Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий

Архипова, Любовь Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий"

На правах рукописи

Лрхипова Любовь Валентиновна

Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность 03.00.13 - физиология

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино).

Научный руководитель доктор биологических наук

Куликов Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Архипов Владимир Иванович

доктор медицинских наук Катунян Павел Иванович

Ведущая организация НИИ ВНД и Нейрофизиологии РАН

па заседании

Защита состоится^^, 2006 г. в /Л У

диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу-.119992 Москва, Ленинские горы д.1, корпус 12, МГУ, Биологаческий факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б.А.Умарова

Одной из самых сложных и окончательно не решенных проблем современной трансплантологии является несовместимость ткани донора и реципиента. В современных исследованиях широко используют иммунодеирессанты, которые помогают продлить срок выживания пересаженной ткани на время их действия. При этом использование иммунодепрессантов ослабляет иммунную систему организма и может привести к тому, что даже элементарная вирусная инфекция становится смертельно опасной. Вместе с тем, известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами относительной иммунопривилегированности: в первую очередь, к ним относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и семенники, что позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. В норме гисто-гематические барьеры этих областей не пропускают иммунокомпетентные клетки. Активированные иммунные клетки, которые все же проникают в эти обласш, элиминируются под действием Fas-Iigand, экспрессированного в этих участках. Функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Nagata, 1995; Chen, 1998; Сепиашвили, 2003). Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al„ 1995; Griffit et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

Если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы, от нейрональных и опухолевых до эндокринных (Krametz , Greene, 1953; Falck, 1959; Green, 1967; Hoffer, Seiger, 1974; Weber et al., 1975; Брагин, Виноградова, 1983; Миронов, 1988; Adeghate,1998; Adeghate, Donath, 2000). Значительное количество работ посвящено пересадкам в семенник. В частности туда пересаживали тиреоидную ткань, Лейдиговские клетки, клетки гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и др. (Scothorne 1977; Setchell et al., 1995; Кирпатовский и др., 1994,1999; Каитова, 2003).

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС, переднюю камеру глаза и тести кул, успешных работ по компенсации нейрональных или

аты пб 'Й5ШЙ<ё5ции.. i _ГГ-) 200^bktJC?O^

эндокринных дефектов после пересадки соответствующих ст] долгое время не было. Первые удовлетворительные результ

недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Рег1о\у й а1., 1979; В]огк1и1пс1, 81епеу1, 1979). В настоящее время начаты операции при других нейрогенеративных заболеваниях ЦНС -хорее Гентинггона, при эпилепсии, травме спинного мозга (Макренко и др., 1998; Ь'ЫуА а1., 1994; и^шоу е1 а!., 1996; 01апоу е1 а1., 1997).

Возможность пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в относительно иммунопривилегированные области организма с целью компенсации различных патологических состояний представляет сегодня несомненный интерес и, несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ в данном направлении, осталось еще большое количество нерешенных проблем В ходе выполнения работы были поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате проведенных исследований предложены оригинальные модели компенсации экспериментального диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса.

Цель работы

Исследование моделей компенсации патологических состояний животных с использованием свойства относительной иммунологической привилегированности передней камеры глаза, мозга и семенника.

Задачи исследования 1.Оценка эффективности моделей компенсации диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса.

2. Исследование физиологических, биохимических и иммунологических особенностей протекания экспериментального диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса в период их инициации, течения и долговременной компенсации с помощью трансплантации адекватных тканей в переднюю камеру глаза, мозг и семенник. Научная новизна работы 1. Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных.

2 Показано, что в течение 2-4 недель после трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированные участки организма - переднюю камеру глаза, мозг, семенник происходит полная или частичная нормализация основных физиологических и биохимических показателей у животных с экспериментальным диабетом.

3. При пересадке поджелудочной железы в семенник сохраняется фертильность животных.

Результаты исследований носят приоритетный характер. Положения, выносимые на защиту

1. С помощью трансплантации иммунокомпетентных тканей возможна приостановка возрастной инволюции тимуса.

2. Возможно ускоренное восстановление клеточности тимуса после радиационного облучения животных и последующей трансплантации иммунокомпетентных тканей.

3. Трансплантация эмбриональной поджелудочной железы в относительно иммунологически привилегированные области организма (переднюю камеру глаза и мозга) позволяет частично или полностью компенсировать эксперименгальный диабет у животных на сроки соизмеримые с естественной продолжительностью их жизни.

4. Основные метаболические показатели, патологически измененные у животных с диабетом, восстанавливаются после трансплантации неонатальной поджелудочной железы в семенник.

5. Пересадка поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника не оказывает выраженного влияния на фертильность животных.

Научно-теоретическое и практическое значение работы

Существует значительное количество экспериментальных патологических состояний, вместе с тем методов их компенсации на сегодня недостаточно. Проведенная работа предоставляет в распоряжение исследователей несколько новых моделей. В первую очередь, это возможность коррекции физиологических, биохимических, а в некоторых случаях, иммунологических отклонений при различных патофизиологических состояниях Исследованные трансплантологические способы позволяют проследить особенности метаболических изменений в различных системах организма в период возникновения, течения и компенсации таких патофизиологических состояний, как диабет, старение, последствия радиационного облучения. В процессе выполнения работы использованы различные схемы алло- и ксенотрансплантации ткани в различные области организма, что позволяет сравнить их преимущества и недостатки.

Полученные данные расширяют возможности оценки метаболических сдвигов, наблюдающихся в организме больных, с теми патологиями, которые моделировались в эксперименте.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на конференциях, симпозиумах, съездах. Некоторые из них: II съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997); I Международный симпозиум «Фундаментальные науки и альтернативная медицина» (Пущино, 1997); VIII конференция «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998); П1, IV Международные симпозиумы «Биологические механизмы старения» (Харьков, 1998, 2000); Международный симпозиум «Оптимизация функций сердца и мозга» (Тамбов, 2000); 1П Национальный геронтологический конгресс Украины (Киев,2000); Российская научная конференция «Проблемы гериатрии в хирургии» (Москва, 2000); VIRFBR international conference "Molecular medicine" (Pushchino, 2001); XIX съезд физиологического общества имени И.П.Павлова (Казань, 2001); Всероссийская конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001); «IV съезд по радиационным исследованиям» (Москва, 2001); «III съезд биохимического общества» (Санкт-Петербург, 2002); II Всероссийская конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002); конференция « Новые технологии в медицинской практике» (Москва, 2003); I Международная медицинская конференция «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003); Российская конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004); I Международная научно-практическая геронтологическая конференция, посвященная памяти Э.С.Пушковой (Санкт-Петербург, 2005).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав с результатами исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 187 страницах машинописного текста, включающих 17 таблиц, 19 рисунков, 7 диаграмм. В списке цитируемой литерагуры 442 источника (176 в отечественных и 266 в зарубежных изданиях). По результатам исследований опубликовано 43 работы (18 статей и 25 тезисов к докладам).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали крыс-самцов «Вистар» и беспородных крыс. Для операции отбирали животных одного возраста, с начальной массой 200-230 г. Кролики-самцы породы Шиншилла, используемые в экспериментах, имели начальный вес 25003000 г., самки-доноры более 4500 г. Все животные выращивались в условиях вивария на стандартной диете. Длиннохвостые якутские суслики Citellus Undulatus привозились

из экспедиции и затем содержались в специализированных помещениях с необходимым температурным режимом.

Всего в работе использовали более 2500 крыс, более 600 эмбрионов, 135 1-2дн. 1фысят, 30 кроликов, 7 сусликов.

Трансплантация тимуса н костного мозга в ПКГ животных

Трансплантируемую ткань тимуса выделяли из крыс самцов "Wistar" массой 120 г. Костный мозг выделяли из бедренной кости. В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса либо костного мозга измельчали до размера частиц примерно 1 мм3. Крысам-реципиентам на глаз наносили по 1 капле 0,1%-расгвора атропина, через 5 минут по 1 капле 0,5%-раствора дикаина, что в еще большей степени снижало чувствительность глаза при операции. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом. Забирали Материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом. В разрез длиной 1,52 мм медленно (7-10 сек) выдавливали трансплантируемые кусочки ткани объемом 35 мм3 и помещали их на радужную оболочку глаза, как можно дальше от разреза. Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете.

Облучение животных

Эксперименты по облучению проводили на у-установке биологического эксперимента в специальных контейнерах, куда помещали не более 5 животных одновременно. Облучение осуществляли у-лучами 60Со с мощностью дозы 1,51,6 Гр/мин в течение 2,5-5 минут при комнатной температуре.

Получение экспериментального диабета

Экспериментальный диабет у крыс получали с помощью аллоксана фирмы "Chemapol", «ДИАэМ», «Sigma», обладающего избирательным токсическим действием на /?-клетки, продуцирующие инсулин (Баранов, 1983; Басмаджян и др.,1987; Lenzen, 1988). Внутрибрюшинно вводили 5%-раствор токсина, из расчета 200-280 мг сухого вещества на 1 кг массы тела. У кроликов экспериментальный диабет вызывали внутривенным введением 170 мг/кг 5%-раствора аллоксана.

Аллотрансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и в боковые желудочки мозга крыс

Для трансплантации отбирали животных, у которых в течение 2-3 "х недель гликемия была не менее 20 ммоль/л (чаще всего 21-25 ммоль/л), а глюкозурия, как правило, превышала 2%. Пересадку ткани проводили в стерильных условиях. В работе

использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью. В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорожденных крысят.

Трансплантацию проводили под эфирным наркозом по методике, разработанной в нашей лаборатории д.б.н. A.B. Куликовым совместно с д.б.н. А.Г. Брагиным.

Иммунодепрессанты ни до операции, ни после нее не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете.

Подготовка трансплантата из ткани поджелудочной железы крыс Трансплантат готовили из ткани поджелудочной железы эмбрионов и новорожденных крысят. После вскрытия брюшной полости хвостовая часть поджелудочной железы удалялась и помещалась в раствор Хэнкса, где производилось ее механическое измельчение на кусочки диаметром 1-3 мм при помощи микрохирургического пинцета и ножниц. Для одной пересадки использовалось 25 30 мкл измельченной поджелудочной железы, взятой от 3-4 доноров.

Аллотрансплантацин ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальвую клетчаточную щель семенника Этот метод трансплантации был разработан совместно с сотрудниками каферы оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН (проф. И.Д. Кирпатовским, с..с. В.Н. Бродягиным, асп. Ю.И. Кистнер). Операция проводилась под общей анестезей парами эфира. По средней линии живота выполнялся разрез длиной 2 см. Лев й семенник выводился в рану. В бессосудистой зоне семенника производился прокч белочной оболочки. Строго под белочной оболочкой поверх семенных канальце поочередно вводились микродилататоры различного диаметра по ходу паравазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника, не проникая в паренхиму органа. В результате формировался искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев Затем в созданный карман паравазальной клетчаточной щели вводились микрофрагменты ткани поджелудочной железы объемом 25-30 мкл с помощью дозатора «MICROMAN» и операционная рана зашивалась.

После аллотрансплантации неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник, с целью проведения в дальнейшем биологического теста для определения фертильности животных, у крыс без диабета осуществлялась односторонняя перевязка и пересечение семенного протока интактного (правого) семенника.

Тестирование уровня глюкозы в крови и моче, определение инсулина (в сыворотке крови, в поджелудочной железе и трансплантате), определение нейромедиаторов (норадреналина и серотонина) в структурах мозга, синтеза белка и РНК в мозге,

определение количества тимоцитов и фрагментированной ДНК, гистологические, иммуногастохимические исследования ткани, динамическая тонометрия оперированных глаз, определение потребления воды, тест на фертильность у экспериментальных животных проводили по стандартным методикам.

Статистика

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Статистика. Для полученных величин проводился подсчет среднеквадратической ошибки. Различия средних величин признавалось достоверным при уровне значимости р<0,05 (по Стъюденту).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ТКАНЕЙ

С целью изучения возрастной инволюции тимуса и компенсации иммунологической недостаточности животным трансплантировали иммунокомпетентные ткани (тимус и костный мозг) в переднюю камеру глаза.

Предварительно была исследована динамика изменения количества тимоцитов и фрагментированной ДНК в гимусе у животных разного возраста (Диаг. 1, 2).

Диаграмма 1.

Количество тимоцитов у интактных животных

Было показано, что у 20-месячных крыс по сравнению с 2,5-месячными наблюдается более чем 90 кратное уменьшение содержания тимоцитов в тимусе.

В то же время увеличивается количество фрагментированной ДНК в тимоцитах. Если у 2,5-месячных животных оно составляет 5%, то у 20-месячных крыс такой неполноценной ДНК уже 25%.

Диаграмма 2.

Количество фрагментированной ДНК у интактных животных разного возраста

(п=12) (п=11) (п>4) (п=14) (п^) (п=5) (п«3|(мвс) |

п - количество животных.

Далее, исследовалась возможность влияния иммунокомпетентных клеток алло - и ксенотрансплантатов предотвращать возрастную деградацию собственного гимуса у реципиентов различных возрастных групп и при разной продолжительности функционирования трансплантата.

Показано, что количество тимоцитов через 3 месяца после трансплантации тимуса в ПКГ крыс увеличилось по сравнению с интактным контролем: в 3 раза у 5-месячных животных, в 2,2 и 2,7 раза у 7 и 8-месячных крыс соответственно (табл.1).

Табл.1. Количество тимоцитов в вилочковой железе у животных разного возраста через 3 месяца после трансплантации (10*7)

Вид опыта Возраст животных

5 месяцев 7 месяцев 8 месяцев

Контроль 2,2 ±0,45 1,2 ±0,13 0,33 ± 0,07

Кол-во животных (п) п = 4 п = 4 п = 4

После трансплантации 6,5 ± 0,63* 2,7 ± 0,25* 0,9 ±0,1*

Кол-во животных (п) п = 5 п = 5 п = 6

* - Р < 0,001

Общепринято считать, что ксенотрансплантация ткани чаще дает худшие результаты, чем аллотрансплантация. Однако, в случае внедрения любого экспериментального способа компенсации той или иной патологии в практику, непременно встанет вопрос о доступности донорского материала и, как следствие, о ксеногенных донорах. У млекопитающих по мере старения происходит необратимая

инволюция тимуса, исключением являются только зимнеспящие животные, у которых наблюдается ежегодная инволюция и последующая регенерация ткани тимуса (Колаева и др., 2003; Куликов, 2005). Поэтому, мы провели серию экспериментов по ксенотрансплантации тимуса сусликов в ПКГ 7-месячных крыс, а также (для сравнения) трансплантацию ткани тимуса аллогенного донора.

Трансплантация ткани тимуса от активных длиннохвостых якутских сусликов СЬеНш ШсШаШв в относительно иммунопривилегированную ПКГ крыс приводит к достоверному торможению возрастной инволюции тимуса. Количество тимоцитов по сравнению с интактным контролем возрастает на 55%, что дает даже лучшие, чем при аллотрансплантации результаты, где показатель прирост тимоцитов составил в данной серии только 10%, хотя в других экспериментах достигал 36% (диаг.З).

Диаграмма 3.

Количество лимфоидных клеток тимуса у 7-месячных крыс через 1 месяц после алло- и ксенотрансплантации ткани тимуса

иитактиый тр-т тимуса тр^т легкого тр-т тимуса I

контроль суслика суслика крысы '

| (л«в) |«1 (п-7) (п-10)

I__________________

Трансплантация ткани легкого от сусликов (контроль на специфичность ткани) не повлияла на количество тимоцитов.

Параллельно с количеством тимоцитов определяли процент фрагментированной ДНК в тимусе. Так, через месяц после аллотрансплантации у 7-ми месячных животных этот показатель снижается более чем в вдвое (с 7,2% до 3,1%).

Показана возможность приостановки необратимого возрастного снижения клеточности тимуса у животных с помощью разработанных способов алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в относительно иммунопривилегированную переднюю камеру крыс.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ТКАНЕЙ (ТИМУС, КОСТНЫЙ МОЗГ) ПОСЛЕ РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ

Известно, что радиационный стресс в сублетальных дозах, как и многие другие

виды стрессов, приводит к обратимой атрофии тимуса. Мы выбрали этот вид стресса

потому, что он является легко воспроизводимым и точным по дозировке.

В первой серии лля проверки влияния трансплантата тим\са на репара1ивн\ю риенерацию костною мозга и его функциональную активность мы оценивали выживаемость крыс после облучения в дозе 8 Грей, вызывающую гибель животных, ч го обусловлено поражением стволовых кроветворных клеток.

Показано, что в группе 3-х месячных крыс, которым после облучения в дозе 8 Гр грансплантировали в переднюю камеру глаза тимус, сушей венно увеличена еыжИиасМ^1 ъ В 1 >1С1лЦа Ь ОПЫШОЙ ¡р) Ги.С Оли* .-ОСГГ.ГЛТЛ.а 51ПС. I,

контрольной группе без трансплантации выжила только 1 крыса (2,9%), она умерла на 5-ой неделе Через 3 месяца в опытной группе выжило 6 животных, через 6 - три. и 1 крыса пережила 13 месяцев. Результаты получены в весенне-летний период (диаг 4) Диагр. 4. Влияние трансплантации тимуса на выживаемость животных

после облучения в дозе 8 гр

Выживаемость животных

100

54 20

0 4 13

1 день 1 мес 3 мес 6 мес 13 мес Время жизни после трансплантации

I Облучение 8 Гр (п=35)

I Облучение 8 Гр + трансплантация тимуса (п=24)

Известно, чго при облучении дозой 4 Гр происходит массовая гибель клеюк в тимусе и костном мозге с последующим восстановлением клеточности через 20-40 дней (Белоусова. 1979) В геронтологии такое воздействие еще называют ускоренным старением. Мы провели несколько серий экспериментов, в которых животным после облучения сублетальной дозой 4 Гр трансплантировали в ПКГ иммунокомпетентные ткани (тимус, костный мозг) или кусочек легкого (контроль на специфичность ткани) Результаты данных исследований представлены в таблице 2.

Табл.2. Количество тимоцитов у 4-мес. животных после облучения в дозе 4 Гр через 1 мес. после трансплантации (х107)

Интактный Контроль Облучение Облучение + тимус Облучение + костный мозг Облучение + легкое

6,6±0,8 п= 11 4.1 ±0,4 п = 5 Р < 0,02 6,8+0,12 п = 6 6±0,28 п = 3 4.1±0,8 п = 5 Р < 0.05

п - количество животных.

Через мееян после облучения в группе без трансплантации количество тимоцитов достоверно ниже по сравнению с интактным контролем. Трансплантация ткани тимуса или костного мозга способствует полному восстановлению клеточности тимуса. Трансплантация ткани легкого не влияла на этот показатель.

Параллельное определение количества фрагментированной ДНК в вилочковой железе в опытной группе животных приводило к снижению данного показателя в 2 раза при трансплантации тимуса, и в 4 раза при трансплантации костного мозга.

Показано, что аллотрансплантация иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс после радиационного облучения в дозе 4 Гр приводит к ускоренному восстановлению иммунологического статуса животных и значительно снижает смертность после облучения в дозе 8 Гр.

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА И БОКОВЫЕ ЖЕЛУДОЧКИ МОЗГА С ЦЕЛЬЮ КОМПЕНСАЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ОТКЛОНЕНИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ

В данной серии экспериментов исследовалось несколько моделей

трансплантологической компенсации экспериментального сахарного диабета (ЭСД) с использованием аллотрансплантации эмбриональной поджелудочной железы (ЭПЖ) в переднюю камеру глаза крыс и кроликов и боковые желудочки мозга крыс.

В опыт отбирали животных с острым аллоксановым диабетом, у которых концентрация глюкозы в крови превышала 20 ммоль/л, а в моче была более 1000 мг%, чаще всего это было 20-27 ммоль/л в крови и более 2000 мг% в моче. Иммунодепрессивная терапия в работе не применялась.

Табл.3. Аплотрансплантапия фетальной поджелудочной железы в ПКГ и боковые желудочки мозга животным с экспериментальным аллоксановым диабетом

Реципиент Донор КОМПЕНСАЦИЯ ДИАБЕТА Кол-во животных, %

Полная Частичная ВСЕГО

Крысы Вистар Крысы Вистар 153 (49%) 124 (40%) 277 (89%)

Крысы Вистар Крысы беспородн. 15 (40,5%) 15 (40,5%) 30 (81%)

Крысы Вистар Крысы Вистар* 6 (60%) 2 (20%) 8 (80%)

Кролик Шиншилла Кролик Шиншилла 3 (30%) 4 (40%) 7 (70%)

Время наблюдения не менее 3 месяцев.

*- в данном варианте трансплантацию ткани проводили в левый боковой

желудочек головного мозга крыс.

За полную компенсацию принимался уровень глюкозы в крови от 4,9 до 7,9 ммоль/л, за частичную - от 8,0 до 15 ммоль/л.

Наиболее высокий процент компенсации экспериментального диабета после трансплантации ЭПЖ в переднюю камеру глаза мы получили, когда в качестве донора и реципиента использовали крыс Вистар (89%).

Для того чтобы убедиться, что нет больших различий при разных вариантах аллотрансплантации, была проведена серия экспериментов по трансплантации ЭПЖ от беспородных крыс крысам Вистар. Компенсация диабета в данной группе наступала у 81% животных: полная у 15 оперированных животных (40,5%), и частичная также у 15 животных (40,5%) (см. табл.4).

При трансплантации ткани в боковые желудочки мозга наблюдался самый высокий процент полной компенсации экспериментального диабета у животных (60%).

Из 10 оперированных кроликов полная компенсация наблюдалась у 3-х и частичная у 4-х животных.

Сахарный диабет - системное заболевание, в результате которого происходят сильные изменения биохимических, иммунологических и физиологических функций в организме. В данном разделе приведены данные о наиболее значимых метаболических отклонениях, происходящих во время инициации и протекания ЭСД и после трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза.

Одним из важнейших показателей является увеличение количества глюкозы в биологических жидкостях организма. Перед трансплантацией возраст животных был 4 месяца, а концентрация глюкозы в крови почти в 5 раз превышала (23±0,3 ммоль/л) данный показатель у контрольной группы животных того же возраста. Мониторинг содержания сахара велся регулярно в течение всего эксперимента: 1 раз в неделю.

Табл. 4. Содержание глюкозы в крови животных с компенсированным трансплантацией диабетом на разных сроках жизни

Компенсированный

Возраст животных Контроль диабет

(мес.) (ммоль/л) (ммоль/л)

4 (момент 5,0 ±0,18 23 ±0,3***

трансплантации) п=10 п=32

4,6 ± 0,05 5,1 ±0,1**

6 п="Ю п-5

4,9 ± 0,09 5,5 ± 0,2*

10 п=10 п=5

5,7 ± 0,03 6,4 ±0,1**

20 п=10 п=5

п - количество животных * - Р<0,05, ** - Р<0,01, **♦ - Р<0,001

В таблице 4 приведены данные по содержание глюкозы в крови через 2, 6, и 16

месяцев после трансплантации (возраст животных 6,10 и 20 мес., соответственно).

Показана долговременная компенсация экспериментального сахарного диабета

Содержание сахара в крови снижалось до уровня близкого к контролю.

У животных в стадии острого и хронического аллоксанового диабета и после

аллотрансплантации ЭПЖ в переднюю камеру глаза определяли уровень содержания

нейромедиаторов (норадреналина и серотонина) в мозге, а также изменения синтеза

белка и РНК. Результаты этих экспериментов представлены в таблицах 5, 6, 7.

Табл.5. Содержание норадреналина и серотонина в неокортексе и стволовой части мозга крыс в контроле, прн аллоксановом диабете и после трансплантации

ЭПЖ

норадреналин (нг/мг ткани)

Ткань Острый диабет п=6 Хронический диабет п=6 Компенсированный Диабет п=7 Контроль п—11

Яеокортекс 45±5 119±5*" 160±20 160±8

Ствол Ю0±20" 154±10" 208±27 215±39

Серотонин (нг/г ткани)

Неокортекс 143±26*" 180±б" 284±32 282±34

Ствол 437±35 321+51' 473±39 460±54

п - количество животных; * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001

Развитие диабетического синдрома у крыс сопровождается (см. табл.5) падением уровня норадреналина (НА) в неокортексе и в стволовом отделах мозга. Показано, что содержание НА в коре по сравнению с контролем составило 70%, в стволовой части мозга - 50%. Содержание сероюнина (5-ОТ) в неокортексе у крыс в стадии острого диабета понижено в среднем на 50%, в стволовой части мозга достоверных изменений не выявлено.

Трансплантация эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ увеличивает содержание нейромедиаторов (норадреналина и серотонина) в неокортексе и стволовом отделах мозга при частичной (хронический диабет) компенсации и нормализует данные показатели при полной компенсации диабета у животных.

В табл.6, представлены данные по интенсивное га включения меченого лейцина в структуры мозга. В стадии острого диабета уровень белкового синтеза, как в неокортексе, так и в стволовом отделе мозга был достоверно понижен на 20%, и в

дальнейшем у крыс в стадии хронического диабета (с уровнем глюкозы в крови 10-12 ммоль/л) снижается до 45% от нормы .

Табл. 6. Включение "*Н-лейцина в неокортекс и стволовой отдел мозга крыс (имп/мин/мг белка) /10"1

Ткань Острый Диабет (п=6) Хронический Диабет (п=6) Компенсированный Диабет (п=7) Контроль (п=11)

Неокортекс 487±15" 270±12** 606±63 603±58

Ствол 338±52* 227±14** 577±67 522x54

п - количество животных, * - Р<0,01, ** Р<0,001

Успешная аллотрансплантация ЭПЖ в переднюю камеру глаза крыс с

экспериментальным диабетом полностью восстанавливала интенсивность белкового

синтеза в неокортексе и в стволовом отделе мозга оперированных животных.

Табл.7. Активность ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli по отношению к различным субстратам (in vitro)

Источник ДНК (хроматин) Кол-во животных имп/мин на 1 мкг ДНК

Мозг интактных животных п= 10 554±40

Мозг животных с ЭСД п= 12 2552±8б"

Мозг животных с Компенсированным диабетом п = 20 864±54"

Печень интактных животных п= 10 441±35

Печень крыс с ЭСД п= 12 1980±72*

Печень животных с Компенсированным диабетом п = 20 652±48*

• Р< 0,001.

Примечание: Активность РНК-полимеразы E.coli на собственной ДНК составила 630±52 имп/мин на 1мкг ДНК.

При исследовании синтеза РНК in vitro обнаружено, что хроматин ткани мозга и

печени крыс с аллоксановым диабетом обладает повышенной РНК-синтезирующей

способностью. Уровень включения 14С-АТФ в мозг и печень был в 4-5 раза выше по

сравнению с интактными животными (табл.7).

Было показано, что аллотрансплантация ЭПЖ в ПКГ значительно нормализует

интенсивность синтеза РНК in vitro в мозге и печени экспериментальных животных.

Кроме того, проводили определение сывороточной ДНК спустя 3 месяца после

трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ.

Бьпо «оказано, чго тиабежческое сосгояние приводит к ! 1-крагноч> увеличению сывороточной ДНК. а после трансплантации этот показатель возвращается к норме

В процессе выполнения работы у 17 крыс с хорошо оформленными аллотрансплантатами и компенсированным диабетом провели удаление оперированных глаз с трансплантатами. У всех 17 животных наблюдали рецидив диабета, развивавшийся в течение 2-4 недель, приведший к их гибели в течение месяца.

В трансплантатах определяли количество иммунореа>пивного ^н'-уртп ^ИРИ; Диагр. 5.

Содержание ПРИ в трансплантатах на разных сроках после операции '

-I 3 5 3

И I

1 1

0} I О 1-

3,53 ±0,4

0,95 ± 0,03

2,85 ± 0,68

18-0невн 2

эыбрионы

Бычо установлено (диагр 5), что трансплантаты, извлеченные из Г1КГ крыс на различных сроках (вплоть до ¡6месяцев), способны к длительному функционированию с выделением инсулина Содержание ИРИ в трансплантатах на мг ткани возрастает в 1,5-3,5 раза с момента трансплантации при этом его вес увечичивается незначительно (от 13,1 ±1,1,иг до 16 ± 2,5 мг)

Хотя содержание инсулина на мг ткани в трансплантате почти в 3-5 раз превышает данный показатель поджелудочной железы интактных животных соответствующею возраста, однако, пересчет количества инсулина, выделяемого из известного объема трансплантата, показал, что пересаженная ткань самостоятельно не должна была столь благополучно компенсировать физиологические и биохимические отклонения, сопутствующие экспериментальному диабету. Совместно с к.м.н М.И.Арбузовой было проведено определение иммунореакгивного инсулина в поджелудочной железе диабетических крыс на момент трансплантации, в ЭПЖ. а также в контрольной и опытной групп крыс через 2. 6, и 16 месяцев после трансплантации (табл.8). На момент трансплантации возраст животных был 4 мес

Табл. 8. Содержание ИРИ в поджелудочной железе 18-дневных эмбрионов, у интактных животных и крыс с компенсированным трансплантацией диабетом

Возраст Животных Контроль (млЕД/мг) Компенсированный Диабет (млЕД/мг)

18 дн. Эмбрионы 0,95 ±0,03 п = 12 -

6 мес. 1,61 ±0,02 п= 10 0,14 ±0,01* п = 5

10 мес. 1,60 ±0,02 п = 10 0,14 ±0,02* п = 3

20мес. 0,58±0,03 п= 10 0,11 ±0,03* п = 3

п - количество животных. *' Р < 0,001.

В поджелудочной железе диабетических крыс (п=10), которым не проводили трансплантацию ЭПЖ железы, через 2-4 недели после введения аллоксана ИРИ обнаружили лишь в количестве 0,0075±0,0025 млЕД/мг (менее 1% от нормы).

Показано что, трансплантация эмбриональной поджелудочной железы стимулировала частичное восстановление инсулинпродукции собственной pancreas Количество ИРИ достоверно увеличивалось в собственной поджелудочной железе через 2 и 6 месяцев после операции в 19раз, через 16 месяцев в 15 раз.

Таким образом, компенсация инсулиновой недостаточности происходит не только за счет выделения гормона непосредственно трансплантатом, но и за счет частичного посттрансплантационного восстановления собственной поджелудочной железы, чего не происходит у крыс с острым аллоксановым диабетом без последующей трансплантации.

Определяли также количество ИРИ в крови интактных животных при экспериментальном сахарном диабете и через 4 мес. после трансплат ации эмбриональной поджелудочной железы в ПКГ.

Было установлено, что ИРИ в крови у животных с ЭСД было в 39 раз меньше, чем у крыс интактной группы (0,6±0,0б и 23,3+2,4 соответственно) После трансплантации количество ИРИ полностью нормализовалось и достоверно не отличалось от интактных животных того же возраста

В этой же серии 3 крысам с острым диабетом вместо поджелудочной железы трансплантировали равные по объему кусочки легкого (контроль на специфичность ткани), животные погибли при высоком уровне гипергликемии (более 20 ммоль/л) и глюкозурии (более 2%), через 7,19 и 23 дня.

Количество глюкозы в моче - довольно важный прогностический показатель, как и потребление воды животными, при диабете 1 типа. В данной серии все животные имели предтрансплантационпую глюкозурию выше 2% (табл.9).

Табл. 9. Содержание глюкозы в моче и потребление воды животными до и после трансплантации ЭПЖ

Животные Количество глюкозы в моче (мг%) Суточное потребл. воды на 100 гр. массы (мл)

Сахарный диабет п =9 Более 2 88,4±7,1*

Через 2 мес. после трансплантации п=19 0-0,150 23,5+2,2

Интакгный контроль п =12 0-0,1 18,5±1,9

п - количество животных. * - Р < 0,001.

После трансплантации ЭПЖ в ПКГ полностью нормализуется уровень глюкозурииу животных и наблюдается снижение потребление воды в 3,8 раза, что практически не отличается от этого показателя у интактных животных.

Кроме того, животные с аллоксановым диабетом становятся более вялыми и теряют вес, что явствует из следующей таблицы (табл.10).

Табл. 10. Масса животных до и после трансплантации фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза

СОСТОЯНИЕ МАССА ЖИВОТНЫХ (г)

ОПЫТ КОНТРОЛЬ

Перед введением аллоксана 20015 200±3

Через 2 недели после введения 175+4* 208±2

Аллоксана, перед трансплантацией п = 9 п - 10

Через 2 мес. 277±4 282±3

после трансплантации п = 9 п= 10

Через 5,5 мес. 495±2 498±4

после трансплантации п = 9 п= 10

п - количество животных, * - Р < 0,01

После введения аллоксана в течение 2 недель животные с диабетом теряют 16% веса, но уже через 2 месяца после трансплантации их вес достоверно не отличается от контрольной группы.

Показано, что аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в передней камере глаза животных.

Аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани в ПКГ компенсирует аллоксановый диабет у 70-89% животных, при этом нормализуется содержание глюкозы в крови и моче, инсулина, сывороточной ДНК в крови, восстанавливается интенсивность синтеза РНК, белка и уровень нейромедиаторов в неокортексе и стволовом отделах мозга, потребление воды, масса животных.

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПАРАВАЗАЛЬНУЮ КЛЕТЧАТОЧНУЮ

ЩЕЛЬ СЕМЕННИКА

В следующих опытах мы провели работу по компенсации физиологических и

биохимических отклонения при ЭСД у крыс с помощью трансплантации неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника. Опытная серия состояла из 42 крыс с уровнем гликемии от 20 до 33 ммоль/л и глюкозурией не менее 2%. Из них 10 крыс с нормогликемией были декашггированы на 3 и 6 неделях (по 5 шт.) для гистологической оценки состояния трансплантата и семенника.

Максимальный срок наблюдения за животными составил 9 недель, в течение которых осуществлялся физиологический и биохимический мониторинг. В конце срока наблюдения выжившие крысы декапитировались с последующим гистологическим исследованием гонад. Вторая группа животных состояла из 40 крыс с экспериментальным сахарным диабетом, которым трансплантация не проводилась За время эксперимента в опытной группе погибло 11 животных (около 26%). Смерть наступала с признаками прогрессирования сахарного диабета, что выражалось в усилении полидипсии (потребление воды 80-90 мл на 100 г веса), полиурии, дальнейшем снижении веса, вялости, дезориентации. Уровень гликемии не снижался и находился в диапазоне от 20 до 33,3 ммоль/л, глюкозурия достигала максимальной величины 2%. Все погибшие животные пережили максимальный срок жизни крыс с ЭСД без трансплантации, то есть 28 дней с момента введения аллоксана.

На протяжении всего срока эксперимента проводился мониторинг показателей углеводного обмена у животных. Средний уровень гликемии до трансплантации у крыс с ЭСД составил 26,4±4,4 ммоль/л, а в контроле 5,3±0,6 ммоль/л.

Результаты экспериментов показали что, через 3 недели после трансплантации наблюдается компенсаторное снижение глюкозы в крови у половины группы до уровня интактного контроля. К KOHtfy срока наблюдения 9 недель у 43% животных уровень глюкозы в крови не превышал 8 ммоль/л, а у остальных наблюдалось снижение показателя как минимум в 1,5-2 раза от исходного уровня.

В результате аллотрансплантации ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника при экспериментальном диабете происходит постепенное, стабильное снижение уровня гликемии (Диаг 6).

Диаг.6. Динамика гликемии у крыс: интактных, диабетических, с интратестикулярной трансплантацией

дни после введения аллоксана ——крысы б ЭСД после трансплантации —— интактные крысы "-"■••="•" крысь с ЭСД без трансплантации*

момент трансплантации. *Примвчание: Динамика гликемии крыс с ЭСД без трансплантации отмечена на рисунке только до 28 дня на момент гибели всех животных.

Общая динамика уровня глюкозы в моче в опытной группе после трансплантации показывает постепенное его снижение- у 62% животных наблюдалась аглюкозурия, а у остальных снижался в 1,5-2раза от исходного уровня. В группе животных с ЭСД без трансплантации снижения глюкозурии не происходило до момента гибели животных

На всем протяжении эксперимента также определяли потребление воды и динамику веса у крыс, как показатели, связанные со степенью выраженности изменений углеводного обмена.

После введения аллоксана суточное потребление воды резко повышалось и перед трансплантацией составляло в среднем 82 мл на 100 г веса, а после трансплантации постепенно снижалось в течение 2-3 недель и в дальнейшем находилось в пределах 25-35 мл. В группе животных с ЭСД сохранялся изначально высокий уровень потребления воды до момента гибели животных.

Основная потеря веса у животных наблюдалась в течение двух недель после введения аллоксана, и на момент трансплантации отмечалось достоверное снижение веса на 15%, а к концу эксперимента достоверно не отличался от контроля.

Морфологическое состояние аллотраисплантата после пересадки ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную шель семенника крыс с ЭСД

Для объективной оценки состояния трансплантата после аллотрансплантации неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника было проведено 2 серии экспериментов: 1-я опытная серия включала 31 животное с ЭСД после трансплантации неонатальной поджелудочной железы, 2-я группа состояла

из 30 интактных животных, которым также была проведена аллотрансплантация. Гистологическое исследование семенников проводилось на сроках 3, 6 и 9 недель после аллотрансплантации, для которых отбирались животные с уровнем гликемии менее 8 ммоль/л и была аглюкозурия.

Изучались окрашенные гематоксилином-эозином и по Маллори гистологические срезы. Для части срезов применялся метод иммуногистохимии с обработкой моноклональными антителами против инсулина для ' выявления инсулинпродуцирующих островковых клеток в трансплантате (рис. 1)

Рис.1. Инсулинсодержащие клетки трансплантата через 9 недель после аллотрансплантации ткани нсонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника животным с компенсированным ЭСД.

1- окрашенные в коричневый цвет островковые клетки, содержащие секреторные гранулы инсулина: 2- окрашенные в фиолетовый цвет гематоксилином инсулиннесодержащие клетки трансплантата. Обработка моноклональными антителами против инсулина. Окраска пероксидазой хрена и подкрашено гематоксилином. 06.60, ок.10.

Биологический тест на фертильность у крыс после аллотрансплантации неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника

Целью проведения теста на фертильность являлось выяснение влияния аллотрансплантации ткани поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель на функциональные возможности семенника. Для этого использовались крысы-самцы без сахарного диабета, которым была проведена аллотрансплантация инсулинпродуцирующей ткани неонатальной поджелудочной железы и пересечение семявыносящего протока контрлатерального семенника.

На сроках 3, 6 и 9 недель после трансплантации 1 самца спаривали с 5-ю половозрелыми интактными самками, по 5 самцов на каждый срок, т.е. 15 самцов и 75

самок. Покрытие во всех сериях составило 100%, и было получено потомство в

количестве от 5 до 11 крысят от каждой самки.

Показана полная либо частичная нормализация состояния углеводного обмена и других исследованных нами физиологических показателей у животных с ЭСДв течение всего срока наблюдения после аллотрансплантации ткани неонаталъной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника

Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 3, 6, 9 недель после пересадки.

Аллотрансплантации ткани неонаталъной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенников крыс не оказывает значимого отрицательного влияния на фертильность

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные исследования были направлены на оценку некоторых трансплантологических способов компенсации экспериментальных патологических состояний у животных.

Трансплантация клеток и тканей в относительно иммунопривилегированные области организма - ПКГ, мозг и семенник позволяет значительно ослабить иммунологический конфликт между тканями донора и реципиента на длительное время без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее

В данной работе исследовалось несколько новых трансплантологических моделей компенсации. Их можно разделить на группы по месту трансплантации (передняя камера глаза, мозг и семенник) и по экспериментальным патологиям, на компенсацию которых направлены эти модели (недостаточность по Т-клеточном> звену иммунологической системы и связанные с этим возрастные изменения, диабет и нарушения физиологических и биохимических показателей).

Проведенные эксперименты показывают возможность долговременной потной или частичной трансплантологической компенсации иммунологических, физиологических и биохимических показателей данных экспериментальных патологий у животных.

ВЫВОДЫ

1. Алло- и ксенотрансплантация иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс приостанавливает возрастную инволюцию тимуса, приводит к ускоренному восстановлению иммунологического статуса организма после радиационного облучения в дозе 4 Гр и увеличивает выживаемость животных в дозе 8 Гр

2. Аллотрансплантатщя эмбриональной поджелудочной железы в мозг и переднюю камеру глаза крыс позволяет получить долговремештую полную или чааичпуто

компенсацию экспериментального сахарного диабета у животных, что выражается в нормализации основных физиологических и биохимических показателях: потребления воды и массы животных; содержания глюкозы, инсулина, сывороточной ДНК в крови; синтеза РНК, белка и содержания медиаторов в неокортексе и в стволовом отделах мозга.

3. Показано, что аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в ПКГ оперированных животных.

4. Аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника дает возможность полностью либо частично нормализовать у животных с ЭСД состояние углеводного обмена и другие исследованные нами физиологические показатели в течение всего срока наблюдения.

5. Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 3,6,9 недель после пересадки.

6. Показано, что аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенников крыс не оказывает значимого отрицательного влияния на фертильность.

7. Использование свойства относительной иммунопривилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника позволяет при трансплантации не применять иммунодепрессию или миминизироватъ ее

8. Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза способствует частичному восстановлению инсулинпродуцирующей способности собственной железы.

Автор выражает сердечную благодарность учителям, коллегам, друзьям за всестороннюю помощь в выполнении, написании и обсуждении работы Список основных публикаций по теме диссертации

1. KulikovA.V., ArkhipovaL.V., TretyakT.M., BraginA.G. Serotonin and norepinephrine content in brain structures of rats with experimental and transplantation-compensated diabetes //J. Himforsch.-1986.-v.27.-№ 5.-P. 495-499.

2. Архипова JI.В., Куликов А.В., Озолинь О.Н. РНК-синтезирующая способность хроматина мозговой ткани крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом. // Вопросы мед. химии.-1988.-№ 5.-С.76-79.

3. Архипова JI.B., Озолинь О.Н., Третьяк Т.М. Влияние катехоламинов и серотонина на РНК-синтезирующую способность изолированных ядер и хроматина мозга и печени крыс. //Биохимия. - 1988. -Т.53. - вып.7. - С. 1078-1081.

4. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Шапошников В.В , Архипова Л.В. Восстановление иммунологического статуса стареющего организма с помощью аллотрансплантации

тимуса и костного мозга // Цитология,-1997, т.39.-№ 6.-С.483.

5. Kulikov A.V.,Korystov Yu.N.,Arbuzova M.I., Shaposhnikova V. V.,Arkhipova L.V fissue transplantation as a compensation for deleterious effects of ageing, radiation, diabetes, and craniocerebral trauma.// Membr. Cell. Biol.- 1998,- V.l l.-№ 6.- P.737-742.

6. Куликов A В., КорыстовЮ.Н., Шапошникова В.В., Архипова JI.B., ЧайлахянЛ.М. Компенсация пострадиационных и возрасгных нарушений с помощью трансплантации тимуса или костного мозга в иммунопривилегированные зоны организма// Доклады Академии Наук, 1998 -Т 36! -.У° 6 -С 843-845

7. Куликов А.В., Арбузова М.И., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Трансплантологические модели компенсации ряда моделей ассациированных со старением.// Биологический вестник,-1998.-Т. 2.-№ 1 .-С.20-22.

8. Куликов АВ., КорыстовЮ.Н, Смирнова Г.Н., Архипова Л.В Эксиеримешальиые трансплантологические способы компенсации физиологических, иммунологических и геронтологических отклонений // В сб "Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии" г. С)мск,-2000,-С.- 45-47.

9. Куликов А.В., КорыстовЮ.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В., Третьяк Т.М. Компенсация возрастной и стрессорной инволюции тимуса. //Доклады РАСЫ -2001.-№ 3.-С.41-43.

Ю.Куликов А.В., Сухих Г.Т., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Полтавцева Р.А., Третьяк Т.М., Чайлахян Л.М. Пролонгирование периода нормогликемии у животных с острым экспериментальным диабетом при помощи различных вариантов трансплантации ткани. // ДАН, 2001 г.- Т. 379- № 4 - С. 561-563.

11.Куликов А В., КорыстовЮ.Н., Арбузова М.И, Смирнова Г.Н., Архипова Л В Компенсация физиологических, иммунологических и возрастных отклонений с помощью тканевой трансплантации // Цитология, 2001,- Т.24 - №4,- С. 358.

12.Куликов А.В., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Демьянова Е.Г., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т. Способы компенсации ускоренного старения и смоделированного аутоиммунного заболевания у животных с помощью трансплантации адекватных тканей и стимуляции пролиферации стволовых клеток. // В сборнике «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)», Москва, 2002, С. 202-203.

13.Корыстов Ю.Н., Куликов А.В., Архипова Л В., Смирнова Г.Н., Шапошникова В.В., Левитман М.Х. Автоматическая акустическая регистрация конфликта в группах мышей и методы определения последствий социального стресса. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г, С. 111-115.

14.Хлысгова З.С., Шмелева С.П., Минина Т.А, Куликов А.В., Бочарова Л С.,

Архипова Л.В., Полтавцева Р А., Рябчиков О П , Сухих Г.Т. Структура поджелудочной

железы крыс-диабетиков породы Вистар после имплантации им аллогенных и

ксеногенных инсулинпродуцирующих и инсулиннепродуцирующих тканей и клеток. //

В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г., С. 232-235.

15.Куликов A.B., Сухих Г.Т., СмирноваГ.Н., Архипова JI.B., ПолтавцеваР.А., Рябчиков О.П., Третьяк Т.М., Куликов Д.А. Экспериментальная компенсация последствий диабета и возможность стимуляции пролиферации стволовых клеток трансплантацией эмбриональной или неонатальной поджелудочной железы. // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр PAII Г.Р. Иваницкого. Пущино, 2003г, С.245-247.

16.КорыстовЮ.Н., Куликов A.B., Архипова Л.В, Смирнова Г.Н., Шапошникова В.В., Левитман М.Х, Чайлахян Л.М. Социальный стресс в группах мышей: методы регистрации конфликта и его последствий.// ДАН, 2003,- Т. 390- № 6.- С. 847-849.

17.Новоселова Е.Г., Куликов A.B., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В. Влияние трансплантации тимуса зимнеспящих сусликов на возрастаю инволюцию вилочковой железы стареющих крыс.//ДАН, 2004,- Т. 397- № 2,- С.277-280.

18.Куликов A.B., Новоселова Е.Г., Корыстов Ю.Н., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Смирнова Г Н., Архипова Л В., Куликов Д А. Возрастная инволюция тимуса- способы замедления.//Успехи геронтологии. - 2005. -Вып.17. - С.82-86.

к исполнению 10/04/2006 Исполнено 11/04/2006

Заказ № 250 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

P-8795

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Архипова, Любовь Валентиновна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История трансплантации ткани различной природы в переднюю камеру глаза и мозг

Гематоэнцефалический барьер.

Гематоофтальмологический барьер.

Иммунологические аспекты трансплантации ткани в переднюю камеру глаза и мозг.

Взаимодействие различных систем организма, роль иммуноком-петентных органов (тимус, костный мозг) в процессе старения, стресса, ионизирующего облучения и др.

Сахарный диабет, осложнения, проблемы консервативной терапии.

Экспериментальный сахарный диабет.

Трансплантация ткани поджелудочной железы при сахарном диабете.

Различные способы алло- и ксенотрансплантации инсулинпродуцирующих клеток.

Трансплантация островковых клеток в паравазальную клетчаточную щель семенника.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные.

Трансплантация тимуса и костного мозга в переднюю камеру глаза животных.

Определение количества тимоцитов у животных.

Облучение животных.

Определение фрагментированной ДНК.

Получение экспериментального диабета.

Тестирование уровня глюкозы в биологических жидкостях экспериментальных животных.

Определение содержания инсулина в поджелудочной железе, трансплантате и сыворотке крови.

Определение потребления воды.

Определение нейромедиаторов (НА и 5-ОТ) в структурах мозга крыс с экспериментальным диабетом.

Определение включения Н3-лейцина в неокортекс и стволовой отдел мозга крыс.

Определение включения Н -уридина (по изменению РНК-синтезирующей способности хроматина мозговой ткани крыс).

Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в боковые желудочки мозга.

Аллотрансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крыс.

Подготовка ткани неонатальной поджелудочной железы крыс для трансплантации.

Аллотрансплантации ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника.

Одностороннее пересечение семявыносящего протока интактного семенника после аллотрансплантации ткани неонатальной поджелудочной железы в контрлатеральный семенник.

Гистологические исследования ткани.

Иммуногистохимические исследования.

Тест на фертильность.

Статистика.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1 .Алло - и ксенотрансплантация тимуса.

Глава 2.Трансплантация иммунокомпетентных тканей (тимус, костный мозг) после радиационного облучения.

Глава 3 J Аллотрансплантация поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и боковые желудочки мозга с целью компенсации физиологических и биохимических отклонений при экспериментальном диабете.

Глава 4.Аллотрансплантация неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий"

Одной из самых сложных и окончательно не решенных проблем трансплантологии является несовместимость ткани донора и реципиента. В современных исследованиях широко используют иммунодепрессанты, которые помогают продлить срок выживания пересаженной ткани на время их действия. При этом использование иммунодеприсантов, ослабляет иммунную защиту организма, может привести к тому, что даже элементарная вирусная инфекция становится смертельно опасной. Вместе с тем, известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами отностительной иммунопривилегированности. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам, в первую очередь, относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и семенник. В норме гистогематические барьеры этих областей, не пропускают иммунокомпетентные клетки. Активированные иммунные клетки, которые все же проникают в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-ligand, экспрессированного в этих участках. Функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1998). Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L - система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffit et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

Если в мозг пересаживали, в основном, ткани ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы, от нейрональных и опухолевых до эндокринных (Брагин, Виноградова, 1983; Миронов, 1988; Krametz , Greene, 1953; Falck, 1959; Green, 1967; Hoffer, Seiger, 1974; Weber et al., 1975; Adeghate,1998; Adeghate, Donath, 2000). Значительное количество работ посвящено пересадкам в семенник. В частности туда пересаживали тиреоидную ткань, Лейдиговские клетки, клетки гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и др. (Scothorne, 1977; Setchell et al., 1995; Кирпатовский и др., 1994, 1999; Каитова, 2003).

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС, переднюю камеру глаза и тестикул успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al., 1979; Bjorklulnd, Stenevi, 1979).

Возможность пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в те области, в которых в силу анатомического строения и выработки иммуномодулирующих агентов они могут функционировать длительное время, представляет сегодня несомненный интерес. В настощее время накоплен значительный клинический опыт в области нейротрансплантации при болезни Паркинсона, начаты операции при других нейрогенеративных заболеваниях ЦНС - хорее Гентингтона, при эпилепсии, травме спинного мозга (Макаренко и др., 1998; Livdval et al., 1994; Ugrumov et al., 1996; Olanov et al., 1997). Несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ по трансплантации тканей в относительно иммунопривилегированные зоны организма, в этой области осталось еще большое количество нерешенных проблем. В ходе выполнения работы были поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате проведенных исследований предложены оригинальные модели компенсации экспериментального диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса.

Цель работы

1.Оценка эффективности моделей компенсации диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса. 2.Исследование физиологических, биохимических и иммунологических особенностей протекания экспериментального диабета, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса в период их инициации, течения и долговременной компенсации с помощью трансплантации адекватных тканей в переднюю камеру глаза, мозг и семенник.

Научная новизна работы 1 .Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных.

2.Показано, что в течение 2-4 недель после трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированные участки организма - переднюю камеру глаза, мозг, семенник происходит полная или частичная нормализация основных физиологических и биохимических показателей у животных с экспериментальным диабетом.

3. При пересадке поджелудочной железы в семенник сохраняется фертильность животных.

Результаты исследований носят приоритетный характер.

Положения, выносимые на защиту

1. С помощью трансплантации иммунокомпетентных тканей возможна приостановка возрастной инволюции тимуса.

2. Возможно ускоренное восстановление клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных и последующей трансплантации иммунокомпетентных тканей.

3. Трансплантация эмбриональной поджелудочной железы в относительно иммунологически привилегированные области организма (переднюю камеру глаза и мозга) позволяет частично или полностью компенсировать экспериментальный диабет у животных на сроки соизмеримые с естественной продолжительностью их жизни,

Научно-теоретическое и практическое значение работы Существует значительное количество экспериментальных патологических состояний, вместе с тем методов их компенсации на сегодня недостаточно. Проведенная работа предоставляет в распоряжение исследователей несколько новых моделей. В первую очередь, это возможность коррекции физиологических, биохимических, а в некоторых случаях, иммунологических отклонений при различных патофизиологических состояниях. Исследованные трансплантологические способы позволяют проследить особенности метаболических изменений в различных системах организма в период возникновения, течения и компенсации таких патофизиологических состояний, как диабет, старение, последствия радиационного облучения. В процессе выполнения работы использованы различные схемы алло- и ксенотрансплантации ткани в различные области организма, что позволяет сравнить их преимущества и недостатки.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИСТОРИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА И МОЗГ

Работы по трансплантации ткани в переднюю камеру глаза и в различные отделы головного мозга ведутся очень давно. Результаты первых исследований в этой области были опубликованы Дооремалом, Томпсоном, Салтыковым и Данн в конце позапрошлого, начале прошлого веков (Van Dooremaal, 1873; Thompson, 1890; Saltykov, 1905; Dunn, 1917).

Очередной бум трансплантологических работ, посвященных пересадке тканей в различные структуры мозга, начался в 80-х годах прошлого века. В настоящее время трансплантация в область ЦНС привлекает внимание широкого круга исследователей. Успехи в развития нейрофизиологии, нейрохимии, морфологии и иммунологии мозга позволяют понять основу относительной иммунологической привилегированности некоторых участков мозга. Подтвердились предположения об уникальной структуре капилляров мозга и особенностях трофических процессов в тканях ЦНС. На сегодняшний день в область ЦНС трансплантированы почти все участки эмбрионального и фетального мозга от соматосенсорной коры (Bragin et al., 1988) до участков спинного мозга (Nornes et al., 1984).

В различных трансплантатах были биохимическии радиоиммунохимически идентифицированы: адренергические, холецистокенинергические, дофаминергические, норадренергические серотонинергические, соматостатинергические, вазопрессинергические (Bjorklund et al., 1976, 1979; Seiger, Olson, 1977; Perlow et al., 1979; Armitia et al., 1981; Lewis, Cotman, 1983; Ebner et al., 1984; McRae-Degueurce et al., 1984; Richards, Raisman, 1984; Kriger, Gibson, 1984; Брагин, Виноградова, 1985; , Clough et al., 1994; Cassel et al., 1995;

Tarricone et al., 1996; Ribotta et al., 1996; и др.) и другие виды нейронов, способные к выживанию и росту в области центральной нервной системы реципиента.

Много работ было посвящено гомо - и гетеротопическим пересадкам таких структур как гиппокамп (Kromer, et al., 1979; Sunde, Zimmer, 1983; Vinogradova et al., 1985; Stafekhina et al., 1995; и др.), мозжечок (Das, Altman, 1972; Alvarado-Mallart, Sotelo, 1982; и др.), кора мозга (Отеллин, 1985; Брагин, 1990; Александрова, 1990, 1999; Das, 1974; Oblinger, Das, 1982; Castro et al., 1987; Gonzales et al., 1988; Bragin et al., 1989, 1992; и др.), сетчатка (Klassen, Lund, 1990; Aramant et al., 1991; Sasaki et al., 1996; и др.). Трансплантированные ткани образовывали специфические гистотипические конструкции в мозге реципиента, формировали сходные слоистые структуры (Александрова, 1999), особенно четко они выявлялись в имплантатах гиппокампа, мозжечка и сетчатки. При морфологических исследованиях трансплантатов коры мозга, гиппокампа, мозжечка было выявлено, что в них формируются нейроны, по своему фенотипу сходные с типичными клеточными элементами исходной структуры (Брагин, Виноградова, 1981; Александрова, Полежаев, 1982; Полежаев, Александрова, 1986; Das, 1985;).

Как сказано выше, трансплантологические работы в этой области имеют более чем вековую историю и стали уже классическими исследованиями, однако наибольшее количество работ было проведено в последний 20 лет.

Ниже мы остановимся на некоторых работах, без которых трудно представить современный прогресс в этой области экспериментальной трансплантологии.

В 1890 году Томпсон пересадил кусочки затылочной коры между взрослыми собаками и от взрослых кошек взрослым собакам.

Основываясь на гистологических исследованиях, проведенных через 3 дня и 7 недель после трансплантации, автор пришел к заключению, что на обоих сроках трансплантаты оставались жизнеспособными. Однако в работе отсутствовали очевидные доказательства приживаемости нейронов в трансплантате, что вызывает сомнения в корректности данного вывода (Thomson, 1890).

В 1905 году Салтыков (Saltykov, 1905) удалял, а затем реимплантировал кусочки левого мозгового неокортекса кроликам, разного возраста (от 6 недель до нескольких месяцев). На 41 животном было показано и хорошо документировано нейрональное выживание до

8 дня после трансплантации.

В 1917 году Элизабет Дан пришла к заключению, что работать следует с тканью молодого организма. Она опубликовала работу, в которой описывались результаты пересадки кусочков коры 9-10-дневных крыс крысам того же возраста. Из 44 животных, успешно перенесших операцию, (всего было оперировано 46 крысят) при гистологическом исследовании через 200 дней после трансплантации у

9 крыс в трансплантатах были обнаружены нейроны. Э.Дан не только установила, что незрелая нервная ткань выживает в мозге с большей вероятностью, но и отметила, что чаще жизнеспособность сохраняют трансплантаты, которые на новом месте оказались хорошо обеспечены кровеносными сосудами. Так, успешно выживали кусочки ткани, помещенные в желудочки мозга, где обеспечен хороший контакт с сосудистой оболочкой, выстилающей эти образования. (Dunn, 1917).

В 1940 году Ле Гро Кларк получил данные, подтверждающие важность этих двух факторов, незрелость донорской ткани и хорошее кровоснабжение трансплантатата в мозгу реципиента для выживания пересаженных нейронов. Он пересаживал 15-20-дневный эмбриональный неокортекс во фронтальную кору 6-недельных кроликов. Гистологические исследования, проведенные через 4 недели после операции, показали, что у большинства обследованных животных незрелые нейроны нормально завершали свое развитие (Le Gros Clark, 1940).

Дас и Альтман в своих исследованиях, проведенных в 1971-1973 годах убедительно показали, что незрелые нейроны мозжечка у молодых крыс и кроликов, помеченные перед трансплантацией радиоактивным тимидином, могут выживать и нормально дифференцироваться дальше. Для доказательства этого положения они через 2 недели после трансплантации исследовали авторадиографически срезы мозжечка реципиентов. На срезах была обнаружена радиоактивность, т.е. пересаженные нейроны не погибли и утилизировали "метку" (Das, Altman, 1971; Das, 1973).

Следует отметить, что, если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза трансплантировали ткани самой различной природы.

В 1930 году May опубликовал первую, хорошо документированную работу по аллотрансплантации неонатальной (0-2 дня) коры в ПКГ крыс. Через 6 месяцев с помощью гистологических исследований автор обнаружил, что трансплантаты хорошо васкуляризованы, а нейроны в них жизнеспособны (May, 1930).

В более поздних своих работах автор наблюдал развитие трансплантатов незрелого мозжечка в ПКГ. Он показал, что в процессе развития и дифференцировки индивидуальные нейроны приобретают внешний вид, морфологически неотличимый от взрослых нейронов (May, 1954).

Нельзя не вспомнить начатые еще в 40-х годах работы Грина по трансплантации в ПКГ животных и птиц тканей самой разной природы. Гистологические исследования, проведенные автором на сроках наблюдения в 40 и более дней после трансплантации, позволили заключить, что ПКГ морских свинок является хорошим местом для роста, развития и дифференцировки трансплантатов при пересадке в нее куриной саркомы, мышиной опухоли С-1300; человеческой аденокарциномы, фибросаркомы, гемоангиобластомы а так же эмбриональной почки цыпленка (Green, Lund, 1944; Green, Arnold, 1945; Green, 1967; и др.).

В более поздних исследованиях по трансплантации опухолевых клеток разной природы в ПКГ говорится о больших перспективах использования этого метода в онкологических исследованиях, поскольку наблюдается резкое снижение уровня дифференцированности и злокачественности некоторых опухолей, культивируемых в передней камере глаза (Швомбергер и др., 1977; Аль-Рубей и др., 1984; и др.).

Ткань головного мозга 2-3-месячных эмбрионов человека успешно пересаживали в ПКГ морских свинок, и нейроны трансплантата сохраняли жизнеспособность более 2 лет, как и при аллотрансплантации эмбриональной ткани мозга кролика. Следует, однако, заметить, что ткань коры больших полушарий взрослых людей и кроликов, трансплантированная в ПКГ, резорбировалась в течение значительно более короткого промежутка времени (Green, Arnold, 1945).

Olson, Malmform (1970) опубликовали первую работу по трансплантации адренергических нейронов в ПКГ крыс. В эксперименте нейроны были идентифицированы с помощью гистохимической, флюоресцентной и радионуклидной методик. Нейроны различных структур мозга, развивающиеся в относительной изоляции от нервных внешних влияний в передней камере глаза, ведут себя по-разному. Нейроны мозжечка через 3-4 недели после трансплантации обнаруживают высокую нерегулярную спонтанную активность, частота и паттерн которой воспроизводят активность клеток Пуркинье в естественных условиях (Hoffer, Seiger, 1974). Нейроны септума воспроизводят типичные черты активности диафферентированного септума со спонтанной активностью, как в инкубационной среде взрослые структуры (20-30 разрядов/с) (Брагин, Виноградова, 1983). В эмбриональных трансплантатах гиппокампа через 3-6 месяцев после пересадки наблюдались относительно регулярные спонтанные разряды, длительность которых в разных трансплантатах колебалась от нескольких десятков до нескольких сотен миллисекунд (Миронов, 1988). Таким образом, активность нейрональных структур в различной степени зависит от нормальной внешней афферентации.

Относительная иммунологическая привилегированность передней камеры глаза (ПКГ) и возможность визуального наблюдения за состоянием помещенного в нее трансплантата делают этот участок очень удобным для экспериментальной трансплантации.

Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС и переднюю камеру глаза, успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al., 1979; Bjorklund, Stenevi, 1979). В тоже время единичные попытки скомпенсировать экспериментальный диабет трансплантацией ткани поджелудочной железы в переднюю камеру глаза в силу методических недоработок заканчивались неудачей (Browning, Resnik, 1951; Weber et al.,1975).

Ниже в обзоре литературы мы остановимся на особеностях трансплантации ткани в мозг и переднюю камеру глаза, которые обусловлены наличием гистогематических барьеров.

ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР В результате многолетних исследований сложились современные представления о гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ). Сама концепция барьера появилась в 1885 году, когда Пауль Эрлих обнаружил, что при внутривенном введении в организм животных кислого красителя церулина- S прокрашиваются все органы и ткани за исключением мозга (Ehrlich, 1885, 1886).

В 1913 году Гольдман показал, что полуколлоидный краситель трипановый синий введенный в кровоток или в переферические органы и ткани окрашивает все органы, кроме ЦНС. При этом переферические нервные узлы окрашивались всегда, в то время как стволовой отдел мозга и сосок зрительного нерва оставались бесцветными. Окрашивались так же твердая мозговая оболочка, сосудистые сплетения, гипофиз (включая его заднюю долю), серый бугор, area postrema и эпифиз. В своих работах, проведенных на разных видах животных, Гольдман показал, что между кровью и нервными центрами существует препятствие, через которое данный краситель не проходит (Goldmann, 1913).

При введении красителя непосредственно в цереброспинальную жидкость у подопытных животных отмечались явления интоксикации, выражавшиеся в возбуждении нервных центров, подергивании отдельных мышц, нередко судорогах и т.д. При вскрытии обнаруживалось, что краситель проникает в ЦНС, преимущественно в те участки, которые соприкасаются с цистернами мозга (Goldmann, 1913b).

В 1921 г. Штерн и Готье в результате многочисленных экспериментов на различных видах животных показали, что значительное число химических веществ, при введении их в общую циркуляцию, не переходят в цереброспинальную жидкость. Между тем как другие вещества, очень близкие к ним, могут быть обнаружены в головном и спинном мозге (Stern, Goutier, 1921), т.е. ГЭБ выполняет функцию регулятора физико-химических и биологических свойств внутренней среды ЦНС (Чороян, 2003).

Гипотеза о том, что капилляры мозга являются анатомической основой ГЭБ, постулированная еще Гольдманом, нашла свое экспериментальное подтверждение лишь в 60-х годах с появлением высокоразрешающей оптики и электронного микроскопа. Известно, что клетки эндотелия, выстилающие просвет капилляров, соединены между собой непрерывными, плотными контактами так, что между клетками нет щелей. Каждая клетка, как правило, заключена в свою собственную наружную мембрану, состоящую из двух слоев, и внешние слои мембран двух соседних клеток оказываются физически соединенными (Connell, Mercer, 1974; Росин, 1981; Бредбери, 1983; Кассиль, 1983; Белова, Юнсон, 1985; и др.). Во многих органах в эндотелии капилляров имеются поры или каналы, пронизывающие весь слой, в то время как в эндотелии сосудов мозга такие каналы отсутствуют (Чернова, 1977; Отеллин и др. 1981; Гольдстейн, Бец, 1986; и др.).

В 60-х годах с появлением зондов, выявляемых с помощью электронного микроскопа, удалось увязать обнаруженные структурные детали с фунуцией ГЭБ. Рис и Карновски, а затем Рис и Бригман провели две серии экспериментов аналогичных опытам прародителей теории ГЭБ, Эрлиха и Гольдмана (Ehrkich, 1885, 1886; Goldman, 1913а, 1913b). В первом случае пероксидазу хрена (фермент по размеру сходный с белками, в норме присутствующими в крови) вводили в кровяное русло экспериментальным животным и через некоторое время проводили электронно-микроскопический анализ. В большинстве органов пероксидаза легко проникала сквозь стенки капилляров по каналам и щелям между стенками эндотелия. В мозгу же плотные контакты между эндотелиальными клетками останавливали пероксидазу, и лишь очень незначительное ее количество переносилось через клетки эндотелия с помощью везикул. Во втором случае, пероксидазу хрена вводили в спинномозговую жидкость и она распространилась в желудочке мозга и проникла во внеклеточное пространство мозговой ткани. Фермент не выходил из мозга, т.к. ему препятствовали плотные контакты между эндотелиальными клетками капилляров (Reese, Karnovsky, 1967; Brightman, Reese, 1969).

Таким образом, под ГЭБ принято подразумевать всю совокупность анатомических образований, расположенных между кровью и мозгом, включая цереброспинальную жидкость. ГЭБ является сложным механизмом, регулирующим и защищающим относительное постоянство химического состава внутренней среды мозга.

ГЭБ обладает регуляторной и защитной функциями. В основе регуляторной функции ГЭБ находится генетически обусловленная селективная проницаемость для веществ, которые физиологически необходимы мозгу. Защитная функция ГЭБ в нормальных условиях ограждает внутреннюю среду мозга от поступления веществ чуждых его функции. Они могут быть как биогенными, постоянно циркулирующими в крови, так и экзогенными, введенными в организм.

ГЕМАТООФТАЛЬМИЧЕСКИЙ БАРЬЕР

Термин гематоофтальмический барьер (ГОБ) был предложен Фрадкиным в 1927 году (Фрадкин и др., 1927).

Обмен между кровью и внутриглазным содержимым происходит через ряд барьерных структур. Между сетчатой оболочкой и кровью существует весьма эффективный барьер. Он обеспечен специальной структурой стенок капилляров, питающих эту часть сетчатой оболочки. Внутренняя треть сетчатки снабжается кровью из ветви ее центральной артерии. Отходящие от артерии сосуды выстланы эндотелием, клетки которого плотно уложены, и каждая перекрывает своим телом места соединения с соседними клетками таким образом, что исключается возможность для межклеточного диапедеза клеток или мелких антигенных частиц из кровеносного русла (Пучковская, 1983; Розенфельд, 1987; Cunha-Var, 1980; и др.).

Остальная часть сетчатки зависит от кровообращения в хориоидее. От этой оболочки глаза она ограничена пластинкой Lamina vitrea (внутренний слой сосудистой оболочки) и слоем клеток пигментного эпителия (один из 10 слоев сетчатки, наружный), так же циркулярно охватывающий сосуды и места соединения эндотелиальных клеток. Эндотелий хориокапилляров имеет фенестрированную стенку и движение макромолекул и красителей типа флюоресцеина к сетчатке прекращается именно на уровне пигментного эпителия (Жоленько, 1969; Steinberg, Miller, 1973; Tze, 1980).

В переднем отделе глаза существует барьер между кровью и водянистой влагой передней камеры глаза (ПКГ). Анатомическими границами передней камеры глаза являются передние поверхности капсулы хрусталика и радужной оболочки, а также задний эпителий роговицы выстланы прочной, полупроницаемой мембраной - задней пограничной пластиной. Последняя, как и капсула хрусталика, являясь полупроницаемой биологической мембраной, оказывается резистентной к пассивному переносу биохимических субстанций между кровью и влагой передней камеры глаза (Жаленько, 1969; Мусаев, 1986; Barker, 1978; и др.). Установлено, что со стороны цилиарного тела барьер между кровью и водянистой влагой обеспечивается стенками сосудов и двумя слоями цилиарного эпителия, со стороны радужной оболочки - только стенками сосудов. Таким образом, пердняя камера глаза защищена от диффузии антигенов из прилежащих тканей. Перенос веществ между кровью и ПКГ возможен из цилиарного тела через стенки сосудов и два слоя цилиарного эпителия, а из радужной оболочки - только через стенки сосудов (Пучковская и др., 1983; и др.).

Гематоофтальмологический барьер является физиологическим механизмом, выполняющим барьерную функцию в отношении прозрачных сред глаза, регулирует относительное постоянство состава внутриглазных жидкостей и оказывает существенное влияние на метаболизм роговой оболочки хрусталика, сетчатки и других частей глаза.

Интерес к трансплантации ткани в ПКГ и мозг связан еще и с тем, что в этих структурах нет лимфатического протока, в результате чего отсутствует афферентное звено иммунной реакции (Виноградова, 1984; Полежаев, Александрова, 1986; и др.).

Кроме того, трансплантаты незрелой ткани ЦНС имеют очень низкий уровень антигенов главного комплекса гистосовместимости (Ярыгин и др. 1997; Winder, Brindin, 1988; Hart et al., 1981; Schnizer et al., 1981; и др.).

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА И МОЗГ

Успешность приживления нейротрансплантата обусловлена, с одной стороны, иммунологической привилегированностью головного мозга и передней камеры глаза за счет наличия ГЭБ и ГОБ, а с другой стороны, низким уровнем антигенов главного комплекса гистосовместимости в незрелой мозговой ткани и синтезом активированными астроцитами ростовых факторов, обладающих иммуносупрессивными свойствами (например, TGF^)- Кроме того, как в мозге, так и в структурах глаза Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Ермакова, 2001; Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi etal., 2004).

Shirai (1921), Murphy и Sturm (1923) были первыми, чьи работы дали толчок развитию исследованиям иммунологического статуса организма при нейротрансплантации. Их работы по экзогенной трансплантации опухолевой ткани привели к исследованиям, в которых и была разработана классическая концепция иммунологической привилегированности мозга (Medawar, 1948; Barker, Billingham, 1977). Согласно этой концепции инородная ткань, трансплантированная в мозг, может жить достаточно долгий период времени по сравнению с аналогичными трансплантатами, помещенными в иммунологически непривилегированные области. Специальный иммунный статус был приписан мозгу, во-первых, в связи с неразвитостью лимфатических сосудов в паренхиме мозга, во-вторых - наличием ГЭБ и, в-третьих, -со слабо выраженной экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (АГКГ). Таким образом, не один фактор, а комбинация факторов отвечает за иммунный статус ЦНС.

В последнее время, однако, появились работы, указывающие на ограниченность иммунопривилегированности мозга. Было обнаружено, что в мозге имеется внутренняя система «иммунного надзора», связанная с наличием резидентных макрофагов и микроглии (Gehrman et al., 1995; Thomas, 1992). При действии провоцирующих факторов микроглия может выполнять роль антиген-презентирующих клеток, способных экспрессировать антигены главного комплекса гистосовместимости.

Как говорилось выше, в мозге достаточно низкий уровень АГКГ. Только определенные клетки, такие как эндотелиальные и периваскулярные клетки, микроглия и клетки соединительной ткани, экспрессируют АГКГ класса I. К тому же микроглия и астроциты могут экспрессировать АГКГ класса II (Widner, 1993), хотя, по мнению других авторов, АГКГ класса II могут экспрессироваться только микроглией (Finsen et al., 1991). При нейротрансплантации экспрессия АГКГ усиливается. При этом наиболее выраженная экспрессия наблюдается при аллотрансплантации (между животными разных линий одного вида) и ксенотрансплантации (между животными разных видов), чем при сингенной трансплантации (между животными одной линии). a-fetoprotein, вырабатываемый незрелой тканью, уменьшает иммунную реакцию. В основном, это происходит за счет снижения экспрессии АГКГ класса II. Иммуносупрессорами являются также простагландин Е2 (PGE2) и ростовой фактор (32 (TGF - (32), продуцируемые активированными астроцитами (Fontana et al., 1984; Widner, 1993). У группы больных с глиомами наблюдался нарушенный иммунный статус, связанный с высоким уровнем TGF-(32, который выделялся опухолевой тканью.

Аллотрансплантаты без иммунносупрессии могут выживать длительное время (Лосева, 1999; Mason et al., 1986), но возможно и отторжение на более коротком временном отрезке (Nicholas et al., 1987; Lawrence et al., 1990). Однако используемая в настоящее время техника внутримозговой трансплантации незрелой нервной ткани практически сводит до минимума возможность возникновения иммунного ответа (Лосева и др., 1990; Ермакова и др., 2000).

В отношении ПКГ следует добавить, что концентрация веществ, растворенных в жидкой фазе крови и во влаге ПКГ, находится в различных соотношениях. Наиболее существенное отличие между камерной влагой и плазмой заключается в крайне низком содержании белка в камерной влаге. Так, определенное различными способами содержание белка во влаге ПКГ составляет у кролика 20-60мг%, у вола и лошади 18-25мг%, у кошки 20-40мг%, у человека 19-34мг%. Тогда как в плазме крови эти цифры составляют 7500-9000мг% (Пири и др.,1968; Петрович, Боровик, 1973; Петрович, 1977; Пучковская и др., 1983). Крайне низко содержание во влаге ПКГ иммуноглобулинов. Лишь 5-10мг% IgG, следы IgA, a IgM, как правило, не обнаруживаются вовсе (Fielder, 1979; Rahi, 1984 и др.). Все это, а также возможность постоянного визуального наблюдения за развитием трансплантата, делает переднюю камеру глаза очень удобной для экспериментальных трансплантологических работ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМ ОРГАНИЗМА, РОЛЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ (ТИМУС, КОСТНЫЙ МОЗГ) В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ, СТРЕССА, ИОНИЗИРУЮЩЕГО ОБЛУЧЕНИЯ.

Нормальная жизнедеятельность организма обеспечивается взаимодействием нейроэндокринологической, иммунологической, гемопоэтической и других систем организма. Каждая из этих систем имеет свой предпочтительный ареал и особенности, но в свете достижений современной биологии и медицины с каждым годом все труднее определить границы между ними. Например, иммунная и гемопоэтическая системы тесно связаны между собой, так как имеют единое происхождение от общих полипонентных стволовых клеток. И к тому же цитокины играют существенную роль в регуляции гемопоэза (Dexter, 1982; Dorshkind, 1990; Kittler et al., 1992; Sutherland et al., 1993; Hauser, 1998). Обе системы играют ключевую роль в защите организма, предупреждении развития опухолей и возникновении ответа на инфекционные агенты (Абелев, 1996; Акмаев, 1997; Лолор, 2000; Lipschitz, 1987; Goya, 1999). Вместе с тем, с возрастом основной гемопоэз у животных и у человека или не изменяется, или изменяется минимально (Lipschitz, 1987). Периферические лимфоидные органы, такие как селезенка и лимфоузлы, с возрастом не претерпевают серьезных изменений в размерах, не происходит значительных поражений костного мозга, продукция стволовых клеток, как правило, хорошо сохранена в старом возрасте, хотя и имеются данные о слабых изменениях скорости их репликации (Фрейдлин, 1997; Harrison et. al., 1978). Другие авторы говорят о снижении активности костного мозга с возрастом (Донцов и др., 2002).

На сегодня не вызывают сомнения объективные данные, свидетельствующие о значительной возрастной инволюции тимуса (Смирнов, Фрейдлин, 2002; Makinodan, Kay, 1980; Lipschitz, 1987; Miller, 1991; Anisimov et. al., 1993). Соответственно, снижается и продукция Т-лимфоцитов. Самая высокая продукция Т-лимфоцитов сохраняется до двух лет, а затем начинается ее падение. Возрастная инволюция тимуса происходит не только у человека. У мыши, например, к 24-месячному возрасту, продукция Т-клеток составляет 0,7% от уровня продукции этих клеток новорожденными особями. К этому возрасту у мыши происходит почти полная редукция тимуса: теряется и структура органа, и его функция (Фрейдлин, 1997). Сходные данные получены на крысах. При подсчете количества тимоцитов в вилочковой железе у 3-х и 20-месячных животных, оказалось, что их у старых крыс более чем в 25 раз меньше, чем у молодых (Куликов и др.). Считается, что инволюция тимуса, начинающаяся при половом созревании, является главным возрастным изменением иммунной системы. Такая инволюция состоит в прогрессивной потере клеточности тимуса с истощением лимфоидного пула клеток в зонах коры и кистозными изменениями эпителиальных клеток. Тимоциты являются источником различных пептидов, вовлекаемых в дифференцирующиеся лимфоидные клетки (Т-клетки) из молодых лимфоидных клеток. Выход дифференцированных Т-клеток снижается с увеличением возраста (Globerson et al., 1990). Прогрессивно снижаются синтез и секреция полипептидных гормонов тимуса, таких как тимозин, тимопоэтин и тимулин. Показано, что некоторые иммуномодуляторы, в частности, те же пептидные препараты тимуса, могут восстанавливать компетентность иммунных клеток в стареющем организме и увеличивать продолжительность жизни животных (Лабунец и др., 1997; Морозов, Хавинсон, 1996, 1997; Anisimov et al., 1982; Anisimov et al., 1998).

Считается установленным, что снижение эндокринной активности тимуса играет ключевую роль в возрастных дисфункциях иммунной системы, поскольку заместительная терапия введением гормонов способна частично восстановить различные иммунные функции в старости (Zatz, Goldstein, 1985).

Кроме того, с возрастом учащаются случаи различных инфекционных заболеваний, аутоиммунных процессов и опухолей. Возможно, это частично обусловлено возрастными дефектами иммунной системы. Связь столь широкого круга связанных с возрастом патологических процессов с дефектами иммунной системы привела даже к появлению предположения, что старение иммунной системы может ограничивать продолжительность жизни (Walford, 1969).

В то время как общее количество Т-клеток в периферической крови в старости заметно не изменяется, наблюдаются четкие различия в относительном количестве подтипов Т-клеток (Lipschitz, 1987; Thompson et al., 1987). Количество незрелых лимфоцитов Т-предшественников увеличивается с возрастом, так же как и процент частично активированных Т-лимфоцитов, несущих маркеры незрелого фенотипа тимуса. Имеют место относительное увеличение цитотоксических супрессорных Т-клеток и уменьшение количества хелперов/индукторов Т-клеток (Lipschitz, 1987; Thompson et al., 1987). Функциональные дефекты клеточно-опосредованного иммунитета коррелируют с уменьшением популяции хелперов/индукторов (Lipschitz, 1987). Клетки, полученные от старых людей или старых лабораторных животных, менее способны к ответу на аллогенные лимфоциты, фитогемаглютинин, конканавалин-А и растворимый антиген. Лимфоциты от более старых мышей обладают меньшей способностью вызывать реакции отторжения, чем те, которые получены от молодых особей тех же инбредных линий (Thompson et al., 1987). Половина здоровых людей в возрасте старше 50 лет страдает кожной гиперчувствительностью (Дильман, 1987, Lipschitz, 1987).

Как уже говорилось, система иммунитета функционирует в тесной и четко координированной взаимосвязи с нервной и эндокринной системами (Абрамов, 1988; Першин, 1994; Акмаев, 1997; Акмаев, Гриневич, 2001; Акмаев, 2003). Многочисленные исследования предоставляют доказательства, что эти системы взаимодействуют между собой в поддержании гомеостаза организма. Роль тимуса, как одного из центральных органов иммунитета, не подвергается сомнению. Вместе с тем, тимус - это и эндокринный орган, в котором синтезируется ряд биологически активных веществ пептидной природы. Многочисленные исследования свидетельствуют о влиянии различных факторов тимуса на нейроэндокринные функции. Пятая фракция тимозина в культуре нормальных и опухолевых клеток гипофиза повышает секрецию АКТГ и бета-эндорфина, продукцию пролактина и гормона роста. Тимозин-бета и 5-я фракция тимозина in vitro стимулируют секрецию гипоталамусом гонадотропин-рилизинг-факторов с последующей стимуляцией продукции лютинизирующего и фоликулостимулирующего гормонов гипофизом (Millington, Buckingam, 1992). Длительное введение 5-й фракции тимозина обезьянам приводит к повышению активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (Milenkovic et al., 1992). Удаление тимуса приводит к дегрануляции соматотропных клеток гипофиза, снижению функции коры надпочечников и половых желез (Чеснокова и др., 1984). У мышей, тимэктомированных в неонатальном периоде, наблюдаются нарушения нейроэндокринных функций (Labunets, 1996; Кудинов, Хромяк, 1997). Не менее значимо и влияние нейроэндокринных факторов на функцию тимуса. Активность тимических эпителиальных клеток может модулироваться гипоталамо-гипофизарной областью. У детей и взрослых с дефицитом гормона роста снижено содержание в периферической крови тимулина, лечение соматотропным гормоном восстанавливает уровень тимического фактора (Mocchegiani et al., 1996). Гипофизэктомия снижает концентрацию в организме гормонов тимуса. Введение экспериментальным животным гипофизарных гормонов препятствует снижению эндокринной функции вилочковой железы (Чеснокова и др., 1984). Инъекции гормона роста старым собакам восстанавливают уровень тимулина до показателей, свойственных молодым животным.

Введение пролактин - и гормон росто-секретирующих клеток старым крысам также способно восстановить атрофированный тимус до уровня молодых. Гормоны коры надпочечников (глюкокортикоиды) обладают тимиколитической активностью. Широко распространена точка зрения о том, что надпочечник и половые железы находятся в антагонистических взаимоотношениях с тимусом. Вместе с тем, удаление тимуса приводит к снижению функциональной активности адреналовых и половых желез. Следовательно, взаимоотношения между указанными органами гораздо более сложны. (Лабунец и др., 1997; Бутенко, 1998). Еще больше вопросов вызывают взаимоотношения между иммунной и нейроэндокринной системами при старении. Учитывая тот факт, что с возрастом происходит выраженная деградация вилочковой железы, можно полагать, что в процессе старения это вызывает существенные изменения не только в системе иммунитета, но и в регуляции нейроэндокринного гомеостаза (Goya, 1999). Большинство исследователей считают, что поскольку тимус у старых животных находится в состоянии атрофии, тимэктомию производить нецелесообразно (Goya R.G. et al., 1987). Однако, как показали исследования, у старых животных удаление тимуса привело к существенному снижению массы надпочечника и резкому падению уровня кортикостерона в крови (Butenko et al., 1999). Кроме того, было установлено, что при старении наблюдается резкое снижение внутрисистемных регуляторных связей, выражающееся в уменьшении взаимного влияния тимуса на периферические лимфоидные органы и в обратном направлении, снижение взаимодействия между периферическими лимфоидными органами - селезенкой, лимфоузлами, Пейеровыми фолликулами (Кудинов, 1994; Бутенко 1998; Бутенко 1998а). Исходя из приведенных данных, можно сделать вывод, что одна из задач диссертационной работы, связанная с экспериментами по трансплантологической компенсации последствий возрастной инволюции тимуса, имеет большое значение для понимания межсистемных отношений в организме.

САХАРНЫЙ ДИАБЕТ, ОСЛОЖНЕНИЯ, ПРОБЛЕМЫ КОНСЕРВАТИВНОЙ ТЕРАПИИ По данным ВОЗ в мире насчитывается более 170 млн. больных диабетом. Экспертная оценка распространенности сахарного диабета позволяет считать, что к 2010 г. в мире будет уже более 230 млн. больных. Удвоение количества больных этим недугом происходит каждые 10-15 лет (Amos A. et al., 1997; King et al., 1998; Балаболкин , 2000).

Диабет - слово греческое и означает "сифон" или " протекать". Использование этого слова для обозначения заболевания, которое протекает с большим употреблением воды и быстрым ее выведением из организма, принадлежит греческому врачу Аретерису Каппадокийскому (138-81 гг. до н.э).

Первое клиническое описание заболевания проведено египетскими врачами за 1500 лет до н.э. Сахарный диабет был известен в Индии, Китае, Древней Греции и Италии. В работе индийского врача Сусрата (400 лет до н.э.) приведено не только описание болезни, но и ее различные клинические формы. На основании вкуса мочи Томас Уиллис (1674) разделил диабет на сахарный (diabetes mellitus) и несахарный, безвкусный (diabetes insipidus). М.Добсон (1776) установил, что сыворотка крови и моча больных сахарным диабетом содержит сахар. На этом основании М.Добсон однозначно указал, что сахарный диабет является системным заболеванием организма, а не первичной почечной болезнью, как считалось до этого (Балаболкин, 1998, 2000).

В Российской Федерации по данным обращаемости в 1997 г. насчитывалось 1952410 больных сахарным диабетом. В соответствии с данными отдела медицинской статистики и информатики Минздрава РФ на 01.01.2003 г. по обращаемости в России насчитывается уже 2182408 больных. Однако истинная заболеваемость сахарным диабетом, как показывают проведенные эпидемиологические исследования (Дедов, и др., 1998; Дедов, 1998), должна составлять около 6-8 млн. человек. Эти данные базируются на основе проведенных эпидемиологических исследований в Москве, Санкт-Петербурге, Новосибирске и других городах Российской Федерации.

Большая социальная значимость сахарного диабета состоит в том, что он приводит к ранней инвалидизации и летальности в связи с поздними сосудистыми осложнениями диабета, в числе которых — микроангиопатии (ретинопатия и нефропатия) макроангиопатии (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей), невропатии. Сахарный диабет - очень частая причина слепоты, смерти от уремии, велик риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. На фоне сахарного диабета летальность таких больных увеличивается в 23 раза. Риск развития ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда возрастает более чем в 2 раза, патологии почек - в 17 раз, гангрены нижних конечностей - в 20 раз гипертонической болезни -более чем в 3 раза (Мазовецкий, Беликов, 1987; Ефимов, 1988; Жуковский, 1989; Балаболкин, 1989, 2000).

Сахарный диабет является тяжелым бременем для здравоохранения. Так, Rubin и соавт. (1994) указывают, что в 1992г. все расходы на здравоохранение США составили 720,5 млрд. долларов, из которых на сахарный диабет пришлось 105,2млрд. или 14,6%. О социальной значимости сахарного диабета свидетельствует постоянное увеличение расходов, связанных с этим заболеванием. В 1984 г. в США эти расходы составляли 14 млрд., в 1987 г. - 20,4 млрд., а в 1992г. - уже 105,2 млрд. долларов. В 1992 г. расходы на одного больного без диабета составили в год 2604 долларов, а на 1 больного диабетом 9493, при этом на 1 больного диабетом с тяжелым течением сахарного диабета - 11 157 долларов.

Как следует из данных литературы, слепота, ампутация конечностей, почечная недостаточность, поражения сердечно сосудистой системы, нейропатии и другие патологии в существенно большей степени выражены у больных диабетом, чем среди населения в целом. Но наиболее тревожны факты, о том, что только 50% больных сахарным диабетом типа 1 доживают до 50 лет. Остальные погибают преимущественно от терминальной почечной недостаточности в возрасте от 20 до 40-50 лет (Дедов и др., 1992; Нестеров, 1997; Clare et al., 1995).

Сахарный диабет типа 1 - это болезнь, вызванная разрушением Р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в большинстве случаев аутоиммунного генеза. Аутоиммунная реакция против (3-клеток может индуцироваться у лиц с генетической предрасположенностью, обусловленной несколькими генами, в том числе - генами области HLA на коротком плече 6-й хромосомы, под воздействием экзогенных факторов (вирусные инфекции, токсические вещества). Когда медленно и постепенно развивающийся диабет приводит к гибели 80-95% инсулинпродуцирующих клеток, возникает абсолютный дефицит инсулина, приводящий к тяжелым метаболическим нарушениям. Лечение таких пациентов требует назначения пожизненной инсулинотерапии (Касаткина, 1996; Lavin, 1994).

На сегодняшний день, как уже говорилось, главная причина высокой смертности пациентов с сахарным диабетом типа 1 - это поздние осложнения, такие как диабетическая микроангиопатия (ретинопатия, нефропатия, нейропатия) и макроангиопатия (атеросклероз). Развитие осложнений обусловлено хронической гипергликемией и сопутствующими метаболическими нарушениями (Дедов, 1996; Балаболкин и др., 1999).

К сожалению, достижение и поддержание постоянной нормогликемии оказывается довольно сложной задачей, и в подавляющем большинстве случаев результаты лечения оставляют желать лучшего. В серии работ последних лет показано, что в нашей стране в поликлинических условиях не более 15% больных компенсированы в достаточной мере, в то время как остальная часть находится в стадии субкомпенсации или декомпенсации. При этом, несмотря на относительно хорошее самочувствие и отсутствие выраженных клинических признаков декомпенсации, показатели углеводного обмена оказываются неудовлетворительными (Касаткина, 1996). По результатам исследования Эндокринологического научного центра (ЭНЦ) РАМН в 1995 году среди популяции детей с сахарным диабетом в Москве были удовлетворительно компенсированы только 18% пациентов (Петеркова, и др., 1997). По данным международного аудита детской диабетологической службы 1997 года, в Московской, Тульской, Тамбовской областях и Саутгемптоне (Великобритания) объективные показатели свидетельствовали о худшем качестве компенсаторного лечения больных с сахарным диабетом в России.А также отмечали наличии многочисленных осложнений основного заболевания (Betts, Logatchev, Volkov, 1998).

Патогенетической терапией сахарного диабета типа 1 является экзогенный инсулин. Однако заместительная терапия инсулином не позволяет восстановить функцию (3-клеток. Частичное восстановление возможно после клинической манифестации заболевания (Щербачева и др., 1989; Дорошенко и др., 2001), но продолжающийся процесс деструкции (3-клеток приводит к полному переходу на заместительную терапию экзогенным инсулином. При этом известно, что какое-то время при уже текущем аутоиммунном процессе сохраняется нормальная секреция инсулина (Ziegler et al., 1987). Терапия даже высокоочищенными препаратами монокомпонентного человеческого инсулина, используемыми в последние годы, не позволяет избежать специфических осложнений диабета и добиться полной компенсации всех видов обмена (Фромен, 1985; Дорошенко и др. 2001; Зак и др. 2001; Podolsky et al., 1980; Andreani, 1984). В связи с этим большое значение в мире в последнее время приобретают исследования в области трансплантационных способов лечения сахарного диабета, но им педшествовали исследования и разработки по различным моделям экспериментальных эндокринопатий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ САХАРНЫЙ ДИАБЕТ

В 1943 году было показано, что введение аллоксана животным вызывает состояние, сходное с сахарным диабетом у людей, с тех пор интерес к этому химическому соединению не ослабевает (Dunn et al., 1943). Это объясняется не только тем, что аллоксановый диабет является достаточно часто используемой моделью диабета, но также и наличием сведений о присутствии эндогенного аллоксана в крови человека (Николаева и др., 1986; Tipson, Ruben, 1945; Cooperstein, 1982).

Содержание аллоксана у людей, собак и крыс составляет 0,150,25 мг%. После введения глюкозы наблюдается его увеличение; с этим, возможно, связано повреждение островковых клеток после внутривенного введения большого количества глюкозы (Sobotka,

Luisado-Opper, 1954). Вероятно, что глюкозный тест хотя и является необходимым, но несет в себе некоторую опасность спровоцировать ухудшение состояния человека, находящегося в стадии преддиабета.

Алл океан впервые получили в 1838 году (Wohler, 1838). Продукт распада мочевой кислоты, он представляет собой белое кристаллическое вещество, розовеющее на воздухе. Растворим в воде, эфире, спирте (Баранов и др., 1983; Lenzen, 1988; и др.). При внутривенном введении диабетогенные дозы для аллоксана составляют (в мг/кг): для обезьян - 100-150, собак - 50-100, кроликов - 150-200, крыс - 50-75; при внутрибрюшинном введении - 150-200 для крыс, 350400 для мышей (Баранов и др., 1983; 1988; Басмаджян и др., 1987; Царенко и др., 1987).

После введения аллоксана наступают значительные гистологические изменения в поджелудочной железе животных и существенные метаболические отклонения в самых различных органах и тканях (Баранов, 1983; Boquist, 1977; и др.). При аллоксановом диабете серьезно страдают обменные процессы, сахарообразование превалирует над скоростью окисления глюкозы и синтеза из нее гликогена, что приводит к быстрому падению содержания депонированного гликогена в печени (Сагидова, 1979; Лебкова, 1980; и др.). Снижение скорости гликолиза и пентозофосфатного пути превращения глюкозы приводит к дефициту образования макроэргических соединений. (Сидоренко, 1981; Тырышкина и др., 1986; Третьяк и др., 1988; и др.). У животных с аллоксановым диабетом нарушен переход углеводов в жиры. С помощью радиоиммунологических методов было установлено, что у крыс превращение глюкозы в жирные кислоты составляло лишь 5% по сравнению с уровнем этого процесса у здоровых животных (Manchester, 1987). Снижается содержание всех фракций гликолипидов в тканях мозга, сердца, селезенки поджелудочной железы, скелетных мышц (Исаев и др., 1983). В периферических нервах при аллоксановом диабете отмечается демиелинизация и дегенерация аксонов (Прихожан, 1981; Eliason, 1969; и др.). В надпочечниках при этом на фоне дистрофических изменений клеток снижается концентрация адреналина, наблюдается дефицит тирозина и аскорбиновой кислоты (Каримова и др., 1986; Wexler, 1980).

К изменениям, обусловленным микроангиопатией при хроническом аллоксановом диабете, следует отнести и ретинопатию. У крыс она наступает примерно через 3 месяц с момента возникновения диабета. При длительно текущих формах описаны помутнение хрусталика и развитие катаракты (Пучковская, 1977; Collins, Corder, 1977).

Здесь представлен перечень наиболее характерных патологических изменений в организме при аллоксановом диабете, которые на фоне гипергликемии, глюкозурии, полифагии, полидипсии и полиурии являются характерными признаками сахарного диабета.

На сегодняшний день существует несколько гипотез диабетогенного действия аллоксана: реакция с сульфгидрильными группами или блокирование цинка в островках Лангерганса; образования гидроксильных радикалов, повреждающих ДНК: инактивации глюкокиназы панкреатических островков (Лапин и др., 1973; Блох и др., 1987; Hammerstrom et al., 1967; Schmidt, 1967; Tomita, Watanabe, 1976; Boguist, 1977; Boguist, Nelson 1981; Jamamoto, 1984; Lenzen, Panten, 1988). Вместе с тем, несмотря на значительное количество работ, подтверждающих избирательное поражение аллоксаном Р-клеток, на сегодня не существует общепринятой теории, всесторонне объясняющей этот феномен, и для выяснения тонких механизмов действия аллоксана на островковый аппарат поджелудочной железы требуются дальнейшие исследования в этой области.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ В последние годы получает все большее развитие клеточная трансплантация как наиболее физиологичный вариант заместительной терапии при различных формах эндокринной недостаточности (Комисаренко, и др., 1991; Скалецкий, 2001; Слюсарев, 2002; Кирпатовский, 2003; Ricordi et al., 1991; и др.). Наиболее заметный прогресс достигнут в области пересадки островковых клеток поджелудочной железы при инсулинзависимом сахарном диабете (Shapiro, et al.„ 2000; Benhamou, et al., 2001; Federlin, et al., 2001).

Клеточная трансплантация имеет ряд преимуществ по сравнению с пересадкой целых органов. Пересадка клеток является обычно достаточно несложной хирургической процедурой. При этом возможно проведение контроля на стерильность и предварительной обработки ткани перед трансплантацией с целью снижения иммуногенности донорского материала, что позволяет не применять иммуносупрессию или значительно уменьшить ее интенсивность. (Шумаков и др., 2001; и др.).

Свободная трансплантация островковой ткани поджелудочной железы развивается по двум основным направлениям:

• трансплантация островков, выделенных из поджелудочной железы взрослых доноров;

• трансплантация островковых клеток поджелудочной железы плодов и новорожденных.

Получение жизнеспособных изолированных островков поджелудочной железы в достаточном количестве является необходимым требованием для обеспечения успешного лечения сахарного диабета с помощью трансплантации панкреатических островков. Островки Лангерганса как анатомически и функционально обособленные образования четко выражены в поджелудочной железе взрослых особей, тогда как в плодной поджелудочной железе помимо островков Лангерганса эндокринные клетки обнаруживаются в эпителиальной выстилке мелких выводных протоков и в составе так называемых ацино-инсулярных комплексов. Поэтому, как правило, для изоляции панкреатических островков используется поджелудочная железа взрослых доноров, в которой островки составляют 1-2% всей массы поджелудочной железы. Разработаны различные методы изоляции островков (Lacy et al., 1967) В 1988г Ricordi с соавт. разработали автоматический метод изоляции островков из поджелудочной железы человека. С помощью этого метода удается выделить до 800 тыс. островков из одной донорской поджелудочной железы (Ricordi et al., 1988, 1991).

По результатам около 300 операций по аллотрансплантации островков, выделенных автоматическим методом, инсулинонезависимость была достигнута в течение недели у 12,4%, до года - у 8,2%, большинство этих пациентов перенесли до или после трансплантации островков пересадку почки и получали иммуносупрессивную терапию (Navarro, 1990; Liu, 2000; и др.). О большей продолжительности инсулинонезависимости сообщает Hering (1997). В течение года после трансплантации 9 из 12 пациентов не нуждались в ведении инсулина, но при этом использовались иммуносупрессанты.

Следует отметить, что в последние годы снизилась активность применения этого метода трансплантационного лечения сахарного диабета. Прежде всего, это обусловлено тем, что пересадка островков поджелудочной железы взрослых доноров требует обязательного применения иммуносупрессантов, которые способны вызвать неблагоприятные эффекты у реципиентов, страдающих сахарным диабетом. Кроме того, как показал клинический опыт, для выделения необходимого количества островков надо в большинстве случаев использовать более чем одну донорскую поджелудочную железу, что зачастую очень сложно обеспечить. Значительный прогресс клинической аллотрансплантации островков наметился благодаря работе канадских ученых, которые пересаживали большое количество выделенных островков (9-11,5 тыс. на килограмм веса) в воротную вену. При этом они, используя наименее токсичные иммуносупрессанты, исключили глюкокортикоиды. Авторам удалось добиться самых значительных на сегодняшний день результатов. В одной статье говорится о 7 пациентах, которые сохраняли инсулиннезависимость от 4,4 до 14,9 месяцев (ср. 11,9), а в другой уже о 12, инсулиннезависимость у которых сохранялась от 6,5 до 17,4 месяцев (ср. 10,2). При этом гипергликемия была снижена в 2 раза по сравнению с дотрансплантационным периодом. К сожалению, отсутствие необходимого количества донорского материала не позволяет широко использовать данную методику (Shapiro с соавт., 2000; Ryan et.al, 2001).

Значительно большее применение получило другое направление свободной пересадки островковой ткани - трансплантация островковых клеток поджелудочной железы плодов и новорожденных (Federlin с соавт., 1991; и др.).

Известно, что плодная поджелудочная железа более богата эндокринной тканью и обладает потенциально меньшей иммуногенностью по сравнению с поджелудочной железой взрослых (Fine, 1989). По данным Ferner (1974) доля эндокринной ткани в поджелудочной железе 4-5месячных плодов человека составляет более 30% общей массы органа. Это несравнимо выше содержания эндокринной ткани в поджелудочной железе взрослого человека, составляющего лишь 1%. В поджелудочной железе новорожденных доля эндокринной ткани также велика - около 10%. В то же время экзокринная ткань плодной поджелудочной железы развита слабо.

В настоящее время широкое распространение получила трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы из плодов человека и животных. Основной механизм культивирования заключается в селективном выживании эндокринных клеток и снижении иммуногенности ткани. Культивирование in vivo оказывает цитотоксический эффект на ацинарную ткань: экзокринные клетки быстро дегенерируют в течение первых нескольких суток культивирования (Блюмкин, Скалецкий, 1984; Thomson, 1983; и др.). Важнейшим является иммуномодуляционное значение культивирования островковой ткани in vitro (Lacy, et al., 1982; 1993). Это выражается в снижении иммуногенности ткани в результате элиминации «лейкоцитов-пассажиров» - носителей поверхностных антигенов II класса, играющих роль в инициации иммунного конфликта и направляющих агрессию Т-клеток против островкового трансплантата, так же в процессе культивирования происходит изменение поверхностных свойств островковых клеток и снижается иммуногенность самих культивируемых клеток (Скалецкий и др., 2002а,б; Lacy et al., 1982; Federlin et al., 1984; Nishino et al.,1984; Tze, Tai, 1988; и др.). Кроме того, целесообразность предварительного культивирования обусловлена и тем, что в процессе инкубации панкреатической ткани можно убедиться в стерильности донорского материала, морфологической сохранности островковых клеток, их функциональной активности.

Большое количество работ по культивированию плодной поджелудочной железы человека и животных, выполнено начиная с 1976г. в лаборатории культур тканей НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (НИИТиИО). Сотрудниками лаборатории были разработаны различные способы получения культур из поджелудочной железы плодов (Блюмкин, 1984; 1985).

Безусловно, наибольший эффект наблюдается при аллотрансплантации, и наиболее подходящим донором для трансплантации в клинике является поджелудочная железа человека. Однако в связи с трудностями получения такого материала, а также рядом этических и юридических проблем встает вопрос об использовании в качестве донора некоторых животных. Для получения культур ксеногенных островковых клеток используется поджелудочная железа плодов свиньи и крупного рогатого скота, а также новорожденных поросят (Комисаренко и др., 1983; Шумаков и др., 1981, 1984; Скалецкий, 1988; и др.).

В последние годы в НИИТиИО стали выполняться клинические трансплантации культур островковых клеток, полученных из поджелудочной железы кролика (Скалецкий и др., 1990). Одним из аргументов в пользу применения этого донорского материала была близость строения инсулина человека и кролика, а также возможность широкого разведения этих животных. В результате проведенных исследований был разработан оригинальный метод получения очищенных культур островковых клеток свободных от балластных элементов и состоящих на 70-80% из жизнеспособных J3 -клеток. При этом Р-клетки обладают высокой инсулинпродуцирующей активностью и имеют сниженную иммуногенность (Скалецкий Н. Н.и др., 1990, 1994, 2001, 2002; и др.).

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

Успешная трансплантация островковых клеток приводит к частичной, реже к полной компенсации нарушений углеводного обмена, выражающейся в нормализации гликемии. Имеются немногочисленные сообщения об единичных случаях отмены инсулина у пациентов с сахарным диабетом на непродолжительное время. (Federlin et al., 1991; Hering et al., 1997; Hu Yuang Feng et al., 1988; 1989; Scharp et al., 1990) Как говорилось выше, канадским ученым из Эдмонтона удалось добиться несколько лучших результатов, но их достижения на сегодня повторить довольно сложно (Shapiro et al., 2000; Ryan et.al., 2001).

Результаты исследований по трансплантации островковых клеток в эксперименте и клинике свидетельствуют о том, что основным эффектом пересадок на данный момент является предотвращение или торможение прогрессирования поздних диабетических осложнений, в наибольшей степени - диабетической полинейропатии, ранних стадий нефропатии и ретинопатии. Другой существенный эффект пересадки -стабилизация течения лабильного сахарного диабета 1 типа, что особенно актуально у детей и подростков (Шумаков, 1981, 1984, 1995; Блюкмин, 1984; Бойко, 1987; Словеснова, 1989; Gray et.al., 1976; Federlin et.al., 1984). Указанные положительные сдвиги носят продолжительный характер и прослеживаются от нескольких недель до года и более.

В первое время перечисленные эффекты объясняли секрецией инсулина [3-клетками трансплантата. Позже было высказано другое предположение, согласно которому под влиянием трансплантации происходит мобилизация пролиферативного пула эпителиальных клеток собственной железы реципиента и дифференцировка клеток-предшественников в [3-клетки через стадию пре-[3-клеток, которые секретируют преимущественно проинсулин и не являются объектами аутоиммунной атаки. Так Righardt с соавт. (1984) наблюдали частичное восстановление собственной поджелудочной железы в виде гиперплазии и гипертрофии Р-клеток у крыс с интрапортальной трансплантацией островков поджелудочной железы изогенного донора. Согласно их мнению, частичное восстановление Р-клеток собственной поджелудочной железы происходит за счет плюропатентных эпителиальных клеток выводных протоков экзокринного отдела поджелудочной железы реципиента. Hahn с соавт. (1986) показали, что через 17 недель после трансплантации островков поджелудочной железы в селезенку крыс WLK со стрептозотоциновым диабетом в собственной поджелудочной железе у этих животных наблюдается достоверное увеличение объема островков и р-клеток в них. После пересадки панкреатической ткани наблюдается преимущественное количественное увеличение эндокринных клеток по отношению к экзокринным, отмечается рост и дифференциацие островковых клеток в течение посттрансплантационного периода (Скалецкий, 1987; Жарков, 1989; Brown et.al.,1984). Показано так же, что даже на отдаленных сроках после внутрибрюшинной трансплантации (более 6 месяцев) ткани неонатальной поджелудочной железы крысам с аллоксановым диабетом происходит увеличение количества р-клеток, и повышенное разрастание протоковых частей собственной поджелудочной железы реципиентов, что позволяет обеспечить компенсацию углеводного обмена (Хлыстова и др., 2003).

Последние годы группа шведских ученых, возглавляемая J. Wahren, активно разрабатывает проблему физиологической роли С-пептида, его синтеза и возможности применения в клинике с целью проведения патогенетической профилактики и терапии сосудистых осложнений сахарного диабета. Известно, что С-пептид отщепляется от молекулы проинсулина в момент освобождения активной формы инсулина. Ранее он считался биологически неактивным. Однако в течение последних лет ряд исследователей продемонстрировали, что использование С-пептида коротким курсом (1-3 кратно с интервалом в 60 минут) уменьшают гломерулярную гиперфункцию, увеличивают утилизацию глюкозы. Более длительная терапия в течение 1-3 месяцев приводит к полному купированию проявлений диабетической нефропатии (Wahren et.al., 1994, 1996, 1998). С этой точки зрения имплантацию островковых клеток следует рассматривать как длительное введение инсулина и С-пептида в организм при диабете.

В качестве трансплантационного материала для лечения сахарного диабета ведутся также экспериментальные исследования по применению клеток инсулиномы - опухоли поджелудочной железы из Р-клеток, продуцирующих инсулин. (Reintgen, Feldman, 1980; Akimaru, Stuhlmiller, Seigler, 1981; Ohgawara et.al., 1995; Dombrowski, Klingmuller, Pfeifer, 1998; и др.). Но в данном случае пока не разрешенной проблемой является контроль над делением онкогенных клеток.

Развитие генно-инженерных технологий, при которых возможно помещение фрагментов ДНК в клетку и присвоение им новых необходимых свойств, позволило проводить разработку генно-инженерных инсулинпродуцирующих клеток. Так Efrat с соавт. (1999) получили линейные |3-клетки от трансгенных мышей, которые вырабатывают инсулин, адекватно отвечая на физиологические стимулы. Репликация клеток тщательно контролируется как в культуре, так in vivo.

Среди методов, способствующих защите Р-клеток от иммунной агрессии, в последнее время применяется макро- и микроинкапсуляция островковых клеток в полунепроницаемые мембраны.

Есть сообщения о трансплантации инкапсулированных человеческих островковых клеток пациенту с сахарным диабетом 1 типа с полной отменой инсулина. Данный метод изучается при ксенотрансплантации островковых клеток свиньи (Elliot, 1996). Для инкапсуляции используется сырье, добываемое из бурых водорослей — альгинат.

Положительные результаты были получены также организацией Neocrin, использующей для микроинкапсуляции островковых клеток свиней полиэтиленгликоль-полимер (Scharp et al., 1990). Данные методики пока не имеют широкого применения при лечении сахарного диабета типа 1. Тем не менее, экспериментальные и клинические исследования по алло - и ксенотрансплантации с применением инкапсуляции продолжаются (Lanza, Ecker et al., 1999).

На сегодня в мире накоплен большой опыт алло - и ксенотрансплантации инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы (Шумаков, Блюмкин, Скалецкий, 1995; Шумаков, Скалецкий, 1995; Krishnamurthi et al., 2001; Odorico et al., 2002; Larsen et al., 2002; Robertson et al., 2003; Nikolaidis et al., 2003). Значительная часть этих работ проводилась и проводится в научных учреждениях нашей страны (Шумаков и др., 1985; 1995; Поташов и др., 1987; Розенталь и др., 1988; Малик, 1990; Павловский, Бойко, 1990; Беникова, Турчин, 1991; Бойко, 1991; Гаврилова, 1992; Галибин и др., 1992; Малайцев и др., 1994; Shumakov et al., 1987, 1989, 1990; Slovesnova et al., 1987; Rosental et al., 1988, 1989). Общей чертой этих работ является использование в качестве трансплантационного материала культур, получаемых из поджелудочной железы внутриутробных плодов человека, свиньи, крупного рогатого скота, а также некоторых новорожденных животных (поросята, кролики). Близкие по содержанию работы примерно в то же время проводились в Китае, Югославии, Венгрии (Басмаджян и др., 1987; Блюмкин и др., 1992; Farkas et al., 1983; Djodjevic et al.,

1987,1990; Hu Y.E., 1988,1992). Во многих странах (Италии, США, ФРГ и Швеции) в практике стали использовать островки Лангерганса, как анатомические отдельности, изолированные из поджелудочной железы взрослых трупных доноров методом Ricordi (Ricordi et al., 1989, 1992; Scharp et al., 1990,1991; Bretzel, Ricordi, 1997; Tzakis et al., 1990). При интрапортальной аллотрансплантации десятков и сотен тысяч таких островков применялась иммуносупрессия. В большинстве случаев пересадка сочеталась с аллотрансплантацией почки трупного донора (в связи с претерминальной или терминальной стадией диабетической нефропатии у реципиента). В то же время чаще всего при алло - и ксенотрансплантации культур островковых клеток, осуществлявшихся в России, а также в Китае, Венгрии и Югославии, иммуносупрессию не применяли и, что особенно важно подчеркнуть, трансплантацию проводили больным, не находившимся на поздних этапах диабетической нефропатии. Основанием же для отказа от иммуносупрессии было то, что при достаточно длительном культивировании in vitro в микрофрагментах плодной донорской поджелудочной железы погибают так называемые лейкоциты-пассажиры (дендритные клетки, гистиоциты, эндотелий островковых капилляров), что приводит к снижению общей антигенности донорского материала (Скалецкий, 1987, 1994; Блюмкин и др., 1992; Шумаков и др., 1995; Snell, 1957; Bowen, Lafferty, 1980; Simeonovich et al., 1980; Lacy et al., 1982; Lafferty, Prowse, 1984). В условиях культивирования также погибают и элиминируются ацинарные клетки экзокринных отделов донорской плодной поджелудочной железы.

Вместе с тем, без иммуносупрессии трансплантаты, хотя и выживают благодаря перечисленным процедурам дольше, все же неизменно отторгаются, если не производить дорогостоящей процедуры подбора ткани донора и реципиента на иммунносовместимость. В России существуют все условия для того, чтобы создать широкую сеть банков данных донорских тканей и клеток, что могло бы весьма значительно повысить эффективность трансплантации любых тканей и органов.

РАЗЛИЧНЫЕ СПОСОБЫ АЛЛО - И КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ИНСУЛИНПРОДУЦИРУЮЩИХ КЛЕТОК Из раздела о трансплантации тканей в переднюю камеру глаза стало понятно, что эта область предпочтительнее для экспериментальной трансплантации тканей самой различной природы. В этом разделе речь, в основном, пойдет о трансплантации инсулинпродуцитующих тканей в области, не являющиеся относительно иммунопривилегированными. По законам иммунологии ткани, пересаженные в такие области, не могут функционировать достаточно долго без иммуннодепрессивных препаратов. Вместе с тем экспериментальные данные показывают эффект трансплантации существенно более длительный, чем должен действовать сам трансплантат вследствие его отторжения.

Безусловно, выживание и функционирование пересаженных трансплантатов инсулинпродуцирующих клеток зависит от многих факторов, таких как качество, количество, предварительная обработка, видовая принадлежность островковых клеток и другие условия. Не последнюю роль играет место трансплантации. Учитывая физиологические механизмы секреции инсулина (Аметов, Кондратьева, 1995), который в первую очередь поступает в воротную вену и проявляет свой основной эффект в печени, наиболее оптимальным выглядит пересадка инсулинпродуцирующих клеток в область, анатомически близкую расположению самой поджелудочной железы (Бойко, Павловский, 1988; Евсеев, 1993). Действительно широкое применение получила, прежде всего, трансплантация в печень, а также в пульпу селезенки, внутрибрюшинно и под капсулу почки. Так по данным Kaufman с соавт. для достижения длительной нормогликемии у собак с экспериментальным диабетом необходимо трансплантировать в печень 4400, в селезенку 4650, а под капсулу почки до 5500 островков на килограмм веса животного. При этом после внутрипеченочного введения нормогликемия наступала раньше, чем после внутриселезеночного (через 1 и 7 сутки, соответственно) (Kaufman et al., 1990). С другой стороны эксперименты Hiller с соавторами на крысах показали прогрессивное ухудшение эндокринной функции островков при трансплантации в воротную вену, по сравнению с пересадкой под капсулу почки (Kaufman et al., 1990; Hiller et al., 1991).

В плане оценки влияния места трансплантации показательны многочисленные эксперименты по изотрансплантации островков, когда отсутствует ярко выраженная иммунная реакция. Результаты изотрансплантации островков в печень и селезенку оказались примерно одинаковыми и показали длительное развитие ремиссии диабета иногда в течение всей жизни реципиента (Finch et al., 1977; Sandler, Andersson, 1981; Federlin, Bretzel, 1984). В сравнительных экспериментах по введению изогенных островковых клеток в другие места, например, подкожно, внутримышечно и внутривенно, в некоторых работах было показано преимущество печени и селезенки для пересадки (Комисаренко и др., 1980; и др.). Dorn с соавт. (Dorn et al., 1977) показали, что при внутрибрюшинном введении изотрансплантатов островковых клеток рецидив диабетического статуса возникал через 3 месяца, в то время как при пересадке в воротную вену печени нормогликемия сохранялась до конца срока наблюдения 1 год.

Положительные эффекты были получены при изотрансплантации взвеси ткани и культур поджелудочной железы плодов и новорожденных в печень, в пульпу селезенки, под капсулу почки и внутрибрюшинно (Herge et al., 1976; Feldman et al., 1980; Brown et al., 1984; и др.). При этом важным является тот факт, что через 2-3 недели после изотрансплантации плодной поджелудочной железы под капсулу почки крысам с аллоксановым диабетом экзокринные клетки в месте трансплантации отсутствуют и преобладают крупные островки Ларгенганса, общая масса которых увеличивается за это время более чем в 20 раз (Herge et al., 1976). Brown с соавторами в экспериментах на крысах и карликовых свиньях также обнаружили, что в течение 10-14 дней экзокринные клетки плодной поджелудочной железы в основном эллиминируются, а в месте трансплантации (почка) остаются лишь островковые клетки (Brown et al., 1984).

Безусловно, в экспериментах по аллотрансплантации островковых клеток наблюдалось более выраженное и быстрое развитие реакции отторжения, особенно при пересадках измельченной ткани поджелудочной железы или изолированных островков. Отторжение происходит, как правило, уже в течение нескольких дней (Комисаренко и др., 1980; Hegre et al., 1976; Sutherland, 1981; Tze, Tai, 1983), или 2-3 недель (Bowen, Lafferty, 1980; Lippert, 1983; Powell, 1987). Данная реакция отмечается при использовании различных мест пересадки - в мышцы, подкожно, в печень, селезенку, под капсулу почки, внутрибрюшинно. Garvey с соавторами (Garvey et al., 1980) проводили аллотрансплантацию ткани свежевыделенной поджелудочной железы крысам со стрептозотоциновым диабетом под капсулу почки. При гистологическом исследовании места пересадки они наблюдали моноклональную инфильтрацию уже через 3 дня, деструкция островковых клеток начиналась с 6 дня, к 14-дневному сроку трансплантаты были почти полностью замещены фиброзной тканью, а к месяцу на месте трансплантации оставалась лишь рубцовая ткань.

При ксенотрансплантации ткани поджелудочной железы период нормогликемии продолжается обычно еще более короткий промежуток времени по сравнению с длительностью данного эффекта при аллогенной пересадке той же ткани. Морфологические признаки реакции отторжения трансплантата существенно не отличаются от таковых при аллотрансплантации островковой ткани поджелудочной железы или же ее сегмента (Nakajima et al., 1982; David et al., 1988).

Как показывает опыт сотрудников НИИТиИО (МЗ), разработка в эксперименте и внедрение в клиническую практику трансплантации культур островковых клеток аллогенного и ксеногенного происхождения, в процессе обработки которых показано снижение иммуногенности трансплантата, позволила применять в качестве места для пересадки не только печень и селезенку, но и мышцы передней брюшной стенки без иммуносупрессии. Так, например, у крыс со стабильным и тяжелым сахарным диабетом, индуцированным аллоксаном после ксенотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека, наступала стойкая ремиссия диабетического статуса до окончания срока эксперимента (20 недель) (Скалецкий и др., 1983, 1985, 1987).

Результаты клинических исследований показывают эффект трансплантации культур островковых клеток в прямую мышцу живота от нескольких месяцев до года. Положительное влияние пересадки проявляется в виде снижения потребности экзогенного инсулина, стабилизации лабильного течения диабета и торможения прогрессирования поздних осложнений диабета. Полной ремиссии сахарного диабета с отменой введения инсулина не происходит (Скалецкий, Онищненко, 2001).

В исследовании, посвященном сравнительной оценке внутримышечных и внутрипортальных пересадок культур островковых клеток в клинике, показано, что при внутрипеченочной пересадке прикрепленной фракции культур островковых клеток поджелудочной железы отмечался более выраженный метаболический эффект, чем при внутримышечной пересадке флотирующей фракции культур (Евсеев, 1993).

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК В ПАРАВАЗАЛЬНУЮ КЛЕТЧАТОЧНУЮ ЩЕЛЬ СЕМЕННИКА

Известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами толерантности к трансплантату. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти области без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза (Жарков, Ярыгин, 1988, 1989; Брагин, 1983, 1986; Tze, Tai, 1988) и тестикул, а также тимус, матрикс волосяного фолликула, плаценту (Кирпатовский и др., 1994, 2003; Bellgrau, 1995; Duke et al., 1999; Rossini et al., 1999). Имееются работы по доказательству иммунопривилегированности семенника при трансплантации в него клеток и тканей. Шведскими учеными, которые пересаживали ауто - и аллотиреоидную ткань в семенник и подкожно у баранов и приматов, были получены хорошие результаты по приживлению ткани в семеннике. Алло- и аутотрансплантат при пересадке в семенник функционировал от 28 дней до 6 недель, в 5 из 6 случаев, пересадка аллотрансплантата под кожу была неэффективной (Setchell, Granholm, Ritzen,1995).

Положительные результаты по трансплантации эндокринных клеток различной природы в мужскую половую железу были получены при пересадке в семенник аллогенных и ксеногенных андрогенпродуцирующих Лейдиговских клеток, клеток гипофиза и ядер переднего гипоталамуса (Кирпатовский, Дендеберов, 1994;

Кирпатовский, Каитова, Лысенко, 1999; Пахомова, 2003; Каитова, 2003). В других исследованиях Ferguson и Scothorne (Ferguson, Scothorne, 1977) пересаживали изолированные микродиссекцией аллотрансплантаты панкреатических островков морским свинкам в тестикул без применения иммуносупрессии. Время выживания островков достигало 11 недель.

Иммунопривилегированность тестикула объясняли вначале иммуносупрессорным эффектом тестостерона и (или) прогестерона, а также более низкой температурой в мошонке (Whitmore, Gittes, 1979; и др.). Однако, в 1984г Selawry и Wittington получили, что при аллотрансплантации культивированных островков крысам (10 островков на грамм веса) интрапортально, под капсулу почки и в ортотопически расположенный семенник не было достигнуто нормогликемии. Пересадка того же количества островков в интраабдоминально расположенный семенник вызывала аглюкозурию на протяжении более 50 дней (Selawry, Wittington, 1984). Более благополучное длительное выживание культивированных неонатальных Р-клеток свиньи в интраабдоминально помещенных тестикулах собак (срок наблюдения 100 дней) демонстрируют эксперименты Gores с соавторами (Gores et al., 2003).

Полученные результаты по лучшему выживанию изолированных островковых клеток в интраабдоминально расположенном семеннике, когда в нем сохраняются преимущественно клетки Сертоли, поставили вопрос о том, что именно эти клетки играют решающую роль для приживления трансплантата в мужской гонаде.

Последующие исследования показали, что клетки Сертоли вырабатывают фактор, в дальнейшем названный Fas-ligand (CD 95 Ligand), оказывающий местный иммуносупрессорный эффект. Selawry, Kotb, Herrod, Lu (1991) исследовали влияние культуры клеток

Сертоли in vivo на лимфоциты. Опыты показали, что вещество, вырабатываемое клетками Сертоли, ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов и снижает продукцию ими интерлейкина-2 (IL-2). В дальнейшем было выяснено, что фактор, вырабатываемый клетками Сертоли, Fas-ligand, относится к семейству факторов некроза опухолей (TNF). Fas-L (CD 95) и его рецептор Fas-R принимают участие в иммунном ответе. Fas-R имеется на неактивных Т и В-лимфоцитах в небольшом количестве, при их активации в иммунном конфликте количество Fas-R возрастает и при соединении Fas-L с Fas-R активированные Т-лимфоциты подвергаются апоптозу (Takeda et al„ 1998; Chen et al., 1998). Fas-L действует на активированные T-лимфоциты и макрофаги, вызывает их гибель, когда на них функционирует Fas-R (Nagata, Golstein, 1995). В экспериментах было выяснено, что Fas-L действует на активные эффекторные клетки иммунной системы (Duke с соавт., 1999). Эффекты Fas-ligand обусловленной иммунопротекции были отмечены так же в передней камере глаза (Lau et al., 1996; Chen, et al., 1998; и др.).

Так же было показано, что тестикулярная ткань и клетки Сертоли экспрессируют и другие факторы, способствующие иммуносупрессии - фактор-Р (TGF-P) - инсулиноподобный фактор-1 (IGF-1). (Allison et al., 1997; и др.). Но в отличие от этих факторов в настоящее время наиболее широко исследован и продемонстрирован в экспериментах иммуносупрессивный эффект Fas-L.

Поскольку клетки Сертоли, вырабатывающие Fas-ligand, оказывают локальную иммуносупрессию для трансплантата (Bellgrau et al., 1995; Griffit, Brunner, 1995; Sanberg et al., 1996; Lau et al., 1996; Duke, 1999; и др.), возможно их использовать при совместной пересадке с основным трансплантатом для создания так называемых искусственных иммунопривилегированных зон. Это подтверждается рядом исследований по успешной аллотрансплантации в мозг крыс клеток striatum и клеток Сертоли без применения циклоспорина - А (Sanberg et al., 1996; Saporta et al., 1997). Имеются данные о способности клеток Сертоли защищать от иммунного конфликта паратиреоидную ткань (Whitmore et al., 1979). Совместная пересадка аллогенных клеток почки и клеток Сертоли под ренальную капсулу у крыс пролонгирует выживание трансплантата (Zhao et al., 2002). Одновременная криоконсервация островковых клеток неонатальных поросят и клеток Сертоли качественно и количественно улучшает состояние Р-клеток (Selawry et al., 1996).

Показано купирование гипергликемии у крыс с экспериментальным диабетом после трансплантации островковых клеток совместно с клетками Сертоли под капсулу почки. В эксперименте на крысах при трансплантации Р-клеток с 75% клетками Сертоли нормогликемия сохранялась более 95 дней. Если же клетки Сертоли составляли в трансплантате 50%, он функционировал только 10 дней. Вместе с тем, если диабетическим мышам Balb/e пересаживали только островковые клетки крыс Lewis (Lewis et al.,1980; 1983), трансплантаты выживали в течение -10.9+0.8 дней, в случае пересадки совместно с клетками Сертоли (Balb/c) - 14.0+1.2 дней. При пересадке островковых клеток с мышиной антилимфоцитарной сывороткой, выживание трансплантатов составило 12.2±0.7 дней. И только совместное использование островковых клеток, клеток Сертоли и антилимфоцитарной сыворотки позволило увеличить время выживания трансплантатов до 64,9±8,1 дней (Selawry, Cameron, 1996; Dufour et al., 2003).

Takeda, Gotoh с соавторами (1998) получили достоверную пролонгацию выживания островков поджелудочной железы. Это происходит при совместной трансплантации ПЖ с Fas-ligandэкспрессирующей тканью семенника под капсулу почки у мышей со стрептозотоциновым диабетом. Lau с соавторами (Lau et al., 1996) экспрессировали Fas-L на миобластах и пересаживали их совместно с островковыми клетками под капсулу почки диабетическим мышам, что привело к увеличению продолжительности функционирования клеток. Таким образом, трансплантация клеток Сертоли вместе с инсулинпродуцирующими клетками приводит к пролонгации их выживания без применения иммунной супрессии как при аллотрансплантации (Cai, Zhan, Не, 2001; Calafiore, Lucca, 2002; Kin et al., 2002), так и при пересадке ксеногенных Р-клеток (Dufour et al., 2003, 2003а).

Данные о наличии факторов естественной локальной иммуносупрессии в тестикуле заставляют по-новому оценить влияние места пересадки на функцию трансплантатов, в частности, островковых клеток и продолжить исследования возможности использования трансплантации инсулинпрордуцирующих клеток в тестикулы для долговременной компенсации экспериментального диабета.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЖИВОТНЫЕ

В экспериментах использовали крыс-самцов породы Вистар и беспородных. Для операции отбирали животных одного возраста, чаще всего с начальной массой 200-230 г. Эмбриональный материал получали от половозрелых крыс-самок Вистар и беспородных. Все животные выращивались в условиях вивария на стандартной диете. Длиннохвостые якутские суслики Citellus Undulatus привозились из экспедиции и затем содержались в специализированных помещениях с необходимым температурным режимом.

Всего в работе использовали более 2500 взрослых и 135 новорожденных крыс, 600 эмбрионов, 7 сусликов длиннохвостых якутских Citellus Undulatus, 30 кроликов.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТИМУСА И КОСТНОГО МОЗГА В ПЕРЕДНЮЮ

КАМЕРУ ГЛАЗА ЖИВОТНЫХ Трансплантируемую ткань тимуса выделяли из крыс самцов "Wistar" массой 120 г. Костный мозг выделяли из бедренной кости.

В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса либо костного мозга измельчали до размера примерно 1 мм3.

Крысам-реципиентам на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина с тем, чтобы зрачок стал максимально большим, а площадь радужной оболочки уменьшилась. Эта манипуляция помогает избежать последующих повреждений богатой капиллярами структуры. Через 5 минут на глаз наносили по 1 капле 0,5%-раствора дикаина, что в еще большей степени снижало чувствительность глаза при операции. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом. В разрез длиной 1,5-2 мм очень медленно выдавливали трансплантируемые кусочки ткани объемом 3-5 мм3 и помещали их на радужную оболочку глаза как можно дальше от разреза.

Иммунодепресантов ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете (Брагин, Куликов, 1983; Kulikov et al., 1986).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТИМОЦИТОВ У ЖИВОТНЫХ После декапитации животным вскрывали грудную полость, извлекали тимус и помещали его в солевой раствор Хенкса без фенолового красного с глюкозой (5 ммоль/л) и антибиотиком (гентамицин, 10мкг/мл), содержащий 20 ммоль/л HEPES ("Serva", США) рН 7,2, температуры 37°С. Тимусы протирали через капроновый фильтр, однократно отмывали после центрифугирования (700 g, 5 мин) и ресуспендировали в растворе Хенкса или RPMI-1640 ("Serva", США) до разной концентрации в интервале 105-108 клеток в 1мл. Концентрацию клеток определяли просчетом в камере Горяева. Клетки инкубировали либо в пластиковых чашках Петри, либо в ячейках 96-луночного плоскодонного планшета (Куликов и др., 2001).

ОБЛУЧЕНИЕ ЖИВОТНЫХ Эксперименты по облучению проводили на гамма-установке биологического эксперимента в специальных контейнерах, куда помещали не более 5 животных одновременно. Облучение осуществляли у-лучами 60Со с мощностью дозы 1,5-1,6 Гр/мин в течение 2,5-5 минут при комнатной температуре (Kulikov et.al., 1998).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТИРОВАННОЙ ДНК Фрагментацию ДНК определяли согласно методу (Ferotti et al.,

1990). 1,5-107 клеток осаждали центрифугированием (Юмин, 700g), ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфферного раствора, содержащего 5мм Tris-HCl, 20 mM EDTA, 0,5% Triton Х-100, рН 8,0.

Лизис проводили в течение 15 мин на льду. Затем образцы центрифугировали при 13000 g в течение 25 минут для разделения высокомолекулярного хроматина (осадок) и фрагментированной ДНК (супернатант). Осадки ресуспендировали в 1мл буфера, содержащего ЮмМ Tris-HCl и 1мМ EDTA, рН 8,0. Осадки и супернатанты окрашивались дифениламином (Burton, 1956) для определения содержания ДНК. Количество ДНК определяли флуориметрическим методом по поглощению растворов при длине волны 600 мм, использовали спектрофлуориметр "Perkin Elmer". Количество фрагментированной ДНК определяли как отношение содержания ДНК в супернатанте к суммарному содержанию ДНК в супернатанте и осадке.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА Экспериментальный диабет у крыс получали с помощью аллоксана фирм "Chemapol" «ДИАэМ», «Sigma», обладающего избирательным токсическим действием на /? -клетки островков Лангерганса. Внутрибрюшинно вводили 5%-раствор токсина, из расчета 200-280 мг сухого вещества на 1кг массы тела.

ТЕСТИРОВАНИЕ УРОВНЯ ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ На первых этапах работы концентрацию глюкозу определяли орто-толуидиновым методом. Орто-толуидиновый реактив представляет собой 8%-раствор орто-толуидина в 80% уксусной кислоте, стабилизированный тиомочевиной и щавелевой кислотой. Глюкоза при нагревании с орто-толуидиновым реактивом дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна ее концентрации в растворе (Меньшиков, 1973). Позже глюкозу сыворотки крови определяли глюкозооксидазным методом (Kadish et al., 1979) на автоанализаторе фирмы "Beckman" США. Для рутинных экспериментов при подготовке животных для трансплантации, когда требуется большое количество измерений, использовали диагностические полоски «Pentafan», «Labstix», «Uriskan» для определения глюкозы в моче, а также «Visidex 2», «Глюкохром Д», «Betachek» и др. для быстрого определения глюкозы в крови.

При проведении работ с интратестикулярной трансплантацией измерения гликемии проводились системой "Glucometer Elite®" с соответствующими тест-полосками (сенсорами), предоставленными фирмой Bayer (Германия). Диапазон измерения прибора составляет от 1,1 ммоль/л до 33,3 ммоль/л. При уровне сахара крови менее 1,1 ммоль/л дисплей глюкометр показывает "Lo", в случае гликемии более 33,3 ммоль/л - "Hi". Учитывая диапазон прибора, показание "Hi" условно принималось за 33,3 ммоль/л.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИНСУЛИНА В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ, ТРАНСПЛАНТАТЕ И СЫВОРОТКИ КРОВИ

Инсулин в тканях определяли по известным методикам (Davoren, 1962; Orland, 1987) с нашими модификациями (Арбузова, Куликов, 1989, 1991). Образец ткани (трансплантат, собственную поджелудочную железу или эмбриональную поджелудочную железу) тщательно измельчали в гомогенизаторе, помещали в сосуд с охлажденным раствором А (375 мл абсолютного этанола и 7,5 мл концентрированной соляной кислоты) в соотношении 1 г ткани на 4 мл раствора. Экстракцию проводили в течение 48 часов при 4°С. Затем гомогенат центрифугировали 10 минут при 6000 q. Супернатант сохраняли, осадок ресуспендировали в растворе В (375 мл абсолютного этанола, 105мл дистиллированной воды и 7,5 мл концентрированной соляной кислоты) в том же соотношении. Экстракцию проводили при 4°С в течение 24 часов, затем снова центрифугировали 10 минут при 6000 q. Объединенный после первой и второй стадии выделения супернатант разводили в зависимости от концентрации инсулина в 100200 раз 0,1 М фосфатным буфером рН-7,4, содержащим 0,1%-бычьего сывороточного альбумина. Определение иммунореактивного инсулина в полученном растворе проводили с помощью стандартных наборов (125) I-insulin RIA KIT (Венгрия). Содержание иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сывортке крови измеряли радиоиммунным методом с помощью набора РИО-ИНС-ПГ-(125) I (Минск) или (125) I-insulin RIA KIT (Венгрия). В работе использовали гамма-счетчик "Nuclear-Chicago Ml 197" (США).

Определение иммунореактивного инсулина в крови, в собственной поджелудочной железе реципиента и в трансплантатах проводили в Эндокринологическом научном центре (Москва) совместно с к.м.н. М.И. Арбузовой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТРЕБЛЕНИЯ ВОДЫ Животных помещали в клетки по 3-5 шт. По градуированным поилкам определяли количество потребляемой воды за сутки. Сопоставляя результат с общим весом животных в клетке, определяли каково среднее потребление воды на 100 г веса животного.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЙРОМЕДИАТОРОВ (НА И 5-ОТ) В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ Исследования проводили по известной методике (Коган, Нечаев, 1979) с нашими модификациями (Kulikov, Arhipova et al., 1986). Измерение проводили на флюориметре марки «Percen-Elmer MRF 44В».

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ 3Н - ЛЕЙЦИНА В НЕОКОРТЕКС И СТВОЛОВОЙ ОТДЕЛ МОЗГА КРЫС

Н - лейцин вводили животным внутрибрюшинно из расчета 0,1мКю на 100г массы. Животных декапитировали под эфирным наркозом, неокортекс и стволовую часть мозга гомогенизировали (300 мг ткани в 3 мл н-бутанола), добавляли 0,1Н HCL и в объеме 0,1 мл наносили на миллипоровые фильтры в 4-х повторностях, промывали 70% спиртом, подсушивали и заливали сцинтилляционной жидкостью. Счет проводили в течение 1 мин. на счетчике Interteknic (Франция). Белок в гомогенате определяли по Лоури (Lowry et al., 1951).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ 14С-АТФ (ПО ИЗМЕНЕНИЮ РНК-СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ХРОМАТИНА ТКАНИ

МОЗГА И ПЕЧЕНИ КРЫС) Хроматин из мозга и печени крыс выделяли по Huang и др.(Huang et al., 1969), с нашими модификациями (Архипова и др., 1981). РНК-полимеразу из E.coli с удельной активностью 4000ед. на 1 мг белка в 1 мин выделяли по методу Берга (Berg et al., 1971). Реакционная смесь объемом 0,2 мл имела следующий состав: 0,01М трис-HCL буфер рН 8,0, содержащий 2 ммоль 2-меркаптоэтанола; 0,01 М MgCL2 ; 0,2 М NaCl, 10"4 М ЭДТА; по 0,2 мМ ГТФ, ЦТФ, УТФ, 0,02 мМ 3Н-АТФ (с удельной активностью 24,8 Ки/мМ) или 14С-АТФ (удельная активность 47 Ки/мМ); 10 мкг РНК-полимеразы из Е. coli. Реакцию запускали добавлением 0,01 мл хроматина (или ДНК), содержащего около 10 мкг ДНК. Время инкубации при 37С составляло 15 мин, затем пробы переносили в ледяную баню, добавляли 1 мг альбумина, 2 мл 5% ТХУ и оставляли на 2 ч при температуре 0-2 С. Материал промывали на фильтрах «Сынпор» № 6 20-ю мл 5% ТХУ и 10-ю мл 96% этанола.

Радиоактивность подсчитывали на сцинтилляционном счетчике «Интертехник» (Франция). Содержание белка определяли по Лоури (Lowry, 1951), ДНК-по Дише (Diche et al.,1948).

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В БОКОВЫЕ ЖЕЛУДОЧКИ МОЗГА КРЫС

Животных-реципиентов под нембуталовым наркозом (45 мг/кг) скальпировали и фиксировали в стереотаксическом аппарате в соответствии с координатами атласа (Bares, Petron, 1967). Затем в кости черепа с помощью зубного бора делали отверстие диаметром 2 мм с координатами центра АР = +1, L = 0,5 мм. Осторожно без повреждения сосудов вырезали твердую оболочку мозга. Трансплантат поджелудочной железы (Э 17-18) объемом 2-3 мм3 вводили в левый боковой желудочек мозга с помощью туберкулинового шприца со стеклянным наконечником, прикрепленным к основанию инъекционной иглы. После забора ткани поджелудочной железы в туберкулиновый шприц его закрепляли на стереотаксисе, конец стеклянного наконечника погружали в область левого бокового желудочка мозга и трансплантат медленно вводили в мозг реципиента. Затем аккуратно вынимали наконечник и с помощью хирургического шелка послойно сшивали мягкие ткани. Животных содержали в стандартных условиях, иммунодепресантов не применяли.

Трансплантацию ткани плодной поджелудочной железы в боковые желудочки мозга крыс проводили совместно с д.б.н. А.Г. Брагиным (Брагин, Куликов с соавт., 1983).

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ

КАМЕРУ ГЛАЗА КРЫС

Для трансплантации отбирали животных, у которых в течение 2-х и более недель гликемия была не менее 19,5 ммоль/л, а глюкозурия, как правило, превышала 2%. В большинстве случаев гликемия составляла 21-25 ммоль/л. Пересадку ткани проводили в стерильных условиях. Стерильность достигали за счет облучения специально оборудованной операционной комнаты ртутно-кварцевой лампой, а также обработкой операционного поля и инструментов этиловым спиртом непосредственно перед операцией.

В работе использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью, для чего предварительно за 17-18 дней попарно ссаживали самок и самцов на 6 часов. В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорожденных крысят.

В период подготовки к операции под нембуталовым наркозом проводили вскрытие самок-доноров по белой линии живота, извлекали зародыш, промывали в дистиллированной воде и спирте, переносили в стерильный раствор Игла. Поджелудочную железу выделяли у эмбрионов под стереомикроскопом МБС-9 . С хвостового конца железы отрезали 1-2 кусочка объемом 0,8-1 мм3, которые переносили в чашку Петри со стерильной средой Игла. Каждый последующий зародыш извлекали у донора только после того, как был отпрепарирован предыдущий, с тем, чтобы он как можно дольше находился в условиях оптимального температурного режима и естественного питания. Крысам-реципиентам с острым экспериментальным диабетом на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина и 0,5%-раствора дикаина. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза туберкулиновым шприцом, фиксированным на препаратоводителе. На наконечник шприца надевали тефлоновую трубочку длиной 20 см, заполненную средой Игла. Трубочка заканчивалась стеклянным наконечником (внутренний диаметр 0,8 мм), куда и попадали трансплантаты.

Разрез длиной 1,5-2 мм производили простерилизованным глазным скальпелем, либо, что оказалась более удобным, осколком бритвы, закрепленным в держателе. Трансплантаты общим объемом 34 мм3 с помощью описанного приспособления в течение 20-25 сек. выдавливали и помещали на радужную оболочку глаза как можно дальше от разреза. Позднее в качестве инструмента для трансплантации стали использовать модернизированную микропипетку с изменяющимся объемом от 5 до 25 мкл.

Иммунодепресанты ни до операции, ни после не использовали. После операции животных содержали на стандартной диете (Брагин, Куликов, 1983; Kulikov et al., 1986).

ПОДГОТОВКА ТКАНИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ Трансплантат приготавливался из ткани поджелудочной железы новорожденных крысят.

После вскрытия брюшной полости поджелудочная железа удалялась и помещалась в раствор Хэнкса, где производилось ее механическое измельчение до микрофрагментов 1-3 мм в диаметре при помощи микрохирургического пинцета и ножниц. Для одной пересадки использовалось 25-30 мкл микрофрагментов измельченной поджелудочной железы, взятой от 3-4 доноров. Для введения микрофрагментов под белочную оболочку семенника использовался дозатор «MICROMAN»

Рис.1. 1- микрофрагменты ткани неонатальной поджелудочной железы в питательной среде, 2- канюля дозатора «MICROMAN», 3- микрофрагменты в канюле.

АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПАРАВАЗАЛЬНУЮ КЛЕТЧАТОЧНУЮ ЩЕЛЬ СЕМЕННИКА

Для трансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник применялся метод, разработанный совместно с профессором И.Д. Кирпатовским, асп. Ю.И. Кистнер (кафедра оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН).

Операция проводилась под общей анестезией парами эфира. По средней линии живота выполнялся разрез длиной 2 см. Левый семенник выводился в рану. В бессосудистой зоне семенника производился прокол белочной оболочки и формируется карман.

Рис 2. Выведение семенника в операционную рану.

Рис.3. Формирование кармана под белочной оболочкой с помощью микродилататора.

Строго под белочной оболочкой, поверх семенных канальцев, поочередно вводились микродилататоры различного диаметра, по ходу паравазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника, не проникая в паренхиму органа. В результате формируется искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев.

Затем в созданный карман паравазальной клетчаточной щели вводились микрофрагменты ткани неонатальной поджелудочной железы объемом 25-30 мкл с помощью дозатора «MICROMAN».

После пересадки прокол белочной оболочки ушивался атравматичной иглой с нитью 6/0. Семенник обрабатывался антисептическим раствором мирамистина и помещался в мошонку. Операционная рана ушивалась через все слои узловыми швами нитью 2-3/0.

Рис. 4. Введение трансплантата микрофрагментов ткани ян

Рис.5. Ушивание белочной оболочки семенника после введения трансплантата

Рис.6. Семенник после аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы. 1- трансплантат под белочной оболочкой; 2- узловой шов в месте прокола белочной оболочки; 3-придаток семенника.

ОДНОСТОРОННЕЕ ПЕРЕСЕЧЕНИЕ СЕМЯВЫНОСЯЩЕГО ПРОТОКА

ИНТАКТНОГО СЕМЕННИКА

После аллотрансплантации ткани неонатальной поджелудочной железы в контрлатеральный семенник, с целью проведения в дальнейшем биологического теста для определения фертильности животных у нелинейных крыс-самцов без диабета осуществлялось односторонняя перевязка и пересечение семенного протока интактного (правого) семенника.

Рис,7. Перевязка семявыносящего протока интактного семенника. 1-семенник; 2- семенной канатик; 3- придаток семенника; 4- сальник семенника; 5- rectum.

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТКАНИ

Ткань фиксировался в растворе Боуэна в течение суток. Затем осуществлялась проводка по спиртам возрастающей концентрации с последующей заливкой ткани семенников в парафиновые блоки. Серийные парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм окрашивались гематоксилином и эозином (Меркулов, 1969).

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТКАНИ Для выявления инсулинпродуцирующих островковых клеток в пересаженном трансплантате использовали «сэндвич»-метод (Straus, 1982; Угрюмов, 1991). В этих целях депарафинированные срезы толщиной 6-7 мкм с помощью обычной нисходящей гистологической проводки доводили до забуференного физраствора. После блокирования эндогенной пероксидазы в течение 15 минут смесью абсолютного метанола с перекисью водорода на срезы в разведении 1:100 наслаивали моноклональные антитела против инсулина свиньи, перекрестно реагирующие с инсулином крысы. После этого срезы инкубировали во влажной камере при температуре 4°С в течение 16 часов. Затем трижды отмывали забуференным физраствором и наслаивали аффинные кроличьи антитела против иммуноглобулина мыши (1:20), меченые пероксидазой хрена (приготовлены в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии Института морфологии человека РАМН). После 1-часовой инкубации при комнатной температуре под контролем глаза проводили проявление пероксидазы с помощью диаминобензидина, разведенного в 0,1%-перекиси водорода. Срезы заключались в канадский бальзам и изучались под световым микроскопом.

В результате получалась высокоселективная окраска в коричневый цвет клеток, содержащих секреторные гранулы с инсулином (Р-клетки). Остальные клетки, входящие в состав ткани, не окрашивались и выглядели бесцветными. В некоторых случаях использовалась дополнительная подкраска гематоксилином для выявления ядер других клеток. Гистологические исследования проводили совместно с сотрудниками института морфологии человека РАМН.

Рис.8.Ткань поджелудочной железы однодневных крысят при иммуногистохимическом исследовании. 1-островковые клетки, содержащие секреторные гранулы инсулина (окрашены в коричневый цвет). 2-клетки ткани поджелудочной железы (неокрашенные). Обработка моноклональными антителами против инсулина «сэндвич»-методом. Об.40 , ок.10.

Тест на фертильность

Для изучения фертильности нелинейных самцов-крыс после аллотрансплантации микрофрагментов ткани поджелудочной железы в левый семенник и пересечения семявыносящего протока правого семенника проводился биологический тест. Учитывая, что самки крыс нередко не допускают спаривания с больными, неполноценными самцами, что часто приводит к каннибализму, тест на фертильность проводился в группе животных без экспериментального сахарного диабета. Само по себе введение химического вещества аллоксана и период гипергликемии, проведение в данной серии двух операций даже при условии последующей компенсации диабета снижает шансы животного в выборе его самкой для спаривания. Было важно оценить влияние самой пересадки микрофрагментов неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника на фертильность крыс. Один самец подсаживался к 5 половозрелым самкам на 21, 42, 63 дни после трансплантации. На каждый срок по 5 самцов (всего 15). Оценивалось количество покрытых самок. (Западнюк с соавт., 1974).

Статистика

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Архипова, Любовь Валентиновна

VI. выводы

2.Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в мозг и переднюю камеру глаза крыс позволяет получить долговременную полную или частичную компенсацию экспериментального сахарного диабета у животных, что выражается в нормализации основных физиологических и биохимических показателей: потребления воды, массы животных, содержания глюкозы, инсулина, сывороточной ДНК в крови, синтеза РЕПС, белка и содержания медиаторов в неокортексе и в стволовом отделах мозга.

3.Показано, что аллотрансплантаты способны к длительному выживанию и продукции инсулина в ПКГ оперированных животных.

4.Аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника дает возможность полностью либо частично нормализовать у животных с ЭСД состояние углеводного обмена и другие исследованные нами физиологические показатели в течение всего срока наблюдения.

5.Гистологические исследования показали выживаемость трансплантатов и продукцию ими инсулина на всех сроках исследования 3, 6, 9 недель после пересадки.

6.Показано, что аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенников крыс не оказывает значимого отрицательного влияния на фертильность.

7.Использование свойства относительной иммунопривилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника позволяет при трансплантации не применять иммунодепрессию.

8.Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза способствует частичному восстановлению инсулинпродуцирующей способности собственной железы.

Автор выражает сердечную благодарность учителям, коллегам из ИТЭБ РАН и других институтов, с которыми проводились совместные исследования, друзьям за всестороннюю помощь в выполнении, написании и обсуждении работы.

VII. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ГОБ - гематоофтальмический барьер

ИЗСД - инеулинзависимый сахарный диабет

ИРИ - иммунореактивный инсулина

ПКГ - передняя камера глаза

ЭПЖ - эмбриональная поджелудочная железа

ЭСД - экспериментальный сахарный диабет

АГКГ- антиген главный комплекс гистосовместимости

НА -норадреналин

5- ОТ -серотонин

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные исследования были направлены на исследование и оценку различных трансплантологических способов компенсации экспериментальных патологических состояний животных и изучение физиологических, биохимических и иммунологических особенностей их протекания в период инициации патологии, течения и долговременной компенсации.

В процессе экспериментальных исследований в качестве реципиентов использовали крыс и кроликов, а в качестве доноров фетального, эмбрионального и неонатального материала - крыс, сусликов. Было исследовано несколько новых трансплантологических моделей компенсации, которые можно разделить на группы по месту трансплантации - передняя камера глаза, мозг и семенник и по экспериментальным патологиям, на компенсацию которых направлены эти модели - экспериментальный сахарный диабет, возрастная и стрессорная инволюция тимуса.

Наличие в организме млекопитающих относительно иммунопривилегированных областей, к которым относят переднюю камеру глаза, мозг и семенник, позволяет значительно ослабить иммунологический конфликт между тканями донора и реципиента на длительное время. Это дает возможность проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее.

Особое строение гисто-гематических барьеров передней камеры глаза и мозга, в норме не пропускающего иммунокомпетентные клетки, позволяет пересаживать туда ткани без опасения за их быстрое отторжение. Интерес к трансплантации ткани в переднюю камеру глаза и мозг связан еще и с тем, что в этих структурах нет лимфатического протока, в результате чего отсутствует афферентное звено иммунной реакции. Активированные иммунные клетки, которые все же могут проникнуть в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-L, экспрессированного в этих участках. Например, функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L-система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003;Choi et al., 2004).

Проведенные эксперименты показывают возможность долговременной полной или частичной трансплантологической компенсации физиологических, иммунологических и биохимических показателей данных экспериментальных патологий у животных.

Трансплантация иммунокомпетентных тканей

Вилочковая железа является центральным органом иммунной системы. Кроме того, тимус - это и эндокринный орган, в котором синтезируется ряд биологически активных веществ пептидной природы.

С началом полового созревания в организме млекопитающих происходит инволюция тимуса, что является главным возрастным изменением иммунной системы. В результате этого процесса в тимусе наблюдается истощение лимфоидного пула клеток в зонах коры и кистозные изменения эпителиальных клеток. Кроме того, с возрастом снижается выход дифференцированных Т-клеток (Globerson A.R et al., 1990). Одновременно с этим в тимусе прогрессивно снижаются синтез и секреция полипептидных гормонов, таких как тимозин, тимопоэтин и тимулин.

Общепринято считать, что снижение эндокринной активности тимуса играет ключевую роль в возрастных дисфункциях иммунной системы. В последние годы было установлено, что введение пептидных гормонов тимуса может частично восстанавливать различные иммунные функции в старости (Zatz, Goldstein, 1985), при этом возрастает компетентность иммунных клеток и увеличивается продолжительность жизни животных (Лабунец и др., 1997; Морозов, Хавинсон, 1997; Anisimov et al., 1982; Anisimov et al., 1998).

Введение тимусных гормонов старым мышам способствует повышению Т-клеточного звена лимфоидной системы, а подсадка тимуса в диффузной камере, не пропускающей клетки, неонатально тимэктомированным мышам обеспечивает устранение проявлений иммунодифицита. Поэтому, становится понятно, как велика роль гуморальных факторов тимусного происхождения при нормальном функционировании вилочковой железы (Ярилин, Беляков, 1996; Goya, 1991).

Известно, что половые железы находятся в антагонистических взаимоотношениях с тимусом. Именно в период полового созревания начинается резкая возрастная инволюция тимуса. А гонадэктомия приводит к повышению у старых животных массы и клеточности тимуса (Ярилин, Беляков, 1996), т.е. отсутствие антагонизма между тимусными и половыми гормонами дает возможность вилочковой железе прогрессивно развиваться. Поэтому, мы в своих исследованиях брали для аллотрансплантации тимус неполовозрелых животных, еще не подвергшийся угнетающему действию половых гормонов. Пролиферативный потенциал и способность к гормональной продукции таких трансплантатов выше, чем у трансплантатов от взрослых животных. Если учесть, что пересадку ткани проводили в относительно иммунопривилегированную переднюю камеру глаза, где она могла функционировать длительное время, становится понятно, почему относительно небольшой кусочек иммунокомпетентной ткани (это относится как к тимусу, так и к костному мозгу) мог дать ускоренное восстановление иммунологического статуса после облучения в дозе 4 Гр и приостановить инволюции тимуса у животных разных возрастных групп. У сусликов (зимнеспящие) тимус в отличие от основной массы млекопитающих проходит ежегодную осеннюю инволюцию и весеннее восстановление. Очевидно, что пролиферативный потенциал в данном случае имеет очень большой запас, поэтому даже при ксенотрансплантации тимуса сусликов в переднюю камеру глаза крыс мы получили результаты лучшие, чем при аллотрансплантации.

Трансплантация инсулинпродуцирующей ткани

При токсическом воздействие на поджелудочную железу аллоксана, стрептозотоцина и некоторых других агентов происходит массовая гибель инсулинпродуцирующих клеток и развивается сахарный диабет. В последние годы многими учеными было установлено, что при недостатке инсулина из протокового эпителия образуются новые [3-клетки (Бородатая и др., 2001; Righardt 1984; Kasper et al., 1991; Bouwens, 1998a,b). Но этот процесс может идти более или менее успешно, когда еще есть остаточная секреция инсулина, предохраняющая организм от диабетической комы. Такие условия создаются у крыс при уровне глюкозы в крови в пределах 1015 ммоль/л, когда животные могут жить достаточно долго, причем иногда у них может происходить нормализация содержания глюкозы в организме. При уровне глюкозы в крови более 20 ммоль/л (именно такой был у наших экспериментальных животных) все крысы погибают, в среднем, на сроках до 1 месяца. После трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривиллегированные зоны (мозг, передняя камера глаза, тестикулы) либо внутрибрюшинно, интрапортально, внутримышечно и.т.д, происходит снижение количества глюкозы в организме у животных и с высокой гипергликемией, и с относительно низкой. Такая физиологическая ситуация позволяет наращивать из резерва протокового эпителия Р-клетки в собственной поджелудочной железе.

Далее на сроках, как правило, до 2 недель происходит отторжение трансплантатов в неиммуннопривилегированных зонах. Но вновь образованные Р-клетки способны приводить к полной, либо частичной компенсации диабета на достаточно длительный срок от нескольких недель до нескольких месяцев. Чем иммунологически ближе донор и реципиент, тем дольше функционирует трансплантат, давая дополнительную возможность восстанавливаться собственной поджелудочной железе.

Эта закономерность справедлива при внутрибрюшинной, интрапортальной, внутримышечной и других видах трансплантации, не связанных с иммунопривиллегированными областями организма.

В наших работах трансплантацию поджелудочной железы с целью компенсации экспериментального сахарного диабета проводили в переднюю камеру глаза, боковые желудочки мозга и семенник.

Сроки наблюдения за животными в различных сериях экспериментов составляли в среднем более 4-х месяцев: при трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в область тестикул несколько меньше (2,25 мес.), при интраокулярной пересадке - до 16 месяцев. Регулярно проводимые физиологические и биохимические эксперименты показали, что трансплантаты способны не только длительно функционировать, но и увеличивать синтез инсулина. Таким образом, длительная компенсация экспериментального диабета при трансплантации эмбриональной или неонотальной поджелудочной железы в относительно иммунопривиллегированные участки организма осуществляется в значительной степени за счет пролонгированной выработки инсулина трансплантатом.

Очевидно, что при столь длительном функционировании трансплантата открываются значительно большие возможности восстановления пула собственных Р-клеток поджелудочной железы.

При этом происходит регенерация инсулинпродуцирующих клеток собственной поджелудочной железы, что и было показано в наших экспериментах.

Таким образом, использование относительно иммунопривилегированных участков организма для разработки новых методов трансплантологической компенсации экспериментальных патологических состояний (ЭСД), возрастной инволюции тимуса, исследование особенностей их протекания, а также возможность нейтрализации воздействия радиационного облучения, имеют существенное значение для экспериментальной физиологии. Результаты, полученные в работе, могут помочь интерпретировать результаты в клинических исследованиях, искать новые подходы для долговременной компенсации патологий-в практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Архипова, Любовь Валентиновна, Москва

1. Абелев Г.И. Основы иммунитета // Соросовский Образовательный Журнал. - 1996. - № 5. - С. 4-10.

2. Абрамов А.В. Arg8. -вазопрессин стимулирует синтез инсулина в бета-клетках поджелудочной железы при хроническом интрацеребровентикулярном введении интактным и диабетическим крысам //ДАН.- 1998.-Т.358.-№3.-С. 416-418.

3. Абрамов В.В. Взаимодействие иммунной и нервной систем. -Новосибирск: Наука. 1988. - 252с.

4. Акмаев И.Г, Взаимодействия основных регулирующих систем (нервной, эндокринной и иммунной) и клиническая манифестация их нарушений // Клиническая медицина. 1997. - № 11. - С. 8-13.

5. Акмаев И.Г. Гриневич В.В. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии// Бюлл. экспер. биол. и мед. 2001. -Т. 131.-№1.-С. 22-32.

6. Акмаев И.Г.Нейроиммуноэндокринология: истоки и перспективы развития// Успехи физиологических наук 2003. - Т. 34. - №4. - С. 415-.

7. Александрова М.А., Полежаев JT.B. Трансплантация нервной ткани мозга в головной мозг крыс // Доклады АН. 1982. - Т. 263. - N 2. -С. 460-463.

8. Александрова М.А. Тканевая дифференцировка коры мозга эмбрионов при трансплантации в головной мозг млекопитающих // Функциональная нейрохирургия. 1990. - N 3. - С. 5-6.

9. Александрова М.А. Механизмы дифференцировки нервной ткани и межклеточные взаимодействия при нейротрансплантации у млекопитающих: Автореф. Дис. д-ра биол. наук. М.: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 1999. - 48с.

10. И. Аметов А.С., Кондратьева JT.B. Препараты инсулина и их применение в лечении инсулинзависимого сахарного диабета // Международная программа «Диабет». 1995. - Ярославль.

11. Арбузова М.И., Куликов А.В., Третьяк Т.М. Содержание иммунореактивного инсулина в поджелудочной железе и аллотрансплантатах в передней камере глаза приэкспериментальном диабете // Пр. эндокринологии. 1991. - Т. 37. -№ 1. - С. 42-44.

12. Архипова Л.В., Куликов А.В., Озолинь О.Н. РНК-синтезирующая способность хроматина мозговой ткани крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом // Успехи медицинских наук. — 1988. Т.5. -С.76-79.

13. Архипова Л.В., Третьяк Т.М., Озолинь О.Н. Влияние катехоламинов и серотонина на РНК-синтезирующую способность изолированных ядер и хроматина мозга и печени крыс // Биохимия.- 1988. Т.53. - вып.7. - С.1078-1081.

14. Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов А.В. Моделирование экспериментального диабета на животных // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино. 11-14 ноября 2002г. - С. 48.

15. Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов А.В. Моделирование экспериментального диабета на животных // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино. 11-14 ноября 2002г. - С. 48.

16. Балаболкин М.И. //Эндокринология. М.: 1989. - С. 247-261.

17. Балаболкин М.И. Эндокринология. Москва.: «Универсум паблишинг». 1998. -. 582с.

18. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Диагностика и классификация сахарного диабета // Сахарный диабет. 1999. - № 3.- С.15.

19. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете // Сахарный диабет. 1999. - №1. -С. 99-108.

20. Балаболкин М.И. Диабетология. М.: « Медицина». 2000. -. 672 с.

21. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г., Ярошевский Ю.А., Никитин А.И. Экспериментальный сахарный диабет. Роль клинической диабетологии. JL: Наука. 1983. - 240 с.

22. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Ситникова A.M., Онегова Р.Ф. Развитие сахарного диабета у потомства крыс и самок с аллоксановым диабетом в 6 изученных поколениях // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1988. - Т. 105. - №1. - С. 13-15.

23. Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Овсепян М.Л., Мартиросян И.М. Коррекция аллоксанового диабета у крыс с помощью ксенотрансплантации пассированных культур бета-клеток поджелудочной железы плода человека // Пробл. эндокринол. -1987.-Т. 33.-N5.-С. 63-65.

24. Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Тананян О.А. Трансплантация бета-клеток поджелудочной железы эмбриона человека больным сахарным диабетом // Врачебное дело. 1987. - № 8. - С. 61-63.

25. Белова Т.И., Юнсон Ю.А. Гемато-энцефалический барьер при эмоциональном стрессе // Успехи физиол. наук. 1985. - N 2. - Т. 16. -С. 61-67.

26. Белоусова О.И. Радиация и система крови. М: Атомиздат. - 1979. -126с.

27. Беникова Е.А., Турчин И.С. Трансплантация культур бета-клеток в лечении инсулинозависимого сахарного диабета у детей // Пробл. эндокринол. 1991. - Т. 37. - № 4. - С. 17-19.

28. Блох К.О., Полторак В.В., Поверенный A.M. Молекулярные механизмы повреждения бета-клеток поджелудочной железы при действии диабетогенных факторов // Успехи современной биологии. 1987.-Т. 103. -№ 1.-С. 96-108.

29. Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., Кауричева Н.Н.: "Флотирующие культуры клеток поджелудочной железы плода" // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1984. - № 6 - С. 764 - 766.

30. Блюмкин В.Н., Бабикова Р.А., Кауричева Н.Н. Скалецкий Н.Н.: "Методы получения культур островковых клеток из поджелудочной железы плодов человека и некоторых млекопитающих животных" // Метод, рекоменд. М.: - 1985. - 19с.

31. Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., Кирсанова JT.A. Культуры островковых клеток поджелудочной железы и их трансплантация // Материалы 3-го Всесоюз. совещ. "Культивирование клеток животных и человека". — Пущино. 1992. - С. 16-23.

32. Бойко Н.И. Аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы хирургическим больным сахарным диабетом: Дис. д-ра мед. наук. М.: - 1991.

33. Брагин А., Виноградова О.С. Гомо и гетеровидовая трансплантация эмбриональной ткани нервной системы // Бюлл. эксп. биол. и мед. -1981. -Ко 10.-С. 486-489.

34. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Активность нейронов септума и гиппокампа трансплантированных в переднюю камеру глаза крысы // Ж. высш. нерв. деят. 1983. - Т. 33. - N 4. - С. 708-716.

35. Брагин А., Виноградова О.С. Электрическая активность нейронов септум и гиппокампа трансплантированных в мозг крысы // Нейрофизиология. 1985. - Т. 17. - №2. - С. 160-168.

36. Брагин А.Г., Куликов А.В., Третьяк Т.М., Журавлева З.Н. (СССР) А.С. 1369039. МКИ А61В10/00 Способ моделирования компенсации сахарного диабета/ 2 ст. :ил., 1986.

37. Брагин А.Г. Трансплантация нервной ткани методические, морфологические и функциональные аспекты: Автореф. дисс. доктора биологических наук. - 1990. - Москва. - С. 1-57

38. Бредбери М. Концепция гемато-энцефалического барьера. М.: Медицина. 1983. - 420с.

39. Бутенко Г.М. Иммунология старения // 1мунолопя та алерголопя. -1998.-№ 1-2. С.26-29

40. Бутенко Г.М. Старение иммунной системы // Проблемы старения и долголетия.- 1998.- Т.7. № 3. - С.100-108

41. Виноградова О.С. Развитие нервной ткани млекопитающих при трансплантации в мозг и переднюю камеру глаза: проблемы и перспективы // Онтогенез. 1984. - Т. 15. - N 3. - С. 229-251.

42. Гаврилова Н.А. Влияние гравитационного плазмафереза и ретробульбарной трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы на течение диабетической ретинопатии: Дис. канд. мед. наук. М.: - 1992.

43. Галибин О.В., Поташов Л.В., Черникова М.В., Бевзюк И.Б. Лечение больных с осложненными формами сахарного диабета в Ленинградском центре трансплантации // Тр. симпоз. "Трансплантационные методы лечения сахарного диабета". Рига. -1988.-С. 62-63.

44. Гольдстейн Г.У., Бец А.Л. Гемато-энцефалический барьер // В мире науки. 1986. - N 11. - С. 40-49.

45. Гуревич Л.Е., Казанцева И.А., Бородатая Е.В. Роль стволовых и полипотентных клеток в дифференцировке и неопластической трансформации клеток поджелудочной железы // Известия АН. Серия биологическая. 2001. - № 6. - С. 753-759.

46. Дедов И.И. Поздние осложнения сахарного диабета. Актуальные проблемы эндокринологии // Тезисы докладов III Всероссийского съезда эндокринологов 4-7 июня 1996 г. М.: 1996. - С. 5-6.

47. Дедов И.И. Синдром диабетической стопы. М.: 1998. - 143.с.

48. Дедов И.И. Сахарный диабет в Российской Федерации: проблемы и пути решения // Сахарный диабет. 1998. - № 1. - С. 7-21.

49. Дильман В. М. Четыре модели медицины. М.: Медицина. - 1987. -288с.

50. Донцов В.И., В.Н. Крутько, Подколзин А.А. Фундоментальные механизмы геропрофилактики. М.: Биоинформсервис. - 2002. -464 с.

51. Дорошенко Е.О., Мартынова М.И., Арион В .Я., Смирнов В.В. Применение тактивина при сахарном диабете у детей. //Медицинский научный и учебно-методический журнал. 2001. -№ 3.-С.98-120

52. Евсеев Ю.И. Сравнительная оценка интрамускулярной и интрапортальной трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы у больных с сахарным диабетом 1 типа //Автореф. дис. к.м.н. Москва. - 1993.

53. Ермакова И.В., Кузнецова Г.Д., Лосева Е.В., Сидоренко А.Е., Иоффе М.Е. Использование нейротрансплатации для подавления судорожной активности у крыс с генетической эпилепсией // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2000. - № 9. - С. 279-283.

54. Ермакова И.В. Компенсаторно-востановительные процессы при внутримозговой трансплантации незрелой нервной ткани // Автореф. дис.докт. биол. наук. М.: 2001. - 44с.

55. Ефимов А.С., Ткач С.Н. Электрофизиологическая характеристика диабетической полинейропатии // Сов. мед. 1988. - № 8. - С. 3-5.

56. Жарков В.П., Ярыгин В.Н., Гольцман Л.Л. Имплантация эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза здоровым и диабетическим крысам // Бюллетень экспер. биол. и мед. 1988. - Т. 105. - № 2. - С. 216-218.

57. Жарков В.П., Ярыгин В.Н., Гольцман Л.Л. Развитие функционирование эмбриональных клеток панкриотическихостровков в передней камере глаза крыс // Бюллетень экспер. биол. и мед. 1989. - Т. 107. - № 3. - С. 342-345.

58. Жоленько А.Б. Глазные болезни. М.: Медицина. - 1969. - 184с.

59. Жуковский М.А. Сахарный диабет у детей. Куйбышев. - 1989. -160с.

60. Зак К.П., Малиновская Т.Н., Большова-Зубковская Е.В. Состояние иммунной системы у детей, больных сахарным диабетом 1 типа (обзор литературы и собственные исследования) // Эндокринология .-2001.-№2.-С. 191-203.

61. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. Киев. - 1974. - 212с.

62. Иммунофизиология. Под. ред. Корневой Е.А. СПб: Наука. - 1993. -684с.

63. Исаев Э.И., Эргашева М.Ж., Салихаджаева Д.С., Туракулов Я.Х. Содержание сиаловых кислот индивидуальных гликолипидов тканей в норме и при аллоксановом диабете у крыс // Пробл. эндокринол. 1983. - Т. 2. - № 1. - С. 67-71.

64. Каитова 3. С. Варианты клинической пересадки гипофизарных клеток в мужскую половую железу // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». 2003. С. 64.

65. Каримова М.Х., Бондаренко М.Ф. Функциональное состояние мозгового слоя надпочечников у крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом // Пробл. эндокринол. 1986. - Т. 32.- № 5. -С. 61-63.

66. Касаткина Э.П.: " Сахарный диабет у детей и подростков" // Москва: Медицина. - 1996. - С. 7 - 49.

67. Кассиль Г.Н. Гемато-энцефалический барьер. Анатомия, физиология, методы исследования. Клиника. М.: - Из-во АМН СССР. - 1963.-408с.

68. Кассиль Г.Н. Внутренняя среда организма. М.: - Наука. - 1983. -224с.

69. Кирпатовский И.Д., Дендеберов Е.С. Аллотрансплантация культуральных неонатальных андрогенпродуцирующих клеток Лейдига // Вестник Российской Академии медицинских наук. -1994.-№4.-С. 42-46.

70. Кирпатовский И.Д., Каитова З.С., Лысенко А.И. Пересадка клеток эндокринных органов при мужском бесплодии // Актуальные вопросы андрологии. Мат. конф. - М.: - 1999. - С. 25-27.

71. Кирпатовский И.Д. Нейроэндокринная трансплантация в андрологии // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». М.: - 2003. - С. 76.

72. Коган Б.М., Нечаев Н.В. Чувствительный и быстрый метод одновременного определения дофамина, норадреналина, серотонина и 5-оксииндолуксусной кислоты в одной пробе // Лаб. дело. 1979,-N5.-С. 301-303.

73. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Комиссаренко Н.В. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочнойжелез плодов человека и животных как метод лечения сахарного диабета // Врач. дело. 1983. - № 4. - С. 52-57.

74. Комисаренко И.В., Рыбаков С.И., Лысенко П. Г. Трансплантация культуры клеток эндокринных желез — новое направление в клинической эндокринологии // Эндокринология. Респ. Межвед. Сборник. - «Здоровье». - 1991. - № 21. - С. 71-78.

75. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Гордиенко В.М., Кравченко В.И., Матвиенко Г.Ф. Особенности течения аллоксанового диабета у крыс при различных способах изотрансплантации островков Лангерганса // Проблемы эндокринол. 1980. - № 1. - С. 59-64.

76. Корыстов Ю.Н. Эмоции, стресс, потребление алкоголя, курение и рак — корреляционные и причинные связи // Журн. ВНД. 1997. - Т. 47. - С. 627-657.

77. Корыстов Ю.Н., Куликов А.В., Архипова Л.В, Смирнова Г.Н., В.В. Шапошникова, М.Х Левитман, Л.М. Чайлахян. Социальный стресс в группах мышей: методы регистрации конфликта и его последствий //ДАН. 2003. - Т. 390. - № 6. - С. 847-849.

78. Кудинов Ю.Г. Взаемовщношення селезшки з шшими перифершними лимфоУдними органами та тимусом при старшш. Автореф. дис. канд. мед. наук. KieB. 1994. - 23 с.

79. Кудинов Ю.Г., Хромяк В.Н. Изменение численности периферических CD4+ лимфоцитов у молодых и старых мышей СВА после однократного введения кортизола и гидроксимочевины // Экспериментальная онкология. Киев. - 1997. - № 1. - С. 12-14

80. Куликов А.В., Корыстов Ю.Н., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В., Куликова Л.И., Третьяк Т.М. Компенсация возрастной и стрессорной инволюции тимуса // Доклады РАСН -2001.-№3.-С. 41-43.

81. Кухарчук В.В. Антиоксидант пробукол предотвращает развитие аллоксанового диабета и снижение активности антиоксидантных ферментов в тканях крыс // Бюл. Экспер. Биол. и медиц. 1992. - № 9. - С. 279-282.

82. Лабунец И.Ф., Терешина О.П., Максюк Т.В. . Новые подходы к применению тималина и эпиталамина в стареющем организме // Фармакологический вестник. 1997. - № 1. - С.45-47

83. Лапин В.И., Корчин В.И., Мейрамов Г.Г., Пальмина Т.В., СатосинВ.Г. Влияние аллоксана на содержание инсулина и цинка в панкреатических островках у экспериментальных животных // Патол. экспер. физиол. терап. 1973. - № 4. - С. 36-40.

84. Лебкова Н.П., Бондаренко М.Ф., Колесова О.Е., Азарян Г.П. Ультраструктурное проявление ранних метаболических нарушений в миокарде собак при аллоксановом диабете // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1980. - Т. 89. - № 5. - С. 614-617.

85. Лолор Г., Фишер Т, Адельма D. Клиническая иммунология и аллергология. Пер. с англ. М.: Практика. - 2000. - 806 с.

86. Лосева Е.В., Ермакова И.В., Тарасова Л.Ю. Действие нейротрансплантации, на мозг крыс с поврежденной височной корой // Нейрофизиология. 1990. - Т. 22. - № 5. - С. 586-595.

87. Мазовецкий А.Г., В.К. Беликов. // В кн. " Сахарный диабет". М.: "Медицина". - 1987.-288 с.

88. Малайцев В.В., Молнар Е.М., Скалецкий Н.Н. Трансплантация фетальной ткани человека — перспективный метод лечения сахарного диабета (обзор) // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. -№4. - С. 350-355.

89. Малик А. Изучение некоторых клинико-лабораторных показателей у больных инсулинозависимым сахарным диабетом послексенотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы: Дис. канд. мед. наук. Киев. - 1990.

90. Меньшиков В.В. Определение глюкозы в биологических жидкостях по цветной реакции с орто-толуидином // Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования. М.: - 1973. - С. 59-60.

91. Меркулов Г. А. Окраска альдегид фуксином // Курс патологогистологической техники. Ленинград. - 1969. - С. 270-275.

92. Мецлер Д. // Биохимия. М.: - 1980. - Т. 3. - 458 с.

93. Миронов С.Ф. Синхронная активность нейронов гиппокампальных // Симпозиум "Трансплантация ткани мозга млекопитающих": Тез. докл. Пущино. - 1988. - С. 48-49.

94. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) // СПб: Наука. 1996.-74 с.

95. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы в профилактике и лечении возрастной патологии // Успехи геронтологии. 1997. - Т. 1. - С. 74-79.

96. Мусаев П.И. Полупроницаемые барьеры глаза. Баку. - Азерб. Гос. изд. - 1986.-169 с.

97. Нестеров А.П. Диабетические поражения органов зрения // Пробл. эндокринологии. 1997. - Т. 43. - № 3. - С. 16-19.

98. Николаева М.Я., Пархимович P.M., Зарайский А.В. Цитотоксичность аллоксана: новый аспект проблемы // Проблемы эндокринологии. 1986. - Т. 32. - N 3. - С. 75-79.

99. Отеллин В.А., Рыбаков В.Л., Байковская М.Н. Ультраструктурная организация участков соприкосновения ликвора и крови с тканью мозга. Гисто-гематические барьеры и нейрогуморальная регуляция. - М.: - Наука. - 1981. - С. 192-200.

100. Отеллин В.А., Гилерович Е.Г., Гусихина В.И. Пересадки эмбриональных закладок неокортекса человека в мозг крыс // Архив АГЭ. 1985. - Т. 89. - № 8. - С. 18 - 22.

101. Павловский М.П., Бойко Н.И. Отдаленные результаты аллотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы // Вести хирургии им. И.И. Грекова. 1990. - №12. - С. 2629.

102. Пальчикова Н.А., Селятицкая Ю.П., Шорин Ю.П. Количественная оценка чувствительности экспериментальных животных к диабетогенному действию аллоксана // Проблемы эндокринологии. 1987.-Т. 33.-№4.-С. 65-78.

103. Пахомова Н. В. Сочетанные пересадки ядер переднего гипоталамуса в комплексе с нейрогипофизом у больных с несахарным диабетом // Материалы форума «мужское здоровье и долголетие». 2003. - С. 92.

104. Першин Б.Б. Стресс, вторичные иммунодефицита и заболеваемость. М.: - Наука. - 1994. - 263 с.

105. Першин Б.Б., Кончугова Т.В. Стресс и иммунитет. Москва. -1996.- 155с.

106. Петеркова В.А., Щербачева JI.H., Кураева T.J1. Диагностика, лечение и профилактика диабетических осложнений у детей и подростков. Москва. - 1997. - С. 5-10.

107. Петрович Ю.А., Боровик Г.А. Ферменты углеводного обмена в глазу при нарушении его иннервации // ДАН СССР. 1973. - Т. 212. -С. 1465-1468.

108. Петрович Ю.А. Гемато-офтальмический барьер. Физиология гисто-гематических барьеров под. ред. Я.А. Росина. М.: Наука. -1977. - С. 313-329.

109. Пири А., Р. ван Гентинген. Биохимия глаза. М.: Медицина. -1968.-400 с.

110. Полежаев Л.В., Александрова М.А. Трансплантация ткани мозга в норме и патологии. М.: Наука. - 1986. - 152с.

111. Поташов Л.В., Благосклонная Я.В., Галибин О.В. Трансплантация островковой ткани поджелудочной железы в лечении осложненных форм сахарного диабета // Тр. 4-го съезда эндокринологов УССР, Львов, Киев. 29 сент. - 1 окт. 1987. - С. 308.

112. Поташов Л. В., Галибин О.В., Прокопчук С.Н. Трансплантация поджелудочной железы // Вестник хирургии. 2000. - Т. 159. - №2. -С. 123-126.

113. Прихожан В.М. Поражение нервной системы при диабете. М.: Медицина. - 1981.- 183 с.

114. Пучковская Н.А. Основы офтальмо-эндокринологии. М.: Медицина. - 1977. - 27 с.

115. Пучковская Н.А., Шульгина Н.С., Минев М.Г., Игнатов Р.Г. Иммунология глазной патологии. М.: Медицина. - 1983. - 223 с.

116. Розенфельд И.А. Приборы и инструменты в офтальмологии. Флюориметрия в офтальмологии. Обзор литературы // Мед. реферат, журн. Офтальмология. 1987. - № 8. - С. 25-30.

117. Резенфельд И.А. Разработка метода исследования барьера кровь/сетчатка и возможности его научно-клинического применения: Дис.канд. мед. наук. М.: - 1989. - 176 с.

118. Розенталь Р. Л., Закриевский Р. Л., Ильинский И.М. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом // Веста, хирургии. 1988. -№ 5. - С. 83-86.

119. Росин Я.А. Учение Л.С. Штерн о гисто-гематических барьерах. Гисто-гематическйе барьеры и нейрогуморальная регуляция. М.: Наука. - 1981.-С. 22-33.

120. Сагидова Р.З. Сравнительная характеристика некоторых метаболических сдвигов при аллоксановом диабете // Механизмы патологических процессов. Ташкент. - 1979. - С. 80-85.

121. Сепиашвили Ф.И. «Основы физиологии иммуной системы» М., Медицина-Здоровье. 2003.- с.239.

122. Сидоренко Д.С. Включение С-глицина и Н-метионина в общие и цитоплазматические белки скелетных мышц при дефиците инсулина и избытке глюкокортикоидных гормонов // Пробл. эндокринол. 1981. - Т. 27. - № 5. - С. 59-61.

123. Скалецкий Н. Н. Внутримышечная ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы. Проблемы трансплантологии и искусственных органов. - М.: - 1983. - С. 79-81.

124. Скалецкий Н. Н. Влияние культивирования островковых клеток поджелудочной железы на их выживание в организме ксеногенного реципиента //тез. Докл. Конф. "Трансплантация органов». Киев. -1985.-С. 219-222.

125. Скалецкий Н. Н. Ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека крысам с экспериментальным сахарным диабетом: Афтореф. дис. канд. мед. наук. М.: - 1987.

126. Скалецкий Н.Н., Шальнев Б.И. Ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы в эксперименте //

127. Трансплантологические методы лечения сахарного диабета: Тез. докл. Рига. - 1988. - С. 39-40.

128. Скалецкий Н. Н., Кирсанова JI. А., Засорина О. В. Получение культур островковых клеток из поджелудочной железы кролика для трансплантации // Тез. Док. «Трансплантация органов». Львов. -1990.- С. 124- 125.

129. Скалецкий Н. Н, Кирсанова Л. А., Блюмкин В. Н. Получение культур островковых клеток из поджелудочной железы и их трансплантация. Проблемы трансплантологии и искусственных органов. - М.: - 1994. - С. 73 - 80.

130. Скалецкий Н.Н., Фатеева Н.Л., Сухих Г.Т., Молнар Е.М. Трансплантация культур островковых клеток фетальной поджелудочной железы в лечении инсулинозависимого са-харного диабета (обзор) // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. - № 4. - С. 356-362.

131. Скалецкий Н. Н., Онищенко Н. А. Клеточная трансплантация: достижения и перспективы // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. - № 3-4. - С. 94-102.

132. Словеснова Т. А. Роль аллотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека в комплексной терапии больных сахарным диабетом: Дис. канд. мед. наук. М.: -1989.

133. Слюсарев А.А. Клинико-иммунологические аспекты трансплантации культур фетальных эндокринных тканей // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. - № 3. - С. 9697.

134. Смирнов B.C., Фрейдлин И.С. Иммунодефицитные состояния //СПб: "Фолиант". - 2002. - 568 с.

135. Тырышкина A.M., Сальник Б.Ю., Долгих Е.В. Окислительное фосфорелирование, активность НАД-Н-оксидазной и сукцинатдегидрогеназной систем в митохондриях тестикул крыс при аллоксановом диабете // Вопр. мед. хим. 1986. - Т. 32. - №3. -С. 82-85.

136. Угрюмов М. В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимиии. Мое. итоги науки и техники. Серия морфология человека и животных. - 1991. -Т. 15. - 121с.

137. Фрадкин М.Я., Гамзаева Е.М., Зверева В.А. Гемато-офтальмический барьер и влияние на него вегетативной нервной системы и эндокринного аппарата // Арх. офтальмол. 1927. - Т. 3. -С. 441-446.

138. Фрейдлин И.С. Загадки тимуса. Возраст и иммунитет. Соросовский образовательный журнала // 1997. № 5. - С. 26-29

139. Фромен Л. А., Фелинг Ф., Бродус А.Е. Эндокринология и метаболизм: Пер. с англ. М.: - Медицина. - 1985. - Т. 2. - 416с.

140. Царенко В.И., Попова Л.П., Дроздович И.Н. Пролангирование жизнедеятельности аллогенных бета-клеток с помощью антирецепторной сыворотки у крыс с аллоксановым диабетом // Пробл. эндокринол. 1987. - Т. 33. - № 4. - С. 60-61.

141. Червова И.А. Морфология гисто-гематических барьеров. В кн. "Физиология гистологических барьеров". Под ред. Я.А. Росина. -М.: Наука. - 1977.-С. 77-114.

142. Чеснокова В.М., Иванова М.Н., Грунтенко Е.В. Эндокринная функция тимуса // Успехи соврем, биол. 1984. - Т. 97. - вып. 3. - С. 435-436

143. Чороян О.Г. Нервная регуляция физиологических функций. В кн. "Физиология человека". Под редакцией В.М.Покровского, Г.Ф.Коротько. - М.: - 2003. - С. 97-111.

144. Швомбергер И.Н., Крыленко В.А., Степанян Л.И., Сангакова Е.В., Бахтин Ю.Б. Перспективы использования передней камеры глаза для изучения пролиферации, дифференциации и гибридизации опухолевых клеток // Цитология. 1977. - Т. 29. - № 6. - С. 665670.

145. Шевчук Н. А. Времяразрешённый иммунофлюоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека // Вопросы мед. химии. 2002. - Т. 47. - Вып. 4. - С. 37-42

146. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Шальнев Б. И. Скалецкий Н.Н. Культуры островковых клеток поджелудочной железы плодов человека и трансплантация их больным сахарным диабетом // Пробл. эндокринол. 1981. - № 1. - С. 25 - 30.

147. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Игнатенко С.Н. Скалецкий Н.Н. Результаты трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом // Пробл. Эндокринол. 1985. - № 5. - С. 67-70.

148. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы (очерки). М.: - 1995. -381 с.

149. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых и других эндокринных клеток // Трансплантология. Руководство. Под ред. В.И. Шумакова. М.: - Медицина; Тула: Репроникс Лтд, 1995. -С. 317-331.

150. Шумаков В.И., Тоневицкий А.Г. Современный взгляд на проблему ксенотрансплантации // Вестн. трансплантологии и искусств, органов. 1999. - №1. - С. 40-49.

151. Шумаков В.И., Тоневицкий А.Г. Иммунологические и физиологические проблемы ксенотрансплантации. М.: - Наука. -2000. - 144 с.

152. Щербачева JI.H., Лобанова A.M., Арбузова М.И. Функциональная активность островкового аппарата у детей с впервые выявленным сахарным диабетом // Педиатрия. 1989. - № 11. - С. 10-14.

153. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы //Иммунология. 1996. - №1. - С.4-10

154. Ярыгин В.Н., Малинина И.Е., Бибаева Л.В. Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на морфофункциональные характеристики нейронов Locus coeruleus // Бюлл. экспер. биол. мед. 1997. - Т. 7. - С. 106-108.

155. Adeghate Е., Donath T.Fixation and tissue preparation method for the localization of monoamine oxidase enzyme activity in the lung and incontrol and transplanted pancreas // Biogenic. Amines. 1993. - N 10. -P. 67-71.

156. Adeghate E. Host-graft circulation and vascular morphology of pancreatic tissue transplants in rats // Anat. Rec. 1998. - N 251. -P.448-459.

157. Adeghate E., Donath T. Tranaplatation of tissue grafts into the anterior eye chamber: a method to study intrinsic neurons // Brain Research Protocols. 2000. - N 6. - P.33-39.

158. Akimaru K., Stuhlmiller G. M. Seigler H. F. Alio transplantation of insulinoma into the testis of diabetic rats // Transplant. 1981. - V.32. №3. - P.227-232.

159. Alvorado-Mallart R.M., Sotelo C. Differentiation of cerebellar anlage heterotopically transplanted to adult rat brain: a light and electron microscopic study // J. Сотр. Neurol. 1982. - V.212. - N 3. - P. 247 -267.

160. Amos A.F., V. Carthy D.J., Zimmet P. The rising global burden of diabetes and its complications: estimates and projections to the year 2010 // Diabet Med. 1997. - V.14. - Suppl. 5. - S1-S85.

161. Andreani D., Federfin K.F., Di Mario U. // Immunology in diabetes. -London-Edinburgh: Kimpton Med.Publ. 1984. - P.298.

162. Anisimov V.N., Birnbaum L.S., Butenko G.M., Cooper R. Principles for Evaluating Chemical Effects on the Aged Population. Environmental Health Criteria 144 // Geneva: WHO. - 1993. - 159 p.

163. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., Morozov V.G. Effect of synthetic dipeptide Thymogen (Glu-Trp) on life span and spontaneoustumor incidence in rats // The Gerontologist. 1998. - V. 38. - Special Issue I. -P. 7-8.

164. Aramant R., Seiler M., Ehinger B. Transplantation embryonic retina to the retina of adult animals // In: Anderson R.E., Nollyfield J.G., La Vail MM, Eds. Retinal Degeneration. Boca Raton: RCS Press. 1991. - P.275 -288.

165. Armitia E.C., Perlow M.J., Brennan M.J., Lander J.M. Fetal raphe and hippocampal transplants into adult and aged С 57BL 16N mice // Brain Res.Bull. 1981. - V.7. - P. 703 - 710.

166. Barker C.F., Billingham R.E. Immunologically privileged sites // Adv. Immunol. 1977. - V.25. - P.l-52.

167. Bellgrau D., Gold D., Selawry H.P., Moore J., Franzusoff A., Duke R. c. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. 1995. -V.377. - P.630-632.

168. Berg D., Barrett K. Chamberlin M. // Meth.Enzymol. / Ed.Colowik S., Kaplan N. N. Y/:Acad.Press. 1971. - V.21. D. - P.506-509.

169. Betts P., Logatchev M.F., Volkov I.E. "An Audit of pediatric diabetes care in Russia and England; an experience in international collaboration" //Hotm. res. 1998.-V.50.-P. 107-140.

170. Bjorklund A., Stenevi U., Svendgaard N-A. Growth of transplanted monoaminoergic neurons into the adult hippocampus along the perforant path // Nature. 1976. - V.262. - N 5571. - P.787-790.

171. Bjorklund A., Stenevi U. Reformation of the severed septohippocampal cholinergic pathway in the adult rat by transplanted septal neurons // Cell Tiss. Res. 1977. - N3. - P. 289-302.

172. Bjorklund A., Stenevi U. Reconstruction of the nigro-striatal dopamine pathway by intracerebral nigral transplants // Brain Res. 1979. - V.177. -P. 555-560.

173. Bjorklund A., Stenevi U., Dunnett S.B., Iversen S.D. Funstional reactivation of the deafferented neostriatum by nigral transplants // Nature. -1981. V.289. - P. 497 - 499.

174. Bjorklund L., Stremberg I. Dopaminergic innervation of striatal grafts placed into different sites of normal striatum: Differences in the tyrosine hydroxylase immunoreactive growth pattern // Exp. Brain Res. 1997. -V.113.-P. 13-23.

175. Boguist L. Alloxan diabetes in mice: study of potentiatin and antogonizing factors // Diabetologia. 1977. - V. 13. - N 4. - P.383-389.

176. Bogust L., Nelson L., Lorentzon R. Uptake of labeled alloxan in mouse organs and mitochondria in vivo and in vitro // Endocrinology. 1981. -V.113.-№3.-P. 943-948.

177. Bouwens L. Cytokeraatins as markers of ductal cell differentiate and islet neogenesis in neonatal rat pancreas // Diabetes. 1994. - V.43. - P. 1279-1283.

178. Bouwens L. Islet Morphogenesis and stem cell markers in rat pancreas // J.Histochem. Cytochem. 1996. - V. 44. - P. 947-951.

179. Bouwens L. Proliferation and differentiation in the human fetal endocrine pancreas // Diabetologia. 1997. - V.40. - P. 398-404.

180. Bouwens L. Transdifferentiation versus stem cell hypothesis for the regeneration of beta-cells in the pancreas // Microscopy Res. Technique. 1998a.-V. 43.-P. 332-336.

181. Bouwevs L. Citokertins and cell differentiation in the pancreas // J .Pathology. 1998b. - V.184. - P. 234-239.

182. Bowen K.M., Lafferty K.J. Reversal of diabetes by allogenic islet transplantation without immunosuppression // Austral. J. Exper. Biol, and Med. Sci. 1980. - V.58. - N 5. - P. 441-447.

183. Bragin A.G., Bohne A. The graft of the neocortex and hypocampus within barrel field of adult rats: the comparison of the morphological criteria of integration with the host brain // Rest. Neurol. Neurosci. -1989.-suppl. 46-47.

184. Bragin A.G., Vinogradova O.S., Stafekhina V.S. Sensory deprivation prevents integration of neocortical grafts with the host brain // Rest. Neurol. Neurosci. 1992. - V.4. - P. 279 - 283.

185. Bretzel R., Ricordi C. Clinical islet transplantation // Diabetologia. -1997.-V.40.-P. B45-B46.

186. Brightman M.W., Reese T.S. Junction between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain // J. Cell. Biol. 1969. - V.40. - P. 648-677.

187. Brown J., Danilovs J.A., Clark W.R., Mullen Y.S. Fetal pancreas as a donor organ// World J.Surg. 1984.- V.8. - P.152-157.

188. Browning H., Resnik R. Homologous and heterologous transplantation of pancreatic tissue in normal and diabetic mice // Yale J. Biol. Med. -1951.-V.24.-N1.-P.141-152.

189. Burton К. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the calorimetric estimation of deoxyribonucleic acid // Biochem. J. 1956. - V.62. - P.315-323.

190. Butenko G.M., Tereshina O.P., Labunetz I.F., Magdich L.V. Stress and immune system in aging // Gerontologie und Geriatrie, Abst. Iyth European Congress of Gerontology. Berlin. - July 7-11, 1999. - P.l 17

191. Cai S., Zhan W., He Y. Effects of Fas-ligand expression on pancreatic islet allografts // Zhonghua. Wai Ke Za Zhi. 2001. - V.39. - N 8. -P.634-7

192. Castro A.J., Tonder N., Sunde N.A., Zimmer J. Fetal cortical transplants in the cerebral hemisphere of newborn rats a retrograde fluorescent analysis of connections // Exp. Brain Res. - 1987. - V.66. - N 3. - P.533 -543.

193. Caterson I.B., Fuller S.J., Randle P.J. Effect of the fatty acid oxidation inhibitor 2-tetradecylglycidic acid on pyruvate dehydrogenase complex activity in slarved and alloxan diabetic rats // Biochem. J. -1982.-V. 208.-Nl.-P. 53-60.

194. Chen J.J., Sun Y., Nabel G.J. Regulation of the proinflammatory effects of Fas-ligand (CD95L) // Science. 1998. - V.282. - N 27. - P. 17141717.

195. Choi C., Benveniste E.N. Fas ligand/Fas system in the brain: regulator of immune and apoptotic responses // Brain Res. Rev. 2004. - V.44. -N1. - P.65-81.

196. Clare C.M., jr. Lee D.A. Prevention and treatment of the complications of diabetes mellitus // New England J. Med. 1995. - V. 332. - N 18. -P.l 210-1217.

197. Collins I., Corder C. Aldose reductuse and sorbitol dehydrogenase of normal and diabetic rat lens // Invest. Opthalmol. Visual.Sci. 1977. -V.16. -N3. -P. 242-243.

198. Connell C.J., Mercer K.Z. Freeze-fracture appearance of the capillary endothelium in the cerebral cortex of mouse brain // Amer. J. Anat. -1974. V.140. N 4. - P. 595-601.

199. Cooperstein S.J. The islets of Langerhans. New - York: - 1982. - P. 387-425.

200. Cunha-Vaz J.G. Sites and functions of the blood-retinal barriers // The blood-retinal barriers ed. J.G. Cunha-Vaz. New -York and London. -1980. - P. 101-117.

201. Das G.D., Altman J. Transplanted precursors of nerve cells: their fate in the cerebellum of young rats // Science. 1971. - V. 173. - P. 637-638.

202. Das G.D., Altman J. Studies on the transplantation of developing neural tissue in the mammalian brain. I.Transplantation of cerebellar slabs intothe cerebellum of neonate rats // Brain Res. 1972. - V.38. - N 2. - P.233 -249.

203. Das G.D. Transplantation of cerebella tissue in the cerebellum of neonate rabbits // Brain Res. 1973. - V.50. - P. 170-173.

204. Das GD. Transplantation of embryonic neural tissue in the mammalian brain. I.Growth and differentiation of neuroblasts from various regions of the embryonic brain in the cerebellum of neonate rats // Life Sci. -1974. V.4.-P. 93 124.

205. Das G.D. Development of neocortical transplants. In: Bjorklund A., Stenevi U., eds. Neural Grafting in the Mammalian CNS // Amsterdam. New York. Oxford: Elsevier. 1985. - P.101 - 123.

206. Date I. Parkinson's disease, trophic factors, and adrenal medullar chromaffin cell grafting: Basic and clinical studies // Brain Res. Bull. -1996. V.40.-P. 1-19.

207. David E.R., Goetz F., Najarian J.S. Pancreas transplantation for diabetes // Lancet. 1988. - N 8594. - P.l 100-1101.

208. Davoren P.R. The isolation of insulin from a single cat pancreas // Biochem. Biophys. Acta. 1962. - V. 63. - N 2. - P. 150-153.

209. Dexter TM. Stromal cell associated haemopoiesis // J. Cell Physiol. -1982.-V.1.-P.87-94.

210. Dische L., Shettles L.B. //J.Biol.Chem. 1948. - V.175. -P.595-603.

211. Djodjevic R., Brkic S.D., Micic D. Human fetal cell implantation in patients with IDDM // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreast". Vrnjacka Banja. - 1987. - Abstr. 31.

212. Djordjevic R., Heding L.G., Zamaklar M. Human fetal islet implantation in insulin dependent diabetics: changes in beta-cell function after implantation // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. - 1990. - Abstr. 33.

213. Dombrowski F., Klingmuller D., Pfeifer U.Insulinoma derived from hyperplastic intra-hepatic islet transplant // Am. J. Pathol. 1998. -V.152. - N 4. - P.1025-38.

214. Dorn A., Lorenz D., Koch G. Immunofluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Insulin und Glukagon in transplantirten isolierten Langerhansschen Inseln bei diabetischen Ratten und Hunden // Anat. Anz. 1977. - V.142. - № 3. - P. 151-158.

215. Dorshkind K. Regulation of hematopoiesis by bone marrow stromal cells and their products // Annu. Rev. Immunol. 1990. - V.8. - P.l 11137.

216. Dufour J.M., Rajotte R.V., Kin Т., Korbutt G.S. Immunoprotection of rat islet xenografts by cotransplantation with Sertoli cells and a single injection of antilymphocyte serum // Transplantation. 2003. - V.75. - N 9. - P.1594-6.

217. Dufour J.M., Rajotte R.V., Seeberger K., Kin Т., Korbutt G.S. Long-term survival of neonatal porcine Sertoli cells in non-immunosuppressed rats // Xenotransplantation. 2003. - V. 10. - N 6. -P.577-86.

218. Duke R. C., Newell E., Schleicher M., Meech S., Bellgrau D. Transplantation of cells and tissues Expressing Fas-ligand // Transplantation Proceedings. 1999. - V. 31. - P. 1479-1481.

219. Dunn E.H. Primary and secondary findings in a series of attempts to transplant cerebral cortex in the albino rat // J. Сотр. Neurol. 1917. -V.27. - P. 565-582.

220. Dunn I., Mc. Letchie N., Sheehan H. Necrosis of islets of Langerhans produced experimentally // Lancet. 1943. - V.244. - N 6242. - P. 484487.

221. Efrat S. Genetically engineered pancreatic beta-cell lines for cell therapy of diabetes // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. - V.875. - P.286-93.

222. Ehrlich P. Das Sauerstoffbedurfnis des Organismus // Fine farbenanalytische studie. Berlin. - 1885. - P.69-73

223. Ehrlich P. Uber die Methylenblaureaction der lebenden Nervensubstanz // Dtsch. Med. Wochenschr. 1886. - V. 12. - N 4. - P.49-52.

224. Eliasson S. Properties of isolated nerve fibres from alloxanized rats // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1969. - V.32. - N 3. - P. 525-529.

225. Eloy R., Kedinger M., Haffen K., Grenier F. Role of embryonic chicken pancreas in the suppression of the diabetic state in the rat // Brit.i J. Surg. 1978. - V.65. - N 5. - P. 368.

226. Farkas Gy, Karacsonyi S., Hodi M. Human embrionalis Langerhans-sziged szovettenyeszet klinikai tranplantalusa // Orvosi Hetilap. 1983. -V.124. - N47- S. 2853-2856.

227. Federlin K., Bretzel R.G. The effect of islet transplantation on complications in experimental diabetes of the rat // Word J. Surg. 1984. -N8.-P. 169-178.

228. Federlin K., Bretzel R. G., Hering B. Pancreatic transplantation in diabetes // Intern. J. Art. Organs. 1991. - V. 14. - N 2. - P. 74 - 77.

229. Federlin K. F., Jahr H., Bretzel R.G. Islet transplantation as treatment of type 1 diabetes: from experimental beginnings to clinical application // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2001. - №109. - Suppl. 2. - P. 373383.

230. Feldman S.D., Scharp D.W., Lacy P.E., Ballinger W. F. Fetal pancreas isografts, cultured and uncultured to reverse streptozocin-induced diabetes mellitus // J. Surg. Res. 1980. - V.29. - № 4. - P. 309-318.

231. Ferguson J., Scothorne R.J. Extended survival of pancreatic islet allografts in the testis of guinea-pigs // J. Anat. 1977. - V. 124. - N 1. -P.l-8.

232. Ferguson J., Scothorne R.J. Furtcher studies on the transplantation of isolated pancreatic islet // J. Anat. 1977. - V. 124. - N 1. - P.9-20.

233. Ferner H. Anatomische Beziehungen zwischen exokrinen undendokrinen Pankreas. Disseminationsprobleme // Gastroenterol. Und Stoffwechsel Aktionen und Interaktionen. Baden-Baden - Brussel. -1974.-P. 75-79.

234. Ferotti M., Toddei F., Mirabelli F., Vairetti M., Belomo G., McConkey ъ D. and Orrenius S. Calcium-dependent DNA fragmentation in humansynovial cells exposed to cold shock // FEBS Lett. 1990. - V.259. - P. 331-334.

235. Fielder A.R., Rahi A.U.S. Immunoglobulins of normal agueous humor //Trans. Ophthal. Soc. U. K. 1979. - V.99. - P. 120-125.

236. Finch D. R. A., Morris P.J. Passive enhancement of isolated pancreatic islet allografts // Transplantation. 1976. - V.22. - № 5. - P. 508-512.

237. Finch D. R. A., Morris P.J. The effekt of increasing islet numbers on survival of pancreatic islet allografts in immunosupressed diabetic rats // Transplantation. 1977. - V.23. - № 1. - P.104-106.

238. Finch D. R. A., Wise P.H., Morris P.J. Successful intrasplenic transplantation of syngenic and allogenic isolated pancreatic islets // Diabetologia. 1977. - V.13. - N 3. - P. 195-199.

239. Fine A. Human fetal tissue research: practice, prospects and poicy // Cell Transplant. 1989. - N2. - P. 113 - 145.

240. Finsen В., Sorensen Т., Gonzalez В., Castellano В., Zimmer J. Immunological reactions to neural grafts in central nervous system // Restorative Neurology and Neuroscience. 1991. - N 2. - P.271- 282.

241. Fontana A., Fierz W., Wekerle H. Astrocytes present myelin basic protein to encephalolitogenic T-cell lines // Nature. 1984. - V.307. -P.273-276.

242. Garvey F.W., Millard P.R., Morris P.J. Experimental transplantation of fetal pancreas and isolated islets in the rat: studies of donor pretreatment and recipient immunosupression // Transplant.Proc. 1980. - V.12. - № 4. -Suppl.2.-P.l86-189.

243. Gehrmann J., Matsumoto J., Kreutzberg G.W. Microglia: intrinsic immunoeffector cell of brain // Brain Res. Rev. 1995. - V.20. - N 3. -P.269-287.

244. Globerson A.R., Abel E.I, Ren-Menahem D. Developmental aspects of T-lymphocytes in aging // In: Goldstein A.L., ed. Biomedical Advances in Aging. New York, London: Plenum Press. - 1990. - P. 363-373.

245. Gonzales M.F., Sharp F.R., Loken J.E. Fetal frontal cortex transplanted to injured motor/sensory cortex of adult rats: reciprocal connections with host thalamus demonstrated with WGA-HRP // Exp. Neurol. 1988. -V.l.-P. 154- 165.

246. Gores P.F., Hayes D.H., Copeland M.J., Korbutt G.S., Halberstadt C., Kirkpatrick S.A., Rajotte R.V. Long-term survival of intratesticular porcine islets in nonimmunosuppressed beagles // Transplantation. -2003. V.75. - N 5. - P.613-8.

247. Goya R.G., Takahashi S., Quigley K.L. Immune-neuroendocrine interactions during aging: age-dependent thyrotropin-inhibiting activity of thymosin peptides //Mech. Aging. Dev. 1987. - V.41. - N 2. - P.219-227

248. Goya R.G. Homeostasis, Thymus Hormones and Aging // Gerontology.- 1999. V.45. -N 3. - P.174-178

249. Gray B.N., Watkins E. Isolated islet transplantation in experimental diabetes // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1976. - V. 54. - P. 57.

250. Gray B.N., Watkins E. Prevention of Vascular complication of diabetes by pancreatic islet transplantation // Arch. Surg. 1976. - V.l 11. - N 3. -P 254-257.

251. Greene H.S.N., Lund P.K. The heterologous transplantation of human cancers // Cancer. Res. 1944. - V.2. - P. 352-360.

252. Greene H.S.N., Arnold H. The homologous and heterologous transplantation of brain and brain tumors // J. Neurosurg. 1945. - V.l 1.- N 4. P. 315-331.

253. Greene H.S.N. The use of transplanted tissue in biology and histology // In vivo techniques in histology/ed. Bourne G.H.- Boltimore. 1967. - P. 80-112.

254. Griffit T.S, Brunner Т., Fletcher S.M., Green .R., Fergusson T.A. Fas ligand induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science.- 1995.-V.270.-P.1189-1192.

255. Hahn H.J., Lucke S., Besch W., Kauert C. Effect of islet transplantation on the recipient endocrine pancreas // Biomed. Biochem. Acta. 1986. -V.44. - N 1. - P.137-142.

256. Hahn J.H., Laube F., Lucke S., Kloting I., Kohnert K.D., Warzock R. Toxic effect of cyclosporine on the endocrine pancreas of Wistar rats // Transplantation. 1986. - V.41. - P.44-49.

257. Hammerstrom L., Hellman В., Ullberg S. On the accumulation of alloxan in the pancreatic beta cell // Diabetologia. - 1967. -V.3. - № 3. -P. 340-345.

258. Harrison D.E., Astle C.M., Delaittre J.A. Los of proliferate capacity in immunohemopoietic stem cells caused by serial transplantation rather than aging // J. Exp. Med. 1978. - V. 147. - P. 1526-1531.

259. Hart D.N.I., Fabre Y.W. Demonstration and characterization of la-positive dendritic cells in the interstitial connective tissue of rat heart and other tissues, but not brain // J. Exp. Med. 1981. - V. 154. - P. 347-361.

260. Hauser S.P., Allewelt M.C., Lipschitz D. A. Effects of myelotoxic agents on cytokine production in murine long-term bone marrow cultures // Stem. Cells. 1998. - V.16. - N 4. - P. 261-270

261. Herge O.D., Leonard R.J., Erlandsen S.L. Transplantation of islet tissue in the rat// Acta endocrinol. 1976. - V.83. - Suppl.205. - P.257-278.

262. Herge O.D., Leonard R.J., Rusin J.D., Lazarow A. Transplantation of the fetal pancreas: Quantitative morphological analyses of the islet tissue growth// Anat. Rec. 1976. - V.185. -№ 2. - P.209-221.

263. Hering B.J. Improved survival of single donor islet allograft in IDDM recipients by refined peritransplant management // Diabetes. -1997. -V.46. Suppl.l. - P.64A.

264. Hiller W.F.A., Klempnauer J., Luck R., Steiniger B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation // Diabetes. 1991. -V.40. - №1. -P.134-140.

265. Hoffer В., Seiger A., Lundberg Т., Olson L. Electrophysiological and cytological studies of brain grafts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo // Brain Res. 1974. - V.79. - N l.-P. 165-184.

266. Huang C.C., Huang P.C. //J.Nturochem. 1969. - V.29. - P.5-12.

267. Hu Y.E., Gu Z.E, Zhang H.D. Islet transplantation in patients with type I diabetes in China // 1st Intern. Congr. on Pancreatic and Islet Transplantation. Stockholm. - 1988. - Abstr. 226.

268. Ни Y.E., Gu Z.E, Zhang H.D., Ye R.S. Fetal islet transplantation in China // Transplant. Proc. 1992. - V.24. - N5. - P.231-233

269. Ни Yuang Feng, Gu Zhi-feng, Zhang Hong-De, Ye Rong-Shao. Fetal islet transplantation // Diabetes. Proc. 13th Congr. Int. Diabetes Fed. Sydney- 20-25 Nov. 1988. Amsterdam etc. 1989. - P.725-728.

270. Jamamoto H., Ushigata J., Okomoto H. DNA strand breaks inpancreatic islets by in vivo administration of alloxan or streptozotocin // Biochem. Biophys. Res. Com. 1984. - V. 103. - N 3. - P. 1014-1020.

271. Kadish A.H., Litle R.L., Sternberg I.C. A new and rapid method for the determination of glucose by measurement of rate of oxygen consumption // Clinical. Chemistry. 1979. - V.14. - N 2. - P. 116-131.

272. Kasper M. Changesin the distributions of intermediate filamentes proteins and collagen in fetal and human pancreas // Histochemistry. -1991. -V.96. P. 376-385.

273. Kaufman D.B., Morel Ph., Field M.J. Purified canine islet autografts: Functional outcome as influenced by islet number and implantation site // Transplantation. 1990. - V.50. - № 3. - P.385-391.

274. Kin Т., Rajotte R.V., Dufour J.M., Korbutt G.S. Development of an immunoprivileged site to prolong islet allograft survival // Cell Transplant. 2002. - V. 11. - N 6. - P.547-52.

275. King H., Aubert RE., Herman W.H. Global burden of diabetes, 1995 -2025: prevalence, numerical estimates, and projections // Diabetes Care.- 1998.-V.21.-P. 1414-1431.

276. Kittler E.L.W., Mc Grath H., Temeles D. Biologic significance of constitutive and subliminal growth factor production by bone marrow stroma // Blood. 1992. - V.79. - P.3168-3178.

277. Klassen H., Lund R.D. Retinal graft-mediated pupillary responses in rats: restoration of a reflex function in the mature mammalian brain // Neurosci. 1990. - V.10. - P. 578 - 587.

278. Konigsrainer A., Dietze O., Habringer C. Morfology of acute rejection and corresponding cytological findings in exocrine secretion after pancreas transplantation in the rat // Transplantation. 1991. - V.52. - № 5. - P.770-777

279. Kopyov O.V., Jacques D., Lieberman A., Duma C.M., Rogers R.L. Outcome following intrastriatal fetal mesencephalic grafts for Parkinson's patients is directly related to the volume of grafted tissue // Exp. Neurol. 1997. - V.146. - P. 536-545.

280. Kordower J.H., Rosenstein J.M., Collier T.J. Functional fetal nigral grafts in a patient with Parkinson's disease: Chemoanatomic, ultrastructural, and metabolic studies // J. Сотр. Neurol. 1996. - V.370.- P. 203-230.

281. Krametz E.T., Greene H.S.N. Heterologous transplantation of neural tumors // Cancer. 1953. - N 6. - P. 100-110.

282. Krishnamurthi V., Philosophe В., Bartlett S.T. Pancreas transplantation: contemporary surgical techniques // Urol. Clin. North Am. 2001. -V.28. - N 4. - P.833-838.

283. Kromer L., Bjorklund A., Stenevi U. Intracephalic implants:A technique for studying neuronal interaction // Science. 1979. - V.204. -P. 1117-1119.

284. Kulikov A.V., Arkhipova L.V., Tretyak T.M., Bragin A.G. Serotonin and norepinephrine content in brain structures of rats with experimental and transplantation-compensated diabetes // J. Hirnforsch. 1986. -V.27. - № 5. - P. 495-499.

285. Kulikov A.V., Tretyak T.M. Insulin as signal molecule for monoaminergic system of the brain // Signal molecule and mechanisms of animal behaviour: Simp. Abstract. Pushchino. - 1989. - P.35-36.

286. Labunets I.F. Age-related biorhythmical disfunction of the pineal gland, thymus and hypophysial-adrenal system in healthy subjects // Aging: immunology and infectious disease. 1996. - V.6. - N 3. - P. 167-176.

287. Lacy P. E., Kostianovsky M. Method for the isolation of intact islets of Lancerhans from rat pancreas // Diabetes. 1967. - V.16. - N 21. - P. 35 -39.

288. Lacy P.E., Davie J.M., Finke E.H. The use of in vitro culture for prevention of immune rejection of the islets // Horm. and Metabol. Res. Suppl. Ser. 1982. - N 12. - P.27-33.

289. Lacy P.E. Status of islet cell transplantation // Diabetes Rev. 1993. -V.l. - P.76-92.

290. Lafferty K.J., Prowse S.J. Theory and practice of immunoregulation by tissue treatment prior to transplantation // World Surg. 1984. - V.8. - N 2.-P. 187-197.

291. Lanza R.P., Ecker D.M., Kuhtreiber W.M., Marsh J.P., Ringeling J., Chick W.L. Transplantation of islet using microencapsulation: studies in diabetic rodents and dogs // J. Mol. Med. 1999. - V.77. - N 1. - P.206-10.

292. Larsen J., Lane J., Mack-Shipman L. Pancreas and kidney transplantation // Curr. Diab. Rep. 2002. - V.2. - N 4. - P.359-64.

293. Lau H.T., Yu M., Fontana A., Stoeckert C.J. Prevention of islet allograft rejection With engineered myoblasts expressing Fas-L in mice // Scienc. 1996. - V.273. - P.109-112.

294. Lavin N. Manual of Endocrinology and Metabolism. Boston/New York/ Toronto/London. 1994. - P. 759-824.

295. Lenzen S., Panten V. Alloxan: history and mechanism of action // Diabetologia. 1988. - V.31. - P. 337-342.

296. Lewis E.R., Cotman C.W. Mechanisms of septal laminated of the developing hippocampus revealed by outgrouwth of fibers from septal implants // Brain Res. 1980. - V. 196. - N2. - P. 307-330.

297. Lewis E.R., Cotman W. Neurotransmitter characteristic of brain grafts:strial and septal tissue from the same laminated input to the hippocampus //Neuroscience. 1983. - V.8. - N 1. - P. 57-66.

298. Lindvall O. Neural transplantation: a hope for patients with Parkinson's disease // Neuroreport. 1997. - V.8. - III-IIX.

299. Lippert H., Lorenz D., Hahn H.J. Allogene transplantation isolierter Langerhansschen Inseln in die Leber diabetischer Hunde liber Berucksichtigung immunologischer Aspekte // Z. Exp. Chir. -1983. -V.l6. -№ 1. P.33-47.

300. Lipschitz D.A. Nutrition, aging and the immunhematopoietic system // Clin. Geriatr. Med. 1987. - V.3. - P.319-328.

301. Liu H. Eric, Kevan C.Hrold. Transplantation of the Islet of Langerhans: Hope for Treatment of Type 1 Diabetes Mellitus // Trends in Endocrin. and metab. 2000. - V.l 1. - N 9. - P.379-382.

302. Lowry O.H., Rosenbvough H.J., Farr A.L., Randall R.I. A protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol.Chem. 1951. -V.193. - N 2. - P. 265-275.

303. Makinodan Т., Kay M.M.B. Age influence on the immune system // Adv. Immunol. 1980. - Vol. 29. - P. 287-330.

304. Malik A., Yefimov A., Turchin I.S., Glebova L. The effect of xenotransplantation on lipid metabolism to type 1 diabetic patients // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. -1990. - Abstr.28.

305. Manchester K. Insulin and protein synthesis // Endocrin.pancreas and diabetes/- Amsterdam, Oxford. 1977. - P. 119-130.

306. May R.M. La greffe dans L oeil de rat blanc adulte du tiss cerebral de rat nouveaune // Archs. Anat. Microsc. Morph. Exp. 1930. - V.26. - P. 433-439.

307. May R.M. La greffe brephoblastigue intraoculaire ducervelet chez la Souris // Archs. Anat. Microsc. Morph. Exp. 1954. - V.43. - P. 42-56.

308. McEvoy R.C., Hegre O.D. Morphometric quantitation of the pancreatic insulin-, glucagon-, and somatostatin-positive cell populations in normal and alloxan-diabetic rats // Diabetes. 1977. - V.26. - № 12. - P. 11401146.

309. Mc Evoy R.C., Leung P.E. Transplantation of fetal rat islet into the cerebral ventricles of alloxan-diabetic rats. Amelioration of diabetic by syngenic but not allogenic islets // Diabets. 1983. - V.32. - N 9. - P. 852-857.

310. Medawar P.B. Immunity to homologous grafted skin. Ill Fate of skin homografts transplanted to the brain, to subcutaneous tissue and to anterior chamber of eye // Brit. J. exp. Patch. 1948. - V.29. - P.58-69.

311. Milenkovic L., Lyson K., Aguila M.C. Effect of Thymosin-al on Hypothalamic Hormone Release //Neuroendocrinology. 1992. - V.56. -N 5. - P.674-680

312. Miller R. Aging and immune system // Int. Rev. Cytol. 1991. - V. 124. -P. 187-216.

313. Millington G., Buckingam J.C. Thymic Peptides and Neuroendocrine-Immune Communications // J. Endocrinol. 1992. - V.133. - N 2. -P.163-169

314. Murphy J.E., Sturm E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain //J. Exp. Med. 1923. - V.38. - P. 183-197.

315. Nagata S., Golstein P. The Fas death Factor // Science. 1995. - V.267. - P.1449-1456.

316. Nakajima Y., Nakano H., Nokagawa K., Segawa M., Shiratori T. Effect of total lymphoid irradiation on pancreatic islet xenografts survival in rats // Transplantation. 1982. - V. 34. - N 2. - P. 98-100.

317. Navarro X., Kennedy W.R., Loewenson R.B. Influence of pancreas transplantation on cardiorespiratory reflexes, nerve condition, and mortality in diabetes mellitus // Diabetes. 1990. - V.39. - P.802-806.

318. Nikolaidis P., Amin R.S, Hwang C.M, Mc Carthy R.M, Clark J.H, Gruber S.A., Chen P.C. Related Role of sonography in pancreatic transplantation // Radiographics. 2003. -V.23. - N 4. - P.939-49.

319. Nishino H., Ohkita H., Fukamizu A. Prolongation of survival time of rat pancreatic islet allografts by tissue culture // Transplant. Proc. 1984. -V. 16.-N6.- P. 1687-93.

320. Nornes H., Bjorklund A., Stenevi V. Transplantation strategies in spinal cord regeneration // Neural transplants: development and function/ ed. Sladek Y.R.H, Gast D.M. New York-Plenum. - 1984. - P. 407-421.

321. Oblinger M.M., Das G.D. Connectivity of neural transplants in adult rats: analysis of affronts and efferent of neocortical transplants in the cerebella hemisphere // Brain Res. 1982. - V.249. - N 1. - P.31- 49.

322. Odorico J.S, Sollinger H.W. Technical and immunosuppressive advances in transplantation for insulin-dependent diabetes mellitus // World J. Surg. 2002. - V.26. - N 2. - P. 194-211.

323. Olanow C.W., Freeman T.B., and Kordower J.H. Neural transplantation as a therapy for Parkinson s disease // Adv. Neurol. 1997. - V.74. -P.249.

324. Orland M.J., Permutt M.A. Quantitative analysis of pancreatic proinsulin m RNA in genetically diabetic (db/db) mice // Diabetes. -1987.-V.36.-N3.-P. 341-347.

325. Perlow M. F., Freed W.F., Hoffer B.I., Seiger A., Olson L„ Wyatt R.Y. Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system // Science. 1979. - V.204. - P. 643 - 647.

326. Podolsky S., Viswanathan M. Secondary diabetes. The spectrum of the diabetic syndromes //New York. Reaven Press. 1980. - 602 p.

327. Powell C.S., Lindsey N.J., Nolan M.S., Wiley K.N., Boyle P.F., Herold A., Beck S., Fox M. The value of urinary anneals as marker early pancreatic allograft rejection // Transplantation. 1987. - V.43. - N 6. -P. 921-923.

328. Qian H., Atherton S. Apoptosis and increased expression of Fas ligand after uniocular anterior chamber (AC) inoculation of HSV-1 // Curr. Eye Res. 2003. - V.26. - N 3-4. - P. 195-203.

329. Rahi A.H.S. Immunopathology of the eye // Neuroimmunology/ ed. P. Behan and F. Spreafico. New - York. - Paven Press. - 1984. - P. 415431.

330. Reese T.S., Karnovsky M.J. Fine structural localization of blood-ocular to exogenous peroxidaze // J. Cell Biol. 1967. - V.34. - N 1. - P. 207212.

331. Reintgen D. S., Feldman J.M. Vervaert C.E., Segler H.F. Transplantation of insulinoma into the diabetic Syrian hamster // Ann. Surg. 1980.-V.191.-P.105.

332. Ribotta MG.Y., Roudet C., Sandillon F., Privat A. Transplantation of embryonic noradrenergic neurons in two models of adult rat spinal cord injury: Ultrastructural immunocytochemical study // Brain Res. 1996. -V.707. - P. 245-255.

333. Ricordi C., Lacy P., Finke E. H. An automated method for the isolation of human pancreatic islets // Diabetes. 1988. - N 37. - P. 413.

334. Ricordi C., Lacy R.E., Scharp D.W. Automated islet isolation from human pancreas // Diabetes. 1989. - V.38. - Suppl. I. - P. 140-142.

335. Ricordi С., Stanzl Т.Е. Cellular transplant // Transpl. Proc. 1991. -V.23. - № 1. - P.73-74.

336. Ricordi C., Tzakis A., Carroli P.B. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases // Transplantation. 1992. -V.53.-N2. - P. 407-414.

337. Righardt M., Menden A., Bretzel R.C., Kederlin K. Islet transplantation in experimental diabetes of the rats. B-cell restoration following islet transplantation. Preliminary results // Hormone and Metab.Res. 1984. -N10.-P. 551-552.

338. Robertson R. P., Sutherland D. E. R. Pancreas transplantation astherapy for diabetes mellitus // Annu. Rev. Med. 1992. - V.43. - P. 395 -415.

339. Rosental R.L., Ilyinsky I.M. Islet cell transplantation in diabetic patients with purulent septic complications // 1st Intern. Congr. On Pancreatic and Islet Transplantation. Stockholm. - 1988. - Abstr. -P.223.

340. Rosental R.L., Leinieks A., Ilyinski I.M., Bicans Y.B. Clinical improvement after islet cell transplantation in diabetes mellitus patients // 3 rd Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Vrnjacka Banja. - 1989,-Abstr.-P.30.

341. Rossini A. A., Greiner D. L., Mordes J. P. Induction of immunologic tolerance for transplantation // Physiol. Rev. 1999. - V.79. - N 1. -P. 107, 110-112.

342. Rubin R.J., Altman W.M., Mendelson D.N. Health care expenditures for people with diabetes mellitus, 1992 // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994. - V.78. - N 4. - P. 809A-809F.

343. Saltykow S. Versuche uber Gehirnreplantation, zugleich lin Beitrag zur Kenntniss reactiver Vorgange an den zelligen Qehirnelementen // Arch.Psychiat.Nerwenkrankh. 1905. - V.40. - P. 329-388.

344. Sanberg P.R, Borlongan C.V, Saporta S., Cameron D.F. Testis-derived Sertoli cells survive and provide localized immunoprotection for xenograft in rat brain // Nature Biotechnol. 1996. - V.14. - P. 16921695.

345. Sandler S., Andersson A. Islet implantation into diabetic mice with pancreatic insulitis // Acta patol. Et microbiol. Scand. 1981. - V.89. -№22.-P. 107-112.

346. Saporta S., Sanberg P.R, Borlongan C.V, Othber R.C, Cameron D.F. The testis-derived cultured Sertoli cell as a natural Fas-L secreting cell for immunosuppressive cellular therapy // Cell Transplant. 1997. - V.6.- N2. P.191-193.

347. Sasaki H., Coffey P., Villegas-Perez M.P. Light induced EEG desynchronization and behavioral arousal in rats with restored retinocollicular projection by peripheral nerve graft // Neurosci. Lett. -1996.-V.218.-P. 45-48.

348. Scharp D. W., Lacy P.E., Santiago J.V. Insulin independence after islet transplantation into type 1 diabetic patients // Diabetes. 1990. -V.30. -N 4. - P.515-518.

349. Scharp D.W., Lacy RE., McCullough С Intraportal human islet transplantation // XIII Intern. Congr. of Transplant. Soc. San Francisco.- 1990.-P. 114.

350. Scharp D.W, Lacy P.E., Santiago J. et al. Results of our first nine intraportal islet allografts in type 1, insulin-dependent diabetic patients //Transplantation. 1991. - V.51. - P. 76-78.

351. Schmidt R.E. Der alloxandiabetes. Morphologie, chemismus und Literatur//Haransg. K.Mothes.Leipzig. 1967. - Bd. 1. - S.142-149.

352. Schnitzer I., Schachner M. Expression of Thy-1, H-2, and NS-4 surface antigens and tetanus toxaid receptors on early post-natal and adult mouse cerebellum // J. Neuroimmunol. 1981. - V.l. - P. 429-456.

353. Seiger A., Olson L. Quantitation of fiber growth in transplanted central monoamine neurons // Cell Tissue Res. 1977. - V.l79. - P. 285 - 316.

354. Selawry H.P., Wittington К. B. Extended allograft survival of islets grafted into intra-abdominally placed testis // Diabetes. 1984. - V.33. -N 4. - P.405-406.

355. Selawry H. P., Wang X., Allouch L. Sertoli cell-induced defects on functionsl and structural characteristics of isolated neonatal porcine islets // Cell Transplant. 1996. - V.5. - N 5. - P.517-524.

356. Shin D.H., Lee E., Kim H.J., Kim S., Cho S.S., Chang K.Y., Lee W.J. Fas ligand mRNA expression in the mouse central nervous system // J. Neuroimmunol. 2002. - V.123. - N 1-2. - P.50-57.

357. Shirai Y. Transplantation of rat sarcoma in adult heterogeneous animals //Jap.med.World. -1921. V.l. - P. 14-15.

358. Shumakov V.I., Ignatenko S.N., Blyumkin V.N. The principal results of pancreatic islet cell culture transplantation in diabetes mellitus patients // Transplant. Proc. 1987. - V. 19. - N 1. - P.2372.

359. Shumakov V.I., Ignatenko S.N., Skaletsky N.N. Treatment of diabetic polyneuropathy by allotransplantation of islet cell culture // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Vrnjacka Banja. -1987. - Abstr.39.

360. Shumakov V.I. The effect of clinical transplantation of fetal islet cell cultures on the late diabetic complications // Diabetes. 1989. - V.38. -Suppl.l.-P. 316.

361. Shumakov V.I., Bljumkin V.N. The problem of free pancreatic cell transplantation: the principal results, hypotheses // 4th Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Belgrade. - 1990. - P.22.

362. Simeonovich Ch.J., Bowen K.M., Kotlarsky I., Lafferty K.J. Modulation of tissue immunogenicity by organ culture // Transplantation. 1980. - N 3. - P. 174-179.

363. Slovesnova T.A., Glukhoded S.V, Skaletsky N.N., Ignatenko S.N. Course of proliferate diabetic retinopathy // Intern. Symp. "Transplantation of endocrine pancreas". Vrnjacka Banja. - 1987. - P. 40.

364. Snell G.D. The homograft rejection // Annu. Rev. Microbiol. -1957. -V.l 1. P.439-458,

365. Sobotka H., Luisado-Opper A. Alloxan in blood plasma before and after injection of glucose // Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 1954. - V.85. -N3.-P. 482-483.

366. Steinberg R.H., Milledr S. Aspect of electrolyte transport in frog pigment epithelium // Exp. eye research. 1973. - V.16. - N 2. - P. 365372.

367. Sunde N., Zimmer J. Cellular, histochemical and connective organization of the hippocampus and fascia dentata transplanted to different regions of immature and adult rat brains // Dev. Brain Res. -1983. V.8. -N2-3. -P.165 - 191.

368. Sutherland D.E.R. Pancreas and islet transplantation. Experimental studies // Diabetologia. 1981. - № 2. - P.l61-181.

369. Sutherland D.E.R. Is there a need for pancreas transplantation? // Transpl.Proc. 1993. - V.25. - № 1. - P.47-50.

370. Sutherland H.J., Hogge D.E., Eaves C.J. Growth factor regulation of the maintenance and differentiation of human long-term culture-initiating cells (LTC-IC)//Leukemia. 1993. - V.7. - Suppl 2. - S.122-S125

371. Tarricone B.J., Simon J.R., Li Y.J., Low W.C. Neural grafting of cholinergic neurons in the hippocampal formation // Behav. Brain Res. -1996.-V.74.-P.25- 44.

372. Thomas W.E. Brain macrophages: evaluation of microglia and their functions // Brain Res. Rev. 1992. - V. 17. - N 1. - P.61-74.

373. Thompson J.S., Robbins J., Cooper J.K. Nutrition and immune functionin the geriatric population // Clin. Geriatr. Med. 1987. - V.3. -P.309-317.

374. Thompson W.G. Successful brain grafting // N. Y. Med. J. 1890. -V.51.-P. 701-702.

375. Thomson N. M., Hancock W. M., Lafferty K. J. Organ culture reduces la-positive cells present within the human fetal pancreas // Transp. Proc. 1983. - V.15. - N 1. - Book 2. - P.1373-1376.

376. Tipson R., Ruben J. On the possible presence of alloxan in normal animal tisues an fluids // Arch.Biochem. 1945. - V.l. - N. 8. - P. 1-6.

377. Towita Т., Watanabe I. The effect of alloxan on the permeabity of isolated pancreatic islets to horseradich peraxidase // Virchows. Arch. -1976. Bd.22. - N 3. - S. 217-232.

378. Tzakis A., Ricordi C, Alejandro R. et al. Pancreatic islet transplantation after upper abdominal exenteration and liver replacement // Lancet. -1990.-V. 336. P.402-406.

379. Tze W.J., Tai J., Wong F.C. In vitro culture a method of pancreatic islet preservation for transplantation // Metab. Clin. Exp. 1980. - V.29. - N 11.-P. 1020-1025.

380. Tze W.J., Tai J. Successful inracerebral allotransplantation of purifed pancreatic endocrine cells in diabetic rat // J. Amer. Diet. Assoc. 1983. -V.32.-N 12.- P. 1185-1187.

381. Tze W.J., Tai J. Prolongation of islet allografts in non-immunosupressed rat recipients // Metab. 1983. - V.32. - № 3. - P. 228-231.

382. Tze W.J., Tai J. Intracerebral allotransplantation of purified pancreatic endocrine cells and pancreatic islet in diabetic rats // Transplantation. -Baltimore. 1984. - V.38. - N 2. - P. 107-111.

383. Tze W.J., Tai J. Allotransplantation of dispersed single pancreatic endocrine cells in diabetic rats // Diabetes. 1988. - V.37. - P.383-392.

384. Ugrumov M.V., Proshlyakova E.V., Sapronova A.Y., and Popov A.P. Development of the mesencephalic and diencephalic catecholaminergic systems in human fetuses: uptake and release of catecholamines in vitro //Neurosci. Lett. 1996. - V.212. - P.29.

385. Van Dooremaal J.C. De ontwikkeling van lovende weefsels op vreenden boden geent // Onderzoekimgen gedaan in het physiologisch laboratorium der utrechtsche hoogeschool. 1873. - V.3. - RII. - P. 277290.

386. Wahren J., Johansson B.L., Wallberg-Henriksson H. Does C-peptide have aphisiological role? // Diabetologia. 1994. - № 37. - Suppl 2. -P.99-107.

387. Wahren J. C-peptide revisited new physiological effects and therapeutic implications // Intern. Med. - 1996. - V.240. - N 3. - P.115 -124.

388. Wahren J. New aspects of Cpeptide phisiology // Hormon and metabol. res. 1998. -V.30.-N 1.-P.2-4

389. Walford R.L. The Immunological Theory of Aging // Copenhagen: Muksgaard. 1969. - 338 p.

390. Weber C., Weil R., Mc Intosh R., Hogle H., Warden G., Reemsma K. Xenotransplantation of piscine islet into hyperglycemic rats // Surgery. 1975. - V.77. - N 2. - P. 208-215.

391. Wexler В., Sangrey D. Good versus moderate regulation of alloxan-inducet diabetes in arterioscleroti and non-arteriosclerotic rats // Diabetologia. 1980. - V.19. - N.3. - P. 242-249

392. Whitmore W. F., Gittes R. F. Intratesticular grafts: the testis as an exceptional immunologically privileged site // Trans. Am. Assoc. GU Surgeons. 1979. - V.70. - P.76-80.

393. Winder H., Brundin P. Immunological aspect of grafting in the mammalian central nervous system. Arevien and speculative synthesis // Brain.Res.Rew. 1988. - V.13. - N 3. - P. 287-324.

394. Widner H. Immunological aspects of intracerebral CNS tissue transplantation // Basic and clinical aspects of neuroscience. 1993. -V.5. - P.63-74.

395. Zatz M.M., Goldstein A.L. Thymosins, lymphokines and the immunology of aging // Gerontology. 1985. - V.31. - P.263-277.

396. Zhao H., Sun X., Ding Q., Zhang Y. Experimental study of Sertoli cell and CTLA-4Ig's induction of immune tolerance of allogeneic renal cell // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2002. - V.40. - N 4. - P.259-64.

397. Ziegler A.G., Standi E. Typ-I-Diabetes mellitus: Immunopathogeneseund chancen einer primaren immunotherapie // Med. klin. 1987. - V.82. - P. 796-800.

Информация о работе

Архипова, Любовь Валентиновна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.13

Диссертация

Оценка функционального состояния животных при компенсации экспериментальных патологий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы