Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе

Латюшин, Ян Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе"

На правах рукописи

Латюшин Ян Витальевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫХ АДАПТАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В СИСТЕМЕ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ГИПОКИНЕТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск 2010

004605054

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» и ФГУ «Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук».

Научный консультант: Павлова Вера Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Ковалъчук Людмила Ахметовна

доктор биологических наук, профессор Пряхин Евгений Александрович доктор биологических наук Сашенков Сергей Львович доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук.

Защита состоится «25» июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. им. Ленина, д. 69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный педагогический университет».

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

П. А. Байгужин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследования гипокинезии как стресс-фактора началось в 60-70-годы XX века в связи с активным развитием космической биологии (В.В. Португалов, 1967; Г.П. Быков, 1970; И.В. Федоров и др., 1972; С.Е. Ли, О.И. Кириллов, 1974; Е.А. Коваленко, 1975). Экспериментальные работы 80-90-ых годов прошлого века характеризовались изучением адаптационных изменений на различных уровнях организации биологических систем (Е.А. Коваленко, H.H. Гуровский, 1980; П.Д Горизонтов, 1983; В.Н. Швец и др., 1984; С.М. Иванова и др., 1986; ДЗ. Шибкова, 1987; Ф.З. Меерсон, H.A. Фомин, В. И. Павлова, Д.З. Шибкова, 1988; И.А. Попова, 1988; ДИ. Бельченко, 1990).

В работах Е.А. Воротниковой (1984), О.Г. Газенко и др. (1986), Ф.З. Меерсона и др. (1988), P.A. Тгараняна (1990), А.Г. Грицука (1995), Е.А. Коваленко (2000), Т. Kawata et. al. (1988) длительная гипокинезия являлась моделью, при которой реализуются резервные механизмы адаптации организма на морфо-функциональном, биохимическом и генетическом уровне (Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1998).

В исследованиях Б.И. Кузника, H.H. Цыбикова (1981), ДН. Маян-ского (1991), В.П. Акопяна, JI.C. Баляна и до. (1997) показано, что, попав в экстремальные условия, организм мобилизует различные адаптационные программы, достигая полноценного приспособления к стрес-сирующим факторам внутренней и внешней среды.

В настоящее время известно, что система крови играет большую роль при ответной реакции организма на любое стрессорное воздействие (И.А. Волчегорский, 1993; Н.В. Васильев, Ю.М. Захаров, Т.И. Коляда, 1992; Е.Д. Гольдберг и др., 2005; П.Д. Горизонтов и др., 1983; A.M. Дыгай и др., 2005; В.П. Шахов и др., 2008; В.Э. Цейлик-ман, 1998; Б.Г. Юшков и др., 1996; А.П. Ястребов и др., 2009;

B.А. Черешнев и др., 2004,; ДЗ. Шибкова, A.B. Аклеев, 2006,

C. Л Сашенков и др., 2006, 2008).

го, травматического и прочих стрессов. При действии стресса вся регулирующая информация идет от нервной системы через гипофизар-но-адреналовую, лимфоидную систему и гемопоэтические органы. Существенно, что весь этот процесс реализуется на уровне исполнительных тканей и органов (P.M. Хаитов, 2001; Ю.Б. Лишманов и др., 2003; A.C. Симбирцев, 2004).

Очевидно, что общий адаптационный синдром развивается на фоне перестройки активности локального микроокружения, в построении которого большую роль играют стромальные элементы и цитокины (Б.Г. Юшков, В.Г. Климин, М.В. Северин, 1999, В.П. Шахов и др., 2005, 2008).

В настоящее время разрабатываются новые схемы восстановления гемопоэза. Особая роль принадлежит мультипотентным мезенхималь-ным стромальным клеткам (ММСК). Они способствуют росту гемопо-этических предшественников путем секреции таких цитокинов, как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15 (И.Ю. Маклакова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании специфического микроокружения многих органов, включая и костный мозг. Они являются основой матричной единицы, так называемых «ниш», в которых происходят процессы хранения, созревания и дифференцировки предшественников эритропоэза, гранулоцитомонопоэза, тромбоцитопоэза и их малодиффе-ренцированных прекурсов (A.M. Дыгай, В.П. Шахов, 1989; Ю.А. Романов и др., 2005; Beyer et. al., 2006; L.M. da Silva et al, 2008; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000, 2006).

Исследований взаимодействия системы мезенхимопоэза и цитоки-новой сети при хроническом стрессе крайне мало. Имеются противоречивые сведения об уровнях содержания цитокинов и костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом стрессе, вызванном гипокинезией (И.Л. Чертков, O.A. Гуревич, 1984; A.C. Симбирцев, 2004; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000; Y. Miura, Z. Gao, M. Miu, 2006).

1990; С.Н. Теплова, Д.А. Алексеев, 2002). По-прежнему остаются открытыми вопросы коррекции повреждающего действия гипокинезии на организм человека, животных и систему крови, в частности.

Большой интерес представляет собой гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ), который является ростовым фактором для гранулоцитарно-макрофагальных типов клеток - предшественников, способным усиливать процессы фагоцитоза в лейкоцитах. В отдельных работах по изучению действия Г-КСФ на пул мезенхимальных стволовых клеток показано, что под действием данного цитокина увеличивается выброс их количества из костного мозга в кровь (В. П. Шахов, И.А. Хлусов, Г.Ц. Дамбаев и др., 2004; R.W. Johnson et al, 1997). Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно - сосудистой системы. При таком стресс-факторе, как гипокинезия, закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови изучены недостаточно и отражены лишь в единичных работах (Ф.И. Ершов и др., 2004).

В связи с отсутствием систематизированных данных о влиянии длительной гипокинезии на состояние костномозгового кроветворения (показатели миелопоэза), регулирующего влияния цитокинов на кроветворение актуальным является изучение молекулярно-клеточных изменений в крови при адаптации к гипокинезии и возможности коррекции повреждающего действия гипокинетического фактора. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

Цель исследования: установить закономерности адаптации системы крови на молекулярно-клеточном уровне к действию острого и хронического гипокинетического стресса с целью обоснования коррекции аплостических нарушений.

В рамках этой общей цели решались следующие задачи:

1. Выявить динамику содержания гуморальных факторов регуляции в плазме крови и тканях костного мозга, селезенки и тимуса на разных этапах развития гипокинетического синдрома.

2. Определить активность системы «перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита» у экспериментальных животных в динамике 30-ти суточной гипокинезии.

3. Выявить характер взаимосвязей между исследуемыми параметрами системы крови экспериментальных животных на разных стадиях формирования адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе.

4. Оценить возможность снижения деструктивных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата церулоплазмина.

5. Установить возможность ускорения репарационных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата граноцита.

Научная новизна исследования

Установлен комплекс параметров, характеризующих состояние систем органов экспериментальных животных в зависимости от длительности воздействия гипокинетического стресса: на ранних сроках (1-ые - 7-ые сутки) в периферической крови достоверно повышается содержание кортикостерона, цитокинов (ИЛ-1р, ИНФ-у, ФНО-а, ИЛ-4), наблюдается выраженный лейкоцитоз; в костном мозге увеличивается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-4), отмечена активация анти-оксидантных ферментов и миелопоэза; в хронической фазе гипокинетического синдрома в плазме крови повышается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), а в костном мозге - ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

С увеличением сроков гипокинетического воздействия нарастают деструктивные изменения в органах системы кроветворения, что подтверждается достоверным повышением уровня ПОЛ в костном мозге, селезенке и тимусе на фоне снижения содержания антиоксидантных ферментов; введение гуморального ангиоксиданта церулоплазмина на ранних стадиях гипокинетического стресса сопровождалось повышением активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) и снижением интенсивности процессов липопероксидации.

Впервые экспериментально установлено, что глубина деструктивных процессов в кроветворных органах достоверно снижалась при кор-реции последствий, вызванных острым и хроническим гипокинетическим стрессом, препаратом граноцит. Впервые показано, что дестабилизация гомеостаза, вызванная гипокинетическим воздействием, сопрово-

задается перестройкой регуляторных механизмов в системе крови, что приводит к включению процессов компенсации с участием мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Баланс между процессами деструкции и регенерации клеточных элементов в системе крови при действии гипокинетического стресса был обусловлен активацией процесса пролиферации ММСК на фоне введения препарата гра-ноциг.

Выявленная реакция системы цитокиновых регуляторов подтверждает этапность включения молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови, что подтверждается изменением соотношения провоспалительных и противовоспалительных цнтокинов при остром и хроническом гипокинетическом стрессе. Впервые показано, что уровень провоспалительных цитокинов повышался в ранние сроки воздействия ГК (исключение составил ИЛ-12), а содержание противовоспалительных цитокинов было достоверно повышено на всех сроках гипокинезии.

Использование цитокиновой стимуляции (препарат граноцит) и антиоксиданта (препарат церулоплазмин) с целью предотвращения срыва гомеостатических механизмов регуляции обеспечило активацию молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови и общую резистентность организма к гипокинетическому воздействию.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты экспериментального исследования существенно углубляют современные представления о закономерностях молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при воздействии экстремальных факторов, в частности острого и хронического гипокинетического стресса. Получены новые данные о роли цитокиновой системы в процессах адаптации системы крови к длительному 30-ти суточному гипокинетическому стрессу, расширяющие знания в области физиологии адаптации. Экспериментально доказана эффективность использования препарата граноцит в качестве средства, снижающего уровень деструктивных процессов в костном мозге и лимфоидных органах при гипокинетическом стрессе. Существенное значение имеет факт установления защитного механизма действия церулоплазмина (метаболи-

та антиоксидантной системы) от аплостических повреждений в организме экспериментальных животных в условиях гипокинезии. По данным исследованиям подана заявка №2009139735 (056294) на получение патента.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования нашли отражения в монографии «Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем», включены в лекционный материал по дисциплинам «Общая физиология», «Физиология спорта», «Основы здорового образа жизни» в Челябинском государственном педагогическом университете, Южно-Уральском государственном университете, Уральском государственном университете им. Горького (г. Екатеринбург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание гуморальных факторов регуляции (цигокинов, анти-оксидантов, глкжокоргтикоидов) в периферической крови, ткани костного мозга, селезенки и тимуса экспериментальных животных зависит от срока гипокинетического воздействия и определяется этапностью развития адаптационных процессов.

2. Функциональная активность цитокиновой «сети» и системы «пе-рекисного окисления липидов - антиоксидантная защита» в системе крови в динамике 30-ти суточной гипокинезии характеризуется различными фазами и обуславливает соотношение процессов деструкции и регенерации в организме экспериментальных животных.

3. Формирование адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе сопровождается: количественно - качественной перестройкой взаимосвязей между параметрами системы крови, что отражает напряжение механизмов регуляции (с 1-ых по 7-ые сутки); изменением общего количества взаимосвязей и соотношения прямых (активирующих) и обратных (стабилизирующих) связей к 15-ым суткам эксперимента.

4. Использование препаратов церулоплазмина и граноцита эффективно снижает деструктивные и ускоряет репарационные процессы в

системе крови экспериментальных животных в условиях 30-ти суточного гипокинетического воздействия.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на 1-ом съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ-ом съезде Физиологическою общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM, Москва, 2006); И-ой Международной научно - практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); IV-ым съезде физиологов Урала (с международным участием) (Екатеринбург, 2009); итоговых научных конференциях ГОУ ВПО «ЧГПУ» (2006,2007,2008,2009).

Публикации по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, - 14.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 300 страницах печатного текста и включает: введение, литературный обзор (глава 1), описание материалов и методов исследования (2), результаты собственных исследований (главы 3, 4 ,5), заключение, выводы, иллюстрирована 32 рисунком и 23 таблицами. Список литературы включает 180 зарубежных источника и 346 отечественных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на 630 белых крысах-самцах линии Вистар массой 150-200 гр. Все животные содержались в одном помещении при температуре воздуха 23-24°С. Животные опытной и контрольной групп получали стандартный брикетированный корм с добавлением растительного масла, рыбьего жира, свежих овощей и воды в неограниченном количестве. В опыт отбирались здоровые животные, прошедшие двухнедельный карантин в виварии. В процессе эксперимента проводи-

лось постоянное наблюдение за поведением и питанием животных; после завершения эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом.

Гипокинезию моделировали путем помещения животных в клетки-пеналы из органического стекла, соответствующие размерам животного, на 1, 3, 5, 7, 10, 15, 30 суток. Контрольных животных содержали в обычных клетках (Е.А. Коваленко, H.H. Гуровский, 1980; Р.А.Тигранян, 1985).

Иммунологические методы

Уровень содержания цитокинов определяли на анализаторе «Mul-tiscane Biotech» (США) в плазме крови с помощью наборов реактивов фирмы «Quanti Kine» (США), в ткани костного мозга с помощью тест-системы для ИФА производства ООО «Цитокин» (СПб.).

Гематологические методы

Препарат граноцит фирмы «Аветус», содержащий рекомбинант-ный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), вводили в течение 3 суток однократно подкожно в дозе 10 мкг/кг (Е.Д. Гольдберг, 2005; Г.Ю. Кнорринг, 2005) с подсчетом общего количества лейкоцитов в периферической крови. В контрольной группе все животные получали эквивалентное количество растворителя данного препарата - физиологического раствора. Анализ качественного и количественного состава клеток крови, костного мозга осуществляли с помощью общепринятых гематологических и цитологических методов с окраской препаратов азур-II эозином (В.П. Шахов, 2005).

Культивирование мультипотентных мезенхим альных стромальных клеток в системе in vitro осуществляли по модифицированному методу А.Я. Фриденштейна в течение 10-14 суток в полной питательной среде: 79% среды D-MEM с низким содержанием глюкозы, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ЮОх концентрата L-глютамина, стрептомицина и пенициллина при 37° С, 100% влажности и 5% СОг в СОг-инкубаторе в 50 мл пластиковых флаконах фирмы «Falcon». Использованные среды и реактивы произведены фирмой «Sigma» (США). Через 3 суток неприлипшие клетки удаляли и заменяли полную среду

свежей порцией, после него каждую новую смену среды осуществляли в течение 5 суток. На 10-14-ые сутки культивирования с помощью инвер-тоскопа фирмы «Opton 2» (Германия) подсчитывали число образовавшихся колоний (клеточных агрегатов, содержащих более 50 кариоци-тов) и окрашивали азур-11 эозином (P.M. Хаитов, 2001; В.П. Шахов, 2005). В ряде случаев идентификацию мультипотенгных мезенхималь-ных стромальных клеток осуществляли после снятия адгезирующих ка-риоцитов 0,5% раствором трипсина с последующим определением в них полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализ) и набора реактивов на ос-теопонтин фирмы «Вектор» (Новосибирск) (В.П. Шахов, 2005; F.M. Watt, 2000).

Биохимические методы

Перекисное окисление липидов в тканях органов изучали по методике J. Stocks et al. (1974) в модификации И. А. Волчегорского и со-авт. (1989, 2000), выявляя продукты ПОЛ спектрофотометрическим методом с выделением гептан- и изопропанолрастворимых липоперокси-дов (рассчитывали в единицах индекса окисления: Е232/220 - относительное содержание диеновых коньюгатов, Е278/220 - уровень кето-диенов и сопряженных триенов), малоновый диальдегид определяли по В.И. Орехович (1977). Активность супероксцвдисмутазы (СОД) (К.Ф.1.15.1.1.)определяли по методу С. Чевари и др. (1985), каталазы (К.Ф. 1.11.1.6.) - методом Н.С. Мамонтова и соавт. (1994). Определение церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови и костном мозге проводили по модифицированному методу Ревина (С. В. Бестужева, В. Г. Колб, 1976). Активность глутатионредуктазы определяли, руководствуясь методом Ф. Е. Путилина (1982).

Церулоплазмин (НПО «Иммунопрепарат», г. Уфа) вводили внут-рибрюшинно из расчета 3 мг на ЮОтр массы тела за 24 часа до опыта и дополнительно за один час до начала эксперимента в течение 3-ех дней.

Результаты исследований обрабатывались с использованием пакета лицензионных прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». О достоверности различий средних величин судили по критерию Стью-денга (t). Для определения статистической значимости межгрупповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Ста-

тистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа по Спирмену (rs) и Кенделлу (rk). Для выявления вклада различных факторов в изменение анализируемых показателей проводили многофакторный дисперсионный анализ признаков сопряженности в главной линейной модели. Качество линейной модели оценивали с помощсью коэффициента правдоподобия /2. Значимость факторов оценивали по величине коэффициента Вальда. В модель включали только показатели, влияние которых было достоверным (р<0,05) (С. Гланц, 1999; О.Ю. Реброва, 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние острого и хронического стресса на содержание продуктов перекисного окисления липидов в костном мозге, тимусе и селезенке

Известно, что усиление перекисного окисления липидов и накопление продуктов липопероксидации, обладающих высокой реакционной способностью, .может оказывать системное повреждающее действие на клетки (В.Е. Коган, 1983; М.В. Биленко, 1989; В.А Барабой, 1991; Ю.А. Владимиров, 1991; S. Thomas, 1998). Механизмы развития острого и хронического стрессов во многом обусловлены активацией процессов липопероксидации (В.Е. Коган, 1983; Н.В. Гуляева, 1989; Н.К. Зенков, 2001; L. Pronai, 1991; P.D. Thomson, 1991; K.S. Dhalla, 1996).

В наших исследованиях разные сроки гипокинезии значительно влияют на соотношение различных категорий продуктов липопероксидации.

В таблице 1 представлены показатели содержания продуктов липопероксидации в ткани костного мозга, тимуса, селезенки в различные сроки острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных.

Содержание первичных и вторичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ через 6 часов и одни сутки после острого гипокинетического воздействия в этих органах оставалось на уровне фоновых величин. Снижение первичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ зафиксировано с 3-их по 15-ые сутки гипокинетического воздействия.

Таблица 1

Показатели содержания продуктов липопероксидации в ткали костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных при воздействии острого и хронического гипокинетическою стресса (М±ш)

Параметры Сроки \ от начала ГК Гсптановая фаза

Костный мозг Тимус Селезенка

Е 232/220 Е 278/220 Е 232/220 Е 278/220 Е 232/220 Е 278/220

Кошроль п=8 0,983±0,002 0,116±0,003 0,630±0,011 0,168±0,00б 0,428±0,011 0,230±0,006

ГКб часов п=8 0,990±0,031 0,120±0,024 0,623±0,065 0,169±0,024 0,432±0,062 0,236±0,040

ГК] сутки п=8 0,988±0,060 0,118±0,036 0,617±0,019 0,173±0,042 0,419±0,016 0,241 ±0,013

ГК3 суток п=8 0,954±0,013* 0,123±0,001* 0,585±0,006** 0,175±0,033 0,407±0,011 0,239±0,012

ГК5 суток п=8 0,945±0,014* 0,127±0,002** 0,565±0,017** 0,188±0,004* 0,385±0,004** 0,248±0,004*

ГК7 суток п=8 0,939±0,012** 0,129±0,003** 0,545±0,021** 0,191±0,005* 0,364±0,012** 0,257±0,006

ГКю суток п=8 0,958±0,011* 0,140±0,004** 0,548±0,017*** 0,200±0,006** 0,377±0,006*** 0,274±0,005**

ГК]5 суток п=6 0,9б2±0,006* 0,166±0,003*** 0,542±0,016*** 0,234±0,004** 0,385±0,005** 0,322±0,004***

Контроль п=6 ГКзо суток п=6 0,960±0,040 0,975*0,002 0,118±0,014 0,157±0,011* 0.645±0,012 0,651 ±0,048 0,171±0,007 0,247±0,006*** 0.441 ±0.006 0,419±0,078 0,245±0,010 0,318±0,020***

Примечание-, достоверность отличий от соответствующего контроля: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, рассчитанные с помощью критерия Стыодента (I).

1) В таблице отражен уровень первичных (ацилгидронерекисей и диеновых коныогатов) и вторичных (кетодиенов и сопряженных триенов) продуктов ПОЛ,

2) Уровень продуктов ПОЛ определялся в У.Е. окислительного индекса, который рассчитывался как отношение оптических плотностей Е2Э2/Е220 для первичных и Е278/Е220 для вторичных продуктов ПОЛ.

Напротив, повышение вторичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ началось с 3-х суток и продолжалось до 30-ти суток гипокинетического воздействия. Увеличение содержания кетодиенов и сопряженных триенов, растворимых в гептане, было зафиксировано в период с 15-ых по 30-е сутки воздействия: в костном мозге - на 43,10% (р<0,001), тимусе - на 39,30% (р<0,01), селезенке - на 40% (р<0,001).

Через 30-ть суток после действия хронического гипокинетического стресса содержание первичных продуктов липопероксидации, растворимых в гептане), сопровождалось нормализацией и увеличением содержания вторичных продуктов липопероксидации, растворимых в гегггане2: в костном мозге - на 33,05% (р<0,05); в тимусе - на 44,4% (р<0,01), в селезенке - на 30% (р<0,001).

В таблице 2 представлены показатели содержания продуктов ПОЛ, растворимых в изопропанолеьг, в ткани костного мозга, тимуса и селезенки при действии острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных. Содержание первичных и вторичных изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ на всех сроках действия стресса в этих органах было повышено, за исключением 3-их суток эксперимента, на которые зафиксировано снижение (в костном мозге, тимусе и селезенке) соответственно на 4,07% (р<0,05), 2,5%, 4%(р<0,05). Кроме того, снижение продуктов ПОЛ в изопропаноле1 было зафиксировано в костном мозге через ГК5 7 суток соответственно - на 12%(р<0,01) и на 9,43% (р<0,01). Продукты ПОЛ, растворимые в изопропанолсг, на всех сроках воздействия были повышены. Увеличение их содержания было зарегистрировано: на 10 - е сутки в костном мозге - на 27,10% (р<0,01), в тимусе - на 21% (р<0,001), в селезенке - на 18% (р<0,001); на 15-е сутки: в костном мозге - на 30,10%(р<0,01), в тимусе - на 37% (р<0,001), в селезенке - на 35% (р<0,001).

30-ые сутки действия стресса сопровождались повышенным содержанием первичных продуктов ПОЛ, растворимых в изопропанолеь в костном мозге - на 15,03% (р<0,01), в тимусе - на 17% (р<0,05), в селезенке - на 18% (р<0,001), и вторичных продуктов ПОЛ, растворимых в изопропаноле2: в костном мозге - на 28% (р<0,001), в тимусе - на 30% (р<0,01), в селезенке - на 29% (р<0,001).

Таблица 2

Показатели содержания продуктов лнпопероксцдацни в ткани костного мозга, гнмуса и селезенки у экпсриментальных животных при воздействии острого н хронического гипокинетического стресса

(М±т)

Параметры Изопропанольная фаза

СрОКИ '^ Костный мозг Тимус селезенка

от начала I Е 232/220 Е 278/220 Е 232/220 Е 278/220 Е 232/220 Е 278/220

Контроль п=8 0,615±0,011 0,432±0,012 0,680±0,01 0,505±0,012 0,658±0,010 0,570±0,011

ГКб часов п=8 0,669±0,014* 0,490±0,010** 0,700±0,006 0,525±0,006 0,691 ±0,008* 0,600±0,006*

ГК1 сутки п=8 0,643±0,002* 0,468±0,006* 0,659±0,003 0,523±0,002 0,645±0,003 0,613±0,008**

ПСз суток п=8 0,590±0,003* 0,465±0,004 0,663±0,063 0,530±0,004 0,632±0,005* 0,621±0,011 **

ГК5 суток п=8 0,541±0,013** 0,473±0,014* 0,707±0,004* 0,555±0,006** 0,684±0,007 0,638±0,013**

ГК7 суток п=8 0,557±0,011 ** 0,484±0,010* 0,740±0,015** 0,575±0,023* 0,711±0,010** 0,655±0,014**

ГКю суток п=8 0,657±0,010* 0,549±0,015** 0,754±0,021 ** 0,611 ±0,012*** 0,724±0,012*** 0,672±0,020***

ГК15 суток п=6 0,658±0,012* 0,562±0,012** 0,782±0,032** 0,692±0,014*** 0,750±0,013*** 0,7691:0,023* **

Контроль п=б 0,612±0,030 0,430±0,010 0.б90±0,025 0,515±0,014 0.672±0.020 0,590±0,021

ГКзо часов п=6 0,550±0,020*** 0,807±0,035* 0,669±0,042*** 0,792±0,010*** 0,761±0,035***

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, рассчиташшх с помощью критерия Стьюдента (t).

Кроме того, для более полного представления о динамике образования продуктов перекисного окисления в ткани костного мозга, тимуса и селезенки определяли вторичный продукт ПОЛ - малоновый диальде-гид (МДА), содержание которого увеличивалось на всех сроках острого и хронического гипокинетического стресса (рис. 1).

0.9 0,85 0,8

Е "3

I 0,75 1 0,7 ^ 0,65 * 0,6

5 °>55

0,5 0,45 0,4

-в—Костный мозг -о—Тимус •Д- ■ • Селезенка

1 3 5 7 10

Время после начала эксперимента, сут.

Рис. 1. Динамика показателей содержания малонового диальдегида в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных при воздействии острого и хронического гипокинетического стресса.

Увеличение МДА зафиксировано на 10-ые, 15-ые сутки с максимумом значений на 30-ые сутки действия гипокинезии', в костном мозге - на 20,40% (р<0,01), 23% и 36% (р<0,001) соответственно; в тимусе -на 22,22% (р<0,01), 25% (р<0,01), 29% (р<0,01). Однако, в селезенке максимум содержания МДА наблюдался на 10-ые сутки - 35,52% (р<0,01), с последующим незначительным снижением (33,27% (р<0,001), 32% (р<0,01)).

Результаты исследований содержания продуктов ПОЛ в разные сроки острого и хронического гипокинетического стресса отражают со-

отношение различных категорий продуктов липопероксидации в органах системы крови, обуславливающих степень повреждения тканей, в частности, при действии 30-ти суточной гипокинезии на организм под действием глюкокортикоидов и каггехоламинов активируются ферменты (липазы, фосфолипазы), что ведет к повышению интенсивности процессов липидной пероксидации, носящих фазный характер. В первой фазе гипокинезии происходит снижение уровня первичных и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ в ткани костного мозга, тимуса и селезенки: первичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ, первичных изопро-панолрастворимых продуктов ПОЛ в костном мозге, тимусе и селезенке. Повышение содержания вторичных продуктов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки зафиксировано на 10-ые, 15-ые, 30-ые сутки действия гипокинезии.

Существенно отметить, что длительное ограничение двигательной активности рассматривается нами как фактор, способствующий «срыву» компенсаторно-адаптационных механизмов организма.

Полученные нами результаты согласуются с данными ранее выполненных исследований, в которых отражена ключевая роль перекис-ного окисления липидов в реализации стрессорных повреждений мембран клеток костного мозга при различных факторах воздействия (Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенникова, 1988; Львовская Е.ИД998; Ю.Г. Камскова, 2003).

Состояние стресс - лимитирующей системы у животных, подвергшихся действию острого и хронического стресса

Антиоксиданты, к которым относятся супероксиддисмутаза, ката-лаза, глутатионредуктаза, находятся в крови и тканях, относятся к периферической стресс - лимитирующей системе. При стрессах, гипоксии, воспалении активируются свободно-радикальные реакции, которые находятся под контролем антиоксидантной системы (Т. Г. Сазонтова, H.A. Анчишкина, Ю.В. Архипенко, 2007).

Полученные данные показывают, что при действии гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных в ранней фазе (1-3-ьи сутки) активность антиоксидантных ферментов увеличивается соответственно: активность СОД - на 10,24% (р<0,01), - на 8% (р<0,05)

ё тааМ'костаого" ■ мбЗга; в тимусе - на 10,66% (р<0,001), - на 8% (р<0,01); в селезенке - на 13,54% (р<0,05), - на 10,42% (р<0,05), активность каталазы увеличилась - на 9,51% (р<0,01) и - на 6% р<0,05) в костном мозге; в тимусе - на 8,30% (р<0,01) и - на 6% (р<0,05); в селезенке на этих же сроках - на 6,35% (р<0,05), - на 8% (р<0,05). Показатели тканевого церулоплазмина и активности глутатионредуктазы с первых по третьи сутки гипокинетического воздействия также были увеличены. Через 5-ть суток эксперимента все антиоксидангные ферменты в ткани костного мозга, тимуса и селезенки снижались ниже контрольных значений.

Известно, что ферментативные антиоксиданты - супероксиддис-мутаза и каталаза являются первым звеном внутриклеточной защиты от активных радикалов, что подтверждается результатами нашего исследования. В острой фазе стресса в костном мозге, тимусе и селезенке эти ферменты повышались, а в фазу хронического стресса - снижались. Поэтому возникла необходимость провести коррекцию для активации стресс-лимитирующей системы в ткани костного мозга, тимуса и селезенки. С этой целью мы осуществляли внутрибрюшинное введение препарата церулоплазмина за сутки до опыта и дополнительно за один час до начала эксперимента в течение 3-ех суток.

Из анализа полученных данных следует, что при применении церулоплазмина наблюдалось повышение показателей активности антиок-сидантных ферментов в костном мозге через сутки: активность СОД увеличилась - на 14,28% (р<0,001), активность каталазы - на 12% (р<0,001); в тимусе активность СОД увеличилась - на 14,46% (р<0,001), активность каталазы - на 16% (р<0,001); в селезенке активность СОД увеличилась - на 15% (р<0,001), активность каталазы - на 11% (р<0,01). (рис.2).

Через трое суток гипокинетического воздействия на фоне введения церулоплазмина активность антиоксидангных ферментов была выше в костном мозге: активность СОД увеличилась - на 16% (р<0,001), активность каталазы - на 12,17% (р<0,001); в тимусе: активность СОД увеличилась - на 18,52% (р<0,001), активность каталазы - на 20% (р<0,001); в селезенке: активность СОД увеличилась - на 22% (р<0,001), активность каталазы - на 19% (р<0,010).

Через 15 суток действия стресса на организм экспериментальных животных на фоне коррекции церулоплазмином показатели активации антиоксидантных ферментов оставались выше уровня контроля.

125% 120%

§ 115% 1

а, но% &

£ 105%

* 100%

0 1 3 7 15 30

В рема после начата эксперимента, суг.

Каталаза >Д

Рис. 2. Динамика показателей антиоксидантных ферментов в органах системы крови у экспериментальных животных при гипокинезии и на фоне введения церулоплазмина.

Тридцатые сутки действия хронического стресса при коррекции церулоплазмином характеризовались повышенным уровнем активности всех антиоксидантных ферментов в костном мозге, тимусе и селезенке по сравнению с уровнем контроля. Следует отметить, что и показатели активности глутатионредуктазы также были выше контрольных значений.

Таким образом, введение препарата церулоплазмина в условиях хронического стресса способствовало активации антиоксидантов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки в период с 5-ых по 30-ые сутки гипокинетического воздействия. Необходимо отметить, что максимальные значения активности исследуемых ферментов зафиксированы на 3-ьи- 15-ые сутки на фоне церулоплазмина.

Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание провоспалительных и противовоспалительных цитоки-нов в периферической крови и ткани костного мозга у экспериментальных животных

Как показали исследования И.В. Нестеровой (1999), A.B. Шурша-линой, В.Н. Верясова, Г.Т. Сухих (2001), Е.Г. Громовой, А.Р. Тугуза (2002), некоторые цитокины обладают «дистантными» свойствами гормонов, циркулируя длительное время в крови и образуя - «гормон-цитокиновую сеть» (G.C. Bagby, 1989; E.N. Benveiuste, 1995).

Цитокины, вырабатываемые активированными лимфоцитами, макрофагами, мультипсггентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга и тимуса (фибробластами, эндотелиапьными клетками, эпителиальными клетками тимуса), являются медиаторами межклеточных коммуникаций. Биологические эффекты цигокинов заключаются в реализации воспалительных и иммунных реакций и кроветворения. Они служат ростовыми факторами, участвуют в межсистемных взаимодействиях (A.A. Ярилин, 1997; А.С.Симбирцев, 2004, O.A. Гомазков, 2006).

С.Л. Кетлинский (1995), КС. Фрецдлин (1995), И.В. Нестерова (1999), R.W. Johnson, S. Arkins (1997) по механизму действия цитокины разделили на провоспалительные (ИЛ-1а, ИЛ-lß ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-у, ФНО-а) и противовоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10).

В таблице 3 представлены результаты исследования содержания провоспалительных цигокинов в сыворотке крови животных при действии острого и хронического стресса. Из анализа результатов таблицы 3 следует, что уровень ИЛ-1а увеличивался на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса: через 3-ое суток - на 23% (р<0,01), на 5-ые - на 33% (р<0,01), на 7-ые - 35,5% (р<0,01). Максимальное содержание данного ингерлейкина зафиксировано на 10-ые сутки -37% (р<0,001) эксперимента. Начиная с 15-ых и по 30-ые сутки действия ГК показатели содержания ИЛ-1а оставались выше значения контроля от 25% (р<0,01) и до 14,15% (р<0,05) соответственно (табл. 3).

Уровень содержания ИЛ-lß также увеличивался на всех сроках у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса, за исключением 30-ых суток ГК, когда снижение его содержания составило 12,31% от значения контроля (табл. 3).

Таблица 3

Показатели содержания провоспалительных шггокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных при действии острого и хроническою стресса (М±ш)

^\Параметры время от " -, начала ГК ИЛ-1а (пкг/мл) ИЛ-1Р (пкг/мл) Ш1-2 (пг/мл) ИЛ-6 (иг/мл) ИЛ-12 (пг/мл)

Ко1ггроль п=8 20,00±1,23 45,00±1,5б 1,06±0,12 17,21±1,12 7,00±0,52

ГК1 сутки п=8 22,60±0,63 50,23±1,46* 1,38±0,04* 20,43±0,67* 5,4±0,34*

ГК3 суток п=8 24,60±0,42** 56,25±2,03*** 1,80±0,21** 18,53±1,44 5,3±0,39*

ГК5 суток п=8 26,60±1,53** 58,50±2,26*** 2,17±0,23*** 20,40±0,75* 4,90±0,14**

ГК7 суток п=8 27,10±1,21** 63,00±4,13*** 2,24±0,16*** 25,20±1,05*** 3,б±0,70**

ГКю суток п=6 27,40±1,32*** 58,50±2,34*** 2,06±0,25** 23,15±1,23** 4,6±0,45**

ГК,5 суток п=6 25,00±1,03** 55,80±2,04*** 1,82±0,08*** 21,04±1,05* 4,50±0,15***

котроль ГКзо суток п=6 18,45±0,84 21,06±0,44* 40,23±1,03 35,28±1,09** 1,30±0,04 1,75±0,11** 16,15±0.45 19,35±0,97* 7.4±0,34 4,50±0,16***

. Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стьюдента (I).

Изучение уровня ИЛ-6 выявило, что достоверное повышение его содержания в сыворотке крови экспериментальных животных наблюдалось через трое суток на 18,71% (р<0,05). Максимальное увеличение содержания данного интерлейкина зафиксировано на 7-ые - 46,43% (р<0,01), а на 10-ые сутки наблюдалось снижение содержания ИЛ-6 до -34,51% (р<0,01) по отношению к 7-ым суткам. Через 15-ть и 30-ть суток гипокинетического воздействия содержание ИЛ-6 оставалось повышенным по отношению к контролю на 22,25% и 19,81% (р<0,05). Таким образом, на всех сроках действия ГК зафиксировано повышенное содержание ИЛ-6 (табл. 3).

Противоположную направленность имела динамика содержания ИЛ-12 в сыворотке крови на всех сроках гипокинетического воздействия. Снижение содержания ИЛ-12 в среднем составило от 23% до 49%, что, вероятно, обусловило снижение миграции стволовых кроветворных клеток в циркуляцию и нарушение формирования экстрамедуллярных очагов кроветворения (табл. 3).

Содержание ФНО-а на всех сроках гипокинетического воздействия оставалось повышенным (рис. 3). Достоверное повышение монокина зафиксировано, начиная с первых и по 15-ые сутки действия гипокинетического стресса По спектру биологических эффектов ФНО-а близок к ИЛ-1 и ИЛ-6 и обладает антиапогттозными эффектами (Е.Таоийк, 2008).

Уровень интерферона-у на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса был повышен, к 30-ым суткам его содержание снизилось до уровня контроля (рис. 3).

Таким образом, в процессе действия острого и хронического гипокинетического стресса на экспериментальных животных содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (ИЛ-1 а, ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-у) носило временные отличия: уровень ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-1а увеличился на всех сроках стресса; ИЛ-(3, ИФН-у увеличивались на всех сроках, за исключением 30-ых суток; уровень ИЛ-12 в сыворотке крови падал на всех сроках. Повышение содержания провоспалительных цитокинов коррелировало с увеличением числа моноцитов и нейтрофилов в периферической крови.

В ткани костного мозга содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а, ИФН-у) увеличивалось на всех сро-

ках действия стресса, кроме 30-ых суток, к которым содержание цито-кинов нормализовалось.

200

Интерферон

| 100

5 160-

1 180

3 5 7 10 15 30

Время после начала эксперимента, сут.

Примечание: * - достоверные отличия от контрольного (исходного) уровня.

Рис. 3. Динамика показателей содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных при действии острого и хронического стресса.

Результаты исследований провоспалительных цитокинов (ИЛ- 1а, ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНО-а) в ткани костного мозга у животных, подвергшихся гипокинетическому стрессу, представлены в таблице 4.

Из анализа результатов таблицы 4 следует, что содержание ИЛ-1а и ИЛ-1 р было повышено на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса в ткани костного мозга.

" Максимальное увеличение содержания ИЛ-1а и ИЛ-1Р было зафиксировано на 7-ые сутки гипокинетического воздействия - на 40,7% (р<0,01) и - на 43,02% (р<0,01) соответственно. К 30-ым суткам гипокинетического воздействия содержание ИЛ-1а и ИЛ-1{3 снизилось до контрольных значений.

Самые высокие значения содержания провоспалигельных цитоки-нов были выявлены для ИЛ-2 в ткани костного мозга. Так, к 7-ым суткам воздействия гипокинезии его содержание было вдвое выше, чем в контроле. Даже к концу эксперимента уровень ИЛ-2 оставался выше контрольных значений - на 28,41% (р<0,01) (табл. 4).

Содержание ИЛ-6 достоверно увеличивалось в ткани костного мозга только в период с 1-ых по 7-ые сутки, на остальных сроках исследования показатели были близки к контрольным значениям.

Таблица 4

Показатели содержания провоспалительных цитокинов в ткани костного мозга при влиянии острого и хронического стресса (М±ш)

\ парамет- N. рЫ врешк от начала ПС \ ИЛ-1а (пкт/мл) ИЛ-lß (пкг/мл) ИЛ-2 (пг/мл) ИЛ-6 (пг/мл) ФНО-а (пг/мл)

Контроль п=8 25,12±0,63 21,06±0,44 6,50±0,21 12,45±0,67 26,56±0,46

ГК) сутки п=8 31,65±1,06** 26,П±1,43** 9,10±0,55*** 15,43±1,08* 29,58±0,88**

ГК3 суток п=8 32,65±1,5б*** 27,00±1,63** 10,92±0,92*** 18,52±1,03**® 33,12±2,03**

ГК5 суток п=8 33,93±2,65** 28,00±1,44*** 12,38±1,03*** 14,12±0,32* 31,09±1Д4**

ГК7 суток п=8 35,34±3,04** 30,12±2,23** 13,19±2,04** 15,03±0,36** 32,00±1,63**

ГКю суток п=6 30,14±1,55** 25,58±i,2i», 11,93±1,32*** 13,34±0,11 30,68±1,51*

ГК,5 суток п-6 28,33±0,43* 24,22±1,32* 9,70±0,54** 14,52±0,81 30,01±1,48*

контроль ГКзо суток п=6 26.00±0,83 27,14±1,53 20,14±0,70 21,55±0,40 6,30±0,33 8,09±0,45** 11.53±0.74 11,05±0,86 27.12±0,65 28,68±0,54

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля:

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, рассчитанных с помощью критерия

Стьюдента (I).

Диапазон увеличения содержания ФНО-а составил на разных сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса от 111% до 125%. Максимальное увеличение ФНО-а зафиксировано на 3-ьи сутки воздействия - на 25% (р<0,01).

Исследование профиля противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных показало, что через сутки гипокинетического воздействия содержание ИЛ-4, ИЛ-10 было увеличено соответственно - на 28,66% (р<0,05), - на 32,03% (р<0,001); через ГК3 суток - на 40,13% (р<0,01), - на 44% (р<0,001) соответственно; через ГК7- на 69% (р<0,01), - на 68% (р<0,001); через ГК15 - на 35,03% (р<0,05), - на 57% (р<0,001) и через ГК30 суток - на 29,03% (недостоверно), - на 34,44% (р<0,01) (рис. 4 А).

180 160 140 120 100 * 80 60 40 20 0

3 4 5 Сыворотка крови

И ИЛ-4 а ИЛ- Ю;

1 2 3 4 5 6 7 Костный мозг

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стыодента 0). 1 - ГКЬ 2 - ГК3,3 - ГК5, 4- ГК7, 5 - ПС,о, 6 - ПС15, 7 - ГК30.

Рис. 4. Динамика содержания противоспалигельных цитокинов в сыворотке крови и ткани костного мозга у экспериментальных животных в условиях гипокинезии

Изучение профиля противовоспалительных цитокинов в ткани костного мозга (рис. 4 Б) выявило, что через одни сутки гипокинетического воздействия содержание цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 увеличилось соответственно - на 32,39% (р<0,01), - на 23% (р<0,01); максимальное увеличение интерлейкина ИЛ-4 зафиксировано через семь суток, а интер-лейкина ИЛ-10 - на десятые сутки гипокинетического воздействия - на 65,27% (р<0,001) и 60,09% (р<0,01) соответственно.

Биологические эффекты противовоспалительных цитокинов связаны со стимуляцией гемопоэза и способностью повышать выживаемость кроветворных клеток, а также с регулированием функций организма, обеспечением развития защитных реакций и поддержанием го-меостаза при различных воздействиях. Существенно отметить, что имеется ряд научных работ, в которых раскрывается влияние цитокинов, как провоспалительных, так и противовоспалительных, на поведенческую реакцию. Проведенный нами эксперимент подтвердил данные положения об изменении этологических показателей, в частности, наблюдались: снижение мотивационной деятельности в сочетании с агедони-ей, перестройка структуры поведения и связи между ними, усиливались тревожно-фобические состояния и др. при моделировании гипокинетического стресса у экспериментальных животных.

Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов в периферической крови у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса

Препарат граноцит представляет собой колониестамулирующий фактор, относится к биологически активным протеинам, регулирующим дифференцировку и пролиферацию клеток органов. Под действием гра-нулоцитарного колониестимулирующего фактора происходит стимуляция и миграция мультипотентных ГС К из костного мозга в кровь, что повышает возможность их поступления в поврежденные лимфоидные органы с последующей активацией в них процессов регенерации (D. М. Bodine et. al., 1994; Т. Takahashi et. al., 1999; Van Os et. al., 2002, A. J. Wagers et. al., 2002). Основываясь на свойствах данного препарата, мы использовали его для коррекции нарушений в системе крови.

Общее количество лейкоцитов в периферической крови у экспериментальных животных в условиях гипокинетического стресса. Так, через 1-ые сутки у экспериментальных животных наблюдалось увеличение общего количества лейкоцитов - на 47,58% (р<0,01).

В последующие сроки ГК наблюдалось постепенное снижение общего количества лейкоцитов в периферической крови и к 10-ым суткам их количество снизилось - на 10,3%, а к 15-ым - на 17,47% по сравнению с контролем.

При введении препарата граноцит уже к 3-им суткам ГК зафиксировано повышение общего количества лейкоцитов в 3,5 раза, на 5-ые -7-ые сутки в 3 раза по отношению к показателям экспериментальных животных, не получавших препарат граноцит. На 10-ые - 15-ые сутки действия гипокинетического стресса количество лейкоцитов оставалось выше на 28,37% и 23,0% (р<0,05) (рис. 5).

450

§ 400 IS 350

i 300 g *

Z ^250

0 О

5 £200

О 100 о

| 50

Примечание: * - достоверные отличия от значения показателя в группе гипокинезия.

Рис. 5. Показатели относительного количества лейкоцитов в периферической крови у крыс, подвергшихся действию гипокинетического стресса в различное время после начала эксперимента (отношение показателей в группе гипокинезия к группе гипокинезия + граноцит).

О 1 3 5 7 10

Время после начала эксперимента, сут.

Влияние препарата граноцит на общее количество кариоцнтов и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса

На рис. 6 представлено общее содержание кариоцигов в костном мозге у экспериментальных животных при гипокинетическом воздействии. С 1-ых по 7-ые сутки содержание ОКК повышалось в среднем на 15,07% - 30% (р<0,01). На 10-ые - 15-ые сутки эксперимента общее количество кариоцигов в костном мозге снижалось - на 30% (р<0,01) (рис. 6).

350

£ зоо

I-

X 250

1^200

0 о

j «150

1 5

li 100

| 50 О

Рис. 6. Показатели относительного количества ОКК и ММСК в костном мозге у крыс в различные сроки гипокинезии (отношение показателей в группе гипокинезия к группе гипокинезия + граноцит).

Содержание кариоцитов в костном мозге, у крыс, подвергшихся гипокинетическому воздействию на фоне коррекции препаратом граноцит, значительно увеличилось по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата, начиная с 3-х и по Ю-ые сутки увеличивалось в среднем 2,5-3 раза, а на 15-ые сутки - в 2 раза.

Содержание мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса, представлено на рис. 6.

О ОКК О ММСК

1 3 5 7 10 15

Время после начала эксперимента, сут.

Процесс гиперплазии костного мозга (повышение содержания мие-лобластов, промиелоцитов и миелоцитов, общего содержания грануло-цитарных элементов в миелоцдной ткани) сопровождался увеличением общего количества мультипсггентных мезенхимальных стромальных клеток на 3-ьи, 5-ые и 7-ые сутки ГК. Аналогичные изменения со стороны гранулоцитарного ростка на фоне введения ММСК были получены в экспериментах на 5-ые сутки после острой кровопотери (И.Ю. Макла-кова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Максимальное значение количества ММСК в костном мозге было на 3-ьи сутки, что составило -173,53% (р<0,01), а ОКК - 132,08%. На 15-ые сутки воздействия отмечалось снижение данного показателя на 16,0% относительно контроля.

Необходимо отметить, что препарат граноциг приводит к достоверному увеличению содержания ММСК костного мозга при действии острого и хронического гипокинетического стресса по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата В период с 3-их по 10-ые сутки увеличение количества ММСК составило 2-2,5 раза. К 15-ым суткам эксперимента содержание ММСК превышало контроль на 48%, а ОКК на 107,54% (рис. 6).

Таким образом, отмечено стимулирующее действие граноцита на миелопоэз и мезенхимопоэз, реализующееся на уровне мультипогент-ных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге (рис. 6).

На рис. 7(А) представлены данные по количеству ядросодержащих клеток (ЯСК) в тимусе экспериментальных животных, подвергшихся влиянию острого и хронического гипокинетического стресса. Через сутки количество ядерных клеток снизилось - на 22,53% (р<0,01), на 3-ьи сутки - на 56,81% (р<0,001). Максимальное снижение ЯСК в тимусе при гипокинетическом воздействии зафиксировано на 10-ые сутки - на 67,91%(р<0,001) (рис. 7А). Достоверное снижение ядросодержащих клеток в тимусе подтверждается гистологическими исследованиями.

Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на ядросодержащие клетки в селезенке представлены на рис. 7(Б). Количество ядросодержащих клеток селезенки, начиная с первых по 15-ые сутки, достоверно снижалось по отношению к контролю: на 1 -ые сутки -на 28,78% (р<0,001), а на 3-ьи - на 46,04% (р<0,001). Максимальное

снижение количества ЯСК в селезенке зафиксировано на пятнадцатые сутки гипокинетического воздействия - на 70,88% (р<0,001).

800 700

еоо

500

1 400

в 1 300 §

Р 200 §

.; юо

•м

X -ь □Птокшездя ОГипокте-шя 4- Гранощгг

-Т" гЬ

ф, л. гЪ

■ га щ А «1

•- Г3" — -

1 3 5,7 10 15 Время после нйчйля эксперимента, су т.

1000 % 900 % 800 | а 700

II600

5 о

5 £ 500 | I 400

£ 300

| 200 К 100 О

—^

□ ГНПОКИНеШЯ □ ГИПОМШПНЯ + ГуаНШт

3 5 7 10 15

Бреаш после иячала ни нер (шснта, су г.

Рис. 7 (А, Б). Динамика показателей количества ядерных клеток в тимусе - А и селезенке - Б у крыс в различное время содержания животных в гипокинетических условиях и при введении граноципга.

При просмотре гистологических препаратов селезенки выявлено, что на всех строках действия гипокинезии было увеличено число и диаметр лимфоидных фолликулов. При этом абсолютная и относительная площадь белой пульпы увеличена по сравнению с показателями группы контроля. Клеточная плотность в Т и В - зонах лимфоидных фолликулов снижена, диаметр лимфоцитов в них увеличен. Абсолютная и относительная площадь Т и В - лимфоидных зон увеличены.

Как следует из рис. 7(A), трехкратное введение препарата грано-цит экспериментальным животным значительно увеличило количество ядросодержащих клеток в ткани тимуса на всех сроках действия гипокинетического стресса: через трое суток - на 49,69% (р<0,001) и составило 520,64±27,11-106 по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата 347,81±18,64-Ю6; на 5-ые, 7-ые и 10-ые сутки увеличение составило - 39,68% (р<0,001), - 31,36% (р<0,001) и - 23,90% (р<0,01) соответственно. На 15-ые и 30-ые сутки количество ядросодержащих клеток оставалось выше контроля - на 15,55% (р<0,05) и - на 10% (р>0,05) (рис.7 А).

На рис. 7(Б) представлены данные исследования ядросодержащих клеток в ткани селезенки на фоне введения препарата граноцит экспериментальным животным, подвергшимся гипокинетическому воздействию. Достоверное увеличение ЯСК было зафиксировано с 3-х по 15-ые сутки в среднем на 10-20%, к 30-ым суткам количество ЯСК оставалось выше контроля - на 8,13% (р>0,05).

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании гемопоэзиндуцирующего микроокружения костного мозга и стромальных «ниш», в процессах пролиферации и дифферен-цировки миелоидных прекурсоров (Watt F.M., 2000). Следует отметить, что в процессе культивирования ММСК они приобретают все черты, характерные для фибробластоподобных стволовых клеток, т.е. округлую и отростчатую форму и дают положительную реакцию на остеопо-этин - специфический маркер мезенхимальных элементов (P.M. Хаитов, 2001; В.А. Козлов, 2004; F.M.Watt, 2000).

Особенности взаимосвязей между параметрами системы крови экспериментальных животных на разных стадиях формирования адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе

Устойчивость гомеостаза обеспечивается эволюционно закрепленными механизмами адаптации, которые проявляются на всех уровнях организации живой материи. Многофакторно организованные механизмы управления жизнеобеспечения работают по каскадному принципу (В.П. Шахов, 2004; Д.З. Шибкова, 2006).

Длительная гипокинезия приводит к перестройке прямых и обратных регулирующих связей между основными биохимическими параметрами, системой цигокинов и клеточных элементов крови, обуславливающих поддержание динамического равновесия в условиях хронического стресса.

Корреляционный анализ выявил исчезновение ряда связей, характеризующих состояние системы крови у контрольных животных и формирование новых нетипичных связей для группы контроля.

Перераспределение активности между компонентами системы крови является необходимым условием компенсации морфофункцио-нальных нарушений в организме, вызванных действующим фактором.

Общее количество корреляционных связей между исследуемыми показателями к 3-им суткам гипокинетического воздействия снижается - на 15,2%, а к 15-ым суткам - на 24%.

Так, число стабилизирующих систему достоверных отрицательных связей снижается на 23% к 3-им суткам гипокинетического воздействия, появляются новые положительные связи, например, между про-воспалительным ингерлейкином ИЛ-4 с нейтрофилами (г=0,7) и моноцитами (г=8) периферической крови.

Отношение числа отрицательных и положительных связей к 7-ым суткам составляло 2,24 в пользу последних, тогда как в контроле, это соотношение было 1,26. Это свидетельствует о продолжающемся процессе активации системы крови в целях формирования новой функциональной системы, обеспечивающей активацию компенсаторно-адаптационного процесса в условиях гипокинетического воздействия.

В целом, корреляционный анализ показывает, что регуляторные связи в системе крови при 30-ти суточной гипокинезии подвержены и количественным, и качественным изменениям.

С помощью многофакторного дисперсионного анализа признаков сопряженности в главной (обобщенной) линейной модели было выявлено, что на количество содержания ЯСК тимуса в условиях гипокинетического воздействия наиболее существенное влияние оказывали цито-кины сыворотки крови: ИЛ-4, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-12 и РАИЛ, среди которых наиболее значимыми были ИЛ-1а, ИЛ-6 и РАИЛ (статистика Валь-да для коэффициентов в главной линейной модели был равен

22,3 (р<0,001), 22,8 (р<0,001), 11,1 (р<0,001) соответственно); на относительное количество нейтрофилов в периферической крови существенное влияние оказывали ИЛ-10 сыворотки крови, РАИ Л и ИЛ-1а костного мозга. При этом ведущим фактором, определяющим изменение количества нейтрофилов в периферической крови, оказался ИЛ-1Р костного мозга (статистика Вальда = 116 (р<0,01)); а на относительное количество моноцитов - ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИЛ-12 и РАИЛ сыворотки крови, среди которых наибольшее влияние оказывали РАИЛ и ИЛ-1Р (статистика Вальда = 324 (р<0,001) и 260 (р<0,001) соответственно).

Количество ОКК в костном мозге в условиях гипокинетического стресса в основном определялся изменениями уровня ИЛ-1Р сыворотки крови, ИНФ-у костного мозга (статистика Вальда = 934,2 (р<0,001) и 27,3 (р<0,001) соответственно). Другие факторы, как ИЛ-10 сыворотки крови, ИЛ-1а костного мозга, оказывали достоверное, но менее значимое, по сравнению с ИЛ-1Р и ИНФ-у, влияние; на количество ММСК оказывал влияние уровень ИЛ-1Р в сыворотке крови (статистика Вальда = 15,9 (р<0,001)).

Таким образом, цигокины регулируют функции организма, обеспечивая развитие защитных реакций и поддержания гомеостаза при различных воздействиях (Симбирцев А.С., 2004).

Обсуждение полученных результатов

Анализ научных источников и результаты собственных экспериментальных исследований позволили выявить основные закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе.

В системе крови в период 30-ти суточной гипокинезии наблюдались гомеостатические сдвиги, указывающие на этапность включения адаптационных процессов.

Данные исследования, представленные в третьей главе (динамика содержания кортикостерона, молекулярных продуктов перекисного окисления липидов, содержание ядросодержащих клеток в иммуноком-петентных органах, активность МАО и др.), свидетельствуют о том, что реакция системы крови на хронический гипокинетический стресс характеризуется как наличием синхронных, так и гетерохронных реакций. В

частности, в острой фазе гипокинетического синдрома увеличивается количество лейкоцитов в периферической крови (достоверно на 40-50%); провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и ткани костного мозга (на 25-70% выше контрольных значений), за исключением цитокина ИЛ-12. Такие показатели, как абсолютное содержание кариоцитов в тимусе, селезенке, снижаются на всех сроках экспериментального воздействия, тогда как в костном мозге в период с 1-ых по 7-ые сутки количество кариоцитов удерживается на уровне 15-ти - 30-ти процентов выше контроля. Еще большие значения выявлены для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. Совершенно очевидно, что клеточное опустошение тимуса и селезенки компенсируется активацией адаптационно - компенсаторных процессов на уровне миеловдного ростка с 3-х по 7-ые сутки исследования.

В острой фазе гипокинетического синдрома значения показателей стресс - реализующей системы были повышены. Это подтверждается увеличением содержания кортикостерона в плазме крови на 55-73%, малонового диальдегида в ткани костного мозга, тимуса и селезенки на 20-22%; напротив, активность моноаминооксидазы в этих органах снижается на 27-35%, а интенсивность процессов липопероксидации увеличивается, о чем свидетельствует повышенное содержание кетодиенов и сопряженных триенов на 12-15%. Также повышалась активность стресс-лимигирующей системы на уровне антиоксидантных ферментов в острую фазу стресса в костном мозге, тимусе и селезенке.

Ограничение стресс-реализующей системы на уровне органов и тканей происходит за счет активации локальных стресс - лимитирующих систем (антиоксидантных систем), включающих в себя антиокси-дантныс ферменты: супероксиддисмутазу, катал азу, церулоплазмин, глутатионредуктазу. Падение их активности может привести к повреждению органов и организма в целом, что и наблюдается в хронической фазе гипокинетического стресса.

Повышенный уровень глюкокортиковдов (увеличение на 50%) способствует активации свободнорадикальных процессов в хроническую фазу гипокинетического синдрома. Наблюдается однонаправленность в функционировании стресс - реализующей системы: МДА на

10-ые - 30-ые сутки гипокинетического стресса в ткани костного мозга, тимуса и селезенки повышается до 29-32%, активность МАО - до 26-30%, содержание продуктов липопероксидации: диеновых коньюга-тов, вторичных кетодиенов и сопряженных триснов было увеличено на 15 - 43%. Напротив, активность антиоксидантных ферментов, деятельность которых направлена на ограничение ПОЛ, в фазу хронического стресса снижалась. Для хронического гипокинетического стресса характерен дисбаланс про- и антиоксидантных систем, который проявляется в нарушении различных звеньев гомеостаза, а именно: в нарушении различных звеньев гомеостаза. Коррекцию нарушения со стороны органов системы крови можно осуществить за счет активации гемопоэза с помощью цитокинов, в частности граноцита.

Известно, что применение граноцита вызывает усиление пролиферации и дифференцировки гранулоцитомакрофагальных колониеобра-зующих единиц, стимуляцию белого ростка системы крови, индуцирует развитие лейкоцитоза и поступление ММСК в кровь (Е.Д. Гольберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др., 2005; В.П. Шахов и др., 2005; P.Bianco et al; 1999). При введении граноцита в наших опытах достоверно увеличивалось: количество ММСК (с 3-их по 15-ые сутки гипокинетического воздействия); количество ОКК в костном мозге ( с 1-ых по 15-ые сутки); общее количество лейкоцитов (с 3-х суток); ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке (с 3-х до 30 суток). Усиление локальной продукции ММСК в костном мозге привело к запуску и активации каскадоподоб-ных механизмов в ответ на введение граноцита, влияющего на миело- и мезенхимопоэз.

Так как стресс - реализующей системе при гипокинетическом воздействии противостоит антиоксидангная система, то для усиления активации последней мы вводили экзогенный гуморальный антиоксидант церулоплазмин (ЦП), который влияет на активность перекисного окисления липидов. Данный белковый фермент выступает в качестве перехватчика супероксидного анион-радикала и гипохлорида (А.Н. Закиро-ва, Л.Н. Мингазетдинова и др., 1994).

Предварительное введение церулоплазмина преду преждает угнетение тканевых антиоксидантных ферментов, способствует снижению

содержания молекулярных продуктов ПОЛ на всех сроках воздействия гипокинезии у экспериментальных животных.

В целом, результаты экспериментального исследования углубляют и расширяют современные представления о закономерностях молеку-лярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при воздействии экстремальных факторов. В частности, в отличие от ранее проведенных исследований по воздействию острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных, нами получены новые данные о роли цигокиновой «сети», про- и анти-оксидантной системы в адаптационных процессах, а также экспериментально доказана эффективность использования препарата граноцит и ангиоксиданга церулоплазмина в качестве средств, снижающих уровень деструктивных процессов и повышающих активность процессов репарации в системе крови.

Выводы

1. При моделировании длительного гипокинетического стресса в организме экспериментальных животных была выявлена активация стресс - реализующей системы:

в в периферической крови на 1,3, 7-ые сутки достоверно увеличивалось содержание кортикостерона, соответственно на 55%, 80%, 73% относительно контроля;

• отмечалась фазность в динамике содержания МАО в костном мозге, тимусе, селезенке: достоверное снижение с 6-ти часов до 3-их суток; повышение с 5-ых по 10-ые сутки (с максимумом на 7-ые сутки) с последующим снижением с 15-ых по 30-ые сутки во всех исследуемых органах;

в интенсивность процессов липвдной пероксидации (ПОЛ) в костном мозге, тимусе и селезенке протекало в две фазы: в 1-ой фазе (начиная с 3-их суток) происходило снижение первичных гептанрастворимых молекулярных продуктов ПОЛ с последующей нормализацией к 30-ым суткам. Содержание вторичных молекулярных продуктов ПОЛ, растворимых как в гепганег, так и в изопропанолег, было достоверно повышено; максимум повышения молекулярных продуктов ПОЛ, растворимых

в гсптанег, зафиксирован в костном мозге - на 43,25%, в селезенке - на 40% (15-ые сутки), в тимусе - на 44,4% (30-ые сутки);

• уровень малонового диальдегида (МДА) в ткани костного мозга, тимуса и селезенки достоверно повышался с первых суток гипокинезии, достигая максимума (130% от контроля) к 10-ым суткам.

2. Активность антиоксидантных ферментов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки (СОД, каталаза, церулоплазмин, глутатионредукта-за) в течение первых трех суток гипокинетического воздействия достоверно увеличивалась, а с 5-ых по 30-ые сутки наблюдалось снижение их активности; в частности, минимальные значения активности катал азы отмечались на 7-ые - 15-ые сутки, а СОД с 15-ых по 30-ые сутки (8185% от контроля). Предварительное введение церулоплазмина предотвращало угнетение активности этих ферментов.

3. При действии острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных деструктивные изменения выражались в достоверном уменьшении массы и клеточности (ЯСК) тимуса до 45-56% на 10-ые - 30-ые сутки, массы и клеточности селезенки на 10-ые - 15-ые сутки. Введение граноцита сопровождалось активацией репаративных процессов на всех сроках действия гипокинетического стресса.

4. При действии гипокинетического стресса динамика количества кариоцитов в костном мозге экспериментальных животных была представлена двумя фазами: достоверным увеличением клеточности в первые семь суток и снижением данного показателя на 10-ые - 15-ые сутки исследования, диапазон изменений составил 32% от контрольных значений. Увеличение клеточности костного мозга сопровождалось ростом количества мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на 48-74% (3-ьи - 7-ые сутки). Введение препарата граноцит животным во время гипокинетического стресса оказывало протекторное действие на костномозговое кроветворение: количество кариоцитов увеличилось в 2,5-3 раза; количество ММСК - в 2-2,5 раза по сравнению с показателями животных, не получавших препарат граноцит.

5. В периферической крови наблюдаются фазные изменения общего количества лейкоцитов: достоверное увеличение в ранние сроки; с восстановлением данного показателя до уровня нормы к 15-ым суткам. При

этом количество лимфоцитов было достоверно снижено на всех сроках гипокинетического стресса. У животных, получавших граноцит. было выявлено увеличение общего количества лейкоцитов в 3-3,5 раза.;

6. При воздействии гипокинетического стресса динамика содержания провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИНФ-у) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов в крови и костном мозге экспериментальных животных носила однонаправленный характер (в сторону увеличения): максимальные значения показателей провоспалительных цитокинов отмечены на 5-ые - 7-ые сутки; высокий уровень противовоспалительных цитокинов отмечен на всех сроках гипокинетического воздействия. ,

7. Длительная гипокинезия приводит к перестройке взаимосвязей между цитокиновой «сетью», про- и антиоксидантой системой, обеспечивающей поддержание динамического равновесия в системе крови при воздействии острого и хронического гипокинетеческого стресса. Многофакторный анализ результатов исследования выявляет ведущую роль цитокинов (РАИЛ, ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-6), влияющих на включение мо-лекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови у экспериментальных животных.

Список публикаций по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Латюшин, Я. В. Роль микроэлементов в организме животных / Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та.- Сер. 4, Естесгв. науки,-2005.-№ 7. - С. 150-156.

2. Латюшин, Я. В. Особенности влияния хронического стресса на перекисное окисление лигаздов в скелетной и сердечной мышцах / Я.В. Латюшин // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2005. - Вып. 5, т. 1.- № 4 (44). -С. 244-247.

3. Усова, Н. Е. Влияние профилактического введения гамма* оксимасляной кислоты на некоторые показатели обмена липидов у животных, подвергнутых стрессам / Н. Е. Усова, Я. В. Латюшин, Ю. Г. Камскова // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. - Серия: Образование,

здравоохранение, физическая культура. - 2005,- Вып. 5,.- т. 1,- № 4 (44). - С. 283-285.

4. Влияние эмоционально-болевого стресса на поведенческую активность крыс в тесте «открытое поле» / Я. В. Латюшин, Ю. Г. Кам-скова, Н. В. Мамылина, В. И. Павлова // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2006. -Вып. 7. - т. 1, - № 3 (58). - С. 178-179.

5. Анализ тревожно - фобического состояния крыс в результате действия острого и хронического стрессов / Я. В. Латюшин, В. И. Павлова, Н. В. Мамылина, Л. П. Щетинкина, Т. Б. Язовских // Вестн. урал. мед. академ. науки. - Екатеринбург, 2006. - № 3 (2). - С. 109-110.

6. Латюшин, Я. В. Состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов у рабочих электроплавильного производства Челябинского абразивного завода в слюне, испытывающих стресс / Я. В. Латюшин, А. Ф. Андрианов // Вестн. урал. мед. академ. науки. -Екатеринбург, 2007. -№ 1,- С. 46-48.

7. Физическая нагрузка в адаптации спортсменов и профилактике психофизического переутомления/ В. И. Павлова, Я. В. Латюшин, Н. В. Мамылина, М. С. Терзи // Теория и практика физической культуры. - 2007.-№ 10. - С. 11-14.

8. Латюшин, Я. В. Влияние препарата «Граноциг» на общее количество клеток мозга и периферической крови при действии хронического стресса/ Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008. -№ 7,- С. 272-280.

9. Шахов, В.П. Представление о системе мезенхимопоэза и ме-зенхимальных стволовых клетках/ В. П. Шахов, Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008 .- № 8. - С. 261-278.

10. Латюшин, Я. В. Особенности влияния хронического стресса на динамику перекисного окисление липидов в тканях костного мозга/ Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008. -№9. - С.271-277.

11. Латюшин, Я.В. Влияние хронического стресса на динамику ПОЛ в ткани костного мозга. / Я.В. Латюшин // Вестник ЧГПУ - 2008. -№9.-С. 264-271.

12. Латюшин, Я. В. Роль цитокинов и гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора в регуляции локального гомеостаза кост-

ного мозга на уровне мезенхнмальных стволовых клеток при моделировании гипокинезии/ Я. В. Латюшин, В. П. Шахов, В. И. Павлова // Веста, урал. мед. академ. науки. - Екатеринбург, 2009. - Т. 26. - № 3. -С. 7-29.

13. Стимуляция мезенхнмальных стволовых клеток и костномозгового гемопоэза с помощью гранулоцигарного колониестимулирующе-го фактора при дезадаптации организма/ Я. В. Латюшин, Н. Ю. Шелга-ев, В. И. Павлова, В. П. Шахов // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. 2009. - Вып. 21, -№39(172). - С. 92-95.

14. Латюшин, Я. В. Динамика ангиоксидантных ферментов в костном мозге животных на фоне коррекции церулоплазмином при действии эмоционально-болевого и гипокинетического стресса/ Я. В. Латюшин, В. И. Павлова, Н. В. Мамылина // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. -2009. 12 .-С. 319-325.

Монография:

15. Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем/ В. П. Шахов, Я. В. Латюшин, С. В. Попов, А. П. Сипок. - М.. Изд-во МГОУ, 2008. - 252 с.

Публикации в других изданиях:

16. Латюшин, Я. В. Антиоксидантная защита костного мозга при действии стресса/ Я. В. Латюшин // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2007.-Вып.12, -№ 16 [88]. - С. 142-144.

17. Угнетение поведенческой активности при длительной гипокинезии и защитные механизмы стресс - лимитирующих систем/ Я. В. Латюшин, Ю. Г. Камскова, В. И. Павлова И. В. Лактионова, Н. В. Мамылина, Д. А. Сарайкин, Н. Е. Усова // Научные труды I съезда физиологов СНГ. - М., 2005. - Т. 2. - С. 238-239.

18. Латюшин, Я. В. Роль цитокинов в процессе адаптации организма к хроническому стрессу / Я. В. Латюшин, Л. П. Щетинкина // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным

факторам среды : материалы II научно - практ. конф., 8-11 нояб. 2008 г. : в 2 т. - Челябинск, - 2008. -.Т.2. - С. 384-387.

19. Latyushin, Ya. V. Adaptation of the organism to longtime hypokinesia by activation of stress-limiting systems / Ya. V. Latyushin, V. I. Pavlova, Yu. G. Kamskova //International society for adaptive medicine (ISAM) VIII world congress. June 21-24, Moskov, Russia. - 2006. - P. 103.

20. Latyushin, Y. V. The Disadaptive Action of the Nervous and Immune Systems in the Acute and Chronis Stress // Y.V. Latyushin / International Symposium «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». - Saint-Petersburg, 2007. - P. 43.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

« ГК - гипокинезия;

• Г- КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ® ИЛ - ингерлейкин;

• ИФН - интерферон;

• МАО - моноаминооксидаза;

в МДА - малоновый диальдегид;

• ММСК - мультипотснтные мезенхимальные стромальные клетки;

в ОАС - общий адаптационный синдром;

• ОКК - общее количество кариоцитов; в ПОЛ - перекисное окисление липидов; в СМ - стромальное микроокружение;

• СОД - супероксиддисмутаза;

в ФНО - фактор некроза опухоли;

в ЦП - церулоплазмин;

® ЯСК - ядросодержащие клетки.

На правах рукописи

Латюшин Ян Витальевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫХ АДАПТАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В СИСТЕМЕ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ГИПОКИНЕТИЧЕСКОМ

СТРЕССЕ

03.03.01 - физиология

Подписано к печати 22.05.2010г. Формат 60x84 1/16 Объем 2,0 уч.-изд.л. Заказ № 1152. Тираж 100 экз. Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ЧГПУ 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 69

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Латюшин, Ян Витальевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Адаптационно-компенсаторные реакции системы крови в условиях стресса

1.1. Влияние стресс-реакции на систему крови и развитие общего адаптационного синдрома.

1.2. Цитокины-медиаторы взаимодействия между нейроэндокринной и иммунной системами, обеспечивающие адаптационные процессы в системе крови.

1.3. Роль кроветворных и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в адаптационных процессах в условиях стресса.

1.4. Состояние прооксидантно - антиоксидантной системы при стрессовых воздействиях.

1.5. Регулирующая роль про- и противовоспалительных цитокинов в системе крови в поддержании гомеостаза при различных экстремальных воздействиях.

1.6. Влияние гормонов и цитокинов на поведенческую активность экспериментальных животных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Экспериментальные животные и моделирование гипокинезии.

2.2. Гематологические методы исследования.

2.3. Иммунологические методы.

2.4. Физиологические методы:.

2.5. Биохимические методы исследования.

2.5.1. Методика определения перекисного окисления липидов.

2.5.2. Методика определения малонового диальдегида.

2.5.3. Определение активности моноаминооксидазы (МАО) (К.Ф.1.4.3.4).

2.5.4. Определение активности супероксидцисмутазы (СОД) (К.Ф.1.15.1.1.) в органах.

2.5.5. Определение активности каталазы (К.Ф.1.11.1.6.) в органах.

2.5.6. Определение церулоплазмина в тканях.

2.5.7. Определение глутатионредуктазы (К.Ф. 1.6.4.2.).

2.5.8 Статистические методы обратоки данных.

ГЛАВА 3. Влияние повреждающего действия острого и хронического гипокинетического стресса на систему крови у экспериментальных животных.

3.1. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание гормона кортикостерона и активность моноаминооксидазы (МАО).

3.2. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на процессы перекисного окисления липидов(ПОЛ) в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных.

3.3. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на состояние стресс-лимитирующей системы у экспериментальных животных.

3.4. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на изменение массы тимуса и содержания в нем ЯСК у экспериментальных животных.

3.5. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на изменение массы селезенки и количества ядросодержащих клеток в ней у экспериментальных животных.

3.6. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на показатели количества лейкоцитов в периферической крови и клеток лейкоцитарной формулы у экспериментальных животных.

3.7. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание количества клеток миелоидного ряда костного мозга экспериментальных животных.

ГЛАВА 4. Роль цитокинов в системе крови в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

4.1. Динамика содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.2. Динамика содержания провосполительных цитокинов в ткани костного мозга у экспериментальных животных подвегшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.3. Динамика содержания противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.4. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание противовоспалительных цитокинов в ткани костного мозга у экспериментальных животных.

4.5. Изучение поведенческой активности животных, перенесших острый и хронический гипокинетический стресс.

4.6. Влияние предварительного введения препарата церулоплазмина на поведенческую активность животных, перенесших острый и хронический гипокинетический стресс (гипокинезию).

Глава 5. Влияние препарата граноцит и препарата церулоплазмин на систему крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1. Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу периферической крови и массу тела экспериментальных животных при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1.1. Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарную формулу при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1.2. Влияние препарата граноцит на показатели лейкоцитарной формулы у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

5.2. Влияние препарата граноцит на количество клеток костного мозга у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и

5.3. Влияние препарата граноцит на общее количество кариоцитов и на количество мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у экспериментальных животных, подвергшихся действию

5.4. Влияние препарата граноцит на динамику массы тимуса, селезенки и ядросодержащих клеток в них у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса

5.4.1. Влияние препарата граноцит на массу тимуса экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.4.2. Влияние препарата граноцит на массу селезенки экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.4.3. Влияние препарата граноцит на количество ЯСК в селезенке экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.5. Влияние препарата церулоплазмин на активность про- и антиоксидантных систем у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе"

Актуальность проблемы

Исследования гипокинезии как стресс-фактора началось в 60-70-годы XX века в связи с активным развитием космической биологии (В.В. Португалов, 1967; Г.П. Быков, 1970; И.В. Федоров и др., 1972; С.Е. Ли, О.И. Кириллов, 1974; Е.А. Коваленко, 1975). Экспериментальные работы 8090-ых годов прошлого века характеризовались изучением адаптационных изменений на различных уровнях организации биологических систем (Е.А. Коваленко, H.H. Гуровский, 1980; П.Д. Горизонтов, 1983; В.Н. Швец и др., 1984; С.М. Иванова и др., 1986; Д.З. Шибкова, 1987; Ф.З. Меерсон, H.A. Фомин, В .И. Павлова, Д.З. Шибкова, 1988; И.А. Попова, 1988; Д.И. Бельченко, 1990).

В работах Е.А. Воротниковой (1984), О.Г. Газенко и др. (1986), Ф.З. Меерсона и др. (1988), P.A. Тиграняна (1990), А.Г. Грицука (1995), Е.А. Коваленко (2000), Т. Kawata et. al. (1988) длительная гипокинезия являлась моделью, при которой реализуются резервные механизмы адаптации организма на морфо-функциональном, биохимическом и генетическом уровне (Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1998).

В исследованиях Б.И. Кузника, H.H. Цыбикова (1981), Д.Н. Маянского (1991), В.П. Акопяна, JI.C. Баляна и др. (1997) показано, что, попав в экстремальные условия, организм мобилизует различные адаптационные программы, достигая полноценного приспособления к стрессирующим факторам внутренней и внешней среды.

А.П. Ястребов и др., 2009; В.А. Черешнев и др., 2004,; Д.З. Шибкова,

A.B. Аклеев, 2006, С.Л Сашенков и др., 2006, 2008).

В последние десятилетия активно изучается влияние стресса на механизмы регуляторных процессов в организме человека и животных, показана его роль в адаптационном процессе при участии цитокиновой сети и антиоксидантов на моделях эмоционального, болевого, травматического и прочих стрессов. При действии стресса вся регулирующая информация идет от нервной системы через гипофизарно-адреналовую, лимфоидную систему и гемопоэтические органы. Существенно, что весь этот процесс реализуется на уровне исполнительных тканей и органов (P.M. Хаитов, 2001; Ю.Б. Лишманов и др., 2003; A.C. Симбирцев, 2004).

B.Г. Климин, М.В. Северин, 1999, В.П. Шахов и др., 2005, 2008).

В настоящее время разрабатываются новые схемы восстановления гемопоэза. Особая роль принадлежит мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК). Они способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции таких цитокинов, как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15 (И.Ю. Маклакова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании специфического микроокружения многих органов, включая и костный мозг. Они являются основой матричной единицы, так называемых «ниш», в которых происходят процессы хранения, созревания и дифференцировки предшественников эритропоэза, гранулоцитомонопоэза, тромбоцитопоэза и их малодифференцированных прекурсоров (A.M. Дыгай, В.П. Шахов, 1989; Ю.А. Романов и др., 2005; Beyer et. al., 2006; L.M. da Silva et al, 2008; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000, 2006).

Исследований взаимодействия системы мезенхимопоэза и цитокиновой сети при хроническом стрессе крайне мало. Имеются противоречивые сведения об уровнях содержания цитокинов и костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом стрессе, вызванном гипокинезией (И.Л. Чертков, O.A. Гуревич, 1984; A.C. Симбирцев, 2004; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000; Y. Miura, Z. Gao, M. Miu, 2006).

Также противоречивы сведения об участии системы крови и регулирующих её факторов в обеспечении резистентности организма к неблагоприятному действию гипокинезии (Г.И. Козинец и др., 1983; Г.Н. Дурнова и др., 1989; Б.И. Кузник и др., 1989; P.A. Тигранян и др., 1990; С.Н. Теплова, Д.А. Алексеев, 2002). По-прежнему остаются открытыми вопросы коррекции повреждающего действия гипокинезии на организм человека, животных и систему крови, в частности.

Большой интерес представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который является ростовым фактором для гранулоцитарно-макрофагальных типов клеток - предшественников, способным усиливать процессы фагоцитоза в лейкоцитах. В отдельных работах по изучению действия Г-КСФ на пул мезенхимальных стволовых клеток показано, что под действием данного цитокина увеличивается выброс их количества из костного мозга в кровь (В.П. Шахов, И.А. Хлусов, Г.Ц. Дамбаев и др., 2004; R.W. Johnson et al, 1997). Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно - сосудистой системы. При таком стресс-факторе, как гипокинезия, закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови изучены недостаточно и отражены лишь в единичных работах (Ф.И. Ершов и др., 2004).

В связи с отсутствием систематизированных данных о влиянии длительной гипокинезии на состояние костномозгового кроветворения показатели миелопоэза), регулирующего влияния цитокинов на 9 кроветворение актуальным является изучение молекулярно-клеточных изменений в крови при адаптации к гипокинезии и возможности коррекции повреждающего действия гипокинетического фактора. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

В рамках этой общей цели решались следующие задачи:

Научная новизна исследования

Установлен комплекс параметров, характеризующих состояние систем органов экспериментальных животных в зависимости от длительности воздействия гипокинетического стресса: на ранних сроках (1-ые - 7-ые сутки) в периферической крови достоверно повышается содержание кортикостерона, цитокинов (ИЛ-10, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-4), наблюдается выраженный лейкоцитоз; в костном мозге увеличивается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-4), отмечена активация антиоксидантных ферментов и миелопоэза; в хронической фазе гипокинетического синдрома в плазме крови повышается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), а в костном мозге - ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

С увеличением сроков гипокинетического воздействия нарастают деструктивные изменения в органах системы кроветворения, что подтверждается достоверным повышением уровня ПОЛ в костном мозге, селезенке и тимусе на фоне снижения содержания антиоксидантных ферментов; введение гуморального антиоксиданта церулоплазмина на ранних стадиях гипокинетического стресса сопровождалось повышением активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) и снижением интенсивности процессов липопероксидации.

Впервые экспериментально установлено, что глубина деструктивных процессов в кроветворных органах достоверно снижалась при корреции последствий, вызванных острым и хроническим гипокинетическим стрессом, препаратом граноцит. Впервые показано, что дестабилизация гомеостаза, вызванная гипокинетическим воздействием, сопровождается перестройкой регуляторных механизмов в системе крови, что приводит к включению процессов компенсации с участием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Баланс между процессами деструкции и регенерации клеточных элементов в системе крови при действии гипокинетического стресса был обусловлен активацией процесса пролиферации ММСК на фоне введения препарата граноцит.

Выявленная реакция системы цитокиновых регуляторов подтверждает этапность включения молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови, что подтверждается изменением соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при остром и хроническом гипокинетическом стрессе. Впервые показано, что уровень провоспалительных цитокинов повышался в ранние сроки воздействия ГК (исключение составил ИЛ-12), а содержание противовоспалительных цитокинов было достоверно повышено на всех сроках гипокинезии.

Теоретическая и практическая значимость работы

12 организме экспериментальных животных в условиях гипокинезии. По данным исследованиям подана заявка №2009139735 (056294) на получение патента.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования нашли отражения в монографии «Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем», включены в лекционный материал по дисциплинам «Общая физиология», «Физиология спорта», «Основы здорового образа жизни» в Челябинском государственном педагогическом университете, ЮжноУральском государственном университете, Уральском государственном университете им. Горького (г. Екатеринбург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание гуморальных факторов регуляции (цитокинов, антиоксидантов, глюкокортикоидов) в периферической крови, ткани костного мозга, селезенки и тимуса экспериментальных животных зависит от срока гипокинетического воздействия и определяется этапностью развития адаптационных процессов.

2. Функциональная активность цитокиновой «сети» и системы «перекисного окисления липидов — антиоксидантная защита» в системе крови в динамике 30-ти суточной гипокинезии характеризуется различными фазами и обуславливает соотношение процессов деструкции и регенерации в организме экспериментальных животных.

13 активирующих) и обратных (стабилизирующих) связей к 15-ым суткам эксперимента.

4. Использование препаратов церулоплазмина и граноцита эффективно снижает деструктивные и ускоряет репарационные процессы в системе крови экспериментальных животных в условиях 30-ти суточного гипокинетического воздействия.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на 1-ом съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ-ом съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM, Москва, 2006); II-ой Международной научно -практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); IV-ым съезде физиологов Урала (с международным участием) (Екатеринбург, 2009); итоговых научных конференциях ГОУ ВПО «ЧГПУ» (2006, 2007, 2008, 2009).

Публикации по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, - 14.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 300 страницах печатного текста и включает: введение, литературный обзор (глава 1), описание материалов и методов исследования (2), результаты собственных исследований (главы 3, 4 ,5), заключение, выводы, иллюстрирована 32 рисунком и 23 таблицами. Список литературы включает 197 зарубежных источника и 294 отечественных.

Информация о работе

Латюшин, Ян Витальевич
доктора биологических наук
Челябинск, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы