Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на индукцию защитных белков в поврежденном миокарде

Бабушкина, Инна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на индукцию защитных белков в поврежденном миокарде
ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на индукцию защитных белков в поврежденном миокарде"

На правах рукописи

Бабушкина Инна Викторовна

ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО КЛЕТОЧНОГО КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА НА ИНДУКЦИЮ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ В ПОВРЕЖДЕННОМ МИОКАРДЕ (экспериментальное исследование)

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Благовещенск - 2011

4851926

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» и Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН.

Научный руководитель доктор ветеринарных наук,

профессор Ильина Ольга Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Сиразиев Ромазаи Закарьянович

кандидат ветеринарных наук, доцент Курятова Елена Вячеславовна

Ведущая организация ФГОУ ВПО «Красноярский

государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится 14 июня 2011 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» в Институте ветеринарной медицины и зоотехники в аудитории 1(а) 5 корпуса по адресу: 675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДальГАУ.

Автореферат опубликован на официальном сайте ФГОУ ВПО ДальГАУ

www.dalgau.ru

Автореферат разослан /3 _2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Лерепелкина Л. И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Непрерывное нарастание в современном мире стрессовых воздействий на организм приводит к изменению функции сердца, состояние которой определяет здоровье и работоспособность как человека, так и животных (Пшеиникова М.Г., 2000; Меерсон Ф.З., 2001; Колесниченко И.С. с соавт., 2008; Никольская В.М., 2011), в связи с чем поиск новых способов защиты миокарда от ишемического повреждения остается актуальным на протяжении многих десятилетий.

В экспериментах на животных были продемонстрированы лечебные эффекты органоспецифической трансплантации клеток. Однако саногенетические механизмы влияния этого трансплантата исследованы недостаточно.

По данным литературы, известно, что клеточная органоспецифическая трансплантация ограничивает повреждение органов при стрессе (Репин B.C. с соавт., 1998; Сухих Г.Т., 1998; Берсенев A.B., 2003; Потапов И.В. с соавт., 2003; Онищенко H.A. с соавт., 2004). Обсуждаются разные теории механизмов действия клеточного трансплантата: трансдифференцировка, или слияние с клетками хозяина, мобилизация клеток-предшественниц, находящихся в самом миокарде, ангиогенез, стабилизация внеклеточного матрикса (Лазарев С.М. с соавт., 2007; Беленков Ю.Н. с соавт., 2008; Кругляков П.В. с соавт., 2008; Шумаков В.И. с соавт., 2009).

Кроме того, установлено, что одним из таких механизмов является стимуляция регенерации поврежденных тканей реципиента ростовыми факторами эмбриональных и неонатальных органоспецифических клеток, среди которых наиболее изученными являются фактор роста гепатоцитов и фактор роста эндотелия сосудов (Шваб О.В. с соавт., 1998; Lee M.S. et al., 2004; Рунович А. А. с соавт., 2005; Лепехова С.А., 2009; Liu К.Х. et al., 2009). С другой стороны, известно, что трансплантация ксеногенных клеток сердца сопровождалась опережающим приростом внутриклеточных стресс-белков в поврежденном органе (Рунович A.A. с соавт., 2005; Бадуев Б.К. с соавт., 2009).

Существует предположение, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате

белков с шаперонной активностью. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд исследований, который демонстрирует способность БТШ70 проникать через модельные мембраны (Negulyaev Y.A. et al., 1996; Harada Y. et al., 2007). Экзогенные БТШ участвуют в целом ряде важных регуляторных каскадов в организме и выполняют сигнальные функции (Evdonin A.L. et al., 2006; Calderwood S.K. et a!., 2007; Евдонин A.JT. с соавт., 2009; Pockley А.С. et al., 2009). В ряде работ был выявлен защитный эффект экзогенных белков теплового шока (Guzhova I.V. et al., 1998; Novoselova T.V. et al., 2005). Кроме того, в работе С.А. Афанасьева было показано, что интрамиокардиальная трансплантация модифицированных мезенхимальных стволовых клеток с повышенным пулом БТ11170 и БТШ60 оказывала положительный эффект при постинфарктном ремоделировании за счет увеличения количества выживших клеток трансплантата (Афанасьев С.А. с соавт., 2008).

Мы предполагаем, что белки теплового шока, содержащиеся в клеточном трансплантате, могут являться важными агентами, определяющими восстановление функций поврежденного органа.

Однако не исключается и другой вариант: специфическая активация собственной системы синтеза стрессовых белков трансплантируемыми клетками или выделяемыми ими агентами.

В связи с этим целью исследования явилось изучение влияния модифицированного клеточного трансплантата с разным уровнем БТШ для выяснения их роли в механизмах защиты поврежденного сердца.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Исследовать разные способы модификации клеточного трансплантата, оказывающие влияние на содержание БТШ в суспензиях клеток сердца неона-тального кролика in vitro.

2. Изучить влияние трансплантации суспензий неонатальных клеток сердца с низким и высоким уровнем БТШ на динамику развития патологического процесса в сердце и содержание стресс-белков в поврежденном миокарде.

3. Изучить особенности течения адреналинового повреждения миокарда у экспериментальных животных при трансплантации суспензий неонатальных клеток сердца в условиях системной блокады белкового синтеза при помощи циклогексимида.

Научная новизна

Показано, что добавление ампициллина в дозе 0,003 мг/мл в среду инкубации суспензий неонатальных клеток сердца приводит к снижению базового уровня белков теплового шока в клетках.

опытами в контрольной группе и экспериментами с использованием немодици-фированного трансплантата.

Сниженное содержание белков теплового шока в трансплантате сопровождается значимым падением уровня БТШ70 в поврежденном миокарде экспериментальных животных по сравнению с другими исследуемыми группами.

Введение трансплантата с повышенным содержанием БТШ обеспечивает более значительную защиту миокарда от повреждения, что проявляется в виде сохраненной активности ЛДГ-1 и КК и меньшим некротическим поражением миокарда.

В условиях предварительного системного подавления белкового синтеза путем введения циклогексимида трансплантация немодифицированных неона-тальных клеток сердца сопровождается более ранним восстановлением продукции БТШ и ограничением деструктивных процессов в миокарде, наблюдаемых в модельных экспериментах в этих условиях.

Теоретическая н практическая значимость работы

Клеточный трансплантат с разным уровнем метаболической активности, отражением которого может быть содержание белков теплового шока, оказывает различное по своей выраженности влияние на один и тот же патологический процесс в организме реципиента. Трансплантат с заведомо высоким уровнем белков теплового шока оказывает более выраженный протекторный эффект, чем трансплантат с низким уровнем данных белков.

При разной исходной реактивности миокарда один и тот же трансплантат оказывает различное действие на защитные внутриклеточные стресс-белки и ферменты, но обеспечивают одинаковый характер выраженности воспалительного процесса, что свидетельствует о том, что кроме белков теплового шока, в клеточном трансплантате имеются другие вещества, оказывающие протекторный эффект.

Это свойство органоспецифического трансплантата, имеющего разный уровень метаболической активности, может быть использовано в экспериментальной практике на различных моделях повреждения органов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инкубация суспензий клеток сердца при 42 °С повышает содержание белков теплового шока, а добавление в среду инкубации антибиотика снижает содержание этого белка.

2. Введение модифицированного трансплантата с повышенным содержанием БТШ приводит к существенному увеличению уровня общего пула БТШ70, большей сохранности активности ферментов и меньшему повреждению миокарда у экспериментальных животных. Эти явления отмечались как при сравнении результатов трансплантации немодифицированных суспензий клеток сердца, так и в опытах без трансплантации. Трансплантация суспен-

зий клеток сердца с пониженным содержанием БТШ70 отличалась от групп сравнения только падением уровня стресс-белков в миокарде. 3. В условиях исходно подавленного белкового синтеза трансплантация немо-дифицированных клеток у экспериментальных животных с повреждением сердца обеспечивает более ранний подъем уровня БТШ в миокарде и меньшее повреждение в данной группе, в сравнении с опытами, проведенными в тех же условиях без трансплантации.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на II съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007); III международной конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки—медицине» и научно-практической конференции «Новые материалы и методы для медицины» (Новосибирск, 2008); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); II научно-практической конференции молодых ученых Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (Иркутск, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание методов исследования и общей характеристики эксперимента, две главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и указателя литературы; иллюстрирована 22 таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы включает 116 работ отечественных и 72 - зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» и Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН.

В соответствии с решаемыми задачами работа состояла из двух этапов: модификация суспензий клеток сердца неонатального кролика и экспериментальные исследования на животных. Модификация клеточного трансплантата осуществлялась путем воздействия на неонатальные клетки сердца высокой температуры или добавления в среду инкубации ампициллина в дозе 0.003 мг/мл среды инкубации.

Эксперименты проведены на 197 беспородных белых крысах-самцах массой тела 180—250 г в осенне-зимний период. Возраст животных был не менее 6 месяцев. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище соответственно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ», все документы, регламентирующие работу вивария, имелись на протяжении всего времени исследования (виварий I категории, вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г., служба ветеринарии Иркутской области).

Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных», а также основывались на положениях Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

При проведении первой части эксперимента мы решали следующую задачу: изучить влияние ксенотрансплантата с низким и высоким уровнем БТШ на динамику развития патологического процесса в сердце и содержание стресс-белков в поврежденном миокарде. Распределение животных на группы в зависимости от характера воздействия представлено в таблице 1.

Контрольной группой исследования являлась группа адреналинового повреждения миокарда (КГА). По методике Грабара - Ольха - Бледиса (1961) крысам подкожно вводили БоМо АёгепаПгп 1пус1гоЫог1сИ 0,1%рго муесИотЬия из расчета 0,5 мл 0,1% раствора однократно в область правого бедра. Через 10 минут после инъекции адреналина подкожно в область левого бедра вводили физиологический раствор в объёме 0,5 мл.

Экспериментальным животным, которые вошли в опытные группы (ОГ), также моделировали адреналиновое повреждение миокарда и через 10 минут после инъекции адреналина подкожно в область левого бедра вводили неонатальные клеточные суспензии сердца кролика (скс) в дозе 500 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора: немодифицированные скс (ОГнк), скс инкубированные 3 часа при 37 °С (ОГ,7), скс инкубированные 1,5 часа при 42 "С, затем еще 1,5 часа при 37 °С (ОГ42), скс инкубированные 1,5 часа при 37 °С с добавлением ампициллина в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации (ОГАМП).

Таблица 1 - Дизайн эксперимента

Воздействие на животных Обозначение групп п

1 часть эксперимента

Адреналиновое повреждение миокарда Немодифицированные суспензии клеток сердца (СКС) ОГнк 17

СКС 3 часа при 37 °С ог37 18

СКС 1,5 часа при 42 °С, затем еще 1,5 часа при 37 "С ОГ42 17

СКС 1,5 часа при 37 "С с ампициллином в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации ОГ/щп 18

Сроки выведения из эксперимента: 1-е и 3-е сутки

II часть эксперимента

Предварительное подавление синтеза белка - ОГц 25

Адреналиновое повреждение миокарда - ОГца 30

Трансплантация немодифицированных СКС ОГцдт 33

Сроки выведения из эксперимента: через 8 ч, 16 ч, 1 и 3 суток

Контроль

Адреналиновое повреждение миокарда КГА 33

Интактные животные 6

Во второй части экспериментальной работы исследуемые параметры изучались на фоне блокады белкового синтеза, что позволит изучить влияние ксено-трансплатггации на индукцию внутриклеточных механизмов защиты на фоне исходно подавленного синтеза белков в поврежденном органе. Во всех случаях использовалась модель адреналинового повреждения миокарда. Для подавления синтеза белка, как было уже сказано выше, животным за 3 ч до введения адреналина проводилась однократная внутрибрюшинная инъекция циклогексимида в дозе 0,15 мг/100 г веса животного.

Животным ОГцЛ подкожно вводился адреналин на фоне предварительной блокады синтеза белка, ОГцлт - подкожное введение адреналина и суспензии неонаталь-ных клеток сердца в тех же условиях, т.е. на фоне подавленного синтеза белка.

Циклогексимид в используемой дозе вводился здоровым животным (ОГц) Группа животных, которая была выведена через 3 часа после инъекции циклогексимида, являлась исходной точкой данного этапа исследования.

Выведение животных из эксперимента в условиях стандартной модели повреждения миокарда осуществлялось через 24 и 72 часа (ОГнк, ОГ37, ОГ42, ОГдмп), при исследованиях на фоне подавленного синтеза белка — через 8,16,24 и 72 часа после введения адреналина (КГД, ОГц, ОГЦА, ОГцАТ).

Метод получения суспензий неонатальных клеток сердца

Суспензии клеток получали из сердца новорожденных кроликов (1-2 суток от момента рождения) по методике А.Б. Борисова (1988). Сердце перед извлечением перфузировали бескальциевым раствором Кребса-Рингера с добавлением 0,1% коллагеназы (тип I, Worthington), 0,1 % гиалуронидазы и 1% бычьего сывороточного альбумина. Препарированный орган фрагментировали и ресуспендировали в растворе ферментов 0,1% коллагеназы и 0,1% гиалуронидазы.

Полученную клеточную суспензию сердца оценивали на жизнеспособность (витальность) по окраске трипановым синим в камере Горяева. Оставшуюся суспензию подвергали центрифугированию, ресуспендировали в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Германия) и инкубировали в чашках Петри в СО,-инкубаторе фирмы «Forma Scientific» (США). При этом применяли различные режимы инкубации в зависимости от поставленных задач.

Уровень БТШ70 и БТШ72 определяли в суспензиях клеток сердца контрольных серий эксперимента: в немодифицированных суспензиях клеток сердца (НСКС) и в суспензиях клеток сердца, инкубированных 3 часа при 37 °С (СКС„) (данная серия эксперимента введена в качестве температурного контроля).

Также был определен уровень данных стресс-белков в суспензиях клеток сердца, подвергнутых температурной модификации: при инкубации суспензий клеток сердца в течение 1.5 часов при 42 °С (СКС41) и при инкубации суспензий клеток сердца в течение 1,5 часов при 42 °С, а затем при дальнейшей инкубации 1,5 часа при 37 °С (СКСШ7). В качестве второго модифицирующего воздействия мы использовали антибиотик -суспензии неонатальных клеток сердца инкубировали с ампициллином в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации в течение 1,5 часов при 37 °С (СКСДМП).

Перед проведением процедуры трансплантации производилась отмывка суспензии клеток сердца от культуральной среды раствором 0,9% NaCI и осуществлялась дополнительная оценка жизнеспособности клеток сердца. На этом этапе витальность клеточного трансплантата составляла 60 % (количество целых клеток). Количество клеток в инъецированной дозе определялось из расчета 2,5 х 105 кл/кг веса животного.

Биохимические исследования

В сердечной ткани экспериментальных животных изучали содержание общего пула цитозольных белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (включает БТШ72 и БТШ73 - индуцибельную и конститутивную формы БТШ70), индуцибельную форму БТШ72, активность креатинкиназы (КК) и лактатдегидрогеназы 1-го типа (ЛДГ-1), содержание пирувата и лактата.

Содержание БТШ70 и БТШ72 определялось с использованием электрофореза по метод)' Лэммли (Laemmli, 1970) с помощью прибора Mini-PROTEAN II («Bio-Rad», США), согласно инструкции производителя, для чего суммарный белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану (иммуноблоттинг) и в последующем для выявления БТШ70 и БТШ72 применяли первичные антитела («Sigma» и «StressGen») на

консервативную для белков этого семейства последовательность. Для последующей детекции этих антител применяли вторичные антитела (Sigma), конъюгированные с щелочной фосфатазой, и окрашивали мембраны в растворе ВС1Р/ NBT.

Полуколичественный анализ содержания белка на мембранах проводили с помощью программы Gel Analysis (Россия). Для определения достоверной картины изменения уровня содержания БТШ рассчитывался коэффициент изменения интенсивности окраски (у.е.), определяющий, во сколько раз интенсивность окраски белкового пятна в опытном варианте больше средней интенсивности окраски пятна контрольного варианта. При определении содержания БТШ70 и БТШ72 в неонатальных клетках сердца использовали среднюю интенсивность пятен белка в нативных клетках сердца (БТШ70 - 0,98 (0,93-1,06); БТШ72 - 0,96 (0,93-1,07)). Для аналогичного расчета в тканях сердца крыс опытных групп в качестве контроля использовали среднюю интенсивность окраски белковых пятен у интактных животных (БТШ70- 1,00 (0,98-1,02); БТШ72- 1,04 (0,65-1,30)).

Активность ферментов КК, ЛДГ-1 оценивали кинетическими экспресс-методами на спектрофотометре ROKI («Ольвекс», Россия) с помощью готовых наборов реактивов (P.Z. CORMAY (Польша, Германия) и Biocon Diagnostik (Германия)) по методикам, рекомендованным Немецким обществом клинической химии (Oliver I.T., 1955; Wroblewski F. et al., 1955). Содержание пирувата определяли по Умбрайту (Камышников B.C., 2004), содержание лактата определяли с помощью стандартных наборов реактивов «Biocon» (Германия) (Bablok W. et al., 1988).

Морфологическое исследование

Для изучения морфометрических показателей использовали стандартные серийные срезы миокарда левого желудочка, перпендикулярные продольной оси сердца, с помощью видеосистемы «Quantimet 5501W» фирмы «Leica QWinl6» и программного пакета «Leica QWinlö».

Для контроля морфометрических изменений в сердце рассчитывались: сосудистый индекс (рассчитывали в 10 срезах, исходя из средней суммарной площади просвета сосудов - S среза 10000 мкм2); клеточный индекс (рассчитывали в 10 срезах, исходя из среднего суммарного количества клеток инфильтрата при той же площади одного среза); площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 10 срезов) и площадь некроза (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 10 срезов)..

Методы статистической обработки результатов

Полученные данные в сравниваемых группах анализировали непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна - Уитни и критерия Крускала - Уоллиса, коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при р < 0,05. Данные представляли в виде медианы с верхним и нижним квартилями (25-й и 75-й процентили). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью статистического пакета программ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Содержание белков теплового шока в суспензиях неонатальных клеток сердца при их модификации

Основной задачей, которую мы решали на данном этапе исследований, была оценка различных способов модификации, оказывающих влияние на содержание белков теплового шока в суспензии клеток сердца неонатального кролика.

С нашей точки зрения, модификация клеточного трансплантата позволит использовать суспензии клеток сердца с разным содержанием белков теплового шока в эксперименте in vivo и в ходе дальнейшего исследования ответить на вопрос о том, влияет ли содержание стресс-белков в трансплантате на механизмы защиты поврежденного сердца. В связи с этим было проведено исследование влияния различных температурных режимов и инкубации с добавлением антибиотика на содержание БТШ70 в суспензиях клеток сердца новорожденных кроликов.

Анализ содержания цитозольного пула БТШ70 (включающего конститутивную и индуцибельную формы) в суспензиях клеток контрольных серии экспериментов показал, что количество данных белков не отличалось между собой и составляло 0,98 и 1,04 у.е. соответственно (табл. 2).

Таблица 2 - Содержание БТШ70 в суспензиях неонатальных клегок сердца при температурной модификации и добавлении в среду инкубации антибиотика

Серии экспериментов Вид модификации п Содержание БТШ70 (у. е.)

1 Контроль НСКС 6 0,98(0,93-1,06)

2 СКС37 6 1,04 (0,99-1,06)

3 Температурная модификация СКС42 6 2,04к;* (2,01-2,06)

4 СКС4237 6 1,98к;* (1,95-2,05)

5 Воздействие антибиотиком СКСамп 6 0,40К;* (0,35-0,46)

Примечание: к - р < 0,05 - в сравнении с 1-й серией экспериментов; * -р < 0,05 - в сравнении со 2-й серией экспериментов (по критерию Манна - Уитни); НСКС - немодифицированные суспензии клеток сердца; СКСу - суспензии клеток сердца инкубированные 3 часа при 37 'С; СКС42 - суспензии клеток сердца инкубированные в течение 1,5 часов при 42 'С; СКС4237 - суспензии клеток сердца инкубированные в течение 1,5 часов при 42 'С, а затем 1,5 часа при 37 'С; СКСАМП - суспензии клеток сердца инкубированные с добавлением ампициллина. Далее обозначения групп те же.

В суспензиях клеток сердца, подвергнутых температурной модификации, наблюдалось достоверное увеличение уровня БТШ70 практически в два раза в сравнении с базовым уровнем в клетках контрольных серий экспериментов.

Напротив, добавление в среду инкубации суспензий клеток сердца сопровождалась значительным снижением уровня БТШ70 в сравнении с контролем (табл. 2).

Как видно из таблицы 3, уровень индуцибельной формы БТШ70 (БТШ72) был достоверно выше в первой серии в немодифицированных суспензиях клеток сердца (0,96 у.е.), в сравнении с суспензиями клеток сердца, инкубированными при 37 °С (0,64 у.е.).

Максимальное содержание БТШ72 обнаружено в суспензиях клеток сердца, подвергнутых дозированному тепловому воздействию. При этом в клетках четвертой серии экспериментов уровень БТШ72 повышался наиболее значимо и составлял 1,95 у.е.

Уровень данных стресс-белков в суспензиях клеток сердца, инкубированных с антибиотиком, был также значительно ниже, чем в контроле (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание БТШ72 в суспензиях неонатальных клеток сердца при температурной модификации и добавлении в среду инкубации антибиотика

Серии экспериментов Вид модификации п Содержание БТШ72 (У- е.)

1 Контроль НСКС 6 0,96 (0,93-1,07)

2 СКС37 6 0,64k (0,49-0,80)

3 Температурная модификация СКС42 6 1,31k:* (1,03-1,34)

4 СКС4237 6 1,95k;* (1,87-2,06)

5 Воздействие антибиотиком СКСдмп 6 0,23k;* (0,15-0,29)

Примечание: к-р< 0,05 -в сравнении с 1 -й серией экспериментов; *-р< 0,05в сравнении со 2-й серией экспериментов (по критерию Манна -Уитни).

Таким образом, инкубация суспензий клеток сердца при высокой температуре или в присутствии ампициллина позволяет направленно изменять содержание стресс-белков в клетках. Полученные данные позволили дифференциально подойти к решению второй задачи и использовать в дальнейших экспериментах /« vivo клеточные трансплантаты с повышенным, пониженным и базовым уровнями белков теплового шока.

3.2. Влияние модифицированного клеточного трансплантата на механизмы защиты миокарда при повреждении

Существующие литературные данные, свидетельствующие о защитной роли белков теплового шока, как на культурах клеток, так и в эксперименте, и данные о высоком базовом содержании этих белков в суспензиях неонатальных клеток сердца позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате белков с шаперонной активностью.

В эксперименте на модели адреналинового повреждения миокарда мы провели исследование модифицированных клеточных суспензий сердца с повышенным, пониженным и базовым содержанием белков теплового шока.

Исследование содержания эндогенного уровня БТШ70 в миокарде опытных животных показало, что максимальное значение фиксировалось к первым суткам наблюдения в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, в сравнении как с контролем, так и с животными с трансплантацией немодифицированных клеток (рис. 1).

К третьим суткам наблюдалось достоверное снижение БТШ70 во всех группах по сравнению с группой контроля. Однако самый низкий уровень БТШ70 был выявлен у экспериментальных животных с трансплантацией клеток, модифицированных нагреванием. По-видимому, необходимость в большой продукции стресс-белков в этой группе утрачивалась в связи с тем, что они выполнили свою защитную функцию.

Напротив, в миокарде животных с введением клеток, инкубированных с ампициллином (ОГдмп), уровень БТШ70 был значимо ниже, чем в контроле (КГД), и составлял 2,89 (2,79-2,95) у.е. (р < 0,05). Возможно, добавление в среду инкубации суспензий клеток сердца ампициллина приводит к накоплению регуляторных пептидов, оказывающих влияние на снижение эндогенного уровня БТШ70. Однако механизм данного явления не ясен и требует дальнейшего изучения.

1.8 2.0 2.2 2,4 2.8 2.6 5.0 3.2 3.4 3.6 Э.е 4,0 5 4 5 в 7 8 9 10 II

1. е. У-«.

Рис. 1 - Содержание БТШ70 (а) и БТШ72 (б) в миокарде крыс в условиях трансплантации модифицированных суспензий клеток сердца.

В контрольной точке трое суток содержание данного белка в исследуемой группе не отличалось от группы с трансплантацией немодифицированных клеток.

Содержание БТШ72 в группах с трансплантацией клеток на первые сутки ниже по сравнению с контролем. Тем не менее, сравнительный анализ показал, что в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, содержание БТШ72 на первые сутки было выше, чем в группах с базовым и пониженным уровнями БТШ (рис. 1). К третьим суткам содержание этих белков во всех группах с трансплантацией ниже, чем в контроле. При этом в группе с введением клеток с повышенным уровнем БТШ уровень эндогенных индуцибельных стресс-белков был минимальным и составлял 3,82 у.е. (ри<0,05).

Как видно га таблицы 4, во всех группах с трансплантацией клеточного материала активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы-1 в миокарде была достоверно выше, чем в группе контроля (адреналиновое повреждение миокарда) (р < 0,05).

Таблица 4 — Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на активность лактатдегидрогеназы-1 и креатинкиназы (мкмоль/мг белка в мин)

в миокарде крыс

Группы животных Лактатдегидрогеназа-1 Креатинкиназа

1-е сутки 3-й сутки 1-е сутки 3-й сутки

Интактные животные 5,86 (5,82-5,90) 17,16(17,05-17,25)

КГА 4,01 0 (3,76-4,16) 4,28 0 (4,21-4,57) 13,59" (13,25-13,78) 12,99" (12,63-13,40)

ОГнк 5,11 к;и (5,02-5,40) 4.42" (4,23-4,63) 16,33к;и (16,06-16,59) 14,90" " (14,66-15,33)

ОГ37 4,54 и;к;* (4.49-4,91) 4,89 и;к;* (4,59-5,00) 16,39 и;К (16,05-16,65) 16,69 ";к;* (16,32-16,90)

ОГ42 5.56 к:*:м (5,43-5,84) 5,69 к:*;м (5,51-5,81) 15,44 *' " (15,36-16,16) 17,04к; (16,62-17,11)

ОГдмп 5,06 к;м'" (4,88-5,46) 4,84к;и (4,69-4,97) 16,28К;и (16,11-16,35) 14,78к; (14,73-15,08)

Примечание: КГД - группа с адреналиновым повреждением миокарда; ОГнк -трансплантация немодифицированных суспензий клеток сердца; ОГ42 - трансплантация суспензий клеток сердца с повышенным содержанием БТШ; ОГдмп - трансплантация суспензий клеток сердца с пониженным содержанием БТШ; к-р< 0,05 в сравнении с группой КГД; * -р < 0,05 в сравнении с группой ОГнк;^ -р < 0,05 в сравнении с ОГ37;0 - р < 0,05 в сравнении с группой «интактные животные» (по критерию Манна - Уитни).

Самая высокая активность КК и ЛДГ, наблюдалась в группе с температурной модификацией, что свидетельствовало о большей сохранности активности этих ферментов у экспериментальных животных (табл. 4). В то же время в условиях

трансплантации клеток, инкубированных с ампициллином, и в группе с трансплантацией ^модифицированных клеток активность данных ферментов не имела существенных различий.

В группе контроля отмечалась наибольшая степень повреждения миокарда, о чем свидетельствовали выраженная клеточная инфильтрация, увеличение сосудистого индекса, отека миокардиальных волокон и площадь некроза. В первые сутки эксперимента в данной группе отмечались острые расстройства кровообращения в виде полнокровия сосудов, небольшие группы кардиомиоци-тов были с признаками некроза, отмечались очаговая фрагментация клеток, выраженная очаговая эозинофилия цитоплазмы, очагово - «тени» или отсутствие ядер. Площадь зон некроза составила 563,24 (493,14-626,35) мкм2. Некроз в миокарде левого желудочка носил более распространенный характер. Клеточный индекс составлял 41,67 (32,94-69.28) у.е., при этом количество нейтрофилов в воспалительном клеточном инфильтрате преобладало над мононуклеарным компонентом.

У животных через трое суток после введения адреналина степень расстройства кровообращения в сравнении с предыдущим сроком не отличалась. Гемодинамические расстройства носили преимущественно перифокальный характер вокруг множественных зон некроза и заключались в расширении капилляров, венозном и капиллярном полнокровии и точечных очаговых кровоизлияниях. Среди клеток инфильтрата также преобладают нейтро-филы, значительную часть по-прежнему составляют мононуклеарные клеточные элементы - лимфоциты и макрофаги. Площадь сформированных некрозов контрактурного и цитолизного типа составила 2115,59 (2054,342205,18) мкм2.

Развитие адреналинового повреждения у животных, которым введение адреналина сочеталось с трансплантацией неонатальных кардиомиоцитов, по своему качеству мало чем отличалось от результатов в контрольной группе. Однако интенсивность воспаления при трансплантации была значительна меньше.

Важно отметить, что в группе с трансплантацией клеточных суспензий сердца, модифицированных высокой температурой, наблюдался меньший отек миокардиальных волокон в сравнении с группой контроля (р < 0,05). Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов в данной группе в первые сутки эксперимента составляла 286,25 (225,55-319,09) мкм2, в третьи сутки-303,99 (260,82-314,51) мкм2, в группе контроля в исследуемые сроки - 381,56 (314,20^10,02) мкм2 и 410,20 (326,35^136,17) мкм2 соответственно.

Следует отметить, что площадь очагов некроза в миокарде у животных при введении им клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока при повреждении миокарда была в 1,27 раза ниже, чем в контрольной группе, и в 1,15 раза ниже, чем в группе с трансплантацией немодифицированных клеток (р < 0,05) (рис. 2).

кг* Г....... ■ Я

ОГик 0 ЯШ

ОГзг 0 1

ОГн ИЗ ШШтШШ 1 суш 3 сутки

ОГмй Г?.....п ■ •

400 600 1600 1800 2000 2200 ЫКМ1

Рис. 2 - Площадь некроза в миокарде экспериментальных животных при трансплантации модифицированных суспензий клеток сердца.

Степень повреждения миокарда в условиях трансплантации клеток, инкубированных с ампициллином, и в группе с трансплантацией немодифицированных клеток не имела существенных различий.

Таким образом, трансплантация суспензий клеток сердца с повышенным уровнем белков теплового шока экспериментальным животным оказывала больший протекторный эффект в сравнении с трансплантацией клеток с базовым содержанием данных белков и сопровождалась значимым повышением эндогенного пула цитозольных БТИ.170.

Мы предполагаем, что своевременное повышение уровня этих защитных белков способствовало более эффективной защите миокарда от повреждения, что проявлялось в большей сохранности ферментной системы миокарда, отвечающей за энергообеспечение миокарда, и ограничении площади очагов некроза.

Напротив, сниженное содержание белков теплового шока в трансплантате сопровождалось значимым падением уровня БТШ70 в поврежденном миокарде, по сравнению с опытами на животных с трансплантацией суспензий клеток сердца с повышенным и базовым содержанием БТШ и контрольными опытами. Тем не менее, показатели, характеризующие повреждение сердечной мышцы свидетельствуют о том, что снижение содержания БТШ в клетках трансплантата уменьшает, но не снимает полностью положительный эффект трансплантации клеток. Следовательно, в реализации защитных механизмов трансплантации суспензий сердечных клеток важную роль играют и другие механизмы, кроме экзогенных белков теплового шока. Для выяснения этого механизма необходимо исследование содержания в суспензиях клеток сердца веществ белковой природы, оказывающих регуляторное воздействие на поврежденный орган.

3.3. Трансплантация суспензий клеток сердца меонатального кролика при повреждении сердца в условиях заблокированных внутриклеточных механизмов защиты миокарда

Чтобы выяснить, какую роль в защите клеток поврежденного органа играют внутриклеточные защитные механизмы миокарда и экзогенные БТШ трансплантата, было важно отделить влияние этих двух механизмов. На данном этапе исследования было важно оценить влияние клеточного трансплантата на внутриклеточные механизмы защиты поврежденного органа в условиях системного подавления белкового синтеза в миокарде.

В миокарде животных опытной группы с подавленным синтезом белка (ОГц) содержание стресс-белков было ниже, чем у интактных животных в первые часы эксперимента (р < 0,05) (рис. 3). Самый низкий уровень БТШ70 наблюдался к 3 часам наблюдения и составлял 0,89 (0,88-0,90) у.е., у интактных животных уровень БТШ70 составлял 1,00 (0,98-1,02) у.е.

у.е.

1.14

1.10

1.06

1.02

0.98 0,04

О.вО

а, а®

Рис. 3 - Содержание БТШ70 в миокарде здоровых животных с подавленным синтезом белка.

Точка 3-го часа являлась исходной в нашем исследовании, поскольку в других опытных группах моделирование повреждения миокарда и ксенотрансплантация суспензий клеток сердца проводилась на фоне подавленного белкового синтеза.

Через 8 часов от исходной точки в миокарде животных данной группы содержание БТ1И70 не изменилось и было ниже уровня стресс-белков у интактных животных, восстановление уровня БТШ70 произошло к 16 часам эксперимента и имело тенденцию к увеличению в последующие сроки исследования.

Предварительное подавление белкового синтеза с помощью циклогексимида у животных с адреналиновым повреждением миокарда существенно ухудшало течение данного процесса. Об этом свидетельствовали еще более низкий

коэффициент отношения пируваг/лактат и существенно менее выраженная активность ферментов ЛДГ1 и КК в миокарде во все сроки исследования, чем в контроле (адреналиновое, повреждение миокарда) (р < 0,05) (рис. 4, 5).

Т-.

.............."""......

.......

О КГл

-» ОГц» «•«Ар

0, 0,12

0.06 0,64 £1,82

■О

♦ «Ж» >8»К лог» *">«*

•Фг

-I

Рис. 4-Динамика активности ЛДГ-1 (а) и соотношения пируват/лактат в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка: КГД - адреналиновое повреждение миокарда; ОГцд - адреналиновое повреждение миокарда в условиях подавленного синтеза белка; ОГцдт - трансплантация суспензий немодифицированных клеток сердца при повреждении миокарда в условиях подавленного синтеза белка. Далее обозначения групп те же.

-О КГ* ^шшныснзадеть«? ■* ОГш «.ЯНГШИШ) •■¿х- ОГтт

"Т

I часое 16 часов 24 часа 72 часа

Рис. 5 - Динамика активности КК в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка.

В то же время трансплантация неонатальных клеток сердца животным на фоне предварительного подавления синтеза белка оказывала иной эффект. В

этом случае выявлялась более высокая активность ферментов ЛДГ1 и КК в миокарде к 16 часам в сравнении с вышеуказанными группами (рис. 4, 5). В последующие сроки активность ферментов была ниже, чем в контроле, но выше, чем в аналогичной группе без трансплантации.

Кроме того, в миокарде животных с повреждением миокарда, как и следовало ожидать, циютогексимид блокировал синтез белков теплового шока, о чем свидетельствуют данные, приведенные на рисунке 6. На всех контрольных точках исследования уровень содержания стресс-белков в данной группе значимо ниже, чем в контроле. При трансплантации суспензий клеток сердца к 16 часам наблюдался больший уровень содержания БТШ70 в сравнении с аналогичной группой без трансплантации (р < 0,05) (рис. 6), что свидетельствует о более ранней индукции защитных механизмов в миокаопе животных этой гпуппы.

у.е.

5,2

2,4

2.0

1,2

0,8

0,4

черазчжяпошг 8 часов 16 часов 24 часа 72 часа

&ведешя цщжтиундэ

Рис. 6 - Содержание БТШ70 в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка.

Установлено, что предварительное подавление синтеза белка приводило к более выраженному повреждающему действию адреналина на миокард, о чем свидетельствовали морфологические изменения в миокарде (рис. 7).

Так, площадь очагов некроза к 16 часам была значимо выше, а в последующие сроки имелась тенденция к дальнейшему увеличению некротического повреждения, которое к 72 часам сопровождалось существенно выраженным отеком миокардиальных волокон в сравнении с группой животных с адреналиновым повреждением миокарда (р < 0.05).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях предварительного подавления синтеза белка в клетках сердца введение адреналина сопровождалось значительным ухудшением патологического процесса в миокарде.

Важно отметить, что у экспериментальных животных с трансплантацией клеток определялись меньшие площадь повреждения и отек миокардиальных волокон, чем в сравниваемых группах (рис. 7). Наиболее существенно эти эффекты проявлялись через 72 часа от начала эксперимента, в этот срок площадь некроза в миокарде была на 15,4 %, а отек миокардиальных волокон - на 27,4% ниже, чем в группе без трансплантации (р < 0,05).

о «Г.

* ОГц. т *

"V öfbir _ ^ ' •

...................... / X

1 ■■■■ Ж 24ЧЙСЙ ''I чг^ j

Рис. 7 - Динамика изменения площади кардиомиоцитов (а) и площади очагов некроза (б) в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка.

Таким образом, трансплантация ^модифицированных суспензий клеток сердца в условиях предварительного подавления белка сопровождалась более ранним восстановлением содержания БТШ70 (к 16-му часу эксперимента) до значений у интактных животных. Также при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного белкового синтеза отмечались меньшая площадь некрозов и отек миокардиальных волокон, более сохранная активность ЛДГ1, в сравнении с группой без трансплантации.

ВЫВОДЫ

1. Инкубация суспензий клеток сердца иеонатального кролика при повышенной температуре (42 °С) позволяет повысить уровень БТШ70 и БТШ72 в 2 раза. Инкубация суспензии клеток сердца с добавлением в питательную среду антибиотика (Ampicillin) снижает уровень БТШ70 и БТШ72 в 2,5 и 4,2 раза соответственно, по сравнению с базовым содержанием изучаемых белков.

2. Применение трансплантата с повышенным содержанием уровня БТШ (температурная модификация) снизило площадь очагов некроза в среднем на 10 % в сравнении с ^модифицированным трансплантатом и опытами с введением клеток сердца с пониженным содержанием БТШ (модификация ампициллином) через трое суток от начала эксперимента. Кроме того, в опытах с температурной модификацией трансплантата отмечался меньший отек кардиомиоцитов в сравнении с адреналиновым повреждением миокарда (на 34,9 %; р < 0,05).

3. Полученный кардиопротекторный эффект в группе с трансплантацией сердечных клеток с температурной модификацией был связан с более высоким уровнем накопления БТШ70 в миокарде животных через сутки от начала эксперимента, чем в других группах (в группе с температурной модификацией уровень БТШ70 составил 3,68 (3,58-3,75) у.е., в группе с базовым содержанием стресс-белков-3,52 (3,41-3,57) у. е., с пониженным - 2,89 (2,79-2,95) у.е. (р < 0,05)).

4. В группе с трансплантацией клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока течение патологического процесса в сердце сопровождалось более высокой активностью ферментов в миокарде на третьи сутки: активность ЛДГ1 была выше в сравнении с группами с базовым и пониженным содержанием белков теплового шока на 1,27 и на 0,85 мкмоль/мг белка в мин; активность КК была выше на 2,14 и 2,26 мкмоль/мг белка в мин, чем у отмеченных групп (р < 0,05), и восстановлением соотношения пируват/лактат до нормальных значений, что не наблюдалось в сравниваемых группах.

5. Трансплантация ^модифицированных суспензий клеток сердца в условиях предварительного подавления белкового синтеза (циклогексимид) у животных при повреждении сердца сопровождалась менее выраженной альтерацией миокарда к третьим суткам эксперимента, чем у животных без трансплантации (площадь некроза была на 15,4 % ниже, чем у животных без трансплантации (/? < 0.05)). При этом активность ферментов в миокарде и уровень БТШ70 в нем были выше чем у животных сравниваемой группы уже к 16 часу наблюдения (ЛДГ1 — на 8,1 %, КК - на 30,3 %, БТШ70 - на 9,4 % соответственно (р < 0,05)).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты исследований можно использовать при написании учебников, учебных пособий и монографий. В учебном процессе на ветеринарных факультетах при изучении хирургии, терапии, анатомии, гистологии, морфологии и патофизиологии животных, а также в вузах при изучении циклов биологических наук.

2. Результаты исследований могут быть использованы в экспериментальной и ветеринарной практике для разработки способа коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Бадуев, Б.К. Изменение содержания белков теплового шока при трансплантации ксеногенных неонатальных клеток в условиях адреналинового миокардита / Б.К. Бадуев, A.A. Рунович, Ю.И. Пивоваров, Т.Е. Курильская, Г.Б. Боровский, В.К. Войников, A.C. Сергеева, И.В. Бабушкина // «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине»: матер, междунар. конф. - Новосибирск, 2006 - С. 67.

*2. Бабушкина, И.В. Эндогенная защита миокарда: роль белков теплового шока в механизмах прекондиционирования / И.В. Бабушкина, A.A. Рунович, ПБ. Боровский, В.К. Войников и др. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2006. - № 5. - С. 27-31.

3. Бабушкина И.В. Индукция синтеза белков теплового шока в суспензии неонатальных клеток сердца / И.В. Бабушкина, A.A. Рунович, Г.Б. Боровский, Т.Е. Курильская и др. // Материалы II съезда кардиологов Сибирского федерального округа. - Томск, 2007. - С. 13.

4. Бадуев, Б.К. Влияние трансплантации ксеногенных неонатальных клеток на изменение содержания белков теплового шока при остром повреждении миокарда I Б.К. Бадуев, А. А. Рунович, Г.Б. Боровский, В.К. Войников, И.В. Бабушкина и др. // Ш международная конференция «Фундаментальные науки - медицине»: сб. тез. науч-практ. конф. - Новосибирск, 2007 - С. 100.

5. Бабушкина, И.В. Оценка влияния гипертермии и антибиотика на содержание белков теплового шока в суспензии неонатальных клеток / И.В. Бабушкина, Б.К. Бадуев, A.C. Сергеева, Г.Б. Боровский // III международная конференция «Фундаментальные науки - медицине»: сб. тез. науч-практ. конф. - Новосибирск, 2007 - С. 99.

6. Бабушкина, И.В. Влияние трансплантации ксеногенных неонатальных клеток сердца с измененным содержанием белков теплового шока на степень защиты поврежденного сердца/ И.В. Бабушкина, Б.К. Бадуев, Г.Б. Боровский Т.Е. Курильская и др. // Сб. трудов ежегод. науч. конф. «Фундаментальные науки-медицине» и науч.-практ. конф. «Новые материалы и методы исследования». - Новосибирск, 2008-С. 189-190.

7. Войников, В.К. Исследование роли БТШ при действии трансплантации на рспаративные процессы в условиях патологии сердца и печени / В.К. Войников, Б.К. Бадуев, Г.Б. Боровский, С.С. Голубев, И.В. Бабушкина и др. // Сб. трудов ежегод. науч. конф. «Фундаментальные науки - медицине» и науч.-практ. конф. «Новые материалы и методы исследования». - Новосибирск, 2008. - С. 191-196.

*8. Бадуев, Б.К. Влияние клеточной трансплантации на индукцию белков теплового шока в поврежденном сердце / Б.К. Бадуев, Г.Б. Боровский, В.К. Войников, С.С. Голубев, И.В. Бабушкина и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. -№ 3. -С. 149-153.

9. Бабушкина, И.В. Роль белков теплового шока в адаптации миокарда к повреждению / И.В. Бабушкина, Т.Е. Курильская, Ю.И. Пивоваров, Г.Б. Боровский и др. // Всероссийская конференция «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды»: мат. Всерос. науч. конф. - Иркутск, 2009. — С. 45—48.

10. Бабушкина, И.В. Течение адреналинового миокардита в условиях трансплантации неонатальных клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока / И.В. Бабушкина, Г.Б. Боровский, Т.Е. Курильская, Ю.И. Пивоваров и др. // Четвертая Всероссийская научно-практическая конференция с междуна-

родным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов»: сб. тез. науч-практ. конф. - Новосибирск, 2009. - С. 19-20.

*11. Бабушкина, И.В. Воздействие модифицированного клеточного трансплантата на течение адреналинового повреждения миокарда / И.В. Бабушкина, Т.Е. Курильская, Ю.И. Пивоваров, Г.Б. Боровский и др. // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАМН. - 2010. - № 5 (75). - С. 217-221.

*12. Бабушкина, И.В. Характер влияния клеточной трансплантации на течение патологического процесса в условиях подавления белкового синтеза в организме / И.В. Бабушкина, Т.Е. Курильская, Ю.И. Пивоваров, Г.Б. Боровский и др. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - Иркутск. -2010.-№6(76), Ч. 1.-С. 156-159.

Примечание: * - издания, рекомендованные ВАК для публикации результатов исследований

БТШ - белки теплового шока

СКС - суспензии клеток сердца

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

КК - креатинкиназа

У.Е. - условные единицы

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

BCIP - 5-bromo-4-chloro-3-indolilphosphate (5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат)

NBT - nitroblue tetrazolium chloride (нитроголубой тетразолиум хлорид)

Подписано в печать 29.04.2011. Бумага офсетная. Формат 60х841/-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 064-11.

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабушкина, Инна Викторовна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ ПОВРЕЖДЕННОГО

СЕРДЦА (обзор литературы).

1.1. Защитные эффекты адаптации к стрессу. Ишемическое повреждение сердца. Феномен ишемического прекондиционирования

1.2. Роль белков теплового шока в адаптации к стрессу.

1.3. Клеточная трансплантация, роль белков теплового шока в защитном эффекте трансплантации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методика приготовления суспензий клеток сердца неонаталь-ного кролика.

2.2. Общая характеристика эксперимента.

2.3. Методы лабораторного контроля.

2.4. Методы морфометрического исследования.

2.5. Методы статистической обработки.

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТЕПЛОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ И АНТИБИОТИКА НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК СЕРДЦА НЕОНА

ТАЛЬНОГО КРОЛИКА.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО КЛЕТОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА НА МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ МИОКАРДА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ.

4.1. Влияние трансплантации суспензий неонатальных клеток сердца с низким и высоким уровнем БТШ на динамику развития патологического процесса в сердце.

4.2. Трансплантация суспензий клеток сердца неонатального кролика при повреждении сердца в условиях заблокированных внутриклеточных механизмов защиты миокарда.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на индукцию защитных белков в поврежденном миокарде"

Актуальность проблемы

Непрерывное нарастание в современном мире стрессовых воздействий на организм приводит к изменению функции сердца, состояние которой определяет здоровье и работоспособность как у человека, так и у животных [32, 59, 74, 87]. В связи, с чем поиск новых способов защиты миокарда от ишемиче-ского повреждения остается актуальным на протяжении многих десятилетий.

По данным литературы известно, что клеточная органоспецифическая трансплантация ограничивает повреждение органов при стрессе [6, 77, 84, 94, 102]. Обсуждаются разные теории механизмов действия клеточного трансплантата: трансдифференцировка, или слияние с клетками хозяина, мобилизация клеток-предшественниц, находящихся в самом миокарде, ангиогенез, стабилизация внеклеточного матрикса [5, 8, 24, 34, 35, 36, 43]. Кроме того, установлено, что одним из таких механизмов является стимуляция регенерации поврежденных тканей реципиента ростовыми факторами эмбриональных и неонатальных органоспецифических клеток, среди которых наиболее изученными являются фактор роста гепатоцитов и фактор роста эндотелия сосудов [1, 44, 111, 153, 155]. С другой стороны, известно, что трансплантация ксеногенных клеток сердца сопровождалась опережающим приростом внутриклеточных стресс-белков в поврежденном органе [1,3].

Вместе с тем в ряде экспериментальных исследований показано, что увеличение уровня белков теплового шока (БТШ) в органах может защищать их от повреждений. Защитная роль БТШ была выявлена в исследованиях, как на культурах клеток, так и in vivo. На уровне сегодняшних представлений белки теплового шока многими авторами расцениваются как часть внутриклеточной стресс-лимитирующей системы, способствующей защите клетки от повреждения [49, 59, 145, 183]. Белки этого класса обладают шаперонной активностью, т. е. принимают участие в правильной укладке полипептидных цепей (фолдинге) в нормальных и, особенно, в экстремальных условиях (таких, как тепловой шок, воздействие сильных оксидантов, интоксикации, ишемии, воспалении и т.д.) [133, 145, 146, 162, 175].

Существует предположение, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате белков с шаперонной активностью. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд исследований, который демонстрирует способность БТШ70 проникать через модельные мембраны [117, 141, 165]. Экзогенные БТШ участвуют в целом ряде важных регуляторных каскадов в организме и выполняют сигнальные функции [26, 129, 135, 171]. В ряде работ был выявлен защитный эффект экзогенных белков теплового шока [140, 166]. Кроме того, в работе С.А. Афанасьева было показано, что интрамиокардиальная трансплантация модифицированных мезенхимальных стволовых клеток с повышенным пулом БТШ70 и БТШ60 оказывала положительный эффект при постинфарктном ремоделировании за счет увеличения количества выживших клеток трансплантата [2].

В связи с этим, целью исследования явилось - изучение влияния модифицированного клеточного трансплантата с разным уровнем БТШ для выяснения их роли в механизмах защиты поврежденного сердца.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать разные способы модификации клеточного трансплантата, оказывающие влияние на содержание БТШ в суспензиях клеток сердца не-онатального кролика т уИго.

Научная новизна

Впервые показано, что добавление ампициллина в дозе 0,003 мг/мл в среду инкубации суспензий неонатальных клеток сердца приводит к снижению базового уровня белков теплового шока в клетках.

Трансплантация ксеногенных неонатальных клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока приводит к существенному увеличению уровня цитозольного пула БТШ70 в поврежденном миокарде по сравнению с опытами в контрольной группе и экспериментами с использованием немодицифированного трансплантата.

В условиях предварительного системного подавления белкового синтеза путем введения циклогексимида трансплантация немодифицированных неонатальных клеток сердца сопровождается более ранним восстановлением продукции БТШ и ограничением деструктивных процессов в миокарде, наблюдаемых в модельных экспериментах в этих условиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инкубация суспензий клеток сердца при 42°С повышает содержание белков теплового шока, а добавление в среду инкубации антибиотика снижает содержание этого белка.

3. В условиях исходно подавленного белкового синтеза трансплантация немодифицированных клеток у экспериментальных животных с повреждением сердца обеспечивает более ранний подъем уровня БТШ в миокарде и меньшее повреждение в данной группе, в сравнении с опытами, проведенными в тех же условиях без трансплантации.

Теоретическая и практическая значимость работы:

При разной исходной реактивности миокарда один и тот же трансплантат оказывает различное действие на защитные внутриклеточные стрессбелки и ферменты, но обеспечивают одинаковый характер выраженности воспалительного процесса, что свидетельствует о том, что кроме белков теплового шока, в клеточном трансплантате имеются другие вещества, оказывающие протекторный эффект.

Апробация основных положений работы

Материалы диссертации представлены на II съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007); III международной конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки — медицине» и научно-практической конференции «Новые материалы и методы для медицины» (Новосибирск, 2008); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); II научно-практической конференции молодых ученых Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (Иркутск, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Бабушкина, Инна Викторовна

выводы

1. Инкубация суспензий клеток сердца неонатального кролика при повышенной температуре (42° С) позволяет повысить уровень БТШ70 и БТШ72 в 2 раза. Инкубация суспензии клеток сердца с добавлением в питательную среду антибиотика (Ampicillin) снижает уровень БТШ70 и БТШ72 в 2,5 и 4,2 раза, соответственно, по сравнению с базовым содержанием изучаемых белков.

2. Применение трансплантата с повышенным содержанием уровня БТШ (температурная модификация) снизило площадь очагов некроза в среднем на 10% в сравнении с немодифицированным трансплантатом и опытами с введением клеток сердца с пониженным содержанием БТШ (модификация ампициллином) через трое суток от начала эксперимента. Кроме того, в опытах с температурной модификацией трансплантата отмечался меньший отек кар-диомиоцитов в сравнении с адреналиновым повреждением миокарда (на 34,9 %,р < 0,05).

3. Полученный кардиопротекторный эффект в группе с трансплантацией сердечных клеток с температурной модификацией был связан с более высоким уровнем накопления БТШ70 в миокарде животных через сутки от начала эксперимента, чем в других группах (в группе с температурной модификацией уровень БТШ70 составил 3,68 (3,58-3,75) у.е., в группе с базовым содержанием стресс-белков - 3,52 (3,41-3,57) у.е., с пониженным — 2,89 (2,79-2,95) у.е. (р < 0,05)).

4. В группе с трансплантацией клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока течение патологического процесса в сердце сопровождалось более высокой активностью ферментов в миокарде на третьи сутки: активность ЛДГ1 была выше в сравнении с группами с базовым и пониженным содержанием белков теплового шока на 1,27 и на 0,85 мкмоль/мг белка в мин; активность КК была выше на 2,14 и 2,26 мкмоль/мг белка в мин, чем у отмеченных групп (р < 0,05), и восстановлением соотношения пиру-ват/лактат до нормальных значений, что не наблюдалось в сравниваемых группах.

5. Трансплантация немодифицированных суспензий клеток сердца в условиях предварительного подавления белкового синтеза (циклогексимид) у животных при повреждении сердца сопровождалась менее выраженной альтерацией миокарда к третьим суткам эксперимента, чем у животных без трансплантации (площадь некроза была на 15,4 % ниже, чем у животных без трансплантации; р < 0,05). При этом активность ферментов в миокарде и уровень БТШ70 в нем были выше чем у животных сравниваемой группы уже к 16 часу наблюдения (ЛДГ1 на 8,1 %, ЮС на 30,3 %, БТШ70 на 9,4 % соответственно; р < 0,05).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследований могут быть использованы:

2. В экспериментальной и ветеринарной практике для разработки способа коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В экспериментальных исследованиях показано, что увеличение уровня белков теплового шока (БТШ) в органах может защищать их от повреждений. Защитная роль БТШ была выявлена в исследованиях, как на культурах клеток, так и in vivo [49, 59, 145, 183].

Существует вероятность того, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате белков с шаперонной активностью. Однако не исключается вариант позитивного эффекта клеточной трансплантации при патологии, который может быть связан со специфической активацией собственной системы синтеза стрессовых белков в поврежденном органе другими компонентами клетки.

В данной работе нами было показано, что трансплантация ксеногенных неонатальных клеточных суспензий сердца с разным уровнем белков теплового шока (БТШ) обеспечивает различные по своему характеру функциональные и структурные изменения в поврежденном органе.

Было установлено, что уровень белков теплового шока в суспензиях неонатальных клеток сердца можно модифицировать путем изменения температурного режима инкубации или добавлении в среду инкубации антибиотика (ампициллина). Инкубация суспензий неонатальных клеток сердца при температурной модификации повышала содержание БТШ70 в 2 раза, а БТШ72 в 1,9 раза, в сравнении с базовым содержанием. Инкубация неонатальных клеток сердца с ампициллином (в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации) сопровождалась снижением количества БТШ70 в 2,5 раза, БТШ72 в 4,2 раза, в сравнении с базовым уровнем. Повышение уровня белков теплового шока в суспензиях неонатальных клеток сердца может свидетельствовать о высокой синтетической и функциональной активности процессов, происходящих в сердечных клетках. Низкий уровень БТШ является маркером низкой синтетической активности в суспензиях клеток сердца.

Таким образом, полученные данные в эксперименте in vitro дали возможность провести сравнительный анализ результатов, полученных на животных с трансплантацией клеток, имеющих высокое и низкое содержания БТШ, т. е. с повышенной и пониженной белково-синтетической активностью.

Исследование содержания БТШ70 в миокарде опытных животных показало, что максимальное значение фиксировалось к первым суткам наблюдения в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, как в сравнении с контролем (адреналиновое повреждение миокарда), так и с животными с трансплантацией немодифицированных клеток. Мы полагаем, что существенное увеличение уровня общего пула БТШ70 в поврежденном миокарде на первые сутки способствовало большей сохранности кардиомиоцитов за счет более эффективного функционирования механизмов ренатурации поврежденных, неправильно свернутых или агрегированных белков, восстанавливая тем самым активность жизненно важных макромолекул [70,71, 137, 142].

К третьим суткам наблюдалось достоверное снижение БТШ70 во всех группах по сравнению с группой животных с адреналиновым повреждением миокарда. Однако самый низкий уровень БТШ70 был выявлен у экспериментальных животных с трансплантацией клеток, модифицированных нагреванием. По-видимому, необходимость в большой продукции стресс-белков в этой группе утрачивалась в связи с тем, что они выполнили свою защитную функцию. Содержание БТШ72 в группах с трансплантацией клеток на первые сутки ниже по сравнению с контролем.

Ранее нами было показано, что трансплантация неонатальных клеток сердца вызывала опережающий подъем уровня стресс-белков по сравнению с вариантом «повреждение без трансплантации» к 16 ч от начала эксперимента и затем наработка этих белков падала к первым суткам [3]. Тем не менее, сравнительный анализ показал, что в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, содержание БТШ72 на первые сутки было выше, чем в группах с базовым и пониженным уровнями БТШ. Это может свидетельствовать о том, что к 16 часу у данных животных содержание белков теплового шока было наибольшим. К трем суткам содержание этих белков во всех группах с трансплантацией ниже, чем в контроле.

Хотелось бы обратить внимание на содержание БТШ70 и БТШ72 в миокарде животных с введением клеток, инкубированных с ампициллином. В первые сутки трансплантация суспензий клеток сердца с пониженным содержанием БТШ сопровождалась значимым падением уровня БТШ70 в сравнении с опытами на животных с трансплантацией суспензий клеток сердца с базовым содержанием БТШ и контрольными опытами. В этот же срок содержание БТШ72 в миокарде животных этой экспериментальной группы не отличалось от опытов с трансплантацией суспензий клеток сердца с базовым содержанием белков теплового шока.

Во всех группах с трансплантацией клеточного материала активность креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы в миокарде была достоверно выше, чем в группе контроля (адреналиновое повреждение миокарда). Самая высокая активность КФК и ЛДП наблюдалась в группе с температурной модификацией, что свидетельствовало о большей сохранности активности этих ферментов у экспериментальных животных. В то же время в условиях трансплантации клеток, инкубированных с ампициллином, и в группе с трансплантацией немодифицированных клеток активность данных ферментов не имела существенных различий.

Как показали исследования, наибольшая степень повреждения миокарда наблюдалась в контрольной группе, о чем свидетельствуют выраженная клеточная инфильтрация, увеличение сосудистого индекса и отека миокарди-альных волокон и площадь некроза. В то время как ксенотрансплантация клеточных суспензий сердца с повышенным уровнем БТШ на этом фоне (при повреждении миокарда) значительно модифицировала интенсивность воспалительного процесса в миокарде. В этих условиях отмечались менее выраженная сосудистая гиперемия и отек миокардиальных волокон. Следует отметить, что площадь очагов некроза в миокарде животных этой экспериментальной группы была в 1,27 раза ниже, чем в контрольной группе и в 1,15 раза ниже, чем в группе с трансплантацией немодифицированных клеток.

Таким образом, можно предположить, что положительный эффект ксе-нотрансплантации суспензий клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока может быть связан с влиянием экзогенных БТШ трансплантата, проникающих через мембраны клеток и выполняющих сигнальные функции [26, 129, 135, 171].

С другой стороны, инкубация суспензий клеток сердца при повышенной температуре приводит к повышению их метаболической активности и накоплению различных регуляторных веществ. Данный факт не исключает специфическую активацию синтеза собственных белков теплового шока в поврежденном органе другими компонентами клетки, не связанными с синтезом стресс-белков. Результаты, полученные на животных с трансплантацией клеток, инкубированных с ампициллином, также свидетельствуют в пользу вышеупомянутого факта. Очевидно, что добавление в среду инкубации ампициллина приводило не только к снижению уровня стресс-белков, но и других белков. Полученные результаты позволили получить новые сведения о механизмах позитивного действия клеточного трансплантата, но в то же время, в ходе исследований возникли вопросы, требующие дальнейшего подробного изучения. В частности, необходимы исследования содержания в суспензиях клеток сердца факторов белковой природы, порождающих активацию накопления БТШ при трансплантации.

Чтобы выяснить какую роль в защите клеток поврежденного органа играют внутриклеточные защитные механизмы миокарда и экзогенные БТШ трансплантата, было важно отделить влияние этих двух механизмов. С этой целью было проведено исследование влияния клеточного трансплантата на внутриклеточные механизмы защиты поврежденного органа в условиях системного подавления белкового синтеза в миокарде.

Как показали наши исследования, предварительное подавление белкового синтеза в миокарде животных при введении адреналина усугубляло течение патологического процесса, о чем свидетельствовали морфологические изменения и снижение активности миокардиальных ферментов в ткани сердца. На всех контрольных точках исследования уровень содержания стресс-белков у животных с предварительным подавлением синтеза белка значимо ниже, чем в контрольной группе (адреналиновое повреждение миокарда). Логично предположить, что большая степень повреждения миокарда (особенно в ранние сроки) связана с тем, что циклогексимид блокировал синтез эндогенных белков теплового шока.

Трансплантация немодифицированных суспензий клеток сердца в условиях предварительного подавления белка сопровождалась более ранним восстановлением содержания БТШ70 (к 16 часу эксперимента) до значений у интактных животных. Также при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного белкового синтеза отмечались меньшая площадь некрозов и отек миокардиальных волокон, более сохранная активность ЛДГ1, в сравнении с группой без трансплантации.

Важно отметить, что у здоровых животных введение циклогексимида приводило к снижению уровня БТШ70 вплоть до восьмого часа наблюдения, при этом исходный уровень восстанавливался к 16 часам. При повреждении миокарда подавление синтеза белка привело к более длительному восстановлению уровня БТШ70, до нормальных значений он восстановился через 72 часа от начала эксперимента. Трансплантация суспензий клеток сердца привела к более раннему восстановлению содержания БТШ70, уже к 16 часу эксперимента.

Полученные данные еще раз подчеркивают регуляторный механизм действия ксенотрансплантации суспензий неонатальных клеток сердца. Поскольку в условиях подавленного синтеза белка, более раннее восстановление собственного синтеза стресс белков возможно лишь в случае триггерного влияния на рецепторный и генетический аппараты поврежденных клеток.

Веществами, оказывающими такой эффект, могут являться как БТШ, имеющиеся в трансплантате, так и другие биологически активные вещества. В проведенных ранее исследованиях выявлено, что имплантируемые неона-тальные клетки содержат в своем составе активные антиоксидантные соединения, это витамины А и Е, микроэлементы, участвующие в активации ферментов антиоксидантной защиты клетки, глутатион и система его ферментов [1, 19]. Высокое содержание в неонатальных клетках сердца белково-пептидных компонентов, также свидетельствует о возможности регуляторно-го воздействия на поврежденные клетки [104, 105].

По-видимому, температурное воздействие на клетки сердца приводит к повышению метаболической активности клеток, что приводит, с одной стороны, к накоплению уровня стресс-белков и вероятно к накоплению регуляторных белково-пептидных компонентов. Полученные нами результаты позволяют нам предположить, что стресс-белки и белково-пептидные компоненты в трансплантате посредством триггерного или рецепторного влияния на геном клетки могут вызывать более раннюю экспрессию синтеза защитных бешеов, либо прямо воздействовать на цитоплазматические белки. Повышение уровня стресс-белков в органе способствует сохранению нативной конформации белков, в том числе ферментов, и приводит к ограничению повреждения миокарда.

Полученные в ходе эксперимента результаты позволили разработать концептуальную схему саногенетического эффекта модифицированного клеточного трансплантата (рис. 11). о о

Экспрессия генов выработки внутриклеточных БТШ X I о >5 я

Л X X ш

0) а со о 1=

Прямое действие на цитоплазматические белки

Усиление синтеза защитных белков теплового шока

Защита ядерных и цитоплазматических белков от протеолиза

Ограничение повреждения рибосом, мембран и мембранных белков

Ренатурация клеточных белков

Сохранение активности ферментов

Рис. 11 Ограничение повреждения органа

- Концептуальная схема саногенетического эффекта модифицированного клеточного трансплантата.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Бабушкина, Инна Викторовна, Иркутск

1. Атеросклероз и клеточная терапия / Под общ. ред. A.A. Руновича, Ю.И. Пивоварова, Т.Е. Курильской. Иркутск: «Дом печати», 2005. -304 с.

2. Бадуев Б.К., Боровский Г.Б., Войников В.К., Голубев С.С. и др. Влияние клеточной трансплантации на индукцию белков теплового шока в поврежденном сердце // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009. — № 3. - С. 149-153.

3. Бадуев Б.К., Рунович A.A., Боровский Г.Б., Войников В.К. и др. Влияние ксеногенной цитотрансплантации на накопление БТШ70 в условиях адреналинового повреждения сердца // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2007. -№ 1 (53). - С. 86-90.

4. Берсенев A.B. Трансплантация клеток эмбриональной печени и стволовых клеток костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий ате-рогенеза (экспериментальное исследование): Автореф. дис. . канд. мед. наук-М., 2003.-27 с.

5. Берсенев A.B., Крашенинников М.Е., Онищенко H.A. Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. -№ 2. - С. 46-53.

6. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций / под общ. ред. В.И. Шумакова, H.A. Онищенко. — М.: Лавр, 2009.-308 с.

7. Бокерия Л.А., Беришвили И.И., Солнышков И.В. Клеточная терапия: взгляд клинициста (нынешнее состояние проблемы и основные направления будущих исследований в кардиологии) // Бюл. НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. 2008. - Т. 9, № 3. - С. 5-16.

8. Бокерия Л.А., Махалдиани З.Б., Сергеев A.B. Современное состояние проблемы клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Литературный обзор. Часть I // Бюл. НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. 2006. -Т. 7, №5.-С. 4-14.

9. Бокерия Л.А., Махалдиани 3.Б., Сергеев A.B. Современное состояние проблемы клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Литературный обзор. Часть II // Бюл. НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. 2006. -Т. 7, №5.-С. 14-24.

10. Бочков Н.П. Клеточная терапия в свете доказательной медицины // Клиническая медицина. 2006. - Т. 84, № 10. - С. 4-10.

11. Брюховецкий A.C., Ушаков С.О. Клинико-патогенетическое обоснование применения фетальных тканей человека при заболеваниях центральной нервной системы // Сб. статей. Трансплантация фетальных тканей и клеток человека М., 1996. - С. 53-56.

12. Буркова М.И., Гребенникова Н.В., Фисенко А.П., ИоноваН.А. и др. Использование фетальных тканей человека в комплексной терапии детей, больных синдромом Дауна // Трансплантация фетальных тканей и клеток человека: Сб. ст. -М., 1996. С. 46-50.

13. Выборова И. С. Влияние ксенотрансплантации эмбриональной ткани на гистоструктуру печени крыс при стрессе и интоксикации этиленглико-лем: Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск, 2007. - 27 с.

14. Городецкая И.В., Божко А.П., Бахтина Л.Ю., Малышев И.Ю. Значение тиреоидных гормонов в стрессиндуцированном синтезе белков теплового шока в миокарде // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 2000. -Т. 130, № 12 .-С. 617-619.

15. Турин A.B., МолошА.И., Сидоренко Г.И. Прерывистая ишемия — уникальный адаптационный феномен. Перспектива новых путей фармакологического воздействия // Кардиология. 1997. - № 6. - С. 45-52.

16. Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета // Биохимия.-2002.-Т. 67, № 5 .-С. 613-623.

17. Гусев H.Б., Букач О.В., Марстон С.Б. Структура, свойства и возможная физиологическая роль малого белка теплового шока с молекулярной массой 20 кДа (Hsp20, HspB6) // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 6. -С. 762-772.

18. Деев Р.В. Отечественный опыт изучения эффективности метода «клеточной кардиомиопластики» в эксперименте // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005. — № 1. - С. 17—18.

19. Евдонин A.JL, Кропачева И.В., Медведева Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 кДа запускает множественные сигнальные каскады в клетках А431 // Биологические мембраны. 2009. - Т. 26, № 4. - С. 298-304.

20. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции // Цитология. 2009. - Т. 51, № 2. - С. 130-137.

21. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебн. для студентов био-логич. спец. ун-тов, 4-е изд., перераб. и доп. М.: «Высшая школа», 1986.- 448 с.

22. Каган-Пономарев М.Я., Самко А.Н., Ходеев Г.В. Влияет ли предшествующая инфаркту миокарда стенокардия на его размер, лечение и прогноз? Клинические аспекты феномена адаптации к ишемии // Кардиология. 1998. - №9. - С. 60-64.

23. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: МЕДпресс-информ, 2004, - 501 с.

24. Каррыева Б.Ч., Ульмасов Х.А., Ляшко В.Н. Белки теплового шока: роль в физиологических и патологических процессах // Терапевтический архив.- 1992,-№2.-С. 148-152.

25. Клинова С.Н., Богородская С.Л., Курильская Т.Е., Пивоваров Ю.И. и др. Динамика адениловых нуклеотидов в раннем периоде инфаркта миокарда и при его коррекции клеточной трансплантацией // Сибирский медицинский журнал. 2009. - Т. 86, № 3. - С. 38-41.

26. Колесниченко И.С., Спицин В.М. Фармакологическая коррекция работоспособности собак // Ветеринарная медицина. 2008. - № 4. - С. 30-31.

27. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Аминева Х.К., Некрасова H.H. и др. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток // Цитология. -2004. Т. 46, № 12. - С. 1043-1054.

28. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Аминева Х.К., Некрасова H.H. и др. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта // Цитология. 2005. - Т. 47, №5.-С. 404-416.

29. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Клеточная терапия инфаркта миокарда // Цитология. 2008. - Т. 50, № 6. - С. 521-527.

30. Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2002. - № 3. - С. 2-19.

31. Кузнецов В.А., Тодосийчук В.В. Оценка феномена адаптации к ишемии методом суточного мониторирования ЭКГ // Кардиология. 1998. - N° 9. - С. 4-6.

32. Кузник Б.И., Цыбиков H.H. Белки теплового шока, атеросклероз, ДВС-синдром и тромбоз // Проблемы клинической медицины. 2009. -№ 1 (19).-С. 110-118.

33. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу // Соросовский образовательный журнал. 1997. - № 2. - С. 5-13.

34. Кулешова Э.В., Казеннов П.А. Аутоиндуцированная толерантность миокарда к ишемии // Российский физиол. журнал 1997. - Т. 83, № 11-12.-С. 105-114.

35. Курильская Т.Е. Патогенетическое обоснование фетальной терапии в профилактике и комплексном лечении ишемической болезни сердца: Ав-тореф. дис. . д-ра мед. наук. Иркутск, 1999. - 35 с.

36. Лазарев С.М., Фетисов К.В. Клеточная терапия в лечении ишемической болезни сердца // Вестник хирургии имени И.И. Грекова. 2007. — Т. 166, № 1. - С. 106-111.

37. Лепехова С.А. Саногенез печеночной недостаточности под влиянием ксе-нотрансплантации клеток печени и селезенки (экспериментальное исследование): Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Иркутск, 2010. - 47 с.

38. Литвицкий П.Ф. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при его регионарной ишемии и последующем возобновлении коронарного кровотока // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 2002. — №2. — С. 2-12.

39. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Гросс Г.Дж. Активация опиоидных рецепторов изменяет устойчивость сердца к аритмогенному действию ишемии и реперфузии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007. - № 2. - С. 21-26.

40. Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Маслов Л.Н., Гросс Г.Дж. Опиатергиче-ское звено антиаритмического эффекта адаптации к гипоксии на модели ишемии и реперфузии in vivo // Патологическая физиология и экспери-мен. терапия. 2003. - №1. - С. 19-21.

41. Малайцев В.В., Богданова И.М., Макарова О.В. Белки теплового шока и их роль в развитии патологических процессов // Архив патологии. 2008. -Т. 70, №6.-С. 31-38.

42. Малышев И.Ю., Малышева Е.В. Белки теплового шока и защита сердца // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 1998. - Т. 126, № 12. - С. 604-611.

43. Малышева Е.В., Замотринский A.B., Малышев И.Ю. Роль белков теплового шока в формировании стрессустойчивости у разных генетическихлиний животных // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 1994. -№7.-С. 11-13.

44. Маргулис Б.А., ГужоваИ.В. Белки стресса в эукариотической клетке // Цитология. 2000. - Т. 42, № 4. - С. 323-342.

45. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс // Цитология. 2009. - Т. 51, № 3. - С. 219-228.

46. Марченков В.В., Марченко Н.Ю., Марченкова С.Ю., Семисотнов Г.В. Молекулярные шаперонины прокариотических и эукариотических клеток // Успехи биологической химии. 2006. - Т. 46. - С. 279-302.

47. Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Гросс Г.Дж., Шультц Дж.Э.Дж. и др. Активация опиатных рецепторов изменяет устойчивость сердца к ишемиче-ским и реперфузионным повреждениям // Вестник аритмологии. 2002. — № 28. - С. 67-78.

48. Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Крылатов A.B., Гросс Г.Дж. Эндогенные опиоидные пептиды и антиаритмический эффект адаптации к стрессу // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. 2004. - № 4. - С. 11— 14.

49. Маслов Л.Н., Ревинская Ю.Г., Рыжов А.И., Нарыжная Н.В. Морфофунк-циональные проявления кардиопротекторного эффекта стимуляции р-опиатных рецепторов в условиях стресса // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. 2001. - №2. - С. 8-12.

50. Маслов Л.Н., Рябов В.В., Сазонова С.И., Тейлор Д.А. Регенерация миокарда человека // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. -2006. № 4. - С. 28-32.111i

51. Меерсон Ф.З. Защита сердца от ишемических повреждений: роль стресс-лимитирующих систем и стабилизации структур миокарда // Российский кардиологический журнал. 2001. - № 5 (31). - С. 49-59.

52. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца. М.: Наука, 1993. - 159 с.

53. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю., Замотринский A.B. Генерализованное накопление стресс-белков при адаптации организма к стрессорным воздействиям // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. — 1993. Т. 116, № 9. -С. 231-233.

54. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю., Замотринский A.B., Шнейдер А.Б. Феномен адаптационной стабилизации структур и роль белков теплового шока в его механизме // Вопросы медицинской химии. 1992. - № 1. - С. 5-9.

55. Меерсон Ф.З., Фролов Б.А., Воляник М.К. Влияние адаптации к периодическому действию гипоксии на показатели системы иммунитета и течение некоторых аллергических заболеваний // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. 1990. — № 3. - С. 16-22.

56. Меерсон Ф.З., Шнейдер А.Б., Устинова Е.Е. Сравнительная оценка защитного эффекта адаптации к периодической гипоксии и стрессорным воздействиям при инфаркте миокарда // Кардиология. 1990. - Т. 30, № 9. - С. 67-69.

57. Методы культивирования клеток: Сб. науч. тр. / А.Б. Борисов. Культивирование клеток сердца. JL: Наука, 1988. - 313 с.

58. Митрохин Ю.И., Гутникова М.Н., Бойков П.Я., Чирков Г.П. и др. Осо2бенности распределения Н.циклогексимида, биосинтез белка и ДНК в органах крысы после сублетального блока трансляции // Биохимия. -1987. Т. 52, № 6. - С. 969-977.

59. Монастырская Е.А., Андреева JI.B., Дучен М.Р., Виегант Ф. и др. Адаптация культуры кардиомиобластов к теплу защищает их от теплового шока:роль оксида азота и белков теплового шока // Биохимия. 2003. - Т. 68, № 7. - С. 992-999.

60. Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программированную гибель. Связь с патологией // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. 2006. -№ 2. -С. 2-16.

61. Нагорнев В.А., Пигаревский П.В., Мальцева C.B. Шапероны и их роль в атерогенезе // Вестник РАМН. 2008. - № 1. - С. 41-45.

62. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соросовский образовательный журнал.- 1996.-№7.-С. 10-18.

63. Наградова Н.К. Сворачивание белков в клетке: о механизмах его ускорения // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 8. - С. 1021-1037.

64. Непомнящих JIM. Патологическая анатомия и ультраструктура сердца. -Новосибирск: Наука, 1981. 324 с.

65. Непомнящих JI.M., Циммерман В.Г. Преднекротические контрактурные повреждения кардиомиоцитов: фотохимическое флюорохромирование и люминесцентная микроскопия миокарда // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 2001. - Т. 132, № 9. - С. 343-349.

66. Никольская A.B. Психосоматические расстройства и заболевания у собак // Ветеринарная клиника. 2011. — № 1 (2). — С. 30—31.

67. Новоселов С.С., Новоселова Т.В., Вербова М.В., Маргулис Б.А. и др. Количественный баланс между Hsp70 и его кошаперонами Hdjl и Bagl определяет его субстрат-связывающую активность // Цитология. 2005. -Т. 47, №3.-С. 220-229.

68. Новоселова Е.Г., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Парфенюк С.Б. и др. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе // Биохимия. 2006. - Т. 71, № 4 . - С. 471-480.

69. Онищенко H.A. Клеточные технологии и современная медицина // Патологическая физиология и эксперимен. терапия. — 2004. — № 4. — С. 2-11.

70. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока // Успехи биологической химии. 2003. - Т. 43. - С. 59-98.

71. Панин JI.E., Колпаков А.Р., Максимов В.Ф. Влияние кортикостерона и липопротеинов плазмы на работоспособность и ультраструктуру изолированного сердца крыс // Кардиология. 2007. - №1. - С. 31-36.

72. Петрищев H.H., Шляхто Е.В., Цырлин В.А., Власов Т.Д. и др. Роль свободных радикалов кислорода в механизмах локального и дистантного ишемического прекондиционирования миокарда // Вестник РАМН. -2006.-№8.-С. 10-15.

73. Петрова И.В., Васина Т.А., Новицкая С.А., Васина И.Г. и др. Изучение действия полусинтетических пенициллинов (ампициллина и карбеницил-лина) на некоторые иммунологические реакции в эксперименте // Антибиотики. 1974. - Т. 19, № 6. - С. 543-545.

74. Плавинский C.JI. Липопротсиды высокой плотности и перекисная концепция патогенеза атеросклероза. Часть 1. Источники и пути модификации липопротеидов // Эфферентная терапия. 1998. - Т. 5, № 2. - С. 11— 20.

75. Попов С.В., Рябов В.В., Суслова Т.Е., Штатолкина М.А. и др. Фундаментальные и прикладные аспекты клеточных технологий в кардиологии и кардиохирургии // Бюл. СО РАМН. 2008. - № 4 (132). - С. 5-15.

76. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Клеточная кардио-миопластика // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2001,-№2.-С. 46-53.

77. Проскуряков С.Я., Габай В.Л., Конопляников А.Г., Замулаева И.А. и др. Иммунология апоптоза и некроза // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 12. -С. 1593-1605.

78. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Продолжение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2000. - № 4. - С. 21-31.

79. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Продолжение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2001. - № 1. - С. 26-31.

80. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Продолжение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2001. - № 2. - С. 26-30.

81. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Продолжение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2001. - № 3. — С. 28—32.

82. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Окончание) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2001. - № 4. - С. 28-40.

83. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2000.-№2.-С. 24-31.

84. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (Продолжение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2000. - № 3. - С. 20-26.

85. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: Российская академия мед. наук: БЭБиМ (Бюлл. экспер. биол. и мед), 1998. -200 с.

86. Рябчиков О.П., Кузнецова JI.B., Назимова C.B., Маршицкая М.И. и др. Гормональный и клеточный состав препаратов фетальных тканей человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1998. - Т. 126, Прил. 1. -С.156-157.

87. Савельев C.B., Корочкин Л.И., Лебедев В.В., Воронов К.А. Гистологический анализ аутопсии после трансплантации фетальной и ксеногенной нервной ткани // Трансплантация фетальных тканей и клеток человека: Сб. ст. М., 1996. - С. 34-38.

88. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медгиз, 1960. - 254 с.

89. Сергеева A.C. Влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепа-тоцитов на содержание белков теплового шока (БТШ70) при экспериментальной гиперхолестеринемии: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Иркутск, 2005. - 26 с.

90. Сидоренко Г.И., Гурин A.B., Сополева Ю.В., Иосава И.К. Феномен прерывистой ишемии у человека и его роль в клинических проявлениях ишемической болезни // Кардиология. 1997. - № 10. - С. 4-16.

91. Соленкова Н.В., Маслов Л.Н., Дауни Дж.М. АТФ-зависимые К+-каналы и регуляция устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным воздействиям // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2006. - № 2. - С. 28-31.

92. Соловьев В.Н., Коваленко Л.П. Влияние бензилпенициллина и ампициллина на эмбриогенез белых крыс // Антибиотики. 1973. - Т. 18, № 9. -С. 815-818.

93. Сухих Г.Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 1998. — Т. 126, Прил. 1.-С. 3-13.

94. Туроверов К.К., Уверский В.Н., Кузнецова И.М. Нативные глобулярные и нативные частично или полностью неупорядоченные белки. Фолдинг, образование надмолекулярных комплексов, агрегация // Цитология. -2009. Т. 51, № 3. - С. 190-203.

95. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Роль пептидов в регуляции старения: результаты и перспективы исследований // Вестник РАМН. — 2010. — № 2. С. 37-45.

96. Хавинсон В.X., Кветной И.М., Южаков В.В. Пептидергическая регуляция гомеостаза. СПб.: Наука, 2003. - 195 с.

97. Халиулин И.Г., Ущеко Д.В. Влияние кратковременных эпизодов ишемии на постишемические реперфузионные нарушения сократимости изолированного сердца крысы // Кардиология. 1996. - Т. 36, № 10. — С. 63-67.

98. Хаткевич А.Н., Дворянцев С.Н., Капелько В.И., Руге Э.К. Защитный эффект ишемической предпосылки (прекондиционирования): влияние длительности ишемии // Кардиология. 1998. — № 5. - С. 4-8.

99. ХосидГ.М., Штейнберг Г.Б., Балабанова Э.Л., БаруР.В. и др. К токсикологической характеристике ампициллина // Антибиотики. — 1975. Т. 20, №7. с. 653-657.

100. Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М. Морфологические типы изменений миофибрилл мышечных клеток сердца // Архив патологии. 1980. - № 12. - С. 3-13.

101. Шабалин A.B., Никитин Ю.П. Защита кардиомиоцита. Современное состояние и перспективы // Кардиология. 1999. - № 3. — С. 4-10.

102. Шваб О.В., Тришкин C.B., Демушкин В.П. Хроматографический анализ пептидов фстальных тканей // Бюл. эксперимен. биологии и медицины. — 1998.-Т. 126, Прил. 1.-С. 191-193.

103. Шевченко Ю.Л., Свистов A.C., Тыренко В.В., Белевитин А.Б. и др. Ау-тоиндуцированная толерантность миокарда к ишемии: роль стрессбелков в механизмах ее возникновения // Физиология человека. 1999. — Т. 25, № 1.- С. 134-139.

104. Шевченко Ю.Л., Свистов А.С., Тыренко В.В., Белевитин А.Б. и др. Белки теплового шока: новые перспективы миокардиальной цитопротекции // Вестник РАМН. 1999. - № 7. - С. 16-20.

105. Шляхто Е.В., Нифонтов Е.М., Галагудза М.М. Пре- и посткондиционирование как способы кардиопротекции: патофизиологические и клинические аспекты // Сердечная недостаточность. 2008. - Т. 9, № 1 (45). -С. 4-10.

106. Шмид Ф. Клеточная терапия шаг в будущее медицины: пер. с нем. -Иркутск, 1998.- 161 с.

107. Юйшу М., Богачева Н.В., Гусев Н.Б. Выделение белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) из печени кролика и изучение его взаимодействия с компонентами тропонина и кальпонином // Биохимия. 1998.-Т. 63, №11 .-С. 1509-1517.

108. Alder G.M., Austen В.М., Bashford C.L., Mehlert A. et al. Heat shock proteins induce pores in membranes // Bioscience Reports. 1990. - Vol. 10 (6). -P. 509-518.

109. AryaR., MallikM., Lakhotia S.C. Heat shock genes integrating cell survival and death // J. Biosci. - 2007. - Vol. 32 (3). - P. 595-610.

110. AshburnerM., Bonner J.J. The induction of gene "activity in Drosophila by heat shock // Cell. 1979. - Vol. 17. - P. 241-254.

111. Balsam L.B., Wagers A.J., Christensen J.L., Kofldis T. et al. Haematopoietic stem cell adopt mature haematopoietic fates in ischemic myocardium // Nature. 2004. - Vol. 428 (6983). - P. 668-673.

112. Baxter G., Yellon D. Delayed myocardial protection following ischemic preconditioning // Basic. Res. Cardiol. 1996. - Vol. 91, N 1. - P. 53-56.

113. Beere H.M. Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress-inducible heat shock protein pathways // The journal of Clinical Investigation. 2005. - Vol. 115, N 10. - P. 2633-2639.

114. Beere H.M. The stress of dying: the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis // Journal of Cell Science. 2004. - Vol. 117 (13). - P. 2641-2651.

115. Beltrami A.P., Barlucchi L., TorellaD., Baker M. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. 2003. -Vol. 114 (6).-P. 763-776.

116. Berry A.J., Lott J.A., Grannis G.F. NADN preparations as they affect reliability of serum lactate dehydrogenase determinations // Clin. Chem. 1973. — Vol. 19, N 11.-P. 1255-1258.

117. Boengler K., Dodoni G., Rodriguez-Sinovas A., Cabestrero A. et al. Connexin 43 in cardiomyocyte mitochondria and its increase by ischemic preconditioning // Cardiovasc. Research. 2005. - Vol. 67. - P. 234-244.

118. Calderwood S.K., Mambula S.S., GrayJr.P.J., Theriault J.R. Extracellular heat shock proteins in cell signaling // FEBS Letters 2007. - Vol. 581. -P. 3689-3694.

119. Carratelli Romano C., Benedetto N., Catania M.R., Rizzo A. et al. Commonly used antibiotics induce expression of Hsp 27 and Hsp 60 and protect human lymphocytes from apoptosis // International Immunopharmacology. 2004. -N4.-P. 1067-1073.

120. Ch'ih J.J., ProcykR., Devlin T.M. Regulation of mammalian protein synthesis in vivo: stimulated protein synthesis in liver in vivo after cycloheximide treatment//Biochem. J. 1977. - Vol. 162. - P. 501-507.

121. Chimenti C., Kajstura J., TorellaD., UrbanekK. et al. Senescence and death of primitive cells and myocytes lead to premature cardiac aging and heat failure // Circ. Res. 2003. - Vol. 93 (7). - P. 604-613.

122. Cumming D.V., Heads R.J., Watson A., Latchman D.S. et al. Differential protection of primary rat cardiocytes by transfection of specific heat stress proteins // J. Mol. Cell. Cardiol. 1996. - Vol. 28 (12). - P. 2343-2349.

123. Dybdahl B., Slordahl S.A., Waage A., Kierulf P. et al. Myocardial ischaemia and the inflammatory response: release of heat shock protein 70 after myocardial infarction // Heart. 2005. - Vol. 91 (3). - P. 299-304.

124. Evdonin A.L., Guzhoval.V., Margulis B.A., Medvedeva N.D. Extracellular heat shock protein 70 mediates heat stress-induced epidermal growth factor receptor trans activation in A431 carcinoma cells // FEBS Lett. 2006. -Vol. 580 (28). - P. 6674-6678.

125. Farber J.L., FarmarR. Differential effects of cycloheximide on protein and RNA synthesis as a function of dose // Biochemical and biophysical research communications. 1973. - Vol. 51. - P. 626-630.

126. Fink A.L. Chaperone-Mediated Protein Folding // Physiological Reviews. -1999. Vol. 79, N 2. - P. 425-449.

127. Guo-Chang Fan, Xiaoping Ren, Jiang Qian, Qunying Yuan et al. Novel Cardioprotective Role of a Small Heat-Shock Protein, Hsp20, Against Ishemia / Reperfusion Injury // Circulation. 2005. - Vol. 111. - P. 1792-1799.

128. GuptaS., Knowlton A.A. HSP60, Bax, Apoptosis and the Heart // J. Cell. Mol. Med. 2005. - Vol. 9, N 1. - P. 51-58.

129. Harada Y., Sato C., KitajimaK. Complex formation of 70-kDa heat shock protein with acidic glycolipids and phospholipids // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007. - Vol. 353 (3). - P. 655-660.

130. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein // Science. 2002. - Vol. 295. - P. 1852-1858.

131. HuB., Mayer M.P., TomitaM. Modeling Hsp70-mediated protein folding // Biophys. J. 2006. - Vol. 91, N 2. - P. 496-507.

132. Huot J., Houle F., Spitz D.R., Landry J. HSP27 phosphorilatyon mediated Resistance against Actin Fragmentation and cell Death induced by oxidative stress // Cancer Res. 1996. - Vol. 56. - P. 273-279.

133. Hut H.M.J., Kampinga H.H., Sibon O.C.M. Hsp70 protests mitotic cells against heat-induced centrosome damage and division abnormalities // Moll. Biol. Cell. 2005. - Vol. 16. - P. 3776-3785.

134. Jaattela M., Wissing D. Heat-shock proteins protect cells from monocyte cytotoxicity: possible mechanism of self-protection // J. Exp. Med. 1993. — Vol. 177.-P. 231-236.

135. Jakob U., Gaestel M., Engel K., Buchner J. Small heat shock proteins are molecular chaperones // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 1517-1520.

136. Jiao J.-D., Garg V., Yang B., Hu K. Novel functional role of heat shock protein 90 in ATP-sensitive K+ channel-mediated hypoxic preconditioning // Cardiovascular Research. 2008. - Vol. 77. - P. 126-133.

137. KriegT., Qin Q., Philipp S., Alexeyev M.F. et al. Acetylcholine and bra-dykinin trigger preconditioning in the heart through a pathway that includes Akt and NOS // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004. - Vol. 287. - P. 2606-2611.

138. Kristiansen S.B., Henning O., Kharbanda R.K., Nielsen-Kudsk J.E. et al. Remote preconditioning reduces ischemic injury in the explanted heart by a Katpchannel-dcpendent mechanism // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. — 2005. -Vol. 288.-P. 1252-1256.

139. Laemmli U.K. Cleavege of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227 (5259). - P. 680-685.

140. Lancaster G.I., Febbraio M.A. Exosome-dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins // J. Biol. Chem. 2005. -Vol. 280 (24). - P. 23349-23355.

141. Lee M.S., MakkarR.R. Stem-cell transplantation in myocardial infarction: a status report // Ann. Intern. Med. 2004. - Vol. 140, N 9. - P. 729-737.

142. Liu G.S., Thornton J., Van Winkle D.M., Stanley A.W. et al. Protection against infarction afforded by preconditioning is mediated by Aj adenosine receptors in rabbit heart // Circulation. 1991. - Vol. 84(1). -P. 350-356.

143. Liu K.X., Kato Y., Matsumoto K., Nakamura T. et al. Characterization of the enhancing effect of protamine on the proliferative activity of hepatocyte growth factor in rat hepatocytes // Pharm. Res. 2009. - Vol. 26, N 4. -P. 1012-1021.

144. Lowry O.H., RosebroughN.J., FarrA.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193, N 1. - P. 265-275.

145. Lu X.-Y., Chen Le, Cai X.-L., Yang H.-T. Overexpression of heat shock protein 27 protects against ischaemia/reperfusion-induced cardiac dysfunction via stabilization of troponin I and T // Cardiovascular Research. — 2008. -Vol. 79.-P. 500-508.

146. Mambula S.S., Calderwood S.K. Heat shock protein 70 is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes // J. Immunol. 2006; - Vol. 177.-P. 7849-7857.

147. MarberM.S., Mestril R., Chi S.H., Sayen M.R. et al. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury // J. Clin. Invest. 1995. - Vol. 95 (4). -P. 1446-1456.

148. Melling C.W.J., Thorp D.B., Milne K.J., Noble E.G. Miocardial Hsp70 phosphorylation and PKC-mediated cardioprotection following exercise // Cell Stress and Chaperones. 2009. - Vol. 14. - P. 141-150.

149. Messina E., Angelis L.D., Frati G., Morrone S. et al. Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart // Circ. Res. -2004. Vol. 95. - P. 911-921.

150. Mestril R., Giordano F.J., Conde A.G., Dillmann W.H. Adenovirus-mediated gene transfer of a heat shock protein 70 (hsp 70i) protects against simulated ischemia // J. Mol. Cell. Cardiol. 1996. - Vol. 28 (12). -P. 2351-2358.

151. Miyazaki T., Sagawa R., Honma T., Noguchi S. et al. 73-kD molecular chap-erone Hsp-73 is a direct target of antibiotic gentamicin // J. Biol. Chem. -2004. Vol. 279 (17). - P. 17295-17300.

152. Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium // Circulation. 1986. — N74.-P. 1124—1136.

153. Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Kinev A.V., VoroninA.P. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells // Bio-chem. biophys. acta. 1996. - Vol. 1282 (1). - P. 156-162.

154. Novoselova T.V., Margulis B.A., Novoselov S.S., Sapozhnikov A.M. et al. Treatment with extracellular HSP70/HSC70 protein can reduce polygluta-mine toxicity and aggregation // J. Neurochem. 2005. - Vol. 94 (3). -P. 597-606.

155. Oliver I.T. A spectrophotometric method for determination of creatin phos-phokinase and myokinase // Biochem. J. 1955. - Vol. 61 (1). - P. 116122.

156. OpieL.H. Недавно выявленные ишемические синдромы и эндогенная цитопротекция миокарда: их роль в клинической кардиологии сегодня и в будущем // Медикография. 1999. - Т. 21, № 2. - С. 65-73.

157. Pelham H.R.B. Speculation on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins // Cell. 1986. - Vol. 46 (7). - P. 959-961.

158. Plumier J.C., KruegerA.M., CurrieR.W., Kontoyiannis D. et al. Transgenic mice expressing the human inducible Hsp70 have hipocampal neurons resistant to ischemic injury // Cell Stress and Chaperones. 1997. - Vol. 2 (3). - P. 162167.

159. Pocklcy A.G., Calderwood S.K., Multhoff G. The atheroprotective properties of Hsp70: a role for Hsp70-endothelial interactions? // Cell Stress and Chaperones. 2009. - Vol. 14. - P. 545-553.

160. Ritossa F.A. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophilae // Cellular and Molecular Life Sciences. 1962. - Vol. 18 (12). -P. 571-573.

161. Schlesinger M.J. Heat Shock Proteins // Journal of Biological Chemistry. -1990. Vol. 265, N 21. - P. 12111-12114.

162. Suzuki K., SawaY., KanedaY., IchikawaH. et al. In vivo gene transfcction with heat shock protein 70 enhances myocardial tolerance to ischemiareperfusion injury in rat // J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 99 (7). - P. 16451650.

163. SzaszG., Gruber W., BerntE. Creatin kinase in serum: 1. determination of optimum reaction conditions // Clin. Chem. 1976. - Vol. 22, N 5. - P. 650-656.

164. Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection // Methods Enzymol.- 1990.-Vol. 182.-P. 679-688.

165. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs // J. Mol. Biol. -1974. Vol. 84 (3). - P. 389-392.

166. Wang Y.P., Maeta H., Mizoguchi K., Suzuki T. et al. Intestinal ischemia preconditions myocardium: role of protein kinase С and mitochondrial K(ATP) channel // Cardiovasc. Res. 2002. - Vol. 55, N 3. - P. 576-582.

167. Welch W.J., Suhan J.P. Cellular and biochemical events in mammalian cells during and after recovery from physiological stress // J. Cell. Biol. 1986. -Vol. 103 (5).-P. 2035-2052.

168. Wroblewski F., LaDue J.S. Lactic dehydrogenase activity in blood // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1955. - Vol. 90 (1). - P. 210-213.

169. Yao S., Peng M., Zhu X., Cheng M. et al. Heat shock protein 72 protects hip-pocampal neurons from apoptosis induced by chronic psychological stress // Int. J. Neurosci. 2007. - Vol. 117, N11.-P. 1551-1564.

170. Yellon D.M., Baxter G.F. A «second window of protection» or delayed preconditioning phenomenon: future horizons for myocardial protection? // J. Mol. Cell. Cardiol. 1995. - Vol. 27 (4). - P. 1023-1034.

171. Yellon D.M., Dana A., Walker J.M. Эндогенная защита миокарда: значение метаболической адаптации («прекондиционирования») // Медико-графия.- 1999.-Т. 21, №2.-С. 80-83.

172. Young J.С., Hoogenraad N.J., Hartl F.U. Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70 // Cell. 2003. - Vol. 112 (1). - P. 41-50.

173. YueY., Qin Q., Cohen M.V., Downey J.M. et al. The relative order of mK(ATP) channels, free radicals and p38 MAPK in preconditioning's protective pathway in rat heart // Cardiovasc. Res. 2002. - Vol. 55, N 3. -P. 681-689.

174. Zhao Y., Wang W., Qian L. Hsp70 may protect cardiomyocytes from stress-induced injury by inhibiting Fas-mediated apoptosis // Cell Stress Chaper-ones. 2007. - Vol. 12 (1). - P. 83-95.

Информация о работе

Бабушкина, Инна Викторовна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2011
ВАК 06.02.01

Диссертация

Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на индукцию защитных белков в поврежденном миокарде - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы