surface antigens and tetanus toxaid receptors on early post-natal and adult mouse cerebellum // J. Neuroimmunol. 1981. - V.l. - P. 429456.

466. Schober W. The rat cortex in stereotaxic coordinates // J. Hirnforschung. 1986. - V.27. - N 2. - P. 121 137.

467. Schravedik C.F.H., Foriers A. Pancreatic hormone receptors on islet cells // Endocrinolgy. 1985. - V.l 17. - N 3. - P. 841-848.

468. Schwartz S. S., Herwitz D.L., Zehfus B. Use of a glucose controlled insulin infusion system (artificial beta cell) to control diabetes during surgery // Diabetologia. 1979. - V.16. - N 3. - P.l57-164.

469. Seiden L.S., Vosmer G. Formation of 6-hydroxydopamine in caudate nucleus of the brain afte a single dose of methylamphetamine // Fharmacol. Biochem. Behav. 1984. - V.21. - P. 29-31.

470. Seiger A., Olson L. Quantitation of fiber growth in transplanted central monoamine neurons // Cell Tissue Res. 1977. - V.179. - P. 285 -316.

471. Selawry H.P., Wittington K. B. Extended allograft survival of islets grafted into intra-abdominally placed testis // Diabetes. 1984. - V.33. -N 4. - P.405-406.

472. Selawry H. P., Wang X., Allouch L. Sertoli cell-induced defects on functionsl and structural characteristics of isolated neonatal porcine islets // Cell Transplant. 1996. - V.5. - N 5. - P.517-524.

473. Selles R., Brynger H. Progress in pancreatic transplantation // Lancet. 1987. - N 8540. - P. 1024-1025.

474. Senoh S., Creveling C.R., Udenfriend S., Witkor B. Chemical. Enzymatic and metabolic studies on the mechanism of oxydation of dopamine // J. Amer. Chem. Soc. 1959. - V.81. - P.6236-6240.

475. Shetty A.K., Turner D.A. Development of fetal hippocampal grafts in intact and lessened hippocampus // Prog. Neurobiol. 1996. - V.50. -P.597 - 653.

476. Shetty A.K., Turner D.A. Development of long-distance efferent projections from fetal hippocampal grafts depends upon pathway specificity and graft location in kainate-lesioned adult hippocampus // Neurosci. 1997. - V.76. - P. 1205 - 1219.

477. Shetty A.K., Turner D.A. Fetal hippocampal cells grafted to kainate-lesioned CA3 region of adult hippocampus suppress aberrant supragranular sprouting of host mossy fibers // Exp. Neurol. 1997. -V.143.-P. 231 -245.

478. Sorensen J., Wanner-Olsen H., Tonder N., Danielsen E., Castro A.J., Zimmer J. Axotomized, adult basal forebrain neurons can innervate fetal frontal cortex grafts: a double fluorescent tracer study in the rat // Brain Res. 1990. - N81. - P.545-551.

479. Shin D.H., Lee E., Kim H.J., Kim S., Cho S.S., Chang K.Y., Lee WJ. Fas ligand mRNA expression in the mouse central nervous system // J. Neuroimmunol. 2002. - V.123. - N 1-2. - P.50-57.

480. Shirai Y. Transplantation of rat sarcoma in adult heterogeneous animals // Jap.med.World. 1921. - V.l. - P. 14-15.

481. Shumakov V.I., Ignatenko S.N., Blyumkin V.N. The principal results of pancreatic islet cell culture transplantation in diabetes mellitus patients // Transplant. Proc. 1987. - V. 19. - N 1. - P.2372.

482. Shumakov V.I., Ignatenko S.N., Skaletsky N.N. Treatment of diabetic polyneuropathy by allotransplantation of islet cell culture // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Vrnjacka Banja. - 1987. - Abstr.39.

483. Shumakov V.I. The effect of clinical transplantation of fetal islet cell cultures on the late diabetic complications // Diabetes. 1989. - V.38. -Suppl.l. - P. 316.

484. Shumakov V.I., Bljumkin V.N. The problem of free pancreatic cell transplantation: the principal results, hypotheses // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. - 1990. - P.22.

485. Sievers J., Klemm H. P., Jenner S., Baumgarte H.G., Berry M. Neuronal and extraneuronal effects of intracisternally administered 6-hydroxydopamine on the developing rat brain // J.Neurochem. 1980. -V.34. - № 4. - P.765-771.

486. Simeonovich Ch.J., Bowen K.M., Kotlarsky I., Lafferty K.J. Modulation of tissue immunogenicity by organ culture // Transplantation. 1980. - N 3. - P. 174-179.

487. Singh B., De Champlain J. Altered ontogenesis of central noradrenergic neurons following neonatal treatment with 6-hydroxydopamine // Brain. Res. 1972. - V.48. - P.432-437.

488. Slovesnova T.A., Glukhoded S.V, Skaletsky N.N., Ignatenko S.N. Course of proliferate diabetic retinopathy // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Vrnjacka Banja. - 1987. - P. 40.

489. Snell G.D. The homograft rejection // Annu. Rev. Microbiol. -1957. -* V.l 1. P.439-458.

490. Sobotka H., Luisado-Opper A. Alloxan in blood plasma before and after injection of glucose // Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 1954. - V.85. -N3.-P. 482-483.

491. Sommer C., Bele S., Kiessling M. Expression of cerebellar specific glutamate and GABAA receptor subunits in heterotopic cerebellar grafts // Dev. Brain Res. 1997. - V.102. - P. 225 - 230.

492. Soria B., Roche E., Berna G., Leon-Quinto T., Reig J.A., Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice // Diabetes. 2000. -V.49. - P. 157-162.

493. Spemann H., Mangolg H. Uber induktion von embrionalanbagen durch implantation artfrember organizatoren // Arch. Microsk. Anat. Entwichlings. Mtch. 1924. - V.100. - P.599 - 638.

494. Stafekhina V.S., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Integration of hippocampal suspension grafts with host neocortex // Neurosci. 1995. -V.64. - P. 643-651.

495. Steinberg R.H., Milledr S. Aspect of electrolyte transport in frog pigment epithelium // Exp. eye research. 1973. - V. 16. - N 2. - P. 365372.

496. Stern L., Gautier R. Recherches sur le leagued cephalo-rachidion, les repports entre le liguide cephalo-rachidien et la circulation sanguine // Arch. Internat. Physiol. 1921. - V. 17. - P. 138-143.

497. Sun A. V., Coddling J.A., Haist R.A. Astady of glucose tolerance and insulin response in partially depancreatectomised dogs // Diabetes. -1974. V.23. - N 5. - P. 424-432.

498. Sunde N., Zimmer J. Cellular, histochemical and connective organization of the hippocampus and fascia dentata transplanted to different regions of immature and adult rat brains // Dev. Brain Res. -1983.-V.8.-N 2-3.-P.165- 191.

499. Sutherland D.E.R. Pancreas and islet transplantation. Experimental studies // Diabetologia. 1981. - № 2. - P. 161-181.

500. Sutherland D.E.R., Kendall D.M., Moudry K.C. Pancreas transplantation in nonuremic, type I diabetic recipients // Surgery. -1988. V.104. -P.453-04.

501. Sutherland D.E.R. Is there a need for pancreas transplantation? // Transpl.Proc. 1993. - V.25. - № 1. - P.47-50.

502. Sutherland H.J., Hogge D.E., Eaves C.J. Growth factor regulation of the maintenance and differentiation of human long-term culture-initiating cells (LTC-IC) // Leukemia. 1993. - V.7. - Suppl 2. - S.122-S125

503. Tarricone B.J., Simon J.R., Li Y.J., Low W.C. Neural grafting of cholinergic neurons in the hippocampal formation // Behav. Brain Res. -1996.-V.74.-P.25-44.

504. Tassin J.P., Velley L., Blanc C., Thieny A.M. Development of cortical and nigro-neostriatal dopaminergic systems after destruction of central noradrenergic neurones in foetal or neonatal rats // Brain Res. -1975. V.83. - № 1. - P.93-106.

505. Thierry A.M. Velley L., Blanc C., Tassin J.P. Development of the mesocortical and nigrostriatal dopaminergic systems following various 6-hydroxydopamine treatments // In: "Chemical Tools in Catecholamine Research". 1975. - V.l. - P. 205-210.

506. Thomas W.E. Brain macrophages: evaluation of microglia and their functions // Brain Res. Rev. 1992. - V. 17. - N 1. - P.61-74.

507. Thompson J.S., Robbins J., Cooper J.K. Nutrition and immune functionin the geriatric population // Clin. Geriatr. Med. 1987. - V.3. -P.309-317.

508. Thompson W.G. Successful brain grafting // N. Y. Med. J. 1890. -V.51.-P. 701-702.

509. Thomson N. M., Hancock W. M., Lafferty K. J. Organ culture reduces la-positive cells present within the human fetal pancreas // Transp. Proc. 1983.-V.15.- N 1. - Book 2. - P.1373-1376.

510. Tipson R., Ruben J. On the possible presence of alloxan in normal animal tisues an fluids // Arch.Biochem. 1945. - V.l. - N. 8. - P. 1-6.

511. Towita T., Watanabe I. The effect of alloxan on the permeabity of isolated pancreatic islets to horseradich peraxidase // Virchows. Arch. -1976. Bd.22. - N 3. - S. 217-232.

512. Triarhou L.C. The cerebellar model of neural grafting: Structural integration and functional recovery // Brain Res. Bull. 1996. - V.39. -P.127 - 138.

513. Tzakis A., Ricordi C, Alejandro R. et al. Pancreatic islet transplantation after upper abdominal exenteration and liver replacement // Lancet. 1990. - V. 336. - P.402-406.

514. Tze W.J., Tai J., Wong F.C. In vitro culture a method of pancreatic islet preservation for transplantation // Metab. Clin. Exp. 1980. - V.29. -Nil.-P. 1020-1025.

515. Tze W.J., Tai J. Successful inracerebral allotransplantation of purifed pancreatic endocrine cells in diabetic rat // J. Amer. Diet. Assoc. 1983. - V.32. - N 12. - P. 1185-1187.

516. Tze W.J., Tai J. Prolongation of islet allografts in non-immunosupressed rat recipients // Metab. 1983. - V.32. - № 3. - P. 228-231.

517. Tze W.J., Tai J. Intracerebral allotransplantation of purified pancreatic endocrine cells and pancreatic islet in diabetic rats // Transplantation. Baltimore. - 1984. - V.38. - N 2. - P. 107-111.

518. Tze W.J., Tai J. Allotransplantation of dispersed single pancreatic endocrine cells in diabetic rats // Diabetes. 1988. - V.37. - P.383-392.

519. Tze W.J., Tai J. Immunological studies in diabetic rat recipients with pancreatic islet cell allograft in the brain // Transplantation. -1989. V.47. - N 6. - P. 1053-1056.

520. Ugrumov M.V., Proshlyakova E.V., Sapronova A.Y., and Popov A.P. Development of the mesencephalic and diencephalic catecholaminergic systems in human fetuses: uptake and release of catecholamines in vitro //Neurosci. Lett. 1996. - V.212. - P.29.

521. Uretsky N.J., Iversen L.L. Effects of 6-hydroxydopamineen on adrenaline-containing neurons in the rat brain // Nature. 1969. - V.221. -P. 537-559.

522. Van Dooremaal J.C. De ontwikkeling van lovende weefsels op vreenden boden geent // Onderzoekimgen gedaan in het physiologisch laboratorium der utrechtsche hoogeschool. 1873. - V.3. - RII. - P. 277290.

523. Vetulani J. Reichenberg K., Wisnikovska G. Asymmetric behavioral and biochemical effects of unilateral injections of 6-hydroxydopamine into lateral brain ventricle of the rat // Eur J.Pharmacol. 1972. - V.19. -№2.-P. 231-238.

524. Wahren J., Johansson B.L., Wallberg-Henriksson H. Does C-peptide have aphisiological role? // Diabetologia. 1994. - № 37. - Suppl 2. -P.99-107.

525. Wahren J. C-peptide revisited new physiological effects and therapeutic implications // Intern. Med. - 1996. - V.240. - N 3. - P.l 15 -124.

526. Wahren J. New aspects of Cpeptide phisiology // Hormon and metabol. res. 1998. - V.30. - N 1. - P.2-4

527. Walford R.L. The Immunological Theory of Aging // Copenhagen: Muksgaard. 1969. - 338 p.

528. Weber C., Weil R., Mc Intosh R., Hogle H., Warden G., Reemsma K. Xenonotransplantation of piscine islet into hyperglycemic rats // Surgery. 1975. - V.77. - N 2. - P. 208-215.

529. Wexler B., Sangrey D. Good versus moderate regulation of alloxan-inducet diabetes in arterioscleroti and non-arteriosclerotic rats // Diabetologia. 1980. - V.19. - N.3. - P. 242-249

530. Whitmore W. F., Gittes R. F. Intratesticular grafts: the testis as an exceptional immunologically privileged site // Trans. Am. Assoc. GU Surgeons. 1979. - V.70. - P.76-80.

531. Winder H., Brundin P. Immunological aspect of grafting in the mammalian central nervous system. Arevien and speculative synthesis // Brain.Res.Rew. 1988. - V.13. - N 3. - P. 287-324.

532. Widner H. Immunological aspects of intracerebral CNS tissue transplantation // Basic and clinical aspects of neuroscience. 1993. -V.5. - P.63-74.

533. Wittington K.B., Solomon S.S., Lu Z.N., Selawry H.P. Islet allografts in thecryptorchid testes of spontaneously diabetic BB/Wor dp rats: response to glucose, glipizide, and arginine // Endocrinology. -1991. V.128. - N 6. - P. 2671-2677.

534. Wohler F., Liebig J. Untersuchungen zur natur der harnsaure // Ann. Pharm. 1838. - V.26. - P. 241-340.

535. Yurek D.M., Lu W., Hipkens S., Wiegand S.J. BDNF enhances the functional reinnervation of the striatum by grafted fetal dopamine neurons // Exp. Neurol. 1996. - V. 137. - P. 105 - 118.

536. Zatz M.M., Goldstein A.L. Thymosins, lymphokines and the immunology of aging // Gerontology. 1985. - V.31. - P.263-277.

537. Zhang W., Lee W.H., Triarhou L.C. Grafted cerebellar cells in a mouse model of hereditary ataxia express IGF-I system genes and partially restore behavioral function // Nature Med. 1996. - V.2. - P. 65 -71.

538. Zhao H., Sun X., Ding Q., Zhang Y. Experimental study of Sertoli cell and CTLA-4Ig's induction of immune tolerance of allogeneic renal cell // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2002. - V.40. - N 4. - P.259-64.

539. Zhao Y., Swenson K., Sergio J.J. Skin graft tolerance across a discordant xenogeneic barrier // Nature Med. 1996. - V.2. - P. 12111214.

540. Zhao Y., Fishman J.A., Sergio J.J. Immune restoration by fetal pig thymus grafts in T-cell-depleted, thymectomized mice // J.Unmunol. -1997. V.158. - P.1641-1646.

541. Zhou W., Raisman G., Zhou C. Transplanted embryonic entorhinal neurons make functional synapses in adult host hippocampus // Brain Res. 1998. - V.788. - N1/2. - P.202-206.

542. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. Giantic mossy fiber synapses in the host neocortex and in the grafts of isolated dentate fascia: problem of the contact specificity // Ibid. 1991. - P. 47-48.

543. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. Intracortical dentate fascia grafts: mossy fiber synapses in the host neocortex // J. Neural. Transpl. & Plasticity. 1994. - V.5. - N 3. - P. 169-182.

544. Ziegler A.G., Standi E. Typ-I-Diabetes mellitus: Immunopathogeneseund chancen einer primaren immunotherapie // Med. klin. 1987. - V.82. - P. 796-800.

545. Straus W. Imidazoloincreasis the sensytivity of Ihe cytochemy reaction for peroxidaze with diamynobenzidine at are neutral pH // JHystochemCytochem. -1982. -V. 30. №5. - P. 491-493.

Информация о работе

Куликов, Александр Владимирович
доктора биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Экспериментально вызванные патофизиологические состояния и их компенсация методами биоинженерии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы